JP2014532395A - 新規ペプチド - Google Patents

Abstract

本発明は、ポリペプチドシャペロニン60.1から誘導できる新規ペプチドおよび炎症状態の予防および/または治療のためなどの医療でのその使用に関する。

Description

本発明は、ポリペプチドシャペロニン60.1から誘導できる新規ペプチドおよび炎症状態の予防および/または治療のためなどの医療でのその使用に関する。

熱ショックポリペプチドは、すべての生物で見出される分子のファミリーであり、その機能は生物学的処理および生物学的分子の安定性を支援することである(Zugel & Kauffman (1999) Role of heat shock polypeptides in protection from and pathogenesis of infectious diseases. Clin. Microbiol. Rev. (12)1: 19-39; Ranford et al. (2000) Chaperonins are cell signalling polypeptides: - the unfolding biology of molecular chaperones. Exp. Rev. Mol. Med., 15 September, www.ermn.cbcu.cam.ac.uk/)。

熱ショックポリペプチドはすべての細胞区画に配置され、広範囲の生物学的分子と相互作用する能力を有する。特に、熱ショックポリペプチドは、ポリペプチドおよびその任意の複合体の組み立てから分解までの任意の時点でポリペプチドのフォールディングおよびポリペプチドの移動を支援しまたそれに影響する。熱ショックポリペプチドの介助者特性のため、それらは分子シャペロンとしても知られるようになった(Laskey et al. (1978) Nucleosomes are assembled by an acidic polypeptide, which binds histones and transfers them to DNA. Nature (275): 416-420)。

熱ショックポリペプチドは、環境ストレスに応答して細胞によって合成され、その環境ストレスには、温度変化(上昇および低下)、およびサイトカインなどの病態生理学的シグナルが含まれるが、それらに限定されない。環境ストレスに応答して、熱ショックポリペプチドは他のポリペプチドをプロセシングするその能力を用いて、該ストレスの存在のせいで生じ得る任意の変性からそのようなポリペプチドを保護する。この機構はまた、該タンパク質を含む細胞を保護する働きをする。

シャペロニンポリペプチドは、ポリペプチドフォールディングでのその役割が周知の、熱ショックポリペプチドの亜群である。シャペロニンポリペプチドの2つのファミリー、シャペロニン60 (約60 kDa)およびシャペロニン10 (約10 kDa)ファミリーが存在する(Ranford, 2000)。最もよく特徴づけられているシャペロニンはE. coli由来のシャペロニンであり、該シャペロニンから、シャペロニン60およびシャペロニン10の特徴的構造が確立されている。ほとんどの他の生物のシャペロニン複合体も、この特徴的構造に実質的に一致する。

シャペロニンの特徴的構造は、互いに向かい合い、シャペロニン10単量体から構成されるヘプタマー環によってキャップされている2つのヘプタマー環(7つのシャペロニン60単量体から構成される)から形成される複合体である。

従来的には、標的ポリペプチドが環形成ヘプタマーのセントラルコアに入ると、シャペロニンがポリペプチドフォールディングを支援し、続いてATPからエネルギーが放出されると、シャペロニン構造のコンフォメーション変化によって標的ポリペプチドはセントラルコアから放出される(Ranson et al. (1998) Review Article: Chaperones. Biochem. J (333): 233-242)。

結核菌(Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis))は、シャペロニン60.1 (Cpn60.1)を生産する。シャペロニン60.1は、他の公知のシャペロニンとのそのアミノ酸配列同一性に基づいて名付けられたポリペプチドである。さらなるM. tuberculosisシャペロニンポリペプチドはシャペロニン10 (Cpn10)およびシャペロニン60.2 (Cpn60.2)である。Cpn60.2はCpn60.1に対して59.6%のアミノ酸配列同一性および65.6%の核酸配列同一性を示す。

国際特許出願公開番号WO02/040037は、M. tuberculosis由来のCpn60.1 (MtCpn60.1)を含む医薬組成物およびそのコード核酸分子を開示する。この出願はまた、類似の生物学的活性を有する全長ポリペプチドから誘導できるいくつかの特定のペプチドフラグメントを開示する。これらの分子の種々の治療的使用も開示され、それには、自己免疫障害、アレルギー状態、Th2型免疫応答を特徴とする状態および好酸球増加を伴う状態の治療および/または予防が含まれる。

国際特許出願公開番号WO2009/106819は、アミノ酸配列: DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAADを有するペプチド("ペプチド4"と表記される)を含む、MtCpn60.1から誘導できる一連の新規ペプチドを開示する。ペプチド4は抗炎症活性を示し、アレルギー性気道炎症の動物モデルにおいて好酸球の動員を顕著に減少させることが示されている。

本発明は、ペプチド4 (DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD)の特定の新規サブフラグメントが生物学的活性、特に白血球血管外遊出の阻害能を示すという予期せぬ知見に基づく。本発明の新規ペプチドは、アミノ酸鎖の長さが比較的短いことにより高収量での製造および単離に好都合であるため、医薬品としての開発に特に適している。それらはまた、MtCpn60.1および公知のそのペプチドフラグメントと比べて、in vivoでの向上した生物学的安定性を有することが示された。

ゆえに、第1の態様では、本発明は、以下の群:
(i) DGSVVVNKVSELPAGH;
(ii) GLNVNTLSYGDLAAD;
(iii) SELPAGHGLNVNLTS;
(iv) DGSVVVNKVS;
(v) ELPAGHGLNV; および
(vi) NTLSYGDLAAD;
から選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたかまたは組換えのペプチド分子、
または機能上等価なそのフラグメントもしくは変異体
を提供する。

M. tuberculosis由来のシャペロニン60.1のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。 図１−１の続き。 M. tuberculosis由来のシャペロニン60.1の赤道ドメインをカバーするペプチド。 図２−１の続き。 非アレルギー性炎症のリポ多糖(LPS)モデルでのM. tuberculosis由来のシャペロニン60.1のペプチドフラグメントの効果。

本発明の好ましい実施形態では、以下の群:
(i) DGSVVVNKVSELPAGH;
(ii) GLNVNTLSYGDLAAD; および
(iii) SELPAGHGLNVNLTS;
から選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたかまたは組換えのペプチド分子、
または機能上等価なそのフラグメントもしくは変異体
を提供する。

本発明の別の好ましい実施形態では、以下の群:
(iv) DGSVVVNKVS;
(v) ELPAGHGLNV; および
(vi) NTLSYGDLAAD;
から選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたかまたは組換えのペプチド分子、
または機能上等価なそのフラグメントもしくは変異体
を提供する。

「機能上等価な」とは、定義されるアミノ酸配列(i)〜(vi)の1種以上によって示されるかまたはそれに起因するいずれかの機能と同一または実質的に類似の機能(例えば生物学的活性)を有する任意のペプチドおよび/またはその変異体もしくはフラグメントを意味する。例えば、(i)〜(vi)で定義されるアミノ酸配列からなるペプチドは抗炎症特性を示し、その抗炎症特性は関節炎および疼痛を含む種々の疾患および障害の予防および/または治療でのその使用を可能にする。特定の生物学的活性に関する機能的等価性は、従来のモデルおよび方法を使用して、例えば熱した板(heated plate)上での足潜時(paw latency)を測定するかまたはin vivoまたはin vitroで炎症性サイトカインの放出を測定することによって測定できる。

「変異体」とは、上記配列列挙(i)〜(vi)のいずれかで定義される配列に対して、75%、80%、85%、90%または95%などの70%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するペプチドを意味する。ゆえに、用語「変異体」とは、例えば組換えDNA技術を使用して作製されたアミノ酸挿入、欠失、および置換によって天然に存在する分子と異なるポリペプチドおよびペプチドを表す。どのアミノ酸残基が、目的の活性を消失することなく、置換、付加または欠失されるかを判定する際の指針は、特定のポリペプチドの配列を相同ペプチドの配列と比較し、かつホモロジーが高い領域(保存領域)に施されるアミノ酸配列変化の数を最小にするかまたはアミノ酸をコンセンサス配列に置換することによって見出せる。

あるいは、遺伝暗号の「縮重」を利用することによって、これらの同一または類似ポリペプチドをコードする組換え変異体を合成または選択することができる。種々の制限部位を生成するサイレント変化などの種々のコドン置換を導入して、プラスミドまたはウイルスベクターへのクローニングまたは特定の原核生物または真核生物系での発現を最適化することができる。ポリヌクレオチド配列の突然変異は、ポリペプチド、または、ポリペプチドのいずれかの部分の特性を改変するためにポリペプチドに付加された他のペプチドのドメインに反映され、リガンド結合親和性、鎖間親和性、または分解/代謝回転速度などの特性を変化させる。

好ましくは、アミノ酸「置換」は、あるアミノ酸を、類似の構造的および/または化学的特性を有する別のアミノ酸で置換した結果であり、すなわち保存的アミノ酸置換の結果である。「保存的」アミノ酸置換は、関与する残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および/または両親媒性の類似性に基づいてなされ得る。例えば、無極性(疎水性)アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれ; 極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが含まれ; 正荷電(塩基性)アミノ酸には、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが含まれ; 負荷電(酸性)アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が含まれる。「挿入」または「欠失」は、好ましくは、約1〜10アミノ酸の範囲であり、より好ましくは1〜5アミノ酸の範囲であり、例えば1、2、3、4または5アミノ酸である。許容される変異は、組換えDNA技術を使用してポリペプチド分子中のアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統的に施し、かつ得られた組換え変異体の生物学的活性をアッセイすることによって実験的に決定される。

あるいは、機能の改変が望まれる場合、挿入、欠失または非保存的改変を操作して改変ポリペプチドを作製することができる。そのような改変は、例えば、本発明のポリペプチドの生物学的機能または生化学的特性の1種以上を変化させることができる。例えば、そのような変化は、リガンド結合親和性、鎖間親和性、または分解/代謝回転速度などのポリペプチド特性を変化させ得る。さらに、そのような変化は、発現のために選択された宿主細胞での発現、スケールアップなどにさらに適したポリペプチドを作製するように選択することができる。

生物学的活性を示すことができる本発明のペプチドのフラグメントもまた、本発明に包含される。そのようなフラグメントは直線形態であってもよいし、例えば、H. U. Saragovi, et al., Bio/Technology 10, 773-778 (1992)およびR. S. McDowell, et al., J. Amer. Chem. Soc. 114, 9245-9253 (1992)(該両文献は参照によりここに組み入れられる)に記載されるような公知の方法を使用して環化されていてもよい。そのようなフラグメントを、タンパク質結合部位の結合価を高めることを含む多数の目的で、免疫グロブリンなどの担体分子に融合させることができる。

本発明は、さらに、以下:
(a) 以下の群:
1. DGSVVVNKVSELPAGH;
2. GLNVNTLSYGDLAAD;
3. SELPAGHGLNVNLTS;
4. DGSVVVNKVS;
5. ELPAGHGLNV; および
6. NTLSYGDLAAD
から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチド配列;
(b) (a)で定義されるポリヌクレオチド配列に対して、75%、80%、85%、90%または95%などの70%を超える同一性を有するポリヌクレオチド配列、または(a)で定義されるポリヌクレオチド配列に2xSSC、65℃の条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、(1)〜(6)のいずれかで定義されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド配列; および
(c) (a)または(b)で定義されるポリヌクレオチド配列のフラグメントであって、そのポリヌクレオチド配列が(1)〜(6)のいずれかで定義されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする、フラグメント
からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列からなる、単離されたかまたは組換えの核酸分子を提供する。

用語「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのヘテロポリマーまたはこれらのヌクレオチドの配列を表す。それはまた、一本鎖または二本鎖であってよく、センスまたはアンチセンス鎖に相当し得るゲノムまたは合成起源のDNAまたはRNA、またはペプチド核酸(PNA)または任意のDNA様またはRNA様物質を表す。本明細書における配列では、Aはアデニンであり、Cはシトシンであり、Tはチミンであり、Gはグアニンであり、NはA、C、GまたはT (U)である。ポリヌクレオチドがRNAである場合、本明細書中に記載の配列中のT (チミン)はU (ウラシル)で置き換えられることが予定される。一般に、本発明によって提供される核酸セグメントは、ゲノムのフラグメントおよび短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連のオリゴヌクレオチドから、または個々のヌクレオチドから組み立てられ、微生物またはウイルスオペロン、または真核生物の遺伝子由来の調節要素を含む組換え転写単位において発現させることができる合成核酸を提供する。

本発明のポリヌクレオチドには、天然に存在するか、または完全もしくは部分的に合成のDNA、例えばcDNAおよびゲノムDNA、およびRNA、例えばmRNAが含まれる。ポリヌクレオチドはcDNAの全コード領域を含んでもよいし、またはcDNAのコード領域の部分に相当するものでもよい。

本発明はまた、本明細書中で開示されるcDNA配列に対応する遺伝子を提供する。対応する遺伝子は、本明細書中で開示される配列情報を使用して公知の方法にしたがって単離することができる。そのような方法は、適切なゲノムライブラリーまたはゲノム物質の他の供給源中の遺伝子の同定および/または増幅のために、開示された配列情報からプローブまたはプライマーを作製することを含む。当技術分野で公知の方法を使用して追加の5'および3'配列を得ることができる。例えば、本発明のポリヌクレオチドのいずれかに対応する全長cDNAまたはゲノムDNAは、本発明のポリヌクレオチドのいずれかまたはその一部をプローブとして使用して好適なハイブリダイゼーション条件下で適切なcDNAまたはゲノムDNAライブラリーをスクリーニングすることによって得ることができる。あるいは、適切なゲノムDNAまたはcDNAライブラリー中の遺伝子の同定および/または増幅を可能にする好適なプライマー(群)の基礎として本発明のポリヌクレオチドを使用することができる。

本発明の核酸配列は、1以上の公的データベース、例えばdbEST、gbpri、およびUniGeneから得られるESTおよび配列(cDNAおよびゲノム配列を含む)から組み立てることができる。EST配列は、全長遺伝子に関する配列情報、代表的フラグメントまたはセグメント情報、または新規セグメント情報の同定を提供することができる。

本発明のポリヌクレオチドはまた、上記ポリヌクレオチドに実質的に等価なヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリヌクレオチドは、上記ポリヌクレオチドに対して、例えば、少なくとも約65%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、より典型的には、少なくとも約85%、86%、87%、88%、89%、より典型的には、少なくとも約90%、91%、92%、93%、94%、さらにより典型的には、少なくとも約95%、96%、97%、98%、99%の配列同一性を有することができる。

本発明のヌクレオチド配列のいずれか、またはその相補配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸配列フラグメントは、本発明の核酸配列の範囲内に含まれ、該フラグメントは、約5ヌクレオチドより大きく、好ましくは7ヌクレオチドより大きく、より好ましくは9ヌクレオチドより大きく、最も好ましくは17ヌクレオチドより大きい。本発明のポリヌクレオチドのいずれか1種に選択的な(すなわちそれに特異的にハイブリダイズする)、例えば15、17、または20ヌクレオチドまたはそれ以上のフラグメントが想定される。ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズできるプローブは、本発明のポリヌクレオチド配列を同一遺伝子ファミリー中の他のポリヌクレオチド配列と識別することができるか、またはヒト遺伝子を他の種の遺伝子と識別することができ、かつ好ましくは特有のヌクレオチド配列に基づく。

本発明の範囲内に入る配列はこれらの特定配列に限定されず、その対立遺伝子変異および種変異をも含む。対立遺伝子変異および種変異は、本発明で提供される配列、その代表的フラグメント、または本発明に対して少なくとも90%同一、好ましくは95%同一なヌクレオチド配列を、同種の別の単離体由来の配列と比較することによって通常通りに決定することができる。さらにまた、コドンの可変性を考慮するよう、本発明は、本明細書中で開示される具体的ORFがコードするものと同じアミノ酸配列をコードする核酸分子を含む。換言すれば、ORFのコード領域における、同一アミノ酸をコードする、あるコドンの別コドンへの置換は明示的に想定される。

用語「ストリンジェント」とは、ストリンジェントであると当技術分野で一般に理解される条件に言及するために使用される。ストリンジェントな条件は高度にストリンジェントな条件(すなわち、0.5 M NaHPO₄、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1 mM EDTA中で65℃でのフィルター結合DNAへのハイブリダイゼーション、および0.1x SSC/0.1% SDS中で68℃での洗浄)、および中程度にストリンジェントな条件(すなわち0.2x SSC/0.1% SDS中で42℃での洗浄)を含むことができる。

デオキシオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの場合、追加の典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、6x SSC/0.05%ピロリン酸ナトリウム中で37℃(14塩基オリゴヌクレオチドの場合)、48℃(17塩基オリゴヌクレオチドの場合)、55℃(20塩基オリゴヌクレオチドの場合)および60℃(23塩基オリゴヌクレオチドの場合)での洗浄ステップを含む。

本明細書中で使用される「SSC」とは、0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH 7.2として定義される。

「同一性」とは、配列をアライメントし、かつ最大配列同一性パーセントを達成するために必要であればギャップを導入した後の、かついかなる保存的置換も配列同一性の部分と考えない場合の、目的の配列のアミノ酸残基または核酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基または核酸残基の数またはパーセンテージ(結果の表示に応じて)を意味する。

2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列同一性パーセンテージは、好適なコンピュータプログラム、例えばUniversity of Wisconsin Genetic Computing GroupのGAPプログラムを使用して決定することができ、同一性パーセントはその配列が最適にアライメントされたポリペプチドに関して算出されるものと理解される。アライメントは、あるいは、Clustal Wプログラムを使用して行うことができる(Thompson et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-80)。使用されるパラメータは以下の通りである: ファストペアワイズアライメントパラメータ: K-タプル(ワード)サイズ; 1, ウインドウサイズ; 5, ギャップペナルティ; 3, トップダイアゴナル(top diagonals)の数; 5. スコアリング法: xパーセント; マルチプルアライメントパラメータ: ギャップオープンペナルティ; 10, ギャップ伸長ペナルティ; 0.05. スコアリングマトリックス: BLOSUM。

配列同一性は、例えばJotun Hein法(Hein, J. (1990) Methods Enzymol. 183:626-645)を使用して決定することができる。配列間の同一性は、当技術分野で公知の他の方法によって決定することもでき、例えばハイブリダイゼーション条件を変動させることによって決定することもできる。

MtCpn60.1は、T.H. Kong et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 1993, 90, 2608-2612およびJ.C. Lewthwaite et al, Infection and Immunity, 2001, 69(12), 7349-7355に記載の方法を使用してクローニングされ、また発現され得る。MtCpn60.1はまた、Lionex (Germany)から市販されている。

本発明のペプチドは、当技術分野で公知の慣用の方法を使用して製造および/または単離することができる。例えば、従来の方法を使用するかまたは、例えばI. Coin, Nature Protocols, 2007, 2, 3247-3256に記載の固相自動合成機を使用する溶液合成または固相合成によって本発明のペプチドを製造および/または単離することができる。好ましくは、G.B. Fields and R.L. Noble, Int. J. Peptide Protein Res., 1990, 35(3), 161-214に記載の方法と類似の方法を使用するFmoc固相合成によって本発明のペプチドを製造する。

本発明のさらなる態様では、医療での使用のための、本明細書中で定義されるペプチドまたは核酸分子を提供する。

一実施形態では、本発明は、ヒト被験体での血管外遊出、すなわち無傷の毛細血管壁を通って周囲の体組織へ入る血液細胞、好ましくは白血球の移動または通過の調節のための、本明細書中で定義されるペプチドまたは核酸分子の使用を提供する。

本発明のペプチドおよび核酸分子はまた、内皮を横切る白血球の流量の増加に関連するヒト被験体の任意の状態、疾患および/または障害の予防および/または治療において有用であることが示される。そのような状態の例には、非限定的に、急性および/または慢性炎症状態、例えば虚血再潅流傷害(冠血管血栓症および大脳動脈閉塞を含む)、自己免疫疾患、例えば多発性硬化症、アレルギー状態、例えば喘息、慢性閉塞性肺疾患および高山病が含まれる。

好ましくは、急性および/または慢性炎症状態、特に非アレルギー性炎症の治療および/または予防に本発明のペプチドまたは核酸分子を使用する。本発明のペプチドまたは核酸分子で予防および/または治療することができる炎症状態の例には、好酸球増加および/または好中球増加に関連する状態が含まれる。急性および/または慢性炎症状態の好ましい例には、感染に関連する兆候(intimation)(例えば敗血性ショック、敗血症または全身性炎症反応症候群(SIRS))、虚血再潅流傷害、例えば冠血管血栓症および大脳動脈閉塞、ショック肺症候群、内毒素致死、関節炎(特に関節リウマチまたは慢性炎症性関節炎)、補体媒介性超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘発性肺損傷、非アレルギー性喘息、炎症性腸疾患およびクローン病が含まれる。

本発明は、さらに、本明細書中で定義されるペプチドまたは核酸分子を、ヒトをはじめとする哺乳類に投与するステップを含む、急性および/または慢性炎症状態を予防および/または治療する方法を提供する。

本発明は、さらに、急性および/または慢性炎症状態の予防および/または治療のための医薬の製造における、本明細書中で定義されるペプチドまたは核酸分子の使用を提供する。

別の実施形態では、本発明は、慢性閉塞性肺疾患の予防および/または治療のための、本明細書中で定義されるペプチドまたは核酸分子の使用を提供する。

さらにまた、本発明のより広い実施形態では、図１のアミノ酸配列を含む、単離されたかもしくは組換えのポリペプチド(すなわちMtCpn60.1)またはその機能上等価なフラグメントもしくは変異体の、慢性閉塞性肺疾患の予防および/または治療のための使用が提供される。MtCpn60.1の好ましいペプチドフラグメントは6〜400残基の範囲の長さである。MtCpn60.1の特に好ましいペプチドフラグメントは15〜100残基の範囲の長さである。MtCpn60.1の特に好ましいペプチドフラグメントの例には、以下のアミノ酸配列:
(vii) MSKLIEYDETARRAMEVGMDKLADTVRVT;
(viii) LGPRGRHVVLAKAFGGPTVTN;
(ix) DGVTVAREIELEDPFEDLGAQLVKSVATKTNDV;
(x) AGDGTTTATILAQALIKGGLRLVAAGVN;
(xi) PIALGVGIGKAADAVSEALLASATP;
(xii) EEGIVPGGGASLIHQARKALTELRASL;
(xiii) TGDEVLGVDVFSEALAAPLFWIAANAGL;
(xiv) DGSVVVNKVSELPAGHGLNVNTLSYGDLAAD;
(xv) GVIDPVKVTRSAVLNASSVARMVLTTETVVV; および
(xvi) LTTETVVVDKPAKAEDHDHHHGHAH
からなるかまたはそれを含むペプチドが含まれる。

本発明の別の実施形態では、図１のヌクレオチド配列(すなわちMtCpn60.1); または図１のポリヌクレオチド配列に対して75%、80%、85%、90%または95%などの70%を超える同一性を有するポリヌクレオチド配列; または図１のポリヌクレオチド配列に2xSSC、65℃の条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列; または図１で定義されるポリヌクレオチド配列のフラグメント、を含む核酸分子の使用を提供し、そのポリヌクレオチド配列は、図１で定義されるアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能上等価なフラグメントもしくは変異体をコードする。

別の実施形態では、本発明は、自己免疫障害の予防および/または治療のための、本明細書中で定義されるペプチドまたは核酸分子の使用を提供する。

本明細書中で使用される用語「自己免疫障害」の範囲内には、自己免疫過程が疾患の病原に寄与することが示され得る状態が含まれる。そのような障害は、典型的に、Tヘルパーリンパ球1 (Th-1)型免疫応答に関連する。

本発明のペプチドまたは核酸分子によって予防および/または治療することができる自己免疫障害の例には、溶血性貧血、血小板減少症、悪性貧血、アジソン病、自己免疫性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性脳炎、結合組織病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎症、ギラン・バレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、重症筋無力症、移植片対宿主病および自己免疫性炎症性眼疾患などの自己免疫障害が含まれる。好ましい自己免疫障害には、関節リウマチおよび多発性硬化症が含まれる。

関節リウマチに対する本発明のペプチドまたは核酸分子の免疫抑制効果を実験動物モデル系で判定することができる。実験モデル系はラットでのアジュバント誘発性関節炎であり、プロトコールはJ. Holoshitz, et at., 1983, Science , 219:56、またはB. Waksman et al., 1963, Int. Arch. Allergy Appl. Immunol., 23:129に記載される。疾患の誘発は、完全フロイントアジュバント(CFA)中の死滅結核菌の懸濁液を、一般には皮内で、単回投与することによって引き起こすことができる。注射経路は様々であってよいが、アジュバント混合物をラットの尾の付け根に注射することができる。ポリペプチドを約1〜5 mg/kgの用量でリン酸緩衝溶液(PBS)中で投与する。コントロールはPBSのみの投与からなる。

試験化合物の効果を試験するための手順は、CFA中の死滅結核菌を皮内注射するステップおよびその直後に試験化合物を投与するステップおよびその後の24日目までの1日おきの処置ステップからなるであろう。マイコバクテリウムCFAの注射後14、15、18、20、22、および24日の時点で、上記J. Holoskitzによって記載されるように全体的な関節炎スコアを得てもよい。データの解析によって、試験化合物が、関節炎スコアの減少によって測定される関節の腫脹に対する劇的な影響を有することが明らかになるであろう。

別の実施形態では、本発明は、アレルギー状態の予防および/または治療のための、本明細書中で定義されるペプチドまたは核酸分子の使用を提供する。本発明のペプチドまたは核酸分子で予防および/または治療することができるアレルギー状態およびアレルギー性障害の例には、湿疹、皮膚炎、アレルギー性鼻炎(花粉症)、アレルギー性気道疾患、好酸球増加症候群、接触皮膚炎; 好酸球性気道炎症および気道過敏、例えば喘息、例えばアレルギー性喘息および内因性喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球性肺炎、アレルギー性気管支炎気管支拡張症、職業性喘息、反応性気道疾患症候群、間質性肺疾患、好酸球増加症候群、寄生虫性肺疾患、によって特徴づけられる呼吸器疾患; アナフィラキシー、血清病、薬物反応、食物アレルギー、昆虫毒アレルギー、肥満細胞症、過敏性間質性肺炎、じんま疹、血管性浮腫、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、多形性紅斑、スチーブンス・ジョンソン症候群、アレルギー性結膜炎、アトピー性角結膜炎、性病性角結膜炎および巨大乳頭性結膜炎が含まれる。免疫抑制が望まれる他の状態(例えば臓器移植を含む)もまた、本発明のペプチドまたは核酸分子を使用して治療することができる。好ましいアレルギー性障害および状態には、喘息、アレルギー性鼻炎、湿疹およびアナフィラキシーが含まれる。

本明細書中で使用される用語「アレルギー性障害」および「アレルギー状態」の範囲内には、Tヘルパーリンパ球2 (Th-2)型免疫応答に関連する状態が含まれる。アレルギー反応では、高いIgEレベルが生じ、かつTh-2免疫応答がTh-1応答より優勢になって、炎症反応が生じる。

アレルギー反応に対するポリペプチドまたはそのアンタゴニストの治療効果は、in vivo動物モデル、例えば累積的接触増強試験(cumulative contact enhancement test)(Lastborn et al., Toxicology 125: 59-66, 1998)、皮膚プリックテスト(Hoffmann et al., Allergy 54: 446-54, 1999)、モルモット皮膚感作試験(Vohr et al., Arch. Toxocol. 73: 501-9)、およびマウス局所リンパ節アッセイ(Kimber et al., J. Toxicol. Environ. Health 53: 563-79)によって評価することができる。

胸腺細胞または脾細胞の細胞傷害性に関する好適なアッセイには、非限定的に、Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan et al., Strober, Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Herrmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:2488-2492, 1981; Herrmann et al., J. Immunol. 128:1968-1974, 1982; Handa et al., J. Immunol. 135:1564-1572, 1985; Takai et al., I. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bowman et al., J. Virology 61:1992-1998; Bertagnolli et al., Cellular Immunology 133:327-341, 1991; Brown et al., J. Immunol. 153:3079-3092, 1994に記載のアッセイが含まれる。

T細胞依存性免疫グロブリン応答およびアイソタイプスイッチングに関するアッセイ(該アッセイは、とりわけ、T細胞依存性抗体応答をモジュレートし、Th1/Th2プロファイルに影響するタンパク質を同定する)には、非限定的に、Maliszewski, J. Immunol. 144:3028-3033, 1990;およびAssays for B cell function: In vitro antibody production, Mond, J. J. and Brunswick, M. In Current Protocols in Immunology. J. E. Coligan et al., eds. Vol 1 pp. 3.8.1-3.8.16, John Wiley and Sons, Toronto. 1994に記載のアッセイが含まれる。

リンパ球混合培養反応(MLR)アッセイ(該アッセイは、とりわけ、主にTh1およびCTL応答を生じさせるタンパク質を同定する)には、非限定的に、Current Protocols in Immunology, Ed by J. E. Coligan et al., Pub. Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience (Chapter 3, In vitro assays for Mouse Lymphocyte Function 3.1-3.19; Chapter 7, Immunologic studies in Humans); Takai et al., J. Immunol. 137:3494-3500, 1986; Takai et al., J. Immunol. 140:508-512, 1988; Bertagnolli et al., J. Immunol. 149:3778-3783, 1992に記載のアッセイが含まれる。

樹状細胞依存性アッセイ(該アッセイは、とりわけ、ナイーブT細胞を活性化する樹状細胞によって発現されるタンパク質を同定する)には、非限定的に、Guery et al., J. Immunol. 134:536-544, 1995; Inaba et al., J. Experimental Medicine 173:549-559, 1991; Macatonia et al., J. Immunol. 154:5071-5079, 1995; Porgador et al., J. Experimental Medicine 182:255-260, 1995; Nair et al., J. Virology 67:4062-4069, 1993; Huang et al., Science 264:961-965, 1994; Macatonia et al., J. Experimental Medicine 169:1255-1264, 1989; Bhardwaj et al., J. Clinical Investigation 94:797-807, 1994; およびInaba et al., J. Experimental Medicine 172:631-640, 1990に記載のアッセイが含まれる。

リンパ球生存/アポトーシスに関するアッセイ(該アッセイは、とりわけ、スーパー抗原誘導後のアポトーシスを妨げるタンパク質およびリンパ球恒常性を調節するタンパク質を同定する)には、非限定的に、Darzynkiewicz et al., Cytometry 13:795-808, 1992; Gorczyca et al., Leukemia 7:659-670, 1993; Gorczyca et al., Cancer Research 53:1945-1951, 1993; Itoh et al., Cell 66:233-243, 1991; Zacharchuk, J. Immunol. 145:4037-4045, 1990; Zamai et al., Cytometry 14:891-897, 1993; Gorczyca et al., Int. J. Oncol. 1:639-648, 1992に記載のアッセイが含まれる。

T細胞関与および発生の早期ステップに影響するタンパク質に関するアッセイには、非限定的に、Antica et al., Blood 84:111-117, 1994; Fine et al., Cellular Immunology 155:111-122, 1994; Galy et al., Blood 85:2770-2778, 1995; Toki et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 88:7548-7551, 1991に記載のアッセイが含まれる。

一実施形態では、本発明は、疼痛の予防および/または治療のための、本明細書中で定義されるペプチドまたは核酸分子の使用を提供する。

用語「疼痛」には、無痛覚および/または痛覚過敏(hyperanalgesia)が含まれる。用語「痛覚過敏」は、早期発生、重症度の増加、持続期間の増加、および/または痛みの感覚に対する感受性の増加を意味する。

本発明のペプチドまたは核酸分子で予防および/または治療することができる疼痛の例には、背痛; 頭痛; 歯痛; 耳痛; 関節炎; 痛風; 軟組織外傷; 靭帯および/または腱外傷性損傷; 骨折; 癌性疼痛; 術後疼痛; 月経痛; 陣痛; 腎管痛; 内臓痛; やけど; 膿瘍; および他の感染が含まれる。

好ましい実施形態では、医薬品は、ペプチド分子または核酸分子の作用を支援または増強するための少なくとも1種の添加物をさらに含む。典型的に、添加物は、少なくとも1種のパラセタモール、アスピリン、イブプロフェン、他の非ステロイド性抗炎症剤(NSAIDS)、シクロオキシゲナーゼ-2 (cylooxygenase-2)選択的インヒビター(CSI)、オピエートから選択される。

「添加物」とは、主薬に加えて提供されかつ、独立にまたは主薬と組み合わせて薬理学的に活性であり、それにより、医薬品中のその存在が主薬の作用を支援または増強する成分を意味する。

好ましくは、該医薬品は延長または持続した鎮痛をもたらす。

鎮痛は、通常、経口または非経口投薬によって達成される。広く公知の鎮痛薬、例えばパラセタモール、アスピリンおよび他の非ステロイド性抗炎症剤(NSAIDS)、例えばイブプロフェン、およびシクロオキシゲナーゼ-2選択的インヒビター(CSI)を用いるほとんどの場合で有効な鎮痛を達成することができる。麻薬性鎮痛薬は中枢神経系(CNS)の特定の受容体に作用する。コデインおよびジヒドロコデインは中程度に強力な麻薬性鎮痛薬であり、低い嗜癖の可能性しか有さない。他のより強力な麻薬性鎮痛薬、例えばモルヒネおよびメタドンを使用して重度の疼痛を制御することができる。

現在公知の鎮痛物質には種々の問題が存在する。それら薬物は、作用期間が比較的短時間であり、鎮痛は数時間しか持続しない。疼痛を制御するために薬物の反復投与が通常必要である。不十分な鎮痛は別の一般的な問題であり、これは患者について用量を増やすか、または薬物を変更することにつながる。NSAIDSの場合、不快な胃腸副作用、例えば消化不良および潰瘍が一般的であり、約3分の2の使用者が有害副作用および不十分な効力のせいでNSAIDSの銘柄を少なくとも1回変更する(Steinfeld S and Bjorke PA. Results from a patient survey to assess gastrointestinal burden of non-steroidal anti-inflammatory drug therapy contrasted with a review of data from EVA to determine satisfaction with rofecoxib. Rheumatology (Oxford) 2002, 41(S1), 23-27.)。さらに、NSAIDおよびCSIは心血管合併症を生じさせる可能性がある(Hillis W S, (2000) Areas of emerging interest in analgesia: cardiovascular complications. Am. J. Ther. 9 (3) 259-69)。アスピリンは少ない比率の子供でライ症侯群を生じさせる可能性があり、ゆえにアスピリンを子供に使用することはできない。パラセタモールは過剰量が肝毒性であるため、慎重に使用しなければならない(Cranswick, N., Coghlan D. Paracetamol efficacy and safety in children: the first 40 years (2000) Am. J. Ther. 7(2) 135-41)。麻薬性鎮痛薬は、傾眠、便秘、吐き気、頭痛および眩暈などの種々の副作用を有する。強力な麻薬性鎮痛薬、例えばモルヒネの反復投与は嗜癖を生じさせる。

現在の鎮痛薬物と比べて鎮痛物質としてのシャペロニンの利点は、少ない有害副作用しか有さないことである。20億人が、結核を発症することなくM. tuberculosisを保菌していると見積もられている。M. tuberculosisの保菌は、一般に公知の鎮痛薬に伴って観察される副作用、例えば胃腸副作用、心血管合併症、肝毒性、ライ症侯群または嗜癖と結び付けられていない。さらに、シャペロニンの鎮痛効果は、慣用の鎮痛物質より持続時間が長いことが示される。

本明細書中で使用される「治療」とは、治療前の徴候と比べた、治療されている状態の1以上の徴候の減少、軽減または排除を意味する。例えば、影響を受け得る徴候には、好酸球増加、特定のサイトカインの分泌低下、Th2型免疫応答、アレルギー性応答および自己抗体の存在が含まれる。

本明細書中で使用される「予防」とは、状態の1以上の徴候の出現または程度によって評価される、該状態の発症の遅延もしくは予防またはその重症度の減少を意味する。

別の態様では、本発明は、本発明のペプチドまたは核酸分子および製薬的に許容される賦形剤を含むかまたはそれらからなる医薬組成物を提供する。

本発明の分子、医薬品および医薬組成物は、注射用持続放出薬物送達系を使用して送達することができる。これらは、特に注射の頻度を減らすように設計される。そのような系の例は、生分解性ミクロスフェア中に組換えヒト成長ホルモン(rhGH)をカプセル封入するニュートロピンデポー剤(Nutropin Depot)であり、該ミクロスフェアは、いったん注射されると、持続期間にわたってゆっくりrhGHを放出する。好ましくは、送達は筋肉内(i.m.)および/または皮下(s.c.)および/または静脈内(i.v.)で行われる。

本発明の分子、医薬品および医薬組成物は、必要とされる部位に直接薬物を放出する、外科的に移植されたデバイスによって投与することができる。例えば、Vitrasertは、CMV網膜炎を治療するために眼内に直接ガンシクロビルを放出する。この毒性物質の罹患部位への直接適用は有効な治療を達成し、薬物の顕著な全身性副作用を伴わない。

本発明の物質、医薬品および医薬組成物の投与に電気穿孔療法(EPT)系を用いることもできる。細胞にパルス電場を与えるデバイスは薬物に対する細胞膜の透過性を増加させ、それにより細胞内薬物送達の顕著な増加を生じさせる。

本発明の分子、医薬品および医薬組成物をエレクトロインコーポレーション(EI)によって送達することもできる。EIは、皮膚表面上の直径30ミクロンまでの小粒子が、電気穿孔で使用されるものと同一または類似の電気パルスを受けた場合に生じる。EIでは、これらの粒子は角質層を通過し皮膚のより深い層に運ばれる。該粒子に薬物または遺伝子を載せるかまたはコーティングすることができ、あるいは粒子は、単純に、薬物が通過して入ることができる皮膚の孔を生じさせる「弾丸」の役目を果たすことができる。

本発明の分子、医薬品および医薬組成物の送達の代替法は、熱感受性のReGel注射系である。体温未満では、ReGelは注射液であり、体温では即時にゲルリザーバーを形成し、ゲルリザーバーはゆっくり崩壊して溶解し、公知の、安全な、生分解性ポリマーになる。バイオポリマーが溶解するにつれて時間をかけて活性物質が送達される。

本発明の分子、医薬品および医薬組成物を経口送達することもできる。該過程は、体内のビタミンB₁₂および/またはビタミンDの経口摂取の天然過程を利用して、タンパク質およびペプチドを共送達することができる。ビタミンB₁₂および/またはビタミンD取り込み系に乗ることによって、本発明の核酸、分子および医薬製剤は腸壁を通過して移動することができる。ビタミンB₁₂アナログおよび/またはビタミンDアナログと薬物との複合体(該薬物は複合体のビタミンB₁₂部分/ビタミンD部分の内因子(IF)への有効な親和性および複合体の活性物質の有効な生物活性をともに保持する)を合成する。。

本発明の分子、医薬品および医薬組成物を「Trojanペプチド」によって細胞に導入することができる。これらは、移動特性を有し、原形質膜を横切って親水性化合物を運ぶことができるペネトラチンと称されるポリペプチドのクラスである。この系は、細胞質および核へのオリゴペプチドの直接ターゲティングを可能にし、また細胞タイプ特異的ではなく、効率が高い。Derossi et al. (1998), Trends Cell Biol 8, 84-87を参照のこと。

好ましくは、本発明の医薬品および/または医薬組成物は、活性成分の1日の用量または単位、1日の用量未満またはその適切な一部を含む単位用量である。

本発明の分子、医薬品および医薬組成物は、通常、製薬的に許容される剤形で、活性成分を含む医薬組成物の形で、場合により無毒の有機、または無機の、酸、または塩基、付加塩の形で、経口または任意の非経口経路によって投与される。治療対象の障害および患者ならびに投与経路に応じて、組成物を種々の用量で投与することができる。

ヒト治療では、本発明の分子、医薬品および医薬組成物を単独で投与することができるが、一般に、意図される投与経路および標準薬務に関して選択される好適な医薬賦形剤、希釈剤または担体との混合物中で投与される。

例えば、本発明の分子、医薬品および医薬組成物は、即時放出型、遅延放出型または徐放型適用のための、香味物質または着色物質を含んでよい、錠剤、カプセル、卵形剤、エリキシル剤、液剤または懸濁剤の形態で経口、口腔内または舌下投与することができる。本発明の分子、医薬品および医薬組成物を陰茎海綿体内注射によって投与することもできる。

そのような錠剤は、賦形剤、例えば微結晶性セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、第二リン酸カルシウムおよびグリシン、崩壊剤、例えばデンプン(好ましくはトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン)、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムおよび特定の複合ケイ酸塩、および造粒結合剤、例えばポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース(HPMC)、ヒドロキシプロピルセルロース(HPC)、スクロース、ゼラチンおよびアカシアを含むことができる。加えて、潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリルおよびタルクを含ませることができる。

類似タイプの固形組成物をゼラチンカプセル中の充填剤として利用することもできる。この関連で好ましい賦形剤には、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子量ポリエチレングリコールが含まれる。水性懸濁液および/またはエリキシル剤の場合、本発明の物質を、種々の甘味料または香味物質、着色料または色素、乳化剤および/または懸濁化剤および希釈剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコールおよびグリセリン、ならびにその組み合わせと混合することができる。

本発明の分子、医薬品および医薬組成物を、非経口で、例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内または皮下投与することができ、あるいは注入技術によって投与することができる。それらは、他の物質、例えば、溶液を血液と等張にするために十分な塩またはグルコース、を含み得る滅菌水性溶液の剤形で最良に使用される。水性溶液は、必要であれば、好適に(好ましくはpH 3〜9に)緩衝化すべきであろう。好適な非経口製剤の滅菌条件下での製造は当業者に周知の標準的製薬技術によって容易に達成される。

非経口投与に好適な医薬品および医薬組成物には、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および、製剤を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質、を含み得る水性および非水性滅菌注射溶液; および懸濁化剤および増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。医薬品および組成物は単位用量または複数回用量容器、例えば封入アンプルおよびバイアル中で提供することができ、使用直前に滅菌液体担体、例えば注射用蒸留水を加えることのみを必要とする凍結乾燥(freeze-dried (lyophilised))条件で保存することができる。前記のような滅菌粉末、顆粒および錠剤から即席の注射溶液および懸濁液を調製することができる。

ヒト患者への経口および非経口投与では、本発明の分子、医薬品および医薬組成物の一日量のレベルは、通常、単一のまたは分割された用量で投与される0.1〜100 mg /成人/日である。

ゆえに、例えば、本発明の分子の錠剤またはカプセルは、必要に応じて一度に1回または2回以上の投与のための0.1mg〜100mgの活性物質を含むことができる。いずれの場合も、任意の個別の患者に最も好適な実際の用量を医師が決定する。それは特定の患者の年齢、体重および反応に応じて変化する。上記用量は平均的な場合の例示である。当然、より多いかまたはより少ない用量範囲が有効である個々の場合が存在する可能性があり、そのような範囲も本発明の範囲内である。

本発明の分子、医薬品および医薬組成物を鼻内にまたは吸入によって投与することもでき、好都合には、乾燥粉末吸入器または加圧容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器からのエアロゾルスプレー投与の形態で、好適な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば1,1,1,2-テトラフルオロエタン(HFA 134A3または1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロプロパン(HFA 227EA3)、二酸化炭素または他の好適なガスを使用して送達される。加圧エアロゾルの場合、一定量を送達するためのバルブを提供することによって投与量単位を決定することができる。加圧容器、ポンプ、スプレーまたは噴霧器は、例えばエタノールおよび噴射剤の混合物を溶媒として使用する活性物質の溶液または懸濁液を含むことができ、それは潤滑剤、例えばソルビタントリオレアートをさらに含むことができる。吸入器または空気吸入器(insufflator)での使用のためのカプセルおよびカートリッジ(例えばゼラチン製)は、本発明の物質および好適な粉末基剤、例えばラクトースまたはデンプンの混合粉体を含むように製剤化することができる。

エアロゾルまたは乾燥粉末製剤は、好ましくは、各一定量または「パフ」が患者への送達のための少なくとも0.1 mgの本発明の分子を含むように設計される。エアロゾルでのトータルの一日量が患者ごとに変動し、一回量でまたは、より通常は、1日を通じて分割された用量中で投与することができることが理解される。

あるいは、本発明の分子、医薬品および医薬組成物は坐剤または膣坐剤の剤形で投与することができ、あるいはローション、溶液、クリーム、ゲル、軟膏または散布粉剤の剤形で局所適用することができる。本発明の分子、医薬品および医薬組成物は、例えば皮膚パッチの使用によって、経皮投与することもできる。それらは、特に眼の疾患の治療のために、眼球経路によって投与することもできる。

眼での使用では、本発明の分子、医薬品および医薬組成物を、等張性でpH調整された滅菌生理食塩水中の微粒化懸濁液として、または、好ましくは、等張性でpH調整された滅菌生理食塩水中の溶液として、場合により保存剤、例えばベンジルアルコニウムクロライドと組み合わせて製剤化することができる。あるいは、それらを軟膏、例えばワセリン中で製剤化することができる。

皮膚への局所適用では、本発明の分子、医薬品および医薬組成物を、例えば1種以上の以下の物質: 鉱油、流動パラフィン、白色ワセリン、プロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレン物質、乳化ワックスおよび水との混合物中に懸濁または溶解させた活性物質を含む好適な軟膏として製剤化することができる。あるいは、それらを、例えば1種以上の以下の物質: 鉱油、ソルビタンモノステアラート、ポリエチレングリコール、流動パラフィン、ポリソルベート60、セチルエステルワックス、セテアリルアルコール、2-オクチルドデカノール、ベンジルアルコールおよび水の混合物中に懸濁または溶解させた好適なローションまたはクリームとして製剤化することができる。

口での局所投与に好適な製剤には、フレーバー基剤(flavoured basis)、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカント中に活性成分を含むロゼンジ; 不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシア中に活性成分を含むトローチ; および好適な液体担体中に活性成分を含む口腔洗浄液が含まれる。

一般に、ヒトでは、本発明の分子、医薬品および医薬組成物、本発明の物質の経口または非経口投与は好ましい経路であり、最も好都合である。

獣医学的使用では、本発明の分子、医薬品および医薬組成物を、通常の獣医学的実施にしたがって好適に許容される製剤として投与し、獣医学の外科医は特定の動物に最も適切な投薬計画および投与経路を決定する。

好都合には、該製剤は医薬製剤である。有益には、該製剤は獣医学の製剤である。

本発明に基づく使用では、有益には、1日の用量は、単一または分割された用量で投与される0.0001〜100,000 mgであり; 好ましくは、1日の用量は0.0001〜1000 mgである。

好ましい医薬製剤には、少なくとも1重量% (例えば少なくとも10重量%、好ましくは少なくとも30重量%、最も好ましく少なくとも50重量%)の活性成分が存在する医薬製剤が含まれる。すなわち、医薬組成物の活性成分と他の成分(すなわちアジュバント、希釈剤および担体の添加)の比は、重量に基づいて少なくとも1:99 (例えば少なくとも10:90、好ましくは少なくとも30:70、最も好ましくは少なくとも50:50)である。

典型的に、患者への用量投与間の時間は6〜12時間の範囲であり; 好ましい実施形態では、患者への用量投与間の時間は事前の投与後9〜12時間の範囲であり; より好ましくは、患者への用量投与間の時間は12時間〜12日の範囲であり; さらにより好ましくは、患者への用量投与間の時間は12日〜6か月の範囲である。

好ましい実施形態では、本発明は、本発明の医薬品を使用してヒトまたは動物患者での疼痛を軽減する使用を提供する。

好ましくは、鼻内; 経口; 非経口; 局所; 眼内; 坐剤; 膣坐剤; または吸入経路を含むかまたはそれからなる群から選択される少なくとも1つの経路による投与を可能にするように本発明の医薬組成物または医薬品を製剤化する。そのような投与経路に好適な製剤は薬学および医学分野の当業者に周知であり、典型的な製剤は上で記載され、かつ添付の実施例に記載される。

別の態様では、本発明は本発明のペプチド分子および/または本発明の核酸分子の、アジュバントとしての使用を提供する。

用語「アジュバント」とは、抗原に組み込まれるかまたは抗原と同時に投与されると、免疫応答を増強する任意の物質を意味する。

別の態様では、本発明は、(i) 本発明のペプチド分子および/または本発明の核酸分子および(ii) 抗原を含む、アジュバント系を提供する。

好ましくは、抗原は以下の抗原: 炭疽抗原; コレラ抗原; ジフテリア抗原; ヘモフィルス・インフルエンザb (Hib)抗原; A型肝炎抗原; B型肝炎抗原; インフルエンザ抗原; 日本脳炎抗原; 麻疹、おたふく風邪および風疹(MMR)抗原; 髄膜炎菌抗原; 百日咳抗原; 肺炎球菌抗原; 灰白髄炎抗原; 狂犬病抗原; 風疹抗原; 天然痘および/またはワクシニア抗原; 破傷風抗原; ダニ媒介脳炎抗原; 結核抗原; 腸チフス抗原; 水痘/帯状疱疹抗原; 黄熱病抗原; および獣医学のワクチン抗原、を含むかまたはそれからなる群から選択される。

実施例
実施例では、本発明のペプチドを参照するために以下の略語を使用する。

F1 - DGSVVVNKVSELPAGH
F2 - GLNVNTLSYGDLAAD
F3 - SELPAGHGLNVNLTS
実験セクション
ペプチドF1〜F3を以下の手順にしたがって合成し単離した。

F1
Merck Chemicals製のFmoc-His(trt)-Wang LL樹脂(200mg)上でこのペプチドを合成した。Protein Technologies Symphony自動合成機を使用して残りのアミノ酸残基を付加した。すべてのカップリング反応はHBTUカップリング剤で10分間の二重カップリングであった。100%トリフルオロ酢酸中で1:1 v/v トリイソプロピルシラン:水を含むスカベンジャー混合物の存在下でペプチドを切断した。LC-ABZ+ (Supelcosil)カラム、5ミクロン粒径、110オングストローム孔サイズ、250 mm x 10 mm、Supelco製でペプチドを精製した。同バッファーで分析を実施したが、C-18、3.5ミクロン、90オングストローム孔サイズ、4.6mm X 150 mmカラム、agilent製を使用した。実施条件は以下の通りであった:
吸収216 nm、流速1 mL/ 分
t=0, 0% B
t=2, 0% B
t=22, 80% B
収率% = 31%。

F2
Merck Chemicals製のFmoc-Asp(OtBu)-Wang LL樹脂(150mg)上でこのペプチドを合成した。Protein Technologies Symphony自動合成機を使用して残りのアミノ酸残基を付加した。すべてのカップリング反応はHBTUカップリング剤で10分間の二重カップリングであった。100%トリフルオロ酢酸中で1:1 v/v トリイソプロピルシラン:水を含むスカベンジャー混合物の存在下でペプチドを切断した。LC-ABZ+ (Supelcosil)カラム、5ミクロン粒径、110オングストローム孔サイズ、250 mm x 10 mm、Supelco製でペプチドを精製した。同バッファーで分析を実施したが、C-18、3.5ミクロン、90オングストローム孔サイズ、4.6mm X 150 mmカラム、agilent製を使用した。実施条件は以下の通りであった:
吸収216 nm、流速1 mL/ 分
t=0, 0% B
t=2, 0% B
t=22, 80% B
収率% = 23%。

F3
Merck Chemicals製のFmoc-Ser(tBu)-Wang LL樹脂(150mg)上でこのペプチドを合成した。Protein Technologies Symphony自動合成機を使用して残りのアミノ酸残基を付加した。すべてのカップリング反応はHBTUカップリング剤で10分間の二重カップリングであった。100%トリフルオロ酢酸中で1:1 v/v トリイソプロピルシラン:水を含むスカベンジャー混合物の存在下でペプチドを切断した。LC-ABZ+ (Supelcosil)カラム、5ミクロン粒径、110オングストローム孔サイズ、250 mm x 10 mm、Supelco製でペプチドを精製した。同バッファーで分析を実施したが、C-18、3.5ミクロン、90オングストローム孔サイズ、4.6mm X 150 mmカラム、agilent製を使用した。実施条件は以下の通りであった:
吸収216 nm、流速1 mL/ 分
t=0, 0% B
t=2, 0% B
t=22, 80% B
収率% = 34%。

実施例1
非アレルギー性炎症のリポ多糖(LPS)モデルでのペプチドフラグメントF1、F2およびF3の効果
目的
これらの実験の目的は、ペプチドF1、F2およびF3がin vivo系で好中球動員を阻害できるかどうかを決定することであった。

方法
雌性Balb/cマウス(Charles River, UK)をF1、F2またはF3 (5pgまたは0.5pg)で鼻内で前処置した。15分後、LPS (25μg)を鼻内投与した。4時間後に気管支肺胞洗浄によって肺への好中球流入を測定した。

結果
得られた結果を図３にまとめる。LPSはコントロールと比較して好中球の用量依存的増加を誘発した。両用量濃度のすべてのペプチドF1〜F3について肺への好中球遊走の顕著な減少が観察された。

結論
本発明のペプチド(F1〜F3)はin vivoで好中球遊走を阻害することが示された。観察された生物学的活性は非アレルギー性炎症での直接的な抗炎症効果を示す。

Claims (20)

1. 以下の群:
   (i) DGSVVVNKVSELPAGH;
   (ii) GLNVNTLSYGDLAAD;
   (iii) SELPAGHGLNVNLTS;
   (iv) DGSVVVNKVS;
   (v) ELPAGHGLNV; および
   (vi) NTLSYGDLAAD;
   から選択されるアミノ酸配列からなる、単離されたかもしくは組換えのペプチド分子または機能上等価なそのフラグメントもしくは変異体。
2. アミノ酸配列DGSVVVNKVSELPAGHからなる、請求項１に記載の単離されたかもしくは組換えのペプチド分子、または機能上等価なそのフラグメントもしくは変異体。
3. アミノ酸配列GLNVNTLSYGDLAADからなる、請求項１に記載の単離されたかもしくは組換えのペプチド分子、または機能上等価なそのフラグメントもしくは変異体。
4. アミノ酸配列SELPAGHGLNVNLTSからなる、請求項１に記載の単離されたかもしくは組換えのペプチド分子、または機能上等価なそのフラグメントもしくは変異体。
5. 以下のポリヌクレオチド配列:
   (a) 以下の群:
   1. DGSVVVNKVSELPAGH;
   2. GLNVNTLSYGDLAAD;
   3. SELPAGHGLNVNLTS;
   4. DGSVVVNKVS;
   5. ELPAGHGLNV; および
   6. NTLSYGDLAAD
   から選択されるアミノ酸配列からなるペプチドをコードするポリヌクレオチド配列;
   (b) (a)で定義されるポリヌクレオチド配列に対して、75%、80%、85%、90%または95%などの70%を超える同一性を有するポリヌクレオチド配列、または(a)で定義されるポリヌクレオチド配列に2xSSC、65℃の条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド配列であって、(1)〜(6)のいずれかで定義されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードするポリヌクレオチド配列; および
   (c) (a)または(b)で定義されるポリヌクレオチド配列のフラグメントであって、そのポリヌクレオチド配列が(1)〜(6)のいずれかで定義されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードする、フラグメント
   からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列からなる、単離されたかまたは組換えの核酸分子。
6. 医療での使用のための、請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド。
7. 医療での使用のための、請求項５に記載の核酸分子。
8. ヒト被験体での血管外遊出の調節のための、請求項６または請求項７に記載の使用。
9. 内皮を横切る白血球の流量の増加に関連するヒト被験体の状態、疾患および/または障害の予防および/または治療のための、請求項６または請求項７に記載の使用。
10. 急性および/または慢性炎症状態の治療および/または予防のための、請求項６または請求項７に記載の使用。
11. 炎症状態が好酸球増加および/または好中球増加と関連している、請求項８に記載の使用。
12. 炎症状態が、感染に関連する兆候(intimation)(例えば敗血性ショック、敗血症または全身性炎症反応症候群(SIRS))、虚血再潅流傷害、内毒素致死、関節炎、補体媒介性超急性拒絶、腎炎、サイトカインまたはケモカイン誘発性肺損傷、非アレルギー性喘息、炎症性腸疾患、およびクローン病からなる群から選択される、請求項１０に記載の使用。
13. 慢性閉塞性肺疾患の治療および/または予防のための、請求項６または請求項７に記載の使用。
14. 自己免疫障害の治療および/または予防のための、請求項６または請求項７に記載の使用。
15. 自己免疫障害が、溶血性貧血、血小板減少症、悪性貧血、アジソン病、自己免疫性糖尿病、インスリン依存性糖尿病、重症筋無力症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、アテローム性動脈硬化症、自己免疫性脳炎、結合組織病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、自己免疫性肺炎症、ギラン・バレー症候群、自己免疫性甲状腺炎、重症筋無力症、移植片対宿主病および自己免疫性炎症性眼疾患からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
16. アレルギー性障害の治療および/または予防のための、請求項６または請求項７に記載の使用。
17. アレルギー性障害が、湿疹、皮膚炎、アレルギー性鼻炎(花粉症)、アレルギー性気道疾患、好酸球増加症候群、接触皮膚炎; 好酸球性気道炎症および気道過敏、例えば喘息、例えばアレルギー性喘息および内因性喘息、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球性肺炎、アレルギー性気管支炎気管支拡張症、職業性喘息、反応性気道疾患症候群、間質性肺疾患、好酸球増加症候群、寄生虫性肺疾患によって特徴づけられる呼吸器疾患; アナフィラキシー、血清病、薬物反応、食物アレルギー、昆虫毒アレルギー、肥満細胞症、過敏性間質性肺炎、じんま疹、血管性浮腫、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、多形性紅斑、スチーブンス・ジョンソン症候群、アレルギー性結膜炎、アトピー性角結膜炎、性病性角結膜炎および巨大乳頭性結膜炎からなる群から選択される、請求項１６に記載の使用。
18. 疼痛の治療および/または予防のための、請求項６または請求項７に記載の使用。
19. 請求項１に記載のペプチド分子または請求項５に記載の核酸分子および製薬的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
20. (i) 請求項１に記載のペプチド分子および/または請求項５に記載の核酸分子および(ii) 抗原を含む、アジュバント系。

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