JP2015164959A

JP2015164959A - 上皮型ナトリウムチャネル活性化剤

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Publication number: JP2015164959A
Application number: JP2015118694A
Authority: JP
Inventors: 考司坂本; Koji Sakamoto; 菜穂子齋藤; Naoko Saito; 浩二郎橋爪; Kojiro Hashizume
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 2015-06-11
Filing date: 2015-06-11
Publication date: 2015-09-17

Abstract

【課題】上皮型ナトリウムチャネル活性化効果を有する上皮型ナトリウムチャネル活性化剤を提供する。【解決手段】キャベツ（Brassicaoleracea）抽出物、フェルラ酸、トコフェロール、キク（Chrysanthemummorifolium）抽出物、ホウレンソウ（Spinaciaoleracea）抽出物、ヤエヤマアオキ（Morindacitrifolia）抽出物及びジメチルオクテノンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする上皮型ナトリウムチャネル活性化剤。【選択図】なし

Description

本発明は、上皮型ナトリウムチャネル活性化剤に関する。

味覚は、有郭乳頭、葉状乳頭、茸状乳頭等舌の表面に存在する味蕾中に存在する味細胞で刺激を感じ、その刺激が鼓索神経、舌咽神経等を介して脳に伝わり、ここで初めて感じる。味覚は、生理状態や心理状態、味質（食の美味しさ）に影響を与えるものであり、非常に重要な、ヒトなどの動物の五感の１つである。
味覚として感じる味は、大きく分けて５つの基本味（甘味、塩味、酸味、旨味、苦味）が知られている。このうち、塩味は、単なる嗜好としてだけではなく、飲食品の美味しさを引きたて食欲増進効果もあることから、飲食品の風味として極めて重要である。

飲食品に塩味を付与するには、通常塩化ナトリウムが用いられる。その主要構成成分であるナトリウムの過剰摂取は、高血圧をはじめとする多くの健康疾患の危険因子である。したがって、塩化ナトリウムの摂取量抑制が推奨されている。これまでに、塩化ナトリウム含量を減じた様々な減塩飲食品が開発され、市販されている。例えば、塩化ナトリウムの代替品として塩化カリウムや硫酸マグネシウムが知られている。しかし、いずれも塩化ナトリウムと比べて塩味が弱いこと、塩味に加えて苦味や渋味等の不快味があり、減塩と味質の両立が困難である。

１つの味蕾中に５０〜１００個程度存在する味細胞に、α−サブユニット、β−サブユニット、γ−サブユニットからなる上皮型ナトリウムチャネル（epithelial Na+ channel、以下、本明細書において「ENaC」ともいう）が発現している。ENaCは、味蕾の頂端膜を通るナトリウムの流入を媒介する塩味受容体の１種であり、温度、浸透圧などによりENaCの活性が制御される。これまでに、ENaCの機能の阻害剤であるアミロライドは、ヒトなどの哺乳動物において塩化ナトリウムに対する味覚応答を減衰させることが知られている。さらに、ENaCが媒介するナトリウムの流入を促進する物質は一般的な鹹味相乗剤として機能し、ヒトの鹹味知覚を増強する（例えば、特許文献１参照）。
さらに、塩味閾値と高血圧症の罹患率の関連性についても知られており、塩味に対して鈍感な場合高血圧罹患率も上昇する（例えば、非特許文献１参照）。例えば、日本人女性の塩味認知閾値と高血圧罹患率を検討した結果、塩味閾値が１％以上のヒトで高血圧罹患率が５５．６％（５５人／９９人中）であるのに対し、塩味閾値が１％未満のヒトで高血圧罹患率が３２．９％（１２７人／３８０人中）となり、塩味閾値が高いと高血圧罹患率が有意に高いことが報告されている。
上記の観点から、ENaCの機能が阻害されると塩味閾値が上昇し、高血圧症に罹患する可能性が高くなる。したがって、高血圧症の予防・治療の観点から、ENaC活性化剤が求められている。

国際公開第０２／０８７３０６号

T．Michikawa et al.，Hypertens．Res.，vol．32，No．5，p．399-403，2009

本発明は、上皮型ナトリウムチャネル活性効果を有する上皮型ナトリウムチャネル活性化剤を提供することを課題とする。さらに、本発明は、本来の風味を損なうことなく、食品及び飲料の塩味の増強効果を有する塩味増強剤を提供することを課題とする。

本発明者等は上記課題に鑑み、鋭意検討を行った。その結果、上皮型ナトリウムチャネルが活性化されると鼓索神経応答が増強し、塩味閾値が低下する（塩味に敏感になる）ことを見出した。さらに、キャベツ（Brassica oleracea）抽出物、フェルラ酸、トコフェロール、キク（Chrysanthemum morifolium）抽出物、ホウレンソウ（Spinacia oleracea）抽出物、ヤエヤマアオキ（Morinda citrifolia）抽出物及びジメチルオクテノンが、上皮型ナトリウムチャネル活性化作用を奏し、鼓索神経応答を増強し、塩味を増強することを見い出した。本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至った。

本発明は、キャベツ（Brassica oleracea）抽出物、フェルラ酸、トコフェロール、キク（Chrysanthemum morifolium）抽出物、ホウレンソウ（Spinacia oleracea）抽出物、ヤエヤマアオキ（Morinda citrifolia）抽出物及びジメチルオクテノンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする上皮型ナトリウムチャネル活性化剤に関する。
また、本発明は、キャベツ抽出物、フェルラ酸、トコフェロール、キク抽出物、ホウレンソウ抽出物、ヤエヤマアオキ抽出物及びジメチルオクテノンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする塩味増強剤に関する。

本発明の上皮型ナトリウムチャネル活性化剤は、優れた上皮型ナトリウムチャネル活性効果を有する。また、本発明の塩味増強剤は、優れた、食品及び飲料の塩味の増強効果を有する。

本発明のENaC活性化剤及び塩味増強剤は、キャベツ抽出物、フェルラ酸、トコフェロール、キク抽出物、ホウレンソウ抽出物、ヤエヤマアオキ抽出物及びジメチルオクテノンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする。

本発明に用いる有効成分のうち、植物抽出物について説明する。
本発明におけるキャベツとは、アブラナ（Brassicaceae）科アブラナ（Brassica）属の多年草で、野菜として広く利用されている。
本発明におけるキクとは、キク（Asteraceae）科キク（Chrysanthemum）属の多年生草本で、観賞用として用いられている。
本発明におけるホウレンソウとは、アカザ（Chenopodiaceae）科ホウレンソウ（Spinacia）属の植物で、野菜として広く利用されている。
本発明におけるヤエヤマアオキとは、アカネ（Rubiaceae）科ヤエヤマアオキ（Morinda）属の常緑小高木で、食用、医薬品、染色材料として利用されている。

本発明における前記植物は、その植物の全ての任意の部分が使用可能である。例えば、上記植物の全木、全草、根、根茎、幹、枝、茎、葉、樹皮、樹液、樹脂、花、果実、種子、果皮、莢、芽、花穂、心材等の任意の部分、及びそれらの組み合わせのいずれか１つ又は２つ以上を使用することができる。
本発明においてキャベツ抽出物を得るには、キャベツの葉を抽出することが好ましい。本発明においてキク抽出物を得るには、キクの花を抽出することが好ましい。本発明においてホウレンソウ抽出物を得るには、ホウレンソウの葉を抽出することが好ましい。本発明においてヤエヤマアオキ抽出物を得るには、ヤエヤマアオキの果実を抽出することが好ましい。
あるいは、本発明において、前記植物の抽出物として、食品、飲料等として市販されている抽出物を用いてもよい。例えば、飲料として市販されているノニジュースをヤエヤマアオキ抽出物として用いてもよい。

本発明において用いる、キャベツ、キク、ホウレンソウ及びヤエヤマアオキの抽出物の製造方法については特に限定はなく、上記植物を通常の方法で抽出することにより抽出物を得ることができる。具体的には、前記植物を乾燥させた乾燥物、その粉砕物等を圧搾抽出することにより得られる搾汁、水蒸気蒸留物、各種抽出溶剤による粗抽出物、粗抽出物を分配又はカラムクロマトなどの各種クロマトグラフィーなどで精製して得られた抽出物画分などを本発明における抽出物として用いることができる。
上記の植物はそのまま抽出に供することも可能であるが、より抽出効率を高めるために、乾燥、細断、粉砕等の工程を加えることも好ましい。また、本発明においては、前記抽出物、水蒸気蒸留物、圧搾物等のいずれかを単独で、又は２種以上を組み合わせて使用してもよい。なかでも、本発明の植物抽出物としては、上記植物を乾燥させた乾燥物又はその粉砕物から、抽出溶剤を用いて得られた抽出物を用いることがより好ましい。

抽出溶剤としては、極性溶剤、非極性溶剤のいずれをも使用することができ、これらを混合して用いることもできる。例えば、水；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類；エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール等の多価アルコール類；アセトン、メチルエチルケトン等のケトン類；酢酸メチル、酢酸エチル等のエステル類；テトラヒドロフラン、ジエチルエーテル等の鎖状及び環状エーテル類；ポリエチレングリコール等のポリエーテル類；ジクロロメタン、クロロホルム、四塩化炭素等のハロゲン化炭化水素類；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の炭化水素類；ベンゼン、トルエン等の芳香族炭化水素類；ピリジン類；超臨界二酸化炭素；油脂、ワックス、その他オイル等が挙げられる。あるいは、上記溶剤の２種以上を組み合わせた混合物を、抽出溶剤として用いることができる。このうち、水、アルコール類、水−アルコール混合液を用いるのが好ましく、エタノール水溶液を用いるのがより好ましい。

本発明で用いられる抽出物を得るための抽出条件については、使用する溶剤によって異なり特に制限はなく、通常の条件を適用できる。例えば、上記植物を０〜１００℃で１時間〜３０日間浸漬又は加熱還流すればよい。また、抽出効率を向上させるため、併せて攪拌を行ったり、溶媒中でホモジナイズ処理を行ってもよい。

上記溶媒で抽出して得られた抽出物はそのまま使用してもよいが、さらに適当な分離手段、例えばゲル濾過、クロマトグラフィー、精密蒸留、活性炭処理等により活性の高い画分を分画して用いることもできる。本発明において、植物の抽出物とは、このようにして得られた各種抽出物、その希釈液、その濃縮液、その精製物又はそれらの乾燥末を包含するものである。

次に、本発明に用いる有効成分のうち、植物抽出物以外の化合物について説明する。
本発明で用いるフェルラ酸（4-ヒドロキシ-3-メトキシ桂皮酸）は下記式で表される桂皮酸の誘導体である。

フェルラ酸は、塩の形とすることにより水溶性を向上させ、生理学的有効性を増大させることができることが知られている。本発明のENaC活性化剤及び塩味増強剤において、フェルラ酸は塩の形態で用いてもよい。
フェルラ酸の塩としては、薬学的に許容される塩であれば特に限定されない。このような塩形成用の塩基物質としては、例えば、水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等のアルカリ金属の水酸化物；水酸化マグネシウム、水酸化カルシウム等のアルカリ土類金属の水酸化物；水酸化アンモニウム等の無機塩基、アルギニン、リジン、ヒスチジン、オルニチン等の塩基性アミノ酸；モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン等の有機塩基が挙げられる。このうち、アルカリ金属又はアルカリ土類金属の水酸化物が好ましい。

前記フェルラ酸の製造方法に特に制限はなく、化学合成したものを用いてもよく、天然物由来の材料から抽出や精製等したものであってもよい。また、試薬として市販されているものをフェルラ酸として用いることもできる。

本発明で用いるトコフェロールはビタミンＥとも呼ばれ、脂溶性ビタミンの１種である。また、トコフェロールは側鎖に二重結合を持たず、下記に示すように４種類の異性体（α−トコフェロール、β−トコフェロール、γ−トコフェロール、δ−トコフェロール）が存在する。

前記トコフェロールの製造方法に特に制限はなく、化学合成したものを用いてもよく、天然物由来の材料から抽出や精製等したものであってもよい。また、試薬として市販されているものをトコフェロールとして用いることもできる。さらに、トコフェロールとして、前記異性体のうち１種を用いてもよいし、前記異性体のうち２種以上を併用してもよい。

本発明で用いるジメチルオクテノン（4,7-ジメチル-6-オクテン-3-オン）は下記式で表される化合物である。

前記ジメチルオクテノンの製造方法に特に制限はなく、化学合成したものを用いてもよく、天然物由来の材料から抽出や精製等したものであってもよい。また、試薬として市販されているものをジメチルオクテノンとして用いることもできる。

本発明のENaC活性化剤及び塩味増強剤には、前記有効成分のうちのいずれか１種を利用しても、２種以上を併用してもよい。

ENaCが活性化されると鼓索神経応答が増強され、塩味閾値が低下する。さらに、キャベツ抽出物、フェルラ酸、トコフェロール、キク抽出物、ホウレンソウ抽出物、ヤエヤマアオキ抽出物及びジメチルオクテノンがENaC活性化作用を奏し、鼓索神経応答を増強し、塩味閾値を低下させる。したがって、キャベツ抽出物、フェルラ酸、トコフェロール、キク抽出物、ホウレンソウ抽出物、ヤエヤマアオキ抽出物及びジメチルオクテノンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とすることで、ENaC活性化剤及び塩味増強剤を得ることができる。さらに、本発明によれば、ENaCを活性化することにより、少ない塩分量でも十分な塩味を感じさせる塩味増強技術の提供が可能となる。前記有効成分がENaC活性化作用を奏し、鼓索神経応答を増強し、塩味閾値を低下させることは、本発明者らによって新たに得られた知見である。

本明細書において、「ENaC活性化」とは、ナトリウムイオンなどのイオン流束の増大、膜電位の増大、電流振幅の増大、電位開口性の増大、ENaC発現の促進などにより、ENaCの機能を増強することを指す。本発明において、「ENaC活性化」とは特に、ナトリウムイオンの流束を増大させ、ENaCの機能を増強することを指す。

ENaC活性化の評価方法について特に制限はないが、例えば特開２００７−５２８７１２号公報に記載の方法を参考にすることができる。
ENaC活性化の評価方法の具体例について説明する。ヒトENaCを安定して機能的に発現する株（以下、本明細書においてENaC安定発現株ともいう）と被検剤とを接触させ、イオン流束の変化を測定することによりENaC活性化の評価が可能となる。イオン流束の変化を測定する方法としては特に制限はなく、パッチクランプ技法、全細胞電流の測定、放射標識イオン流束アッセイ、電位感受性色素又はイオン感受性色素を用いた蛍光アッセイなどが挙げられる。

本発明のENaC活性化剤によれば、ENaCの活性化が治療に有効な組織障害又は病態が予防又は改善される。ENaCが発現する組織としては、味蕾、尿細管腔膜、結腸、膀胱、肺、角膜、気道、皮膚、唾液腺、汗腺、乳腺などが知られている。ENaCの機能の低下により障害を受ける組織は、生体内の任意の組織であり得、例えば、舌、眼、耳、皮膚、上皮、血液、リンパ、鼓索神経、食道、消化管、胃、血管、皮膚、肺、心臓、腎臓、膀胱、小腸、大腸等が挙げられる。組織障害及び病態の例としては、味覚障害、下痢、低ナトリウム血症状、肺水腫、高カリウム血症、皮膚バリア障害、等が挙げられる（例えば、文献S．Zeissig et al.，Gastroenterology，vol．134，No．5，p．436-447，2008；T．Maruo et al.，J．Invest．Dermatol.，vol．118，No．4，p．589-594，2002；N．Randrianarison et al.，Am．J．Physiol．Lung Cell Mol．Physiol.，vol．294，No．3，p．409-416，2008；F．J．McDonald et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A.，vol．96，No．4，p．1727-1731，1999等参照）。したがって、ENaCの活性化により、これらの組織障害及び病態の予防又は改善が可能となる。

ENaCの活性化が治療に有効な組織障害又は病態について、具体例を挙げて説明する。
ENaC活性と、塩味閾値との間に相関関係があり、味蕾中に存在する味細胞で発現するENaCが媒介するナトリウムの流入を促進する物質は一般的な鹹味相乗剤として機能し、ENaCが活性化されると塩味閾値が低下する（塩味に敏感になる）（例えば、国際公開第０２／０８７３０６号等参照）。したがって、本発明のENaC活性化剤は、少ない塩分量でも十分な塩味を感じさせる塩味増強剤や、塩分の過剰摂取が原因の１種である高血圧の予防・改善剤等への適用が可能である。
また、ヒトの腎皮質集合管（腎遠位尿細管）を構成する尿細管腔膜にもENaCが発現している。尿細管腔膜に発現するENaCは、ナトリウムを再吸収することにより体内ナトリウム量を緻密に制御することが知られており、体液量、血漿浸透圧、血圧等の調節に非常に重要な役割を有する。
クローン病患者は慢性的な腸の炎症が起こっており、下痢などの症状を有している。クローン病患者における腸のENaCの機能を解析したところ、ENaCを介したNa透過性が低下しており、γサブユニットの遺伝子発現が低下する。これは、ENaCの活性化により、下痢などの症状を緩和できることを示している（S．Zeissig et al.，Gastroenterology，vol．134，No．5，p．436-447，2008等参照）。
ENaCのαサブユニットを欠損させたマウスでは、野生型のマウスに比べて、表皮の肥厚や脂質異常分泌などが起こる、組織切片を観察すると乾癬様な形状である、等の報告がされている。これらは、ENaCがケラチノサイトの分化などに関与にしていることを示しており、ENaCの機能の低下が、皮膚バリア障害を起こすことを示唆している（T．Maruo et al.，J．Invest．Dermatol.，vol．118，No．4，p．589-594，2002等参照）。
肺に発現するENaCは、Naを透過させることにより肺の水分を除去し、肺水腫を予防する役割を担っている。ENaCのβサブユニットを欠損させたマウスでは、クリアランス（水分除去能）が32%減少することが報告されている。これは、ENaCを活性化することにより、肺水腫の予防が可能であることを示している（N．Randrianarison et al.，Am．J．Physiol．Lung Cell Mol．Physiol.，vol．294，No．3，p．409-416，2008等参照）。
ENaCのβサブユニットを欠損させると、血中ナトリウム濃度が低下し、カリウム濃度が増加することが報告されている。これは、ENaCを活性化することにより、低ナトリウム血症、高カリウム血症を予防できることを示している（F．J．McDonald et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A.，vol．96，No．4，p．1727-1731，1999等参照）。

本発明の塩味増強剤によれば、飲食品本来の風味を損なうことなく、少量の添加で飲食品の塩味を強化することができる。また、塩味増強が治療に有効な組織障害または病態が予防又は改善される。
塩味閾値の上昇（塩味が鈍感になること）により障害を受ける組織は、生体内の任意の組織であり得、例えば、舌、腎臓、心臓、血管等が挙げられる。組織障害及び病態の例としては、味覚障害、高血圧症、腎障害、心筋梗塞、脳卒中等が挙げられる（例えば、武田ら、医学の歩み、第231巻、第8号、805-808頁、2009年等参照）。したがって、塩味の増強により、これらの組織障害及び病態の予防又は改善が可能となる。

本発明のENaC活性化剤及び塩味増強剤は、医薬品、医薬部外品、食品、飲料等の用途に適用することができる。さらに本発明のENaC活性化剤及び塩味増強剤は、液状、固形状、乳液状、ペースト状、ゲル状、パウダー状（粉末状）、顆粒状、ペレット状、スティック状等、ヒトや動物に適用されうる各種剤型をとることができる。

本発明のENaC活性化剤及び塩味増強剤を医薬品、医薬部外品に適用する場合、必要により各種添加剤を配合し、前記有効成分を適量含有させて、各種剤形の医薬品又は医薬部外品として調製することができる。例えば、錠剤、被覆錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、エキス剤等の経口医薬として、又は、軟膏、眼軟膏、ローション、クリーム、貼付剤、坐剤、点眼薬、点鼻薬、注射剤といった非経口医薬として調製することができる。これらの医薬は、各種添加剤を用いて常法に従って製造すればよい。使用する添加剤には特に制限はなく、通常用いられているものを使用することができる。その例としては、デンプン、乳糖、白糖、マンニトール、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩等の固形担体、蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、エタノール等のアルコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール等の液体担体、各種の動植物油、白色ワセリン、パラフィン、ロウ類等の油性担体、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤、崩壊剤、滑沢剤、希釈剤、浸透圧調整剤、ｐＨ調整剤、防腐剤、酸化防止剤、着色剤、紫外線吸収剤、保湿剤、増粘剤、光沢剤、緩衝剤、矯味剤、矯臭剤等が挙げられる。

本発明のENaC活性化剤及び塩味増強剤を飲食品、ペットフード等に適用する場合、食用又は飲料用に適した形態、例えば、顆粒状、粒状、錠剤、カプセル、ペーストなどに成形して提供することができる。さらに、前記飲食品は、一般飲食品の他、ENaCの機能の低下や塩味閾値の上昇により発症し、ENaCの機能の増強や塩味増強が治療又は予防に有効な症状の予防又は改善をコンセプトとし、必要に応じてその旨を表示した美容食品、病者用食品、栄養機能食品又は特定保健用食品等の機能性飲食品の形態とすることができる。

飲食品の形態としては特に制限はなく、例えば、果汁飲料、乳飲料、茶系飲料等の飲料類、キャンディ、ドロップ、ゼリー、クッキー、チョコレート、ケーキ、ヨーグルト、ガム等の菓子類、調味料、調理油、乳製品、パン類、麺類、加工米等が挙げられる。また、錠剤（タブレット）、カプセル、顆粒、シロップ等の美容食品、健康飲食品等としてもよい。
これらの飲食品は、例えば、甘味剤、着色剤、抗酸化剤、ビタミン類、香料、ミネラル等の添加剤、タンパク質、脂質、糖質、炭水化物、食物繊維等の食品原料を適宜組み合わせて用い、これと本発明のENaC活性化剤及び塩味増強剤とを含有させ、常法に従って各種飲食品の形態とすることにより調製することができる。

本発明のENaC活性化剤及び塩味増強剤はそのままで医薬品、医薬部外品、食品、飲料等として用いてもよいし、医薬品、医薬部外品、食品、飲料等の添加剤又は配合剤として用いてもよい。

本発明のENaC活性化剤及び塩味増強剤における前記有効成分の配合量は、その使用形態により異なるが、医薬品、例えば、錠剤、被覆錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤等の経口用固形製剤、内服液剤、シロップ剤等の経口用液体製剤の場合は、０．００００５〜１０質量％が好ましく、０．０００２〜２質量％がより好ましく、０．００５〜０．１質量％がさらに好ましい。飲食品やペットフード等に配合する場合は、０．００００５〜１０質量％が好ましく、０．０００２〜２質量％がより好ましく、０．００５〜０．１質量％がさらに好ましい。

本発明のENaC活性化剤及び塩味増強剤の投与又は摂取量は、個体の状態、体重、性別、年齢、又はその他の要因に従って変動し得る。成人（体重６０kg）の１日当りの投与又は摂取量は、０．００５〜２０００ｍｇが好ましく、０．０２〜２００ｍｇがより好ましく、０．５〜２０ｍｇがさらに好ましい。本発明のENaC活性化剤及び塩味増強剤は、１日に３回、１日に２回、１日１回、２日に１回、３日に１回、１週間に１回、又は任意の期間及び間隔で投与又は摂取され得る。

以下、本発明を実施例に基づきさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

製造例１キャベツ抽出物の調製
キャベツ・パウダー（抽出部位：葉、こだま食品社より入手）１０ｇに５０％エタノール水溶液１００ｍＬを加え、室温で７日間静置した。その後ろ過を行い、キャベツ抽出物を得た。抽出物の固形分濃度は４．３９％（ｗ／ｖ）であった。

製造例２フェルラ酸の調製
トランス-4-ヒドロキシ-3-メトキシ桂皮酸（アルドリッチ社より入手）を濃度１％（ｗ／ｖ）となるよう９９．５％エタノールに溶解し、フェルラ酸を調製した。

製造例３トコフェロールの調製
イーミックス３５Ｌ（商品名、エーザイフード・ケミカル社製）を濃度１％（ｗ／ｖ）となるよう９９．５％エタノールに溶解し、トコフェロールを調製した。

製造例４キク抽出物の調製
菊花エキスパウダーMF（商品名、抽出部位：花、丸善製薬社製）を濃度１％（ｗ／ｖ）となるように２０％エタノールに溶解し、キク抽出物を調製した。

製造例５ホウレンソウ抽出物の調製
ホウレンソウ・パウダー（抽出部位：葉、こだま食品より入手）１０ｇに５０％エタノール水溶液１００ｍＬを加え、室温で７日間静置した。その後ろ過を行い、ホウレンソウ抽出物を得た。抽出物の固形分濃度は３．６４％（ｗ／ｖ）であった。

製造例６ヤエヤマアオキ抽出物の調製
ノニジュース（エアーグリーン社から入手）を濃度１％（ｖ／ｖ）となるよう１００％エタノールで希釈し、ヤエヤマアオキ抽出物を調製した。

製造例７ジメチルオクテノンの調製
ジメチルオクテノン（ジボダン社から入手）を濃度１％（ｖ／ｖ）となるよう１００％エタノールで希釈し、ジメチルオクテノンを調製した。

試験例１ ENaCの活性化試験
前記製造例１〜７で調製したサンプルを用いたヒトENaCの活性化試験を、特表２００７−５２８７１２号公報に記載の方法に準じて、下記の通り行った。
ヒト腎臓細胞に発現するENaCのαサブユニットをコードするＤＮＡをクローニングしたｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、Pyrobest（商品名）DNA polymerase（タカラバイオ社製）及び下記αサブユニット遺伝子増幅用プライマーを用いてＰＣＲ（Polymerase chain reaction）を行い、ENaCのαサブユニットをコードするｃＤＮＡ断片（αサブユニットPCR増幅断片）を増幅した。
＜αサブユニット遺伝子増幅用プライマー＞
5’側プライマー：5’-CACCATGGAGGGGAACAAGC-3’（配列番号１）
3’側プライマー：5’-GGGCCCCCCCAGAGGACA-3’（配列番号２）

ヒト腎臓細胞に発現するENaCのβサブユニット又はγサブユニットをコードするＤＮＡをクローニングしたｃＤＮＡ（クロンテック社製）を鋳型とし、Advantage 2 polymerase（クロンテック社製）、及び下記βサブユニット遺伝子増幅用プライマー又はγサブユニット遺伝子増幅用プライマーを用いてＰＣＲを行い、ENaCのβサブユニットをコードするｃＤＮＡ断片（βサブユニットPCR増幅断片）及びγサブユニットをコードするｃＤＮＡ断片（γサブユニットPCR増幅断片）をそれぞれ増幅した。
＜βサブユニット遺伝子増幅用プライマー＞
5’側プライマー：5’-ATGCGGTACCATGCACGTGAAGAAGTACCT-3’（配列番号３）
3’側プライマー：5’-GCATCTCGAGTAGATGGCATCACCCTCACT-3’（配列番号４）
＜γサブユニット遺伝子増幅用プライマー＞
5’側プライマー：5’-ATGCAAGCTTATGGCACCCGGAGAGAAGAT-3’（配列番号５）
3’側プライマー：5’-GCATGAATTCCAGAGCTCATCCAGCATCTG-3’（配列番号６）

前記αサブユニットPCR増幅断片をヒト哺乳動物発現ベクターpcDNA3.1（ネオマイシン（neomycin）耐性遺伝子含有、インビトロジェン社製）に、前記βサブユニットPCR増幅断片をヒト哺乳動物発現ベクターpcDNA4（ゼオシン（Zeocin）（商品名）耐性遺伝子含有、インビトロジェン社製）に、前記γサブユニットPCR増幅断片をヒト哺乳動物発現ベクターpcDNA6（ブラストサイジン（Blasticidin）耐性遺伝子含有、インビトロジェン社製）にそれぞれクローニングし、pcDNA3.1／αENaC、pcDNA4／βENaC及びpcDNA6／γENaCを作製した。

HEK293(ヒト胎児腎細胞)を細胞数が１×１０⁵cells/wellになるよう24wellプレートに播種し、３７℃、５％CO₂条件下にて２４時間培養を行った。血清使用量低減培地（商品名：Opti-MEM、インビトロジェン社製）１００μＬに、pcDNA3.1／αENaC ０．３μｇ、pcDNA4／βENaC ０．３μｇ、pcDNA6／γENaC ０．３μｇ、及び遺伝子導入用カチオン性脂質（商品名：lipofectamine 2000、インビトロジェン社製）１μＬを添加し、室温で２０分間インキュベートした。インキュベート後、混合溶液を前記24wellプレートに添加し、３７℃、５％CO₂条件下にて２４時間培養を行った。アミノグリコシド系抗生物質G418（ナカライテスク社製）８００μｇ／ｍＬ、bleomycin系抗生物質ゼオシン（商品名、インビトロジェン社製）１５０μｇ／ｍＬ、ヌクレオシド系抗生物質ブラストサイジン（インビトロジェン社製）６μｇ／ｍＬを含むD-MEM培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium、ギブコ社製）を用いて培地交換を行い、３日間培養後同様の培地で洗浄しさらに培養を行う操作を繰り返し行い、生育した細胞をENaC安定発現株として得た。

ENaC安定発現株及びHEK293をそれぞれ、細胞数が２．０×１０⁴cells/wellになるよう96wellプレート（ベクトン・ディッキンソン社製）に播種して、３７℃、５％CO₂条件下で４８時間培養を行った。培地を除去し、ナトリウムフリーリンガー液（Na free Ringer solution；１５０ｍＭ NMDG-Cl、５ｍＭ KCl、１ｍＭ CaCl₂、１ｍＭ MgCl₂、１０ｍＭグルコース、１０ｍＭ HEPES）で２回洗浄後、ナトリウムフリーリンガー液で調製した１０μＭの蛍光ナトリウムイオン蛍光指示薬（商品名：CoroNa Green、インビトロジェン社製）を添加し、３７℃、５％CO₂環境下で４５分間インキュベートした。
ナトリウムフリーリンガー液で再度２回洗浄した後、製造例１〜７で調製したサンプルを終濃度が0.005体積%となるよう前記96wellに添加し、３７℃、５％CO₂環境下で２０分間インキュベートを行った。その後、培養液に終濃度が１５０ｍＭになるようNaClを添加し、ＦＤＳＳ（Functional Drug Screening System、浜松ホトニクス社製）を用いて細胞内に取り込まれたナトリウムイオンの蛍光強度を測定し、イオン流束を解析した。なお、蛍光強度は、NaCl添加後１秒毎に測定した蛍光強度を、NaCl添加前の蛍光強度を1.0とした場合の相対値として算出し、5分間測定した平均値として表した。

測定した蛍光強度から、下記に示す方法により、ENaC活性を測定した。
ENaC安定発現株に各サンプル及びNaClを添加した場合の相対蛍光強度（Ａ）からHEK293に各サンプル及びNaClを添加した場合の相対蛍光強度（Ｃ）を引いた値を、ENaC安定発現株にNaClのみを添加した場合の相対蛍光強度（Ｂ）からHEK293にNaClのみを添加した場合の相対蛍光強度（Ｄ）を引いた値で割ったものをENaC活性とした（下記式（１）参照）。下記式より得られた数値が１より大きい場合、ナトリウムイオンのイオン流束が増大していること、すなわちENaCの機能が活性化されていることを示す。結果を表１に示す。

表１の結果から明らかなように、製造例１〜７で調製したサンプルそれぞれを添加することにより、蛍光強度が増大し、ENaCが活性化した。
なお、ENaC安定発現株におけるENaC活性のNaCl濃度依存性を検討したところ、２００ｍＭのNaClのENaC活性は、式（１）において、Ｂ及びＤが１５０ｍＭのNaClのみを添加した場合の相対蛍光強度、Ａ及びＣが２００ｍＭのNaClのみを添加したときの相対蛍光強度で表され、2.0相当であった。表１の結果から、キャベツ抽出物、フェルラ酸、トコフェロール、キク抽出物、ホウレンソウ抽出物、ヤエヤマアオキ抽出物及びジメチルオクテノンを添加した場合、ENaC活性は2.0以上であった。したがって、これらの成分は、２００ｍＭのNaClと同等以上のENaC活性効果を有する。

試験例２塩味増強剤の官能評価
７５ｍＭ食塩水(精製塩、ジャパンソルト社製)に、前記製造例で調製したフェルラ酸、ヤエヤマアオキ抽出物、トコフェロール及びキク抽出物をそれぞれ0.005体積%になるよう添加した味溶液を調製した。
３０代の男女３名が、蒸留水１０ｍＬを１０秒間含漱した後に、前記味溶液１０ｍＬを１０秒間口に含み、吐出した。７５ｍＭの食塩水の塩味強度のスコアを５、１５０ｍＭの食塩水の塩味強度のスコアを１０とし、前記味溶液の塩味強度を１０段階で評価した。また、前記味溶液の風味が食塩水に対して変化があったかどうかを評価した。その結果を表２に示す。

表２の結果から明らかなように、本発明の塩味増強剤は、飲食品本来の風味を損なうことなく、塩味を増強する。

試験例３ラット鼓索神経応答試験
Wistarラット（雌、約15週齢のリタイアラット、体重250g程度、日本SLCより入手）に対し、ペントバルビタール(大日本住友製薬社製)65mg/kg及びウレタン(Wako社製)75mg/kgをそれぞれ腹腔内投与し、麻酔導入を行った。その後、気管へカニューレを挿入し呼吸を確保した後、頬部を切開して筋肉を切断した。弓状骨と下顎骨を粉砕し結合組織から離した後、骨の下に存在する鼓索神経を露出させ、神経を電極に固定した。

灌流系にて舌全体へ、20mM食塩水に0〜0.01体積%のフェルラ酸(シグマ社製)を添加した溶液を滴下し、鼓索神経からの信号を記録した。なおフェルラ酸溶液の滴下は、フェルラ酸溶液滴下1分間、水洗浄3分間、静置2分間のサイクルで行った。データは12秒毎の応答のピーク値を1分間測定してその平均値を算出し、0.3M塩化アンモニウムを滴下したときの応答値に対する相対値として示した。その結果を表３に示す。

表３の結果から明らかなように、試験例１で示したようにENaC活性を有する、本発明のENaC活性化剤は、鼓索神経応答増強効果を有する。さらに、濃度依存的に神経応答が増強する。

試験例１〜３の結果は、本発明のENaC活性化剤がENaCを活性化し、これに伴い鼓索神経応答が増強され、飲食品本来の風味を損なうことなく塩味を強化することを示すものである。

Claims

フェルラ酸、トコフェロール及びジメチルオクテノンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする上皮型ナトリウムチャネル活性化剤。
ナトリウムイオンの流束を増大させ、上皮型ナトリウムチャネルの機能を増強する、請求項１記載の上皮型ナトリウムチャネル活性化剤。
フェルラ酸、トコフェロール及びジメチルオクテノンからなる群より選ばれる少なくとも１種を有効成分とする塩味増強剤。