JP2015083575A - 糖尿病治療用組成物、そのスクリーニング方法及びキット - Google Patents
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Abstract
【解決手段】小分子、RNA分子、siRNA分子、miRNA分子またはこれらの分子の先駆体、アンチセンスオレゴヌクレオチド、アプタマー、ポリペプチド、抗体またはリボザイムを含む群から選択され、その中でもRNA、ペプチド、小分子およびアプタマーが好ましい。
【選択図】なし
Description
[発明の簡単な説明]
キナーゼが阻害の標的として好ましく、また阻害の好ましい目的は代謝性疾患の治療、より好ましくは炭水化物代謝性疾患の治療、さらに好ましくは糖尿病の治療、さらに好ましくは2型真性糖尿病の治療、そして最も好ましいのはインスリンの産生および/またはインスリンの放出の上方調節である。さらに本発明は、代謝性疾患の治療、さらに好ましくは炭水化物代謝性疾患の治療、さらに好ましくは糖尿病の治療、さらに好ましくは2型真性糖尿病の治療、最も好ましくはインスリン産生および/またはインスリン放出の上方調節のために、SCYL1をコードする核酸、ADCK1をコードする核酸、およびGRK5をコードする核酸からなる群から選ばれた少なくとも1種の核酸を不活性化、分解、下方調節、インターカレーションするためのモジュレーターに言及する。
[説明]
意外なことに、スニチニブは投薬量依存的方法においてインスリン放出に効果があることがわかった。この効果はスニチニブによってある種のキナーゼの阻害に起因することが分かった。さらに意外なことに、他の化合物による60kDaより大きなモル質量の特定された蛋白質キナーゼの阻害は結果として上昇したインスリン放出になることがわかった。またさらに、ある種の蛋白質キナーゼ対の併用阻害は結果として付加的なインスリンの放出になることがわかった。さらに、ある種の蛋白質キナーゼ対の阻害は結果としてスニチニブ治療後の効果と同等のインスリン放出になることがわかった。
a)SCYL1、ADCK1、およびGRK5からなる群から選ばれた少なくと も
1種の蛋白質キナーゼの阻害、または
b)SCYL1をコードする核酸、ADC1をコードする核酸、およびGRK5をコ
ードする核酸からなる群から選ばれた少なくとも1種の核酸の不活性化、分解、下方調節、インターカレーション
のためのモジュレーターに特に言及する。
a)SCYL1、ADCK1、およびGRK5からなる群から選ばれた少なくとも1種の蛋白質キナーゼ、または、
b)SCYL1をコードする核酸、ADCK1をコードする核酸、およびGRK5をコードする核酸からなる群から選ばれた少なくとも1種の核酸の不活性化、分解、下方調節またはインターカレーション
のための好ましい阻害剤に言及する。
はGRK5の作用は、不活性化、分解、下方調節、またはインターカレーションにより、DNAおよびRNAの両者であることができる蛋白質キナーゼSCYL1、ADCK1、および/またはGRK5をコードする核酸の干渉により妨げられる。核酸の不活性化は、
例えばヌクレオチドのメチル化、挿入、欠失、ヌクレオチドの交換、架橋、鎖の切断/破損によって生じることができる。核酸は温度、化学物質、酵素、および特にRNAによって、脱アデニル化または5'分解または3'分解によって単一ヌクレオチドに分解されることが可能である。DNAまたはRNAの下方調節は、DNAまたはRNAのような核酸の発現の減少と言及され、通常ポリペプチドであるレプレッサーの結合により生じることができるが、しかしまた核酸の化学的また構造的変化または修飾によっても生じることができる。インターカレーションは分子が他の2つの分子間に可逆的に入り込むことである。核酸では、インターカレーションは適切な大きさと化学的性質を有するリガンドが塩基対間に適合する場合に生じる。
NA分子類であって、19−30ヌクレオチド、好ましくは20−25ヌクレオチドの長さを有する。SiRNAは特定の遺伝子発現のRNA干渉に関与する。SiRNAは長い二本鎖RNAからリボヌクレアーゼ(RNase)IIIダイサーによってカットされる。SiRNAを化学合成によっても得ることができる。またsiRNAは抗ウイルスメカニズムまたはゲノムのクロマチン構造の形成に役割を果たす。分子研究においては、合成siRNAはまたRNA干渉(RNAi)において特定の標的遺伝子の発現を下方に調節するために使用されることもできる。本質的に興味のある任意の遺伝子をノックダウンするsiRNAの能力で、siRNAは、インスリン産生におけるsiRNAの役割を研究するために蛋白質キナーゼをノックダウンするのに使用されている(図1−図4)。本発明では、SiRNAは、好ましいキナーゼの阻害のための好ましいモジュレーターである。
sha)のようなエンドヌクレアーゼにより処理される。したがって、例えば、27ヌク
レオチドよりも長い、好ましくは30から100ヌクレオチドまたはそれ以上の長さを有するdsRNA分子またはショートヘアピンRNA分子(shRNA)、および最も好ましくは30−50ヌクレオチドの長さをを有するdsRNA分子を用いることができる。
アプタマー)を選択することによって創出される。アプタマーもまた本発明の好ましいキ
ナーゼの阻害のための好ましいモジュレーターである。
ペプチドは、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸残基の連鎖である。ペプチドは僅かな蛋白質と見られることができる。ペプチドは通常100アミノ酸までの長さであり化合物ではそれ以降は蛋白質と言われる。ポリペプチドは少なくとも10アミノ酸のペプチドである。シクロペプチドは環状構造を形成する2個、3個またはそれ以上のアミノ酸により形成され、従ってC−末端およびN−末端アミノ酸は存在しない。ペプチドは本発明の好ましいキナーゼの阻害のための好ましいモジュレーター、ポリペプチドさらに好ましいモジュレーターである。
害する小分子であり、主として癌治療のために使用される。しかしながら、本発明では、ス二チ二ブ治療は1つの主要な副作用として高血圧を伴うので、薬剤のス二チ二ブは好ましいキナーゼの阻害のためのモジュレーターではない。糖尿病である人々は糖尿病でない人々に比べてより高血圧の問題を有する傾向にある。糖尿病と高血圧の両者を有することは、胸部疾患、脳卒中、眼、腎臓、および神経混乱のリスクが増加する限り損傷を与えるワンツーパンチを与えることができる。高血圧と関連する特に一般的な糖尿病の合併症がある。高血圧と関連する特に一般的な糖尿病の合併症は糖尿病網膜症および糖尿病腎症を含む。英国プロスぺクティブ糖尿病研究(Prospective Diabetes Study)によって行われた研究で確立されたように、糖尿病を有する人々の血圧を管理することは将来の合併症のリスクを低下させる。
しくは膵臓細胞からのインスリン放出のレベルを増加させるために使用されることができる。
座薬を調製するためには、脂肪酸グリセリド混合物のような低融点ワックス、例えばココアバターを先ず溶かし、その中に活性成分を撹拌または撹拌と同様に混合することによって均一に分散させる。次に溶融した均一混合物は適当な大きさの鋳型に注入され、冷却してそれによって固体化される。
来技術で、マトリックスまたはリザーバ型の経皮パッチに含まれることができる。
構成成分の粉末は、有効成分および水またはジュースに懸濁されることができる適切な希釈剤を含む粉末混合物を言う。新生児、トドラー(toddlers)および/または幼児のための経口投薬形態の一例としては、粉ミルクおよび粉ミルクホエイから作られる母乳代替物、及び任意でまた部分的に乳糖で代用されるヒトの母乳代替物がある。
かい養毛状の凝結物を産生する。大部分のホエイ蛋白質はラクトアルブミン、ラクトフェ
リン、分泌型IgA、および血清アルブミンであり、多くの他の蛋白質とペプチドを少量伴っている。
栄養上の成分に加えて、母乳は有効な非栄養機能を有する豊富な生体活性成分を含む。生体活性成分はサイトカインおよび抗炎症性物質などの広範囲の特定または非特定の抗菌因子、ホルモン、成長調節剤および消化性酵素を含み、これらの多くは多様な活性を有する。幼いときは宿主側防御および消化器官の未熟のため、生体活性成分は特に小さい幼児にとって重要であり得る。
ム、酢酸ナトリウム、オレイン酸ナトリウム、ポリエチレングリコール、およびd’l−ロイシンのような水溶性潤滑剤などを含む。また潤滑剤は、顆粒表面および顆粒間、及び錠剤プレスの一部に存在する必要があるので、圧縮前の最後の段階で加えられる。組成物中の潤滑剤の量は、組成物の約0.05〜約15重量%の範囲、好ましくは約0.2〜約5重量%、さらに好ましくは約0.3〜約3重量%、そして最も好ましくは、約0.3〜約1.5重量%の範囲であることができる。
solution)および緩衝液(buffered solution)なる用語は、水素イオン濃度またはpHに関して使用される場合に、酸またはアルカリの添加または溶剤での希釈に際してのpHの変化を阻害するために、システム、特に水溶液系の能力を言う。好適な緩衝系は、以下の緩衝液:蟻酸塩(pKa=3.75)、乳酸塩(pKa=3.86)、安息香酸(pKa=4.2)、シュウ酸塩(pKa=4.29)、フマル酸塩(pKa=4.38)、アニリン(pKa=4.63)、酢酸緩衝液(pKa=4.76)、クエン酸塩緩衝液(pKa2=4.76、pKa3=6.4)、グルタミン酸塩緩衝液(pKa=4.3)、リン酸塩緩衝液、(pKa=7.20)、コハク酸塩(pKa1=4.93、pKa2=5.62)、ピリジン(pKa=5.23)、フタル酸塩(pKa=5.41)、ヒスチジン(pKa=6.04)、MES(2−(N−モルフォリノ)エタンスルホン酸(pKa=6.15)、マレイン酸(pKa=6.26)、カコジル酸塩(ジメチルアルシネ―ト、pKa=6.27)、炭酸(pKa=6.35)、ADA(N−(2−アセトアミド)イミノ−ジアセチック酸、(pKa=6.62)、PIPES(4−ピぺラジンビス−(エタンスルホン酸、BIS−TRIS−プロパン(1,3−
ビス[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパン)(pKa=6.80)、エチレ
ンジアミン(pKa=6.85)、ACES 2−[(2-アミノ−2−オキソエチル)アミノ] エタンスルホン酸(pKa=6.9)、イミダゾール(pKa=6.95)、M
OPS(3−(N−モルフイン)−プロパンスルホン酸(pKa=7.20)、ジエチルマロン酸(pKa=7.2)、TES(2−[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノエタンスルホン酸(pKa=7.50)およびHEPES(N−2−ヒドロキシルエチルピぺラジン−N'−2−エタンスルホン酸(pKa=7.55)または他のpKaが3.
8〜7.7の範囲を有する緩衝液からなる群から選ばれることができる。
エン酸塩のようなカルボキシリック三酸緩衝液(Carboxylic triacid
buffers)の群が好ましい。好ましい緩衝液の別の群は、硫酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、シュウ酸塩、水酸化カルシウムおよびリン酸塩緩衝液のような無機緩衝液が挙げられる。また好ましい緩衝液の別の群は、イミダゾール、ジエチレンジアミン、およびピぺラジンのような窒素含有緩衝液である。
グ株式会社(Mack Publishing Co.)、イーストン、ペンシルバニア
州)で分かり得る。本願で述べる化合物を含む好適な組成物は、適切な液体医薬用担体中での化合物溶液、または錠剤、ピル、フィルム状錠剤、被覆錠剤、ドラジェー糖衣錠、カプセル、粉末または沈着剤、ゲル、スラリー、懸濁物、エマルジョン等のような任意の製
剤であり得る。
投薬のために蒸留水または他の適切な液体中で再水和した後、凍結乾燥製剤はほぼ再水和された化合物製剤に対する標的組織、例えば静脈内投与のための血液、または吸入投与のための肺組織のおおよその生理的浸透圧を有するべきである。従って再水和された配合物は実質的に等張であることが好ましい。
食品)として使用することに関する。そのようなダイエタリーサプリメントは経口投与が
好ましく、以下に限定するものではないが特に新生児、トドラー(toddlers)、および/または幼児への経口投与が好ましい。ダイエタリーサプリメントは、栄養を補給することを目的とする。これらの製品の「ダイエットの成分」はさらに、ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他の植物、およびアミノ酸、および酵素、臓器組織、顆粒状物質および代謝物質などの物質を含み得る。ダイエタリーサプリメントは、錠剤、カプセル、ソフトジェル、ジェルカップ、液体または粉末などの形態で製造され得る。
a)試験化合物をSCYL1、ADCK1およびGRK5ポリペプチドからなる群から選ばれた少なくとも1種のポリペプチドと接触させること、
b)前記試験化合物の前記SCYL1、ADCK1およびGRK5ポリペプチドとの結合を検出すること、
c)前記試験化合物の存在下で、前記SCYL1、ADCK1およびGRK5ポリペプチ
ドの活性を測定すること
を含む。
より蛋白質―RNA相互作用を検出するのに用いられるインビトロ技術である。インキュベーションの後に、結合反応は非変性ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動を介して分離される。蛋白質―DNA複合体のように、蛋白質―RNA複合体はゲルマトリックス中を遊離DNA断片よりもゆっくりと移動する。これは非結合RNAプローブに関連する移動シフトを引き起こす。特異性は競合反応により決定され、過剰な非標識RNAは結合反応でインキュベートされて、結果として標識RNAおよび非標識RNA配列が同一の蛋白質に結合するように競合する場合にシフトシグナルは減少する。あるいは、蛋白質―RNA複合体は架橋されてもよく、反応は変性ゲルで実行する。特異性は単一シフトバンドの可視化により決定される。蛍光および化学発光検出も可能であるが、従来ではRNAプローブは検出のために放射性標識される。非放射性RNA末端標識技術には限界があるが、今日ではさらなる汎用性ビオチンや蛍光標識方法が利用可能である。あるいはサンプルから蛋白質―RNA複合体を選択的に抽出するRNAプルダウンアッセイを実行することができる。この方法は幾つかのRNAが標的蛋白質とともに使われることができるという有利な点を有し、選択的に結合するRNAを特定することが可能である。典型的には、RNAプルダウンアッセイは、ビオチンまたはアジドフォスフィン化学など高親和性タグを利用する。RNAプローブは、ビオチン化され細胞溶解物からの蛋白質と複合化され、次にアガロースまたは磁気ビーズを用いてで精製されることが可能である。あるいは、蛋白質を標識し得ること、またはRNA−蛋白質複合体を目的の蛋白質に対する抗体を用いて分離し得る。RNAは次にノーザンブロット法またはRT−PCR分析により検出され、蛋白質はウエスタンブロット法または質量分析法で検出される。また蛋白質―RNA相互作用はオリゴヌクレオチド標的リボヌクレアーゼH保護アッセイ(RPA)により特定されることもでき、オリゴヌクレオチド標的リボヌクレアーゼH保護アッセイは細胞抽出物中のRNAおよびRNA断片を検出するための強力な方法である。ノーザンブロット法またはRT−PCR分析とは異なり、RPAアッセイは、ハイブリダイゼーション及び検出に非常に短いセグメントを必要とし、標的RNAの整合性においてより柔軟性が大きくなる。またRPAアッセイは蛋白質―RNA相互作用をマッピングするために用いられることもできる。RPAの適応において、リボヌクレアーゼHはDNAプローブとハイブリダイズされた特異的部位で標的RNA分子を切断するために用いられる。蛋白質が標的配列でRNAと結合する場合には、プローブハイブリダイぜーションを防ぎ、リボヌクレアーゼHによる切断を防ぎ、そして蛋白質とRNAの相互作用の部位を示すであろう。リボヌクレアーゼHは、目的のRNA分子を切断するためにDNAプローブと4つの塩基対ハイブリッドのみを必要とする。多くの小プローブを使うことでRNAの全体配列を相互作用の部位のためにマッピングされることができる。
できる。核酸間の結合を試験するさらなる方法はゲルシフト法の利用があり、ゲルシフト方法ではハイブリッド分子は電気泳動により変性ゲル中でより遅く流れる。
を特定する全ての方法において、本発明のポリペプチドの発現レベルとキナーゼ活性は試験化合物の非存在で検出された発現レベルとキナーゼ活性と比較される。本発明は、特に本発明のポリペプチドのキナーゼ活性に阻害活性を持つ化合物の特定に関する。従って特に発現と活性の測定される阻害に関する。
ある。mRNAの定量化の別の方法はマイクロアレイを用いる方法であり、しかしながらマイクロアレイを用いる方法はmRNAの大規模なセットが調査される場合により実用的である。
RK5を含む系および基質に添加し、基質に付着したリン酸塩の放射性を測定することで検出されることができる。
節能力のための試験化合物でアッセイするために高生産性スクリーニングで用いられることができる。これらの試験化合物は、キナーゼ活性に対する試験化合物の効果を決定するために機能性キナーゼに対してさらにスクリーニングされることができる。さらにこれらの化合物は、活性/有効性を決定するために動物または無脊椎系で試験されることができ
る。化合物は所望の度合いでキナーゼを活性(作用薬)または不活性(拮抗薬)することが特定されることができる。さらに、SCYL1、ADCK1および/またはGRK5は、キ
ナーゼ蛋白質と通常キナーゼ蛋白質と相互作用する分子、例えば基質またはキナーゼ蛋白質が通常相互作用するシグナル経路の成分(例えば、別のキナーゼ))の相互作用を刺激または阻害する能力のために化合物をスクリーニングするために用いられることができる。そのようなアッセイは典型的には、キナーゼ蛋白質またはフラグメント(断片)を標的分子と相互作用させることができる条件下でキナーゼ蛋白質を候補化合物と結合するステップと、蛋白質と標的との複合体の形成を検出すること、または、例えば、蛋白質のリン酸化、cAMP代謝回転およびアデニル酸シクラーゼの活性化などのシグナル伝達の任意の関連効果などのような、キナーゼ蛋白質と標的との相互作用の生化学的結果を検出するこ
とを含む。
互作用する化合物(例えば、結合相手および/またはリガンド)を発見するようにデザイン
された方法において競合結合アッセイにも有用である。従って化合物は、化合物が結合あるいはポリペプチドと相互作用することができる条件下で、キナーゼポリペプチドに曝される。また可溶性キナーゼポリペプチドも混合物に添加される。試験化合物が可溶性キナーゼポリペプチドと相互作用する場合には、形成された複合体の量または標的とするキナーゼの活性は減少する。このアッセイの形式は、キナーゼの特定領域と相互作用する化合物を探求する場合に特に有用である。
a)SCYL1、ADCK1、および/またはGRK5ポリペプチド、
および/または、
b)SCYL1をコードする核酸、ADCK1をコードする核酸、および/またはG
RK5をコードする核酸、
および
c)SCYL1、ADCK1および/またはGRK5ポリペプチド、または対応する
核酸の結合によりインスリン産生に影響を与えることが知られているコントロール化合物。
さらに好ましい実施の形態では、本発明は:
a)SCYL1、ADCK1、および/またはGRK5ポリペプチド、
および/または、
b)SCYL1をコードする核酸、ADCK1をコードする核酸、および/またはGRK5をコードする核酸、
および
c)SCYL1、ADCK1および/またはGRK5ポリペプチド、または対応する
核酸の結合によりインスリン産生に影響を与えることが知られているコントロール化合物、
さらに、
d)インスリン産生細胞株。
さらに好ましい実施の形態では、本発明は:
a)SCYL1、ADCK1、およびGRK5ポリペプチド、
および/または、
b)SCYL1をコードする核酸、ADCK1をコードする核酸、およびGRK5をコードする核酸、
および
c)SCYL1、ADCK1およびGRK5ポリペプチド、または対応する核酸の結合によりインスリン産生に影響を与えることが知られているキナーゼSCYL1、ADCK1およびGRK5それぞれのコントロール化合物
を含むキットを提供する
さらに好ましい実施の形態では、本発明は:
a)SCYL1、ADCK1、およびGRK5ポリペプチド、
および/または、
b)SCYL1をコードする核酸、ADCK1をコードする核酸、およびGRK5を
コードする核酸、
および
c)SCYL1、ADCK1およびGRK5ポリペプチド、または対応する核酸の結合によりインスリン産生に影響を与えることが知られているキナーゼSCYL1、ADCK1およびGRK5それぞれのコントロール化合物、
さらに、
d)インスリン産生細胞株。
キットを用いた全ての実施の形態において、コントロール化合物は上記で特徴付けされた任意の試験化合物であることができる。コントロール化合物は、試験化合物の結合/阻
害の有効性を参照するために用いられ、それは選択されたポリペプチドまたは選択されたポリペプチドをコードする対応核酸に結合しそれによりポリペプチドの活性または発現を阻害することが知られているからである。選択されたコントロール化合物は、阻害化合物が試験されるための同一のポリペプチドを参照し、例えば、SCYL1の阻害のための複数の化合物がテストされる場合には、コントロール化合物は、SCYL1を阻害する化合物である。
い。
a)SCYL1、ADCK1およびGRK5からなる群から選ばれた少なくとも1種のチロシンキナーゼの阻害または活性化、
または
b)SCYL1をコードする核酸、ADCK1をコードする核酸およびGRK5をコードする核酸からなる群から選ばれた少なくとも1種の核酸の不活性化、分解、下方調節、インターカレーションまたは活性化
のための少なくとも1種のモジュレーターの医薬的に効果のある量を必要とする被検者
に投与することを含む。
響を与えることが知られている本発明の化合物は、代謝性疾患の、好ましくは真性糖尿病の、より好ましくは2型真性糖尿病の治療のため、最も好ましくは膵臓細胞からのインスリン放出のレベルを増加させるために、上記概略のように薬剤の範囲内で本発明の化合物を投与することで使用されることができる。本発明の好ましい実施の形態では、SCYL1、ADCK1およびGRK5の少なくとも2つが1つ以上の本発明の化合物により調節される。
インスリン放出に対するキナーゼSCYL1、ADCK1およびGRK5の影響は、限定されるものではないが、特に炭水化物代謝性疾患、好ましくは真性糖尿病、より好まし
くは2型真性糖尿病の診断のためにポリペプチドの利用を示唆する。
1=wo2-NBDG+化合物(グルコースのない培地+化合物)。
2=wo2-NBDG(グルコースのない培地)。
4=100μM の2−NBDG+化合物。
上部パネルは左から右に常に化合物1-3を示す。下部パネルは左から右に常に化
合物4−5およびスニチニブを示す。(図20および21:スニチニブは用いない。)
実施例1:膵臓ベータ細胞株ベーターTC6のsiRNAスクリーニング
スニチニブ治療後の高インスリン放出の原因であろうキナーゼを特定するために、我々はキノームーワイド(kinome−wide)siRNAノックダウンスクリーニングを実行した。各キナーゼ激減のインスリン放出の効果は、ラット/マウス インスリン
ELISAを用いてモニターされた。得られたデータは、ポジティブコントロールとしてスニチニブ治療(5μM)と比較され、非標的siRNAと相関させた。候補遺伝子は、階層的に集積して用いることによって、及び15%インスリン放出を著しく増加/減少を
提示することによって限定された。SCY1様1(SCYL1)、aarF含有キナーゼ1(ADCK1)およびG蛋白質結合受容体キナーゼ5(GRF5)の激減は、コントロールsiRNAと比べて、ベータ−TC6細胞にインスリン放出を高めることになり、それらのキナーゼをインスリン放出の潜在的ネガティブモジュレーターとする(図1)。
実施例2:ネガティブモジュレーターの有効性
ネガティブモジュレーターキナーゼSCYL1、GRK5およびADCK1の有効性確認のために、標的遺伝子は、4つの異なるsiRNA配列それぞれを用いて激減させた(図2A−D)。遺伝子激減は72時間後にmRNAレベルで測定され、一方インスリン放出は2時間インキュベーション後ラット/マウス インスリン ELISAを用いて測定
された。残留キナーゼSCYL1、GRK5およびADCK1の激減は異なる効率で増加したインスリン放出につながった。さらに、50からほぼ100%の範囲でRT−PCRおよびデンシトメトリーをスキャンすることによって評価され、キナーゼのインスリン放出はSCYL1およびADCK1のそれぞれのノックダウン効率と逆相関した。全ての配列が等しいノックダウン効率となるGRK5の場合には、この相関関係は観察されなかった。増加はSCYL1(46.38±5.51%)の激減で最高となり、次にGRK5(41.23±1.53%)、そしてADCK1(33.95±9.02%)である。スニチニブは、コントロールとして含められた(図3)。これはインスリン放出を誘発してこれらのキナーゼの役割を高めるものである。
スニチニブ治療と比較すると、シングルノックダウンの効果は、インスリン放出の誘発に複数のキナーゼの関与を示唆しているとははっきりとは断言されなかった。候補キナーゼは様々なシグナル経路で広範囲に広がる。キナーゼがインスリン放出に関して冗長効果あるいは相加効果のどちらを持つのかを調べるために、実施可能なキナーゼ対それぞれについて我々はダブルノックダウンを実施した。ダブルノックダウンによるインスリン増加はシングルノックダウンおよび非標的siRNAと相関した。16のキナーゼ対の内、SCYL1とADCK1激減は結果として最大のインスリン放出となり(90.64±17.32%)、スニチニブが誘発するインスリン放出に匹敵した(図4)。他のキナーゼ対は、シングルノックダウンと比べてインスリン放出の増加は見られなかった(データは示さず)。
実施例4:ベーターTC6のキナーゼC候補遺伝子発現の減少によるAKT1のリン酸化
SCYL1、GRK5およびADCK1の遺伝子発現はsiRNAにより阻害された。SCYL1、GRK5およびADCK1の下方調節は許容標準偏差で(SCYL1:43.73±3.37%;GRK5:96.53±28.87%;ADCK1:)AKTのリン酸化を高めた (図5)。遺伝子発現のsiRNA媒介による減少がAKTのリン酸化を
結果として増大させたことが結論づけられることができる。前述の通りこの増大はレイビガー、Bおよびその同僚らによる文献によればインスリン放出に関係すると思われる。(レイビガーら(Leibiger et al.)、FASEBジャーナル(FASEB
J.) 2010年、24;p1824−1837)。
実施例5:24時間のスニチニブ治療におけるSCYL1、GRK5およびADCK1のmRNAレベル測定
ベータTC6細胞は、1μM,5μMでそれぞれスニチニブを24時間処置された。mRNAレベルを測定することで遺伝子発現の阻害が証明された。スニチニブ治療は候補キナーゼのmRNAレベルに負の影響を与える(図6)。この見解はスニチニブがより長期間使用される臨床現場において糖尿病患者に対してスニチニブの正の効果のさらなる説明を示すだろう。
実施例6:ベータC2C12および3T3−L1細胞における候補キナーゼノックダウンによる蛍光グルコース類似体2−NBDGの取り込み
候補遺伝子発現の減少と呼応して細胞のグルコース取り込みが調査された。ADCK1は9.72±3.81%増加を示した一方、GRK5の下方調節はC2C12における2−NBDBの取り込みに著しく影響する(GRK5:21.24±3.96%)。3T3−L1細胞では、SCYL1の遺伝子減少による遺伝子発現の減少は、グルコースの取り込みに対し影響することを示す(9.45±3.45%)(図7)。全てのデータは平均値
として提示される(±SEM)。G蛋白質結合受容体キナーゼ5(GRK5)およびADCK1の発現の減少は、インスリン刺激を必要とせずにマウス筋芽細胞(C2C12)でグルコース類似体2−NBDG(21.24±3.96%)の取り込みを高めて、それによりGRK5はインスリン感受性および/またはインスリン非依存性グルコースの取り込
みを引き起こすと思われると結論付けられることができる。
実施例7:C2C12および3T3−L1細胞の候補標的ノックダウンにおけるAKT1のリン酸化
SCYL1、GRK5およびADCK1の遺伝子発現の減少におけるAKT1リン酸化が研究された。図解するように、SCYL1およびGRK5の下方調節はC2C12細胞でAKT1のリン酸化を増大させる。3T3−L1モデルシステムでは、我々は全ての候
補キナーゼのAKT1リン酸化の減少を検出した(図8)。末梢組織では、AKT1リン
酸化は、GLUT4転座と関係があり、そのためグルコースの取り込みと関係があることが結論付けられることができる。ベーターTC6細胞株において、SCYL1およびGRK5のノックうダウンはAKT1のリン酸化を増大させる。さらに、C2C12細胞における2-NBDG取り込みアッセイの結果、および候補遺伝子発現の減少によるベータ−
TC6でのAKT1リン酸化の観察される増大は、高インスリン放出に関してGRK5の機能的役割を説明するだろう。
実施例8:ベータTC6細胞により放出されたインスリンへの潜在的グルコース介在効果の分析
外部グルコースの影響は、グルコースを含まないコントロールと比較して1.125から4.5mMの範囲のグルコース濃度で調査された(図9)。生理的濃度から病理生理学的濃度の範囲(1g/L(5.5mM)から4.5g/L(25.5mM)までの範囲)の異なるグルコース濃度のベータTC6細胞培地への添加は、結果的にインスリン放出は濃度依存的に増加しない。しかしながら、0.8g/L(4.5mM)を下回る濃度で使用すると、
グルコースはインスリンのグルコース依存的放出を示した(Poitoutら、「糖尿病
(Diabetes)」、1995年、4;p306−313)。従って低グルコース環境での今後の実験では0.2g/L(1.125mM)のグルコース濃度が選択された
。
実施例9:低グルコース培地における遺伝子発現の減少後のベータT6細胞によるインスリン放出
インスリン放出は0.2g/L(1.125mM)低グルコース環境下で遺伝子発現の
減少により媒介された(図10)。SCYL1、GRK5およびADCK1のノックダウ
ンは低グルコース環境下でインスリン放出を減少させると思われることを結論付けられることができる。実施されたMTTアッセイは細胞生存率を損なわないことを示した。
実施例10:医薬品開発のための抗糖尿病標的としてのGRK5
8800カスタマー(costomer)化合物は、GRK5の酵素力を阻害するための8800カスタマー(costomer)化合物の能力をスクリーニングされた。スクリーニングはADP Glo(登録商標)キナーゼアッセイ技術(プロメガ株式会社製)を用いて実施された。小分子量化合物は原液濃度10mMで送達され、100μMの最終アッセイ濃度で試験された。平均阻害率が3.2%で標準偏差が11%の狭いヒット分布が観察された。その結果、36.1%(=inhav+(3Xinhstdev))より大きい阻害値を持つ化合物は、ヒットとして考慮されるものとして推奨される。最上の候補化合物を表3に要約する。スクリーニングにより特定された5つ全ての化合物は、200から450g/molの範囲の分子量を有する。
GRK5阻害剤治療によりベータ−TC6細胞におけるインスリン放出は増加した。化合物2(C2)、化合物3(C3)、化合物5(C5)による阻害は、我々のシステムにおいてス二チニブ(SUT)の効果を2倍にすることでインスリン放出を高める最も著しい効果をもたらした(C2:5μMで2.58±0.94、10μMで2.01±0.19;C3:5μMで3.52±1.35、10μMで2.15±0.59; C5:5μ
Mで1.93±0.5、10μMで1.69±0.19)(図12)。これらの値は表5にも示した。
実施例12:シクロへキシミドとGRK5阻害剤治療で蛋白質の生合成の阻止後に放出されたインスリン
インスリン放出においてGRK5阻害剤の効果は増強されたインスリン合成に基づくものではないことがわかった。インスリン放出はシクロヘキシミド(CHX)とDMSOの平均値(±SEM)で処理したコントロールと比較したシクロヘキシミドと適切な5μM化
合物治療により測定された(図13)。蛋白質転写が阻止されてそれにより蛋白質生合成によりインスリンが再生することは、GRK5阻害剤化合物に曝すことでインスリン放出に影響しないことが結論づけられることができる。
実施例13:GRK5阻害剤によるベータTC6細胞におけるAKT1リン酸化
AKT1のリン酸化は、GRK5阻害剤治療で測定された。ベータTC6細胞は適切な化合物5μMと10μM各々で治療され、DMSOコントロールおよびAKT蛋白質レベルと比較された。AKT1は、1μg/mLインスリン処理によりリン酸化され、それに
関してAKT1のリン酸化はGRK5阻害剤と処理することで高められることが特徴づけられることができる(図14)。これとは対照的に、コントロールとしてのス二チニブは、インスリンを媒介したAKT1リン酸化の増加を減少させる。前記のAKTリン酸化および2−NBDG取り込みのためのノックダウン研究とともに、GRK5はグルコースの取り込みに影響を与えるのでそれによりインスリンの放出を増加させることになることを我々は示唆する。
実施例14:低グルコース環境下(1.25mM)でGRK5阻害後にベータTC6細胞により放出されたインスリン
低グルコース環境下でのGRK5の阻害は、5μM処理(図15)と10μM処理(図16)後インスリン分泌を減少させることになった。明らかにした化合物の5μMと10μMそれぞれによるGRK5の阻害は結果として低グルコース培地(1.125mM)でのインスリン放出の減少につながったと結論づけられることができる。実施されたMTTアッセイは細胞生存率を損なわないことを示した。
実施例15:C2C12、TC6、3T3−L1および細胞にGRK5化合物を処理した後の2−NBDGを介したグルコースの取り込み
5つ全ての化合物のC2C12(図17)およびTC6(図18)細胞において、GRK5の阻害は蛍光グルコース類似体2−NBDの増加した取り込みをにつながった。我々は、GRK5の阻害はインスリンを必要とすることなくグルコースの感受性を増加させることにつながることを示唆する。従ってGRK5のリン酸化の阻止はインスリンの代用となることができた。
5つ全ての化合物で成熟C2C12管状筋細胞(図20)および3T3−L1脂肪細胞(図21)において、GRK5の阻害は蛍光グルコース類似体2-NBDGの増加した取
り込みにつながった(表4に要約される)。C2C12細胞の系列では、化合物1−5によるGRK5阻害後に成熟管状筋細胞は増加する2-NBDGの取り込みをを示す。さら
に、成熟脂肪細胞も5つ全ての化合物に応答し、それは脂肪細胞のグルコース代謝は基本的により高いので容易に検出されることができたことを示唆している。
Claims (14)
- モジュレータであって、
a)SCYL1、ADCK1およびGRK5からなる群から選ばれた少なくとも1種の蛋白質キナーゼの阻害、
または
b)SCYL1をコードする核酸、ADCK1をコードする核酸およびGRK5をコードするた核酸からなる群から選ばれた少なくとも1種の核酸の不活性化、分解、下方調節、インターカレーション、
のための、
炭水化物代謝性疾患を治療するためのモジュレーター。 - 前記疾患は糖尿病である、請求項1に記載のモジュレーター。
- 前記疾患は2型真性糖尿病である、請求項1または請求項2に記載のモジュレーター。
- 前記モジュレーターはインスリン産生の上方調節および/またはインスリン放出のため
に用いられる、請求項1、請求項2または請求項3に記載のモジュレーター。 - 前記モジュレーターは、
a)小分子、
b)RNA分子、
c)siRNA分子、miRNA分子またはsiRNA分子、miRNA分子の前駆体、d)アンチセンス オリゴヌクレオチド、
e)アプタマー、
f)ポリペプチド、
g)抗体、または、
h)リボザイム、
である、請求項1〜請求項4のいずれか1項に記載のモジュレーター。 - 炭水化物代謝性疾患を治療するための請求項1〜請求項5のいずれか1項に記載の前記モジュレーターを含む医薬用組成物。
- 前記疾患は糖尿病である、請求項6に記載の医薬用組成物。
- 前記疾患は2型真性糖尿病である、請求項6または請求項7に記載の医薬用組成物。
- インスリン産生の上方調節および/またはインスリン放出のために用いられる、請求項
6、請求項7または請求項8に記載の医薬品組成物。 - 炭水化物代謝性疾患を治療するためのモジュレーターをスクリーニングする方法であって、該方法は:
a)試験化合物をSCYL1、ADCK1およびGRK5ポリペプチドからなる群から選ばれた少なくとも1種のポリペプチドと接触させること、
b)前記試験化合物と前記SCYL1、ADCK1またはGRK5ポリペプチドとの結合を検出すること、および、
c)前記試験化合物の存在下で、前記SCYL1、ADCK1またはGRK5ポリペプチドの活性を測定すること、
を含む方法。 - ポリペプチドの代わりに前記ポリペプチドをコードする核酸を用いて、前記活性の代わりに発現率を測定する、請求項10に記載の方法。
- 前記試験化合物は、RNAまたはペプチドまたは抗体またはキナーゼ阻害剤である、請求項10または請求項11に記載の方法。
- キットであって、
a)SCYL1、ADCK1、および/またはGRK5ポリペプチド、
b)SCYL1をコードする核酸、ADCK1をコードする核酸、およびGRK5をコードする核酸、
c)インスリン産生細胞株、
d)SCYL1、ADCK1および/またはGRK5ポリペプチド、または対応核酸の結
合によりインスリン産生に影響を与えることが知られているコントロール化合物 を含むキット。 - 代謝性疾患の治療のための方法であって、:
a)SCYL1、ADCK1およびGRK5からなる群から選ばれた少なくとも1種のチロシンキナーゼの阻害または活性化、または、
b)SCYL1をコードする核酸、ADCK1をコードする核酸およびGRK5をコードする核酸からなる群から選ばれた少なくとも1種の核酸の不活性化、分解、下方調節、インターカレーションまたは活性化、
のための少なくとも1種のモジュレーターの医薬的に効果のある量を必要とする被検者に投与することを含む、
代謝性疾患の治療のための方法。
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