JP2015102475A5

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Publication number: JP2015102475A5
Application number: JP2013244499A
Authority: JP
Filing date: 2013-11-27
Publication date: 2016-06-02
Anticipated expiration: 2033-11-27

Description

上述したＭＡＬＤＩ-ＩＴＭＳやＭＡＬＤＩ-ＩＴ-ＴＯＦＭＳを用いた糖ペプチドの分析においては、イオントラップにイオンを捕捉する過程で、糖ペプチドイオンから一部又は全ての糖が脱離したプロダクトイオンが生成され易い。そのため、試料中に糖鎖構造のみが異なるタンパク質アイソフォーム（グリコフォーム）混合物が含まれる場合、検出されたイオンが試料中に元々含まれていた糖ペプチドのイオンであるのか、或いは上述したような意図しない糖の脱離により生じたプロダクトイオンであるのか区別がつかない。そのため、ＭＡＬＤＩ-ＩＴＭＳやＭＡＬＤＩ-ＩＴ-ＴＯＦＭＳを用いる場合、試料にグリコフォーム混合物が含まれると試料中には存在しないプロダクトイオンを誤って元々試料に含まれていたものであると判断する恐れがある。これを避けるためには、グリコフォームを高い純度で以て予め精製する前処理を行う必要があり、作業が大変煩雑で面倒である。

一方、従来からグリコフォームの定量分析に用いられているＭＡＬＤＩ-リニア型ＴＯＦＭＳでは、ＭＳ¹スペクトル中に現れたイオンピークが糖ペプチド由来のものであるのか或いはその他の分子に由来するものであるのか判別することができない。リフレクトロン飛行時間型質量分離器と高エネルギ衝突誘起解離セルを用いたＭＡＬＤＩ-ＴＯＦ／ＴＯＦＭＳ（例えば島津製作所製の「AXIMA Performance」など）が利用できる場合には、ＭＳ²分析を実施することによってＭＳ²分析のプリカーサイオンが糖ペプチドイオンであるか否かを判別することは可能である。しかしながら、ＭＳ²分析実施前にＭＳ²分析のプリカーサイオンを糖ペプチドイオンのみに絞り込んでおくことはできない。このため、本来であれば実施する必要のない無駄なＭＳ²分析を実施してしまうことを避けることはできず、ＭＳ²分析に多大な時間を要することとなる。その上、ＴＯＦ／ＴＯＦＭＳによるＭＳ²分析ではコリジョンエネルギが大きく２次開裂が多く生じるために、糖鎖結合部位の同定信頼性が低下する。また、分子量が５０００を超えるような糖ペプチドのＭＳ²スペクトルからは十分な構造情報を得られない、といった欠点があり、糖ペプチドの構造解析の性能はイオントラップを利用したＭＡＬＤＩ-ＩＴＭＳやＭＡＬＤＩ-ＩＴ-ＴＯＦＭＳに劣る。

本実施例の糖ペプチド解析装置は、試料Ｓに対して分析を実行してデータを収集する分析部１と、収集されたデータを解析処理するデータ解析部２と、を備え、分析部１は、同じ化合物を含む試料Ｓをそれぞれ分析するイオントラップ型質量分析部１１と飛行時間型質量分析部１２とを含む。

上述したようにイオントラップ型質量分析部１１では分析の過程で糖の一部の脱離が起こるため、ＩＴマススペクトルにはそうした脱離によって生成された不完全な糖ペプチドイオンと、元々試料Ｓに含まれていた、ペプチドは同じで糖鎖の構造が相違する糖ペプチド（つまりはグリコフォーム）のイオンとが混在して現れる。前者のイオンと後者のイオンとはＩＴマススペクトルのみからは判別できない。これに対し、ＴＯＦマススペクトルには元々試料Ｓに含まれていた糖ペプチドのインタクトイオンが現れる筈であるから、ＩＴマススペクトルとＴＯＦマススペクトルとに共通に現れるイオンが、元々試料Ｓに含まれていたペプチドが同一である糖ペプチド、つまりグリコフォームのインタクトイオンであると、高い確度で推定することができる。

定量解析部２４は、糖ペプチド検出部２３で検出された糖ペプチドイオンについて、マススペクトル作成部２２で得られたＴＯＦマススペクトル中のピーク強度を取得し、そのピーク強度の相対値を用いてグリコフォームの相対的な定量を行う。即ち、図４に示したマススペクトルにおいて○印で示された３本のピークの相対強度から各グリコフォームの相対的な定量値を計算する。このときに用いるピーク強度としては、ピークの高さのほかに、ピークの面積を用いてもよい。

図５は図４に示した糖ペプチドイオンについて上述のフローに従った構造解析を行った結果をマススペクトル上に重ねた、最終的な分析結果の表示の一例である。３つの糖ペプチドイオンに対応するピークにそれぞれの糖ペプチドの構造が関連付けて表示されている。また、ピーク強度が大きいが目的とする糖ペプチドのグリコフォームでないピークにはその旨が表記されている。このような表示によれば、同じ試料に含まれるグリコフォームの構造を一目で把握することができる。また、この例では相対強度はピーク強度の比から明らかであるが、このマススペクトル上にグリコフォームの相対定量値を数値で示してもよい。また、ピーク強度比の算出には、ピークの高さ以外にピーク面積を用いてもよい。