JP2015158470A - 電気泳動に供するための試料の作製方法、並びに、当該試料を用いた電気泳動法およびポリヌクレオチドの定量方法 - Google Patents

Abstract

【課題】コストが低く、短い時間で定量が終了し、様々な種類の核酸の定量が可能であり、かつ、定量の精度が高いポリヌクレオチドの定量方法および電気泳動法、並びに、これらに用いる試料の作製方法を提供する。【解決手段】ポリヌクレオチドおよび蛍光標識された内部標準物質を含むサンプル溶液と、有機溶媒とを混合して、混合後の水相を電気泳動に供する。【選択図】なし

Description

本発明は、電気泳動に供するための試料の作製方法、並びに、当該試料を用いた電気泳動法およびポリヌクレオチドの定量方法に関する。

近年、ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）によって構成された薬剤等の開発が進められている。

このような薬剤を用いて効果的に疾患の治療を行うためには、患者の体内における薬剤の濃度を正確に測定した上で、患者の体内における薬剤の濃度を適切に調節する必要がある。そこで、患者から採取した様々な試料（例えば、血液など）中に存在するポリヌクレオチドを正確に定量するための技術の開発が進められている。

試料中に含まれるポリヌクレオチドの定量には、従来、ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ法が用いられてきた。しかし、質量分析法を利用してポリヌクレオチドを定量しようとすれば、ポリヌクレオチドをイオン化させる際に多価イオンが発生する。それ故に、ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ法では、低濃度のポリヌクレオチドを定量することは困難であり、多くの文献によれば、ＬＣ―ＭＳ／ＭＳ法では、数ｎｇ／ｍＬ以上の濃度のポリヌクレオチドでなければ定量できないことが報告されている（例えば、非特許文献１参照）。

一方、ポリヌクレオチドによって構成された薬剤の血中濃度は数ｎｇ／ｍＬ以下になることがある。それ故に、高感度な定量方法の開発が望まれていた。

高感度な定量方法として、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた定量方法、および、レーザー誘導蛍光検出と組み合わされたキャピラリー電気泳動を用いた定量方法などの開発が進められた。

ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳを用いた定量方法の場合、生体に投与されたポリヌクレオチドと、生体内における当該ポリヌクレオチドの代謝物とを分離するには、イオンペア試薬を移動相に用い、長い時間をかけて分離をする必要があり、スループットの観点から欠点がある。一方、レーザー誘導蛍光検出と組み合わされたキャピラリー電気泳動を用いた定量方法では、生体に投与されたポリヌクレオチドと当該ポリヌクレオチドの代謝物とを短時間で分離できる。

つまり、上述した２種類の定量方法の中では、レーザー誘導蛍光検出と組み合わされたキャピラリー電気泳動を用いた定量方法の方が、短時間で生体内のポリヌクレオチドに関するより詳細なデータが得られるとともに、当該データに基づいたより適切な治療を行うことができる可能性が高い。それ故に、高感度な定量方法の中でも、特に、レーザー誘導蛍光検出と組み合わされたキャピラリー電気泳動を用いた定量方法の開発に注目が集まっている（例えば、非特許文献２〜４参照）。

レーザー誘導蛍光検出と組み合わされたキャピラリー電気泳動を用いた定量方法では、ポリヌクレオチドをキャピラリー電気泳動に供する前に、試料（例えば、血液）からポリヌクレオチドを精製するという作業を行っている。そして、精製されたポリヌクレオチドに対して、当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズする蛍光標識されたプローブ、および、蛍光を示す内部標準物質（例えば、低分子化合物）が加えられた後、当該混合物が、キャピラリー電気泳動に供される。

なお。上記精製を行うための具体的な方法としては、例えば、市販のカラムを用いてポリヌクレオチドを精製する方法、および、エタノール沈殿法によってポリヌクレオチドを精製する方法を挙げることができる。上記精製方法はポリヌクレオチドに特化した処理方法であるため、内部標準物質としてはポリヌクレオチドである必要がある。しかし、上記内部標準物質としてポリヌクレオチドを用いた場合、プローブや試料に対する非特異的なハイブリダイゼーションが起こり、内部標準物質として機能しなくなる。この反応を避けるために、ポリヌクレオチドではなく、低分子化合物が内部標準物質として用いられている。

キャピラリー電気泳動中の混合物には、蛍光標識されたプローブにハイブリダイズしたヌクレオチド、および、蛍光を示す内部標準物質が含まれている。そして、レーザー誘導蛍光検出によって、蛍光標識されたプローブにハイブリダイズしたポリヌクレオチドを検出するとともに、検出されたプローブに由来する蛍光シグナルに基づいて、ポリヌクレオチドの量が算出される。更に、当該算出された量は、内部標準物質に由来する蛍光シグナルに基づいて補正される。

レーザー誘導蛍光検出と組み合わされたキャピラリー電気泳動を用いた定量方法では、以上のようにして、試料（例えば、血液）中に含まれるポリヌクレオチドが定量される。

William D van Dongen and Wilfried MA Niessen, Bioanalysis, 2011, Vol.3, p.541-564 Eunmi Ban et. al., Electrophoresis, 2013, Vol.34, p.598-604 Nasrin Khan et. al., Analytical Chemistry, 2011, Vol.83, p.6196-6201 Svetlana M Krylova et. al., Analytical Chemistry, 2010, Vol.82, p.4428-4433

しかしながら、従来のレーザー誘導蛍光検出と組み合わされたキャピラリー電気泳動を用いた定量方法は、コストが高く、精製に長い時間を要し、特定の種類の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡの何れか一方）の定量に限定され、かつ、内部標準物質を欠いていることにより回収率が反映されない、という問題点を有している。

例えば、上述したように、従来の定量方法では、ポリヌクレオチドをキャピラリー電気泳動に供する前に、市販のカラムを用いた方法またはエタノール沈殿法によって試料（例えば、血液）からポリヌクレオチドを精製するという作業を行っている。

それ故に、従来の定量方法は、精製に用いるカラムなどのためにコストが高くなる、および、精製作業に長い時間が必要になる、という問題点を有している。

また、上述したように、従来の定量方法では、ポリヌクレオチドをキャピラリー電気泳動に供する前に、市販のカラムを用いた方法またはエタノール沈殿法によって試料（例えば、血液）からポリヌクレオチドを精製するという作業を行っている。そして、この精製の過程において、精製されるポリヌクレオチドの種類が、ＤＮＡまたはＲＮＡの何れか一方に限定されることになる。

それ故に、従来の定量方法は、特定の種類の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡの何れか一方）の定量に限定される、という問題点を有している。

また、上述したように、従来の定量方法では、内部標準物質としてポリヌクレオチドを用いた場合、プローブや試料に対する非特異的なハイブリダイゼーションが起こり、内部標準物質として機能しなくなる。この反応を避けるために、ポリヌクレオチドではなく、低分子化合物が内部標準物質として用いられている。

このような内部標準物質を予め試料（例えば、血液）に添加した状態にて、市販のカラムを用いた方法またはエタノール沈殿法によってポリヌクレオチドを精製すると、精製物の中には内部標準物質が存在しない。つまり、精製の過程で、内部標準物質が失われてしまう。それ故に、従来の定量方法では、精製後のポリヌクレオチドに対して、蛍光を示す内部標準物質が加えられた後、当該混合物が、キャピラリー電気泳動に供される。

しかしながら、このような従来の定量方法では、ポリヌクレオチドを精製する過程で発生する誤差（例えば、ポリヌクレオチドの精製効率など）を補正した上で、ポリヌクレオチドの量を決定することが不可能になる（換言すれば、試料をキャピラリー電気泳動装置へ注入するときの誤差しか補正できない）。つまり、従来の定量方法は、測定試料の精製効率と検量線試料の精製効率とが異なる場合、誤ったデータ解釈を引き起こす可能性があるという問題点を有している。

本発明は、上記従来の問題点に鑑みなされたものであって、その目的は、コストが低く、短い時間で定量が終了し、様々な種類の核酸の定量が可能であり、かつ、定量の精度が高いポリヌクレオチドの定量方法および電気泳動法、並びに、これらに用いる試料の作製方法を提供することにある。

本発明者は、上記課題を解決するために検討を重ねた結果、ポリヌクレオチドを定量するための一連の工程（例えば、有機溶媒による精製、電気泳動による泳動、レーザー誘導蛍光検出による検出）において定量対象であるポリヌクレオチドと同等の挙動を示す内部標準物質を用い、ポリヌクレオチドおよび内部標準物質の両方に上述した一連の工程を経させた上で、実測されたポリヌクレオチドの量を内部標準物質に基づいて補正すれば、上述した従来の定量方法が有している問題点を解決できることを見出し、本発明を完成させるに至った。

本発明の電気泳動に供するための試料の作製方法は、上記課題を解決するために、ポリヌクレオチドおよび蛍光標識された内部標準物質を含むサンプル溶液と、有機溶媒とを混合して、混合後の水相を得る工程を含むことを特徴としている。

本発明の電気泳動に供するための試料の作製方法では、上記蛍光標識された内部標準物質は、上記水相を得る工程において、混合後の水相へ移行するものであることが好ましい。

本発明の電気泳動に供するための試料の作製方法では、上記蛍光標識された内部標準物質の全質量に対する、上記水相へ移行する上記蛍光標識された内部標準物質の質量の比率は、上記ポリヌクレオチドの全質量に対する、上記水相へ移行する上記ポリヌクレオチドの質量の比率と略同一であることが好ましい。

本発明の電気泳動に供するための試料の作製方法では、上記蛍光標識された内部標準物質の全質量に対する、上記水相へ移行する上記蛍光標識された内部標準物質の質量の比率をＡ（％）とし、上記ポリヌクレオチドの全質量に対する、上記水相へ移行する上記ポリヌクレオチドの質量の比率をＢ（％）としたとき、上記Ａ（％）は、０．５０×Ｂ（％）〜１．５０×Ｂ（％）であることが好ましい。

本発明の電気泳動に供するための試料の作製方法では、上記蛍光標識された内部標準物質は、フルオレセイン若しくはフルオレセイン骨格を有する類縁体（例えば、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ローダミン）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）若しくはＤｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ骨格を有する類縁体、蛍光標識されたヌクレオチド、蛍光標識されたデオキシヌクレオチド、または、蛍光標識されたポリヌクレオチドであることが好ましい。

本発明の電気泳動に供するための試料の作製方法では、上記蛍光標識された内部標準物質は、蛍光標識されたヌクレオチド、または、蛍光標識されたデオキシヌクレオチドであることが好ましい。

本発明の電気泳動に供するための試料の作製方法では、上記蛍光標識されたヌクレオチド、および、蛍光標識されたデオキシヌクレオチドは、アデノシン三リン酸、シチジン三リン酸、チミジン三リン酸、グアノシン三リン酸、ウリジン三リン酸、アデノシン二リン酸、シチジン二リン酸、チミジン二リン酸、グアノシン二リン酸、ウリジン二リン酸、アデノシン一リン酸、シチジン一リン酸、チミジン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、または、これらの類縁体が蛍光標識されたものであることが好ましい。

本発明の電気泳動に供するための試料の作製方法では、上記蛍光標識された内部標準物質は、４７０ｎｍ〜７００ｎｍの波長で蛍光を示すものであることが好ましい。

本発明の電気泳動に供するための試料の作製方法では、上記有機溶媒は、フェノールを含む有機溶媒であることが好ましい。

本発明の電気泳動に供するための試料の作製方法では、上記水相が、電気泳動に供される試料であることが好ましい。

本発明の電気泳動法は、上記課題を解決するために、本発明の電気泳動に供するための試料の作製方法にて作製された試料を用いることを特徴としている。

本発明のポリヌクレオチドの定量方法は、上記課題を解決するために、本発明の電気泳動法を用いることを特徴としている。

本発明の装置は、上記課題を解決するために、本発明の方法にて作製された試料の分離分析を行うことを特徴としている。

本発明の装置は、電気泳動装置であることが好ましい。

本発明は、レーザー誘導蛍光検出法と組み合わされた電気泳動法を用いてポリヌクレオチドを定量する。それ故に、本発明によれば、微量のポリヌクレオチドを定量することができるという効果を奏する。

従来の定量方法では、ポリヌクレオチドの精製に、数時間を要していた。一方、本発明では、これらに対応する作業を、数十分で行うことが可能である。それ故に、本発明によれば、ポリヌクレオチドの定量に要する時間を大幅に削減することができるという効果を奏する。

本発明は、ポリヌクレオチドを精製するためのカラム等を必要としない。それ故に、本発明によれば、ポリヌクレオチドの定量にかかる費用を大幅に削減することができるという効果を奏する。

従来の定量方法では、定量するポリヌクレオチドの種類（ＤＮＡまたはＲＮＡ）に応じて、ヌクレオチドを精製する方法を選択する必要があった。一方、本発明では、簡易な方法で精製した精製物であって、何れの種類のポリヌクレオチドをも含み得る精製物を用いて定量を行う。それ故に、本発明では、同じ方法によって、何れの種類のポリヌクレオチド（ＤＮＡおよびＲＮＡ）をも定量することができるという効果を奏する。

本発明は、定量対象であるポリヌクレオチドおよび内部標準物質が混在する溶液と有機溶媒とを混合して水相を得た後、当該水相に定量対象に対して相補的な蛍光標識されたポリヌクレオチドを加え、蛍光標識されたポリヌクレオチドとハイブリダイゼーションした定量対象を含む溶液を電気泳動へ供する。そして、実測されたポリヌクレオチドの量（濃度）を、内部標準物質を基準として補正する。つまり、補正後のポリヌクレオチドの量は、電気泳動における誤差（例えば、サンプルを分析装置へ注入するときに生じる注入量の誤差など）のみならず、ポリヌクレオチドを精製（例えば、有機溶媒を用いた抽出）するときに生じる精製効率の誤差をも補正された値となる。それ故に、本発明によれば、測定試料の精製効率と、検量線の作製に用いた試料の精製効率とが若干異なっていたとしても、ポリヌクレオチドの量を精度よく決定することができるという効果を奏する。

本発明の実施例における、ＣＥ−ＬＩＦによる、２１塩基からなるＤＮＡとプローブ１とをハイブリダイズさせた試料の検出結果を示すクロマトグラムである。 本発明の実施例における、ＣＥ−ＬＩＦによる、２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡとプローブ２とをハイブリダイズさせた試料の検出結果を示すクロマトグラムである。

本発明は、以下に説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。

また、本明細書にて「Ａ〜Ｂ」と記載した場合、当該記載は「Ａ以上Ｂ以下」を意図するものとする。

〔１．電気泳動へ供するための試料の作製方法〕
本実施の形態の電気泳動（例えば、レーザー誘導蛍光検出と組み合わされた電気泳動（例えば、レーザー誘導蛍光検出と組み合わされたキャピラリー電気泳動））へ供するための試料の作製方法は、ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）および蛍光標識された内部標準物質とを含むサンプル溶液と、有機溶媒とを混合して、混合後の水相を得る工程を含んでいる。サンプル溶液と有機溶媒とを混合すれば、当該有機溶媒を主成分とする有機相と、水相とが分離する。そして、当該水相にはポリヌクレオチドおよび内部標準物質の両方が含まれており、当該水相が、電気泳動へ供するための試料となる。つまり、上記水相は、アルコール沈殿（例えば、エタノールまたはイソプロパノールなどのアルコールを用いた沈殿）の処理を受ける事無く、当該水相が、電気泳動へ供されることになる。

換言すれば、本実施の形態の電気泳動へ供するための試料の作製方法は、水相に対して濃縮処理（例えば、アルコール沈殿処理）を行う事の無い、電気泳動へ供するための試料の作製方法である。

上記電気泳動の具体的な形態は特に限定されず、例えば、キャピラリー電気泳動、または、板状のゲルを用いた電気泳動であってもよい。

なお、本明細書において「ヌクレオチド」とは、ヌクレオシドにリン酸基がエステル結合したものを意図する。「ヌクレオシド」とは、プリン塩基またはピリミジン塩基と糖とが結合したものを指し、プリン塩基はプリン塩基の修飾体であってもよく、ピリミジン塩基はピリミジン塩基の修飾体であってもよく、糖は糖の修飾体であってもよい。

本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、同一または異なるヌクレオシドが、リン酸ジエステル結合を介して連なったものを意図する。リン酸ジエステル結合の部分は、チオエート化されていてもよい。また、本明細書における「ポリヌクレオチド」には、ＤＮＡまたはＲＮＡによって構成されたポリヌクレオチドが包含され、単に核酸という場合もある。また、本明細書における「ポリヌクレオチド」は、２個以上のヌクレオチドが連結しているポリマーを意図し、ポリマーを構成するヌクレオチドの数の上限値は限定されない。

本明細書において「オリゴヌクレオチド」とは、ポリヌクレオチドの中でも、特に２個以上１００個未満のヌクレオチドが連結しているポリマーを意図する。

上記サンプル溶液は、少なくとも、定量対象であるポリヌクレオチドと内部標準物質とを含んでいればよく、具体的な構成は特に限定されない。

例えば、所望の水溶液（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）に対してポリヌクレオチドおよび内部標準物質を加えることによってサンプル溶液を作製することができる。

あるいは、生体試料（例えば、細胞、組織、尿、糞便、血液、喀痰、膿汁、微生物、ウイルス、培養液など）、または、工業製品（例えば、飲料水、食品、医薬品、化粧品）を液状化した上で、当該液状化された生体試料または工業製品に対して内部標準物質を加えることによってサンプル溶液を作製することができる。この場合には、生体試料または工業製品中に含有されているポリヌクレオチドが、定量対象となる。

上記生体試料の由来は特に限定されず、ヒトであってもよいし、非ヒト動物であってもよいし、ヒトを除く脊椎動物（例えば、ブタ、ウシ、ヒツジ、ニワトリなど）であってもよいし、微生物であってもよいし、ウイルスであってもよい。

生体試料または工業製品を液状化する方法は特に限定されないが、例えば、生体試料または工業製品に対して所望の水溶液（例えば、蒸留水、生理的食塩水、リン酸緩衝液、トリス緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）を加えてもよいし、生体試料または工業製品に対して所望の水溶液を加えた上で、ミキサー等で固形物を破砕してもよい。

上記蛍光標識された内部標準物質は、上記水相を得る工程において、混合後の水相へ移行するものであればよい。上記構成によれば、電気泳動へ供するための試料中に、ポリヌクレオチドおよび蛍光標識された内部標準物質の両方が存在するので、当該内部標準物質に基づいて、実測されたポリヌクレオチドの量を正確に補正することができる。

更に具体的に、蛍光標識された内部標準物質の全質量（換言すれば、水相に含まれている内部標準物質の質量と、有機相に含まれている内部標準物質の質量との合計）に対する、水相へ移行する蛍光標識された内部標準物質の質量の比率は、ポリヌクレオチドの全質量（換言すれば、水相に含まれているポリヌクレオチドの質量と、有機相に含まれているポリヌクレオチドの質量との合計）に対する、上記水相へ移行する上記ポリヌクレオチドの質量の比率と、略同一であってもよい。勿論、上記２つの比率は、同一であってもよい。

例えば、蛍光標識された内部標準物質の全質量に対する、水相へ移行する蛍光標識された内部標準物質の質量の比率をＡ（％）とし、ポリヌクレオチドの全質量に対する、上記水相へ移行する上記ポリヌクレオチドの質量の比率をＢ（％）とする。

この場合、上記Ａ（％）は、０．５０×Ｂ（％）〜１．５０×Ｂ（％）であることが好ましく、０．６０×Ｂ（％）〜１．４０×Ｂ（％）であることが更に好ましく、０．７０×Ｂ（％）〜１．３０×Ｂ（％）であることが更に好ましく、０．８０×Ｂ（％）〜１．２０×Ｂ（％）であることが更に好ましく、０．９０×Ｂ（％）〜１．１０×Ｂ（％）であることが好ましく、０．９１×Ｂ（％）〜１．０９×Ｂ（％）であることが更に好ましく、０．９２×Ｂ（％）〜１．０８×Ｂ（％）であることが更に好ましく、０．９３×Ｂ（％）〜１．０７×Ｂ（％）であることが更に好ましく、０．９４×Ｂ（％）〜１．０６×Ｂ（％）であることが更に好ましく、０．９５×Ｂ（％）〜１．０５×Ｂ（％）であることが更に好ましく、０．９６×Ｂ（％）〜１．０４×Ｂ（％）であることが更に好ましく、０．９７×Ｂ（％）〜１．０３×Ｂ（％）であることが更に好ましく、０．９８×Ｂ（％）〜１．０２×Ｂ（％）であることが更に好ましく、０．９９×Ｂ（％）〜１．０１×Ｂ（％）であることが更に好ましく、１．００×Ｂ（％）であることが最も好ましい。

上記蛍光標識された内部標準物質は、上記水相を得る工程において、混合される前のサンプル溶液に含まれる内部標準物質の１０重量％以上が、より好ましくは２０重量％以上が、より好ましくは３０重量％以上が、より好ましくは４０重量％以上が、より好ましくは５０重量％以上が、より好ましくは６０重量％以上が、より好ましくは６７重量％以上が、より好ましくは７０重量％以上が、より好ましくは８０重量％以上が、より好ましくは８１重量％以上が、より好ましくは９０重量％以上が、より好ましくは９５重量％以上が、混合後の水相へ移行するものであることが好ましい。

ポリヌクレオチドは、有機相ではなく、水相へ移行する。それ故に、ポリヌクレオチドと同等に水相へ移行する内部標準物質、換言すれば、水相へ移行する割合が高い内部標準物質であるほど、より精度高くポリヌクレオチドを定量することができる。

上記蛍光標識された内部標準物質は、フルオレセイン若しくはフルオレセイン骨格を有する類縁体（例えば、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ローダミン）、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）若しくはＤｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ骨格を有する類縁体、蛍光標識されたヌクレオチド、蛍光標識されたデオキシヌクレオチド、または、蛍光標識されたポリヌクレオチドであってもよい。これらの中では、蛍光標識されたヌクレオチド、または、蛍光標識されたデオキシヌクレオチドを用いることが好ましい。

なお、「フルオレセイン骨格」とは、３Ｈ−キサンテン骨格の９位にベンゼン環が結合した骨格を意図する。上記「フルオレセイン骨格を有する類縁体」は、キサンテン骨格内の酸素原子が、炭素原子、ケイ素原子、ゲルマニウム原子、スズ原子、または、鉛原子に置換された化合物があり得る。

また、上記「Ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ骨格を有する類縁体」は、Ｄｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ骨格を有する化合物が意図され、具体例として、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ（登録商標）、および、ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ（登録商標）を挙げることができる。

蛍光標識されたヌクレオチド、および、蛍光標識されたデオキシヌクレオチドは、定量対象であるポリヌクレオチドと分子構造が似ているので、ポリヌクレオチドを定量するための一連の工程（例えば、有機溶媒による精製、電気泳動による泳動、レーザー誘導蛍光検出による検出）において、定量対象であるポリヌクレオチドと同等の挙動を示す。それ故に、上記構成であれば、より精度高くポリヌクレオチドを定量することができる。

また、蛍光標識されたヌクレオチド、および、蛍光標識されたデオキシヌクレオチドは、定量対象であるポリヌクレオチド、および、当該ポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブに対して、非特異的に結合することがない。それ故に、上記構成であれば、より精度高くポリヌクレオチドを定量することができる。

上記蛍光標識されたヌクレオチドの具体的な構成は特に限定されないが、ヌクレオチド（例えば、アデノシン三リン酸、シチジン三リン酸、チミジン三リン酸、グアノシン三リン酸、ウリジン三リン酸、アデノシン二リン酸、シチジン二リン酸、チミジン二リン酸、グアノシン二リン酸、ウリジン二リン酸、アデノシン一リン酸、シチジン一リン酸、チミジン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、若しくは、これらの類縁体）、または、デオキシヌクレオチドが蛍光標識されたものであり得る。

上記類縁体としては、以下のものを挙げることができる。つまり、
（ｉ）リン酸ジエステル結合部分が、チオエート、ジチオエート、アミデート、ホルムアセタール、３’−アミン、カルバメート、または、ボラノフォスフェートによって修飾されたヌクレオチド。

（ｉｉ）ヌクレオチド内の糖部分の修飾は特に限定されないが、例えば、２’位、３’位、４’位、および／または、５’位の酸素原子が他の原子に置換されたヌクレオチド。

例えば、ハロゲン化、Ｏ−アルキル化（例えば、Ｏ−メチル化、Ｏ−エチル化、Ｏ−メトキシエチル化、Ｏ−アリル化）、Ｏ−アリール化、Ｓ−アルキル化（例えば、Ｓ−メチル化、Ｓ−エチル化、Ｓ−アリル化）、Ｓ−アリール化、または、アミノ化（−ＮＨ_２）されたヌクレオチド。なお、「アリール」とは、共役π電子系を有する環を少なくとも１つ有する芳香族の基を指し、炭素環式アリール、複素環式アリール及び二アリール基を含み、そのいずれもが場合により置換されていてもよい。アリール基に付く好ましい置換基は、ハロゲン、トリハロメチル、ヒドロキシル、ＳＨ、シアノ、アルコキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル及びアミノ基を挙げることできる。

（ｉｉｉ）４’位の酸素原子が硫黄に置換されたヌクレオチド、２’位と４’位とがメチレンを介して修飾されたヌクレオチド、３’位と４’位とがメチレンを介して修飾されたヌクレオチド、３’位または５’位の水酸基がアミノ基に置換されたヌクレオチド、５’位の水酸基がアミノ基へ置換されるとともに３’位と５’位とがメチレンを介して修飾されたヌクレオチド、糖部分がリボースから他の糖（例えば、グリセロール、シクロヘキセン、または、スレオース）に置換されたヌクレオチド。

（ｉｖ）ヌクレオチド内の塩基の修飾は特に限定されないが、例えば、５位ピリミジン改変、６位、７位および／または８位プリン改変（例えばＯ−メチル修飾）を受けたヌクレオチド、環外アミンでの改変を受けたヌクレオチド、４−チオウリジンへの置換が施されたヌクレオチド、５−ブロモ修飾されたヌクレオチド、５−ヨードウラシル修飾されたヌクレオチド、５−メチルシトシン修飾されたヌクレオチド。

内部標準物質を蛍光標識する方法は特に限定されないが、例えば、周知の方法によって、市販の蛍光色素（例えば、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ａｌｅｘａ４８８（登録商標）など）を所望の内部標準物質へ連結させればよい。

上記蛍光色素としては、ポリヌクレオチドの定量に用いるプローブの標識に用いられる蛍光色素と同じものを用いることが好ましい。換言すれば、蛍光標識された内部標準物質と、ポリヌクレオチドの定量に用いられる蛍光標識されたプローブとは、同じ波長で蛍光を示すものであることが好ましい。

上記構成によれば、ポリヌクレオチドの定量時に、蛍光標識された内部標準物質と、蛍光標識されたプローブとを、簡便な装置によって同時に検出および定量することができる。

例えば、上記蛍光標識された内部標準物質は、４７０ｎｍ〜７００ｎｍ（例えば、５２０ｎｍ、５６０ｎｍ、６５５ｎｍ、または、６７５ｎｍ）の波長において蛍光を示すものであってもよい。勿論、上記蛍光標識された内部標準物質は、上述した波長以外において蛍光を示すものであってもよい。

上記サンプル溶液は、タンパク質変性剤（具体的には、ドデシル硫酸ナトリウム、または、プロテアーゼ）を含んでいてもよい。上記構成によれば、定量を阻害するタンパク質の活性を低下、または、定量を阻害するタンパク質を除去することができるので、より精度高くポリヌクレオチドを定量することができる。

サンプル溶液中におけるタンパク質変性剤の濃度としては特に限定されないが、例えば、１．５％（ｗ／ｖ）〜２％（ｗ／ｖ）であってもよい。上記構成によれば、定量を阻害することなく、より精度高くポリヌクレオチドを定量することができる。

上記サンプル溶液は、ハイブリダイゼーションバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ａｃｅｔａｔｅ（ｐＨ８．０）、５０ｍＭ 塩化ナトリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ）を含んでいてもよい。当該構成によれば、最適な塩濃度およびｐＨにて、ハイブリダイゼーションを行うことができる。

サンプル溶液の精製に用いる有機溶媒としては特に限定されず、例えば、フェノールを含む有機溶媒であり得る。例えば、有機溶媒としては、「フェノール」、「フェノールとクロロホルムとの混合物」、「フェノールとイソアミルアルコールとの混合物」、または、「フェノールとクロロホルムとイソアミルアルコールとの混合物」を用いることが可能である。

上記有機溶媒のｐＨは特に限定されないが、例えば、ｐＨ７〜ｐＨ８であることが好ましく、ｐＨ８．０程度が最も好ましい。上記構成によれば、ＤＮＡおよびＲＮＡの両方を、同等に水相へ移行させることができ、その結果、同じ方法にてＤＮＡおよびＲＮＡの両方を定量することができる。

〔２．電気泳動法〕
本実施の形態の電気泳動法は、本発明の電気泳動へ供するための試料の作製方法にて作製された試料を用いる方法である。

電気泳動の具体的な形態は特に限定されず、例えば、キャピラリー電気泳動、または、板状のゲルを用いた電気泳動であってもよい。

分離に用いるゲルとしては特に限定されず、適宜、市販のゲル（例えば、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲルなど）を用いることが可能である。

また、電気泳動は、市販の電気泳動装置を用いて行うことが可能である。

〔３．ポリヌクレオチドの定量方法〕
本実施の形態のポリヌクレオチドの定量方法は、本発明の電気泳動法を用いればよく、その具体的な構成は、特に限定されない。

例えば、本実施の形態のポリヌクレオチドの定量方法は、本発明の電気泳動法と、周知のレーザー誘導蛍光検出とを組み合わせて構成することも可能である。

以下に、本実施の形態のポリヌクレオチドの定量方法の一例を示すが、本発明は、以下の構成に限定されない。

本実施の形態のポリヌクレオチドの定量方法は、上述した本発明の方法にて作製された電気泳動に供するための試料へ、上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズする蛍光標識されたプローブを加えて混合物を作製する混合工程と、上記混合物を電気泳動に供するとともに、該電気泳動中に、上記蛍光標識された内部標準物質に由来する蛍光シグナルと、上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブに由来する蛍光シグナルと、を検出する検出工程と、上記蛍光標識された内部標準物質に由来する蛍光シグナルのエリア値に対する上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブに由来する蛍光シグナルのエリア値の比と、予め作製されている検量線とに基づいて、上記サンプル溶液中に含まれるポリヌクレオチドの量を算出する算出工程と、を含んでいる。

以下に、各工程について説明する。なお、〔１．電気泳動へ供するための試料の作製方法〕の欄にて既に説明した構成については、以下ではその説明を省略する。

〔３−１．混合工程〕
混合工程は、本発明の方法にて作製された電気泳動に供するための試料へ、ポリヌクレオチドにハイブリダイズする蛍光標識されたプローブを加えて混合物を作製する工程である。本発明では、当該混合工程において、ポリヌクレオチドとプローブとがハイブリダイズすることになる。

上記プローブは、ポリヌクレオチドにハイブリダイズするものであればよく、その具体的な構成は特に限定されない。

例えば、上記プローブとして、定量対象であるポリヌクレオチドに相補的なＤＮＡまたはＲＮＡを用いることができる。更に具体的に、上記プローブは、定量対象であるポリヌクレオチドの全長または部分長に対して相補的なＤＮＡまたはＲＮＡを用いることができる。

プローブを蛍光標識する方法は特に限定されないが、例えば、周知の方法によって、市販の蛍光色素（例えば、フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、Ａｌｅｘａ４８８（登録商標）など）を所望のプローブへ連結させればよい。

上記蛍光色素としては、上述した内部標準物質の標識に用いられる蛍光色素と同じものを用いることが好ましい。換言すれば、蛍光標識された内部標準物質と、蛍光標識されたプローブとは、同じ波長で蛍光を示すものであることが好ましい。

上記構成によれば、ポリヌクレオチドの定量時に、蛍光標識された内部標準物質と、蛍光標識されたプローブとを、簡便な装置によって同時に検出および定量することができる。

例えば、上記蛍光標識されたプローブは、４７０ｎｍ〜７００ｎｍ（例えば、５２０ｎｍ、５６０ｎｍ、６５５ｎｍ、または、６７５ｎｍ）の波長において蛍光を示すものであってもよい。勿論、上記蛍光標識されたプローブは、上述した波長以外において蛍光を示すものであってもよい。

当該混合工程における混合物の温度は特に限定されないが、非特異的なハイブリゼーションを阻害できる温度に設定することも可能である。この場合、プローブの塩基配列に応じて当該温度を設定すればよい。具体的には、プローブの塩基数、プローブのＧＣ含量、プローブのＴｍ値などに基づいて設定することが可能である。

例えば、４４℃〜４８℃に設定することも可能であり、５２℃〜６０℃に設定することも可能である。勿論、本発明は、当該温度に限定されない。

〔３−２．検出工程〕
検出工程は、上述した混合物を電気泳動に供するとともに、該電気泳動中に、蛍光標識された内部標準物質に由来する蛍光シグナルと、ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブに由来する蛍光シグナルと、を検出する工程である。

電気泳動、および、レーザー誘導蛍光検出の具体的な方法は特に限定されず、適宜、市販の装置と、当該装置に添付のプロトコールとを用いて行えばよい。

〔３−３．算出工程〕
算出工程は、蛍光標識された内部標準物質に由来する蛍光シグナルのエリア値に対するポリヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブに由来する蛍光シグナルのエリア値の比と、予め作製されている検量線とに基づいて、初発の試料であるサンプル溶液中に含まれるポリヌクレオチドの量を算出する工程である。

つまり、算出工程では、まず、最終的に検出される内部標準物質の量に対する最終的に検出されるポリヌクレオチドの量の比が計算されることになる。そして、当該比を、予め作製されている検量線の関数（例えば、初発の試料であるサンプル溶液中に含まれるポリヌクレオチドの濃度（既知の濃度）と、比（実際に測定された蛍光シグナルのエリア値から算出した比）との関係を示す関数）へ代入することによって、初発の試料であるサンプル溶液中に含まれるポリヌクレオチドの量が算出される。

この時、上述した比と検量線とを用いて初発の試料であるサンプル溶液中に含まれるポリヌクレオチドの量が算出されるので、ポリヌクレオチドを定量するための一連の工程（例えば、有機溶媒による精製、電気泳動による泳動、レーザー誘導蛍光検出による検出）で発生する様々な誤差が補正された状態で、初発の試料であるサンプル溶液中に含まれるポリヌクレオチドの量が算出されることになる。その結果、より精度高くポリヌクレオチドを定量することができる。

なお、蛍光シグナルは、蛍光の測定時間に対して、当該時間における蛍光強度がプロットされたクロマトグラム（換言すれば、クロマトグラム中のピーク）として示され得る（例えば、図１および２参照）。そして「蛍光シグナルのエリア値」とは、当該ピークと、蛍光強度のベースラインとで囲まれた領域の面積が意図される。

上記検量線の具体的な構成は特に限定されないが、例えば、既知の濃度のポリヌクレオチドおよび既知の濃度の蛍光標識された内部標準物質を含むサンプル溶液を用いて得られる、蛍光標識された内部標準物質に由来する蛍光シグナルのエリア値に対する上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブに由来する蛍光シグナルのエリア値の比と、上記ポリヌクレオチドの既知の濃度との、関数であってもよい。以下に、当該検量線の作製方法について更に説明する。

まず、様々な濃度であって、かつ、既知の濃度のポリヌクレオチドと、一定の濃度の蛍光標識された内部標準物質と、を含む複数のサンプル溶液を作製する。

次いで、当該複数のサンプル溶液を、上述した混合工程および検出工程にかけて、各サンプル溶液について、蛍光標識された内部標準物質に由来する蛍光シグナルと、ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブに由来する蛍光シグナルと、を検出する。そして、蛍光標識された内部標準物質に由来する蛍光シグナルのエリア値に対するポリヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブに由来する蛍光シグナルのエリア値の比を算出する。

以上により、初発の試料であるサンプル溶液の各々に関して、サンプル溶液中のポリヌクレオチドの既知の濃度と、実際に測定された比との対応関係が明らかになる。

次いで、上記ポリヌクレオチドの既知の濃度をＸ軸、上記比をＹ軸として、各サンプル溶液のデータをＸＹ平面上にプロットする。

更に、周知の方法（例えば、最小二乗法など）によって上記データに近似する関数（例えば、Ｙ＝ａＸ＋ｂ、ａおよびｂは、実験によって決定される定数）を特定し、当該関数を検量線として用いることができる。

実際の定量では、算出工程において、実際に測定されたデータに基づいて比（Ｙの値）が決定されるので、当該比を上述した関数に代入すれば、ポリヌクレオチドを定量するための一連の工程（例えば、有機溶媒による精製、電気泳動による泳動、レーザー誘導蛍光検出による検出）で発生する様々な誤差が補正された状態で、初発の試料であるサンプル溶液中のポリヌクレオチドの量（濃度）が算出されることになる。

なお、以上に検量線の一例を説明したが、本発明は、勿論当該検量線に限定されず、適宜、所望の検量線を用いることが可能である。

本実施の形態のポリヌクレオチドの定量方法は、以下のように構成することが可能である。

実施の形態のポリヌクレオチドの定量方法は、本発明の方法にて作製された電気泳動に供するための試料へ、上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズする蛍光標識されたプローブを加えて混合物を作製する混合工程と、上記混合物を電気泳動に供するとともに、該電気泳動中に、上記蛍光標識された内部標準物質に由来する蛍光シグナルと、上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブに由来する蛍光シグナルと、を検出する検出工程と、上記蛍光標識された内部標準物質に由来する蛍光シグナルのエリア値に対する上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブに由来する蛍光シグナルのエリア値の比と、予め作製されている検量線とに基づいて、上記サンプル溶液中に含まれるポリヌクレオチドの量を算出する算出工程と、を含み得る。

上記検量線は、既知の濃度の上記ポリヌクレオチドおよび上記蛍光標識された内部標準物質を含むサンプル溶液を用いて得られる、上記蛍光標識された内部標準物質に由来する蛍光シグナルのエリア値に対する上記ポリヌクレオチドにハイブリダイズしたプローブに由来する蛍光シグナルのエリア値の比と、上記既知の濃度との、関数であってもよい。

上記蛍光標識されたプローブは、４７０ｎｍ〜７００ｎｍ（例えば、５２０ｎｍ、５６０ｎｍ、６５５ｎｍ、または、６７５ｎｍ）の波長で蛍光を示すものであってもよい。

〔４．装置〕
本実施の形態の装置は、本発明の電気泳動へ供するための試料の作製方法によって作製された試料の分離分析を行うことを特徴としている。換言すれば、本実施の形態の装置は、本発明の電気泳動へ供するための試料の作製方法を用いて、試料の分離分析を行うことを特徴としている。

上記構成によれば、微量のポリヌクレオチドを、短時間にて、低コストにて、かつ、高精度にて、分離分析することができる。また、上記構成によれば、同じ構成の装置を用いて、ＤＮＡおよびＲＮＡの各々を分離分析することができる。

本実施の形態の装置は、例えば、電気泳動装置であり得る。

本実施の形態の装置の具体的な構成は特に限定されないが、例えば、本発明の電気泳動へ供するための試料の作製方法を実施するための構成、換言すれば、本発明の電気泳動へ供するための試料の作製方法にしたがって試料を作製するための試料作製部を備えていてもよい。

また、本実施の形態の装置は、上記試料作製部を備えること無く、本発明の電気泳動へ供するための試料の作製方法にしたがって作製された試料を装置内へ導入するための試料導入部を備えていてもよい。

上記試料作製部は、例えば、ポリヌクレオチドおよび蛍光標識された内部標準物質を含むサンプル溶液と有機溶媒とを混合するための混合部、および、混合後の水相を回収するための回収部を備え得る。

上記混合部は、例えば、サンプル溶液と有機溶媒とを収容するための容器、および、当該容器内のサンプル溶液と有機溶媒とを混合するためのブレード、を備えるものであってもよい。

上記容器およびブレードは特に限定されず、適宜、周知の容器およびブレードを用いることができる。例えば、上記容器およびブレードは、有機溶媒によって劣化しない材料によって形成されているものであることが好ましい。

また、上記混合部は、例えば、サンプル溶液と有機溶媒とを収容するための容器、および、当該容器を振動させるための振動部（例えば、当該容器に対して、上下方向への運動、左右方向への運動、および／または、回転運動を生じさせる振動部）、を備えるものであってもよい。

上記容器および振動部の具体的な構成は特に限定されず、周知の容器および振動部を用いることができる。例えば、上記容器は、有機溶媒によって劣化しない材料によって形成されているものであることが好ましい。

上記回収部は、水相を回収できるものであればよく、具体的な構成は、特に限定されない。例えば、上記回収部は、各種注射器であってもよい。混合部にて混合された溶液を所定の時間静置すれば、水相と有機相とに分離する。そして、各種注射器によって、水相のみを回収すればよい。この場合、各種注射器によって回収された水相を、装置内に配置されている電気泳動用のゲルへ供すればよい。

上記試料導入部は、本発明の電気泳動へ供するための試料の作製方法にしたがって作製された試料を装置内へ導入することができるものであればよい。

例えば、試料導入部は、装置の表面に設けられた開口、および、当該開口から装置内に導入された試料を格納するための格納部（換言すれば、空間）を備えていてもよい。

この場合、上記格納部が、装置内に配置されている電気泳動用のゲルへと連結されており、当該格納部に格納された試料が、電気泳動用のゲルに供されてもよい。

本実施の形態の装置は、４７０ｎｍ〜７００ｎｍの波長の蛍光を検出するための検出部を備えていてもよい。

上記検出部の具体的な構成は特に限定されず、適宜、周知の検出機器を検出部として用いることができる。

本実施の形態の装置は、上述した構成以外に、周知の装置、または、周知の電気泳動装置が備えている各種構成を備えることも可能である。

〔実施例１〕ＤＮＡの精製
１６０μＬのヒト血漿に、２０％（ｗ／ｖ）の濃度にてＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）を含む水溶液を２０μＬ添加して、ヒト血漿に含まれる成分が可溶化された水溶液を作製した。

２１塩基からなるＤＮＡ（Integrated DNA Technologies, Inc）をＴＥ溶液（ｐＨ８．０（ナカライテスク株式会社））に溶解し、当該水溶液を、更にハイブリダイゼーションバッファーで希釈して、２１塩基からなるＤＮＡを含む水溶液を作製した。なお、当該ＤＮＡの塩基配列は、以下のとおりである。つまり、
ＤＮＡ：５’−ＧＣＧＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＣＧ−３’・・・・（配列番号１）。

ヒト血漿に含まれる成分が可溶化された水溶液に対して、２１塩基からなるＤＮＡを含む水溶液を１０μＬ添加し、更に、内部標準物質であるフルオレセインを５００ｎＭの濃度にて含む水溶液を１０μＬ添加して、混合溶液を作製した。

上記混合溶液に対して、ＴＥ溶液（ｐＨ８．０）にて飽和された有機溶媒の混合物（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）（Sigma-Aldrich Co. LLC.）を２００μＬ添加し、撹拌および混合した後、室温で１００００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。

遠心分離によって分離された上清９０μＬを回収して、ＤＮＡを含有する試料溶液とした。

〔実施例２〕ｍｉｃｒｏＲＮＡの精製
１６０μＬのヒト血漿に、２０％（ｗ／ｖ）の濃度にてＳＤＳを含む水溶液を２０μＬ添加して、ヒト血漿に含まれる成分が可溶化された水溶液を作製した。

２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡ（Integrated DNA Technologies, Inc）をＴＥ溶液（ｐＨ８．０（ナカライテスク株式会社））に溶解し、当該水溶液を、更にハイブリダイゼーションバッファーで希釈して、２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡを含む水溶液を作製した。なお、当該ｍｉｃｒｏＲＮＡの塩基配列は、以下のとおりである。つまり、
ｍｉｃｒｏＲＮＡ：５’−ＵＵＡＡＧＡＣＵＵＧＣＡＧＵＧＡＵＧＵＵＵ−３’・・・・（配列番号２）。

ヒト血漿に含まれる成分が可溶化された水溶液に対して、２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡを含む水溶液を１０μＬ添加し、更に、内部標準物質であるＢＯＤＩＰＹ（登録商標） ＦＬ ＡＴＰ（Life Technologies Corporation.）を５００ｎＭの濃度にて含む水溶液を１０μＬ添加して、混合溶液を作製した。

上記混合溶液に対して、ＴＥ溶液（ｐＨ８．０）にて飽和された有機溶媒の混合物（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）（Sigma-Aldrich Co. LLC.）を２００μＬ添加し、撹拌および混合した後、室温で１００００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。

遠心分離によって分離された上清９０μＬを回収して、ｍｉｃｒｏＲＮＡを含有する試料溶液とした。

〔実施例３〕プローブと、ＤＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡとのハイブリダイゼーション反応
実施例１に記載した２１塩基からなるＤＮＡに対して相補的な３’−ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチド（以下、オリゴヌクレオチド１と呼ぶ）、および、実施例２に記載した２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡに対して相補的な３’−ＦＡＭ標識オリゴヌクレオチド（以下、オリゴヌクレオチド２と呼ぶ）をＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃより購入した（ＦＡＭ：Ｅｘ／Ｅｍ＝４８８ｎｍ／５２０ｎｍ）。なお、各オリゴヌクレオチドの塩基配列は、以下のとおりである。つまり、
オリゴヌクレオチド１：５’−ＣＧＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＡＣＧＣ−３’・・・・（配列番号３）；
オリゴヌクレオチド２：５’−ＡＡＡＣＡＴＣＡＣＴＧＣＡＡＧＴＣＴＴＡＡ−３’・・・・（配列番号４）。

実施例１にて作製した９０μＬの試料溶液に対して、１０μＬのプローブ１（プローブの量は、５０ｎＭ）を加え、全量を１００μＬとした。そして、当該混合物を最適な温度にて３０分間インキュベートして、２１塩基からなるＤＮＡとプローブ１とをハイブリダイズさせた。

また、実施例２にて作製した９０μＬの試料溶液に対して、１０μＬのプローブ２（プローブの量は、５０ｎＭ）を加え、全量を１００μＬとした。そして、当該混合物を最適な温度にて３０分間インキュベートして、２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡとプローブ２とをハイブリダイズさせた。

以上のようにしてハイブリダイズさせた試料を、後述する実施例に用いた。

〔実施例４〕ＣＥ−ＬＩＦ（Capillary Electrophoresis − Laser Induced Fluorescence）による検出
実施例３にて作製したハイブリダイズさせた試料を、下記の条件にてキャピラリー電気泳動するとともに、レーザー誘導蛍光検出法によって検出した。
・キャピラリー電気泳動装置：ＰＡ ８００ ｐｌｕｓ（ベックマン・コールター株式会社製）、
・キャピラリー：２０．０ｃｍ（有効長）、３０．２ｃｍ（全長）、７５μｍ（内径）（ＧＬサイエンス株式会社製）、
・キャピラリー温度：３０℃、
・ランニングバッファー：２５ｍＭ 四ホウ素酸ナトリウム（ｐＨ９．２）、
・検出：レーザー誘導蛍光検出、
・分離条件（２１塩基からなるＤＮＡとプローブ１とをハイブリダイズさせた試料の場合）：０分から１０分にかけて２１ｋＶ、
・分離条件（２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡとプローブ２とをハイブリダイズさせた試料の場合）：０分から１０分にかけて１２ｋＶ、１０分から１２分は１２ｋＶ。

図１に、２１塩基からなるＤＮＡとプローブ１とをハイブリダイズさせた試料の検出結果を示し、図２に、２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡとプローブ２とをハイブリダイズさせた試料の検出結果を示す。

具体的に、図１において、「ＩＳ」は、内部標準物質であるフルオレセインを示し、「未反応プローブ」は、２１塩基からなるＤＮＡとハイブリダイズしていないプローブ１を示し、「ＤＮＡ−ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄ」は、２１塩基からなるＤＮＡとハイブリダイズしているプローブ１を示している。

一方、図２において、「ＩＳ」は、内部標準物質であるＢＯＤＩＰＹ（登録商標） ＦＬ ＡＴＰを示し、「未反応プローブ」は、２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡとハイブリダイズしていないプローブ２を示し、「ｍｉＲＮＡ−ＤＮＡ ｈｙｂｒｉｄ」は、２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡとハイブリダイズしているプローブ２を示している。

図１から、内部標準物質であるフルオレセインと２１塩基からなるＤＮＡとは、ＴＥ溶液（ｐＨ８．０）にて飽和された有機溶媒の混合物にて処理した場合、同等に水相（換言すれば、上述した「ＤＮＡを含有する試料溶液」）へ移行することが明らかになった。

また、上述した「ＤＮＡを含有する試料溶液」には若干の有機溶媒（例えば、フェノール）が残存するが、このような有機溶媒が存在しても、２１塩基からなるＤＮＡとプローブ１とのハイブリダイゼーションには影響がないことが明らかになった。

一方、図２から、内部標準物質であるＢＯＤＩＰＹ（登録商標） ＦＬ ＡＴＰと２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡとは、ＴＥ溶液（ｐＨ８．０）にて飽和された有機溶媒の混合物にて処理した場合、同等に水相（換言すれば、上述した「ｍｉｃｒｏＲＮＡを含有する試料溶液」）へ移行することが明らかになった。

また、上述した「ｍｉｃｒｏＲＮＡを含有する試料溶液」には若干の有機溶媒（例えば、フェノール）が残存するが、このような有機溶媒が存在しても、２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡとプローブ２とのハイブリダイゼーションには影響がないことが明らかになった。

〔実施例５〕ＣＥ−ＬＩＦによる検出データの直線性の確認
２１塩基からなるＤＮＡをＴＥ溶液（ｐＨ８．０（ナカライテスク株式会社））に溶解し、更にハイブリダイゼーションバッファーで希釈して、２１塩基からなるＤＮＡを様々な濃度にて含有する水溶液を作製した。

具体的には、０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、２５０ｐＭ、５００ｐＭ、１０００ｐＭ、２０００ｐＭ、３０００ｐＭ、４０００ｐＭ、または、５０００ｐＭにてＤＮＡを含む、複数の混合溶液を作製した。

また、２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡをＴＥ溶液（ｐＨ８．０（ナカライテスク株式会社））に溶解し、更にハイブリダイゼーションバッファーで希釈して、２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡを様々な濃度にて含有する水溶液を作製した。

具体的には、０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、１０００ｐＭ、２０００ｐＭ、３０００ｐＭ、４０００ｐＭ、または、５０００ｐＭにてｍｉｃｒｏＲＮＡを含む、複数の混合溶液を作製した。

上述した各濃度の水溶液を実施例１〜３の方法で処理し、実施例４に記載の条件にてキャピラリー電気泳動するとともに、レーザー誘導蛍光検出法によって検出した。

上述したように、本実施例では、レーザー誘導蛍光検出を行うためにベックマン・コールター株式会社製のキャピラリー電気泳動装置を用いている。そして本実施例では、当該キャピラリー電気泳動装置に組み込まれたプログラムによって、検出された蛍光シグナルのエリア値から、ポリヌクレオチドの量（換言すれば、濃度）を算出している。

簡単に言えば、２１塩基からなるＤＮＡにハイブリダイズしたプローブ１が示す蛍光シグナルのエリア値から、混合溶液中のＤＮＡの濃度を算出し、２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡにハイブリダイズしたプローブ２が示す蛍光シグナルのエリア値から、混合溶液中のｍｉｃｒｏＲＮＡの濃度を算出した。

そして、混合溶液に実際に含まれているＤＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡの濃度と、算出された濃度とを比較して、算出されたデータの直線性を確認した。

表１に、ＤＮＡを含む混合溶液に関する試験データを示し、表２に、ｍｉｃｒｏＲＮＡを含む混合溶液の試験データを示す。なお、表１および表２において、「Nominal concentration」とは、試験に用いた混合溶液に実際に含まれているＤＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡの理論濃度を示している。また、「Determined concentration」とは、検出された蛍光の強度と蛍光が検出された時間とから算出された、混合溶液に含まれるＤＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡの濃度を示している。また、「Accuracy」とは、「Nominal concentration」と「Determined concentration」とのズレを示している。また、「Ｓ１」〜「Ｓ９」は、各混合溶液に付された名前である。

表１および表２に示すように、混合溶液に実際に含まれているＤＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡの濃度と、算出された濃度とは非常に近似しており、算出されたデータが直線性を有していることが確認された。

〔実施例６〕生体試料中へのポリヌクレオチドの添加回収
１６０μＬのヒト血漿に、２０％（ｗ／ｖ）の濃度にてＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）を含む水溶液を２０μＬ添加して、ヒト血漿に含まれる成分が可溶化された水溶液を作製した。

２１塩基からなるＤＮＡをＴＥ溶液（ｐＨ８．０（ナカライテスク株式会社））に溶解し、２１塩基からなるＤＮＡを様々な濃度にて含有する水溶液を作製した。また、２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡをＴＥ溶液（ｐＨ８．０（ナカライテスク株式会社））に溶解し、２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡを様々な濃度にて含有する水溶液を作製した。そして、各水溶液を、更にハイブリダイゼーションバッファーで希釈して、２１塩基からなるＤＮＡを含む水溶液、または、２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡを含む水溶液を作製した。

ヒト血漿に含まれる成分が可溶化された水溶液に対して、２１塩基からなるＤＮＡを含む水溶液を１０μＬ添加し、更に、内部標準物質であるフルオレセインを５００ｎＭの濃度にて含む水溶液を１０μＬ添加して、複数の混合溶液を作製した（ｎ＝５）。なお、各混合溶液におけるＤＮＡの添加濃度を、５０ｐＭ、１５０ｐＭ、２５００ｐＭ、４０００ｐＭおよび５０００ｐＭとした。

また、ヒト血漿に含まれる成分が可溶化された水溶液に対して、２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡを含む水溶液を１０μＬ添加し、更に、内部標準物質であるＢＯＤＩＰＹ（登録商標） ＦＬ ＡＴＰ（Life Technologies Corporation.）を５００ｎＭの濃度にて含む水溶液を１０μＬ添加して、複数の混合溶液を作製した（ｎ＝５）。なお、各混合溶液におけるｍｉｃｒｏＲＮＡの添加濃度を、５０ｐＭ、１５０ｐＭ、２５００ｐＭ、４０００ｐＭおよび５０００ｐＭとした。

上記混合溶液の各々に対して、ＴＥ溶液（ｐＨ８．０）にて飽和された有機溶媒の混合物（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）（Sigma-Aldrich Co. LLC.）を２００μＬ添加し、撹拌および混合した後、室温で１００００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。

遠心分離によって分離された上清９０μＬを回収して、ＤＮＡ、または、ｍｉｃｒｏＲＮＡを含有する試料溶液とした。

ＤＮＡを含有する９０μＬの試料溶液の各々に対して、１０μＬのプローブ１（プローブの量は、５０ｎＭ）を加え、全量を１００μＬとした。そして、当該混合物を最適な温度にて３０分間インキュベートして、２１塩基からなるＤＮＡとプローブ１とをハイブリダイズさせた。

また、ｍｉｃｒｏＲＮＡを含有する９０μＬの試料溶液の各々に対して、１０μＬのプローブ２（プローブの量は、５０ｎＭ）を加え、全量を１００μＬとした。そして、当該混合物を最適な温度にて３０分間インキュベートして、２１塩基からなるｍｉｃｒｏＲＮＡとプローブ２とをハイブリダイズさせた。

ハイブリダイズさせた試料を、実施例４と同じ条件にてキャピラリー電気泳動するとともに、レーザー誘導蛍光検出法によって検出した。試料中の濃度算出には、実施例５の検量線を使用した。

表３に、ＤＮＡを含む混合溶液に関する試験データを示し、表４に、ｍｉｃｒｏＲＮＡを含む混合溶液の試験データを示す。なお、表３および表４において、「Nominal concentration」とは、試験に用いた混合溶液に実際に含まれているＤＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡの理論濃度を示している。また、「Average Determined concentration」とは、検出された蛍光の強度と蛍光が検出された時間とから算出された、混合溶液に含まれるＤＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡのｎ＝５測定の平均濃度を示している。また、「Accuracy」とは、「Nominal concentration」と「Determined concentration」とのズレを示している。また、「Precision」とは、ｎ＝５測定のバラツキを示している。また、「ＬＬＯＱ」、「Ｌ」、「Ｍ」、「Ｈ」および「ＵＬＯＱ」は、各混合溶液に付された名前である。

表３および表４に示すように、血漿に由来する様々な不純物を含んだ混合液を用いた場合であっても、混合溶液に実際に含まれているＤＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡの濃度と、算出された濃度とは非常に近似しており、算出されたデータから、良好な添加回収であることが確認された。

〔実施例７〕有機溶媒の混合物を用いた精製における、ＤＮＡまたはｍｉｃｒｏＲＮＡと、内部標準物質との精製効率の比較
実施例１および実施例２では、有機溶媒の混合物を用いて混合溶液を精製している。そこで、本実施例７では、当該精製における内部標準物質の精製効率と、ポリヌクレオチドの精製効率とを比較した。なお、ポリヌクレオチドの精製は、上述したプローブ１を用いて確認した。

３２０μＬの超純水に、２０％（ｗ／ｖ）の濃度にてＳＤＳ（sodium dodecyl sulfate）を含む水溶液を４０μＬ添加し、更に、２０ｎＭの濃度にてプローブ１を含む溶液２０μＬ、および、２０ｎＭの濃度にて内部標準物質（フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＡＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＧＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ ＧＤＰ、Ｏｒｅｇｏｎ Ｇｒｅｅｎ、Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ Ｇｒｅｅｎ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８−ｄＵＴＰ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８）を含む溶液２０μＬ、を添加した。

次いで、上述した溶液２００μＬを採取し、ＴＥ溶液（ｐＨ８．０）にて飽和された有機溶媒の混合物（フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール＝２５：２４：１）（Sigma-Aldrich Co. LLC.）を２００μＬ添加し、撹拌および混合した後、室温で１００００ｒｐｍにて５分間遠心分離した。

遠心分離によって分離された上清１００μＬを回収した。

有機溶媒によって精製する前の水溶液、および、精製後に得られた上清の各々を、実施例４と同じ条件にてキャピラリー電気泳動するとともに、レーザー誘導蛍光検出法によって検出した。

検出された内部標準物質およびプローブ１の蛍光のエリア値から、内部標準物質のエリア値に対するプローブ１のエリア値を算出した（有機溶媒の混合物処理前：Ｒａｔｉｏ１、有機溶媒の混合物処理後：Ｒａｔｉｏ２）。

更に、Ｒａｔｉｏ２に対するＲａｔｉｏ１の比を算出することで、ポリヌクレオチドおよび内部標準物質の、水相への移行の差を確認した。つまり、当該比が１よりも大きい場合は、ポリヌクレオチドよりも内標準物質の方が水相への移行性が高く、当該比が１の場合は、水相への移行性が同等、当該比が１よりも小さい場合は、内標準物質はポリヌクレオチドよりも水相への移行性が低いことを示している。試験データを表５に示す。

表５に示すように、有機溶媒で精製した場合、内部標準物質はポリヌクレオチドと同等の水相への移行性を有していることが明らかになった。

本発明は、様々な試料（例えば、生体試料（例えば、血液、血漿、尿、細胞破砕物）、化学試料）に含有されるポリヌクレオチドの定量に利用することができる。

本発明は、電気泳動（更に具体的には、レーザー誘導蛍光検出と組み合わされた電気泳動（更に具体的には、レーザー誘導蛍光検出と組み合わされたキャピラリー電気泳動））に供する試料の作製、および、当該試料を用いたポリヌクレオチドの定量方法に利用することができる。

Claims (14)

1. ポリヌクレオチドおよび蛍光標識された内部標準物質を含むサンプル溶液と、有機溶媒とを混合して、混合後の水相を得る工程を含むことを特徴とする、電気泳動に供するための試料の作製方法。
2. 上記蛍光標識された内部標準物質は、上記水相を得る工程において、混合後の水相へ移行するものであることを特徴とする、請求項１に記載の電気泳動に供するための試料の作製方法。
3. 上記蛍光標識された内部標準物質の全質量に対する、上記水相へ移行する上記蛍光標識された内部標準物質の質量の比率は、上記ポリヌクレオチドの全質量に対する、上記水相へ移行する上記ポリヌクレオチドの質量の比率と略同一であることを特徴とする、請求項１または２に記載の電気泳動に供するための試料の作製方法。
4. 上記蛍光標識された内部標準物質の全質量に対する、上記水相へ移行する上記蛍光標識された内部標準物質の質量の比率をＡ（％）とし、上記ポリヌクレオチドの全質量に対する、上記水相へ移行する上記ポリヌクレオチドの質量の比率をＢ（％）としたとき、上記Ａ（％）は、０．５０×Ｂ（％）〜１．５０×Ｂ（％）であることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の電気泳動に供するための試料の作製方法。
5. 上記蛍光標識された内部標準物質は、フルオレセイン若しくはフルオレセイン骨格を有する類縁体、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）若しくはＤｉｐｙｒｒｏｍｅｔｈｅｎｅ骨格を有する類縁体、蛍光標識されたヌクレオチド、蛍光標識されたデオキシヌクレオチド、または、蛍光標識されたポリヌクレオチドであることを特徴とする、請求項１〜４の何れか１項に記載の電気泳動に供するための試料の作製方法。
6. 上記蛍光標識された内部標準物質は、蛍光標識されたヌクレオチド、または、蛍光標識されたデオキシヌクレオチドであることを特徴とする、請求項５に記載の電気泳動に供するための試料の作製方法。
7. 上記蛍光標識されたヌクレオチド、および、蛍光標識されたデオキシヌクレオチドは、アデノシン三リン酸、シチジン三リン酸、チミジン三リン酸、グアノシン三リン酸、ウリジン三リン酸、アデノシン二リン酸、シチジン二リン酸、チミジン二リン酸、グアノシン二リン酸、ウリジン二リン酸、アデノシン一リン酸、シチジン一リン酸、チミジン一リン酸、グアノシン一リン酸、ウリジン一リン酸、または、これらの類縁体が蛍光標識されたものであることを特徴とする、請求項５または６に記載の電気泳動に供するための試料の作製方法。
8. 上記蛍光標識された内部標準物質は、４７０ｎｍ〜７００ｎｍの波長で蛍光を示すものであることを特徴とする、請求項１〜７の何れか１項に記載の電気泳動に供するための試料の作製方法。
9. 上記有機溶媒は、フェノールを含む有機溶媒であることを特徴とする、請求項１〜８の何れか１項に記載の電気泳動に供するための試料の作製方法。
10. 上記水相が、電気泳動に供される試料であることを特徴とする、請求項１〜９の何れか１項に記載の電気泳動に供するための試料の作製方法。
11. 請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法にて作製された試料を用いることを特徴とする、電気泳動法。
12. 請求項１１に記載の電気泳動法を用いることを特徴とする、ポリヌクレオチドの定量方法。
13. 請求項１〜１０の何れか１項に記載の方法にて作製された試料の分離分析を行うことを特徴とする装置。
14. 上記装置が電気泳動装置であることを特徴とする請求項１３に記載の装置。

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