JP2015062360A

JP2015062360A - 試料の加熱方法、並びに、マイクロチップ

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Publication number: JP2015062360A
Application number: JP2013197664A
Authority: JP
Inventors: 良教赤木; Yoshinori Akagi; 山本　一喜; Kazuki Yamamoto; 一喜山本; 修一郎松本; Shuichiro Matsumoto; 野村　茂; Shigeru Nomura; 茂野村
Original assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Current assignee: Sekisui Chemical Co Ltd
Priority date: 2013-09-25
Filing date: 2013-09-25
Publication date: 2015-04-09

Abstract

【課題】より簡単な構成をもって、加熱時におけるマイクロチップ内の液体試料の蒸発や気泡発生を抑制することができる技術を提供する。【解決手段】マイクロチップ１は、基材２、保護部材３、反応槽（密閉空間）５、及びガス発生フィルム（ガス発生剤）６を有する。ガス発生フィルム５は光応答性又は熱応答性のガス発生剤からなる。反応槽５に収容された液体試料１０を加熱する際に、ガス発生フィルム５に光などの外部刺激を付与してガスを発生させる。これにより反応槽１０に気体による圧力が付与され、圧力を加えながら液体試料１０を加熱することができる。本発明の加熱方法は、核酸増幅反応における変性（解離）工程等に用いることができる。【選択図】図１

Description

本発明は、試料の加熱方法、並びに、マイクロチップに関する。本発明は、微量試料を用いた核酸増幅反応等に有用なものである。

微量の液体試料を取り扱うことができるマイクロチップが知られている。例えば、手で容易に取り扱い得る大きさの基板（チップ）内に、液体試料等を搬送するためのマイクロ流路が形成され、必要に応じて、試料の導入部、試薬類の保持部、反応槽等が設けられたマイクロチップやマイクロ流体デバイスが知られている（例えば、特許文献１，２）。

ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（ＰＣＲ）法等の核酸増幅反応を、マイクロチップを用いて行うことができる。マイクロチップを用いることにより、微量の液体試料であっても核酸増幅反応を容易に行うことができる。

一般に、核酸増幅反応は核酸を変性（解離）させる工程を包含する。この変性工程では、液体試料を９４℃〜９６℃程度の高温に晒す必要がある。しかし、液体試料を高温に晒すと、液体試料が蒸発するという問題がある。さらに、高温によって液体試料に気泡が発生するという問題がある。気泡の発生は、反応液の各種検出時に悪影響を与える。これらの問題は、試料が微量である場合に特に深刻となる。
マイクロチップを用いる場合において、加熱時における液体試料の蒸発や気泡の発生といった問題を解決するために、種々の技術が提案されている。例えば特許文献３には、液体試料が収容される反応室（容器部）を弾性部材で構成して変形容易とし、空気等の加圧媒体を反応室に導入して加圧しながら反応室内の液体試料を加熱する方法が記載されている。また特許文献４には、被検出部において反応の検出が行われるマイクロチップにおいて、被検出部に送液することにより被検出部内を加圧し、反応液の気泡を溶解消滅させる技術が記載されている。すなわち、加圧により沸点が上昇し、液体試料の蒸発が抑えられる。また加圧により液体の飽和ガス濃度が上昇し、気泡を溶解消滅させることができる。

特開２０１２−１３２８７９号公報特開２０１２−２１５５３５号公報国際公開第２００８／０９６５６３号国際公開第２０１２／０８６１６８号

しかし、特許文献３，４に記載されている技術では、加圧媒体（空気や液体）をマイクロチップに供給するための構成が別途必要であり、取り扱いが煩雑である。そこで本発明は、より簡単な構成をもって、加熱時におけるマイクロチップ内の液体試料の蒸発や気泡発生を抑制することができる技術を提供することを目的とする。

上記した課題を解決するための本発明の１つの様相は、マイクロチップに設けられた密閉空間に導入された液体試料を加熱する試料の加熱方法であって、前記マイクロチップは光応答性又は熱応答性のガス発生剤を備えており、前記ガス発生剤から発生したガスを前記密閉空間に導入して圧力を加えながら、前記液体試料を加熱することを特徴とする試料の加熱方法である。

本発明の試料の加熱方法は、マイクロチップ内で液体試料を加熱する方法に係るものである。本発明では、用いるマイクロチップが光応答性又は熱応答性のガス発生剤を備えている。そして、当該ガス発生剤から発生したガスによって、密閉空間に導入された液体試料に圧力を加えながら、液体試料を加熱する。本発明によれば、マイクロチップにガス発生剤が設けられているので、液体試料を加圧しながら加熱する場合に、加圧媒体を供給するための構成を別途用意する必要がない。そのため、マイクロチップのディスポーザブル化、軽量化、および薄型化が容易となる。さらに、光や熱をガス発生剤に付与するだけの簡単な構成で密閉空間を加圧できるので、システム全体のメンテナンス性がよい。本発明によれば、簡単な構成をもって、マイクロチップ内の液体試料の蒸発や気泡の発生を抑制することができる。本発明は、例えば、マイクロチップを用いた核酸増幅反応における核酸の変性（解離）工程に有用である。

好ましくは、前記ガス発生剤は、前記密閉空間内に設置されている。

好ましくは、前記マイクロチップは前記密閉空間に連通する流路を有し、前記ガス発生剤から発生したガスを、当該流路を通じて前記密閉空間に導入する。

好ましくは、前記流路には、ガスの逆流を防止する逆流防止手段が設けられている。

好ましくは、前記ガス発生剤は、アゾ又はアジド系ガス発生剤である。

好ましくは、前記ガス発生剤は、粘着性を有するバインダー樹脂に含有されている。

好ましくは、前記ガス発生剤は、フィルム状又はテープ状である。

好ましくは、前記液体試料は核酸を含有するものであり、核酸増幅反応における加熱を要する工程で行われる。

加熱を要する工程の例としては、核酸の変性（解離）工程が挙げられる。

好ましくは、前記液体試料を９３℃〜９７℃に加熱する。

本発明の他の様相は、上記構成の試料の加熱方法に用いられるマイクロチップであって、液体試料を導入可能な密閉空間を有し、当該密閉空間に導入された液体試料を加熱可能であり、光応答性又は熱応答性のガス発生剤を備え、当該ガス発生剤から発生したガスを前記密閉空間に導入することにより前記密閉空間を加圧可能であることを特徴とするマイクロチップである。

本発明のマイクロチップは、上記構成の試料の加熱方法に用いられるものである。本発明のマイクロチップは、光応答性又は熱応答性のガス発生剤を備えており、当該ガス発生剤から発生したガスを密閉空間に導入することにより、前記密閉空間を加圧可能である。本発明のマイクロチップによれば、簡単な構成をもって、密閉空間に導入された液体試料を加圧しながら加熱することができる。

本発明によれば、簡単な構成をもって、加熱時におけるマイクロチップ内の液体試料の蒸発や気泡の発生を抑制することができる。本発明は、例えば、マイクロチップを用いた核酸増幅反応における核酸の変性（解離）工程に有用である。

本発明の第一実施形態に係るマイクロチップに液体試料が導入された状態を模式的に表す断面図である。本発明の第二実施形態に係るマイクロチップに液体試料が導入された状態を模式的に表す断面図である。本発明の第三実施形態に係るマイクロチップに液体試料が導入された状態を模式的に表す断面図である。

以下、本発明の実施形態について図面を参照しながら説明する。なお、発明の理解を容易にするために、各図面において、各部材の大きさや厚みについては一部誇張して描かれており、実際の大きさや比率等とは必ずしも一致しないことがある。また本発明がこれらの実施形態に限定されないことは当然である。

本発明の第一実施形態に係るマイクロチップ１は、例えばＰＣＲ法による核酸増幅反応に用いられるものである。マイクロチップ１は全体形状が板状であり、図１に示すように、板状の基材２に保護部材３が積層された基本構造を有している。マイクロチップ１は、さらに反応槽（密閉空間）５とガス発生フィルム６を備えている。

反応槽（密閉空間）５は、液体試料１０が導入かつ収容される密閉可能な部屋であり、直方体状の空間である。反応槽５は、基材２に形成された凹部７とガス発生フィルム６とで囲まれた空間で構成されている。
反応槽５の容積は、数〜数百ｍｍ³（μＬ）程度である。そして、液体試料１０は、例えば当該容積の３０〜８０％程度まで収容されている。したがって、液体試料１０の上側にはある程度の空隙がある。
マイクロチップ１の反応槽５は、外部のヒータによって加熱可能である。すなわち外部のヒータをマイクロチップ１に接触させることにより、反応槽５に収容された液体試料１０を加熱することができる。

ガス発生フィルム６は、反応槽５の上側に設けられている。ガス発生フィルム６は、凹部７の開口部を隙間なく覆っており、反応槽５の天面を構成している。すなわちガス発生フィルム６の下面は、反応槽５の内部に向かって露出している。
ガス発生フィルム６は、光応答性又は熱応答性のガス発生剤で構成されている。そのため、ガス発生フィルム６に光や熱からなる外部刺激を与えることにより、ガスを発生させることができる。発生したガスは反応槽５の内部に供給される。

保護部材３は、ガス発生フィルム６全体を覆うように基材２の上に積層されている。保護部材３は光透過性の材料で構成されている。そのため、マイクロチップ１の上側から光を照射すると、光がガス発生フィルム６に到達できる。またガス発生フィルム６を外から視認可能である。

さらにマイクロチップ１には、液体試料１０を導入するための試料導入口、当該試料導入口から反応槽５に至るマイクロ流路、および当該マイクロ流路の一部を開放・閉鎖して反応槽５を密閉可能にするバルブ（いずれも図示せず）が設けられている。

反応槽５に収容された液体試料１０を加圧しながら加熱する方法について説明する。
まず、試料導入口（図示せず）から液体試料１０を導入し、反応槽５に所望量の液体試料１０を収容する。バルブ（図示せず）を閉鎖し、反応槽５を密閉状態とする。これにより、図１に示す状態となる。

次に、マイクロチップ１の上側から、発光ダイオード（ＬＥＤ）等からなる光源１２を用いて光を照射する。これにより、照射された光がガス発生フィルム６に到達し、ガスが発生する。発生したガスは反応槽５に供給され、反応槽５の内部に気体の圧力が付与される。すなわち反応槽５内の気圧が上昇する。反応槽５の内部が所望の圧力になった時点で、ヒータを基材２の裏面の反応槽５に相当する位置に接触させる。これにより、反応槽５内の圧力が高められた状態で、反応槽５内の液体試料１０が加熱される。すなわち、ガスによる圧力を加えながら液体試料１０を加熱することとなる。例えば、核酸増幅反応の変性工程を行うのであれば、液体試料１０が９３℃〜９７℃、好ましくは９４℃〜９６℃となるように加熱する。
このとき、反応槽５の内部の圧力が高められているので、加熱による液体試料１０の蒸発と気泡発生が抑えられる。

なお、ガスによる圧力を加えながら液体試料を加熱する態様としては、ガスによる圧力が付与された状態で加熱するものであれば特に限定はない。例えば、ガス発生フィルム６への光照射と反応槽５への加熱を並行して行うことが挙げられる。また、所望の圧力になった時点でガス発生フィルム６への光照射を停止し、その後、反応槽５へ加熱を開始することが挙げられる。

本実施形態では、ガス発生フィルム６に付与する外部刺激として光を用いたが、光の代わりに熱を付与してもよい。また、光と熱を併用してもよい。

続いて、本発明の第二実施形態について、図２を参照しながら説明する。
第二実施形態に係るマイクロチップ２１は、第一実施形態と同様に、全体形状が板状であり、板状の基材２２に保護部材２３が積層された基本構造を有している。そしてマイクロチップ２１は、さらに反応槽（密閉空間）２５とガス発生フィルム６を備えている。ただし本実施形態では、ガス発生フィルム６は、基材２２の下側（裏面）に設けられている。また反応槽２５は、基材２２に形成された凹部２７と保護部材２３とで囲まれた空間で構成されている。

本実施形態では、基材２２の裏面にガス供給口３１が設けられている。また、ガス供給口３１から反応槽２５に至るガス供給用流路３２が設けられている。さらに、ガス供給用流路３２の途中に逆止弁（逆流防止手段）３３が設けられている。逆止弁３３により、反応槽２５からガス供給口３１に向かってガスや反応液が逆流することが防止される。

ガス供給用流路３２は、マイクロ流路に属するものである。マイクロ流路とは、流路を流れる液体に所謂マイクロ効果が発現する形状寸法に形成されている微細な流路をいう。具体的には、流路を流れる液体が、表面張力と毛細管現象との影響を強く受け、通常の寸法の流路を流れる液体とは異なる挙動を示す形状寸法に形成されている微細な流路である。マイクロ流路の内径は、一般に０．０２μｍ〜２ｍｍ程度である。ただし本実施形態では、ガス供給用流路３２に液体が流れることはない。

ガス発生フィルム６は、ガス供給口３１全体を塞ぐように、基材２２の裏面に貼付されている。すなわち、ガス発生フィルム６の一方の面が、ガス供給用流路３２の内部に向かって露出している。

反応槽２５の容積は、第一実施形態の反応槽５の容積と同程度である。液体試料１０の量も第一実施形態と同程度である。

本実施形態のマイクロチップ２１を用いて反応槽２５内の液体試料１０を加熱する方法は、第一実施形態と基本的に同じである。すなわち、図２に示す状態で、基材２２の裏面側からガス発生フィルム６に向けて光源１２から光を照射する。これによりガス発生フィルム６からガスが発生し、ガス供給口３１にガスが供給される。供給されたガスは、ガス供給用流路３２を通じて反応槽２５内に導入される。これにより、反応槽２５の内部に気体の圧力が付与される。すなわち反応槽２５内の気圧が上昇する。反応槽２５の内部が所望の圧力になった時点で、ヒータを基材２２の裏面の反応槽５に相当する位置に接触させる。これにより、反応槽２５内の圧力が高められた状態で、反応槽２５内の液体試料１０が加熱される。すなわち、ガスによる圧力を加えながら液体試料１０を加熱することとなる。本実施形態によっても、反応槽２５の内部の圧力が高められているので、加熱による液体試料１０の蒸発と気泡発生が抑えられる。また本実施形態では逆止弁３３が設けられているので、反応槽２５内のガスや液体試料１０が逆流することはない。

本実施形態においても、ガス発生フィルム６に付与する外部刺激として、光の代わりに熱を付与してもよい。また、光と熱を併用してもよい。

続いて、本発明の第三実施形態について、図３を参照しながら説明する。
第三実施形態に係るマイクロチップ４１は、第一実施形態と同様に、全体形状が板状であり、板状の基材４２にガス発生フィルム６が貼付された基本構造を有し、さらに板状の基材４２により反応槽４５は略Ｕ字型を形成し、液体試料１０とガス発生フィルム６との間には２つの空間が存在する。前記二つの空間の少なくとも一方にあるガス発生フィルム６に光源１２から光照射をすれば、ガス発生フィルム６から発生したガスにより、反応槽４５の内部の圧力を上昇させることができる。なお、ガス発生フィルム６に粘着性がある場合は、ガス発生フィルム６が保護層の役割を果たし、別途保護層を設ける必要はない。

以下、各部材を構成する材料等について説明する。
基材２，２２，４２は、例えば、樹脂、セラミックス、ガラス等により構成することができる。基材２，２２，４２を構成する樹脂としては、例えば、有機シロキサン化合物、ポリメタクリレート樹脂、環状ポリオレフィン樹脂などが挙げられる。有機シロキサン化合物の具体例としては、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリメチル水素シロキサンなどが挙げられる。

保護部材３，２３は、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）等の光透過性の材料で構成されている。

ガス発生フィルム（ガス発生剤）６を構成する材料の例としては、アゾ化合物、アジド化合物、ポリオキシアルキレン樹脂、などが挙げられる。
アゾ化合物の具体例としては、例えば、２，２’−アゾビス（Ｎ−シクロヘキシル−２−メチルプロピオンアミド）、２，２’−アゾビス［Ｎ−（２−メチルプロピル）−２−メチルプロピオンアミド］等が挙げられる。
アジド化合物としては、例えば、スルフォニルアジド基またはアジドメチル基を有する化合物が挙げられる。アジドメチル基を有する化合物の具体例としては、例えば、グリシジルアジドポリマー等が挙げられる。
さらに、国際公開第２００９／１１３５６６号に記載されているような、光酸発生剤（スルホン酸オニウム塩、ベンジルスルホン酸エステル、ハロゲン化イソシアヌレート、ビスアリールスルホニルジアゾメタン等）と酸刺激ガス発生剤（炭酸塩及び／又は重炭酸塩等）の組み合わせ、光塩基発生剤（コバルトアミン系錯体、カルバミン酸ｏ−ニトロベンジル、オキシムエステル、カルバモイルオキシイミノ基含有化合物等）と塩基増殖剤（Ｆｌｕ３、Ｆｌｕ４等）の組み合わせ、等を、ガス発生剤を構成する材料として用いることができる。

前記ガス発生剤は、粘着性を有するバインダー樹脂と混合して用いることができる。好ましく用いられるバインダー樹脂の具体例としては、アクリル樹脂、グリシジルアジドポリマーなどが挙げられる。また、前記ガス発生剤は、光増感剤を含ませてもよい。好ましく用いられる光増感剤の具体例としては、ベンゾフェノン、ジエチルチオキサントン、アントラキノン、ベンゾイン、アクリジン誘導体などが挙げられる。

光源１２の例としては、発光ダイオード（ＬＥＤ）からなる光源が挙げられる。光源の出力（ワット数）は、必要とするガス発生量や加熱時間に応じて適宜選択することができる。

本発明の加熱方法が適用される工程の例としては、ＰＣＲ法等の核酸増幅反応における変性（解離）工程が挙げられる。当該変性工程では、通常９４℃〜９６℃程度の温度まで液体試料を加熱するので、本発明の効果（蒸発防止、気泡発生防止）が特に顕著に発揮される。その他、通常５５℃〜７５℃程度の中高温で行われるアニーリング工程等にも本発明の加熱方法を適用することができる。
もちろん本発明の加熱方法は核酸増幅反応に限定されず、マイクロチップ内で液体試料を加熱する全ての反応に適用できる。

１マイクロチップ
５反応槽（密閉空間）
６ガス発生フィルム（ガス発生剤）
１０液体試料
２１マイクロチップ
２５反応槽（密閉空間）
３２ガス供給用流路（流路）
３３逆止弁（逆流防止手段）
４１マイクロチップ
４５反応槽（密閉空間）

Claims

マイクロチップに設けられた密閉空間に導入された液体試料を加熱する試料の加熱方法であって、前記マイクロチップは光応答性又は熱応答性のガス発生剤を備えており、前記ガス発生剤から発生したガスを前記密閉空間に導入して圧力を加えながら、前記液体試料を加熱することを特徴とする試料の加熱方法。
前記ガス発生剤は、前記密閉空間内に設置されていることを特徴とする請求項１に記載の試料の加熱方法。
前記マイクロチップは前記密閉空間に連通する流路を有し、前記ガス発生剤から発生したガスを、当該流路を通じて前記密閉空間に導入することを特徴とする請求項１に記載の試料の加熱方法。
前記流路には、ガスの逆流を防止する逆流防止手段が設けられていることを特徴とする請求項３に記載の試料の加熱方法。
前記ガス発生剤は、アゾ又はアジド系ガス発生剤であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記載の試料の加熱方法。
前記ガス発生剤は、粘着性を有するバインダー樹脂に含有されていることを特徴とする請求項１〜５のいずれかに記載の試料の加熱方法。
前記ガス発生剤は、フィルム状又はテープ状であることを特徴とする請求項１〜６のいずれかに記載の試料の加熱方法。
前記液体試料は核酸を含有するものであり、核酸増幅反応における加熱を要する工程で行われることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の試料の加熱方法。
前記液体試料を９３℃〜９７℃に加熱することを特徴とする請求項１〜８のいずれかに記載の試料の加熱方法。
請求項１〜９のいずれかに記載の試料の加熱方法に用いられるマイクロチップであって、液体試料を導入可能な密閉空間を有し、当該密閉空間に導入された液体試料を加熱可能であり、光応答性又は熱応答性のガス発生剤を備え、当該ガス発生剤から発生したガスを前記密閉空間に導入することにより前記密閉空間を加圧可能であることを特徴とするマイクロチップ。