JP2014520527A - 植物における耐乾燥性を改善するためのjaz5aの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
以下の説明および実施例では、いくつもの用語が使用されている。そのような用語に与えられる範囲を含めた本明細書および特許請求の範囲の明瞭かつ一貫した理解をもたらすために、以下の定義が提供される。ここで特に定義されていなければ、使用されている技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されているものと同じ意味を有する。全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
(a)配列番号4のアミノ酸配列を有するタンパク質;または
(b)(a)のタンパク質から、配列番号4のアミノ酸配列の1つまたは複数の残基の置換、欠失または付加によって得られ、配列番号4で示されるアミノ酸配列と機能的に等しいタンパク質;または
(c)配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の同一性を有し、配列番号4で示されるアミノ酸配列と同じ機能を有するタンパク質
である、タンパク質の使用が提供される。
(i)前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド;または
(ii)(i)のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド
からなる群から選択されるポリヌクレオチドの使用が提供される。
一実施形態では、前記ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、配列番号1または配列番号2に記載されている。ある実施形態では、そのようなポリヌクレオチドを含むキメラ遺伝子が提供される。一実施形態では、前記ポリヌクレオチドを含有するベクターが提供される。前記ベクターは、使用する宿主細胞または宿主植物に基づいて選択することができる。当業者は、指定の宿主細胞に適したベクターを選択することができる。
(a)前記宿主細胞を発現に適した条件下で培養するステップと
(b)培養物から前記タンパク質を単離するステップと
を含む、上述のタンパク質を調製するための方法が提供される。
(1)本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含有するアグロバクテリウムを用意するステップと、
(2)植物の細胞、器官または組織を用意するステップと、
(3)本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが植物細胞に導入されるように、ステップ(2)の植物の細胞、器官または組織を、ステップ(1)のアグロバクテリウムと接触させるステップと、
(4)任意選択により、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが導入された植物の細胞、器官または組織を選抜するステップと、
(5)ステップ(3)の植物の細胞、器官または組織を植物に再生させるステップと、
を含む。一実施形態では、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを植物細胞の染色体内に組み込む。
本発明では、「BccJAZ5aタンパク質の保存された突然変異体」とは、配列番号4のアミノ酸配列の最大20個、好ましくは最大10個、より好ましくは最大5個、最も好ましくは最大3個のアミノ酸が同様の性質または近い性質を有するアミノ酸で置き換えられたポリペプチドを指す。これらの突然変異体ポリペプチドは、以下のTable1(表1)に示されているアミノ酸の置き換えに従って作製されることが好ましい。
配列番号4のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、成熟ポリペプチドのみをコードするコード配列;成熟ポリペプチドのコード配列および追加的なコード配列;成熟ポリペプチドのコード配列および非コード配列、任意選択により、さらに追加的なコード配列を含んでよい。
(1)本発明のBccJAZ5aタンパク質をコードするポリヌクレオチド(またはその変異体)、または前記ポリヌクレオチドを含む組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするステップ;
(2)宿主細胞を培地中で培養するステップ;
(3)培地または培養細胞からタンパク質を単離し、精製するステップ。
(1)BccJAZ5aタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターを含むアグロバクテリウム株を用意するステップと、
(2)BccJAZ5aタンパク質をコードするポリヌクレオチドが植物細胞に移入されかつゲノムに組み込まれることができ、それにより植物細胞を形質転換するように、植物細胞、組織または器官をステップ(1)のアグロバクテリウムと接触させるステップと、
(3)任意選択により、BccJAZ5aタンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換された植物細胞または組織を選抜するステップと、
(4)ステップ(3)の植物細胞または組織を植物に再生するステップと
を含む。
配列番号1:BccJAZ5aタンパク質をコードするゲノムDNA配列
配列番号2:BccJAZ5aタンパク質をコードするcDNA配列
配列番号3:BccJAZ5bタンパク質をコードするゲノムDNA配列
配列番号4:BccJAZ5aタンパク質のアミノ酸配列
配列番号5:フォワードプライマー5'AAGAAGCCAAGTCTGTGA3'
配列番号6:リバースプライマー5'TCGGAGGATAATGATGAC3'
恒常的35Sプロモーター(35S::BccJAZ5a)の後にチンゲンサイ(Brassica rapa ssp. chinensis)由来のBccJAZ5aをコードするヌクレオチド配列を有するシロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)(At)の2回の個々の形質転換事象由来の分離T3後代(6つの個々の植物から回収された)(以後、突然変異種子または突然変異植物と称される)をthe National Laboratory of Plant Molecular Genetics、Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology、Shanghai Institutes for Biological Sciences、Chinese Academy of Sciences、300 Fenglin Road、Shanghai 200032、Chinaから入手した。対照として、At Col-0(Columbia、N60000;以後対照種子または植物と称される)をthe Nottingham Arabidopsis Stock Centre(NASC;School of Biosciences、University of Nottingham、Sutton Bonington Campus、Loughborough、LE12 5RD United Kingdom)から入手した。
BccJAZ5a:
フォワード:5'AAGAAGCCAAGTCTGTGA 3'(配列番号5);
リバース:5'TCGGAGGATAATGATGAC 3'(配列番号6)
であった。
砂を1部、バーミキュライトを1部および堆肥を2部含む土壌混合物(砂:バーミキュライト:堆肥=1:1:2)を使用した。この混合物は水の浸透を増加させ、したがって各ポットの均一な水の取り込みおよびよりよい排水が容易になる。播種する前に、層別化のために、種子を暗く湿気のある条件下、4℃で3日間保持した。
10DAGに、植物に栄養(EC-1.5)を与え、15DAGに、各ポットを乾燥トレーに移動させた。この日以降、植物に少しも水を与えなかった。水を控えている間、位置の影響を減らし、均一な蒸発を可能にするために、ポットをトレー内で毎日シャッフルした。毎日、植物、特に対照(または野生型)(Col-0)にしおれの徴候が観察された(図1参照)。乾燥日数(DOD: day of drought)19日目に、Col-0は完全にしおれ、補水しても回復しなかった。この日をその永久しおれ点(PWP)と決定した。この日以降、突然変異体の反復試験体に補水し、回復の徴候について観察し、写真を撮った(図2参照)。突然変異植物は、乾燥の下で対照よりも少なくとも1日長い生存を示した。
本出願の発明者らは、BccJAZ5aタンパク質(配列番号4)内のドメインを同定した。101〜130位はtifyドメインを構成し、184〜209のセグメントはCCT_2モチーフである。これらのドメインは、タンパク質の耐乾燥機能の重要な活性部位である可能性がある。
BccJAZ5aタンパク質(配列番号4)の配列において、BccJAZ5a-M1変異体が得られるようにアミノ酸9をAからVに変化させる。
BccJAZ5aタンパク質(配列番号4)の配列において、BccJAZ5a-M2変異体が得られるようにアミノ酸253をLからIに変化させる。
BccJAZ5aタンパク質(配列番号4)の配列において、BccJAZ5a-M3変異体が得られるようにアミノ酸147をVからAに変化させ、およびアミノ酸230をLからIに変化させる。
BccJAZ5aタンパク質(配列番号4)の配列において、BccJAZ5a-M4変異体が得られるようにアミノ酸266〜270を欠失させる。
BccJAZ5aタンパク質(配列番号4)の配列において、BccJAZ5a-M5変異体が得られるようにアミノ酸159〜161を欠失させる。
BccJAZ5aタンパク質(配列番号4)の配列において、BccJAZ5a-M6変異体が得られるように4つのアミノ酸ATAAをC末端に付加する。
Claims (22)
- (a)配列番号4のアミノ酸配列を有するタンパク質;または
(b)(a)のタンパク質から、配列番号4のアミノ酸配列の1つまたは複数の残基の置換、欠失または付加によって得られ、配列番号4で示されるアミノ酸配列と同一の機能を有するタンパク質;または
(c)(a)のタンパク質から得られ、配列番号4のアミノ酸配列に対して少なくとも60%の同一性を有し、配列番号4で示されるアミノ酸配列と同等の機能を有するタンパク質
である、植物起源の単離された耐乾燥性タンパク質。 - (i)請求項1に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチド;または
(ii)(i)のポリヌクレオチドと相補的なポリヌクレオチド
からなる群から選択される、単離されたポリヌクレオチド。 - 配列番号1または配列番号2に記載のヌクレオチド配列を有する、請求項2に記載のポリヌクレオチド。
- 請求項2または3に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項4に記載のベクターを含む、または請求項2もしくは3に記載のポリヌクレオチドを含む、遺伝子操作された宿主細胞。
- ポリヌクレオチドがゲノム内に組み込まれている、請求項5に記載の遺伝子操作された宿主細胞。
- (a)請求項5または6に記載の宿主細胞を培養するステップと、
(b)請求項1に記載のタンパク質を発現させるステップと、
(b)請求項1に記載のタンパク質を単離するステップと
を含む、請求項1に記載のタンパク質を調製するための方法。 - 耐乾燥性が改善された植物をもたらすための、請求項1に記載のタンパク質または前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの使用。
- 耐乾燥性が改善された植物をもたらすための方法であって、前記植物における請求項1に記載のタンパク質の発現または活性をもたらすまたは増強することを含む方法。
- 前記植物を、請求項1に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドで形質転換することを含む、請求項9に記載の方法。
- ポリヌクレオチドを植物のゲノムに組み込む、請求項10に記載の方法。
- (1)請求項1に記載のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含有するアグロバクテリウム株を用意するステップと、
(2)植物の細胞、器官または組織を用意するステップと、
(3)タンパク質をコードするポリヌクレオチドが植物の細胞、器官または組織に導入されるように、ステップ(2)の植物の細胞、器官または組織を、ステップ(1)のアグロバクテリウム株と接触させるステップと、
(4)任意選択により、植物細胞を選抜するステップと、
(5)植物の細胞、器官または組織を植物に生長させるステップと
を含む、請求項10または11に記載の方法。 - ポリヌクレオチドを植物の細胞、器官または組織に導入した後、ポリヌクレオチドが植物の細胞、器官または組織のゲノム内に組み込まれる、請求項12に記載の方法。
- 請求項2または3に記載のポリヌクレオチド、または請求項4に記載のベクターを含む、遺伝子改変植物。
- 植物が、双子葉植物、単子葉植物および裸子植物からなる群から選択され、より詳細には、コムギ、オオムギ、ライムギ、イネ、トウモロコシ、モロコシ、ビート、リンゴ、セイヨウナシ、セイヨウスモモ、モモ、アンズ、サクランボ、イチゴ、タイワンウラジロイチゴ、クロイチゴ、マメ、レンズマメ、エンドウマメ、ダイズ、セイヨウアブラナ、マスタード、ケシ、オリーブ、ヒマワリ、ヤシ、ヒマシ油を産生する植物、カカオ、ピーナッツ、ヒョウタン、キュウリ、スイカ、綿、アマ、アサ、ジュート、柑橘類、レモン、グレープフルーツ、ホウレンソウ、レタス、アスパラガス、キャベツ、ハクサイ、チンゲンサイ、ニンジン、タマネギ、ジャガイモ、トマト、ピーマン、アボカド、カッシア、ショウノウ、タバコ、ナッツ、コーヒー、ナス、サトウキビ、茶、コショウ、ブドウ、イラクサ、バナナ、天然ゴムノキおよび観賞植物からなる群から選択される、請求項14に記載の遺伝子改変植物。
- 植物が、アブラナ科、イネ科およびバラ科の植物からなる群から選択される、請求項14に記載の遺伝子改変植物。
- 請求項14から16までのいずれか一項に記載の遺伝子改変植物由来の種子。
- 配列番号1または配列番号2の配列の少なくとも30ヌクレオチドを含む、植物における耐乾燥性を同定するための分子マーカー。
- 植物細胞のDNAの配列決定を行い、配列番号1または配列番号2の配列の少なくとも30ヌクレオチドを同定するステップを含む、請求項18に記載の分子マーカーを同定する方法。
- 配列番号1または配列番号2の少なくとも30ヌクレオチドを増幅するステップと、そうして得られたアンプリコンを検出するステップとを含む、請求項18に記載の分子マーカーを同定する方法。
- 配列番号1または配列番号2の少なくとも30ヌクレオチドを、プライマー対を使用して増幅する、請求項20に記載の分子マーカーを同定する方法。
- プライマー対が、配列番号5および配列番号6のヌクレオチド配列で示される、請求項21に記載の分子マーカーを同定する方法。
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