JP2015055487A

JP2015055487A - Ｂ型インフルエンザウイルスの測定方法

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Publication number: JP2015055487A
Application number: JP2013187320A
Authority: JP
Inventors: 浩一稲野; Koichi Inano; 恭宮澤; Yasushi Miyazawa; 治石川; Osamu Ishikawa
Original assignee: Denka Seiken Co Ltd
Current assignee: Denka Seiken Co Ltd
Priority date: 2013-09-10
Filing date: 2013-09-10
Publication date: 2015-03-23
Anticipated expiration: 2033-09-10
Also published as: US11360088B2; EP3045914A1; CN105683756A; KR102227648B1; CN105683756B; EP3045914B1; US20160223541A1; JP6182027B2; EP3045914A4; KR20160051816A; WO2015037629A1

Abstract

【課題】Ｂ型インフルエンザウイルスを特異的かつ従来法よりも高感度に検出することができる、免疫測定によるＢ型インフルエンザウイルスの測定方法、及びそのための器具又はキットを提供すること。【解決手段】Ｂ型インフルエンザウイルスの測定方法は、Ｂ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）の１２５〜２４８番目のアミノ酸領域とそれぞれ特異的に反応する２種類のモノクローナル抗体であって、同時にＭ１の１２５〜２４８番目のアミノ酸領域に結合できる２種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いるサンドイッチ法によりＢ型インフルエンザウイルスを免疫測定することを含む。【選択図】図２

Description

本発明は、免疫測定によるＢ型インフルエンザウイルスの測定方法及びそのための器具又はキットに関する。

インフルエンザは冬期に流行する感染症で、高熱、上気道炎、倦怠感などの臨床症状を呈するが、それらの症状のみではアデノ、ＲＳ、パラインフルエンザ、ヒトメタニューモなど他のウイルスに起因する感染症と区別することは必ずしも容易ではない。

インフルエンザの確定診断法としては、ウイルス分離、血清学的診断、核酸検出（ＰＣＲ法）などがあるが、これらの方法は診察室等の日常の医療現場で簡単に行えるものではないため、より簡便な診断方法が求められていた。近年になり、簡便性と迅速性を兼ね備えた、イムノクロマト法を原理とする抗原検出試薬が開発されると、広く診断補助に利用されるようになった。

しかし、Ｂ型インフルエンザではＡ型インフルエンザと比べて、患者から採取された検体に含まれるウイルス量が少なく、抗原検出試薬を用いた場合にＡ型よりも検出感度が低いことが指摘されている（非特許文献１）。

インフルエンザウイルスは分節状のマイナス鎖ＲＮＡをゲノム遺伝子とするウイルスで、ＨＡ、ＮＡ、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２、Ｍ、ＮＰ、ＮＳの８分節から成る。インフルエンザウイルスは、構成するタンパク質のうち、マトリックスタンパク質（Ｍ１）と核タンパク質（ＮＰ）の抗原性の違いにより、Ａ型、Ｂ型、およびＣ型に分類される。該タンパク質は抗原性がそれぞれ異なるため、異なる型の間で交差反応を示さない。

Ｂ型インフルエンザはウイルス形態、および臨床症状からはＡ型インフルエンザと見分けが付かないが、Ａ型と同様にヒトインフルエンザの病原体として重要である。

Ｂ型インフルエンザウイルスのＭ分節にはＭ１とＢＭ２という異なる２つの遺伝子がコードされており、それぞれから構成タンパク質が合成される。これらのタンパク質はＡ型インフルエンザウイルスのＭ１とＭ２に相当するが、Ｂ型のＢＭ２はＡ型のＭ２と構造が大きく異なる。Ｍ１はウイルスエンベロープの内側を裏打ちする形で局在しており、これが実質的な殻の役割を果たしていると考えられている。

インフルエンザに対する治療薬として、オセルタミビルリン酸塩、ザナミビル水和物、ペラミビル水和物、ラニナミビルオクタン酸エステル水和物、アマンタジン塩酸塩が用いられているが、Ｍ２阻害剤であるアマンタジン塩酸塩はB型インフルエンザウイルスの感染増殖を阻害しないためA型インフルエンザの治療にのみ用いられる。さらに前４者はノイラミニダーゼ（ＮＡ）阻害剤として同一の作用点を示す治療薬であるが、インフルエンザの型によって解熱時間やウイルス残存率などの有効性に差異があることが指摘されている（非特許文献２）。従って、インフルエンザの型の鑑別は、その後の適切な治療薬選択のために重要である。

従来のインフルエンザの検出には抗ＮＰ抗体（特許文献１ないし３）、抗Ｍ２抗体（特許文献４）などが用いられていたが、Ｍ１と特異的に反応する抗Ｍ１抗体は用いられていなかった。

特開2007-285749 特許4936428 WO2005/007698 特許4932940

ウイルス第 56 巻第１号，pp.109-116，2006（インフルエンザの診断と治療） J Infect. 2008 Jan;56(1):51-7. Epub 2007 Oct 15.（A comparison of the effectiveness of zanamivir and oseltamivir for the treatment of influenza A and B.） Orthobyxoviridae, Fields Virology.4th edition.2001

従来の免疫測定法では、抗ＮＰモノクローナル抗体などが用いられていたが、Ｂ型インフルエンザウイルスに対する反応性が低く、より反応性の高い抗体が求められていた。

本発明の目的は、Ｂ型インフルエンザウイルスを特異的かつ従来法よりも高感度に検出することができる、免疫測定によるＢ型インフルエンザウイルスの測定方法、及びそのための器具又はキットを提供することである。

本願発明者らは、鋭意研究の結果、Ｂ型インフルエンザウイルスのＭ１タンパク質の特定の領域をエピトープとする２種類のモノクローナル抗体を用いたサンドイッチ法により、Ｂ型インフルエンザウイルスを特異的かつ従来法よりも高感度に検出することができることを見出し本発明を完成した。

すなわち、本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）の１２５〜２４８番目のアミノ酸領域とそれぞれ特異的に反応する２種類のモノクローナル抗体であって、同時にＭ１の１２５〜２４８番目のアミノ酸領域に結合できる２種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いるサンドイッチ法によりＢ型インフルエンザウイルスを免疫測定することを含む、Ｂ型インフルエンザウイルスの測定方法を提供する。また、本発明は、Ｂ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）の１２５〜２４８番目のアミノ酸領域とそれぞれ特異的に反応する２種類のモノクローナル抗体であって、同時にＭ１の１２５〜２４８番目のアミノ酸領域に結合できる２種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、Ｂ型インフルエンザウイルス測定用免疫測定器具又はキットを提供する。

本発明の免疫測定により、従来とは異なるタンパク質を標的として、Ｂ型インフルエンザウイルスをＡ型インフルエンザウイルスと鑑別して検出することができる。また本発明により提供される免疫測定器具又はキットを用いることでＢ型インフルエンザウイルスを特異的かつ高感度に検出することが可能となり、インフルエンザの診断および治療に大きく貢献するものと考えられる。

本発明のイムノクロマト免疫測定器具の好ましい１形態を模式的に示した図である。下記実施例において行った、各種モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロットの結果を示す図である。

本発明に用いるモノクローナル抗体は、Ｂ型インフルエンザウイルスＭ１（以下Ｂ−Ｍ１と略す）と抗原抗体反応する。Ｂ−Ｍ１は２４８アミノ酸残基から構成されるタンパク質であり、ウェスタンブロット法による検出に該抗体を用いることで、分子量２０〜３５ｋＤに抗原抗体反応による特異的なシグナルを検知することができる。本明細書において「特異的」とは、タンパク質と該抗体が混じり合う液系において、該抗体がＢ−Ｍ１以外のタンパク質成分と検出可能なレベルで抗原抗体反応を起こさないか、または何らかの結合反応や会合反応を起こしたとしても、該抗体のＢ−Ｍ１との抗原抗体反応よりも明らかに弱い反応しか起こさないことを意味する。本発明に用いるモノクローナル抗体はＢ−Ｍ１アミノ酸配列の１２５〜２４８番目のアミノ酸領域と反応する。Ｂ−Ｍ１のアミノ酸配列は公知であり、例えばＧｅｎＢａｎｋ：ＡＥＮ７９４２４等に記載されている（配列番号１）。

本発明のモノクローナル抗体を基に、抗原結合部位のみを分離させて反応に使用することができる。すなわち、公知の方法により作製された、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などの特異的な抗原結合性を有する断片（抗原結合性断片）は本発明の範囲に含まれる。また、モノクローナル抗体のクラスはＩｇＧに限定されず、ＩｇＭやＩｇＹでもよい。

Ｂ型インフルエンザウイルスは、抗原的・遺伝系統的に異なる２つのグループ、すなわち山形系統およびビクトリア系統に分類されるが、好ましい形態では本発明のモノクローナル抗体はいずれの系統のウイルス株であっても特異的にＢ−Ｍ１と反応する。より好ましくは、公知の全てのインフルエンザＢ型ウイルス株のＭ１と特異的に反応する。

好ましい形態では、本発明に用いるモノクローナル抗体は、他の感染症の病原体と特異的な抗原抗体反応しない。例えば、Ａ型インフルエンザウイルス、アデノウイルス、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、パラインフルエンザウイルス、ＲＳウイルス、オウム病クラミジア、トラコーマ・クラミジア、肺炎マイコプラズマ、百日咳菌、大腸菌、インフルエンザ菌、レジオネラ・ニューモフィラ、リステリア菌、緑膿菌、セラチア菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、肺炎球菌、化膿レンサ球菌、Ｂ群レンサ球菌、Ｃ群レンサ球菌、Ｇ群レンサ球菌、と抗原抗体反応をしない。

本発明に用いるモノクローナル抗体は、公知の免疫学的手法を用い、Ｂ−Ｍ１又はその部分ペプチド（１２５〜２４８番目のアミノ酸領域から成るポリペプチド又はその部分ペプチド）を被免疫動物に免疫し、被免疫動物の細胞を用いてハイブリドーマを作製することにより得ることができる。免疫に用いるペプチドの長さは特に限定されないが、好ましくは５アミノ酸以上、より好ましくは１０アミノ酸以上のペプチドを用いて免疫原とすることができる。

免疫原とするＢ−Ｍ１は培養ウイルス液から得ることもできるが、Ｂ−Ｍ１をコードするＤＮＡをプラスミドベクターに組み込み、これを宿主細胞に導入して発現させることにより得ることもできる。

免疫原とするＢ−Ｍ１またはその部分ペプチドは以下に例示するようなタンパク質と融合タンパク質として発現させ、精製の後、または未精製のまま免疫原として用いることもできる。融合タンパク質の作製には、当業者が「タンパク質発現・精製タグ」として一般的に用いる、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、Ｎｕｓタグ、Ｓタグ、ＨＳＶタグ、ＦＲＡＧタグ、ポリヒスチジンタグなどが利用できる。これらとの融合タンパク質は、消化酵素を用いてＭ１あるいはその部分ペプチド部分とそれ以外のタグ部分とを切断し、分離精製した後に免疫原として用いることが好ましい。

免疫した動物からのモノクローナル抗体の調製は、周知のケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）により容易に行うことができる。すなわち、免役した動物から、脾細胞やリンパ球等の抗体産生細胞を回収し、これを常法によりマウスミエローマ細胞と融合させてハイブリドーマを作製し、得られたハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングし、クローニングされた各ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体のうち、Ｂ−Ｍ１の１２５〜２４８番目のアミノ酸配列から成るポリペプチド（以下、「Ｂ−Ｍ１Ｃ」）と抗原抗体反応するモノクローナル抗体を選択する。

腹水や培養上清からのモノクローナル抗体の精製は、公知のイムノグロブリン精製法を用いることができる。例えば、硫酸アンモニウムや硫酸ナトリウムを用いた塩析による分画法、ＰＥＧ分画法、エタノール分画法、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー法、ゲルろ過法などが挙げられる。また免疫動物種とモノクローナル抗体のクラスに応じて、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬのいずれかを結合させた担体を用いたアフィニティクロマトグラフィー法によっても精製することが可能である。

本発明のＢ型インフルエンザウイルスの測定方法では、上記のようにして作製した抗Ｂ型インフルエンザウイルスＭ１Ｃ抗体（以下、「抗Ｂ−Ｍ１Ｃ抗体」と略すことがある）を２種類用いてサンドイッチ法による免疫測定を行う。サンドイッチ法を行うためには、これらの２種類のモノクローナル抗体は、同時にＢ−Ｍ１Ｃに結合可能なものであることが必要であり、そのような組み合わせを選択する。サンドイッチ法自体は免疫測定の分野において周知であり、例えばイムノクロマト法やELISA法により行うことができる。これらのサンドイッチ法自体はいずれも周知であり、本発明の方法は、上記した２種類の抗Ｂ−Ｍ１Ｃ抗体を用いること以外は、周知のサンドイッチ法により行うことができる。なお、本発明において、「測定」には、定量、半定量、検出のいずれもが包含される。

サンドイッチ法を検出原理とする免疫測定において、抗体が固定化される固相としては、抗体を公知技術により固定可能なものは全て用いることができ、例えば、毛細管作用を有する多孔性薄膜（メンブレン）、粒子状物質、試験管、樹脂平板など公知のものを任意に選択できる。また、抗体を標識する物質としては、酵素、放射性同位体、蛍光物質、発光物質、有色粒子、コロイド粒子などを用いることができる。

前述の種々の材料による免疫測定法の中でも、特に臨床検査の簡便性と迅速性の観点から、メンブレンを用いたラテラルフロー式の免疫測定法が好ましい。

本発明では、抗Ｂ−Ｍ１抗体を用いてラテラルフロー式に免疫測定を行うことができる免疫測定器具をも提供する。本発明が提供する免疫測定器具は、測定対象物（抗原）を捕捉する抗体（抗体１）が固定化された検出領域を有する支持体、移動可能な標識抗体（抗体２）を有する標識体領域、検体を滴加するサンプルパッド、展開された検体液を吸収する吸収帯、これら部材を１つに貼り合わせるためのバッキングシートから成り、抗体１および抗体２の少なくとも一方が本発明の抗Ｂ−Ｍ１抗体である免疫測定器具である。

なお、検出領域の数および標識体領域に含まれる標識抗体の種類は１に限られるものではなく、複数の測定対象物に対応する抗体を用いることで、２以上の抗原を同一の免疫測定器具にて検出することができる。

図１は、本発明の免疫測定器具の好ましい１形態を示した図である。イが支持体、ロが標識体領域、ハが検出領域、ニがサンプルパッド、ホが吸収帯、ヘがバッキングシートを指している。

図１の上が上面図、下が切断断面図である。図の例では、バッキングシート上に２個の検出領域が形成された支持体、吸収帯、標識体領域、サンプルパッドらがそれぞれ積層されている。そして図示のように、吸収帯の一方の端部と支持体の一方の端部、支持体の他方の端部と標識体領域の一方の端部、標識体領域の他方の端部とサンプルパッドの一方の端部がそれぞれ重ね合わされており、これにより連続したラテラルフローの流路が形成されている。

支持体は、抗原を捕捉するための抗体を固定化する性能を持つ材料であり、かつ液体が水平方向に通行することを妨げない性能を持つ。好ましくは、毛細管作用を有する多孔性薄膜であり、液体およびそれに分散した成分を吸収により輸送可能な材料である。支持体を成す材質は特に限定されるものではなく、例えばセルロース、ニトロセルロース、セルロースアセテート、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ガラス繊維、ナイロン、ポリケトンなどが挙げられる。このうちニトロセルロースを用いて薄膜としたものがより好ましい。

標識体領域は、標識抗体を含む多孔性基材から成り、基材の材質は一般的に用いられているガラス繊維や不織布等を用いることができる。該基材は、多量の標識抗体を含浸させるために、厚さ0.3mm〜0.6mm程度のパッド状であることが好ましい。

検出領域は、抗原を捕捉する抗体が固定化された支持体の一部の領域を指す。検出領域は、Ｂ−Ｍ１抗原を捕捉するための抗Ｂ−Ｍ１抗体を固定化した領域を少なくとも１つ設け、さらにＡ型インフルエンザウイルスを検出するための検出領域を設けることが、実際の診断補助のためには好ましい。

サンプルパッドは、検体または検体を用いて調製された試料を滴加するための部位であり、吸水性を持つ多孔性材料である。該材料には一般的に用いられるセルロース、ガラス繊維、不織布等を用いることができる。多量の検体を免疫測定に用いるために、厚さ0.3mm〜1mm程度のパッド状であることが好ましい。なお、サンプルパッドと前述の標識体領域はあくまで機能的な区別であって、必ずしも個別の材料である必要はない。すなわち、サンプルパッドとして設置した材料の一部領域が標識体領域の機能を有することも可能である。

吸収帯は、支持体に供給され検出領域で反応に関与しなかった成分を吸収するための部材である。該材料には、一般的な天然高分子化合物、合成高分子化合物等からなる保水性の高いろ紙、スポンジ等を用いることができるが、検体の展開促進のためには吸水性が高いものが好ましい。

バッキングシートは、前述の全ての材料、すなわち支持体、サンプルパッド、標識体領域、吸収帯らが、部分的な重なりをもって貼付・固定されるための部材である。バッキングシートは、これら材料らが最適な間隔で配置・固定されるのであれば、必ずしも必要ではないが、製造上あるいは使用上の利便性から、一般的には用いたほうが好ましい。

図１で説明した形態の免疫測定器具において、検体は、サンプルパッド、標識体領域、支持体、検出領域、吸収帯らの一連の接続により形成された多孔性流路を通過する。よって本形態においては、これら全てが検体移動領域となる。各構成材料の材質や形態によって、検体が材料内部を浸透せず界面を通行する形態もありうるが、本明細書で定義する検体移動領域は材料の内部か界面かを問わないため、該形態の免疫測定器具も本明細書の範囲に含まれる。

図１の形態に基づき、本発明の免疫測定器具の使用方法について述べる。

測定は、検体または検体を用いて調製された試料をサンプルパッドに滴加することにより開始される。滴加する検体試料は予め、界面活性剤を含む緩衝液を用いて２〜２０倍程度に希釈されていることが好ましい。

サンプルパッドに滴加された検体試料は毛管作用によって標識体領域、支持体、吸収帯へと順次、水平方向に展開される。標識体領域では検体試料の展開と共に標識抗体が液中に放出され支持体へと展開される。検体試料中に抗原が存在する場合において、支持体の検出領域では捕捉抗体により抗原が特異的に捕捉され、なおかつ抗原は標識抗体とも特異的反応により複合体を形成する。これにより検出領域では抗原を介した抗体のサンドイッチが成立し、標識抗体−抗原複合物を検出領域にて検知することができる。

以下、本発明を実施例に基づきより具体的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

（実施例１）抗Ｂ型インフルエンザウイルスＭ１モノクローナル抗体の作製
１．Ｂ型インフルエンザウイルスＭ１抗原の調製
Ｂ／Ｆｌｏｒｉｄａ／４／２００６株ウイルスＲＮＡから逆転写反応により構築したｃＤＮＡライブラリーを基にＭ１をコードするＤＮＡをプラスミドベクターにサブクローニングした。該プラスミドベクターを導入した大腸菌株を通気攪拌培養することでＭ１を発現させた。Ｍ１は、菌体を破砕し遠心分離により回収した後、クロマトグラフィーに供して精製した。本明細書において、該精製品を精製Ｍ１抗原と呼ぶ。

２．抗Ｂ型インフルエンザウイルスＭ１モノクローナル抗体の作製
精製Ｍ１抗原をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、精製Ｍ１抗原を固相したプレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞株をプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。得られた腹水から、プロテインＡカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー法によりＩｇＧを精製し、精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＭ１抗体を得た。

（参考例１）
１．抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰモノクローナル抗体の作製
Ｂ型インフルエンザウイルス抗原をＢＡＬＢ／ｃマウスに免疫し、一定期間飼育したマウスから脾臓を摘出し、ケラーらの方法（Kohler et al., Nature, vol, 256, p495-497(1975)）によりマウスミエローマ細胞（Ｐ３×６３）と融合した。得られた融合細胞（ハイブリドーマ）を、３７℃インキュベーター中で維持し、Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗原を固相したプレートを用いたＥＬＩＳＡにより上清の抗体活性を確認しながら細胞の純化（単クローン化）を行った。取得した該細胞株をプリスタン処理したＢＡＬＢ／ｃマウスに腹腔投与し、約２週間後、抗体含有腹水を採取した。

得られた腹水からプロテインＡカラムを用いたアフィニティクロマトグラフィー法により、それぞれＩｇＧを精製し、精製抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体を得た。本明細書において、該精製抗体を抗Ｂ−ＮＰ抗体と呼ぶ。

（実施例２）着色ポリスチレン粒子を用いたインフルエンザウイルス抗原検出試薬
１．抗Ｂ型インフルエンザウイルスＭ１抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
実施例１で精製した抗Ｂ−Ｍ１抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈した液をＰＥＴフィルムで裏打ちされたニトロセルロースメンブレンの所定の位置に線状に塗布し、４５℃、３０分間乾燥させ、抗Ｂ型インフルエンザウイルスＭ１抗体固定化メンブレンを得た。本明細書において、抗Ｍ１抗体固定化メンブレンと呼ぶ。

２．抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体のニトロセルロースメンブレンへの固定化
参考例１で作製した抗ＮＰ抗体を用いて前述の実施例２−１と同様の方法により、抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体固定化メンブレンを得た。本明細書において、抗ＮＰ抗体固定化メンブレンと呼ぶ。

３．抗Ｂ型インフルエンザウイルスＭ１抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
実施例１で作製した抗Ｂ−Ｍ１抗体を1.0mg/mLになるように精製水で希釈し、これに着色ポリスチレン粒子を0.1％になるように加え、攪拌後、カルボジイミドを1％になるように加え、さらに攪拌する。遠心操作により上清を除き、50mM Tris（pH9.0）、3％BSAに再浮遊し、抗Ｂ型インフルエンザウイルスＭ１抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。本明細書において、抗Ｍ１抗体固定化粒子と呼ぶ。

４．抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体の着色ポリスチレン粒子への固定化
参考例１で作製した抗Ｂ−ＮＰ抗体を用いて前述の実施例２−３と同様の方法により、抗Ｂ型インフルエンザウイルスＮＰ抗体結合着色ポリスチレン粒子を得た。本明細書において、抗ＮＰ抗体固定化粒子と呼ぶ。

５．抗Ｂ型インフルエンザウイルス抗体結合着色ポリスチレン粒子の塗布・乾燥
３および４で作製した抗体固定化粒子をグラスファイバー不織布に所定量１．０μｇを塗布し、４５℃、３０分間乾燥させた。本明細書において、乾燥パッドと呼ぶ。

６．Ｂ型インフルエンザウイルス試験片の作製
１および２で作製した抗体固定化メンブレンと５で作製した乾燥パッドを他部材（バッキングシート、吸収帯、サンプルパッド）とを貼り合せて５ｍｍ幅に切断し、Ｂ型インフルエンザウイルス試験片とした。本明細書において、試験片と呼ぶ。なお、貼り合わせの際に、抗体固定化メンブレンおよび乾燥パッドの少なくとも一方に抗Ｂ−Ｍ１抗体が含まれる組み合わせとなるように試験片を作製した。

７．Ｂ型インフルエンザウイルス抗原の検出
６で作製した試験片のサンプルパッドに、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原を含む検体浮遊液（10mM ADA（pH6.0）、１％ポリオキシエチレンアルキルエーテル）を６０μＬ滴加し、８分間静置する。抗原と反応した抗体固定化粒子が抗体固定化メンブレンの抗体塗布位置において捕捉され、それによる発色を目視で確認できた場合に＋と判定する。発色を目視で確認できない場合は−と判定する。本試験において、全ての組み合わせの試験片、すなわち抗体固定化メンブレンおよび乾燥パッドの一方または両方が抗Ｂ−Ｍ１抗体であるときに＋となった。

（実施例３）抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット法による抗原検出
１．Ｂ型インフルエンザウイルスリコンビナントＭ１の調製
実施例１−１で構築したｃＤＮＡライブラリーを基に、Ｍ１アミノ酸配列の１〜１２４番目をコードするＤＮＡおよび１２５〜２４８番目をコードするＤＮＡをそれぞれプラスミドベクターにサブクローニングした。該プラスミドベクターを導入した大腸菌株を通気攪拌培養することでリコンビナントＭ１を発現させた。リコンビナントＭ１は、菌体を破砕し遠心分離により回収した後、クロマトグラフィーに供して精製した。本明細書において、前者のアミノ酸配列から成るリコンビナントＭ１をＭ１−Ｎ、後者のアミノ酸配列から成るリコンビナントＭ１をＭ１−Ｃと呼ぶ。

２．ウェスタンブロット法による反応性確認
精製Ｍ１抗原、Ｍ１−Ｎ、Ｍ１−Ｃを用いて実施例１で得られた抗体の反応性を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは１０％アクリルアミドゲルを用いて常法で行った。電気泳動後、ＰＶＤＦ膜に転写した。スキムミルクでブロッキングを行った後、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１μｇ／ｍＬに調整した抗Ｂ−Ｍ１抗体を室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した後、３０００倍に希釈したＨＲＰ標識抗マウス抗体を室温で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで十分に洗浄した後、化学発光検出試薬を用いてシグナルを検出した。試験した抗体は精製Ｍ１抗原と反応することが確認され、Ｍ１−Ｎに反応する抗体と、Ｍ１−Ｃに反応する抗体とに判別された。結果を図２に示す。本明細書において、前者の抗体を抗Ｍ１−Ｎ抗体、後者を抗Ｍ１−Ｃ抗体と呼ぶ。

（実施例４）抗Ｍ１−Ｎ抗体と抗Ｍ１−Ｃ抗体とを組み合わせた抗原検出試薬の性能確認
１．抗Ｍ１−Ｎ抗体と抗Ｍ１−Ｃ抗体とを組み合わせた試験片の作製
実施例２−６と同様の方法で以下の試験片を作製した。抗体固定化メンブレンと乾燥パッドとを、抗Ｍ１−Ｎ抗体同士で組み合わせた試験片（ＮＮ試験片）、抗Ｍ１−Ｃ抗体同士で組み合わせた試験片（ＣＣ試験片）、抗体固定化メンブレンに抗Ｍ１−Ｎ抗体を用い乾燥パッドに抗Ｍ１−Ｃ抗体を用いた試験片（ＮＣ試験片）、抗体固定化メンブレンに抗Ｍ１−Ｃ抗体を用いた乾燥パッドに抗Ｍ１−Ｎ抗体を用いた試験片（ＣＮ試験片）。

２．抗ＮＰ抗体の組み合わせによる試験片の作製
対照として、実施例２−６と同様の方法で、抗ＮＰ固定化メンブレンと抗ＮＰ固定化粒子を用いた試験片を作製した（従来法試験片）。

３．試験片のＢ型インフルエンザ抗原検出感度比較
１および２で作製した試験片のサンプルパッドに、Ｂ型インフルエンザウイルス抗原を含む検体浮遊液（10mM ADA（pH6.0）、１％ポリオキシエチレンアルキルエーテル）を６０μＬ滴加し、８分間静置する。抗原と反応した抗体固定化粒子が抗体固定化メンブレンの抗体塗布位置において捕捉され、それによる発色を目視で確認できた場合に＋と判定する。発色を目視で確認できない場合は−と判定する。ＣＣ試験片は従来法試験片に比べて４倍高い検出感度を示した。結果を表１に示す。

イ支持体
ロ標識体領域
ハ検出領域
ニサンプルパッド
ホ吸収帯
ヘバッキングシート

Claims

Ｂ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）の１２５〜２４８番目のアミノ酸領域とそれぞれ特異的に反応する２種類のモノクローナル抗体であって、同時にＭ１の１２５〜２４８番目のアミノ酸領域に結合できる２種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を用いるサンドイッチ法によりＢ型インフルエンザウイルスを免疫測定することを含む、Ｂ型インフルエンザウイルスの測定方法。
前記サンドイッチ法がイムノクロマト法である請求項１記載の方法。
前記サンドイッチ法がELISA法である請求項１記載の方法。
Ｂ型インフルエンザウイルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１）の１２５〜２４８番目のアミノ酸領域とそれぞれ特異的に反応する２種類のモノクローナル抗体であって、同時にＭ１の１２５〜２４８番目のアミノ酸領域に結合できる２種類のモノクローナル抗体又はその抗原結合性断片を含む、Ｂ型インフルエンザウイルス測定用免疫測定器具又はキット。
前記モノクローナル抗体の一方である第１抗体またはその抗原結合性断片が支持体上に固定化された検出領域と、前記もう一方のモノクローナル抗体である第２抗体またはその抗原結合性断片を検体と共に供給する標識体領域と、検体移動領域を備えたイムノクロマト免疫測定器具。
前記モノクローナル抗体の一方である第１抗体またはその抗原結合性断片が固定化された支持体と、前記もう一方のモノクローナル抗体である第２抗体またはその抗原結合性断片を含む請求項４記載のＢ型インフルエンザウイルス測定用免疫測定器具又はキット。