JP2015118029A - 生体試料中のビオチンまたはその関連物質の測定方法 - Google Patents
生体試料中のビオチンまたはその関連物質の測定方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015118029A JP2015118029A JP2013262185A JP2013262185A JP2015118029A JP 2015118029 A JP2015118029 A JP 2015118029A JP 2013262185 A JP2013262185 A JP 2013262185A JP 2013262185 A JP2013262185 A JP 2013262185A JP 2015118029 A JP2015118029 A JP 2015118029A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- biotin
- sample
- plasma
- waste liquid
- biological sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 title claims abstract description 251
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 title claims abstract description 124
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 title claims abstract description 124
- 239000011616 biotin Substances 0.000 title claims abstract description 124
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 82
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 title claims abstract description 44
- 239000000126 substance Substances 0.000 title claims abstract description 43
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 133
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 68
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 19
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 claims abstract description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 126
- 239000002699 waste material Substances 0.000 claims description 67
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 55
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 35
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 claims description 32
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 claims description 32
- 125000000538 pentafluorophenyl group Chemical group FC1=C(F)C(F)=C(*)C(F)=C1F 0.000 claims description 22
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 19
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 18
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims description 8
- 208000001647 Renal Insufficiency Diseases 0.000 claims description 6
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 6
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 238000000589 high-performance liquid chromatography-mass spectrometry Methods 0.000 claims description 4
- 201000001474 proteinuria Diseases 0.000 claims description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 10
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 57
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 30
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 30
- YBJHBAHKTGYVGT-HSDBBJNISA-N OC(=O)C(C(CC[C@@H]1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12)([2H])[2H])([2H])[2H] Chemical compound OC(=O)C(C(CC[C@@H]1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12)([2H])[2H])([2H])[2H] YBJHBAHKTGYVGT-HSDBBJNISA-N 0.000 description 28
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 20
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 19
- 238000000691 measurement method Methods 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 14
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 14
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000002552 multiple reaction monitoring Methods 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 10
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 10
- VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N ammonium formate Chemical compound [NH4+].[O-]C=O VZTDIZULWFCMLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 8
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 7
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 7
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 7
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 7
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 6
- 206010004906 Biotin deficiency Diseases 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 5
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 5
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 4
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 4
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 description 3
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 3
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 description 3
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 2
- 101000713575 Homo sapiens Tubulin beta-3 chain Proteins 0.000 description 2
- 101000713585 Homo sapiens Tubulin beta-4A chain Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100036790 Tubulin beta-3 chain Human genes 0.000 description 2
- 102100036788 Tubulin beta-4A chain Human genes 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 150000001615 biotins Chemical class 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000004807 desolvation Methods 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 2
- 229960001008 heparin sodium Drugs 0.000 description 2
- 238000010813 internal standard method Methods 0.000 description 2
- 238000000752 ionisation method Methods 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000006199 nebulizer Substances 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 2
- 239000004810 polytetrafluoroethylene Substances 0.000 description 2
- 229920001343 polytetrafluoroethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 238000005464 sample preparation method Methods 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- -1 urine Substances 0.000 description 2
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 2
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 2
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 2
- 0 *CC(*)(*)C(*)(*)C[C@@](C1N2)SCC1NC2=O Chemical compound *CC(*)(*)C(*)(*)C[C@@](C1N2)SCC1NC2=O 0.000 description 1
- VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 2-(2,3-dihydro-1H-inden-2-ylamino)-N-[3-oxo-3-(2,4,6,7-tetrahydrotriazolo[4,5-c]pyridin-5-yl)propyl]pyrimidine-5-carboxamide Chemical compound C1C(CC2=CC=CC=C12)NC1=NC=C(C=N1)C(=O)NCCC(N1CC2=C(CC1)NN=N2)=O VZSRBBMJRBPUNF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NZERRTYPTPRCIR-ZKWXMUAHSA-N Alpha-Dehydrobiotin Natural products N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCC=CC(=O)O)SC[C@@H]21 NZERRTYPTPRCIR-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- QDFGCLSCEPNVQP-VPLCAKHXSA-N Bisnorbiotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCC(=O)O)SC[C@@H]21 QDFGCLSCEPNVQP-VPLCAKHXSA-N 0.000 description 1
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 1
- 235000005956 Cosmos caudatus Nutrition 0.000 description 1
- 206010012438 Dermatitis atopic Diseases 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 206010020575 Hyperammonaemia Diseases 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N Metaphosphoric acid Chemical compound OP(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- ITHUGYGPPSVHRH-FXQIFTODSA-N Methyl bisnorbiotinyl ketone Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCC(=O)C)SC[C@@H]21 ITHUGYGPPSVHRH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 208000007101 Muscle Cramp Diseases 0.000 description 1
- BAQMYDQNMFBZNA-UHFFFAOYSA-N N-biotinyl-L-lysine Natural products N1C(=O)NC2C(CCCCC(=O)NCCCCC(N)C(O)=O)SCC21 BAQMYDQNMFBZNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010037575 Pustular psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 208000005392 Spasm Diseases 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 229940125681 anticonvulsant agent Drugs 0.000 description 1
- 239000001961 anticonvulsive agent Substances 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 201000008937 atopic dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- BAQMYDQNMFBZNA-MNXVOIDGSA-N biocytin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)NCCCC[C@H](N)C(O)=O)SC[C@@H]21 BAQMYDQNMFBZNA-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- QPFQYMONYBAUCY-ZKWXMUAHSA-N biotin sulfone Chemical compound N1C(=O)N[C@H]2CS(=O)(=O)[C@@H](CCCCC(=O)O)[C@H]21 QPFQYMONYBAUCY-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- KCSKCIQYNAOBNQ-YBSFLMRUSA-N biotin sulfoxide Chemical compound N1C(=O)N[C@H]2CS(=O)[C@@H](CCCCC(=O)O)[C@H]21 KCSKCIQYNAOBNQ-YBSFLMRUSA-N 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 125000006267 biphenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 1
- 210000000692 cap cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 150000001793 charged compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007882 cirrhosis Effects 0.000 description 1
- 208000019425 cirrhosis of liver Diseases 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000009563 continuous hemofiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000003544 deproteinization Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- QLBHNVFOQLIYTH-UHFFFAOYSA-L dipotassium;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [K+].[K+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O QLBHNVFOQLIYTH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 1
- 125000001207 fluorophenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000002615 hemofiltration Methods 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N hydron Chemical compound [H+] GPRLSGONYQIRFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- NZERRTYPTPRCIR-ARSLAPBQSA-N lidimycin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CC/C=C/C(=O)O)SC[C@@H]21 NZERRTYPTPRCIR-ARSLAPBQSA-N 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000027939 micturition Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000009145 protein modification Effects 0.000 description 1
- 201000010914 pustulosis of palm and sole Diseases 0.000 description 1
- 208000011797 pustulosis palmaris et plantaris Diseases 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 1
- 125000004079 stearyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
Images
Abstract
【課題】生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を迅速かつ簡便に高感度で測定する方法の提供。【解決手段】生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を測定する方法であって、（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程と、（２）工程（１）で得られた試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を、高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法を用いて測定する工程とを含む、方法。【選択図】図１
Description
本発明は、生体試料中のビオチンまたはその関連物質の測定方法、より詳細には、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用した生体試料（例えば、血漿、透析廃液、尿）中のビオチンまたはその関連物質の測定方法に関する。
ビオチンは、ビタミンＢ群に属する水溶性ビタミンの一種であり、ビタミンＢ７またはビタミンＨとも呼ばれている。ビオチンは、生体内でカルボキシラーゼ反応の補酵素として、呼吸系、β-酸化、脂肪酸生合成などにおいて機能することが知られている。
近年、ビオチンと種々の疾患との関係が明らかになりつつある。例えば、ビオチンは、アトピー性皮膚炎、掌蹠膿疱症等の皮膚疾患の治療に有効であること、血液透析による四肢の痙攣に対する抑制・予防効果があること、肝硬変患者における高アンモニア血症改善、耐糖能およびインスリン抵抗性の改善、血圧上昇抑制などの効果があることが知られている。他にも、先天的なビオチン代謝酵素欠損や抗痙攣薬の長期投与、特殊調製粉乳の摂取乳児等にビオチン欠乏症が発症することが知られている（特許文献１、非特許文献１〜１０など）。
したがって、健康管理や疾患の診断、ビオチンの体内動態に関する研究のため、血漿や透析廃液、尿などの生体試料中のビオチンおよびビオチン関連物質を迅速かつ簡便に高感度で測定することが必要とされている。
したがって、健康管理や疾患の診断、ビオチンの体内動態に関する研究のため、血漿や透析廃液、尿などの生体試料中のビオチンおよびビオチン関連物質を迅速かつ簡便に高感度で測定することが必要とされている。
一方、ビオチンの測定法としては、微生物学的定量法、結合アッセイ法、ＨＰＬＣ法、光学的測定法などが知られている。しかしながら、微生物学的定量法は精度が低い、操作が煩雑で時間を要することなどの問題があり、結合アッセイ法はビオチン関連物質（例えば、ビオチン代謝物）とも非特異的に反応するなどの問題があり、光学的測定法およびＨＰＬＣ法は感度が低いなどの問題がある（非特許文献１１）。
また、ＨＰＬＣ法で感度を高めるため、プレカラムやポストカラムによる誘導体化などが採用されているが（特許文献２など）、工程が煩雑であり、簡便ではなかった。
また、ＨＰＬＣ法で感度を高めるため、プレカラムやポストカラムによる誘導体化などが採用されているが（特許文献２など）、工程が煩雑であり、簡便ではなかった。
また、高速液体クロマトグラフ／質量分析法（ＬＣ／ＭＳ）または高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）を用いたビオチンの測定法も知られている（非特許文献１２〜２３）。しかしながら、これらの文献に記載の測定法は、主として食品などを対象としたものであり、また、血漿や透析廃液、尿などの生体試料中のビオチンおよびビオチン関連物質を迅速かつ簡便に高感度で測定することができるものではなかった。
Tohoku J Exp Med. (2012) 227 217-223.
Acta Pediatr Scand. (1988) 77 762-3.
診断と治療、80巻 1397-1402 1992
医学のあゆみ、Vol.186 No.2 156-7 1998
Ren Fail. (1996) 18(1) 131-137
J Clin Biochem Nutr. (1995) 18， 35-42.
British Journal of Nutrition. (2008) 99， 756-63
ビタミン、86巻、12号、678-84、2012
Adv Pediatr. (1991) 1-21
Neulrology. (1997) 49 1444-7
A Government Chemist Programme Report LGC Limited 2011.9
Agro Food Ind Hi-Tech. (2010) 21(6) 39-41.
Anal Bioanal Chem. (2010) 397(2) 471-81.
Chromatographia. (2009) 69 629-35.
Rapid Commun Mass Spectrom. (2008) 22(13) 2029-43.
J Chromatogr Sci. (2008) 46 225-32.
Anal Bioanal Chem. (2007) 387 2441-2448.
J Chromatography A. (2007) 1142 231-35.
Curr Eye Res. (2006) 31(10) 797-809.
J Chromatography B. (2006) 831 8-16.
Anal Commun. (1996) 33 159-162.
ASEAN Food Journal. (1991) 6(4) 163-4.
J Chromatogr. (1984) 303(1) 272-6.
本発明は、血漿や透析廃液、尿などの生体試料中のビオチンおよびビオチン関連物質を迅速かつ簡便に高感度で測定する方法を提供することを課題とするものである。
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討した結果、生体試料中のタンパク質を除去した後、高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法を用いて測定することで、生体試料中のビオチンおよびビオチン関連物質を迅速かつ簡便に高感度で測定することができることを見出し、本発明を完成させるに至った。
したがって、本発明は、以下の態様を含む。
［１］ 生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を測定する方法であって、
（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程と、
（２）工程（１）で得られた試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を、高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法を用いて測定する工程と
を含む、方法。
［２］ 生体試料が血漿、透析廃液または尿である、上記［１］に記載の方法。
［３］ 生体試料が血漿である、上記［２］に記載の方法。
［４］ 生体試料が透析廃液である、上記［２］に記載の方法。
［５］ 生体試料が尿である、上記［２］に記載の方法。
［６］ 血漿が血液透析患者由来の血漿である、上記［３］に記載の方法。
［７］ 透析廃液が血液透析患者由来の透析廃液である、上記［４］に記載の方法。
［８］ 透析廃液が血液透析濾過患者由来の透析廃液である、上記［４］に記載の方法。
［９］ 透析廃液が腹膜透析患者由来の透析廃液である、上記［４］に記載の方法。
［１０］ 尿が腎不全患者由来の尿である、上記［５］に記載の方法。
［１１］ 尿がタンパク尿である、上記［５］に記載の方法。
［１２］ 工程（１）が、メタノールを用いてタンパク質を沈殿させることにより除去する工程である、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］ 高速液体クロマトグラフに使用するカラムが、疎水性相互作用、双極子-双極子相互作用、およびπ-π相互作用により分離するカラムである、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］ カラム担体の官能基が、ペンタフルオロフェニル基が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基を含む、上記［１２］に記載の方法。
［１５］ 生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を測定するための測定用キットであって、
（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程に使用するための試薬と、
（２）高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法に使用するための機器
を含む、キット。
［１］ 生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を測定する方法であって、
（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程と、
（２）工程（１）で得られた試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を、高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法を用いて測定する工程と
を含む、方法。
［２］ 生体試料が血漿、透析廃液または尿である、上記［１］に記載の方法。
［３］ 生体試料が血漿である、上記［２］に記載の方法。
［４］ 生体試料が透析廃液である、上記［２］に記載の方法。
［５］ 生体試料が尿である、上記［２］に記載の方法。
［６］ 血漿が血液透析患者由来の血漿である、上記［３］に記載の方法。
［７］ 透析廃液が血液透析患者由来の透析廃液である、上記［４］に記載の方法。
［８］ 透析廃液が血液透析濾過患者由来の透析廃液である、上記［４］に記載の方法。
［９］ 透析廃液が腹膜透析患者由来の透析廃液である、上記［４］に記載の方法。
［１０］ 尿が腎不全患者由来の尿である、上記［５］に記載の方法。
［１１］ 尿がタンパク尿である、上記［５］に記載の方法。
［１２］ 工程（１）が、メタノールを用いてタンパク質を沈殿させることにより除去する工程である、上記［１］〜［１１］のいずれかに記載の方法。
［１３］ 高速液体クロマトグラフに使用するカラムが、疎水性相互作用、双極子-双極子相互作用、およびπ-π相互作用により分離するカラムである、上記［１］〜［１２］のいずれかに記載の方法。
［１４］ カラム担体の官能基が、ペンタフルオロフェニル基が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基を含む、上記［１２］に記載の方法。
［１５］ 生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を測定するための測定用キットであって、
（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程に使用するための試薬と、
（２）高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法に使用するための機器
を含む、キット。
本発明の測定法によれば、生体試料中のビオチンおよびビオチン関連物質を迅速かつ簡便に高感度で測定することができる。
すなわち、本発明の測定法の感度は、市販されている代表的な結合アッセイキットと同等の感度でビオチンおよびビオチン関連物質を測定が可能である。また、ＨＰＬＣでの分離に加えて、ＭＲＭ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：多重反応モニタリング）で分子量によるフィルタリングも行なっているので、微生物学的定量法や結合アッセイなどのように、ビオチンとビオチン関連物質（ビオチン代謝物など）との交差性はほとんどないと考えられる。
また、試料の前処理は、除タンパク質法であり、従来のＨＰＬＣによるビオチン血漿測定法の前処理において使用されていた誘導体化などが不要であるので、容易かつ短時間で前処理を行うことができる。
従来のＨＰＬＣ法では、ヒト血漿の場合、ビオチンの保持時間は早いものでも７〜８分であり、１検体の測定にほとんどが数十分から１時間程度の時間を要していたが、本発明の測定法では、１検体の分析サイクルは５分程度（ビオチンの保持時間は２分未満）と短いため、効率的な多検体処理が可能である。
すなわち、本発明の測定法の感度は、市販されている代表的な結合アッセイキットと同等の感度でビオチンおよびビオチン関連物質を測定が可能である。また、ＨＰＬＣでの分離に加えて、ＭＲＭ法（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ：多重反応モニタリング）で分子量によるフィルタリングも行なっているので、微生物学的定量法や結合アッセイなどのように、ビオチンとビオチン関連物質（ビオチン代謝物など）との交差性はほとんどないと考えられる。
また、試料の前処理は、除タンパク質法であり、従来のＨＰＬＣによるビオチン血漿測定法の前処理において使用されていた誘導体化などが不要であるので、容易かつ短時間で前処理を行うことができる。
従来のＨＰＬＣ法では、ヒト血漿の場合、ビオチンの保持時間は早いものでも７〜８分であり、１検体の測定にほとんどが数十分から１時間程度の時間を要していたが、本発明の測定法では、１検体の分析サイクルは５分程度（ビオチンの保持時間は２分未満）と短いため、効率的な多検体処理が可能である。
本発明は、生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を測定する方法であって、
（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程と、
（２）工程（１）で得られた試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を、高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法を用いて測定する工程と
を含む、方法に関するものである。
（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程と、
（２）工程（１）で得られた試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を、高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法を用いて測定する工程と
を含む、方法に関するものである。
本発明における「生体試料」とは、ヒト、動物、または植物から得られる、尿、血液、血漿、組織、細胞などの材料を含む試料を意味し、本発明の方法により測定可能な試料であれば特に限定されない。なかでも、血漿および尿が好ましく、血漿が特に好ましい。さらに、透析廃液のように、生体由来成分が含まれる試料も本発明の「生体試料」として好適に用いられる。
なかでも、ヒト由来の生体試料が好ましい。ヒトとしては、健常者であっても、種々の疾患を患う患者、例えば、腎不全患者、血液透析患者、血液透析濾過患者、腹膜透析患者、ビオチン欠乏症患者などであってもよいが、ビオチン量の欠乏および過剰による影響を受けやすいことから、特に血液透析患者、血液透析濾過患者、腹膜透析患者が挙げられる。
血漿は、血液に含まれる液体成分の一つで血液の５５％を占める。血清とフィブリノーゲンから成り、物質の輸送、ガス交換、血液凝固、免疫に関与するほか、浸透圧や水素イオン濃度の調節などによって内部環境を整えるのに重要な役割を果たしている。
本発明における「血漿」としては、特に限定されず、ヒト、ラット、マウス、イヌ、サルなどの哺乳動物の血液由来のものが挙げられる。また、その調製方法も特に限定されず、従来既知の方法を用いることができる。好ましくは、採血後、抗凝固剤（ヘパリンナトリウム、ＥＤＴＡ-２Ｎａ、ＥＤＴＡ-２Ｋ等）入りのプラスチックチューブに移し、氷冷化で保存し、４℃で遠心分離後、採取する。なかでも、ヒトの血漿が好ましい。ヒトとしては、健常者、血液透析患者、ビオチン欠乏症患者等が挙げられ、特に血液透析患者が挙げられる。
透析廃液は、血液浄化療法により透析患者血液中の老廃物の除去や電解質濃度の調整等を行った後の透析液であり、透析患者血液中の低分子代謝物等が含まれている。血液透析患者は合併症として貧血症状を有しており、採血は最小限にすることが望ましいとされている。そのため、非侵襲性に採取可能な透析廃液で透析患者の血中代謝物濃度を測定することは患者に負担を与えることがなく、さらに、高分子フィルターを通過した除蛋白試料であることから分析が容易であるといった利点がある。しかしながら、これまで透析廃液中のビオチンを測定した例はなかった。
本発明における「透析廃液」としては、特に限定されず、腎不全患者、血液透析患者、血液透析濾過患者、腹膜透析患者、ビオチン欠乏症患者などの血液浄化療法が必要な患者に対する、血液透析、腹膜透析、血液濾過、血液透析濾過（ＨＤＦ）、持続的血液透析濾過などの血液浄化療法から生じる廃液が挙げられる。
尿は、腎臓において血液が濾過されることにより作られる排泄物であり、体内で生産される老廃物の除去や体内の水分量を調整する働きを持つ。成分のほとんどが水分であり、他に尿素や電解質等を含む。
本発明における「尿」としては、特に限定されず、ヒト、ラット、マウス、イヌ、サルなどの哺乳動物由来のものが挙げられる。なかでも、ヒトの尿が好ましい。ヒトとしては、健常者、排尿が確認される初期の腎不全患者や血液透析患者、血液透析濾過患者、腹膜透析患者、ビオチン欠乏症患者等が挙げられ、特に腎不全患者が挙げられる。
なかでも、ヒト由来の生体試料が好ましい。ヒトとしては、健常者であっても、種々の疾患を患う患者、例えば、腎不全患者、血液透析患者、血液透析濾過患者、腹膜透析患者、ビオチン欠乏症患者などであってもよいが、ビオチン量の欠乏および過剰による影響を受けやすいことから、特に血液透析患者、血液透析濾過患者、腹膜透析患者が挙げられる。
血漿は、血液に含まれる液体成分の一つで血液の５５％を占める。血清とフィブリノーゲンから成り、物質の輸送、ガス交換、血液凝固、免疫に関与するほか、浸透圧や水素イオン濃度の調節などによって内部環境を整えるのに重要な役割を果たしている。
本発明における「血漿」としては、特に限定されず、ヒト、ラット、マウス、イヌ、サルなどの哺乳動物の血液由来のものが挙げられる。また、その調製方法も特に限定されず、従来既知の方法を用いることができる。好ましくは、採血後、抗凝固剤（ヘパリンナトリウム、ＥＤＴＡ-２Ｎａ、ＥＤＴＡ-２Ｋ等）入りのプラスチックチューブに移し、氷冷化で保存し、４℃で遠心分離後、採取する。なかでも、ヒトの血漿が好ましい。ヒトとしては、健常者、血液透析患者、ビオチン欠乏症患者等が挙げられ、特に血液透析患者が挙げられる。
透析廃液は、血液浄化療法により透析患者血液中の老廃物の除去や電解質濃度の調整等を行った後の透析液であり、透析患者血液中の低分子代謝物等が含まれている。血液透析患者は合併症として貧血症状を有しており、採血は最小限にすることが望ましいとされている。そのため、非侵襲性に採取可能な透析廃液で透析患者の血中代謝物濃度を測定することは患者に負担を与えることがなく、さらに、高分子フィルターを通過した除蛋白試料であることから分析が容易であるといった利点がある。しかしながら、これまで透析廃液中のビオチンを測定した例はなかった。
本発明における「透析廃液」としては、特に限定されず、腎不全患者、血液透析患者、血液透析濾過患者、腹膜透析患者、ビオチン欠乏症患者などの血液浄化療法が必要な患者に対する、血液透析、腹膜透析、血液濾過、血液透析濾過（ＨＤＦ）、持続的血液透析濾過などの血液浄化療法から生じる廃液が挙げられる。
尿は、腎臓において血液が濾過されることにより作られる排泄物であり、体内で生産される老廃物の除去や体内の水分量を調整する働きを持つ。成分のほとんどが水分であり、他に尿素や電解質等を含む。
本発明における「尿」としては、特に限定されず、ヒト、ラット、マウス、イヌ、サルなどの哺乳動物由来のものが挙げられる。なかでも、ヒトの尿が好ましい。ヒトとしては、健常者、排尿が確認される初期の腎不全患者や血液透析患者、血液透析濾過患者、腹膜透析患者、ビオチン欠乏症患者等が挙げられ、特に腎不全患者が挙げられる。
ビオチンは、下記の構造式で示される化合物（分子式：Ｃ１０Ｈ１６Ｎ２Ｏ３Ｓ、分子量：２４４．３１）であり、ビタミンＢ群に属する水溶性ビタミンの一種であり、ビタミンＢ７またはビタミンＨとも呼ばれている。
ビオチンの構造式：
本発明における「ビオチン関連物質」としては、例えば、ビオチンスルフォキシド、ビオチンスルフォン、ビスノルビオチン、ビスノルビオチンメチルケトン、ビオシチン、α-デヒドロビオチン、ホモビオチン、ノルビオチンなどのビオチンの代謝物、誘導体、類縁体などが挙げられる。
また、上記「ビオチン」および「ビオチン関連物質」の各種の塩も本発明の測定法の対象となる。
ビオチンの構造式：
また、上記「ビオチン」および「ビオチン関連物質」の各種の塩も本発明の測定法の対象となる。
上記工程（１）は、生体試料中に含まれるタンパク質を除去する工程である。試料中にタンパク質が多量に存在すると、上記工程（２）におけるビオチンまたはビオチン関連物質の測定が困難になるためである。工程（１）としては、特に限定されないが、例えば、タンパク質の変性による不溶化、物理的な除去、浸透制限充填剤の利用などの方法が挙げられる。
「タンパク質の変性による不溶化」としては、例えば、過塩素酸、トリクロロ酢酸、メタリン酸のような酸の添加；アセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノールのような有機溶媒の添加；加熱；冷却などの方法が挙げられる。
「物理的な除去」としては、例えば、メンブレンフィルターなどを使用した限外ろ過、透析チューブなどを使用した透析、超遠心分離などが挙げられる。
上記タンパク質を除去方法は、１種の方法のみでも２種以上の方法を組み合わせてもよい。
「タンパク質の変性による不溶化」としては、例えば、過塩素酸、トリクロロ酢酸、メタリン酸のような酸の添加；アセトン、アセトニトリル、メタノール、エタノールのような有機溶媒の添加；加熱；冷却などの方法が挙げられる。
「物理的な除去」としては、例えば、メンブレンフィルターなどを使用した限外ろ過、透析チューブなどを使用した透析、超遠心分離などが挙げられる。
上記タンパク質を除去方法は、１種の方法のみでも２種以上の方法を組み合わせてもよい。
工程（１）としては、タンパク質と結合したビオチンを遊離させる点から、特に、有機溶媒の添加によりタンパク質を不溶化（沈殿）させ、除去することが好ましい。有機溶媒としては、特に、ビオチンの回収率の点から、メタノールが好ましい。
生体試料中に有機溶媒（例えばメタノール）を添加してタンパク質を除去する場合、例えば、以下の手順および条件で行うことが好ましい。
まず、生体試料中に対して所定量のメタノールを混合し、該混合物を所定の時間撹拌する。メタノールの添加量は生体試料の量に基づいて定めることができる。通常、生体試料に対して、メタノールを通常等量〜１００倍量、好ましくは等量〜１０倍量使用するが、生体試料の使用量、除タンパク効率、上清採取量および蒸発乾固後の再溶解量の点から、好ましくは生体試料５０〜５００μＬに対して、メタノールを生体試料の３〜１０倍量使用することができる。撹拌時間および温度は、特に限定されないが、例えば、撹拌時間は１０秒〜１分間、温度は１５〜３０℃とすることができる。その後、遠心分離して沈殿を除き、上清を採取する。遠心分離は、特に限定されないが、例えば、８，０００〜１５，０００×ｇで、４℃〜３０℃、１０〜１５分間の条件で行うことができる。
生体試料中に有機溶媒（例えばメタノール）を添加してタンパク質を除去する場合、例えば、以下の手順および条件で行うことが好ましい。
まず、生体試料中に対して所定量のメタノールを混合し、該混合物を所定の時間撹拌する。メタノールの添加量は生体試料の量に基づいて定めることができる。通常、生体試料に対して、メタノールを通常等量〜１００倍量、好ましくは等量〜１０倍量使用するが、生体試料の使用量、除タンパク効率、上清採取量および蒸発乾固後の再溶解量の点から、好ましくは生体試料５０〜５００μＬに対して、メタノールを生体試料の３〜１０倍量使用することができる。撹拌時間および温度は、特に限定されないが、例えば、撹拌時間は１０秒〜１分間、温度は１５〜３０℃とすることができる。その後、遠心分離して沈殿を除き、上清を採取する。遠心分離は、特に限定されないが、例えば、８，０００〜１５，０００×ｇで、４℃〜３０℃、１０〜１５分間の条件で行うことができる。
上記工程（２）は、工程（１）で得られたタンパク質除去後の試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を、高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法（以下、「ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ」と称する）を用いて測定する工程である。
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、試料をＨＰＬＣで分離し、溶出成分をイオン化室に導入し、イオン化してマススペクトルを得、これを第１段目の質量分析計（ＭＳ）でイオン（分子イオンの付加体）を選択し、コリジョンセルと呼ばれる衝突室で不活性ガスを衝突させてイオンを解離させて、第２段目のＭＳで分析する方法である。
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳは、試料をＨＰＬＣで分離し、溶出成分をイオン化室に導入し、イオン化してマススペクトルを得、これを第１段目の質量分析計（ＭＳ）でイオン（分子イオンの付加体）を選択し、コリジョンセルと呼ばれる衝突室で不活性ガスを衝突させてイオンを解離させて、第２段目のＭＳで分析する方法である。
本発明におけるＬＣ／ＭＳ／ＭＳに使用する機器としては、特に限定されず、例えば、液体クロマトグラフ用の機器としては、Ｎｅｘｅｒａ（島津製作所製）、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ（ウォーターズ製）などが挙げられ、タンデム質量分析用の機器としては、例えば、ＱＴＲＡＰ ５５００（エービー・サイエックス製）、ＴＳＱ Ｖａｎｔａｇｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）などが挙げられる。
上記工程（２）におけるＨＰＬＣ用のカラムとしては、例えば、疎水性相互作用、双極子-双極子相互作用およびπ-π相互作用から選択される少なくとも１種の作用により分離するカラムが挙げられる。
疎水性相互作用により分離するカラムとしては、例えば、カラム担体の官能基としてオクタデシル基を含むカラム（Ｃ１８カラム）、具体的には、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣＴＭ ＨＳＳ Ｔ３（ウォーターズ製）、ＹＭＣ―Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８（ワイエムシィ製）などが挙げられる。
双極子-双極子相互作用により分離するカラムとしては、例えば、カラム担体の官能基としてフッ素が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基（例えば炭素数３〜９個、特に炭素数３個）を含むカラム、具体的には、Ｆｌｕｏｆｉｘ-ＩＩ １２０Ｅ（和光純薬工業製）、Ｆｌｕｏｐｈａｓｅ ＲＰ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）、Ｆｌｕｏｐｈａｓｅ ＷＰ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）などが挙げられる。
π-π相互作用により分離するカラムとしては、例えば、カラム担体の官能基として芳香環基（フェニル基、ビフェニル基など）を含むカラム、具体的には、Ｘｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｆｌｕｏｒｏ―Ｐｈｅｎｙｌカラム（ウォーターズ製）、Ａｌｌｕｒｅ Ｂｉｐｈｅｎｙｌ カラム（レステック製）、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ Ｐｈ―３（ジーエルサイエンス製）、ＹＭＣ―Ｐａｃｋ Ｐｈ（ワイエムシィ製）、ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｐｈｅｎｙｌ （ウォーターズ製）などが挙げられる。
疎水性相互作用、双極子-双極子相互作用およびπ-π相互作用により分離するカラムとしては、例えば、カラム担体の官能基としてペンタフルオロフェニル基が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基（例えば炭素数３〜９個、特に炭素数３個）を含むカラム、具体的には、Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆ５（シグマ-アルドリッチ製）、ＴＣＩ Ｓｔｅｌｌａ ＰＦＰ（東京化成製）、Ｋｉｎｅｔｅｘ２．６μｍミニボアカラム（フェノメネクス製）、ＣＡＰＣＥＬＬ ＣＯＲＥ（資生堂製）、Ｐｕｒｓｕｉｔ ＰＦＰ（アジレント・テクノロジー製）、ＸＳｅｌｅｃｔ ＨＳＳ ＰＦＰ ＸＰ Ｃｏｌｕｍｎ（ウォーターズ製）、ＹＭＣ―Ｔｒｉａｒｔ ＰＦＰ（ワイエムシィ製）、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤ ＰＦＰ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）などが挙げられる。
本発明においては、ビオチンおよびビオチン関連物質と他の成分とを明確に分離することができることから、疎水性相互作用、双極子-双極子相互作用およびπ-π相互作用により分離するカラムが好ましく、特にカラム担体の官能基としてペンタフルオロフェニル基が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基（例えば炭素数３〜９個、特に炭素数３個）を含むカラムが好ましい。
疎水性相互作用により分離するカラムとしては、例えば、カラム担体の官能基としてオクタデシル基を含むカラム（Ｃ１８カラム）、具体的には、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣＴＭ ＨＳＳ Ｔ３（ウォーターズ製）、ＹＭＣ―Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８（ワイエムシィ製）などが挙げられる。
双極子-双極子相互作用により分離するカラムとしては、例えば、カラム担体の官能基としてフッ素が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基（例えば炭素数３〜９個、特に炭素数３個）を含むカラム、具体的には、Ｆｌｕｏｆｉｘ-ＩＩ １２０Ｅ（和光純薬工業製）、Ｆｌｕｏｐｈａｓｅ ＲＰ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）、Ｆｌｕｏｐｈａｓｅ ＷＰ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）などが挙げられる。
π-π相互作用により分離するカラムとしては、例えば、カラム担体の官能基として芳香環基（フェニル基、ビフェニル基など）を含むカラム、具体的には、Ｘｓｅｌｅｃｔ ＣＳＨ Ｆｌｕｏｒｏ―Ｐｈｅｎｙｌカラム（ウォーターズ製）、Ａｌｌｕｒｅ Ｂｉｐｈｅｎｙｌ カラム（レステック製）、Ｉｎｅｒｔｓｉｌ Ｐｈ―３（ジーエルサイエンス製）、ＹＭＣ―Ｐａｃｋ Ｐｈ（ワイエムシィ製）、ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｐｈｅｎｙｌ （ウォーターズ製）などが挙げられる。
疎水性相互作用、双極子-双極子相互作用およびπ-π相互作用により分離するカラムとしては、例えば、カラム担体の官能基としてペンタフルオロフェニル基が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基（例えば炭素数３〜９個、特に炭素数３個）を含むカラム、具体的には、Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆ５（シグマ-アルドリッチ製）、ＴＣＩ Ｓｔｅｌｌａ ＰＦＰ（東京化成製）、Ｋｉｎｅｔｅｘ２．６μｍミニボアカラム（フェノメネクス製）、ＣＡＰＣＥＬＬ ＣＯＲＥ（資生堂製）、Ｐｕｒｓｕｉｔ ＰＦＰ（アジレント・テクノロジー製）、ＸＳｅｌｅｃｔ ＨＳＳ ＰＦＰ ＸＰ Ｃｏｌｕｍｎ（ウォーターズ製）、ＹＭＣ―Ｔｒｉａｒｔ ＰＦＰ（ワイエムシィ製）、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ＧＯＬＤ ＰＦＰ（サーモフィッシャーサイエンティフィック製）などが挙げられる。
本発明においては、ビオチンおよびビオチン関連物質と他の成分とを明確に分離することができることから、疎水性相互作用、双極子-双極子相互作用およびπ-π相互作用により分離するカラムが好ましく、特にカラム担体の官能基としてペンタフルオロフェニル基が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基（例えば炭素数３〜９個、特に炭素数３個）を含むカラムが好ましい。
ＨＰＬＣの条件は、特に限定されず、使用するカラムに応じて、移動相、流速、カラム温度、などを決定すればよい。
例えばカラム担体の官能基としてペンタフルオロフェニル基が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基（例えば炭素数３〜９個、特に炭素数３個）を含むカラムを使用する場合、例えば以下の条件で行うことが好ましい。
移動相としては、ギ酸、酢酸等の揮発性の酸および／またはギ酸アンモニウムや酢酸アンモニウムなど揮発性の塩を用いて、ｐＨを２〜８に調整した溶液と、メタノールやアセトニトリルなどの有機溶媒との混液を使用することができる。カラム温度および流速並びに試料注入量は特に限定されないが、カラムや装置の性能に合わせて、カラム温度は２０〜５０℃、流速は０．２〜０．６ｍＬ/ｍｉｎ、試料注入量は１〜２０μＬの条件で行うことができる。
例えばカラム担体の官能基としてペンタフルオロフェニル基が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基（例えば炭素数３〜９個、特に炭素数３個）を含むカラムを使用する場合、例えば以下の条件で行うことが好ましい。
移動相としては、ギ酸、酢酸等の揮発性の酸および／またはギ酸アンモニウムや酢酸アンモニウムなど揮発性の塩を用いて、ｐＨを２〜８に調整した溶液と、メタノールやアセトニトリルなどの有機溶媒との混液を使用することができる。カラム温度および流速並びに試料注入量は特に限定されないが、カラムや装置の性能に合わせて、カラム温度は２０〜５０℃、流速は０．２〜０．６ｍＬ/ｍｉｎ、試料注入量は１〜２０μＬの条件で行うことができる。
本発明の測定法は、上記工程（１）および（２）の二工程のみを必須工程とするものであり、従来のＨＰＬＣによるビオチン血漿測定法の前処理において使用されていた誘導体化などの工程が不要であるので、生体試料中のビオチンおよびビオチン関連物質を迅速かつ簡便に高感度で測定することができる。本発明の測定法では、１検体の分析サイクルは、通常、５分程度である。したがって、効率的な多検体処理が可能であり、健康管理や疾患の診断、ビオチンの体内動態に関する研究において、有利に使用することができる。
本発明はまた、生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を測定するための測定用キットであって、
（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程に使用するための試薬と、
（２）高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法に使用するための機器
を含む、キットに関する。
当該キットに使用するための試薬（１）および機器（２）としては、上記本発明の測定法に使用する試薬および機器が挙げられる。
（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程に使用するための試薬と、
（２）高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法に使用するための機器
を含む、キットに関する。
当該キットに使用するための試薬（１）および機器（２）としては、上記本発明の測定法に使用する試薬および機器が挙げられる。
以下、本発明の測定法を、実施例を参照して説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例１
１. 標準溶液および内標準溶液の調製
１．１ 標準原液
ビオチン（分子式：Ｃ１０Ｈ１６Ｎ２Ｏ３Ｓ、分子量：２４４．３１、サンケミカル株式会社製）１０ｍｇを正確に量り、メタノールでメスフラスコにて１０ｍＬとし超音波洗浄器で溶解して１ｍｇ/ｍＬの標準原液を調製した。
ビオチンの構造式：
１．２ 検量線用標準溶液
標準原液を下表１に従いシリコンコーティングされたガラス試験管を用いてメタノールで希釈し、検量線用標準溶液を調製した。
１. 標準溶液および内標準溶液の調製
１．１ 標準原液
ビオチン（分子式：Ｃ１０Ｈ１６Ｎ２Ｏ３Ｓ、分子量：２４４．３１、サンケミカル株式会社製）１０ｍｇを正確に量り、メタノールでメスフラスコにて１０ｍＬとし超音波洗浄器で溶解して１ｍｇ/ｍＬの標準原液を調製した。
ビオチンの構造式：
１．２ 検量線用標準溶液
標準原液を下表１に従いシリコンコーティングされたガラス試験管を用いてメタノールで希釈し、検量線用標準溶液を調製した。
１．３． 内標準原液および内標準溶液
ｒａｃ ビオチン-ｄ４（分子式：Ｃ１０Ｈ１２Ｄ４Ｎ２Ｏ３Ｓ、分子量：２４８．３４、トロントリサーチケミカルズ製）の１ｍｇ入り製品の容器にメタノールを１ｍＬ添加し、超音波洗浄器で溶解して１ｍｇ／ｍＬの内標準原液を調製した。
ｒａｃ ビオチン-ｄ４の構造式：
この内標準原液２００μＬを２０ｍＬのメスフラスコに採取して、メタノールで２０ｍＬにメスアップし、１０μｇ／ｍＬの内標準溶液（ＩＳＳ-１）を調製した。
ＩＳＳ-１を下表２に従いメスフラスコを用いてメタノールで希釈し、内標準溶液（ＩＳＳ-３）を調製した。なお、調製量の増減は可とし、必要量に応じて同比率にて調製した。
ｒａｃ ビオチン-ｄ４（分子式：Ｃ１０Ｈ１２Ｄ４Ｎ２Ｏ３Ｓ、分子量：２４８．３４、トロントリサーチケミカルズ製）の１ｍｇ入り製品の容器にメタノールを１ｍＬ添加し、超音波洗浄器で溶解して１ｍｇ／ｍＬの内標準原液を調製した。
ｒａｃ ビオチン-ｄ４の構造式：
この内標準原液２００μＬを２０ｍＬのメスフラスコに採取して、メタノールで２０ｍＬにメスアップし、１０μｇ／ｍＬの内標準溶液（ＩＳＳ-１）を調製した。
ＩＳＳ-１を下表２に従いメスフラスコを用いてメタノールで希釈し、内標準溶液（ＩＳＳ-３）を調製した。なお、調製量の増減は可とし、必要量に応じて同比率にて調製した。
２. 分析法検証用試料の調製
２．１． 検量線用試料
検量線用標準溶液ＳＳ-５〜ＳＳ-１０を３０μＬずつ採取し、Ｄ-ＰＢＳ（-）（細胞培養用、和光純薬工業製） ３００μＬを添加し、検量線用試料を調製した（調製濃度２、１、０．５、０．４、０．２および０．１ｎｇ／ｍＬ）。
ブランク試料およびゼロ試料はメタノール３０μＬにＤ-ＰＢＳ（-）３００μＬを添加した。
２．２. 血漿試料
正常ヒト血漿・プール（コスモバイオ製、抗凝固剤：ヘパリンナトリウム、以下、「ヒト血漿」と称する）３００μＬにメタノール３０μＬを添加し、血漿試料を調製した。
２．３. ビオチン添加血漿試料
検量線用標準溶液ＳＳ-４（１００ｎｇ／Ｌ）をメタノールで２倍に希釈して５０ｎｇ/ｍＬ溶液を調製後、１０ｍＬのメスフラスコに１００μＬ採取し、ヒト血漿で正確にメスアップしたビオチン濃度０．５ｎｇ／ｍＬの溶液３００μＬにメタノールを３０μＬを添加し、ビオチン添加血漿試料を調製した。
２．１． 検量線用試料
検量線用標準溶液ＳＳ-５〜ＳＳ-１０を３０μＬずつ採取し、Ｄ-ＰＢＳ（-）（細胞培養用、和光純薬工業製） ３００μＬを添加し、検量線用試料を調製した（調製濃度２、１、０．５、０．４、０．２および０．１ｎｇ／ｍＬ）。
ブランク試料およびゼロ試料はメタノール３０μＬにＤ-ＰＢＳ（-）３００μＬを添加した。
２．２. 血漿試料
正常ヒト血漿・プール（コスモバイオ製、抗凝固剤：ヘパリンナトリウム、以下、「ヒト血漿」と称する）３００μＬにメタノール３０μＬを添加し、血漿試料を調製した。
２．３. ビオチン添加血漿試料
検量線用標準溶液ＳＳ-４（１００ｎｇ／Ｌ）をメタノールで２倍に希釈して５０ｎｇ/ｍＬ溶液を調製後、１０ｍＬのメスフラスコに１００μＬ採取し、ヒト血漿で正確にメスアップしたビオチン濃度０．５ｎｇ／ｍＬの溶液３００μＬにメタノールを３０μＬを添加し、ビオチン添加血漿試料を調製した。
３. 試料前処理法
以下の手順で試料の前処理を行った。
（１）検量線用試料、ゼロ試料およびビオチン添加血漿試料には内標準溶液ＩＳＳ-３を３０μＬ添加した。ブランク試料および血漿試料にはメタノールを３０μＬ添加した。
（２）各試料にメタノールを１．２ｍＬ添加し、血漿を含まない試料は約５〜１０秒間、血漿を含む試料は約１分間撹拌した。
（３）血漿を含まない試料は１ｍＬを採取し、血漿を含む試料は４℃、１０，０００ｒｐｍ（９１７５×ｇ）で１０分間遠心し、上清を１ｍＬ採取した。
（４）５０℃で窒素ガスによる蒸発乾固を行い、残渣に１０％メタノール２００μＬを添加し、超音波洗浄器で１５分間溶解した。
（５）溶解後、ＨＰＬＣバイアルに移し、血漿を含まない試料はそのままＬＣ/ＭＳ/ＭＳで分析した。血漿を含む試料は０．２μｍのフィルター（マイレクス-ＬＨフィルターユニット、フィルター直径４ｍｍ、フィルター孔径０．２０μｍ、ＰＴＦＥ、親水性、ミリポア製）でろ過後、ＨＰＬＣバイアルに移し、ＬＣ/ＭＳ/ＭＳで分析した。
以下の手順で試料の前処理を行った。
（１）検量線用試料、ゼロ試料およびビオチン添加血漿試料には内標準溶液ＩＳＳ-３を３０μＬ添加した。ブランク試料および血漿試料にはメタノールを３０μＬ添加した。
（２）各試料にメタノールを１．２ｍＬ添加し、血漿を含まない試料は約５〜１０秒間、血漿を含む試料は約１分間撹拌した。
（３）血漿を含まない試料は１ｍＬを採取し、血漿を含む試料は４℃、１０，０００ｒｐｍ（９１７５×ｇ）で１０分間遠心し、上清を１ｍＬ採取した。
（４）５０℃で窒素ガスによる蒸発乾固を行い、残渣に１０％メタノール２００μＬを添加し、超音波洗浄器で１５分間溶解した。
（５）溶解後、ＨＰＬＣバイアルに移し、血漿を含まない試料はそのままＬＣ/ＭＳ/ＭＳで分析した。血漿を含む試料は０．２μｍのフィルター（マイレクス-ＬＨフィルターユニット、フィルター直径４ｍｍ、フィルター孔径０．２０μｍ、ＰＴＦＥ、親水性、ミリポア製）でろ過後、ＨＰＬＣバイアルに移し、ＬＣ/ＭＳ/ＭＳで分析した。
４. 分析条件
分析には以下の機器を使用した。
分析には以下の機器を使用した。
４．１. ＨＰＬＣの移動相の調製
ギ酸アンモニウム６３０．６ｍｇを正確に量り、精製水でメスフラスコにて１０００ｍＬとし、１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム溶液を調製した。これにギ酸を添加してｐＨ３．０に調整して移動相Ａ液とした。
４．２. ＨＰＬＣ条件
分析カラム：ACQUITY UPLC HSS T3 (1.8μm、2.1×100mm)（ウォーターズ製）
ガードフィルター：KrudKatcher Ultra In-Line Filter（フェノメネクス製）
カラム温度：50℃
移動相：A液：10mmol/Lギ酸アンモニウム（pH 3.0）、B液：アセトニトリル
タイムプログラム：
0→1.5min：20%B
1.5→3.0min：80%B
3.0→5.0min：20%B（分析サイクル：5分）
流速：0.4mL/min
４．３. オートサンプラー条件
オートサンプラー設定温度：4℃
洗浄溶媒：10％メタノール
注入量：15μL
４．４. ＭＳ/ＭＳ条件
イオン化法：ESI法（ポジティブイオンモード）
イオンスプレイ電圧：5500V
ターボヒーター：700℃
カーテンガス：30psi
ネブライザーガス：30psi
デソルベーションガス：80psi
測定法：MRM
モニターイオン：
ビオチン：m/z 245＞227（CE19）
rac biotin-d4：m/z 249＞231（CE19）
ギ酸アンモニウム６３０．６ｍｇを正確に量り、精製水でメスフラスコにて１０００ｍＬとし、１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム溶液を調製した。これにギ酸を添加してｐＨ３．０に調整して移動相Ａ液とした。
４．２. ＨＰＬＣ条件
分析カラム：ACQUITY UPLC HSS T3 (1.8μm、2.1×100mm)（ウォーターズ製）
ガードフィルター：KrudKatcher Ultra In-Line Filter（フェノメネクス製）
カラム温度：50℃
移動相：A液：10mmol/Lギ酸アンモニウム（pH 3.0）、B液：アセトニトリル
タイムプログラム：
0→1.5min：20%B
1.5→3.0min：80%B
3.0→5.0min：20%B（分析サイクル：5分）
流速：0.4mL/min
４．３. オートサンプラー条件
オートサンプラー設定温度：4℃
洗浄溶媒：10％メタノール
注入量：15μL
４．４. ＭＳ/ＭＳ条件
イオン化法：ESI法（ポジティブイオンモード）
イオンスプレイ電圧：5500V
ターボヒーター：700℃
カーテンガス：30psi
ネブライザーガス：30psi
デソルベーションガス：80psi
測定法：MRM
モニターイオン：
ビオチン：m/z 245＞227（CE19）
rac biotin-d4：m/z 249＞231（CE19）
５. 濃度算出法
検量線用試料（６濃度：０．１、０．２、０．４、０．５、１および２ｎｇ／ｍＬ、各濃度ｎ＝１）を調製し、測定した。測定には内標準物質（ＩＳＳ-３）とのピーク面積比による内標準法により行った。定量値は、Ａｎａｌｙｓｔ Ｖｅｒ．１．６．１（エービー・サイエックス製）により算出した。検量線の重み付けには１／ｘ２を用いた。
検量線用試料（６濃度：０．１、０．２、０．４、０．５、１および２ｎｇ／ｍＬ、各濃度ｎ＝１）を調製し、測定した。測定には内標準物質（ＩＳＳ-３）とのピーク面積比による内標準法により行った。定量値は、Ａｎａｌｙｓｔ Ｖｅｒ．１．６．１（エービー・サイエックス製）により算出した。検量線の重み付けには１／ｘ２を用いた。
６. 結果
６．１. 血漿試料
図１に血漿試料および検量線試料（０．０５ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示す。内標準物質について、血漿中に妨害と成り得るピークは確認できなかった。
６．２. 検量線
図２に典型的な検量線の結果を示す。０．１〜２ｎｇ／ｍＬの濃度範囲において、検量線の直線性は３回の測定において相関係数（ｒ）がそれぞれ０．９９９６、０．９９９６および０．９９９８、相対誤差（％ＲＥ）はそれぞれ-２．０〜＋３．０％、-２．８〜＋２．４％、-２．３〜＋１．５％であり、判断基準（ｒ：０．９９以上、％ＲＥ：定量下限濃度で±２０％以内、その他で±１５％以内）を満たしていた。また、定量限界値は０．１ｎｇ／ｍＬであった。
６．３. ビオチンおよびｒａｃ ビオチン-ｄ４添加血漿試料
図４にビオチンおよびｒａｃビオチン-ｄ４添加血漿試料のクロマトグラムを示す。
また、表４に得られたビオチン添加血漿試料の定量値から血漿試料（ブランク）の定量値の平均値を差し引き、真度（％ＲＥ）、精度（％ＣＶ）および回収率（％）を下記式（１）〜（３）により算出した結果を示した。０．５ｎｇ／ｍＬ添加試料において、精度（％ＣＶ）は２．２％、真度（％ＲＥ）は-３．４％であり、判断基準（％ＣＶ：１５．０％以下、％ＲＥ：±１５．０％以内）を満たしていた。
６．１. 血漿試料
図１に血漿試料および検量線試料（０．０５ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示す。内標準物質について、血漿中に妨害と成り得るピークは確認できなかった。
６．２. 検量線
図２に典型的な検量線の結果を示す。０．１〜２ｎｇ／ｍＬの濃度範囲において、検量線の直線性は３回の測定において相関係数（ｒ）がそれぞれ０．９９９６、０．９９９６および０．９９９８、相対誤差（％ＲＥ）はそれぞれ-２．０〜＋３．０％、-２．８〜＋２．４％、-２．３〜＋１．５％であり、判断基準（ｒ：０．９９以上、％ＲＥ：定量下限濃度で±２０％以内、その他で±１５％以内）を満たしていた。また、定量限界値は０．１ｎｇ／ｍＬであった。
６．３. ビオチンおよびｒａｃ ビオチン-ｄ４添加血漿試料
図４にビオチンおよびｒａｃビオチン-ｄ４添加血漿試料のクロマトグラムを示す。
また、表４に得られたビオチン添加血漿試料の定量値から血漿試料（ブランク）の定量値の平均値を差し引き、真度（％ＲＥ）、精度（％ＣＶ）および回収率（％）を下記式（１）〜（３）により算出した結果を示した。０．５ｎｇ／ｍＬ添加試料において、精度（％ＣＶ）は２．２％、真度（％ＲＥ）は-３．４％であり、判断基準（％ＣＶ：１５．０％以下、％ＲＥ：±１５．０％以内）を満たしていた。
実施例２
１. 標準溶液および内標準溶液の調製
１．１. 標準原液
ビオチン１０ｍｇを正確に量り、メタノールでメスフラスコにて１０ｍＬとし超音波洗浄器で溶解して１ｍｇ／ｍＬの標準原液を調製した。
１．２. 検量線用標準溶液
標準原液を下表５に従いシリコンコーティングされたガラス試験管を用いてメタノールで希釈し、検量線用標準溶液を調製した。
１. 標準溶液および内標準溶液の調製
１．１. 標準原液
ビオチン１０ｍｇを正確に量り、メタノールでメスフラスコにて１０ｍＬとし超音波洗浄器で溶解して１ｍｇ／ｍＬの標準原液を調製した。
１．２. 検量線用標準溶液
標準原液を下表５に従いシリコンコーティングされたガラス試験管を用いてメタノールで希釈し、検量線用標準溶液を調製した。
１．３. 内標準原液および内標準溶液
実施例１で調製した内標準溶液（ＩＳＳ-１）２００μＬを５ｍＬのメスフラスコに採取して、メタノールで５ｍＬにメスアップし、４００ｎｇ／ｍＬの内標準溶液（ＩＳＳ-４）を調製した。
実施例１で調製した内標準溶液（ＩＳＳ-１）２００μＬを５ｍＬのメスフラスコに採取して、メタノールで５ｍＬにメスアップし、４００ｎｇ／ｍＬの内標準溶液（ＩＳＳ-４）を調製した。
２. 分析法検証用試料の調製
２．１. 検量線用試料
検量線用標準溶液ＳＳ-５〜ＳＳ-７およびＳＳ-９〜ＳＳ-１１を３０μＬずつ採取し、Ｄ-ＰＢＳ（-）３００μＬを添加し、検量線用試料を調製した（調製濃度２、１、０．５、０．２、０．１および０．０５ｎｇ／ｍＬ）。
ブランク試料およびゼロ試料はメタノール３０μＬにＤ-ＰＢＳ（-）３００μＬを添加した。
２．２. 血漿試料
ヒト血漿３００μＬにメタノール３０μＬを添加し、血漿試料を調製した。
２．３. ビオチン添加血漿試料
検量線用標準溶液ＳＳ-４（１００ｎｇ／Ｌ）をメタノールで２倍に希釈して５０ｎｇ／ｍＬ溶液を調製し、１０ｍＬのメスフラスコに１００μＬ採取し、ヒト血漿で正確にメスアップしたビオチン濃度０．５ｎｇ／ｍＬの溶液３００μＬにメタノールを３０μＬ添加し、ビオチン添加血漿試料を調製した。
２．１. 検量線用試料
検量線用標準溶液ＳＳ-５〜ＳＳ-７およびＳＳ-９〜ＳＳ-１１を３０μＬずつ採取し、Ｄ-ＰＢＳ（-）３００μＬを添加し、検量線用試料を調製した（調製濃度２、１、０．５、０．２、０．１および０．０５ｎｇ／ｍＬ）。
ブランク試料およびゼロ試料はメタノール３０μＬにＤ-ＰＢＳ（-）３００μＬを添加した。
２．２. 血漿試料
ヒト血漿３００μＬにメタノール３０μＬを添加し、血漿試料を調製した。
２．３. ビオチン添加血漿試料
検量線用標準溶液ＳＳ-４（１００ｎｇ／Ｌ）をメタノールで２倍に希釈して５０ｎｇ／ｍＬ溶液を調製し、１０ｍＬのメスフラスコに１００μＬ採取し、ヒト血漿で正確にメスアップしたビオチン濃度０．５ｎｇ／ｍＬの溶液３００μＬにメタノールを３０μＬ添加し、ビオチン添加血漿試料を調製した。
３. 試料前処理法
以下の手順で試料の前処理を行った。
（１）検量線用試料、ゼロ試料およびビオチン添加血漿試料には内標準溶液ＩＳＳ-４を３０μＬ添加した。ブランク試料および血漿試料にはメタノールを３０μＬ添加した。
（２）各試料にメタノールを１．２ｍＬ添加し、血漿を含まない試料は約５〜１０秒間、血漿を含む試料は約１分間撹拌した。
（３）血漿を含まない試料は１ｍＬを採取し、血漿を含む試料は４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を１ｍＬ採取した。
（４）５０℃で窒素ガスによる蒸発乾固を行い、残渣に１％ギ酸/メタノール（９/１）２００μＬを添加し、超音波洗浄器で１５分間溶解した。
（５）溶解後、ＨＰＬＣバイアルに移し、血漿を含まない試料はそのままＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した。血漿を含む試料は０．４５μｍのフィルター（マイレクス-ＬＨフィルターユニット、フィルター直径４ｍｍ、フィルター孔径０．４５μｍ、ＰＴＦＥ、親水性、ミリポア製）でろ過し、ＨＰＬＣバイアルに移し、ＬＣ/ＭＳ/ＭＳで分析した。
以下の手順で試料の前処理を行った。
（１）検量線用試料、ゼロ試料およびビオチン添加血漿試料には内標準溶液ＩＳＳ-４を３０μＬ添加した。ブランク試料および血漿試料にはメタノールを３０μＬ添加した。
（２）各試料にメタノールを１．２ｍＬ添加し、血漿を含まない試料は約５〜１０秒間、血漿を含む試料は約１分間撹拌した。
（３）血漿を含まない試料は１ｍＬを採取し、血漿を含む試料は４℃、１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心し、上清を１ｍＬ採取した。
（４）５０℃で窒素ガスによる蒸発乾固を行い、残渣に１％ギ酸/メタノール（９/１）２００μＬを添加し、超音波洗浄器で１５分間溶解した。
（５）溶解後、ＨＰＬＣバイアルに移し、血漿を含まない試料はそのままＬＣ／ＭＳ／ＭＳで分析した。血漿を含む試料は０．４５μｍのフィルター（マイレクス-ＬＨフィルターユニット、フィルター直径４ｍｍ、フィルター孔径０．４５μｍ、ＰＴＦＥ、親水性、ミリポア製）でろ過し、ＨＰＬＣバイアルに移し、ＬＣ/ＭＳ/ＭＳで分析した。
４. 分析条件
分析には以下の機器を使用した。
分析には以下の機器を使用した。
４．１. ＨＰＬＣの移動相の調製
ギ酸アンモニウム６３０．６ｍｇを正確に量り、精製水でメスフラスコにて１０００ｍＬとし、１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム溶液を調製した。また、ギ酸５００μＬをメスフラスコを用いて精製水で１０ｍＬとして、５％ギ酸溶液を調製した。ギ酸アンモニウム溶液１０００ｍＬに５％ギ酸溶液を２．８ｍＬ添加して撹拌し、ｐＨが約４．１であることを確認し、これを移動相Ａ液とした。
４．２. ＨＰＬＣ条件
分析カラム：Ascentis Express F5 HPLC Column (2.7μm、2.1×100mm)（シグマ-アルドリッチ製）
ガードフィルター：KrudKatcher Ultra In-Line Filter（フェノメネクス製）
カラム温度：50℃
移動相：A液：10mmol/Lギ酸アンモニウム（pH4.1）、B液：アセトニトリル
タイムプログラム：
0→2.5min：7%B
2.5→4.0min：70%B
4.0→5.0min：7%B（分析サイクル：5分）
流速：0.6mL/min
４．３. オートサンプラー条件
オートサンプラー設定温度：4℃
洗浄溶媒：10%メタノール
注入量：20μL
４．４. ＭＳ/ＭＳ条件
イオン化法：ESI法（ポジティブイオンモード）
イオンスプレイ電圧：5500V
ターボヒーター：700℃
カーテンガス：30psi
ネブライザーガス：30psi
デソルベーションガス：80psi
測定法：MRM
モニターイオン：
ビオチン：m/z 245 > 227 (CE19)
rac ビオチン-d4：m/z 249 > 231 (CE19)
ギ酸アンモニウム６３０．６ｍｇを正確に量り、精製水でメスフラスコにて１０００ｍＬとし、１０ｍｍｏｌ／Ｌギ酸アンモニウム溶液を調製した。また、ギ酸５００μＬをメスフラスコを用いて精製水で１０ｍＬとして、５％ギ酸溶液を調製した。ギ酸アンモニウム溶液１０００ｍＬに５％ギ酸溶液を２．８ｍＬ添加して撹拌し、ｐＨが約４．１であることを確認し、これを移動相Ａ液とした。
４．２. ＨＰＬＣ条件
分析カラム：Ascentis Express F5 HPLC Column (2.7μm、2.1×100mm)（シグマ-アルドリッチ製）
ガードフィルター：KrudKatcher Ultra In-Line Filter（フェノメネクス製）
カラム温度：50℃
移動相：A液：10mmol/Lギ酸アンモニウム（pH4.1）、B液：アセトニトリル
タイムプログラム：
0→2.5min：7%B
2.5→4.0min：70%B
4.0→5.0min：7%B（分析サイクル：5分）
流速：0.6mL/min
４．３. オートサンプラー条件
オートサンプラー設定温度：4℃
洗浄溶媒：10%メタノール
注入量：20μL
４．４. ＭＳ/ＭＳ条件
イオン化法：ESI法（ポジティブイオンモード）
イオンスプレイ電圧：5500V
ターボヒーター：700℃
カーテンガス：30psi
ネブライザーガス：30psi
デソルベーションガス：80psi
測定法：MRM
モニターイオン：
ビオチン：m/z 245 > 227 (CE19)
rac ビオチン-d4：m/z 249 > 231 (CE19)
５. 濃度算出法
検量線用試料（６濃度：０．０５、０．１、０．２、０．５、１および２ｎｇ／ｍＬ、各濃度ｎ＝１）を調製し、測定した。測定には内標準物質（ＩＳＳ-４）とのピーク面積比による内標準法により行った。定量値は、Ａｎａｌｙｓｔ Ｖｅｒ.１.６．１（エービー・サイエックス）により算出した。検量線の重み付けには１／ｘ２を用いた。
検量線用試料（６濃度：０．０５、０．１、０．２、０．５、１および２ｎｇ／ｍＬ、各濃度ｎ＝１）を調製し、測定した。測定には内標準物質（ＩＳＳ-４）とのピーク面積比による内標準法により行った。定量値は、Ａｎａｌｙｓｔ Ｖｅｒ.１.６．１（エービー・サイエックス）により算出した。検量線の重み付けには１／ｘ２を用いた。
６. 結果
６．１. 血漿試料
図４に血漿試料および検量線試料（０．１ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した。内標準物質について、血漿中に妨害と成り得るピークは確認できなかった。
６．２. 検量線
図５に典型的な検量線の結果を示した。０．０５〜２ｎｇ／ｍＬの濃度範囲において、検量線の直線性は３回の測定において相関係数（ｒ）がそれぞれ０．９９９７、０．９９９３および０．９９９７、相対誤差（％ＲＥ）はそれぞれ-４．０〜＋２．０％、-４．０〜＋３.２％、-３．５〜＋２．３％であり、判断基準（ｒ：０．９９以上、％ＲＥ：定量下限濃度で±２０％以内、その他で±１５％以内）を満たしていた。また、定量限界値は０．０５ｎｇ／ｍＬであった。
６．３. ビオチンおよびｒａｃビオチン-ｄ４添加血漿試料
図６にビオチンおよびｒａｃビオチン-ｄ４添加血漿試料のクロマトグラムを示す。
また、表７に得られたビオチン添加血漿試料の定量値から血漿試料（ブランク）の定量値の平均値を差し引き、真度（％ＲＥ）、精度（％ＣＶ）および回収率（％）を上記式（１）〜（３）により算出した結果を示した。０．５ｎｇ／ｍＬ添加試料において、精度（％ＣＶ）は２．２％、真度（％ＲＥ）は-３．４％であり、判断基準（％ＣＶ：１５．０％以下、％ＲＥ：±１５．０％以内）を満たしていた。
６．１. 血漿試料
図４に血漿試料および検量線試料（０．１ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した。内標準物質について、血漿中に妨害と成り得るピークは確認できなかった。
６．２. 検量線
図５に典型的な検量線の結果を示した。０．０５〜２ｎｇ／ｍＬの濃度範囲において、検量線の直線性は３回の測定において相関係数（ｒ）がそれぞれ０．９９９７、０．９９９３および０．９９９７、相対誤差（％ＲＥ）はそれぞれ-４．０〜＋２．０％、-４．０〜＋３.２％、-３．５〜＋２．３％であり、判断基準（ｒ：０．９９以上、％ＲＥ：定量下限濃度で±２０％以内、その他で±１５％以内）を満たしていた。また、定量限界値は０．０５ｎｇ／ｍＬであった。
６．３. ビオチンおよびｒａｃビオチン-ｄ４添加血漿試料
図６にビオチンおよびｒａｃビオチン-ｄ４添加血漿試料のクロマトグラムを示す。
また、表７に得られたビオチン添加血漿試料の定量値から血漿試料（ブランク）の定量値の平均値を差し引き、真度（％ＲＥ）、精度（％ＣＶ）および回収率（％）を上記式（１）〜（３）により算出した結果を示した。０．５ｎｇ／ｍＬ添加試料において、精度（％ＣＶ）は２．２％、真度（％ＲＥ）は-３．４％であり、判断基準（％ＣＶ：１５．０％以下、％ＲＥ：±１５．０％以内）を満たしていた。
実施例３
健常人および透析患者の血漿中ビオチン濃度を固定相がオクタデシルシリル（ＯＤＳ）（Ｃ１８）であるカラム（ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３、ウォーターズ製）を用いた分析法（以下、「ＯＤＳ法」）、ペンタフルオロフェニル(ＰＦＰ)カラム（Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆ５ ＨＰＬＣ ｃｏｌｕｍｎ、シグマ-アルドリッチ製）を用いた分析法（以下、「ＰＦＰ法」）により測定した。
健常人および透析患者の血漿中ビオチン濃度を固定相がオクタデシルシリル（ＯＤＳ）（Ｃ１８）であるカラム（ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＨＳＳ Ｔ３、ウォーターズ製）を用いた分析法（以下、「ＯＤＳ法」）、ペンタフルオロフェニル(ＰＦＰ)カラム（Ａｓｃｅｎｔｉｓ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｆ５ ＨＰＬＣ ｃｏｌｕｍｎ、シグマ-アルドリッチ製）を用いた分析法（以下、「ＰＦＰ法」）により測定した。
１. 実験方法
血漿試料は、健常人および透析患者より採血し、分離した血漿３００μＬにメタノール３０μＬを添加したものを使用した。
検量線用試料の調製は、ＯＤＳ法、ＰＦＰ法共に実施例２の条件にて行った。また、分析方法は、ＯＤＳ法は実施例１、ＰＦＰ法は実施例２の条件にしたがって測定した。
試料前処理法については、検量線用試料、ゼロ試料および血漿試料には内標準溶液（ＩＳＳ-３）を３０μＬ添加し、ブランク試料にはメタノールを３０μＬ添加した。その後は実施例２の３．（２）〜（５）の手順に従い行った。
血漿試料は、健常人および透析患者より採血し、分離した血漿３００μＬにメタノール３０μＬを添加したものを使用した。
検量線用試料の調製は、ＯＤＳ法、ＰＦＰ法共に実施例２の条件にて行った。また、分析方法は、ＯＤＳ法は実施例１、ＰＦＰ法は実施例２の条件にしたがって測定した。
試料前処理法については、検量線用試料、ゼロ試料および血漿試料には内標準溶液（ＩＳＳ-３）を３０μＬ添加し、ブランク試料にはメタノールを３０μＬ添加した。その後は実施例２の３．（２）〜（５）の手順に従い行った。
２. 結果
２．１. ビオチンピークの分離
図７に示されるように、ＯＤＳ法では、ＭＲＭクロマトグラム上でビオチンのピークに夾雑ピークが重なりピークの分離が困難であった。特に透析患者の血漿においてこの傾向が強く見られた。一方、ＰＦＰ法を用いた場合、ビオチンのピークを分離することができた。
２．２. イオン化抑制
表８に示されるように、ＯＤＳ法では、マトリックス効果によるイオン化抑制が強く、内標準物質で比較すると、透析患者の血漿において、標準液のピーク面積に対して５０％以下の面積値となる血漿試料が散見されたが、ＰＦＰ法ではイオン化抑制が改善された。これにより、低濃度の血漿中ビオチンピークを検出することができた。
２．３. 定量限界値
上記のように、ＰＦＰ法は、ＯＤＳ法に比べてビオチンピークの分離およびイオン化抑制の点で改善されていた。これにより、ビオチンの定量限界値は、ＯＤＳ法が０．１ｎｇ／ｍＬであるのに対して、ＰＦＰ法は０．０５ｎｇ／ｍＬであり、高感度であった。
２．１. ビオチンピークの分離
図７に示されるように、ＯＤＳ法では、ＭＲＭクロマトグラム上でビオチンのピークに夾雑ピークが重なりピークの分離が困難であった。特に透析患者の血漿においてこの傾向が強く見られた。一方、ＰＦＰ法を用いた場合、ビオチンのピークを分離することができた。
２．２. イオン化抑制
表８に示されるように、ＯＤＳ法では、マトリックス効果によるイオン化抑制が強く、内標準物質で比較すると、透析患者の血漿において、標準液のピーク面積に対して５０％以下の面積値となる血漿試料が散見されたが、ＰＦＰ法ではイオン化抑制が改善された。これにより、低濃度の血漿中ビオチンピークを検出することができた。
２．３. 定量限界値
上記のように、ＰＦＰ法は、ＯＤＳ法に比べてビオチンピークの分離およびイオン化抑制の点で改善されていた。これにより、ビオチンの定量限界値は、ＯＤＳ法が０．１ｎｇ／ｍＬであるのに対して、ＰＦＰ法は０．０５ｎｇ／ｍＬであり、高感度であった。
実施例４
血液透析患者の血液透析（ＨＤ）廃液中ビオチン濃度をＰＦＰ法により測定した。
１. 実験方法
血液透析廃液試料は、血液透析患者の血液透析廃液（ＨＤ廃液１〜４）３００μＬにメタノール３０μＬを添加したものを使用した。
検量線用試料の調製および分析方法は、実施例２の条件にて行った。また、試料前処理法については、検量線試料およびビオチン測定用血液透析廃液試料には内標準物質（ＩＳＳ-４）３０μＬを、妨害ピーク確認用血液透析廃液試料についてはメタノール３０μＬを添加し、以後は実施例２の３．（２）〜（５）に従い行った。
２. 結果
２．１. 血液透析廃液試料中妨害ピークの確認
図８に血液透析廃液試料および検量線試料（０．５ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した。また、内標準物質であるｒａｃビオチン-ｄ４について、血液透析廃液中に妨害と成り得るピークは確認できなかった（図８Ｄ）。
２．２. 血液透析廃液試料中ビオチン濃度
表９に血液透析廃液中ビオチン濃度の測定結果を示した。
血液透析患者の血液透析（ＨＤ）廃液中ビオチン濃度をＰＦＰ法により測定した。
１. 実験方法
血液透析廃液試料は、血液透析患者の血液透析廃液（ＨＤ廃液１〜４）３００μＬにメタノール３０μＬを添加したものを使用した。
検量線用試料の調製および分析方法は、実施例２の条件にて行った。また、試料前処理法については、検量線試料およびビオチン測定用血液透析廃液試料には内標準物質（ＩＳＳ-４）３０μＬを、妨害ピーク確認用血液透析廃液試料についてはメタノール３０μＬを添加し、以後は実施例２の３．（２）〜（５）に従い行った。
２. 結果
２．１. 血液透析廃液試料中妨害ピークの確認
図８に血液透析廃液試料および検量線試料（０．５ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した。また、内標準物質であるｒａｃビオチン-ｄ４について、血液透析廃液中に妨害と成り得るピークは確認できなかった（図８Ｄ）。
２．２. 血液透析廃液試料中ビオチン濃度
表９に血液透析廃液中ビオチン濃度の測定結果を示した。
実施例５
血液透析濾過（ＨＤＦ）廃液中のビオチン濃度をＰＦＰ法により測定した。
１. 実験方法
血液透析濾過試料は血液透析濾過患者の廃液（ＨＤＦ廃液）３００μＬにメタノール３０μＬを添加したものを使用した。
検量線用試料の調整および分析方法については、実施例２の条件にて行った。また、試料前処理法については実施例４に従って行った。
２. 結果
２．１. 血液透析濾過試料中妨害ピークの確認
図９に血液透析濾過廃液試料および検量線試料（０．５ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した。内標準物質であるｒａｃビオチン-ｄ４について、血液透析濾過廃液中に妨害と成り得るピークは確認できなかった（図９Ｄ）。
２．２. 血液透析濾過廃液試料中ビオチン濃度
表１０に血液透析濾過廃液中ビオチン濃度の測定結果を示した。
血液透析濾過（ＨＤＦ）廃液中のビオチン濃度をＰＦＰ法により測定した。
１. 実験方法
血液透析濾過試料は血液透析濾過患者の廃液（ＨＤＦ廃液）３００μＬにメタノール３０μＬを添加したものを使用した。
検量線用試料の調整および分析方法については、実施例２の条件にて行った。また、試料前処理法については実施例４に従って行った。
２. 結果
２．１. 血液透析濾過試料中妨害ピークの確認
図９に血液透析濾過廃液試料および検量線試料（０．５ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した。内標準物質であるｒａｃビオチン-ｄ４について、血液透析濾過廃液中に妨害と成り得るピークは確認できなかった（図９Ｄ）。
２．２. 血液透析濾過廃液試料中ビオチン濃度
表１０に血液透析濾過廃液中ビオチン濃度の測定結果を示した。
実施例６
腹膜透析廃液中のビオチン濃度をＰＦＰ法により測定した。
１. 実験方法
腹膜透析廃液試料は、腹膜透析患者の廃液（ＰＤ廃液）３００μＬにメタノール３０μＬを添加したものを使用した。
検量線用試料の調整および分析方法については、実施例２の条件にて行った。試料前処理法は、実施例４の条件にて行った。
２. 結果
２．１. 腹膜透析廃液試料中妨害ピークの確認
図１０に腹膜透析廃液試料および検量線試料（２.０ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した。内標準物質であるｒａｃビオチン-ｄ４について、腹膜透析廃液中に妨害と成り得るピークは確認できなかった（図１０Ｄ）。
２．２. 腹膜透析廃液試料中ビオチン濃度
表１１に腹膜透析廃液中ビオチン濃度の測定結果を示した。
腹膜透析廃液中のビオチン濃度をＰＦＰ法により測定した。
１. 実験方法
腹膜透析廃液試料は、腹膜透析患者の廃液（ＰＤ廃液）３００μＬにメタノール３０μＬを添加したものを使用した。
検量線用試料の調整および分析方法については、実施例２の条件にて行った。試料前処理法は、実施例４の条件にて行った。
２. 結果
２．１. 腹膜透析廃液試料中妨害ピークの確認
図１０に腹膜透析廃液試料および検量線試料（２.０ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した。内標準物質であるｒａｃビオチン-ｄ４について、腹膜透析廃液中に妨害と成り得るピークは確認できなかった（図１０Ｄ）。
２．２. 腹膜透析廃液試料中ビオチン濃度
表１１に腹膜透析廃液中ビオチン濃度の測定結果を示した。
実施例７
尿中のビオチン濃度をＰＦＰ法により測定した。
１. 実験方法
検量線用試料の調整および分析方法については、実施例２の条件にて行った。尿試料は、血液透析患者の尿（尿１：透析治療歴約１年の糖尿病患者、尿２：透析治療歴約３年の非糖尿病患者）および蛋白尿（尿３：尿蛋白２＋）各３００μＬにメタノール３０μＬを添加したものを使用した。試料前処理法は、実施例４の条件にて行った。
２. 結果
２．１. 透析廃液試料中妨害ピークの確認
図１１に尿試料および検量線試料（２.０ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した。内標準物質であるｒａｃビオチン-ｄ４について、尿中に妨害と成り得るピークは確認できなかった（図１１Ｄ）。
２．２. 尿試料中ビオチン濃度
表１２に尿中ビオチン濃度の測定結果を示した。
尿中のビオチン濃度をＰＦＰ法により測定した。
１. 実験方法
検量線用試料の調整および分析方法については、実施例２の条件にて行った。尿試料は、血液透析患者の尿（尿１：透析治療歴約１年の糖尿病患者、尿２：透析治療歴約３年の非糖尿病患者）および蛋白尿（尿３：尿蛋白２＋）各３００μＬにメタノール３０μＬを添加したものを使用した。試料前処理法は、実施例４の条件にて行った。
２. 結果
２．１. 透析廃液試料中妨害ピークの確認
図１１に尿試料および検量線試料（２.０ｎｇ／ｍＬ）のクロマトグラムを示した。内標準物質であるｒａｃビオチン-ｄ４について、尿中に妨害と成り得るピークは確認できなかった（図１１Ｄ）。
２．２. 尿試料中ビオチン濃度
表１２に尿中ビオチン濃度の測定結果を示した。
Claims (15)
- 生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を測定する方法であって、
（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程と、
（２）工程（１）で得られた試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を、高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法を用いて測定する工程と
を含む、方法。 - 生体試料が血漿、透析廃液または尿である、請求項１に記載の方法。
- 生体試料が血漿である、請求項２に記載の方法。
- 生体試料が透析廃液である、請求項２に記載の方法。
- 生体試料が尿である、請求項２に記載の方法。
- 血漿が血液透析患者由来の血漿である、請求項３に記載の方法。
- 透析廃液が血液透析患者由来の透析廃液である、請求項４に記載の方法。
- 透析廃液が血液透析濾過患者由来の透析廃液である、請求項４に記載の方法。
- 透析廃液が腹膜透析患者由来の透析廃液である、請求項４に記載の方法。
- 尿が腎不全患者由来の尿である、請求項５に記載の方法。
- 尿がタンパク尿である、請求項５に記載の方法。
- 工程（１）が、メタノールを用いてタンパク質を沈殿させることにより除去する工程である、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
- 高速液体クロマトグラフに使用するカラムが、疎水性相互作用、双極子-双極子相互作用、およびπ-π相互作用により分離するカラムである、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
- カラム担体の官能基が、ペンタフルオロフェニル基が結合した直鎖または分岐鎖のアルキル基を含む、請求項１２に記載の方法。
- 生体試料中のビオチンまたはビオチン関連物質を測定するための測定用キットであって、
（１）生体試料中のタンパク質を除去する工程に使用するための試薬と、
（２）高速液体クロマトグラフ／タンデム質量分析法に使用するための機器
を含む、キット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013262185A JP6255234B2 (ja) | 2013-12-19 | 2013-12-19 | 生体試料中のビオチンまたはその関連物質の測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2013262185A JP6255234B2 (ja) | 2013-12-19 | 2013-12-19 | 生体試料中のビオチンまたはその関連物質の測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2015118029A true JP2015118029A (ja) | 2015-06-25 |
| JP6255234B2 JP6255234B2 (ja) | 2017-12-27 |
Family
ID=53530873
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2013262185A Active JP6255234B2 (ja) | 2013-12-19 | 2013-12-19 | 生体試料中のビオチンまたはその関連物質の測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP6255234B2 (ja) |
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021128665A1 (zh) * | 2019-12-27 | 2021-07-01 | 上虞新和成生物化工有限公司 | 一种生物素中间体双氨基物的hplc检测方法 |
| CN113092640A (zh) * | 2021-03-29 | 2021-07-09 | 河北常山生化药业股份有限公司 | 肝素钠注射液中苯甲醇与苯甲醛的检测方法 |
| CN114371243A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-04-19 | 湖南中晟全肽生化有限公司 | 一种d-生物素的HPLC检测方法 |
| CN114674954A (zh) * | 2022-03-25 | 2022-06-28 | 浙江工商大学 | 一种检测加工食品中不同阶段美拉德反应产物的方法 |
| CN117347530A (zh) * | 2023-12-04 | 2024-01-05 | 天津玉健生物工程有限公司 | 一种维生素b2中塑化剂的检测方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008093762A1 (ja) * | 2007-01-31 | 2008-08-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 低分子量ペプチドの高感度定量方法 |
| JP2009294118A (ja) * | 2008-06-06 | 2009-12-17 | Hitachi High-Technologies Corp | 生体試料分離方法，生体試料検出方法，生体試料分離システム及び生体試料分離・検出システム |
| WO2012026569A1 (ja) * | 2010-08-26 | 2012-03-01 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 液体クロマトグラフィー用充填剤、分離カラム及び液体クロマトグラフィー装置 |
| WO2012174144A1 (en) * | 2011-06-16 | 2012-12-20 | Baylor Research Institute | Analysis of total homocysteine and methylmalonic acid in plasma by lc-ms/ms from a plasma separator device (psd) |
| WO2013098645A2 (en) * | 2011-12-28 | 2013-07-04 | Medimass, Ltd. | System and method for rapid evaporative ionization of liquid phase samples |
-
2013
- 2013-12-19 JP JP2013262185A patent/JP6255234B2/ja active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008093762A1 (ja) * | 2007-01-31 | 2008-08-07 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | 低分子量ペプチドの高感度定量方法 |
| JP2009294118A (ja) * | 2008-06-06 | 2009-12-17 | Hitachi High-Technologies Corp | 生体試料分離方法，生体試料検出方法，生体試料分離システム及び生体試料分離・検出システム |
| WO2012026569A1 (ja) * | 2010-08-26 | 2012-03-01 | 株式会社日立ハイテクノロジーズ | 液体クロマトグラフィー用充填剤、分離カラム及び液体クロマトグラフィー装置 |
| WO2012174144A1 (en) * | 2011-06-16 | 2012-12-20 | Baylor Research Institute | Analysis of total homocysteine and methylmalonic acid in plasma by lc-ms/ms from a plasma separator device (psd) |
| WO2013098645A2 (en) * | 2011-12-28 | 2013-07-04 | Medimass, Ltd. | System and method for rapid evaporative ionization of liquid phase samples |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021128665A1 (zh) * | 2019-12-27 | 2021-07-01 | 上虞新和成生物化工有限公司 | 一种生物素中间体双氨基物的hplc检测方法 |
| CN113092640A (zh) * | 2021-03-29 | 2021-07-09 | 河北常山生化药业股份有限公司 | 肝素钠注射液中苯甲醇与苯甲醛的检测方法 |
| CN114371243A (zh) * | 2021-12-28 | 2022-04-19 | 湖南中晟全肽生化有限公司 | 一种d-生物素的HPLC检测方法 |
| CN114674954A (zh) * | 2022-03-25 | 2022-06-28 | 浙江工商大学 | 一种检测加工食品中不同阶段美拉德反应产物的方法 |
| CN117347530A (zh) * | 2023-12-04 | 2024-01-05 | 天津玉健生物工程有限公司 | 一种维生素b2中塑化剂的检测方法 |
| CN117347530B (zh) * | 2023-12-04 | 2024-02-13 | 天津玉健生物工程有限公司 | 一种维生素b2中塑化剂的检测方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP6255234B2 (ja) | 2017-12-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6255234B2 (ja) | 生体試料中のビオチンまたはその関連物質の測定方法 | |
| Reyes-Garcés et al. | Solid phase microextraction devices prepared on plastic support as potential single-use samplers for bioanalytical applications | |
| Thornalley et al. | Quantitative screening of advanced glycation endproducts in cellular and extracellular proteins by tandem mass spectrometry | |
| Dualde et al. | Determination of four parabens and bisphenols A, F and S in human breast milk using QuEChERS and liquid chromatography coupled to mass spectrometry | |
| Randell et al. | Measurement of methylglyoxal in rat tissues by electrospray ionization mass spectrometry and liquid chromatography | |
| JP5024044B2 (ja) | 試料溶液中のアルブミンの分析方法 | |
| Anguizola et al. | Development of affinity microcolumns for drug–protein binding studies in personalized medicine: interactions of sulfonylurea drugs with in vivo glycated human serum albumin | |
| Balgoma et al. | Quantification of lipid mediator metabolites in human urine from asthma patients by electrospray ionization mass spectrometry: controlling matrix effects | |
| Rueth et al. | Guanidinylations of albumin decreased binding capacity of hydrophobic metabolites | |
| Li et al. | Determination of uric acid in biological samples by high performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry and study on pathogenesis of pulmonary arterial hypertension in pulmonary artery endothelium cells | |
| Birjandi et al. | Application of solid phase microextraction for quantitation of polyunsaturated fatty acids in biological fluids | |
| Fahrenholz et al. | Molecular speciated isotope dilution mass spectrometric methods for accurate, reproducible and direct quantification of reduced, oxidized and total glutathione in biological samples | |
| Onat et al. | Development of a biocompatible solid phase microextraction thin film coating for the sampling and enrichment of peptides | |
| Yeniceli et al. | A simple and sensitive LC–ESI-MS (ion trap) method for the determination of bupropion and its major metabolite, hydroxybupropion in rat plasma and brain microdialysates | |
| Suzuki et al. | Determination of creatinine-related molecules in saliva by reversed-phase liquid chromatography with tandem mass spectrometry and the evaluation of hemodialysis in chronic kidney disease patients | |
| Xiang et al. | Determination of gouty arthritis' biomarkers in human urine using reversed-phase high-performance liquid chromatography | |
| CN108802250B (zh) | 超高效液质联用检测脑微透析液中11种神经递质的方法 | |
| JP2014119370A (ja) | 試料前処理方法 | |
| Wang et al. | Application of online microdialysis coupled with liquid chromatography-tandem mass spectrometry method in assessing neuroprotective effect of Rhizoma coptidis on diabetic rats | |
| Pecce et al. | Optimization of an HPLC method for phenylalanine and tyrosine quantization in dried blood spot | |
| Koizumi et al. | Influence of glycosylation on the drug binding of human serum albumin | |
| KR101476144B1 (ko) | 생약 유래 성분의 고감도 정량 방법 | |
| Sitar et al. | Asymmetric dimethylarginine (ADMA) in human blood: effects of extended haemodialysis in the critically ill patient with acute kidney injury, protein binding to human serum albumin and proteolysis by thermolysin | |
| Ito et al. | Quantification of intact carboplatin in human plasma ultrafitrates using hydrophilic interaction liquid chromatography–tandem mass spectrometry and its application to a pharmacokinetic study | |
| Wang et al. | An optimized high throughput clean-up method using mixed-mode SPE plate for the analysis of free arachidonic acid in plasma by LC-MS/MS |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20160826 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821 Effective date: 20160826 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20170425 |
|
| A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20170428 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20170620 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20171128 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20171204 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6255234 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |