JP2014518859A - ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子に対する活性依存型プローブ - Google Patents
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Abstract
本発明は、選択的トリプシン様セリンプロテアーゼ活性依存型プローブ、とりわけウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子活性依存型プローブ、その使用及び上記プローブを使用する選択的なウロキナーゼ活性の検出方法に関する。
【選択図】図1
【選択図】図1
Description
本発明は、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)活性依存型プローブ、その使用、並びに上記プローブを使用するin vitro及びin vivoにおけるuPA活性の検出方法に関する。
トリプシン様(S1)ファミリーのセリンプロテアーゼは、消化、血液凝固、及び免疫を含む多くの主要な生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たす。さらに、多くのS1セリンプロテアーゼは、がん1〜3、創傷治癒4、5、関節炎6、皮膚疾患、ALS7、感染症8等の疾患に関与する。S1ファミリーの全メンバーは、オキシアニオンホール及びSer、His、Aspアミノ酸(触媒三残基)からなる触媒部位を含む同様のタンパク質フォールディングを有する。典型的には、このファミリーのメンバーは、深いS1ポケットを有し、このポケットの底部にはマイナスに帯電しているArg残基がある。
多くの膜固定型セリンプロテアーゼは、ヒトがんにおいて異常発現し、疾患状態のバイオマーカー指標として示唆されてきた9。根拠は、ヒトがんにおける発現研究、そして場合によってはマウス発癌モデルに由来する。これに関する重要なトリプシン様セリンプロテアーゼはウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)である。uPAは、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子系(uPAS)のメンバーであり、がん浸潤及びがん転移のプロセスに関与する。uPAは、単鎖酵素前駆体(pro−uPA又はsc−uPA)として合成及び分泌され、その受容体(uPAR)に結合した後、Lys158−Ile159ペプチド結合の開裂を介して、活性な二重鎖形(tc−uPA)へと活性化される。活性化は、プラスミンによって引き起こされる。uPAがその膜結合受容体(uPAR)に付着した場合、プラスミノーゲンがプラスミンへと活性化する。プラスミンは、細胞外マトリクス(ECM)の破壊において重要な役割を果たす。それは、直接的に、及び/又は特定のマトリクスメタロプロテアーゼ(MMP)の活性化を介して、一部のECM構成成分(例えば、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、IV型コラーゲン、プロテオグリカン及びフィブリン)を分解することができる。さらに、tc−uPA、プラスミン及びMMPは、VEGF(血管内皮増殖因子)、HGF(肝細胞増殖因子)及びTGF−β(形質転換増殖因子)のような、一部のマイトジェン因子、遊走促進(motogenic)因子及び血管新生増殖因子を放出/活性化することができる。uPA/uPAR系の主要な内因性のインヒビターは、PAI−1(プラスミノーゲン活性化因子インヒビター1)であり、これは、その受容体と関連する活性型uPAに結合し、複合体の細胞内移行を行う10〜12。
がん治療及びがんバイオマーカー13〜15の有効な標的とは別に、uPAは、関節炎16、アテローム性動脈硬化、黄斑変性17、創傷治癒18、ALS7及びてんかん19等が挙げられるがこれらに限定されないその他の疾患に対する標的及びバイオマーカーとしても言及されている。
がんにおけるuPAの重要性を強調する例はわずかである。
原発性乳房腫瘍組織における高レベルのuPA及び/又はPAI−1は、腫瘍の悪性度及び患者の予後不良と関連している20。また、その他のタイプ(例えば、子宮内膜、前立腺、直腸結腸)のがんに関する、uPA及びPAI−1と腫瘍の進行及び患者の予後との関係も示されている。さらに、乳がんに関する腫瘍マーカーの臨床的有用性の格付けにおいて、最も高いLOE(証拠レベル)が達成された21。したがって、uPAは、有効なバイオマーカーであり、uPAの可視化/標識化は、診断及び/又は治療ガイダンスの強力なツールとなるであろう。
上述の内容について、一般的に、in vitro又はin vivo環境において定性的及び定量的な方式でuPAの触媒活性を可視化又は捕捉することができる化学的ツールは、種々の非臨床的適用及び臨床的適用に極めて有用であろうことが認識されている。活性依存型プローブは、機構的に関連するクラスの酵素と反応する特別に設計された化学プローブである22。プローブは、典型的には2つの要素、即ち、反応基及びタグからなる。加えて、一部のプローブは、選択性を増強する結合基を含み得る。反応基は、通常、活性型酵素の活性部位において求核残基に共有結合する求電子物質を含む。タグは、蛍光色素分子等のレポータータグ又は可視化タグ、ビオチン等の増強手段、又はレポータータグ、可視化タグ又は増強手段を導入するアルキン若しくはアジドであってもよいがこれらに限定されない。そのようなタグ化プローブを得るのに好適なあらゆる化学反応、例えばヒュスゲン1,3−双極性付加環化(クリックケミストリーとも呼ばれる)23等を使用することができるが、これらに限定されない。
活性依存型プローブ技術の主な利点は、タンパク質又はmRNAの存在量に限定されず、酵素活性部位の可用性を直接的にモニタリングすることができることである。内因性インヒビターと相互作用することの多いセリンプロテアーゼ、又は非活性型酵素前駆体として存在するセリンプロテアーゼ等の酵素群により、この技術は、活性よりも存在量に頼る従来の技術を上回る価値のある利益を提供する。最も重要なことは、化学プローブを用いた実験から強固な結論を導くため、後者は、或る特定の品質基準を満たさなければならない。Nature Chemical Biology (March 2010)では、化学プローブに関して最近焦点となっている問題について、何人かの著者らがこれらの品質基準について考察している24、25。
有効性:化学プローブは、そのタンパク質標的に対して高い親和性を有する必要がある。不可逆的プローブの場合、プローブのその標的(複数の場合もある)への共有結合は、十分に迅速に進行しなければならない。
選択性:これはおそらく最も重要な基準である。標的のプロファイリング及び標的の可視化実験の間、メカニズムに関する確固たる結論を得ることを目的とするのであれば、化学プローブには高い選択性が間違いなく必要不可欠である。化学プロテオミクスは、化学プローブの確実な標的選択性を確定するのに必須となる新たな規律である。
共有結合性バインダー:優良な薬剤と優良な化学プローブの相違は、それらの標的との相互作用の性質にある。製薬業界には、(多くの例がその反対であることを証明しているにも関わらず)不可逆的インヒビターは望ましくない毒性プロファイルを有するという強い先入観が存在する。不可逆的な化学プローブに関して、生物学的標的の長期に亘る化学的ノックダウンは、分子標的と、その標的を調節するより幅広い生物学的結論との関連性を立証するであろう。また、画像化目的及びMSに基づく化学プロテオミクスの実験のため、プローブと標的との間の強固な共有結合(covalent link)が有利である。
触媒活性との相関:酵素について、化学プローブは、標的酵素の触媒的に活性な画分のみをモニタリングしなければならない。
細胞透過性:膜透過性は、細胞内標的の前提条件である。
安定性:プローブは、それらが使用される条件(in vitro及び/又はin vivo)下で十分に長い半減期を有していなければならない。
多用途性:理想的には、同一のプローブを、種々のレポータータグ及び可視化タグにより多目的に誘導体化することができる。
非特異的活性依存型プローブ、ペプチドプローブ、内部消光蛍光基質(internally quenched fluorescent substrates)及び抗体等のタンパク質をモニタリングする既存の技術はいずれも以下の1以上の欠点、即ち、有効性及び選択性の欠如、共有結合を形成せずタンパク質活性と相関がないこと、細胞透過性及び安定性が低いこと、レポータータグ又は画像化タグによる直接的な誘導体化ができないことに悩まされている。
次の段落において、本発明者らは、非特異的活性依存型プローブ(ABP)、ペプチド構造を有する活性依存型プローブ、内部消光蛍光基質及び抗体に基づく既存の技術に関連する欠点を更に考察する。
非特異的ABPは、酵素ファミリー及びスーパーファミリー全体を標的とする22。例えば、Cravatt他によって開発された、ローダミンでタグ付されたフルオロホスホネートプローブ(FP−ローダミン)又はビオチンでタグ付されたフルオロホスホネートプローブ(FP−ビオチン)が挙げられる26。FP−ビオチンは、プロテオーム中の代謝的に活性なセリン加水分解酵素の80%超を標識化可能であることが示されている27。これらのプローブの主な欠点は選択性が欠如していることである。プローブの選択性は、その自然バックグラウンドにおける或るタンパク質標的の選択的なモニタリング、可視化及び検証の基本原則である。
現行の技術水準は、プロテアーゼを標的とする活性依存型プローブにおいて、通常、理想的にはプロテアーゼの活性部位の内部又は近辺の結合部位によって特異的に認識されるペプチド部分を導入することによって選択性を取得することを教示している28、29。しかしながら、これらのペプチド化合物には、ペプチドの欠点、即ち、低い膜透過性及び代謝不安定性がある23。
プロテアーゼの触媒活性の画像化は、内部消光蛍光基質を用いて行われている。これらのプローブは、互いに近接した一対の蛍光色素分子及び消光単位を含み、蛍光色素分子を検出不可能とする。標的プロテアーゼによって消光基質が開裂した後のみ、そのクエンチャーから蛍光色素分子が放出されて蛍光シグナルを検出することができる30。Ralph Weissleder他のグループは、in vivoでの腫瘍においてプロテアーゼ活性を画像化するこれらの活性化可能なプローブの開発について大規模に研究してきた31、32。この技法は、とりわけ、カテプシンB及びMMPに対して実証されている。ここでも主な制限は、本質的には上述のペプチド基質の使用に関連するものである。
さらに、画像化は蛍光発光に制限される。おそらく、最大の欠点は、標的との共有結合が形成されず、蛍光色素分子の急速な拡散が生じ、それゆえに高解像度の局在研究における使用に限定されることである。近年、比較研究において、ペプチドABPが消光基質プローブよりも優れていることが示されている23。
最後に、生物学的マトリクスにおけるタンパク質標的の存在を示すためにモノクローナル抗体が多く使用される。これらの抗体は、高い有効性と選択性を伴って結合するが、それらは共有結合を形成しない。認識されるエピトープによっては、触媒的に活性でない酵素をも検出される。また、抗体は、上述の巨大な生体分子固有の欠点を有している。
上記考察を鑑みて、本発明者らは、新規な選択的非ペプチドプロテアーゼ結合単位と種々のタイプの可視化タグ又はレポータータグとの有効な組み合わせを可能とし、同一のプロテーゼ結合単位を有しながらも全く異なるタイプのレポータータグ又は可視化タグを有する活性依存型プローブの収集につながる、活性依存型プローブのモジュール的アプローチの開発に努めてきた。そのような収集により、既存の生物学的な課題に適用される種々の画像化/可視化技法の結果を迅速に評価し、又は更にはそれらを組み合わせることができるかもしれない。可視化タグ/レポータータグは、可視領域(例えばローダミン)若しくは近赤外領域(NIR)(例えば、BODIPY)由来の種々の蛍光色素分子、金属イオンに対するキレート剤(MRIにはガドリニウム、又はSPECTには99mTc)、及びPETに対する18F標識化分子であり得る。化学プローブは、生命科学(例えば、画像化、組織学、プロテオミクス等)への種々の適用のみならず、あらゆる産業プロセスでの品質管理に関するツールとして使用され得る。
上記考察より、標的と共有結合を形成する頭部(warhead)と多用途の誘導体化のための手段とを含む選択的に結合する非ペプチドプローブは、科学的及び技術的な技術水準を向上するであろうことが明らかである。本発明者らが知る限り、uPAを標的とするそのようなプローブは、科学文献及び特許文献に記載されていない。
次の段落において、本発明者らは、トリプシン様ファミリーを標的とするプローブに関する最も近い技術水準、及び本発明者らの新規なプローブと比較した際のそれらの欠点について述べる。
2008年、Oikonomopoulou他は、捕捉抗体に連結されたペプチド活性依存型プローブを用いたツールを報告している33。プローブは、カリクレイン6の認識に関与するpro−lysペプチド断片の周囲に構築されていた。当該分野の専門家らであれば、Oikonomopoulou他によって述べられているプローブに関連する選択性の問題に対処するため、抗体アプローチが必要であることに同意するであろう。このプローブは、Pan他によって以前に説明されていた34。この論文は、このプローブの非選択性を明確に示した。β−トリプターゼ、トリプシン、トロンビン及びプラスミンに対するKi(app)は、同程度(0.6μM〜6μM)であった。Pan他は、プロリン残基の組み込みは、単一アミノ酸Lysプローブと比較した全体的な反応性を増加するということを明確に述べた。しかしながら、これは、選択性プロファイルの変化を伴わない、わずかな活性の増加にすぎなかった。
Brown他による、より最近の公表論文は、共にトリプシンフォールド(trypsin fold)S1Aプロテアーゼのメンバーである、マトリプターゼを標的とするホスホネート−ABP、及びトロンビンの合成及び評価を報告している29。Brown他は、広い特異性を持つホスホネートABP及び特異的S1AプロテアーゼABPの設計には、ペプチド配列が必要であると述べている。加えて、ホスホネートの脱離基、ペプチド配列、ペプチド長及びペプチド安定性は、有効性を高める重要な要素として示されている29。最も有効なペプチド含有プローブは、マトリプターゼに対するIC50値0.068μM及びki 490M−1s−1を有し、これはかなり少ない。さらに、提示されているプローブのIC50値は、長期のプレインキュベーション期間(4時間)の後に取得されており、反応が遅いという特徴を強調している。
2011年、特定のプロテアーゼの検出用の特定のジフェニルホスホネートプローブ群に関する特許文献1が、公開された35。しかしながら、この特定の発明は、P1における天然アミノ酸ジフェニルホスホネート誘導体(例えば、バリル基、フェニルアラニル基、アルギニル基又はリシル基)を有する具体的分子を開示している。さらに、特許文献1に開示される全ての化合物は、スクシニル部分を含み、これは上記化合物に必須と考えられている。そのようなスクシニル部分は、バイオマーカーの認識、バイオマーカーに対する化合物の選択性、シグナル対ノイズ比の改善、及び化合物の分解耐性に極めて重要かつ必須であることが明らかとなっている。実際、化合物への小さい化学的修飾であっても予想に反して劇的にその活性プロファイル及び選択性プロファイルを変化し得ることから、一般的にペプチジル部分又はスクシニル部分は優れた特徴を有するタグ化ジフェニルホスホネートプローブの製造に必須であると考えられるのは当然である。したがって、ペプチジルリンカー又はスクシニルリンカーが活性依存型プローブを改良することが提言された。したがって、一般的な教示を前提とすると、ペプチジルリンカー又はスクシニルリンカーを使用せずに、タグ化ジフェニルホスホネートプローブが優れた活性依存型特性を有する化合物をもたらすことは予想されていなかった。一般的な教示に鑑みて、なおも驚くべきことに、本発明において開示される化合物は、ペプチジル部分及び/又はスクシニル部分を必要とすることなく、優れた活性依存型特性を有することが見出された。
最も密接に関連する適用は、uPAに対する内部消光蛍光基質を用いたuPA活性のin vivo/in vitro画像化のためのツールである36。使用されるプローブは高分子量であってペプチドの特徴を有し、蛍光色素を含むペプチド断片を放出する36。標的酵素の共有結合的標識化は達成されないであろう。上記段落からわかるように、これは、おそらくuPA活性を可視化又は捕捉するのに最も理想的なプローブではない。
非常に選択的かつ有力な方法でuPAと反応する非ペプチドジフェニルホスホネート不可逆的結合インヒビターを説明する密接に関連する技術水準は、Joossens他によって開示されている37。記載されるインヒビターは、画像化プローブとしてではなく、有効な薬剤候補として発明されたものである。当業者であれば、可視化タグと組み合わされたリンカーのような大きな置換基を組み込みながらも、同時に有効性及び選択性を維持することは明らかではないことを認識するであろう。
小さな不可逆的uPAインヒビターUAMC−0015037及びUAMC−0025137に基づき、本発明者らは、選択的にuPAを標的とする、反応速度の早い結合パラメーター(fast kinetic binding parameters)を示し、15分という短時間のインキュベーション期間の後に高いIC50値を示す、第一の活性依存型プローブを設計した(図1)。前臨床及び臨床の場におけるそれらの使用において、反応の速度は有益となるであろう。凝固及び線維素溶解に関与する4種の密接に関連したセリンプロテアーゼ(tPA、トロンビン、プラスミン及びFXa)と選択性を比較した。この選択性プロファイルは、既に言及したトリプシン様セリンプロテアーゼに対する既存のプローブのプロファイルよりも著しく優れており、これらと比較して、本発明者ら自身のプローブは、重要な血液凝固酵素を妨げることがないことから、in vivoの場における使用に好都合であろう。また同様に、tPAに対するそれらの選択性が、in vitroでの適用(例えば、組織学における腫瘍の可視化)においてより明確なプロファイルを示唆することが期待できる。
本発明者らが、uPAに対して同様の選択性及び活性を保持しながらアルファアミノ(例えば、メチルカルバメート)に結合された小さな基を大きな置換基によって置換することができたという事実は予想外のことであった。リンカー、特にアジド/アルキン−アルカン/ポリエチレンリンカーによるメチルカルバメートの置き換えは、uPAに対する活性にわずかな影響しか与えない。大きなローダミンがこれらの分子に連結されたとしても、有効性はわずかに低下するのみであり(10倍)、依然として極めて良好な選択性プロファイルを保持する。これらのプローブは、現在まで、血液凝固及び線維素溶解カスケードのプロテアーゼを妨げない、uPAを対象とする最も有効で選択的なプローブである。
本発明において提示されるプローブは、密接に関連するBrown他の公表論文29において提示されるものとは非常に異なるものである。
1)本発明によるプローブは、有効ながんバイオマーカーであるuPAを標的とするものであり、Brown他のものはマトリプターゼ(本発明時点で有効なバイオマーカーではない)に対するものである。
2)本明細書に提示されるプローブは、より速い阻害反応速度を有する。Brown他により取得されたマトリプターゼに対する最も高い二次阻害定数(second
order inhibition constant)は、490M−1s−1であったが、本発明者らのものはuPAに対して10倍高い(良好な)ものであった(4000M−1s−1)。重要な点は、本発明者らのものは、全てのIC50アッセイにおいて基質を添加する前にプローブ酵素混合物に対して僅か15分のインキュベーション期間を使用したのに対し、Brown他は4時間であり、結合反応速度が最善のものではないことが反映されている。
order inhibition constant)は、490M−1s−1であったが、本発明者らのものはuPAに対して10倍高い(良好な)ものであった(4000M−1s−1)。重要な点は、本発明者らのものは、全てのIC50アッセイにおいて基質を添加する前にプローブ酵素混合物に対して僅か15分のインキュベーション期間を使用したのに対し、Brown他は4時間であり、結合反応速度が最善のものではないことが反映されている。
2)Brown他によって明確かつはっきりと述べられているように、Brown他の公表論文のプローブはこの有効性を取得するためにペプチドテイルを必要とする。プロテアーゼ結合部分が可視化タグに直接的に結合されたプローブは、二次阻害定数50M−1s−1を取得したにすぎない。さらに、トロンビンに対するIC50値0.097μMは、マトリプターゼに対する選択性を示唆するものではない。加えて、そのドメインにおけるBrown他自身の見解によれば、Brown他は、ジアリールホスホネート活性依存型プローブを用いて一般的に許容され得る結合反応速度を得るためにはペプチドテイルが必須条件であると予想している。本発明者らは、背景技術の項において、ペプチドの特徴は、前臨床及び臨床での使用のためのプローブ設計には不利であると説明した。
3)Brown他のプローブは、トロンビンと比較してマトリプターゼに選択的ではない。これは、凝固及び線維素溶解カスケードの阻害に影響を与える可能性がある。このカスケードのその他の酵素の阻害に関する情報について、全く言及されていない。本発明において提示されるプローブは、プラスミン、tPA、トロンビン及びFXaに対して少なくとも100倍の選択性を示す。
4)Brown他によって提示されるプローブは、可視化タグ/レポータータグを変更する可能性について示されなかった。さらに、ビオチンのみが[ストレプトアビジン−蛍光色素分子]複合体の添加を介して標的酵素を示す間接的可視化タグとしてここに提示されている。
一般に、Brown他の論文は、その他の公表論文と一致して、有効で選択的なジフェニルホスホネートプローブを取得するためにはペプチドの特徴が必要であると教示している。本発明において、本発明者らは、最適なプローブ設計のために、全ての特徴(即ち、共有結合性バインダー、非ペプチドの特徴、低分子量及び種々の可視化タグを柔軟に組み込むことができること)を有する非ペプチド型プローブの取得が可能であることを証明した。
Martin他は、2011年にジフェニルホスホネートプローブに関する発明を開示した35。この発明は、必須のスクシニル部分と組み合わせて、P1においてアルギニル、バリル、フェニルアラニル及びリシルを有する特定のプローブを使用する方法論を記載している。興味深いことに、提示されたプローブの選択性及び有効性に関するデータについては何ら記載されていない。Pan他のデータに基づき34、本発明者らは、これらのプローブは、おそらく有効ではなく選択的ではないと結論づけることができた。本発明者らの調査より、アルギニル部分は選択的かつ有効なuPAプローブを設計するうえで理想的なP1修飾ではないと、本発明者らは理解している37。記載される発明において、種々の可視化タグの柔軟な組み込みを可能とする手段は予測されていない。
小さな非ペプチド分子との選択的かつ有効なuPA共有結合に関する最も近い技術水準は、2007年にJoossens他により発表された37。しかしながら、これらの近年開示された分子は、画像化プローブとして有用な特性を全く有していない。さらに、大きな置換基を組み込み、最適なプローブの特徴を導く十分な有効性及び選択性を維持することは明らかではない。P1残基並びにリンカー及び可視化タグに直接的に結合されたジフェニルホスホネート頭部のみを含むほとんどの分子プローブは、特定の標的の非選択的で有効な共有結合性バインダーである34。
第1の態様では、本発明は、式I:
(式中、
R1及びR2は、−H、OH、−ハロ、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、−NR5R6、−(C=O)−R7及びSO2−R8を含む群から各々独立して選択され;
R5、R6、R9及びR10は、−H、−O、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル及び−(C=O)−C1〜6アルキルを含む群から各々独立して選択され;
R7及びR8は、−ハロ、−OH、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、及び−NR9R10を含む群から各々独立して選択され;
R3は、−グアニジノであり;
Aは、直接結合及びC1〜6アルキルを含む一覧から選択され;
Lは、−SO2−R4−アミド−;−SO2−R4−スルホンアミド;−SO2−R4−トリアゾール−;−SO2−R4−尿素−;−SO2−R4−アミン;−SO2−R4−カルバメート−;−(C=O)−R4−アミド−;−(C=O)−R4−スルホンアミド−;−(C=O)−R4−トリアゾール−;−(C=O)−R4−尿素−;−(C=O)−R4−アミン−;−(C=O)−R4−カルバメート−;−(C=O)−O−R4−アミド−;−(C=O)−O−R4−スルホンアミド−;−(C=O)−O−R4−トリアゾール−;−(C=O)−O−R4−尿素−;−(C=O)−O−R4−アミン−;−(C=O)−O−R4−カルバメート−;−(C=O)−N−R4−アミド−、−(C=O)−N−R4−スルホンアミド−;−(C=O)−N−R4−トリアゾール−;−(C=O)−N−R4−尿素−;−(C=O)−N−R4−アミン−;−(C=O)−N−R4−カルバメート−;−R4−アミド−、−R4−スルホンアミド−;−R4−トリアゾール−;−R4−尿素−;−R4−アミン−;−R4−カルバメート−を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
m、n及びoは、各々独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり、
Yは、検出可能な標識を表す)
の化合物、又はその立体異性体、互変異性体、ラセミ体、代謝体、プロドラッグ若しくはプレドラッグ、塩、水和物、又は溶媒和物を提供する。
R1及びR2は、−H、OH、−ハロ、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、−NR5R6、−(C=O)−R7及びSO2−R8を含む群から各々独立して選択され;
R5、R6、R9及びR10は、−H、−O、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル及び−(C=O)−C1〜6アルキルを含む群から各々独立して選択され;
R7及びR8は、−ハロ、−OH、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、及び−NR9R10を含む群から各々独立して選択され;
R3は、−グアニジノであり;
Aは、直接結合及びC1〜6アルキルを含む一覧から選択され;
Lは、−SO2−R4−アミド−;−SO2−R4−スルホンアミド;−SO2−R4−トリアゾール−;−SO2−R4−尿素−;−SO2−R4−アミン;−SO2−R4−カルバメート−;−(C=O)−R4−アミド−;−(C=O)−R4−スルホンアミド−;−(C=O)−R4−トリアゾール−;−(C=O)−R4−尿素−;−(C=O)−R4−アミン−;−(C=O)−R4−カルバメート−;−(C=O)−O−R4−アミド−;−(C=O)−O−R4−スルホンアミド−;−(C=O)−O−R4−トリアゾール−;−(C=O)−O−R4−尿素−;−(C=O)−O−R4−アミン−;−(C=O)−O−R4−カルバメート−;−(C=O)−N−R4−アミド−、−(C=O)−N−R4−スルホンアミド−;−(C=O)−N−R4−トリアゾール−;−(C=O)−N−R4−尿素−;−(C=O)−N−R4−アミン−;−(C=O)−N−R4−カルバメート−;−R4−アミド−、−R4−スルホンアミド−;−R4−トリアゾール−;−R4−尿素−;−R4−アミン−;−R4−カルバメート−を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
m、n及びoは、各々独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり、
Yは、検出可能な標識を表す)
の化合物、又はその立体異性体、互変異性体、ラセミ体、代謝体、プロドラッグ若しくはプレドラッグ、塩、水和物、又は溶媒和物を提供する。
好ましい化合物群は、上記式中、
R1及びR2は、−H及び−NH−(C=O)−CH3を含む群から各々独立して選択され;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Lは、−(C=O)−O−R4−トリアゾール−又は−(C=O)−R4−トリアゾール−であり;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
mは、1、2、3又は4であり;
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり;
oは、1、2、3又は4であり;
Yは、検出可能な標識を表す、式Iによる化合物が好ましい。
R1及びR2は、−H及び−NH−(C=O)−CH3を含む群から各々独立して選択され;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Lは、−(C=O)−O−R4−トリアゾール−又は−(C=O)−R4−トリアゾール−であり;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
mは、1、2、3又は4であり;
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり;
oは、1、2、3又は4であり;
Yは、検出可能な標識を表す、式Iによる化合物が好ましい。
本発明による検出可能な標識は、磁気共鳴画像法、X線画像法、超音波、核医学画像法、マルチモーダル画像法、蛍光画像法、生物発光画像法、顕微鏡検査、質量検出器、波長検出器、燐光画像法、化学発光画像法等を含む一覧から選択される方法によって機器により検出することができる基であることが意図される。
本発明の更なる態様は、式Iによる化合物を調整する式II:
R1及びR2は、−H、OH、−ハロ、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、−NR5R6、−(C=O)−R7及びSO2−R8を含む群から各々独立して選択され;
R5、R6、R9及びR10は、−H、−O、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル及び−(C=O)−C1〜6アルキルを含む群から各々独立して選択され;
R7及びR8は、−ハロ、−OH、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、及び−NR9R10を含む群から各々独立して選択され;
R3は、−グアニジノであり;
Aは、直接結合及びC1〜6アルキルを含む一覧から選択され;
Bは、−(C=O)−O−R4−アルキン、−(C=O)−O−R4−N3、−(C=O)−R4−アルキン、又は−(C=O)−R4−N3を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
m、n及びoは、各々独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10である)
の中間体を提供することである。
R5、R6、R9及びR10は、−H、−O、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル及び−(C=O)−C1〜6アルキルを含む群から各々独立して選択され;
R7及びR8は、−ハロ、−OH、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、及び−NR9R10を含む群から各々独立して選択され;
R3は、−グアニジノであり;
Aは、直接結合及びC1〜6アルキルを含む一覧から選択され;
Bは、−(C=O)−O−R4−アルキン、−(C=O)−O−R4−N3、−(C=O)−R4−アルキン、又は−(C=O)−R4−N3を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
m、n及びoは、各々独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10である)
の中間体を提供することである。
好ましい中間体群は、上記式中、
R1及びR2は、−H及び−NH−(C=O)−CH3を含む群から各々独立して選択され;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Bは、−(C=O)−O−R4−アルキン、−(C=O)−O−R4−N3、−(C=O)−R4−アルキン、又は−(C=O)−R4−N3を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
mは、1、2、3又は4であり;
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり;
oは、1、2、3又は4である、式IIによる中間体である。
R1及びR2は、−H及び−NH−(C=O)−CH3を含む群から各々独立して選択され;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Bは、−(C=O)−O−R4−アルキン、−(C=O)−O−R4−N3、−(C=O)−R4−アルキン、又は−(C=O)−R4−N3を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
mは、1、2、3又は4であり;
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり;
oは、1、2、3又は4である、式IIによる中間体である。
特に、本発明の化合物及び上記化合物を含む組成物は、トリプシン様セリンプロテアーゼを対象とする活性依存型プローブとして非常に有用であり、したがって特に、
種におけるトリプシン様セリンプロテアーゼ活性の検出;
種におけるトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素活性の解析;
種におけるトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素活性の可視化;
ヒト又は動物におけるがん細胞、特にトリプシン様セリンプロテアーゼを発現するがん細胞の可視化;
ヒト又は動物における細胞、特にトリプシン様セリンプロテアーゼを発現する細胞の可視化;
に使用することができる。
種におけるトリプシン様セリンプロテアーゼ活性の検出;
種におけるトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素活性の解析;
種におけるトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素活性の可視化;
ヒト又は動物におけるがん細胞、特にトリプシン様セリンプロテアーゼを発現するがん細胞の可視化;
ヒト又は動物における細胞、特にトリプシン様セリンプロテアーゼを発現する細胞の可視化;
に使用することができる。
本発明の更なる態様は、
ヒト又は動物においてがん細胞を可視化する方法であって、上記ヒト又は動物に本発明による化合物又は組成物を投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含む、方法;
種において活性トリプシン様セリンプロテアーゼを可視化する方法であって、上記種に本発明による化合物又は組成物を投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含む、方法;
種においてトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害することを目的とする治療の効果をモニタリングする方法であって、本発明による化合物又は組成物を種々の時間点(即ち、治療前、治療中及び/又は治療後)に上記種に投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含み、発生するシグナルの経時的な減少が、上記治療が効果的であることを示す、方法;
を提供することである。
ヒト又は動物においてがん細胞を可視化する方法であって、上記ヒト又は動物に本発明による化合物又は組成物を投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含む、方法;
種において活性トリプシン様セリンプロテアーゼを可視化する方法であって、上記種に本発明による化合物又は組成物を投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含む、方法;
種においてトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害することを目的とする治療の効果をモニタリングする方法であって、本発明による化合物又は組成物を種々の時間点(即ち、治療前、治療中及び/又は治療後)に上記種に投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含み、発生するシグナルの経時的な減少が、上記治療が効果的であることを示す、方法;
を提供することである。
本発明の具体的な好ましい実施態様において、本発明において使用されるトリプシン様セリンプロテアーゼは、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)である。
これより、本発明を更に説明する。以下の節では、本発明の種々の態様を更に詳細に規定する。そこで規定された各々の態様は、そうではないことが明確に示されていない限り、他の任意の態様(単数又は複数)と組み合わせてもよい。特に、好適又は有利であると示される任意の特徴を、好適又は有利であると示される他の任意の特徴(単数又は複数)と組み合わせてもよい。
上述のように、第1の態様では、本発明は、式I:
(式中、
R1及びR2は、−H、OH、−ハロ、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、−NR5R6、−(C=O)−R7及びSO2−R8を含む群から各々独立して選択され;
R5、R6、R9及びR10は、−H、−O、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル及び−(C=O)−C1〜6アルキルを含む群から各々独立して選択され;
R7及びR8は、−ハロ、−OH、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、及び−NR9R10を含む群から各々独立して選択され;
R3は、−グアニジノであり;
Aは、直接結合及びC1〜6アルキルを含む一覧から選択され;
Lは、−SO2−R4−アミド−;−SO2−R4−スルホンアミド;−SO2−R4−トリアゾール−;−SO2−R4−尿素−;−SO2−R4−アミン;−SO2−R4−カルバメート−;−(C=O)−R4−アミド−;−(C=O)−R4−スルホンアミド−;−(C=O)−R4−トリアゾール−;−(C=O)−R4−尿素−;−(C=O)−R4−アミン−;−(C=O)−R4−カルバメート−;−(C=O)−O−R4−アミド−;−(C=O)−O−R4−スルホンアミド−;−(C=O)−O−R4−トリアゾール−;−(C=O)−O−R4−尿素−;−(C=O)−O−R4−アミン−;−(C=O)−O−R4−カルバメート−;−(C=O)−N−R4−アミド−、−(C=O)−N−R4−スルホンアミド−;−(C=O)−N−R4−トリアゾール−;−(C=O)−N−R4−尿素−;−(C=O)−N−R4−アミン−;−(C=O)−N−R4−カルバメート−;−R4−アミド−、−R4−スルホンアミド−;−R4−トリアゾール−;−R4−尿素−;−R4−アミン−;−R4−カルバメート−を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
m、n及びoは、各々独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり、
Yは、検出可能な標識を表す)
の化合物(その立体異性体、互変異性体、ラセミ体、代謝体、プロドラッグ若しくはプレドラッグ、塩、水和物、又は溶媒和物を含む)を提供する。
R1及びR2は、−H、OH、−ハロ、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、−NR5R6、−(C=O)−R7及びSO2−R8を含む群から各々独立して選択され;
R5、R6、R9及びR10は、−H、−O、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル及び−(C=O)−C1〜6アルキルを含む群から各々独立して選択され;
R7及びR8は、−ハロ、−OH、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、及び−NR9R10を含む群から各々独立して選択され;
R3は、−グアニジノであり;
Aは、直接結合及びC1〜6アルキルを含む一覧から選択され;
Lは、−SO2−R4−アミド−;−SO2−R4−スルホンアミド;−SO2−R4−トリアゾール−;−SO2−R4−尿素−;−SO2−R4−アミン;−SO2−R4−カルバメート−;−(C=O)−R4−アミド−;−(C=O)−R4−スルホンアミド−;−(C=O)−R4−トリアゾール−;−(C=O)−R4−尿素−;−(C=O)−R4−アミン−;−(C=O)−R4−カルバメート−;−(C=O)−O−R4−アミド−;−(C=O)−O−R4−スルホンアミド−;−(C=O)−O−R4−トリアゾール−;−(C=O)−O−R4−尿素−;−(C=O)−O−R4−アミン−;−(C=O)−O−R4−カルバメート−;−(C=O)−N−R4−アミド−、−(C=O)−N−R4−スルホンアミド−;−(C=O)−N−R4−トリアゾール−;−(C=O)−N−R4−尿素−;−(C=O)−N−R4−アミン−;−(C=O)−N−R4−カルバメート−;−R4−アミド−、−R4−スルホンアミド−;−R4−トリアゾール−;−R4−尿素−;−R4−アミン−;−R4−カルバメート−を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
m、n及びoは、各々独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり、
Yは、検出可能な標識を表す)
の化合物(その立体異性体、互変異性体、ラセミ体、代謝体、プロドラッグ若しくはプレドラッグ、塩、水和物、又は溶媒和物を含む)を提供する。
本発明の化合物を説明する場合、使用される用語は、文脈上他に指示がない限り、以下の定義に従って解釈されるものとする:
「アルキル」という用語は、それ自体が又は別の置換基の一部として、式:CxH2x+1(式中、xは1以上の数である)の完全に飽和した炭化水素を指す。概して、本発明のアルキル基は1個〜6個の炭素原子を含む。アルキル基は線状であっても、又は分岐状であってもよく、本明細書中で示されるように置換されていてもよい。本明細書中で炭素原子の後に下付き文字が使用されている場合、下付き文字は指定の基が含有し得る炭素原子の数を指す。したがって、例えばC1〜4アルキルとは、1個〜4個の炭素原子のアルキルを意味する。アルキル基の例としては、メチル、エチル、n−プロピル、i−プロピル、ブチル及びその異性体(例えば、n−ブチル、i−ブチル、及びt−ブチル)、ペンチル及びその異性体、ヘキシル及びその異性体、ヘプチル及びその異性体、オクチル及びその異性体、ノニル及びその異性体、デシル及びその異性体が挙げられる。C1〜6アルキルは、1個〜6個の炭素原子を有する線状、分岐状、又は環状のアルキル基全てを含み、そのためメチル、エチル、n−プロピル、i−プロピル、ブチル及びその異性体(例えば、n−ブチル、i−ブチル、及びt−ブチル)、ペンチル及びその異性体、ヘキシル及びその異性体、シクロペンチル、2−メチルシクロペンチル、3−メチルシクロペンチル、又は4−メチルシクロペンチル、シクロペンチルメチレン、及びシクロヘキシルを含む。
「ハロ」又は「ハロゲン」という用語は、基又は基の一部として、フルオロ、クロロ、ブロモ、又はヨードの総称である。
「アミド」という用語は、基又は基の一部として、窒素原子に結合されたカルボニル基−(C=O)−を含む。
「スルホンアミド」という用語は、基又は基の一部として、アミン基に結合されたスルホニル基−S(=O)2−を含み、二価のスルホンアミドは例えば−S(=O)2−NH−を表す。
「尿素」という用語は、基又は基の一部として、カルボニル基(C=O)基によってつなぎ合わされた2つのアミン基を含み、二価の尿素は例えば−NH−(C=O)−NH−を表す。
「カルバメート」という用語は、基又は基の一部として、アミン基に結合されたカルボキシル基−O−C(=O)を含み、二価のカルバメートは例えば−O−(C=O)−NH−を表す。
「トリアゾール」という用語は、基又は基の一部として、式C2H3N3の(即ち、2つの炭素原子及び3つの窒素原子を有する)5員環を指す。特に、本発明において使用されるトリアゾールという用語は、1,2,3−トリアゾールを指し、より具体的にはトリアゾールという用語は以下に示される化学的部分を指す:
文脈上他に指示がない限り、アスタリスクは、示した一価又は二価のラジカルが、それが関係し、ラジカルが一部を形成する構造に結合する点を示すのに本明細書中で使用される。上記の図形表示は、分子のその他の部分における上記基の実際の配置とは無関係である。
本発明において使用される場合、「本発明の化合物」という用語又は同様の用語は常に、一般式I又は一般式IIの化合物及びその任意のサブグループを含むと意図される。この用語はまた、その立体異性体、互変異性体、ラセミ体、代謝体、プロドラッグ若しくはプレドラッグ、塩、水和物、又は溶媒和物を指す。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、数量を特定していない単数形(singular
forms "a", "an", and "the")は文脈上他に明白に規定されない限り、複数の指示対象を含む。一例としては、「化合物」とは、1つの化合物又は2つ以上の化合物を意味する。
forms "a", "an", and "the")は文脈上他に明白に規定されない限り、複数の指示対象を含む。一例としては、「化合物」とは、1つの化合物又は2つ以上の化合物を意味する。
本発明との関連で使用される「検出可能な標識」は、機器により検出可能なシグナルを発生するシグナル発生基を包含することを意味し、当該技術において既知の好適ないかなる基であってもよい。特に、本発明による検出可能な標識は、磁気共鳴画像法、X線画像法、超音波、核医学画像法、マルチモーダル画像法、蛍光画像法、生物発光画像法、顕微鏡検査、質量検出器、波長検出器、燐光画像法、化学発光画像法等を含む一覧から選択される方法によって、機器により検出され得る基を意味する。上記検出可能な標識の存在により、本発明による化合物の可視化及び/又は検出が可能となる。特に、検出可能な標識は、放射性同位体、蛍光色素分子、MRI用造影剤(即ち、常磁性金属)、X線反応剤、及びビオチン標識又はそれらの派生物を含む群から選択されてもよい。
好適な放射性同位体は、3H、11C、13N、15O、18F、51Cr、52Fe、52mMn、55Co、60Cu、61Cu、62Zn、62Cu、63Zn、64Cu、66Ga、67Ga、68Ga、70As、71As、72As、74As、75Se、75Br、76Br、77Br、80mBr、82mBr、82Rb、86Y、88Y、89Sr、89Zr、97Ru、99mTc、110In、111In、113mIn、114mIn、117mSn、120I、122Xe、123I、124I、125I、166Ho、167Tm、169Yb、193mPt、195mPt、201Tl、203Pbを含む一覧から選択されてもよい。特定の実施態様において、検出可能な標識は、11C、18F、124I、又は125I等の小さいサイズの有機PET標識及びSPECT標識である。また、治療に使用されるようなその他の元素及び放射性同位体を適用してもよい。金属放射性核種は、例えば、当業者に既知の方法による直接的な組み込みによって、キレート剤中に好適に(suitably)組み込まれる。
好適な蛍光色素分子は、フルオレセイン、Alexa Fluor、Oregon Green、アクリジン、ダンシル、NBP、BODIPY、及びローダミンを含む、非限定的な一覧から選択されてもよい。
MRI用造影剤は、常磁性イオン又は超常磁性粒子であってもよい。常磁性イオンの例として、Gd、Fe、Mn、Cr、Co、Ni、Cu、Pr、Nd、Yb、Tb、Dy、Ho、Er、Sm、Eu、Ti、Pa、La、Sc、V、Mo、Ru、Ce及びDyを含む群から選択されてもよい。
好適なX線反応剤としては、ヨウ素、バリウム、硫酸バリウム、ガストログラフィン(gastrografin)が挙げられるがこれらに限定されず、又は、ヨウ素化合物及び/又は硫酸バリウムで満たされた小胞、リポソーム又はポリマーカプセルを含んでもよい。
本発明による化合物は種々の方法によって合成され得るが、好ましい方法の一つとしてクリックケミストリーの使用が挙げられ、特にアジドとアルキン基との反応を含む付加環化反応が挙げられる。Cu(I)塩の存在下で、最終アルキン及びアジドは1,3−双極子付加環化を経て1,4−二置換1,2,3−トリアゾールを形成する。カップリング相手としてアジド及びアルキンを選択することは、銅が存在しなければ本来的に互いに非反応性であり、その他の官能基及び反応条件に対して非常に寛容であることから、特に有益である。当業者に明らかなように、アジドは検出可能な標識に存在してもよく、アルキンは本発明の中間体化合物に存在してもよく、その逆であってもよい。従来の標識化方法に対するクリックケミストリーによるアプローチの利益は、使用される標識が異なるだけで、単一の中間体化合物から開始することが可能であり、また複数の最終化合物の合成を容易に可能とする点である。さらに、このアプローチの選択性により、化合物において予め決定された部位においてのみ結合反応が起こり、単一の予定されていた最終生成物のみが生じる。加えて、標識化反応中に形成されるトリアゾール環は加水分解(hydrolyze)されず、酸化及び還元に対して極めて安定であり、これは最終的な活性依存型プローブがin vivoにおいて非常に安定であることを意味する。
別の実施態様において、中間体及び可視化タグは、リンカー部と可視化タグとの間で共有結合を形成することが可能な予想される全ての末端(end-standing)官能基を用いて設計され得る。1つの例として、アミド結合を生じることが知られている従来的な反応環境下で連結されてアミド結合を形成することが可能な、末端カルボン酸及びアミンが挙げられる。結合形成をもたらすこれらの反応タイプに関する手順は当業者に既知である。
好ましい実施形態において、本発明は式Iの化合物を提供し、式中、以下の1つ又は複数の限定が適用される:
R1及びR2は、−H及び−NH−(C=O)−CH3を含む群から各々独立して選択され;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Lは、−(C=O)−O−R4−トリアゾール−又は−(C=O)−R4−トリアゾールであり;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
mは、1、2、3又は4であり;
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり;
oは、1、2、3又は4であり;
Yは、検出可能な標識を表す。
R1及びR2は、−H及び−NH−(C=O)−CH3を含む群から各々独立して選択され;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Lは、−(C=O)−O−R4−トリアゾール−又は−(C=O)−R4−トリアゾールであり;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
mは、1、2、3又は4であり;
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり;
oは、1、2、3又は4であり;
Yは、検出可能な標識を表す。
更なる好ましい実施態様において、本発明は式Iの化合物を提供し、式中、以下の1つ又は複数の限定が適用される:
R1及びR2は、各々−Hであり;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Lは、−(C=O)−O−R4−トリアゾール−であり;
R4は、−(CH2−CH2−O)m−(CH2)−であり;
mは、1、2又は3であり;
Yは、検出可能な標識である。
R1及びR2は、各々−Hであり;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Lは、−(C=O)−O−R4−トリアゾール−であり;
R4は、−(CH2−CH2−O)m−(CH2)−であり;
mは、1、2又は3であり;
Yは、検出可能な標識である。
更なる好ましい実施態様において、本発明は式Iの化合物を提供し、式中、以下の1つ又は複数の限定が適用される:
R1及びR2は、−H及び−NH−(C=O)−CH3を含む群から各々独立して選択され;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Lは、−(C=O)−O−CH2−CH2−CH2−トリアゾール−であり;
Yは、検出可能な標識を表す。
R1及びR2は、−H及び−NH−(C=O)−CH3を含む群から各々独立して選択され;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Lは、−(C=O)−O−CH2−CH2−CH2−トリアゾール−であり;
Yは、検出可能な標識を表す。
更なる態様において、本発明は本発明による化合物を調製する式II:
(式中、
R1及びR2は、−H、OH、−ハロ、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、−NR5R6、−(C=O)−R7及びSO2−R8を含む群から各々独立して選択され;
R5、R6、R9及びR10は、−H、−O、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル及び−(C=O)−C1〜6アルキルを含む群から各々独立して選択され;
R7及びR8は、−ハロ、−OH、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、及び−NR9R10を含む群から各々独立して選択され;
R3は、−グアニジノであり;
Aは、直接結合及びC1〜6アルキルを含む一覧から選択され;
Bは、−(C=O)−O−R4−アルキン、−(C=O)−O−R4−N3、−(C=O)−R4−アルキン、又は−(C=O)−R4−N3を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
m、n及びoは、各々独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10である)
の中間体を提供する。
R1及びR2は、−H、OH、−ハロ、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、−NR5R6、−(C=O)−R7及びSO2−R8を含む群から各々独立して選択され;
R5、R6、R9及びR10は、−H、−O、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル及び−(C=O)−C1〜6アルキルを含む群から各々独立して選択され;
R7及びR8は、−ハロ、−OH、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、及び−NR9R10を含む群から各々独立して選択され;
R3は、−グアニジノであり;
Aは、直接結合及びC1〜6アルキルを含む一覧から選択され;
Bは、−(C=O)−O−R4−アルキン、−(C=O)−O−R4−N3、−(C=O)−R4−アルキン、又は−(C=O)−R4−N3を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
m、n及びoは、各々独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10である)
の中間体を提供する。
好ましい中間体群は、式IIの化合物であり、式中、以下の1つ又は複数の限定が適用される:
R1及びR2は、−H及び−NH−(C=O)−CH3を含む群から各々独立して選択され;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Bは、−(C=O)−O−R4−アルキン、−(C=O)−O−R4−N3、−(C=O)−R4−アルキン、又は−(C=O)−R4−N3を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
mは、1、2、3又は4であり;
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり;
oは、1、2、3又は4である。
R1及びR2は、−H及び−NH−(C=O)−CH3を含む群から各々独立して選択され;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Bは、−(C=O)−O−R4−アルキン、−(C=O)−O−R4−N3、−(C=O)−R4−アルキン、又は−(C=O)−R4−N3を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
mは、1、2、3又は4であり;
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり;
oは、1、2、3又は4である。
更に好ましい中間体群は、式IIの化合物であり、式中、以下の1つ又は複数の限定が適用される:
R1及びR2は、各々−Hであり;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Bは、−(C=O)−O−R4−アルキン及び−(C=O)−O−R4−N3を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2−CH2−O)m−(CH2)−又は−(CH2)n−を含む一覧から選択され;
mは、1、2又は3であり;
nは、6である。
R1及びR2は、各々−Hであり;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Bは、−(C=O)−O−R4−アルキン及び−(C=O)−O−R4−N3を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2−CH2−O)m−(CH2)−又は−(CH2)n−を含む一覧から選択され;
mは、1、2又は3であり;
nは、6である。
更なる好ましい中間体群は、式IIの化合物であり、式中、以下の1つ又は複数の限定が適用される:
R1及びR2は、−H及び−NH−(C=O)−CH3を含む群から各々独立して選択され;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Bは、−(C=O)−O−CH2−CH2−CH2−N3及び−(C=O)−O−CH2−CH2−CH2−アルキンを含む一覧から選択される。
R1及びR2は、−H及び−NH−(C=O)−CH3を含む群から各々独立して選択され;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Bは、−(C=O)−O−CH2−CH2−CH2−N3及び−(C=O)−O−CH2−CH2−CH2−アルキンを含む一覧から選択される。
更なる目的として、本発明は、本発明による化合物を含む組成物を提供する。上記組成物の製剤化は使用される検出可能な標識のタイプに依存することが当業者に明らかである。
例えば、本発明の化合物は、遊離酸若しくは遊離塩基として、及び/又は薬学的に許容可能な酸付加塩及び/又は塩基付加塩(例えば無毒の有機若しくは無機の酸若しくは塩基を用いて得られる)の形態で、水和物、溶媒和物、及び/又は複合体の形態で、及び/又はエステルのようなプロドラッグ又はプレドラッグの形態で使用してもよい。「溶媒和物」という用語は、本明細書中で使用される場合、特に指定しない限りは、本発明の化合物により形成され得る、適切な無機溶媒(例えば水和物)、又はアルコール、ケトン、エステル等(これらに限定されない)のような有機溶媒との任意の組合せを含む。そのような塩、水和物、溶媒和物等、及びそれらの調製物は当業者には明らかであり、例えば米国特許第6,372,778号、米国特許第6,369,086号、米国特許第6,369,087号、及び米国特許第6,372,733号に記載された塩、水和物、溶媒和物等を参照する。
本発明による化合物の薬学的に許容可能な、すなわち水溶性、脂溶性、又は分散性の産物の形態の塩としては、例えば無機若しくは有機の酸若しくは塩基から形成される、従来の非毒性塩又は第4級アンモニウム塩が挙げられる。かかる酸付加塩の例としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、硫酸水素塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳酸塩、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプタン酸塩(glucoheptanoate)、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩、臭化水素塩、ヨウ化水素塩、2−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メタンスルホン酸塩、2−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、シュウ酸塩、パルモ酸塩(palmoate)、ペクチン酸塩、過硫酸塩、3−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩、及びウンデカン酸塩が挙げられる。塩基付加塩としては、アンモニウム塩、ナトリウム塩及びカリウム塩のようなアルカリ金属塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩のようなアルカリ土類金属塩、ジシクロヘキシルアミン塩、N−メチル−D−グルカミンのような有機塩基との塩、並びにアルギニン、リジンのようなアミノ酸との塩等が挙げられる。さらに、塩基性窒素含有基は、低級ハロゲン化アルキル、例えば塩化、臭化、及びヨウ化メチル、エチル、プロピル、及びブチル;例えば硫酸ジメチル、硫酸ジエチル、硫酸ジブチル、及び硫酸ジアミルのような硫酸ジアルキル;長鎖ハロゲン化物、例えば塩化、臭化、及びヨウ化デシル、ラウリル、ミリスチル、及びステアリル;臭化ベンジル及び臭化フェネチルのようなハロゲン化アラルキル等のような作用物質を用いて四級化することができる。他の薬学的に許容可能な塩としては、硫酸塩エタノール付加物(sulfate
salt ethanolate)及び硫酸塩が挙げられる。
salt ethanolate)及び硫酸塩が挙げられる。
概して、本発明の化合物は、少なくとも1つの本発明の化合物と、少なくとも1つの薬学的に許容可能な担体、希釈剤、又は賦形剤、及び/又はアジュバントとを含む医薬調製物又は医薬組成物として配合することができる。
非限定的な例によると、そのような配合物としては、経口投与、非経口投与(例えば静脈注射、筋肉注射、若しくは皮下注射、又は静脈内注入)、局所投与(眼を含む)、吸入、皮膚パッチ、インプラント、坐薬による投与等に適した形態であってもよい。そのような適切な投与形態(投与の様式に応じて固体、半固体、又は液体であってもよい)、並びにその調整に使用される方法、並びに担体、希釈剤、及び賦形剤は、当業者には明らかである。ここでも例えば米国特許第6,372,778号、米国特許第6,369,086号、米国特許第6,369,087号、及び米国特許第6,372,733号、並びにRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版のような標準的なハンドブックを参照する。
かかる調製物の幾つかの好ましいが非限定的な例としては、錠剤、ピル、散剤、ロゼンジ剤、分包剤、カシェ剤、エリキシル剤、懸濁剤、乳剤、液剤、シロップ剤、エアロゾル剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、軟ゼラチンカプセル剤及び硬ゼラチンカプセル剤、坐薬、点眼剤、無菌注射溶液、及びボーラス投与用及び/又は連続投与用の無菌包装散剤(通常使用前に再構成する)が挙げられ、これらは、それ自身そのような配合に適している担体、賦形剤及び希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカントゴム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、セルロース、(滅菌)水、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸塩及びプロピルヒドロキシ安息香酸塩、タルク、ステアリン酸マグネシウム、食用油、植物油、及び鉱物油、又はこれらの適切な混合物と共に配合してもよい。配合物は、任意に他の薬学的に活性な物質(本発明の化合物との相乗効果に導いても、又は導かなくてもよい)と、医薬配合物において一般的に用いられる他の物質、例えば滑沢剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、分散剤、崩壊剤、増量剤、充填剤、保存剤、甘味剤、香味剤、流動調節剤、放出剤等とを含有することができる。組成物もまた、例えばリポソーム又は天然ゲル若しくは合成ポリマーをベースとする親水性ポリマーマトリクスを用いて、それに含有される活性化合物(複数の場合もある)の急速な、持続した又は遅延した放出を提供するように配合してもよい。本発明による医薬組成物の化合物の溶解性及び/又は安定性を増強するために、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン若しくはγ−シクロデキストリン又はそれらの誘導体を用いることに利点があり得る。
さらに、アルコールのような共溶媒によって本化合物の溶解性及び/又は安定性を向上させることができる。水性組成物の調製において、本発明の化合物の塩を添加すれば、それらの水溶性が増加するため、より適しているとされる。
調製物は、それ自体既知の方法で調製してもよく、通常少なくとも1つの本発明による化合物を、1つ又は複数の薬学的に許容可能な担体、及び必要に応じて他の薬学的に活性な化合物と、必要であれば無菌状態下で混合することを伴う。ここでも米国特許第6,372,778号、米国特許第6,369,086号、米国特許第6,369,087号、及び米国特許第6,372,733号、並びに上述された更なる従来技術、並びにRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版のような標準的なハンドブックを参照する。
本発明の医薬調製物は、好ましくは単位用量形態であることが好ましく、例えば任意に製品情報及び/又は使用に関する指示を含む1つ又は複数の紙片の付いた、箱、ブリスター、バイアル、ビン、サチェット、アンプル又は他のいずれかの適切な単回投与又は複数回投与用のホルダー又は容器(適切なラベルを付けてもよい)の中に適切に入れることができる。一般的にそのような単位用量は、少なくとも1つの本発明の化合物を、1mg〜1000mg、通常5mg〜500mg含有しており、例えば1単位用量当たり約10mg、25mg、50mg、100mg、200mg、300mg又は400mgである。
化合物は、主に使用される具体的な調製物、及び治療又は予防対象の病態に応じて、経口経路、経直腸経路、経眼経路、経皮経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、又は鼻腔内経路を含む様々な経路によって投与することができ、経口投与及び静脈内投与が通常は好ましい。少なくとも1つの本発明の化合物は、一般的に「効果的な量」投与されるが、その意味は、適切な投与を行った場合、投与された個体において所望の治療効果又は予防効果を達成するために十分な式I〜式IIの化合物の任意の量を意味する。通常予防又は治療対象の病態及び投与経路によって、このような効果的な量は、通常、1日につき患者の体重1kg当たり、0.01mg〜1000mgであり、より多くの場合0.1mg〜500mg、例えば1mg〜250mg、例としては、1日につき患者の体重1kg当たり、約5mg、10mg、20mg、50mg、100mg、150mg、200mg又は250mgであり、毎日1回の服用で、1回若しくは複数回の服用に分けて、又は例えば点滴を用いて本質的に連続的に投与することができる。投与量(複数の場合もある)、投与経路及び更なる治療レジメンは、患者の年齢、性別及び全身状態、並びに治療対象の疾患/症状の性質及び重症度に応じて、治療を行う臨床医によって決定することができる。ここでも米国特許第6,372,778号、米国特許第6,369,086号、米国特許第6,369,087号、及び米国特許第6,372,733号、並びに上述された更なる従来技術、並びにRemington's Pharmaceutical Sciencesの最新版のような標準的なハンドブックを参照する。
本発明の方法に従って、上記医薬組成物は治療中の異なる時間に別々に、又は分けて若しくは単一の混合形態で同時に投与することができる。本発明はそれ故、同時又は交互に全てのそのような治療計画を包含すると理解されるべきであり、「投与する」という用語はそれに従って解釈されるべきである。
経口投与形態については、本発明の組成物は、賦形剤、安定剤又は不活性希釈剤のような適切な添加剤と混合し、通例の方法によって、錠剤、コーティング錠、硬カプセル、水溶液、アルコール溶液又は油性溶液のような適切な投与形態にすることができる。適切な不活性担体としては、アラビアゴム、マグネシア、炭酸マグネシウム、リン酸カリウム、ラクトース、グルコース、又はデンプン、特にコーンスターチが挙げられる。この場合、調製は乾燥又は湿った顆粒の両方で行うことができる。適切な油性の賦形剤又は溶剤は、ひまわり油又はタラ肝油のような植物油又は動物油である。水溶液又はアルコール溶液に適した溶媒は水、エタノール、糖液、又はそれらの混合物である。ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールは、他の投与形態用の更なる補助剤としても有用である。即時型放出錠剤に関しては、これらの組成物は、微結晶セルロース、リン酸二カルシウム、デンプン、ステアリン酸マグネシウム及びラクトース、及び/又は当該技術分野で知られている他の賦形剤、結合剤、増量剤、崩壊剤、希釈剤及び滑沢剤を含有してもよい。
経鼻エアロゾル又は吸入によって投与される場合は、これらの組成物は、医薬配合の分野において既知の技法に従って調製することができ、ベンジルアルコール又は他の適切な保存剤、生体内利用性を増強させる吸収促進剤、フッ化炭素類、及び/又は当該技術分野で既知の他の可溶化剤又は分散剤を用いて生理食塩水溶液として調製することができる。エアロゾル又は噴霧剤の形態の投与に適切な医薬配合物は、例えば、薬学的に許容可能な溶媒、例えばエタノール又は水若しくはそのような溶媒の混合液中における本発明の化合物又はそれらの生理学的に許容可能な塩の溶液、懸濁液又は乳濁液である。必要に応じて、配合物はまた、界面活性剤、乳化剤及び安定剤、並びに噴射剤のような他の医薬補助剤を更に含有することができる。
皮下投与に関しては、本発明による化合物を、必要に応じて、溶解剤、乳化剤、又は更なる補助剤のような、それに通常使用される物質と共に溶液、懸濁液、又はエマルションにする。本発明の化合物をまた、凍結乾燥することもでき、得られる凍結乾燥物は、例えば注射又は点滴の調製物の生産に用いることができる。適切な溶媒としては、例えば、水、生理的食塩水、若しくはアルコール、例えば、エタノール、プロパノール、グリセロール、更にグルコース溶液若しくはマンニトール溶液のような糖溶液、又はその代わりに、言及した種々の溶媒の混合物が挙げられる。注射溶液又は懸濁液は、マンニトール、1,3−ブタンジオール、水、リンガー液又は等張塩化ナトリウム溶液のような適切な非毒性の非経口的に許容可能な希釈剤若しくは溶媒を用いて、又は合成モノグリセリド若しくはジグリセリドを含む無菌の無刺激性不揮発油及びオレイン酸を含む脂肪酸のような適切な分散剤又は湿潤剤及び懸濁化剤を用いて既知の当該技術分野に従って配合することができる。
坐薬の形態で経直腸投与を行う場合、これらの配合物は、本発明による化合物を、常温では固体であるが、直腸腔で液化及び/又は溶解し薬剤を放出する、ココアバター、合成グリセリドエステル、又はポリエチレングリコールのような適切な無刺激性の賦形剤と混合することにより調製することができる。
本発明は、以下の様々な目的に対して本発明による化合物及び/又は組成物を提供することを目的とするが、これらに限定されない:
種においてトリプシン様プロテアーゼ活性を検出すること。
種においてトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素活性を解析すること。
種においてトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素活性を可視化すること。
ヒト又は動物のがん細胞、特にトリプシン様セリンプロテアーゼを発現しているがん細胞を可視化すること。
種においてトリプシン様プロテアーゼ活性を検出すること。
種においてトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素活性を解析すること。
種においてトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素活性を可視化すること。
ヒト又は動物のがん細胞、特にトリプシン様セリンプロテアーゼを発現しているがん細胞を可視化すること。
本発明において使用される「種」という用語は、タンパク質含有材料、細胞溶解物、細胞、組織溶解物、組織、動物及びヒトを包含することを意味する。
本発明において使用される「セリンプロテアーゼ」という用語は、プロテアーゼ(タンパク質におけるペプチド結合を切断する酵素)であって、その酵素の活性部位における少なくとも1つのアミノ酸がセリンであるプロテアーゼを包含することを意味する。一般的に、セリンプロテアーゼは、それらの構造的相同性に基づいてファミリーに分けることができ、更に配列類似性に基づいてサブグループ(例えば(キモ)トリプシン様プロテアーゼグループ)に分けられることが知られている。
好ましい実施態様において、トリプシン様セリンプロテアーゼは、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)であり、ウロキナーゼとしても知られている。これは、血液又は細胞外マトリクス等の幾つかの生理学的な場所において発現するプロテアーゼである。その主な基質は、セリンプロテアーゼプラスミンの不活性形である、プラスミノーゲンである。血栓溶解及び細胞外マトリクスの分解におけるその役割により、uPAは、血管疾患及びがんに関与すると考えられている。したがって、本発明による化合物及び組成物は、uPAを発現するがん細胞の検出、解析及び可視化に非常に好適である。
本発明の更なる態様は、
ヒト又は動物においてがん細胞を可視化する方法であって、上記ヒト又は動物に本発明による化合物又は組成物を投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含む、方法;
種において活性トリプシン様セリンプロテアーゼを可視化する方法であって、上記種に本発明による化合物又は組成物を投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含む、方法;
種においてトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害することを目的とする治療の効果をモニタリングする方法であって、本発明による化合物又は組成物を種々の時間点(即ち、治療前、治療中及び/又は治療後)に上記種に投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含み、発生するシグナルの経時的な減少が、上記治療が効果的であることを示す、方法;
を提供することである。
ヒト又は動物においてがん細胞を可視化する方法であって、上記ヒト又は動物に本発明による化合物又は組成物を投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含む、方法;
種において活性トリプシン様セリンプロテアーゼを可視化する方法であって、上記種に本発明による化合物又は組成物を投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含む、方法;
種においてトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害することを目的とする治療の効果をモニタリングする方法であって、本発明による化合物又は組成物を種々の時間点(即ち、治療前、治療中及び/又は治療後)に上記種に投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含み、発生するシグナルの経時的な減少が、上記治療が効果的であることを示す、方法;
を提供することである。
下記実施例において提示される反応模式図に従って、本発明の化合物を調製することができるが、当業者であれば、これらは本発明の一例にすぎず、有機化学分野における当業者によって通常使用される標準的な各合成プロセスのいずれによっても本発明の化合物を調製可能であることが十分理解できるであろう。
本発明をここで、以下の合成例及び生物学的例を用いて説明するが、これらは本発明の範囲を何ら限定するものではない。
図2は、クリッカブルプローブ及び官能化プローブを得るのに一般的な合成ストラテジーの概要を説明する。このプローブを合成するための主要な反応は、Birum−Oleksyszyn反応である。この反応は、アルデヒド、カルバメート、亜リン酸塩及び触媒を必要とする。触媒としてルイス酸を使用する場合、この分子は酸に不安定なBoc保護基を含んでもよい38。この反応において種々のカルバメートを使用することにより、ベンジルグアニジン基を保持したまま、種々の側鎖を導入する機会が与えられる。カルバメート系中間体がアジド又はアルキン官能基を含有する場合、得られるプローブ(クリッカブルプローブ)を種々の可視化タグ(例えば、ローダミン、ビオチン)に共役させることができる。これは、uPAの標識化及び可視化に使用することができる官能化プローブをもたらす。
模式図1は、試薬としてトリクロロアセチルイソシアネートを使用して、種々のカルバメートの合成を示す。アルコール(中間体4〜6、10、13、17、18、23)を対応するカルバメート(中間体7〜9、11、14、19、20、24)に変換する。これらのアルコールはそのようにしてもたらされるか、又は求核置換反応を介して商業的に入手可能なエチレングリコール及びハロゲン化アルキルアルコールから作製された。
デス−マーチンペルヨージナン(periodinane)(模式図2)によって対応するBoc保護アルコール(中間体26)から調製されたBoc保護4−アミノフェニルアセトアルデヒド(中間体27)を、種々のカルバメートと共にアミドアルキル化反応において使用し、ジアリールホスホネート(中間体28〜36)を得た。Boc保護基の酸分解による(acidolytic)除去の後(中間体37〜45)、N,N’−ビス(tert−ブトキシカルボニル)−1−グアニルピラゾールを使用して保護グアニジン基を導入した(中間体46〜54)。Boc脱保護により中間体55〜63が提供された。
模式図3は、例示的な可視化タグとして使用され、クリッカブルプローブの共役可能性を示す、種々の可視化タグ(ローダミン、ビオチン、BODIPY及び4−フルオロベンズアミド)の合成を示す。
既知文献の手順39によって、ピペラジンローダミン(中間体67)を合成した。その文献の著者らは、仕上げにフラッシュクロマトグラフィーは不要であると言及していたが、本発明者らはフラッシュクロマトグラフィーを用いずに純粋化合物を得ることができなかった。8−アジドオクタン酸(中間体65)とのカップリングにより、アジド−ローダミン(中間体68)を得た。
ビオチンと、DCC及びN−ヒドロキシスクシンイミドとの反応によって、活性化されたビオチン−エステル(中間体71)が2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エタンアミンと容易に反応して、アジド−ビオチン(中間体72)を生じさせることができる。
2つの2,4−ジメチル−ピロール単位と、アシルクロリド(中間体69)と、BF3との縮合は、所望のアジド−BODIPY(中間体73)を与える。
5つ目の合成可能な標識はCy5である。合成はJung他によって説明され、アジドリンカーによって更に修飾することができる(Michael E. Jung and Wan-Joong Kim, Bioorganic & Medicinal
Chemistry, 2006, 14, 92-97)。
Chemistry, 2006, 14, 92-97)。
試薬及び条件:(a)NaH、プロパルギルブロミド、THF (b)i)トリクロロアセチルイソシアネート、DCM ii)K2CO3、MeOH、H2O (c)NaN3、H2O、Δ (d)TsCl、TEA、DCM (e)NaN3、CH3CN、Δ
試薬及び条件:(a)(Boc)2O、TEA、ジオキサン (b)デス−マーチンペルヨージナン、DCM (c)中間体7〜9;11;14;19;20;24、Cu(OTf)2、28〜35に対してトリフェニルホスファイト、DCM、36に対してトリパラセタモールホスファイト、THF (d)TFA、DCM (e)TEA、DCM、54に対してN,N’−ビス(tert−ブトキシカルボニル)−1−グアニルピラゾール DCM/アセトニトリル(1/1)
試薬及び条件:(a)NaN3、DMF、Δ (b)オキサリルクロリド、DMF (c)Al(Me)3、ピペラジン、DCM、Δ (d)TBTU、TEA、中間体65、DMF (e)DCC、N−ヒドロキシスクシンイミド、DMF (f)TEA、74、DMF (g)2,4−ジメチル−ピロール、BF3、DIPEA (h)N−スクシンイミジル−4−フルオロベンゾエート、TEA、DCM (i)2−アジドエチルアミン、TBTU、DIPEA、DMF
実験部
Sigma-Aldrich、Acros又はFluorochemより試薬を入手した。全化合物の特徴付けは、1H NMR及び質量分析法によって実施した。1H NMRスペクトルを400MHz Bruker Avance III nanobayスペクトロメーターで記録した。ES質量スペクトルを、Bruker DaltonicsからのEsquire 3000plusイオントラップ質量分析計より取得した。以下のいずれかの方法を用いて純度を確認した:質量検出器又はUV検出器を用いたHPLCシステム。水(A)及びCH3CN(B)を溶離液として使用した。MS検出器としてのEsquire 3000plusと連結されたAlltech Prevail C18カラム(2.1×50mm、3μm)を用い、0.2mL/分の流速で5%から100%のB、20分間の勾配を用いて、Agilent 1100シリーズHPLCシステムでLC−MSスペクトルを記録した。ギ酸0.1%を溶媒A及び溶媒Bに添加した。Ultrasphere ODSカラム(4.6×250mm、5μm)を備えたGilsonの機器で逆相HPLCを行った。1mL/分の流速で10%から100%のB、35分間の勾配を用いた。トリフルオロ酢酸0.1%を溶媒A及び溶媒Bに添加した。波長は214nmを使用した。必要に応じて、Flashmaster II(Jones chromatography)上でのフラッシュクロマトグラフィーにより、生成物を精製した。
Sigma-Aldrich、Acros又はFluorochemより試薬を入手した。全化合物の特徴付けは、1H NMR及び質量分析法によって実施した。1H NMRスペクトルを400MHz Bruker Avance III nanobayスペクトロメーターで記録した。ES質量スペクトルを、Bruker DaltonicsからのEsquire 3000plusイオントラップ質量分析計より取得した。以下のいずれかの方法を用いて純度を確認した:質量検出器又はUV検出器を用いたHPLCシステム。水(A)及びCH3CN(B)を溶離液として使用した。MS検出器としてのEsquire 3000plusと連結されたAlltech Prevail C18カラム(2.1×50mm、3μm)を用い、0.2mL/分の流速で5%から100%のB、20分間の勾配を用いて、Agilent 1100シリーズHPLCシステムでLC−MSスペクトルを記録した。ギ酸0.1%を溶媒A及び溶媒Bに添加した。Ultrasphere ODSカラム(4.6×250mm、5μm)を備えたGilsonの機器で逆相HPLCを行った。1mL/分の流速で10%から100%のB、35分間の勾配を用いた。トリフルオロ酢酸0.1%を溶媒A及び溶媒Bに添加した。波長は214nmを使用した。必要に応じて、Flashmaster II(Jones chromatography)上でのフラッシュクロマトグラフィーにより、生成物を精製した。
中間体の合成
反応手順A
中間体4:2−(プロパ−2−イニルオキシ)エタノール
0℃にて30分間に亘り、THF(80ml)中の水素化ナトリウム(45.9mmol)の溶液にTHF(100ml)中のエタン−1,2−ジオール(182mmol)を滴加した。この溶液を室温で2時間撹拌した。3−ブロモプロパ−1−イン(41.8mmol)を添加し、この溶液を一晩還流した後、水(80ml)を添加した。溶媒を蒸発させ、EtOAc(4×100ml)を用いて抽出した。混合された有機層をブラインにより洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、真空下で濃縮濾過した。得られた混合物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した(100%ヘキサンからヘキサン中40%EtOAc)。
収率:40%
MS(ESI)m/z 123 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ1.9(br s,1H)、2.44(t,J=2.4Hz,1H)、3.64(t,J=4.4Hz,2H)、3.76(t,J=4.4Hz,2H)、4.20(d,J=2.4Hz,2H)
反応手順A
中間体4:2−(プロパ−2−イニルオキシ)エタノール
0℃にて30分間に亘り、THF(80ml)中の水素化ナトリウム(45.9mmol)の溶液にTHF(100ml)中のエタン−1,2−ジオール(182mmol)を滴加した。この溶液を室温で2時間撹拌した。3−ブロモプロパ−1−イン(41.8mmol)を添加し、この溶液を一晩還流した後、水(80ml)を添加した。溶媒を蒸発させ、EtOAc(4×100ml)を用いて抽出した。混合された有機層をブラインにより洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、真空下で濃縮濾過した。得られた混合物をフラッシュクロマトグラフィーにより精製した(100%ヘキサンからヘキサン中40%EtOAc)。
収率:40%
MS(ESI)m/z 123 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ1.9(br s,1H)、2.44(t,J=2.4Hz,1H)、3.64(t,J=4.4Hz,2H)、3.76(t,J=4.4Hz,2H)、4.20(d,J=2.4Hz,2H)
以下の中間体を同様の方法によって調製した:
中間体5:2−(2−(プロパ−2−イニルオキシ)エトキシ)エタノール
収率:36%
MS(ESI)m/z 167 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 2.44(t,J=2.4Hz,1H)、3.62(t,J=4.4Hz,2H)、3.69〜3.77(m,6H)、4.22(d,J=2.4Hz,2H)
中間体5:2−(2−(プロパ−2−イニルオキシ)エトキシ)エタノール
収率:36%
MS(ESI)m/z 167 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 2.44(t,J=2.4Hz,1H)、3.62(t,J=4.4Hz,2H)、3.69〜3.77(m,6H)、4.22(d,J=2.4Hz,2H)
中間体6:2−(2−(2−(プロパ−2−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)エタノール
収率:41%
MS(ESI)m/z 211.0 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 2.28(br s,1H)、2.44(t,J=2.4Hz,1H)、3.62〜3.75(m,12H)、4.21(d,J=2Hz,2H)
収率:41%
MS(ESI)m/z 211.0 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 2.28(br s,1H)、2.44(t,J=2.4Hz,1H)、3.62〜3.75(m,12H)、4.21(d,J=2Hz,2H)
反応手順B
中間体7:2−(プロパ−2−イニルオキシ)エチルカルバメート
0℃にて、2,2,2−トリクロロアセチルイソシアネート(isocyanate)(10.79mmol)を、乾燥DCM(50ml)中の2−(プロパ−2−イニルオキシ)エタノール(中間体4)(8.99mmol)の溶液に添加した。室温にて1時間撹拌した後、溶媒を蒸発させ、反応混合物をMeOH30ml及び水3ml中に溶解した。K2CO3(15.46mmol)を添加し、反応物を一晩撹拌した。MeOHを蒸発させ、水(50ml)を添加した。この水層を、EtOAcを用いて2度抽出した。有機層を混合し、ブラインで洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして蒸発させた。黄色の油性液体を得た。
収率:79%
MS(ESI)m/z 182 [M+K]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 2.45(t,J=2.4Hz,1H)、3.75(t,J=4.4Hz,2H)、4.21(d,J=2Hz,2H)、4.26(t,J=4.4Hz,2H)、4.79(br s,2H)
中間体7:2−(プロパ−2−イニルオキシ)エチルカルバメート
0℃にて、2,2,2−トリクロロアセチルイソシアネート(isocyanate)(10.79mmol)を、乾燥DCM(50ml)中の2−(プロパ−2−イニルオキシ)エタノール(中間体4)(8.99mmol)の溶液に添加した。室温にて1時間撹拌した後、溶媒を蒸発させ、反応混合物をMeOH30ml及び水3ml中に溶解した。K2CO3(15.46mmol)を添加し、反応物を一晩撹拌した。MeOHを蒸発させ、水(50ml)を添加した。この水層を、EtOAcを用いて2度抽出した。有機層を混合し、ブラインで洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、そして蒸発させた。黄色の油性液体を得た。
収率:79%
MS(ESI)m/z 182 [M+K]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 2.45(t,J=2.4Hz,1H)、3.75(t,J=4.4Hz,2H)、4.21(d,J=2Hz,2H)、4.26(t,J=4.4Hz,2H)、4.79(br s,2H)
以下の中間体を同様の方法によって調製した:
中間体8:2−(2−(プロパ−2−イニルオキシ)エトキシ)エチルカルバメート
収率:74%
MS(ESI)m/z 226 [M+K]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 2.40(t,J=2.4Hz,1H)、3.65(m,6H)、4.20(m,4H)、4.90(br s,2H)
中間体8:2−(2−(プロパ−2−イニルオキシ)エトキシ)エチルカルバメート
収率:74%
MS(ESI)m/z 226 [M+K]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 2.40(t,J=2.4Hz,1H)、3.65(m,6H)、4.20(m,4H)、4.90(br s,2H)
中間体9:2−(2−(2−(プロパ−2−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)エチルカルバメート
収率:84%
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 2.44(t,J=2.4Hz,1H)、3.68(m,10H)、4.22(m,4H)、4.95(br s,2H)
収率:84%
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 2.44(t,J=2.4Hz,1H)、3.68(m,10H)、4.22(m,4H)、4.95(br s,2H)
中間体11:ペンタ−4−イニルカルバメート
収率:65%
1H−NMR(400MHz,CDCl3):δ 1.87(q,J=6.8Hz,2H)、1.98(t,J=2.8Hz,1H)、2.3(dt,J=2.8Hz及びJ=6.8Hz,2H)、4.23(t,J=6.4Hz,2H)、10.82(br s,2H)
収率:65%
1H−NMR(400MHz,CDCl3):δ 1.87(q,J=6.8Hz,2H)、1.98(t,J=2.8Hz,1H)、2.3(dt,J=2.8Hz及びJ=6.8Hz,2H)、4.23(t,J=6.4Hz,2H)、10.82(br s,2H)
中間体14:6−アジドヘキシルカルバメート
収率:68%
MS(ESI)m/z 209.2 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 1.39(m,4H)、1.63(m,4H)、3.27(t,J=6.8Hz,2H)、4.06(t,J=6.8Hz,2H)、4.59(br s,2H)
収率:68%
MS(ESI)m/z 209.2 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 1.39(m,4H)、1.63(m,4H)、3.27(t,J=6.8Hz,2H)、4.06(t,J=6.8Hz,2H)、4.59(br s,2H)
中間体19:2−(2−アジドエトキシ)エチルカルバメート
収率:88%
MS(ESI)m/z 197.1 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 3.39(t,J=4.8Hz,2H)、3.69(m,4H)、4.24(t,J=4.4Hz,2H)、4.79(br s,2H)
収率:88%
MS(ESI)m/z 197.1 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 3.39(t,J=4.8Hz,2H)、3.69(m,4H)、4.24(t,J=4.4Hz,2H)、4.79(br s,2H)
中間体20:2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エチルカルバメート
収率:80%
MS(ESI)m/z 241.2 [M+Na]+、257.1 [M+K]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 3.40(t,J=5.2Hz,2H)、3.70(m,8H)、4.23(m,2H)、4.82(br s,2H)
収率:80%
MS(ESI)m/z 241.2 [M+Na]+、257.1 [M+K]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 3.40(t,J=5.2Hz,2H)、3.70(m,8H)、4.23(m,2H)、4.82(br s,2H)
中間体24:2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチルカルバメート
収率:70%
MS(ESI)m/z 285.2 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 3.39(t,J=5.2Hz,2H)、3.67(m,12H)、4.23(m,2H)、4.81(br s,2H)
収率:70%
MS(ESI)m/z 285.2 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 3.39(t,J=5.2Hz,2H)、3.67(m,12H)、4.23(m,2H)、4.81(br s,2H)
反応手順C
中間体13:6−アジドヘキサン−1−オール
水(10ml)中の6−ブロモヘキサン−1−オール(中間体12)(5.52mmol)の溶液に、アジ化ナトリウム(27.6mmol)を添加し、90℃にて3時間撹拌した。この混合物を室温まで冷却し、2N HClで処理した。この水性溶液を、EtOAc、ブラインを用いて抽出(3回)し、Na2SO4上で乾燥させた。真空下で溶媒を除去し、淡黄色油を得て、それをそれ以上の精製を行わずに次の工程において使用した。
収率:81%
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 1.41(m,6H)、1.61(m,4H)、3.27(t,J=6.8Hz,2H)、3.65(t,J=6.4Hz,2H)
中間体13:6−アジドヘキサン−1−オール
水(10ml)中の6−ブロモヘキサン−1−オール(中間体12)(5.52mmol)の溶液に、アジ化ナトリウム(27.6mmol)を添加し、90℃にて3時間撹拌した。この混合物を室温まで冷却し、2N HClで処理した。この水性溶液を、EtOAc、ブラインを用いて抽出(3回)し、Na2SO4上で乾燥させた。真空下で溶媒を除去し、淡黄色油を得て、それをそれ以上の精製を行わずに次の工程において使用した。
収率:81%
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 1.41(m,6H)、1.61(m,4H)、3.27(t,J=6.8Hz,2H)、3.65(t,J=6.4Hz,2H)
以下の中間体を同様の方法によって調製した:
中間体17:2−(2−アジドエトキシ)エタノール
収率:80%
MS(ESI)m/z 154.1 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 2.27(br s,1H)、3.41(t,J=5.2Hz,2H)、3.62(t,J=4.8Hz,2H)、3.70(t,J=4.8Hz,2H)、3.76(t,J=4.8Hz,2H)
中間体17:2−(2−アジドエトキシ)エタノール
収率:80%
MS(ESI)m/z 154.1 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 2.27(br s,1H)、3.41(t,J=5.2Hz,2H)、3.62(t,J=4.8Hz,2H)、3.70(t,J=4.8Hz,2H)、3.76(t,J=4.8Hz,2H)
中間体18:2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エタノール
収率:82%
MS(ESI)m/z 198.1 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 2.36(t,J=6Hz,1H)、3.40(t,J=5.2Hz,2H)、3.62(t,J=4.4Hz,2H)、3.68(m,6H)、3.73(m,2H)
収率:82%
MS(ESI)m/z 198.1 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 2.36(t,J=6Hz,1H)、3.40(t,J=5.2Hz,2H)、3.62(t,J=4.4Hz,2H)、3.68(m,6H)、3.73(m,2H)
反応手順D
中間体22:2−(2−(2−(2−ヒドロキシエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル4−メチルベンゼンスルホネート
2,2’−(2,2’−オキシビス(エタン−2,1−ジイル)ビス(オキシ))ジエタノール(中間体21)(40.0mmol)及びTEA(20.00mmol)をDCM(50ml)に溶解した。その後、トシル−Cl(1.907g、10.00mmol)を一度に添加した。得られた混合物を室温にて1時間撹拌した。この混合物を1M KHSO4及び5%NaHCO3を用いて洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過した。溶媒の蒸発後、黄色油が形成された。
収率:72%
MS(ESI)m/z 371.3 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 2.34(br s,1H)、2.45(s,3H)、3.55〜3.73(m,14H)、4.17(t,2H)、7.33(d,J=8.4Hz,2H)、7.80(d,J=8.4Hz,2H)
中間体22:2−(2−(2−(2−ヒドロキシエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル4−メチルベンゼンスルホネート
2,2’−(2,2’−オキシビス(エタン−2,1−ジイル)ビス(オキシ))ジエタノール(中間体21)(40.0mmol)及びTEA(20.00mmol)をDCM(50ml)に溶解した。その後、トシル−Cl(1.907g、10.00mmol)を一度に添加した。得られた混合物を室温にて1時間撹拌した。この混合物を1M KHSO4及び5%NaHCO3を用いて洗浄し、Na2SO4上で乾燥させ、濾過した。溶媒の蒸発後、黄色油が形成された。
収率:72%
MS(ESI)m/z 371.3 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 2.34(br s,1H)、2.45(s,3H)、3.55〜3.73(m,14H)、4.17(t,2H)、7.33(d,J=8.4Hz,2H)、7.80(d,J=8.4Hz,2H)
反応手順E
中間体23:2−(2−(2−(2−アジエトキシ)エトキシ)エトキシ)エタノール
アセトニトリル(10ml)中の2−(2−(2−(2−ヒドロキシエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチルメタンスルホネート(中間体22)(1.836mmol)の溶液に、アジ化ナトリウム(9.18mmol)を添加し、23時間に亘り還流した。溶媒を蒸発させ、EtOAc(50ml)及び水(50ml)を添加した。有機層を混合し、2N HCl及びブラインで洗浄し、Na2SO4上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、油性生成物として中間体23を得た。
収率:77%
MS(ESI)m/z 242.2 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 2.25(br s,1H)、3.39(t,J=5.2Hz,2H)、3.61(t,J=4.8Hz,2H)、3.68(m,10H)、3.73(t,J=4.8Hz,2H)
中間体23:2−(2−(2−(2−アジエトキシ)エトキシ)エトキシ)エタノール
アセトニトリル(10ml)中の2−(2−(2−(2−ヒドロキシエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチルメタンスルホネート(中間体22)(1.836mmol)の溶液に、アジ化ナトリウム(9.18mmol)を添加し、23時間に亘り還流した。溶媒を蒸発させ、EtOAc(50ml)及び水(50ml)を添加した。有機層を混合し、2N HCl及びブラインで洗浄し、Na2SO4上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去し、油性生成物として中間体23を得た。
収率:77%
MS(ESI)m/z 242.2 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 2.25(br s,1H)、3.39(t,J=5.2Hz,2H)、3.61(t,J=4.8Hz,2H)、3.68(m,10H)、3.73(t,J=4.8Hz,2H)
反応手順F
中間体26:tert−ブチル4−(2−ヒドロキシエチル)フェニルカルバメート
ジオキサン100ml中の2−(4−アミノフェニル)エタノール(中間体25)(87mmol)の溶液に、トリエチルアミン(87mmol)及びBoc2O(96mmol)を添加した。その混合物を、室温にて一晩撹拌した。その溶液を真空下で濃縮し、EtOAcに溶解し、2N HCl、飽和NaHCO3及びブラインの溶液で洗浄した。有機層をNa2SO4上で乾燥した。フラッシュクロマトグラフィー(100%ヘキサンから100%EtOAc)によって精製物を取得した。
収率:50%
MS(ESI)m/z 260 [M+Na]+、275.90 [M+K]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 1.5(s,9H)、2.83(t,J=6.4Hz,2H)、3.83(t,J=6.4Hz,2H)、6.4(s,1H)、7.15(d,J=8.4Hz,2H)、7.30(d,J=8.4Hz,2H)
中間体26:tert−ブチル4−(2−ヒドロキシエチル)フェニルカルバメート
ジオキサン100ml中の2−(4−アミノフェニル)エタノール(中間体25)(87mmol)の溶液に、トリエチルアミン(87mmol)及びBoc2O(96mmol)を添加した。その混合物を、室温にて一晩撹拌した。その溶液を真空下で濃縮し、EtOAcに溶解し、2N HCl、飽和NaHCO3及びブラインの溶液で洗浄した。有機層をNa2SO4上で乾燥した。フラッシュクロマトグラフィー(100%ヘキサンから100%EtOAc)によって精製物を取得した。
収率:50%
MS(ESI)m/z 260 [M+Na]+、275.90 [M+K]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 1.5(s,9H)、2.83(t,J=6.4Hz,2H)、3.83(t,J=6.4Hz,2H)、6.4(s,1H)、7.15(d,J=8.4Hz,2H)、7.30(d,J=8.4Hz,2H)
反応手順G
中間体27:tert−ブチル4−(2−オキソエチル)フェニルカルバメート
DCM(50ml)中のデス−マーチンペルヨージナン(31.0mmol)の撹拌溶液に、tert−ブチル4−(2−ヒドロキシエチル)フェニルカルバメート(中間体26)(20.65mmol)を添加した。溶液を、室温にて4時間撹拌した。得られた溶液を、1時間に亘って、激しく撹拌されている飽和NaHCO3及びNa2S2O3溶液(1:1;各100ml)へと注いだ。有機層を分離し、ブラインで洗浄して、Na2SO4上で乾燥した。溶媒を蒸発させて褐色の油性生成物が形成された。
収率:89%
MS(ESI)m/z 257.90 [M+Na]+、290 [M+Na+CH3OH]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 1.5(s,9H)、3.6(d,J=2.4Hz,2H)、7.1(d,J=8.4Hz,2H)、7.35(d,J=8.4Hz,2H)、9.7(t,J=2.4Hz,1H)
中間体27:tert−ブチル4−(2−オキソエチル)フェニルカルバメート
DCM(50ml)中のデス−マーチンペルヨージナン(31.0mmol)の撹拌溶液に、tert−ブチル4−(2−ヒドロキシエチル)フェニルカルバメート(中間体26)(20.65mmol)を添加した。溶液を、室温にて4時間撹拌した。得られた溶液を、1時間に亘って、激しく撹拌されている飽和NaHCO3及びNa2S2O3溶液(1:1;各100ml)へと注いだ。有機層を分離し、ブラインで洗浄して、Na2SO4上で乾燥した。溶媒を蒸発させて褐色の油性生成物が形成された。
収率:89%
MS(ESI)m/z 257.90 [M+Na]+、290 [M+Na+CH3OH]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 1.5(s,9H)、3.6(d,J=2.4Hz,2H)、7.1(d,J=8.4Hz,2H)、7.35(d,J=8.4Hz,2H)、9.7(t,J=2.4Hz,1H)
反応手順H
中間体28:2−(プロパ−2−イン−1−イルオキシ)エチル(2−(4−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)フェニル)−1−(ジフェノキシホルフォリル)エチル)カルバメート
DCM(25ml)中のtert−ブチル4−(2−オキソエチル)フェニルカルバメート(中間体27)(6.99mmol)及び2−(プロパ−2−イニルオキシ)エチルカルバメート(中間体7)(6.99mmol)の溶液に、トリフェニルホスファイト(6.99mmol)及びCu(OTf)2(0.699mmol)を添加した。反応混合物を、室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗混合物を少量のMeOHに溶解した。−20℃で溶液を保存することにより沈殿を得た。沈殿を濾別した。
収率:44%
MS(ESI)m/z 617 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.5(s,9H)、2.4(t,J=2.4Hz,1H)、2.4〜3.55(m,1H)、3.3〜3.4(m,1H)、3.6(s,2H)、4.1〜4.2(m,4H)、4.65〜4.77(m,1H)、5.03〜4.10(d,J=11.2Hz,1H)、6.41(s,1H)、7.10〜7.36(m,14H)
中間体28:2−(プロパ−2−イン−1−イルオキシ)エチル(2−(4−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)フェニル)−1−(ジフェノキシホルフォリル)エチル)カルバメート
DCM(25ml)中のtert−ブチル4−(2−オキソエチル)フェニルカルバメート(中間体27)(6.99mmol)及び2−(プロパ−2−イニルオキシ)エチルカルバメート(中間体7)(6.99mmol)の溶液に、トリフェニルホスファイト(6.99mmol)及びCu(OTf)2(0.699mmol)を添加した。反応混合物を、室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗混合物を少量のMeOHに溶解した。−20℃で溶液を保存することにより沈殿を得た。沈殿を濾別した。
収率:44%
MS(ESI)m/z 617 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.5(s,9H)、2.4(t,J=2.4Hz,1H)、2.4〜3.55(m,1H)、3.3〜3.4(m,1H)、3.6(s,2H)、4.1〜4.2(m,4H)、4.65〜4.77(m,1H)、5.03〜4.10(d,J=11.2Hz,1H)、6.41(s,1H)、7.10〜7.36(m,14H)
以下の中間体を同様の方法によって調製した:
中間体29:2−(2−(プロパ−2−イン−1−イルオキシ)エトキシ)エチル(2−(4−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)フェニル)−1−(ジフェノキシホルフォリル)エチル)カルバメート
収率:43%
MS(ESI)m/z 661.4 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.5(s,9H)、2.4(t,J=2.4Hz,1H)、2.9〜3.05(m,1H)、3.3〜3.4(m,1H)、3.55〜4.15(m,8H)、4.2(d,J=2.4Hz,2H)、4.65〜4.75(m,1H)、5.10〜5.16(d,J=10.4Hz,1H)、6.47(s,1H)、7.10〜7.35(m,14H)
中間体29:2−(2−(プロパ−2−イン−1−イルオキシ)エトキシ)エチル(2−(4−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)フェニル)−1−(ジフェノキシホルフォリル)エチル)カルバメート
収率:43%
MS(ESI)m/z 661.4 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.5(s,9H)、2.4(t,J=2.4Hz,1H)、2.9〜3.05(m,1H)、3.3〜3.4(m,1H)、3.55〜4.15(m,8H)、4.2(d,J=2.4Hz,2H)、4.65〜4.75(m,1H)、5.10〜5.16(d,J=10.4Hz,1H)、6.47(s,1H)、7.10〜7.35(m,14H)
中間体30:2−(2−(2−(プロパ−2−イン−1−イルオキシ)エトキシ)エトキシ)エチル(2−(4−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)フェニル)−1−(ジフェノキシホルフォリル)エチル)カルバメート
収率:53%
MS(ESI)m/z 705.3 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 1.51(s,9H)、2.43(t,J=2.4Hz,1H)、2.99(m,1H)、3.37(m,1H)、3.57〜3.71(m,10H)、4.12(m,2H)、4.19(d,J=2.4Hz,2H)、4.72(m,1H)、5.18(d,J=10.4Hz,1H)、6.57(s,1H)、7.11〜7.35(m,14H)
収率:53%
MS(ESI)m/z 705.3 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 1.51(s,9H)、2.43(t,J=2.4Hz,1H)、2.99(m,1H)、3.37(m,1H)、3.57〜3.71(m,10H)、4.12(m,2H)、4.19(d,J=2.4Hz,2H)、4.72(m,1H)、5.18(d,J=10.4Hz,1H)、6.57(s,1H)、7.11〜7.35(m,14H)
中間体31:ペンタ−4−イン−1−イル(2−(4−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)フェニル)−1−(ジフェノキシホルフォリル)エチル)カルバメート(中間体31)
収率:49%
MS(ESI)m/z 601.1 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 1.51(s,9H)、1.72(q,J=6.4Hz,2H)、1.95(t,J=2.4Hz,1H)、2.15(t,2H)、2.97(m,1H)、3.35(m,1H),4.06(t,2H)、4.71(m,1H)、4.98(d,J=10Hz,1H)、6.44(s,1H)、7.10〜7.35(m,14H)
収率:49%
MS(ESI)m/z 601.1 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 1.51(s,9H)、1.72(q,J=6.4Hz,2H)、1.95(t,J=2.4Hz,1H)、2.15(t,2H)、2.97(m,1H)、3.35(m,1H),4.06(t,2H)、4.71(m,1H)、4.98(d,J=10Hz,1H)、6.44(s,1H)、7.10〜7.35(m,14H)
中間体32:6−アジドヘキシル(2−(4−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)フェニル)−1−(ジフェノキシホルフォリル)エチル)カルバメート
収率:40%
MS(ESI)m/z 660.5 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.32(m,4H)、1.57(m,13H)、2.98(m,1H)、3.23(t,J=6.8Hz,2H)、3.35(m,1H)、3.97(m,2H)、4.73(m,1H)、4.99(d,J=10.4Hz,1H)、6.47(s,1H)、7.1〜7.4(m,14H)
収率:40%
MS(ESI)m/z 660.5 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.32(m,4H)、1.57(m,13H)、2.98(m,1H)、3.23(t,J=6.8Hz,2H)、3.35(m,1H)、3.97(m,2H)、4.73(m,1H)、4.99(d,J=10.4Hz,1H)、6.47(s,1H)、7.1〜7.4(m,14H)
中間体33:2−(2−アジドエトキシ)エチル(2−(4−(tert−ブトキシカルボニル)アミノ)フェニル)−1−(ジフェノキシホルフォリル)エチル)カルバメート
収率:51%
MS(ESI)m/z 648.4 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.51(s,9H)、2.98(m,1H)、3.35(m,3H)、3.57(m,4H)、4.14(m,2H)、4.72(m,1H)、5.12(d,J=10Hz,1H)、6.46(s,1H)、7.10〜7.35(m,14H)
収率:51%
MS(ESI)m/z 648.4 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.51(s,9H)、2.98(m,1H)、3.35(m,3H)、3.57(m,4H)、4.14(m,2H)、4.72(m,1H)、5.12(d,J=10Hz,1H)、6.46(s,1H)、7.10〜7.35(m,14H)
中間体34:2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エチル(2−(4−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)フェニル)−1−(ジフェノキシホルフォリル)エチル)カルバメート
収率:30%
MS(ESI)m/z 692.5 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.51(s,9H)、2.98(m,1H)、3.35(m,3H)、3.63(m,8H)、4.14(m,2H)、4.72(m,1H)、5.13(d,J=10Hz,1H)、6.47(s,1H)、7.1〜7.4(m,14H)
収率:30%
MS(ESI)m/z 692.5 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.51(s,9H)、2.98(m,1H)、3.35(m,3H)、3.63(m,8H)、4.14(m,2H)、4.72(m,1H)、5.13(d,J=10Hz,1H)、6.47(s,1H)、7.1〜7.4(m,14H)
中間体35:2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル(2−(4−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)フェニル)−1−(ジフェノキシホルフォリル)エチル)カルバメート(中間体35)
収率:22%
MS(ESI)m/z 736.5 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 1.51(s,9H)、2.98(m,1H)、3.35(m,3H)、3.62(m,12H)、4.12(m,2H)、6.53(br s,1H)、7.1〜7.4(m,14H)
収率:22%
MS(ESI)m/z 736.5 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 1.51(s,9H)、2.98(m,1H)、3.35(m,3H)、3.62(m,12H)、4.12(m,2H)、6.53(br s,1H)、7.1〜7.4(m,14H)
反応手順I
中間体36:ペンタ−4−イン−1−イル(2−(4−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)フェニル)−1−(ビス(4−アセトアミドフェノキシ)ホスホリル)エチル)カルバメート
THF(50ml)中のtert−ブチル4−(2−オキソエチル)フェニルカルバメート(中間体26)(5.95mmol)及び2−(プロパ−2−イニルオキシ)エチルカルバメート(中間体11)(5.95mmol)の溶液に、トリス(4−アセトアミドフェニル)ホスファイト(5.95mmol)及びCu(OTf)2(0.595mmol)を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗混合物をフラッシュクロマトグラフィー(100%EtOAcからEtOAc中10%MeOH)で精製した。
収率:5%
MS m/z 715.3 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.51(s,9H)、1.97(br s,1H)、2.14(m,8H)、2.97(m,1H)、3.28(m,1H)、4.05(m,2H)、4.66(m,1H)、5.48(m,1H)、6.9〜7.4(m,12H)
中間体36:ペンタ−4−イン−1−イル(2−(4−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)フェニル)−1−(ビス(4−アセトアミドフェノキシ)ホスホリル)エチル)カルバメート
THF(50ml)中のtert−ブチル4−(2−オキソエチル)フェニルカルバメート(中間体26)(5.95mmol)及び2−(プロパ−2−イニルオキシ)エチルカルバメート(中間体11)(5.95mmol)の溶液に、トリス(4−アセトアミドフェニル)ホスファイト(5.95mmol)及びCu(OTf)2(0.595mmol)を添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗混合物をフラッシュクロマトグラフィー(100%EtOAcからEtOAc中10%MeOH)で精製した。
収率:5%
MS m/z 715.3 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.51(s,9H)、1.97(br s,1H)、2.14(m,8H)、2.97(m,1H)、3.28(m,1H)、4.05(m,2H)、4.66(m,1H)、5.48(m,1H)、6.9〜7.4(m,12H)
反応手順J
中間体37:2−(プロパ−2−イニルオキシ)エチル2−(4−アミノフェニル)−1−(ジフェノキシホルフォリル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート
DMC(25ml)中の2−(プロパ−2−イン−1−イルオキシ)エチル(2−(4−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)フェニル)−1−(ジフェノキシホルフォリル)エチル)カルバメート(中間体28)(3.16mmol)の溶液に、TFA(25ml)を添加した。その溶液を1時間撹拌し、その後溶媒を蒸発させた。生成物をエーテルで洗浄した。
収率:87%
MS(ESI)m/z 495 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 3.83(s,1H)、3.03〜3.15(m,1H)、3.38〜3.48(m,1H)、3.58〜3.64(s,2H)、3.97〜4.15(m,4H)、4.59〜4.68(m,1H)、7.12〜7.51(m,14H)
中間体37:2−(プロパ−2−イニルオキシ)エチル2−(4−アミノフェニル)−1−(ジフェノキシホルフォリル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート
DMC(25ml)中の2−(プロパ−2−イン−1−イルオキシ)エチル(2−(4−((tert−ブトキシカルボニル)アミノ)フェニル)−1−(ジフェノキシホルフォリル)エチル)カルバメート(中間体28)(3.16mmol)の溶液に、TFA(25ml)を添加した。その溶液を1時間撹拌し、その後溶媒を蒸発させた。生成物をエーテルで洗浄した。
収率:87%
MS(ESI)m/z 495 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 3.83(s,1H)、3.03〜3.15(m,1H)、3.38〜3.48(m,1H)、3.58〜3.64(s,2H)、3.97〜4.15(m,4H)、4.59〜4.68(m,1H)、7.12〜7.51(m,14H)
以下の中間体を同様の方法によって調製した:
中間体38:2−(2−(プロパ−2−イニルオキシ)エトキシ)エチル2−(4−アミノフェニル)−1−(ジフェノキシホスホリル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート(中間体38)
収率:93%
MS(ESI)m/z 539 [M+H]+
中間体38:2−(2−(プロパ−2−イニルオキシ)エトキシ)エチル2−(4−アミノフェニル)−1−(ジフェノキシホスホリル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート(中間体38)
収率:93%
MS(ESI)m/z 539 [M+H]+
中間体39:2−(2−(2−(プロパ−2−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)エチル2−(4−アミノフェニル)−1−(ジフェノキシホスホリル)エチルカルバメート
収率:91%
MS(ESI)m/z 583.2 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 2.87(t,J=2.4Hz,1H)、3.13(m,1H)、3.46〜3.69(m,10H)、3.98〜4.15(m,2H)、4.18(d,J=2.4Hz,2H)、4.67(m,1H)、7.1〜8.0(m,14H)
収率:91%
MS(ESI)m/z 583.2 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 2.87(t,J=2.4Hz,1H)、3.13(m,1H)、3.46〜3.69(m,10H)、3.98〜4.15(m,2H)、4.18(d,J=2.4Hz,2H)、4.67(m,1H)、7.1〜8.0(m,14H)
中間体40:ペンタ−4−イニル2−(4−アミノフェニル)−1−(ジフェノキシホスホリル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート
収率:82%
MS(ESI)m/z 479.1 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 1.7(q,J=6.4Hz,2H)、2.18(dt,J=2.8Hz及びJ=6.8Hz,2H)、2.23(t,J=2.8Hz,1H)、3.06(m,1H)、3.43(m,1H)、4.0(m,2H)、4.64(m,1H)、7.1〜7.5(m,14H)
収率:82%
MS(ESI)m/z 479.1 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 1.7(q,J=6.4Hz,2H)、2.18(dt,J=2.8Hz及びJ=6.8Hz,2H)、2.23(t,J=2.8Hz,1H)、3.06(m,1H)、3.43(m,1H)、4.0(m,2H)、4.64(m,1H)、7.1〜7.5(m,14H)
中間体41:6−アジドヘキシル2−(4−アミノフェニル)−1−(ジフェノキシホスホリル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート
収率:98%
MS(ESI)m/z 538.4 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 1.34(m,4H)、1.55(m,4H)、3.07(m,1H)、3.24(t,J=6.8Hz,2H)、3.41(m,1H)、3.86(m,1H)、3.99(m,1H)、4.64(m,1H)、7.10〜7.50(m,14H)
収率:98%
MS(ESI)m/z 538.4 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 1.34(m,4H)、1.55(m,4H)、3.07(m,1H)、3.24(t,J=6.8Hz,2H)、3.41(m,1H)、3.86(m,1H)、3.99(m,1H)、4.64(m,1H)、7.10〜7.50(m,14H)
中間体42:2−(2−アジドエトキシ)エチル2−(4−アミノフェニル)−1−(ジフェノキシホスホリル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート(中間体42)
収率:98%
MS(ESI)m/z 526.3 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 3.10(m,1H)、3.44(m,1H)、3.60(m,4H)、4.02(m,1H)、4.10(m,1H)、4.66(m,1H)、7.15〜7.55(m,14H)
アジドエトキシ側鎖由来の1つのCH2が、MeOHピークの後ろに隠れている。
収率:98%
MS(ESI)m/z 526.3 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 3.10(m,1H)、3.44(m,1H)、3.60(m,4H)、4.02(m,1H)、4.10(m,1H)、4.66(m,1H)、7.15〜7.55(m,14H)
アジドエトキシ側鎖由来の1つのCH2が、MeOHピークの後ろに隠れている。
中間体43:2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エチル2−(4−アミノフェニル)−1−(ジフェノキシホスホリル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート
収率:97%
MS(ESI)m/z 570.4 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 3.09(m,1H)、3.44(m,1H)、3.61(m,8H)、3.99(m,1H)、4.11(m,1H)、4.64(m,1H)、7.0〜7.54(m,14)
1つのCH2が、MeOHピークの後ろに隠れている。
収率:97%
MS(ESI)m/z 570.4 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 3.09(m,1H)、3.44(m,1H)、3.61(m,8H)、3.99(m,1H)、4.11(m,1H)、4.64(m,1H)、7.0〜7.54(m,14)
1つのCH2が、MeOHピークの後ろに隠れている。
中間体44:2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル2−(4−アミノフェニル)−1−(ジフェノキシホスホリル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート
収率:98%
MS(ESI)m/z 614.4 [M+H]+、636.4 [M+Na]+
収率:98%
MS(ESI)m/z 614.4 [M+H]+、636.4 [M+Na]+
中間体45:ペンタ−4−イニル2−(4−アミノフェニル)−1−(ビス(4−アセトアミドフェノキシ)ホスホリル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート
収率:82%
MS(ESI)m/z 593.2 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 1.70(m,2H)、2.11(s,6H)、2.17(m,2H)、2.25(t,J=2.4Hz,1H)、3.04(m,1H)、3.41(m,1H)、3.96(m,2H)、4.59(m,1H)、7.11(m,4H)、7.18(d,J=8.4Hz,2H)、7.38(d,J=8.4Hz,2H)、7.54(d,J=8.8Hz,4H)
収率:82%
MS(ESI)m/z 593.2 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 1.70(m,2H)、2.11(s,6H)、2.17(m,2H)、2.25(t,J=2.4Hz,1H)、3.04(m,1H)、3.41(m,1H)、3.96(m,2H)、4.59(m,1H)、7.11(m,4H)、7.18(d,J=8.4Hz,2H)、7.38(d,J=8.4Hz,2H)、7.54(d,J=8.8Hz,4H)
中間体55:2−(プロパ−2−イニルオキシ)エチル1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート
収率:95%
MS(ESI)m/z 537 [M+H]+
1H NMR(MeOD,400MHz)δ 2.82(t,J=2.4Hz,1H)、3.03〜3.14(m,1H)、3.37〜3.44(m,1H)、3.61〜3.65(m,2H)、4.03〜4.16(m,4H)、4.58〜4.67(m,1H)、7.15〜7.45(m,14H)
LC−MS tr 14.3分(97.4%)
HPLC(214nm)tr 18.23分(100%)
HPLC(254nm)tr 18.23分(100%)
収率:95%
MS(ESI)m/z 537 [M+H]+
1H NMR(MeOD,400MHz)δ 2.82(t,J=2.4Hz,1H)、3.03〜3.14(m,1H)、3.37〜3.44(m,1H)、3.61〜3.65(m,2H)、4.03〜4.16(m,4H)、4.58〜4.67(m,1H)、7.15〜7.45(m,14H)
LC−MS tr 14.3分(97.4%)
HPLC(214nm)tr 18.23分(100%)
HPLC(254nm)tr 18.23分(100%)
中間体56:2−(2−(プロパ−2−イニルオキシ)エトキシ)エチル1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート
収率:98%
MS(ESI)m/z 581 [M+H]+
1H NMR(MeOD,400MHz)δ 2.84(t,J=2.4Hz,1H)、3.03〜3.15(m,1H)、3.36〜3.45(m,1H)、3.53〜4.18(m,10H)、4.57〜4.69(m,1H)、7.16〜7.99(m,14H)
LC−MS tr 13.8分(97.8%)
HPLC(214nm)tr 18.29分(100%)
HPLC(254nm)tr 18.32分(100%)
収率:98%
MS(ESI)m/z 581 [M+H]+
1H NMR(MeOD,400MHz)δ 2.84(t,J=2.4Hz,1H)、3.03〜3.15(m,1H)、3.36〜3.45(m,1H)、3.53〜4.18(m,10H)、4.57〜4.69(m,1H)、7.16〜7.99(m,14H)
LC−MS tr 13.8分(97.8%)
HPLC(214nm)tr 18.29分(100%)
HPLC(254nm)tr 18.32分(100%)
中間体57:2−(2−(2−(プロパ−2−イニルオキシ)エトキシ)エトキシ)エチル1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート
収率:75%
MS(ESI)m/z 625 [M+H]+
1H NMR(MeOD,400MHz)δ 2.82(t,1H,J=J’=2.4)、3.03〜3.15(m,1H)、3.37〜3.45(m,1H)、3.54〜4.19(m,14H)、4.58〜4.70(m,1H)、7.16〜7.97(m,14H)
LC−MS tr 14.0分(96.5%)
HPLC(214nm)tr 18.43分(100%)
HPLC(254nm)tr 18.42分(100%)
収率:75%
MS(ESI)m/z 625 [M+H]+
1H NMR(MeOD,400MHz)δ 2.82(t,1H,J=J’=2.4)、3.03〜3.15(m,1H)、3.37〜3.45(m,1H)、3.54〜4.19(m,14H)、4.58〜4.70(m,1H)、7.16〜7.97(m,14H)
LC−MS tr 14.0分(96.5%)
HPLC(214nm)tr 18.43分(100%)
HPLC(254nm)tr 18.42分(100%)
中間体58:ペンタ−4−イニル1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート
収率:61%
MS(ESI)m/z 521.2 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 1.72(q,J=6.8Hz,2H)、2.20(dt,J=7.2Hz及び2.4Hz,2H)、2.23(t,J=2.4Hz,1H)、3.07(m,1H)、3.40(m,1H)、4.03(m,2H)、4.64(m,1H)、7.15〜7.45(m,14H)
LC−MS tr 14.3分(99%)
HPLC(UV 214nm)tr 19.07分(99.1%)
HPLC(UV 254nm)tr 19.20分(100%)
収率:61%
MS(ESI)m/z 521.2 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 1.72(q,J=6.8Hz,2H)、2.20(dt,J=7.2Hz及び2.4Hz,2H)、2.23(t,J=2.4Hz,1H)、3.07(m,1H)、3.40(m,1H)、4.03(m,2H)、4.64(m,1H)、7.15〜7.45(m,14H)
LC−MS tr 14.3分(99%)
HPLC(UV 214nm)tr 19.07分(99.1%)
HPLC(UV 254nm)tr 19.20分(100%)
中間体59:6−アジドヘキシル1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート
収率:75%
MS(ESI)m/z 580.3 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 1.35(m,4H)、1.56(m,4H)、3.15(m,1H)、3.25(m,3H)、3.43(m,1H)、3.98(m,2H)、4.65(m,1H)、7.18〜7.94(m,14H)
LC−MS tr 11.2分(100%)
収率:75%
MS(ESI)m/z 580.3 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 1.35(m,4H)、1.56(m,4H)、3.15(m,1H)、3.25(m,3H)、3.43(m,1H)、3.98(m,2H)、4.65(m,1H)、7.18〜7.94(m,14H)
LC−MS tr 11.2分(100%)
中間体60:2−(2−アジドエトキシ)エチル1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート
収率:45%
MS(ESI)m/z 568.4 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 3.10(m,1H)、3.41(m,1H)、3.60(m,4H)、4.08(m,2H)、4.63(m,1H)、7.15〜7.45(m,14H)
LC−MS tr14.7分(99.1%)
HPLC(214nm)tr 19.01分(97%)
HPLC(254nm)tr 18.92分(97%)
収率:45%
MS(ESI)m/z 568.4 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 3.10(m,1H)、3.41(m,1H)、3.60(m,4H)、4.08(m,2H)、4.63(m,1H)、7.15〜7.45(m,14H)
LC−MS tr14.7分(99.1%)
HPLC(214nm)tr 19.01分(97%)
HPLC(254nm)tr 18.92分(97%)
中間体61:2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エチル1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート
収率:63%
MS(ESI)m/z 612.4 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 3.1(m,1H)、3.31(m,2H)、3.42(m,1H)、3.62(m,8H)、4.04(m,1H)、4.11(m,1H)、4.63(m,1H)、7.15〜7.45(m,14H)
LC−MS tr 14.6分(93.3%)
HPLC(214nm)tr 18.9分(91.1%)
収率:63%
MS(ESI)m/z 612.4 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 3.1(m,1H)、3.31(m,2H)、3.42(m,1H)、3.62(m,8H)、4.04(m,1H)、4.11(m,1H)、4.63(m,1H)、7.15〜7.45(m,14H)
LC−MS tr 14.6分(93.3%)
HPLC(214nm)tr 18.9分(91.1%)
中間体62:2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート
収率:78%
MS(ESI)m/z 656.5 [M+H]+
HPLC(214nm)tr 18.8分(95.5%)
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 3.09(m,1H)、3.35(t,J=5.2Hz,2H)、3.40(m,1H)、3.63(m,12H)、4.05(m,1H)、4.11(m,1H)、4.64(m,1H)、7.15〜7.45(m,14H)
収率:78%
MS(ESI)m/z 656.5 [M+H]+
HPLC(214nm)tr 18.8分(95.5%)
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 3.09(m,1H)、3.35(t,J=5.2Hz,2H)、3.40(m,1H)、3.63(m,12H)、4.05(m,1H)、4.11(m,1H)、4.64(m,1H)、7.15〜7.45(m,14H)
中間体63:ペンタ−4−イニル1−(ビス(4−アセトアミドフェノキシ)ホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート
収率:67%
MS(ESI)m/z 635.3 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 1.71(m,2H)、2.11(s,6H)、2.18(m,2H)、2.23(t,J=2.8Hz,1H)、3.12(m,1H)、3.40(m,1H)、4.02(m,1H)、7.13(m,4H)、7.22(d,J=8.4Hz,2H)、7.40(d,J=8.4Hz,2H)、7.55(m,4H)
LC−MS tr 11.4(96.5%)
収率:67%
MS(ESI)m/z 635.3 [M+H]+
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 1.71(m,2H)、2.11(s,6H)、2.18(m,2H)、2.23(t,J=2.8Hz,1H)、3.12(m,1H)、3.40(m,1H)、4.02(m,1H)、7.13(m,4H)、7.22(d,J=8.4Hz,2H)、7.40(d,J=8.4Hz,2H)、7.55(m,4H)
LC−MS tr 11.4(96.5%)
反応手順K
中間体46:2−(プロパ−2−イン−1−イルオキシ)エチル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−((2,3−ビス−(tert−ブトキシカルボニル)グアニジン)フェニル)エチル)カルバメート
CHCl3(50ml)中の2−(プロパ−2−イニルオキシ)エチル2−(4−アミノフェニル)−1−(ジフェノキシホスホリル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート(中間体37)(1.890mmol)の溶液に、(Z)−tert−ブチル(1H−ピラゾール−1−イル)メタンジイリデンジカルバメート(1.890mmol)及びトリエチルアミン(5.67mmol)を添加した。その溶液を、室温にて3日間撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗混合物をEtOAcに溶解し、1N HCl、飽和NaHCO3及びブラインの溶液で洗浄した。有機溶媒を無水Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、蒸発し、フラッシュクロマトグラフィー(100%ヘキサンからヘキサン中30%EtOAc)によって精製した。
収率:32%
MS(ESI)m/z 737 [M+1]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.48(s,9H)、1.53(s,9H)、2.44(s,1H)、2.93〜3.07(m,1H)、3.32〜3.43(m,1H)、3.63(d,J=4.4Hz,2H),4.12〜4.23(m,4H)、4.66〜4.81(m,1H)、5.05(d,J=10Hz,1H)、7.10〜7.35(m,14H)、7.57(d,J=8.4Hz,2H)、10.3(s,1H)、11.6(s,1H)
中間体46:2−(プロパ−2−イン−1−イルオキシ)エチル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−((2,3−ビス−(tert−ブトキシカルボニル)グアニジン)フェニル)エチル)カルバメート
CHCl3(50ml)中の2−(プロパ−2−イニルオキシ)エチル2−(4−アミノフェニル)−1−(ジフェノキシホスホリル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート(中間体37)(1.890mmol)の溶液に、(Z)−tert−ブチル(1H−ピラゾール−1−イル)メタンジイリデンジカルバメート(1.890mmol)及びトリエチルアミン(5.67mmol)を添加した。その溶液を、室温にて3日間撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗混合物をEtOAcに溶解し、1N HCl、飽和NaHCO3及びブラインの溶液で洗浄した。有機溶媒を無水Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、蒸発し、フラッシュクロマトグラフィー(100%ヘキサンからヘキサン中30%EtOAc)によって精製した。
収率:32%
MS(ESI)m/z 737 [M+1]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.48(s,9H)、1.53(s,9H)、2.44(s,1H)、2.93〜3.07(m,1H)、3.32〜3.43(m,1H)、3.63(d,J=4.4Hz,2H),4.12〜4.23(m,4H)、4.66〜4.81(m,1H)、5.05(d,J=10Hz,1H)、7.10〜7.35(m,14H)、7.57(d,J=8.4Hz,2H)、10.3(s,1H)、11.6(s,1H)
以下の中間体を同様の方法によって調製した:
中間体47:2−(2−(プロパ−2−イン−1−イルオキシ)エトキシ)エチル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−(2,3−ビス−(tert−ブトキシカルボニル)グアニジン)フェニル)エチル)カルバメート
収率:60%
MS(ESI)m/z 781[M+H]+,803 [M+Na]+、819 [M+K]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.51(s,9H)、1.54(s,9H)、2.42(t,J=2.4Hz,1H)、2.94〜3.07(m,1H)、3.33〜3.43(m,1H)、3.55〜4.20(m,10H)、4.68〜4.81(m,1H)、5.06(d,J=9.6Hz,1H)、7.10〜7.59(m,14H)、10.30(s,1H)、11.60(s,1H)
中間体47:2−(2−(プロパ−2−イン−1−イルオキシ)エトキシ)エチル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−(2,3−ビス−(tert−ブトキシカルボニル)グアニジン)フェニル)エチル)カルバメート
収率:60%
MS(ESI)m/z 781[M+H]+,803 [M+Na]+、819 [M+K]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.51(s,9H)、1.54(s,9H)、2.42(t,J=2.4Hz,1H)、2.94〜3.07(m,1H)、3.33〜3.43(m,1H)、3.55〜4.20(m,10H)、4.68〜4.81(m,1H)、5.06(d,J=9.6Hz,1H)、7.10〜7.59(m,14H)、10.30(s,1H)、11.60(s,1H)
中間体48:2−(2−(2−(プロパ−2−イン−1−イルオキシ)エトキシ)エトキシ)エチル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−(2,3−ビス(tert−ブトキシカルボニル)グアニジノ)フェニル)エチル)カルバメート
収率:76%
MS(ESI)m/z 825 [M+H]+,847 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.48(s,9H)、1.53(s,9H)、2.41(t,1H)、2.96〜3.07(m,1H)、3.33〜3.42(m,1H)、3.65〜4.20(m,12H)、4.68〜4.81(m,1H)、5.1〜5.16(d,J=10Hz,1H)、7.11〜7.35(m,14H)、7.53〜7.58(d,J=8.4Hz,2H)
収率:76%
MS(ESI)m/z 825 [M+H]+,847 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.48(s,9H)、1.53(s,9H)、2.41(t,1H)、2.96〜3.07(m,1H)、3.33〜3.42(m,1H)、3.65〜4.20(m,12H)、4.68〜4.81(m,1H)、5.1〜5.16(d,J=10Hz,1H)、7.11〜7.35(m,14H)、7.53〜7.58(d,J=8.4Hz,2H)
中間体49:ペンタ−4−イン−1−イル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−(2,3−ビス(tert−ブトキシカルボニル)グアニジン)フェニル)エチル)カルバメート
収率:61%
MS(ESI)m/z 743.1 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz): δ 1.51(d,18H)、1.73(q,J=6.4Hz,2H)、1.96(t,J=2.8Hz,1H)、2.17(t,2H)、3.01(m,1H)、3.38(m,1H),4.08(t,J=6Hz,2H)、4.76(m,1H)、4.96(d,J=10.4Hz,1H)、7.0〜7.6(m,14H)、10.33(s,1H)、11.63(s,1H)
収率:61%
MS(ESI)m/z 743.1 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz): δ 1.51(d,18H)、1.73(q,J=6.4Hz,2H)、1.96(t,J=2.8Hz,1H)、2.17(t,2H)、3.01(m,1H)、3.38(m,1H),4.08(t,J=6Hz,2H)、4.76(m,1H)、4.96(d,J=10.4Hz,1H)、7.0〜7.6(m,14H)、10.33(s,1H)、11.63(s,1H)
中間体50:6−アジドヘキシル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−(2,3−ビス(tert−ブトキシカルボニル)グアニジン)フェニル)エチル)カルバメート
収率:35%
MS(ESI)m/z 780.6 [M+H]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz): δ 1.32(m,4H)、1.52(m,22H)、3.02(m,1H)、3.22(t,J=6.8Hz,2H)、3.37(m,1H)、3.97(t,J=6.4Hz,2H)、4.77(m,1H)、4.93(d,J=10.8Hz,1H)、7.1〜7.6(m,14H)、10.31(s,1H)、11.61(s,1H)
収率:35%
MS(ESI)m/z 780.6 [M+H]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz): δ 1.32(m,4H)、1.52(m,22H)、3.02(m,1H)、3.22(t,J=6.8Hz,2H)、3.37(m,1H)、3.97(t,J=6.4Hz,2H)、4.77(m,1H)、4.93(d,J=10.8Hz,1H)、7.1〜7.6(m,14H)、10.31(s,1H)、11.61(s,1H)
中間体51:2−(2−アジドエトキシ)エチル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−(2,3−ビス(tert−ブトキシカルボニル)グアニジン)フェニル)エチル)カルバメート
収率:36%
MS(ESI)m/z 768.5 [M+H]+、790.6 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz): δ1.53(d,18H)、3.01(m,1H)、3.32(t,J=4.8Hz,2H)、3.40(m,1H)、3.59(m,4H)、4.15(m,2H)、4.75(m,1H)、5.09(d,J=10.4Hz,1H)、7.10〜7.60(m,14H)、10.31(s,1H)、11.6(s,1H)
収率:36%
MS(ESI)m/z 768.5 [M+H]+、790.6 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz): δ1.53(d,18H)、3.01(m,1H)、3.32(t,J=4.8Hz,2H)、3.40(m,1H)、3.59(m,4H)、4.15(m,2H)、4.75(m,1H)、5.09(d,J=10.4Hz,1H)、7.10〜7.60(m,14H)、10.31(s,1H)、11.6(s,1H)
中間体52:2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エチル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−(2,3−ビス(tert−ブトキシカルボニル)グアニジノ)フェニル)エチル)カルバメート
収率:37%
MS(ESI)m/z 812.5 [M+H]+、834.5 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz): δ 1.53(d,18H)、3.02(m,1H)、3.38(m,3H)、3.63(m,8H)、4.13(m,2H)、4.75(m,1H)、5.13(s,J=10Hz,1H)、7.1〜7.6(m,14H)、10.3(s,1H)、11.6(s,1H)
収率:37%
MS(ESI)m/z 812.5 [M+H]+、834.5 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz): δ 1.53(d,18H)、3.02(m,1H)、3.38(m,3H)、3.63(m,8H)、4.13(m,2H)、4.75(m,1H)、5.13(s,J=10Hz,1H)、7.1〜7.6(m,14H)、10.3(s,1H)、11.6(s,1H)
中間体53:2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−(2,3−ビス(tert−ブトキシカルボニル)グアニジノ)フェニル)エチル)カルバメート
収率:27%
MS(ESI)m/z 878.6 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz): δ 1.52(d,18H)、3.02(m,1H)、3.39(m,3H)、3.63(m,12H)、4.14(m,2H)、4.75(m,1H)、5.15(d,1H)、7.1〜7.6(m,14H)、10.3(s,1H)、11.6(s,1H)
収率:27%
MS(ESI)m/z 878.6 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz): δ 1.52(d,18H)、3.02(m,1H)、3.39(m,3H)、3.63(m,12H)、4.14(m,2H)、4.75(m,1H)、5.15(d,1H)、7.1〜7.6(m,14H)、10.3(s,1H)、11.6(s,1H)
反応手順L
中間体54:ペンタ−4−イン−1−イル(1−(ビス(4−アセトアミドフェノキシ)ホスホリル)−2−(4−(2,3−ビス(tert−ブトキシカルボニル(butoxycarbonyl))グアニジン)フェニル)エチル)カルバメート
DCM(3ml)及びアセトニトリル(容量:3.00ml)中のペンタ−4−イニル2−(4−アミノフェニル)−1−(ビス(4−アセトアミドフェノキシ)ホスホリル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート(中間体45)(0.283mmol)の溶液に、Boc−ピラゾールグアニジン(0.566mmol)及びTEA(0.849mmol)を添加した。その溶液を5時間撹拌した。追加のBoc−ピラゾールグアニジン(0.566mmol)を添加し、更に48時間溶液を撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗生成物をEtOAcに溶解した。有機層を2N HCl、飽和NaHCO3及びブラインの溶液で洗浄した。それをNa2SO4上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(EtOAc中2.5%MeOH)を使用して精製した。
収率:34%
MS(ESI)m/z 857.3 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.46(s,9H)、1.54(s,9H)、1.72(m,2H)、2.0(m,7H)、2.17(m,2H)、2.89(m,1H)、3.20(m,1H)、4.08(m,2H)、4.64(m,1H)、6.38(d,J=10Hz,1H)、6.8〜7.5(m,12H)、8.46(s,1H)、8.64(s,1H)、10.19(s,1H)、11.62(s,1H)
中間体54:ペンタ−4−イン−1−イル(1−(ビス(4−アセトアミドフェノキシ)ホスホリル)−2−(4−(2,3−ビス(tert−ブトキシカルボニル(butoxycarbonyl))グアニジン)フェニル)エチル)カルバメート
DCM(3ml)及びアセトニトリル(容量:3.00ml)中のペンタ−4−イニル2−(4−アミノフェニル)−1−(ビス(4−アセトアミドフェノキシ)ホスホリル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート(中間体45)(0.283mmol)の溶液に、Boc−ピラゾールグアニジン(0.566mmol)及びTEA(0.849mmol)を添加した。その溶液を5時間撹拌した。追加のBoc−ピラゾールグアニジン(0.566mmol)を添加し、更に48時間溶液を撹拌した。溶媒を蒸発させ、粗生成物をEtOAcに溶解した。有機層を2N HCl、飽和NaHCO3及びブラインの溶液で洗浄した。それをNa2SO4上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。粗生成物を、フラッシュクロマトグラフィー(EtOAc中2.5%MeOH)を使用して精製した。
収率:34%
MS(ESI)m/z 857.3 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz)δ 1.46(s,9H)、1.54(s,9H)、1.72(m,2H)、2.0(m,7H)、2.17(m,2H)、2.89(m,1H)、3.20(m,1H)、4.08(m,2H)、4.64(m,1H)、6.38(d,J=10Hz,1H)、6.8〜7.5(m,12H)、8.46(s,1H)、8.64(s,1H)、10.19(s,1H)、11.62(s,1H)
反応手順M
中間体65:8−アジドオクタン酸
DMF(5ml)中の8−ブロモオクタン酸(中間体64)(2.241mmol)の撹拌溶液に、アジ化ナトリウム(4.48mmol)を添加し、その混合物を85℃で3時間加熱した。粗反応混合物を、DCM(50ml)で希釈し、この溶液を0.1N HClで洗浄した。有機層を、無水Na2SO4上で乾燥した。溶媒を蒸発させた。黄色の油性生成物が得られた。
収率:79%
MS(ESI)m/z 184.0 [M−H]−
1H−NMR(CDCl3,400MHz): δ 1.37(m,6H)、1.63(m,4H)、2.35(t,J=7.2Hz,2H)、3.25(t,J=6.8Hz,2H)
中間体65:8−アジドオクタン酸
DMF(5ml)中の8−ブロモオクタン酸(中間体64)(2.241mmol)の撹拌溶液に、アジ化ナトリウム(4.48mmol)を添加し、その混合物を85℃で3時間加熱した。粗反応混合物を、DCM(50ml)で希釈し、この溶液を0.1N HClで洗浄した。有機層を、無水Na2SO4上で乾燥した。溶媒を蒸発させた。黄色の油性生成物が得られた。
収率:79%
MS(ESI)m/z 184.0 [M−H]−
1H−NMR(CDCl3,400MHz): δ 1.37(m,6H)、1.63(m,4H)、2.35(t,J=7.2Hz,2H)、3.25(t,J=6.8Hz,2H)
反応手順N
中間体67:N−(6−(ジエチルアミノ)−9−(2−(ピペラジン−1−カルボニル)フェニル)−3H−キサンテン−3−イリデン)−Nエチルエタンアミニウムクロリド
ヘプタン中のトリメチルアルミニウム(4.52mmol)の1.0Mの溶液を、室温にてCH2Cl2 3.5ml中のピペラジン(9.04mmol)溶液に滴加した。添加の間にガス発生が観察された。1時間撹拌した後、白色沈殿が観察された。CH2Cl2 2ml中のローダミンBベース(中間体66)(2.26mmol)溶液を、不均一溶液に滴加した。その溶液を48時間(65℃)に亘って還流した。ガス発生が終わるまで、0.1M HCl水溶液を滴加した。不均一溶液を濾過し、残留した固体をCH2Cl2及びCH2Cl2/MeOH溶液(4:1)で濯いだ。混合された濾液を濃縮し、残留物をCH2Cl2に溶解し、濾過して不溶性塩類を除去し、再び濃縮した。その後、得られたガラス質の固体を、低濃度のNaHCO3(2%(m/v))水溶液とEtOAcとの間で分割した。分離の後、水層を追加のEtOAcを3回に分けて洗浄して残留した出発材料を除去した。保持された水層をNaClで飽和し、1M HCl水溶液で酸性化し、次いで薄桃色が持続するまでiPrOH/CH2Cl2(2:1)を用いて複数に分けて抽出した。その後、混合された有機層を、Na2SO4上で乾燥し、減圧下で濃縮濾過した。ガラス質の紫色の固体を微量のMeOHに溶解し、多量のEt2Oへ滴加することによって沈殿させた。濾過により、濃い紫色の固体として生成物を採取した。フラッシュクロマトグラフィー(100%DMCからDCM中15%のMeOH)を使用し、更なる精製を行った。
収率:15%
MS(ESI)m/z 511.80 [M]+
1H−NMR(MeOD,400MHz): δ 1.32(t,J=7.2Hz,12H)、2.70(br s,4H)、3.41(br s,4H)、3.70(q,J=7.2Hz,8H)、6.97(d,J=2.4Hz,2H)、7.08(dd,J=2.8Hz及びJ=9.2Hz,2H)、7.27(d,J=9.6Hz,2H)、7.51(m,1H)、7.68(m,1H)、7.70(m,2H)
HPLC(214nm)tr 18.08分(100%)
中間体67:N−(6−(ジエチルアミノ)−9−(2−(ピペラジン−1−カルボニル)フェニル)−3H−キサンテン−3−イリデン)−Nエチルエタンアミニウムクロリド
ヘプタン中のトリメチルアルミニウム(4.52mmol)の1.0Mの溶液を、室温にてCH2Cl2 3.5ml中のピペラジン(9.04mmol)溶液に滴加した。添加の間にガス発生が観察された。1時間撹拌した後、白色沈殿が観察された。CH2Cl2 2ml中のローダミンBベース(中間体66)(2.26mmol)溶液を、不均一溶液に滴加した。その溶液を48時間(65℃)に亘って還流した。ガス発生が終わるまで、0.1M HCl水溶液を滴加した。不均一溶液を濾過し、残留した固体をCH2Cl2及びCH2Cl2/MeOH溶液(4:1)で濯いだ。混合された濾液を濃縮し、残留物をCH2Cl2に溶解し、濾過して不溶性塩類を除去し、再び濃縮した。その後、得られたガラス質の固体を、低濃度のNaHCO3(2%(m/v))水溶液とEtOAcとの間で分割した。分離の後、水層を追加のEtOAcを3回に分けて洗浄して残留した出発材料を除去した。保持された水層をNaClで飽和し、1M HCl水溶液で酸性化し、次いで薄桃色が持続するまでiPrOH/CH2Cl2(2:1)を用いて複数に分けて抽出した。その後、混合された有機層を、Na2SO4上で乾燥し、減圧下で濃縮濾過した。ガラス質の紫色の固体を微量のMeOHに溶解し、多量のEt2Oへ滴加することによって沈殿させた。濾過により、濃い紫色の固体として生成物を採取した。フラッシュクロマトグラフィー(100%DMCからDCM中15%のMeOH)を使用し、更なる精製を行った。
収率:15%
MS(ESI)m/z 511.80 [M]+
1H−NMR(MeOD,400MHz): δ 1.32(t,J=7.2Hz,12H)、2.70(br s,4H)、3.41(br s,4H)、3.70(q,J=7.2Hz,8H)、6.97(d,J=2.4Hz,2H)、7.08(dd,J=2.8Hz及びJ=9.2Hz,2H)、7.27(d,J=9.6Hz,2H)、7.51(m,1H)、7.68(m,1H)、7.70(m,2H)
HPLC(214nm)tr 18.08分(100%)
反応手順O
中間体68:N−(9−(2−(4−(8−アジドオクタノイル)ピペラジン−1−カルボニル)フェニル)−6−(ジエチルアミノ)−3H−キサンテン−3−イリデン)−N−エチルエタンアミニウムクロリド
DMF(20ml)中の8−アジドオクタン酸(中間体65)(1.828mmol)溶液に、TBTU(2.010mmol)及びDIPEA(5.48mmol)を添加した。室温にて15分間、溶液を撹拌した。N−(6−(ジエチルアミノ)−9−(2−(ピペラジン−1−カルボニル)フェニル)−3H−キサンテン−3−イリデン)−N−エチルエタンアルミニウムクロリド(中間体67)(1.828mmol)を添加し、その溶液を室温にて一晩撹拌した。水200mlを添加し、水層をDCMで抽出した(2回)。得られた有機層を、2N HCl、飽和NaHCO3及びブラインの溶液で抽出した。溶媒をNa2SO4上で乾燥し、濾過して蒸発させた。形成された生成物を、ヘキサン、EtOAc/ヘキサン(1/4)及び2×20ml EtOAc/ヘキサン(1/1)で洗浄した。濃い紫色の固体が形成された。生成物を少量のDCMに溶解し、多量のエーテルに添加した。沈殿が形成された。
収率:87%
MS(ESI)m/z 678.7 [M]+
1H−NMR(MeOD,400MHz): δ 1.31(m,18H)、1.56(m,4H)、2.34(t,J=7.6Hz,2H)、3.27(t,J=6.4Hz,2H)、3.35(br s,8H)、3.70(q,J=7.2Hz,8H)、6.96(d,J=2.4Hz,2H)、7.07(dd,J=2.4Hz及びJ=9.6Hz,2H)、7.28(d,J=9.6Hz,2H)、7.52(m,1H)、7.70(m,1H)、7.77(m,2H)
LC−MS tr 21.5分(100%)
HPLC(214nm)tr 27.3分(100%)
HPLC(254nm)tr 27.4分(100%)
中間体68:N−(9−(2−(4−(8−アジドオクタノイル)ピペラジン−1−カルボニル)フェニル)−6−(ジエチルアミノ)−3H−キサンテン−3−イリデン)−N−エチルエタンアミニウムクロリド
DMF(20ml)中の8−アジドオクタン酸(中間体65)(1.828mmol)溶液に、TBTU(2.010mmol)及びDIPEA(5.48mmol)を添加した。室温にて15分間、溶液を撹拌した。N−(6−(ジエチルアミノ)−9−(2−(ピペラジン−1−カルボニル)フェニル)−3H−キサンテン−3−イリデン)−N−エチルエタンアルミニウムクロリド(中間体67)(1.828mmol)を添加し、その溶液を室温にて一晩撹拌した。水200mlを添加し、水層をDCMで抽出した(2回)。得られた有機層を、2N HCl、飽和NaHCO3及びブラインの溶液で抽出した。溶媒をNa2SO4上で乾燥し、濾過して蒸発させた。形成された生成物を、ヘキサン、EtOAc/ヘキサン(1/4)及び2×20ml EtOAc/ヘキサン(1/1)で洗浄した。濃い紫色の固体が形成された。生成物を少量のDCMに溶解し、多量のエーテルに添加した。沈殿が形成された。
収率:87%
MS(ESI)m/z 678.7 [M]+
1H−NMR(MeOD,400MHz): δ 1.31(m,18H)、1.56(m,4H)、2.34(t,J=7.6Hz,2H)、3.27(t,J=6.4Hz,2H)、3.35(br s,8H)、3.70(q,J=7.2Hz,8H)、6.96(d,J=2.4Hz,2H)、7.07(dd,J=2.4Hz及びJ=9.6Hz,2H)、7.28(d,J=9.6Hz,2H)、7.52(m,1H)、7.70(m,1H)、7.77(m,2H)
LC−MS tr 21.5分(100%)
HPLC(214nm)tr 27.3分(100%)
HPLC(254nm)tr 27.4分(100%)
反応手順P
中間体69:8−アジドオクタノイルクロリド
無水トルエン(容量:50ml)中の8−アジドオクタン酸(中間体65)(2g、10.80mmol)の撹拌溶液に、オキサリルクロリド(16.20mmol)を添加した。触媒量のDMF(2滴)を添加し、溶液を室温にて4時間撹拌した。白色沈殿(recipitate)が観察された。真空下での濃縮の後、残留物をトルエンを用いて同時に蒸発させた。赤色生成物が得られ、それ以上精製せずに次の工程で使用した。
中間体69:8−アジドオクタノイルクロリド
無水トルエン(容量:50ml)中の8−アジドオクタン酸(中間体65)(2g、10.80mmol)の撹拌溶液に、オキサリルクロリド(16.20mmol)を添加した。触媒量のDMF(2滴)を添加し、溶液を室温にて4時間撹拌した。白色沈殿(recipitate)が観察された。真空下での濃縮の後、残留物をトルエンを用いて同時に蒸発させた。赤色生成物が得られ、それ以上精製せずに次の工程で使用した。
反応手順Q
中間体71:2,5−ジオキソピロリジン−1−イル5−((3aS,4S,6aR)−2−オキソヘキサヒドロ−1H−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル)ペンタノエート
D−ビオチン(0.819mmol)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(0.819mmol)を、50ml容の丸底フラスコ内で撹拌しながら6mlの高温無水DMF(70℃)に溶解した。DCC(1.064mmol)を添加し、溶液を室温にて一晩撹拌した。形成されたDCUを濾別し、溶液を蒸発乾固させた。残留物を、沸騰したイソプロパノール中に溶解し(taken up)、室温まで溶液を冷却した。目的化合物が折出し、生成物を濾別した。
収率:79%
MS(ESI)m/z 364.1 [M+Na]+
1H−NMR(DMSO,400MHz): δ 1.42〜1.67(m,6H)、2.57〜2.60(d,J=12.4Hz,1H)、2.68(t,J=7.3Hz,2H)、2.81〜2.90(m,5H)、3.11(m,1H)、4.14〜4.17(m,1H)、4.29〜4.35(m,1H)、6.37(s,1H)、6.42(s,1H)
中間体71:2,5−ジオキソピロリジン−1−イル5−((3aS,4S,6aR)−2−オキソヘキサヒドロ−1H−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル)ペンタノエート
D−ビオチン(0.819mmol)及びN−ヒドロキシスクシンイミド(0.819mmol)を、50ml容の丸底フラスコ内で撹拌しながら6mlの高温無水DMF(70℃)に溶解した。DCC(1.064mmol)を添加し、溶液を室温にて一晩撹拌した。形成されたDCUを濾別し、溶液を蒸発乾固させた。残留物を、沸騰したイソプロパノール中に溶解し(taken up)、室温まで溶液を冷却した。目的化合物が折出し、生成物を濾別した。
収率:79%
MS(ESI)m/z 364.1 [M+Na]+
1H−NMR(DMSO,400MHz): δ 1.42〜1.67(m,6H)、2.57〜2.60(d,J=12.4Hz,1H)、2.68(t,J=7.3Hz,2H)、2.81〜2.90(m,5H)、3.11(m,1H)、4.14〜4.17(m,1H)、4.29〜4.35(m,1H)、6.37(s,1H)、6.42(s,1H)
反応手順R
中間体72:N−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−5−((3aS,4S,6aR)−2−オキソヘキサヒドロ−1H−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル)ペンタンアミド
TEA(0.879mmol)を、DMF 15ml中の2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エタンアミン(0.879mmol)溶液に添加した後、DMF 10ml中のビオチン−NHS(中間体71)(0.879mmol)溶液を添加した。得られた溶液を、室温にて15時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、得られた粗混合物をフラッシュクロマトグラフィー(100%EtOAcからEtOAc中20%MeOH)によって精製した。
収率:77%
MS(ESI)m/z 467.3 [M+Na]+
1H−NMR(DMSO,400MHz): δ 1.29〜1.64(m,6H)、2.07(t,J=7.2Hz,2H)、2.59(d,J=12.8Hz,1H)、2.82(dd,J=5.2Hz及びJ=12.4Hz,1H)、3.09(m,1H)、3.18(m,2H)、3.38(m,4H)、3.53(m,8H)、3.62(m,2H)、4.12(m,1H)、4.31(m,1H)、6.36(s,1H)、6.42(s,1H)、7.83(t,J=5.6Hz,1H)
中間体72:N−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−5−((3aS,4S,6aR)−2−オキソヘキサヒドロ−1H−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル)ペンタンアミド
TEA(0.879mmol)を、DMF 15ml中の2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エタンアミン(0.879mmol)溶液に添加した後、DMF 10ml中のビオチン−NHS(中間体71)(0.879mmol)溶液を添加した。得られた溶液を、室温にて15時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、得られた粗混合物をフラッシュクロマトグラフィー(100%EtOAcからEtOAc中20%MeOH)によって精製した。
収率:77%
MS(ESI)m/z 467.3 [M+Na]+
1H−NMR(DMSO,400MHz): δ 1.29〜1.64(m,6H)、2.07(t,J=7.2Hz,2H)、2.59(d,J=12.8Hz,1H)、2.82(dd,J=5.2Hz及びJ=12.4Hz,1H)、3.09(m,1H)、3.18(m,2H)、3.38(m,4H)、3.53(m,8H)、3.62(m,2H)、4.12(m,1H)、4.31(m,1H)、6.36(s,1H)、6.42(s,1H)、7.83(t,J=5.6Hz,1H)
反応手順S
中間体73:10−(7−アジドヘプチル)−5,5−ジフルオロ−1,3,7,9−テトラメチル−5H−ジピロロ[1,2−c:2’,1’−f][1,3,2]ジアザボリニン−4−イウム−5−ウイド
DCE 10ml中の8−アジドオクタニルクロリド(中間体66)(10.80mmol)の1M溶液を作製し、2,4−ジメチル−ピロール(22.68mmol)を添加した。得られた混合物を65℃にて2時間撹拌した。室温まで冷却するために置いた後、ボロントリフルオリドエーテル複合体(54.0mmol)を滴加し、N,N−ジ−イソ−プロピルエチルアミン(43.2mmol)を滴加した。その後、N2ガスを溶液中にバブリングし、反応混合物を常温で一晩撹拌した。H2O及びEtOAcを添加した。Na2SO4上で有機層を乾燥し、溶媒の蒸発の後に粗生成物が得られた。フラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン中7%EtOAc)を用いた精製により、所望の生成物が生じた。
収率:6%
MS(ESI)m/z 410.1 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 1.30〜1.7(m,10H)、2.414(s,6H)、2.514(s,6H)、2.94(m,2H)、3.26(m,2H)、6.052(s,2H)
中間体73:10−(7−アジドヘプチル)−5,5−ジフルオロ−1,3,7,9−テトラメチル−5H−ジピロロ[1,2−c:2’,1’−f][1,3,2]ジアザボリニン−4−イウム−5−ウイド
DCE 10ml中の8−アジドオクタニルクロリド(中間体66)(10.80mmol)の1M溶液を作製し、2,4−ジメチル−ピロール(22.68mmol)を添加した。得られた混合物を65℃にて2時間撹拌した。室温まで冷却するために置いた後、ボロントリフルオリドエーテル複合体(54.0mmol)を滴加し、N,N−ジ−イソ−プロピルエチルアミン(43.2mmol)を滴加した。その後、N2ガスを溶液中にバブリングし、反応混合物を常温で一晩撹拌した。H2O及びEtOAcを添加した。Na2SO4上で有機層を乾燥し、溶媒の蒸発の後に粗生成物が得られた。フラッシュクロマトグラフィー(ヘキサン中7%EtOAc)を用いた精製により、所望の生成物が生じた。
収率:6%
MS(ESI)m/z 410.1 [M+Na]+
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 1.30〜1.7(m,10H)、2.414(s,6H)、2.514(s,6H)、2.94(m,2H)、3.26(m,2H)、6.052(s,2H)
反応手順T
中間体75:N−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−4−フルオロベンズアミド
2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エタンアミン(中間体74)(2mmol)を、DCM 2ml及びTEA(3.00mmol)に溶解した。DCM 1mlに溶解した2,5−ジオキシピロリジン−1−イル4−フルオロベンゾエート(2.200mmol)をこの溶液に添加した。得られた混合物を、室温にて4時間撹拌した。その後、粗反応物をDCMで希釈し、10%クエン酸溶液及びブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー(100%DCMからDCM中4%MeOH)により所望の生成物が生じた。
収率:74%
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 3.27(m,2H)、3.57(m,14H)、6.90(br s,1H)、7.02(m,2H)、7.76(m,2H)
中間体75:N−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−4−フルオロベンズアミド
2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エタンアミン(中間体74)(2mmol)を、DCM 2ml及びTEA(3.00mmol)に溶解した。DCM 1mlに溶解した2,5−ジオキシピロリジン−1−イル4−フルオロベンゾエート(2.200mmol)をこの溶液に添加した。得られた混合物を、室温にて4時間撹拌した。その後、粗反応物をDCMで希釈し、10%クエン酸溶液及びブラインで洗浄した。有機層をNa2SO4上で乾燥し、濾過し、減圧下で濃縮した。フラッシュクロマトグラフィー(100%DCMからDCM中4%MeOH)により所望の生成物が生じた。
収率:74%
1H−NMR(CDCl3,400MHz):δ 3.27(m,2H)、3.57(m,14H)、6.90(br s,1H)、7.02(m,2H)、7.76(m,2H)
反応手順U
中間体77:2−((1E,3E,5E)−5−(1−(6−((2−アジドエチル)アミノ)−6−オキソヘキシル)−3,3−ジメチルインドリン−2−イリデン)ペンタ−1,3−ジエン−1−イル)−1,3,3−トリメチル−3H−インドール−1−イウム
DMF 4ml中の(2−((1E,3E,5E)−5−(1−(5−カルボキシペンチル)−3,3−ジメチルインドリン−2−イリデン)ペンタ−1,3−ジエン−1−イル)−1,3,3−トリメチル−3H−インドール−1−イウム)(中間体76)(0.193mmol)の溶液に、TBTU(0.231mmol)及びDIPEA(0.424mmol)を添加した。室温にて1時間に亘り得られた溶液を撹拌した後、2−アジドエチルアミン*(0.267mmol)を添加した。この最終溶液を、室温にて一晩撹拌した。DMFを減圧下で除去した後、フラッシュクロマトグラフィー(100%DCMからDCM中10%MeOH)を行った。
収率:57%
1H−NMR(MeOD,400MHz): δ 1.46(m,2H)、1.68(m,14H)、1.75(m,2H)、2.22(t,J=7.2Hz,2H)、3.30(s,4H)、3.61(s,3H)、4.09(t,J=7.6Hz,2H)、6.25(dd,J=2.8Hz及びJ=13.6Hz,2H)、6.62(t,J=12.4Hz,1H)、7.26(m,4H)、7.39(m,2H)、7.47(d,J=7.6Hz,2H)、8.22(t,J=13.6Hz,2H)
LC−MS tr 19.0分(98.7%)
*下記参考文献の手順に従って2−アジドエチルアミンを合成した:Benalil, A.;
Carboni, B.; Vaultier, M. Synthesis of 1,2-aminoazides.Conversion to
unsymmetrical vicinal diamines by catalytic hydrogenation or reductive
alkylation with dichloroboranes. Tetrahedron 1991, 47, 8177-8194
中間体77:2−((1E,3E,5E)−5−(1−(6−((2−アジドエチル)アミノ)−6−オキソヘキシル)−3,3−ジメチルインドリン−2−イリデン)ペンタ−1,3−ジエン−1−イル)−1,3,3−トリメチル−3H−インドール−1−イウム
DMF 4ml中の(2−((1E,3E,5E)−5−(1−(5−カルボキシペンチル)−3,3−ジメチルインドリン−2−イリデン)ペンタ−1,3−ジエン−1−イル)−1,3,3−トリメチル−3H−インドール−1−イウム)(中間体76)(0.193mmol)の溶液に、TBTU(0.231mmol)及びDIPEA(0.424mmol)を添加した。室温にて1時間に亘り得られた溶液を撹拌した後、2−アジドエチルアミン*(0.267mmol)を添加した。この最終溶液を、室温にて一晩撹拌した。DMFを減圧下で除去した後、フラッシュクロマトグラフィー(100%DCMからDCM中10%MeOH)を行った。
収率:57%
1H−NMR(MeOD,400MHz): δ 1.46(m,2H)、1.68(m,14H)、1.75(m,2H)、2.22(t,J=7.2Hz,2H)、3.30(s,4H)、3.61(s,3H)、4.09(t,J=7.6Hz,2H)、6.25(dd,J=2.8Hz及びJ=13.6Hz,2H)、6.62(t,J=12.4Hz,1H)、7.26(m,4H)、7.39(m,2H)、7.47(d,J=7.6Hz,2H)、8.22(t,J=13.6Hz,2H)
LC−MS tr 19.0分(98.7%)
*下記参考文献の手順に従って2−アジドエチルアミンを合成した:Benalil, A.;
Carboni, B.; Vaultier, M. Synthesis of 1,2-aminoazides.Conversion to
unsymmetrical vicinal diamines by catalytic hydrogenation or reductive
alkylation with dichloroboranes. Tetrahedron 1991, 47, 8177-8194
最終化合物の合成
最終化合物の合成のため、Boc保護グアニジン中間体(中間体46〜54)、又は非保護グアニジン中間体(中間体55〜63)のいずれかを使用することができる。クリックケミストリー(Cu(I)触媒ヒュスゲンアジドアルキン付加環化)を用いることにより、種々の視覚化タグ(例えば、ローダミン、ビオチン、BODIPY)を中間体に付加することができる。
最終化合物の合成のため、Boc保護グアニジン中間体(中間体46〜54)、又は非保護グアニジン中間体(中間体55〜63)のいずれかを使用することができる。クリックケミストリー(Cu(I)触媒ヒュスゲンアジドアルキン付加環化)を用いることにより、種々の視覚化タグ(例えば、ローダミン、ビオチン、BODIPY)を中間体に付加することができる。
ローダミン最終生成物及びBODIPY最終生成物の場合、「クリック」反応が非保護グアニジン中間体に対して実施されたが、ビオチン及び4−フルオレンズアミド(fluorenzamide)は最終工程として脱保護によりboc保護グアニジン中間体に連結された。
ローダミン−アジド(中間体68)を、アルキンプローブ(中間体55〜58及び63)と連結し、そして、中間体58/63のリンカー部を保持する最終化合物が最も速い阻害速度定数を有することが分かった。したがって、種々の視覚化タグの更なる連結は、中間体58、又はその保護アナログ(中間体49)に対してのみ行われた。
in situで産生されたCu(I)触媒(CuSO4/アスコルビン酸ナトリウム)の存在下、水媒体中で室温にて「クリック」反応を行った(模式図4及び模式図5)。
同様の方法において、Cy5型可視化リンカーを用いたuPA活性依存型プローブの合成が可能であった。
模式図4:最終化合物1〜6を得るための、クリッカブルプローブ(中間体55〜58又は中間体63)におけるローダミン−アジド(中間体68)又はBODIPY−アジド(中間体73)の連結。
試薬及び条件:(a)CuSO4、アスコルビン酸ナトリウム、H2O、t−BuOH (b)CuSO4、アスコルビン酸ナトリウム、H2O、THF
模式図5:最終化合物7、8及び9をそれぞれ得るための、中間体58におけるビオチン−アジド(中間体72)、4−フルオロベンズアミド(中間体75)、Cy5−アジド(中間体77)の連結。
試薬及び条件:(a)i)CuSO4、アスコルビン酸ナトリウム、H2O、t−BuOH ii)TFA、DCM (b)i)CuSO4、アスコルビン酸ナトリウム、H2O、THF ii)TFA、DCM
生化学的評価 uPA及びその他の代表的なトリプシン様セリンプロテアーゼに対する中間体55〜63及び最終化合物1〜9のIC50値を判定した。後者は、血液凝固カスケード及び線維素溶解に関与する、tPA、プラスミン、トロンビン、及びFXaである。
最終化合物の合成
反応手順V
最終化合物1:2,2,2−トリフルオロ酢酸、N−(6−(ジエチルアミノ)−9−(2−(4−(8−(4−((2−(((1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチル)カルバモイル)オキシ)エトキシ)メチル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)オクタノイル)ピペラジン−1−カルボニル)フェニル)−3H−キサンテン−3−イリデン)−N−エチルエタンアミニウムクロリド2−(プロパ−2−イ二ルオキシ)エチル1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート(中間体55)(0.154mmol)、N−(9−(2−(4−(8−アジドオクタノイル)ピペラジン−1−カルボニル)フェニル)−6−(ジエチルアミノ)−3H−キサンテン−3−イリデン)−N−エチルエタンアミニウムクロリド(中間体68)(0.154mmol)、アスコルビン酸ナトリウム(0.369mmol)及び硫酸銅(II)(0.092mmol)を水(400μl)及びt−BuOH(400μl)に溶解した。その溶液を、室温にて5時間撹拌した。DCM(40ml)及びH2O(40ml)を添加した。有機層を分離し、ブライン溶液で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、真空下で除去した。粗生成物を少量のDCMに溶解し、Et2Oに添加した。沈殿が形成され、エーテルを除去した。残留した固体をEt2Oで数回洗浄した。
収率:29%
MS(ESI)m/z 607.9 [M+H]2+
1H−NMR(MeOD,400MHz): δ 1.32(m,18H)、1.52(m,2H)、1.87(m,2H)、2.33(t,J=7.2Hz,2H)、3.10(m,1H)、3.41(m,8H)、3.50(m,1H)、3.63(m,2H)、3.69(m,8H)、4.11(m,2H)、4.37(m,2H)、4.64(m,3H)、6.99(d,J=2.4Hz,2H)、7.10(dd,J=2.4Hz及びJ=9.6Hz,2H)、7.17〜7.44(m,16H)、7.54(m,1H)、7.73(m,1H)、7.80(m,2H)、7.94(br s,1H)
LC−MS tr 15.5分(90.8%)
反応手順V
最終化合物1:2,2,2−トリフルオロ酢酸、N−(6−(ジエチルアミノ)−9−(2−(4−(8−(4−((2−(((1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチル)カルバモイル)オキシ)エトキシ)メチル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)オクタノイル)ピペラジン−1−カルボニル)フェニル)−3H−キサンテン−3−イリデン)−N−エチルエタンアミニウムクロリド2−(プロパ−2−イ二ルオキシ)エチル1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチルカルバメート2,2,2−トリフルオロアセテート(中間体55)(0.154mmol)、N−(9−(2−(4−(8−アジドオクタノイル)ピペラジン−1−カルボニル)フェニル)−6−(ジエチルアミノ)−3H−キサンテン−3−イリデン)−N−エチルエタンアミニウムクロリド(中間体68)(0.154mmol)、アスコルビン酸ナトリウム(0.369mmol)及び硫酸銅(II)(0.092mmol)を水(400μl)及びt−BuOH(400μl)に溶解した。その溶液を、室温にて5時間撹拌した。DCM(40ml)及びH2O(40ml)を添加した。有機層を分離し、ブライン溶液で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥させ、濾過し、真空下で除去した。粗生成物を少量のDCMに溶解し、Et2Oに添加した。沈殿が形成され、エーテルを除去した。残留した固体をEt2Oで数回洗浄した。
収率:29%
MS(ESI)m/z 607.9 [M+H]2+
1H−NMR(MeOD,400MHz): δ 1.32(m,18H)、1.52(m,2H)、1.87(m,2H)、2.33(t,J=7.2Hz,2H)、3.10(m,1H)、3.41(m,8H)、3.50(m,1H)、3.63(m,2H)、3.69(m,8H)、4.11(m,2H)、4.37(m,2H)、4.64(m,3H)、6.99(d,J=2.4Hz,2H)、7.10(dd,J=2.4Hz及びJ=9.6Hz,2H)、7.17〜7.44(m,16H)、7.54(m,1H)、7.73(m,1H)、7.80(m,2H)、7.94(br s,1H)
LC−MS tr 15.5分(90.8%)
以下の化合物を同様の方法によって調製した:
最終化合物2:2,2,2−トリフルオロ酢酸、N−(6−(ジエチルアミノ)−9−(2−(4−(8−(4−(11−(ジフェノキシホスホリル)−12−(4−グアニジノフェニル)−9−オキソ−2,5,8−トリオキサ−10−アザドデシル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)オクタノイル)ピペラジン−1−カルボニル)フェニル)−3H−キサンテン−3−イリデン)−N−エチルエタンアミニウムクロリド
収率:66%
MS(ESI)m/z 629.9 [M+H)]2+
HPLC(214nm)tr 23.8分(91.1%)
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 1.32(m,18H)、1.53(m,2H)、1.89(m,2H)、2.33(m,2H)、3.12(m,1H)、3.39(m,8H)、3.62(m,6H),8.37(q,J=6.8Hz,8H)、4.09(m,2H)、4.38(m,2H)、4.62(m,2H)、4.67(m,1H)、6.9〜8.0(m,25H)
LC−MS tr 16.0分(96.0%)
最終化合物2:2,2,2−トリフルオロ酢酸、N−(6−(ジエチルアミノ)−9−(2−(4−(8−(4−(11−(ジフェノキシホスホリル)−12−(4−グアニジノフェニル)−9−オキソ−2,5,8−トリオキサ−10−アザドデシル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)オクタノイル)ピペラジン−1−カルボニル)フェニル)−3H−キサンテン−3−イリデン)−N−エチルエタンアミニウムクロリド
収率:66%
MS(ESI)m/z 629.9 [M+H)]2+
HPLC(214nm)tr 23.8分(91.1%)
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 1.32(m,18H)、1.53(m,2H)、1.89(m,2H)、2.33(m,2H)、3.12(m,1H)、3.39(m,8H)、3.62(m,6H),8.37(q,J=6.8Hz,8H)、4.09(m,2H)、4.38(m,2H)、4.62(m,2H)、4.67(m,1H)、6.9〜8.0(m,25H)
LC−MS tr 16.0分(96.0%)
最終化合物3:2,2,2−トリフルオロ酢酸、N−(6−(ジエチルアミノ)−9−(2−(4−(8−(4−(14−(ジフェノキシホスホリル)−15−(4−グアニジノフェニル)−12−オキソ−2,5,8,11−テトラオキサ−13−アザペンタデシル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)オクタノイル)ピペラジン−1−カルボニル)フェニル)−3H−キサンテン−3−イリデン)−N−エチルエタンアミニウムクロリド
追加精製工程:生成物をDCMに溶解し、EtOAcに添加した。沈殿が形成された。この手順を繰り返したが、化合物はヘキサンに添加した。
収率:37%
MS(ESI)m/z 651.9 [M+H]2+1H−NMR(MeOD,400MHz)_ 1.30(m,18H)、1.52(m,2H)、1.87(m,2H)、2.32(t,J=7.2Hz,2H)、3.10(m,1H)、3.98(m,8H)、3.56〜3.71,(m,18H)、4.07(m,2H)、4.36(m,2H)、4.60(m,3H)、6.95(d,J=2.4Hz,2H)、7.06(dd,J=2.4Hz及びJ=9.6Hz,2H)、7.15〜7.52(m,16H)、7.69(m,1H)、7.77(m,2H)、7.90(m,2H)
LC−MS tr 13.9分(90.1%)
追加精製工程:生成物をDCMに溶解し、EtOAcに添加した。沈殿が形成された。この手順を繰り返したが、化合物はヘキサンに添加した。
収率:37%
MS(ESI)m/z 651.9 [M+H]2+1H−NMR(MeOD,400MHz)_ 1.30(m,18H)、1.52(m,2H)、1.87(m,2H)、2.32(t,J=7.2Hz,2H)、3.10(m,1H)、3.98(m,8H)、3.56〜3.71,(m,18H)、4.07(m,2H)、4.36(m,2H)、4.60(m,3H)、6.95(d,J=2.4Hz,2H)、7.06(dd,J=2.4Hz及びJ=9.6Hz,2H)、7.15〜7.52(m,16H)、7.69(m,1H)、7.77(m,2H)、7.90(m,2H)
LC−MS tr 13.9分(90.1%)
最終化合物4:2,2,2−トリフルオロ酢酸、N−(6−(ジエチルアミノ)−9−(2−(4−(8−(4−(3−(((1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチル)カルバモイル)オキシ)プロピル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)オクタノイル)ピペラジン−1−カルボニル)フェニル)−3H−キサンテン−3−イリデン)−N−エチルエタンアミニウムクロリド
収率:65%
MS(ESI)m/z 599.8 [M+H]2+
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 1.30(m,18H)、1.52(m,2H)、1.86(m,4H)、2.32(m,2H)、2.69(m,2H)、3.10(m,1H)、3.38(m,8H)、3.68(q,J=6.8Hz,8H)、3.98(m,2H)、4.33(m,2H)、4.63(m,1H)、6.9〜7.8(m,25H)
HPLC(214nm)tr 23.8分(91.8%)
LC−MS tr 16.4分(97.1%)
収率:65%
MS(ESI)m/z 599.8 [M+H]2+
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 1.30(m,18H)、1.52(m,2H)、1.86(m,4H)、2.32(m,2H)、2.69(m,2H)、3.10(m,1H)、3.38(m,8H)、3.68(q,J=6.8Hz,8H)、3.98(m,2H)、4.33(m,2H)、4.63(m,1H)、6.9〜7.8(m,25H)
HPLC(214nm)tr 23.8分(91.8%)
LC−MS tr 16.4分(97.1%)
最終化合物5:2,2,2−トリフルオロ酢酸、N−(9−(2−(4−(8−(4−(3−(((1−(ビス(4−アセトアミドフェノキシ)ホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチル)カルバモイル)オキシ)プロピル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)オクタノイル)ピペラジン−1−カルボニル)フェニル)−6−(ジエチルアミノ)−3H−キサンテン−3−イリデン)−N−エチルエタンアミニウムクロリド
収率:51%
MS(ESI)m/z 657.2 [M+H]2+
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 1.34(m,18H)、1.51(m,2H)、1.85(m,4H)、2.11(s,6H)、2.31(t,2H)、2.68(t,J=7.6Hz,2H)、3.13(m,1H)、3.36(m,9H)、3.65(q,8H)、3.95(m,2H)、4.30(t,2H)、4.60(m,1H)、6.94〜7.55(m,23H)
LC−MS tr 14.5分(91.3%)
収率:51%
MS(ESI)m/z 657.2 [M+H]2+
1H−NMR(MeOD,400MHz)δ 1.34(m,18H)、1.51(m,2H)、1.85(m,4H)、2.11(s,6H)、2.31(t,2H)、2.68(t,J=7.6Hz,2H)、3.13(m,1H)、3.36(m,9H)、3.65(q,8H)、3.95(m,2H)、4.30(t,2H)、4.60(m,1H)、6.94〜7.55(m,23H)
LC−MS tr 14.5分(91.3%)
最終化合物6:10−(7−(4−(3−(((1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチル)カルバモイル)オキシ)プロピル−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)ヘプチル)−5,5−ジフルオロ−1,3,7,9−テトラメチル−5H−ジピロロ[1,2−c:2’,1’−f][1,3,2]ジアザボリニン−4−イウム−5−ウイド2,2,2−トリフルオロアセテート
t−BuOHに代えてTHFを使用した。精製工程において沈殿はなかった。抽出後、生成物は純粋物であった。
収率:82%
MS(ESI)m/z 908.5 [M+1]+
1H−NMR(MeOH,400MHz): δ 1.25〜1.65(m,8H)、1.88(m,4H)、2.43(s,6H)、2.45(s,6H)、2.68(t,J=7.5Hz,2H)、3.00(m,2H)、3.09(m,1H)、3.43(m,1H)、3.97(t,J=6.1Hz,2H)、4.34(t,J=6.9Hz,2H)、4.64(m,1H)、6.13(s,2H)、7.15〜7.50(m,14H)、7.67(s,1H)
LC−MS tr 17.7分(95.0%)
t−BuOHに代えてTHFを使用した。精製工程において沈殿はなかった。抽出後、生成物は純粋物であった。
収率:82%
MS(ESI)m/z 908.5 [M+1]+
1H−NMR(MeOH,400MHz): δ 1.25〜1.65(m,8H)、1.88(m,4H)、2.43(s,6H)、2.45(s,6H)、2.68(t,J=7.5Hz,2H)、3.00(m,2H)、3.09(m,1H)、3.43(m,1H)、3.97(t,J=6.1Hz,2H)、4.34(t,J=6.9Hz,2H)、4.64(m,1H)、6.13(s,2H)、7.15〜7.50(m,14H)、7.67(s,1H)
LC−MS tr 17.7分(95.0%)
反応手順W
最終化合物7:3−(1−(13−オキソ−17−((3aS,4S,6aR)−2−オキソヘキサヒドロ−1H−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル)−3,6,9−トリオキサ−12−アザヘプタデシル)−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)プロピル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチル)カルバメート2,2,2−トリフルオロアセテートペンタ−4−イン−1−イル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−(2,3−ビス(tert−ブトキシカルボニル)グアニジン)フェニル)エチル)カルバメート(中間体49)(0.139mmol)及びN−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−5−((3aS,4S,6aR)−2−オキソヘキサヒドロ−1H−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル)ペンタンアミド(中間体72)(0.139mmol)を、t−BuOH及びH2O(各600μl)の混合物に溶解した後、アスコルビン酸ナトリウム(0.333mmol)及びCuSO4(0.083mmol)を添加した。得られた溶液を、室温にて4時間撹拌した。水及びDCMを添加し、水層をDCMで更に2回洗浄した。混合された有機層を1N HCl、飽和重炭酸塩、及びブラインの溶液で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。得られた粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(EtOAc中20%MeOH)により精製し、3−(1−(13−オキソ−17−((3aS,4S,6aR)−2−オキソヘキサヒドロ−1H−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル)−3,6,9−トリオキサ−12−アザヘプタデシル)−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)プロピル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−(2,3−ビス(tert−ブトキシカルボニル)グアニジノフェニル)エチル)カルバメート2,2,2−トリフルオロアセテートを得た。
収率:62%
MS(ESI)m/z 1187.8 [M+Na]+
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 1.45(s,9H)、1.51(m,2H)、1.57(s,9H)、1.60〜1.75(m,4H)、1.88(m,2H)、2.18(t,J=7.4Hz,2H)、2.67(m,3H)、2.90(dd,1H)、3.05(m,1H)、3.17(m,1H)、3.40(m,1H)、3.50(m,2H)、3.55(s,4H)、3.58(s,4H)、3.85(t,J=5.1Hz,2H)、3.96(dt,J=1.7Hz及び6.1Hz,2H)、4.26(m,1H)、4.46(m,1H)、4.51(t,J=4.6Hz,2H)、4.64(m,1H)、7.1〜7.55(m,14H)、7.76(s,1H)
最終化合物7:3−(1−(13−オキソ−17−((3aS,4S,6aR)−2−オキソヘキサヒドロ−1H−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル)−3,6,9−トリオキサ−12−アザヘプタデシル)−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)プロピル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチル)カルバメート2,2,2−トリフルオロアセテートペンタ−4−イン−1−イル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−(2,3−ビス(tert−ブトキシカルボニル)グアニジン)フェニル)エチル)カルバメート(中間体49)(0.139mmol)及びN−(2−(2−(2−(2−アジドエトキシ)エトキシ)エトキシ)エチル)−5−((3aS,4S,6aR)−2−オキソヘキサヒドロ−1H−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル)ペンタンアミド(中間体72)(0.139mmol)を、t−BuOH及びH2O(各600μl)の混合物に溶解した後、アスコルビン酸ナトリウム(0.333mmol)及びCuSO4(0.083mmol)を添加した。得られた溶液を、室温にて4時間撹拌した。水及びDCMを添加し、水層をDCMで更に2回洗浄した。混合された有機層を1N HCl、飽和重炭酸塩、及びブラインの溶液で洗浄し、無水Na2SO4上で乾燥し、濾過し、蒸発させた。得られた粗生成物をフラッシュクロマトグラフィー(EtOAc中20%MeOH)により精製し、3−(1−(13−オキソ−17−((3aS,4S,6aR)−2−オキソヘキサヒドロ−1H−チエノ[3,4−d]イミダゾール−4−イル)−3,6,9−トリオキサ−12−アザヘプタデシル)−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)プロピル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−(2,3−ビス(tert−ブトキシカルボニル)グアニジノフェニル)エチル)カルバメート2,2,2−トリフルオロアセテートを得た。
収率:62%
MS(ESI)m/z 1187.8 [M+Na]+
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 1.45(s,9H)、1.51(m,2H)、1.57(s,9H)、1.60〜1.75(m,4H)、1.88(m,2H)、2.18(t,J=7.4Hz,2H)、2.67(m,3H)、2.90(dd,1H)、3.05(m,1H)、3.17(m,1H)、3.40(m,1H)、3.50(m,2H)、3.55(s,4H)、3.58(s,4H)、3.85(t,J=5.1Hz,2H)、3.96(dt,J=1.7Hz及び6.1Hz,2H)、4.26(m,1H)、4.46(m,1H)、4.51(t,J=4.6Hz,2H)、4.64(m,1H)、7.1〜7.55(m,14H)、7.76(s,1H)
この得られた「クリック」生成物を、DCM 1ml及びTFA 1ml中に溶解することによって脱保護した。この溶液を室温にて2時間撹拌した後、溶媒を蒸発させた。低温エーテルを添加し、化合物を洗浄した。
収率:54%
MS(ESI)m/z 965.5 [M+1]+、494.1 [(M+Na)/2]+
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 1.44(m,2H)、1.50〜1.75(m,4H)、1.89(m,2H)、2.20(t,J=7.4Hz,2H)、2.70(m,3H)、2.92(dd,1H)、3.09(m,1H)、3.19(m,1H)、3.44(m,1H)、3.51(m,2H)、3.58(s,4H)、3.61(s,4H)、3.89(t,J=5.1Hz,2H)、4.00(m,2H)、4.29(m,1H)、4.48(m,1H)、4.51(t,J=4.9Hz,2H)、4.64(m,1H)、7.15〜7.50(m,14H)、7.76(s,1H)
LC−MS tr 12.9分(98.2%)
収率:54%
MS(ESI)m/z 965.5 [M+1]+、494.1 [(M+Na)/2]+
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 1.44(m,2H)、1.50〜1.75(m,4H)、1.89(m,2H)、2.20(t,J=7.4Hz,2H)、2.70(m,3H)、2.92(dd,1H)、3.09(m,1H)、3.19(m,1H)、3.44(m,1H)、3.51(m,2H)、3.58(s,4H)、3.61(s,4H)、3.89(t,J=5.1Hz,2H)、4.00(m,2H)、4.29(m,1H)、4.48(m,1H)、4.51(t,J=4.9Hz,2H)、4.64(m,1H)、7.15〜7.50(m,14H)、7.76(s,1H)
LC−MS tr 12.9分(98.2%)
以下の化合物を同様の方法によって調製した:
最終化合物8:3−(1−(1−(4−フルオロフェニル)−1−オキソ−5,8,11−トリオキサ−2−アザトリデカン−13−イル)−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)プロピル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチル)カルバメートヒドロクロリド
t−BuOHに代えてTHFを使用した。フラッシュ精製(EtoAc中10%MeOH)
「クリック」生成物の脱保護の後、得られた化合物を、エーテル中の1N HClをTFA塩に添加することによりHCl塩に変換した。沈殿が形成された。
収率:98%
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 1.95(m,2H)、2.80(t,J=8.0Hz,2H)、3.10(m,1H)、3.41(m,1H)、3.56(m,12H)、3.90(t,J=8.0Hz,2H)、3.99(m,1H)、4.04(m,1H)、4.65(m,3H)、7.20(m,10H)、7.38(m,4H)、7.45(d,J=8.0Hz,2H)、7.88(dd,J=5.3Hz及びJ=7.2Hz,2H)、8.21(s,1H)
LC−MS tr 14.1分(97.4%)
最終化合物8:3−(1−(1−(4−フルオロフェニル)−1−オキソ−5,8,11−トリオキサ−2−アザトリデカン−13−イル)−1H−1,2,3−トリアゾール−4−イル)プロピル(1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチル)カルバメートヒドロクロリド
t−BuOHに代えてTHFを使用した。フラッシュ精製(EtoAc中10%MeOH)
「クリック」生成物の脱保護の後、得られた化合物を、エーテル中の1N HClをTFA塩に添加することによりHCl塩に変換した。沈殿が形成された。
収率:98%
1H−NMR(MeOD,400MHz):δ 1.95(m,2H)、2.80(t,J=8.0Hz,2H)、3.10(m,1H)、3.41(m,1H)、3.56(m,12H)、3.90(t,J=8.0Hz,2H)、3.99(m,1H)、4.04(m,1H)、4.65(m,3H)、7.20(m,10H)、7.38(m,4H)、7.45(d,J=8.0Hz,2H)、7.88(dd,J=5.3Hz及びJ=7.2Hz,2H)、8.21(s,1H)
LC−MS tr 14.1分(97.4%)
最終化合物9:2−((1E,3E,5E)−5−(1−(6−((2−(4−(3−(((1−(ジフェノキシホスホリル)−2−(4−グアニジノフェニル)エチル)カルバモイル)オキシ)プロピル)−1H−1,2,3−トリアゾール−1−イル)エチル)アミノ)−6−オキソヘキシル)−3,3−ジメチルインドリン−2−イリデン)ペンタ−1,3−ジエン−1−イル)−1,3,3−トリメチル−3H−インドール−1−イウム
生成物を凍結乾燥した(水/t−BuOH (3/1)中に溶解)。
収率:87%
1H−NMR(MeOD,400MHz): 1.41(m,2H)、1.60(m,2H)、1.72(m,8H)、1.78(m,3H)、1.89(m,3H)、2.17(t,J=7.2Hz,2H)、2.70(t,J=7.6Hz,2H)、3.11(m,1H)、3.37(s,2H)、3.45(m,1H)、3.62(s,4H)、3.99(t,J=6.0Hz,2H)、4.11(t,J=7.6Hz,1H)、4.45(t,J=5.6Hz,2H)、4.65(m,1H)、6.28(dd,J=13.6Hz及びJ=17.6Hz、2H)、6.63(t,J=12.4Hz,1H)、7.15〜7.52(m,22H)、7.70(s,1H)、8.04(d,J=8.8H,1H)、8.26(t,J=11.6Hz,2H)
LC−MS tr 17.4分(92.2%)
生成物を凍結乾燥した(水/t−BuOH (3/1)中に溶解)。
収率:87%
1H−NMR(MeOD,400MHz): 1.41(m,2H)、1.60(m,2H)、1.72(m,8H)、1.78(m,3H)、1.89(m,3H)、2.17(t,J=7.2Hz,2H)、2.70(t,J=7.6Hz,2H)、3.11(m,1H)、3.37(s,2H)、3.45(m,1H)、3.62(s,4H)、3.99(t,J=6.0Hz,2H)、4.11(t,J=7.6Hz,1H)、4.45(t,J=5.6Hz,2H)、4.65(m,1H)、6.28(dd,J=13.6Hz及びJ=17.6Hz、2H)、6.63(t,J=12.4Hz,1H)、7.15〜7.52(m,22H)、7.70(s,1H)、8.04(d,J=8.8H,1H)、8.26(t,J=11.6Hz,2H)
LC−MS tr 17.4分(92.2%)
in vitroアッセイ及びin vivoアッセイ
uPA阻害:in vitro評価 80μMのKmで発色基質Biophen CS−61(44)(LpyroGlu−Gly L−Arg−p−NA・HCl)を用いて、Spectramax 340(Molecular Devices)マイクロタイタープレートリーダーにおいて、37℃で酵素活性を測定した。
uPA阻害:in vitro評価 80μMのKmで発色基質Biophen CS−61(44)(LpyroGlu−Gly L−Arg−p−NA・HCl)を用いて、Spectramax 340(Molecular Devices)マイクロタイタープレートリーダーにおいて、37℃で酵素活性を測定した。
基質及びヒト酵素は、Nodiaより入手した。405nmで反応をモニタリングし、20分間で0吸光単位〜0.25吸光単位において初速度を特定した。反応混合物は、最終容量200μLにおいて緩衝溶液145μL中に250μMの基質と約1mUの酵素とを含むものであった。50mMトリス緩衝溶液(pH8.8)を使用した。各インヒビター濃度から5μLを添加し、総容量0.2mL中0μM〜250μMの最終濃度を得た。定期的に2度に亘って活性測定を行った。基質の添加前に37℃にて15分間の酵素とプレインキュベーションした後の酵素活性を50%に低下させるために必要とされるインヒビターの濃度として、IC50値を規定する。Grafit5を用いた4パラメータロジスティック方程式によりデータをフィッティングすることによってIC50値を取得した。
式中、s=傾斜因子、v=速度、I0=インヒビター濃度、及び範囲=フィッティングされた非阻害値−バックグラウンドである。方程式は、xが増加するとともにyが低下すると仮定する。
インヒビターのストック溶液をDMSO中に調製し、−20℃で保存した。本明細書に記載される化合物が擬1次反応速度に従ってuPAを完全に不活性化することから、IC50値は不活性化の二次速度定数と逆相関する。単純な擬1次の不活性化プロセスについては、下記方程式に記載されるように、インヒビター(vi)とインキュベーションを行った後の活性は、インヒビターの濃度(i)により変化する。
式中、V0はインヒビターが存在しない場合の活性であり、kが不活性化の二次速度定数であり、tが時間である。経時的な阻害から不活性化速度定数を決定した。
基質(最終濃度250μM)とインヒビターを混合し、酵素を含む緩衝溶液を0時間で添加した。20分以内に酵素の完全阻害が得られるようにインヒビター濃度を選択した。進行曲線は、時間を関数として生成されるp−ニトロアニリドの吸光度を示す。最初はいずれのインヒビターも酵素に結合しておらず、進行曲線(dA/dt)に対する接線は遊離酵素の濃度に比例する。上述のように、インヒビターの結合反応速度によって経時的に遊離酵素濃度が低下する。進行曲線は、擬1次条件([I]0>>[E]0)において記録され、全時間経過において基質の変換は10%未満であった。これらの条件において、dA/dtは時間と共に指数関数的に低下した。擬一次速度定数であるkobs値を得るため、統合速度方程式を用いて進行曲線をフィッティングした。
式中、At=時間tにおける吸光度、A0=時間0における吸光度、及びv0=非阻害初速度である。
インヒビター濃度([I]0)に対するkobsのプロットの直線部分の傾斜から見かけ上の二次速度定数(kapp)を算出した。インヒビターと基質とが競合する場合、酵素の或る特定の画分が酵素基質複合体として存在するため、kappは上述の「真の」二次速度定数kよりも小さい。Lambeir他によって説明されるように40、kappは実験に使用される基質濃度に依存する。ほとんどの最終化合物について、[I]0に対するkobsのプロットは直線ではないが、双曲線関数:kobs=k2[I]0/(K1+[I]0)(二段階機構(two-step mechanism))によりフィッティングすることができた。式中、K1は可逆的酵素インヒビター複合体の解離定数であり、k2は酵素の不可逆的修飾に関連する一次速度定数である。k2/K1としてkappを算出することができた。
uPAに対する選択性の決定。プラスミン(ヒト血漿由来、Sigma)、tPA(組換え体、Nodia)、トロンビン(ヒト血漿由来、Sigma)及びFXaに対するIC50値は、uPAに対するものと同様の方法で決定された。tPA(Km:1mM)に対してはBiophen CS−05(88)(H−D−Ile−Pro−Arg−pNa・2HCl)、プラスミン(Km:400μM)及びトロンビン(Km:150μM)に対してはbiophen CS−21(66)(pyroGlu−Pro−Arg−pNA・HCl)、そしてFXa(Km:1.5mM)に対してはBiophen CS−11(32)(Suc−Ile−Gly(a Pip)Gly−Arg−pNA.HCl)を基質として使用した。トロンビン及びプラスミンに対して基質580μM、tPAに対して基質1.25mM、FXaに対して基質522μM、そしてトリプシンに対して基質425μMと、酵素約5mUと、緩衝溶液145μLとが混合物に含まれていた。tPA及びトロンビン対してTris緩衝溶液(pH8.3)を使用し、FXaに対してTris緩衝溶液(pH8.3)を使用し、プラスミンに対してTris緩衝溶液(pH7.4)を使用した。結果を表1に示す。
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malignancy. Current Pharmaceutical Design 2004, 10, 39-49.
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Plasminogen Activator System: A Target for Anti-Cancer Therapy. Current Cancer
Drug Targets 2009, 9, 32-71.
12. Dass, K.; Ahmad, A.; Azmi, A. S.; Sarkar, S. H.; Sarkar, F. H.
Evolving role of uPA/uPAR system in human cancers. Cancer Treat Rev 2008, 34,
122-36.
13. Kjellman, A.; Akre, O.; Gustafsson, O.; Hoyer-Hansen, G.; Lilja, H.;
Norming, U.; Piironen, T.; Tornblom, M. Soluble urokinase plasminogen activator
receptor as a prognostic marker in men participating in prostate cancer
screening. Journal of Internal Medicine 2011, 269, 299-305.
14. Harbeck, N.; Thomssen, C. A New Look at Node-Negative Breast Cancer.
Oncologist 2011, 16, 51-60.
15. Harbeck, N.; Schmitt, M.; Meisner, C.; Friedel, C.; Untch, M.;
Schmidt, M.; Lisboa, B.; Sweep, C.; Janicke, F.; Thomssen, C.; Grp, C. N. S.
Final 10-year analysis of prospective multicenter Chemo N0 trial for validation
of ASCO-recommended biomarkers uPA/PAI-1 for therapy decision making in
node-negative breast cancer. Journal of Clinical Oncology 2009, 27, -.
16. Chu, S. C.; Yang, S. F.; Lue, K. H.; Hsieh, Y. S.; Hsiao, T. Y.; Lu,
K. H. Urokinase-type plasminogen activator, receptor, and inhibitor correlating
with gelatinase-B (MMP-9) contribute to inflammation in Gouty arthritis of the
knee. Journal of Rheumatology 2006, 33, 311-317.
17. Das, A.; Boyd, N.; Jones, T. R.; Talarico, N.; McGuire, P. G.
Inhibition of choroidal neovascularization by a peptide inhibitor of the
urokinase plasminogen activator and receptor system in a mouse model. Archives
of Ophthalmology 2004, 122, 1844-1849.
18. Fish, P. V.; Barber, C. G.; Brown, D. G.; Butt, R.; Collis, M. G.;
Dickinson, R. P.; Henry, B. T.; Horne, V. A.; Huggins, J. P.; King, E.; O'Gara,
M.; McCleverty, D.; McIntosh, F.; Phillips, C.; Webster, R. Selective
urokinase-type plasminogen activator inhibitors. 4.
1-(7-Sulfonamidoisoquinolinyl)guanidines. Journal of Medicinal Chemistry 2007,
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19. Iyer, A. M.; Zurolo, E.; Boer, K.; Baayen, J. C.; Giangaspero, F.;
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Urokinase Plasminogen Activator in Human Epileptogenic Pathologies.
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21. Schmitt, M.; Mengele, K.; Napieralski, R.; Magdolen, V.; Reuning,
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Comparative Assessment of Substrates and Activity Based Probes as Tools for
Non-Invasive Optical Imaging of Cysteine Protease Activity. Plos One 2009, 4,
-.
24. Frye, S. V. The art of the chemical probe. Nature Chemical Biology
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25. Kodadek, T. Rethinking screening. Nature Chemical Biology 2010, 6,
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Superfamilies: Serine Hydrolases as a Case Study. Journal of Biological
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27. Bachovchin, D. A.; Ji, T. Y.; Li, W. W.; Simon, G. M.; Blankman, J.
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Design, synthesis, and characterization of urokinase
plasminogen-activator-sensitive near-infrared reporter. Chemistry & Biology
2004, 11, 99-106.
37. Joossens, J.; Ali, O. M.; El-Sayed, I.; Surpateanu, G.; Van der
Veken, P.; Lambeir, A. M.; Setyono-Han, B.; Foekens, J. A.; Schneider, A.;
Schmalix, W.; Haemers, A.; Augustyns, K. Small, potent, and selective diaryl
phosphonate inhibitors for urokinase-type plasminogen activator with in vivo
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38. Van der Veken, P.; El Sayed, I.; Joossens, J.; Stevens, C. V.;
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39. Nguyen, T.; Francis, M. B. Practical synthetic route to
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40. Lambeir, A. M.; Borloo, M.; DeMeester, I.; Belyaev, A.; Augustyns,
K.; Hendriks, D.; Scharpe, S.; Haemers, A. Dipeptide-derived diphenyl
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3. Sanders, A. J.; Webb, S. L.; Parr, C.; Mason, M. D.; Jiang, W. G. The
Type II Transmembrane Serine Protease, Matriptase-2: Possible Links to Cancer?
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16. Chu, S. C.; Yang, S. F.; Lue, K. H.; Hsieh, Y. S.; Hsiao, T. Y.; Lu,
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17. Das, A.; Boyd, N.; Jones, T. R.; Talarico, N.; McGuire, P. G.
Inhibition of choroidal neovascularization by a peptide inhibitor of the
urokinase plasminogen activator and receptor system in a mouse model. Archives
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M.; McCleverty, D.; McIntosh, F.; Phillips, C.; Webster, R. Selective
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1-(7-Sulfonamidoisoquinolinyl)guanidines. Journal of Medicinal Chemistry 2007,
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Arcella, A.; Di Gennaro, G. C.; Esposito, V.; Spliet, W. G. M.; Van Rijen, P.
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S.; von Minckwitz, G.; Thomssen, C.; Harbeck, N. uPA and PAI-1 in breast
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21. Schmitt, M.; Mengele, K.; Napieralski, R.; Magdolen, V.; Reuning,
U.; Gkazepis, A.; Sweep, F.; Brunner, N.; Foekens, J.; Harbeck, N. Clinical
utility of level-of-evidence-1 disease forecast cancer biomarkers uPA and its
inhibitor PAI-1. Expert Review of Molecular Diagnostics 2010, 10, 1051-1067.
22. Cravatt, B. F.; Wright, A. T.; Kozarich, J. W. Activity-based
protein profiling: From enzyme chemistry. Annual Review of Biochemistry 2008,
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23. Blum, G.; Weimer, R. M.; Edgington, L. E.; Adams, W.; Bogyo, M.
Comparative Assessment of Substrates and Activity Based Probes as Tools for
Non-Invasive Optical Imaging of Cysteine Protease Activity. Plos One 2009, 4,
-.
24. Frye, S. V. The art of the chemical probe. Nature Chemical Biology
2010, 6, 159-161.
25. Kodadek, T. Rethinking screening. Nature Chemical Biology 2010, 6,
162-165.
26. Simon, G. M.; Cravatt, B. F. Activity-based Proteomics of Enzyme
Superfamilies: Serine Hydrolases as a Case Study. Journal of Biological
Chemistry 2010, 285, 11051-11055.
27. Bachovchin, D. A.; Ji, T. Y.; Li, W. W.; Simon, G. M.; Blankman, J.
L.; Adibekian, A.; Hoover, H.; Niessen, S.; Cravatt, B. F. Superfamily-wide
portrait of serine hydrolase inhibition achieved by library-versus-library
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28. Edgington, L. E.; Berger, A. B.; Blum, G.; Albrow, V. E.; Paulick,
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caspase-targeted activity-based probes. Nature Medicine 2009, 15, 967-U177.
29. Brown, C. M.; Ray, M.; Eroy-Reveles, A. A.; Egea, P.; Tajon, C.;
Craik, C. S. Peptide Length and Leaving-Group Sterics Influence Potency of
Peptide Phosphonate Protease Inhibitors. Chemistry & Biology 2011, 18,
48-57.
30. Rao, J. H.; Dragulescu-Andrasi, A.; Yao, H. Q.; Yao, H. Q.
Fluorescence imaging in vivo: recent advances. Current Opinion in Biotechnology
2007, 18, 17-25.
31. Mahmood, U.; Weissleder, R. Near-infrared optical imaging of
proteases in cancer. Molecular Cancer Therapeutics 2003, 2, 489-496.
32. Elias, D. R.; Thorek, D. L.; Chen, A. K.; Czupryna, J.; Tsourkas, A.
In vivo imaging of cancer biomarkers using activatable molecular probes. Cancer
Biomark 2008, 4, 287-305.
33. Oikonomopoulou, K.; Hansen, K. K.; Baruch, A.; Hollenberg, M. D.;
Diamandis, E. P. Immunofluorometric activity-based probe analysis of active
KLK6 in biological fluids. Biological Chemistry 2008, 389, 747-756.
34. Pan, Z. Y.; Jeffery, D. A.; Chehade, K.; Beltman, J.; Clark, J. M.;
Grothaus, P.; Bogyo, M.; Baruch, A. Development of activity-based probes for
trypsin-family serine proteases. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters
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35. Martin, S. L.; Walker, B. 2011.
36. Law, B.; Curino, A.; Bugge, T. H.; Weissleder, R.; Tung, C. H.
Design, synthesis, and characterization of urokinase
plasminogen-activator-sensitive near-infrared reporter. Chemistry & Biology
2004, 11, 99-106.
37. Joossens, J.; Ali, O. M.; El-Sayed, I.; Surpateanu, G.; Van der
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Schmalix, W.; Haemers, A.; Augustyns, K. Small, potent, and selective diaryl
phosphonate inhibitors for urokinase-type plasminogen activator with in vivo
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38. Van der Veken, P.; El Sayed, I.; Joossens, J.; Stevens, C. V.;
Augustyns, K.; Haemers, A. Lewis acid catalyzed synthesis of N-protected
diphenyl 1-aminoalkylphosphonates. Synthesis-Stuttgart 2005, 634-638.
39. Nguyen, T.; Francis, M. B. Practical synthetic route to
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40. Lambeir, A. M.; Borloo, M.; DeMeester, I.; Belyaev, A.; Augustyns,
K.; Hendriks, D.; Scharpe, S.; Haemers, A. Dipeptide-derived diphenyl
phosphonate esters: Mechanism-based inhibitors of dipeptidyl peptidase IV.
Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects 1996, 1290, 76-82.
Claims (18)
- 式I:
R1及びR2は、−H、OH、−ハロ、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、−NR5R6、−(C=O)−R7及びSO2−R8を含む群から各々独立して選択され;
R5、R6、R9及びR10は、−H、−O、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル及び−(C=O)−C1〜6アルキルを含む群から各々独立して選択され;
R7及びR8は、−ハロ、−OH、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、及び−NR9R10を含む群から各々独立して選択され;
R3は、−グアニジノであり;
Aは、直接結合及びC1〜6アルキルを含む一覧から選択され;
Lは、−SO2−R4−アミド−;−SO2−R4−スルホンアミド;−SO2−R4−トリアゾール−;−SO2−R4−尿素−;−SO2−R4−アミン;−SO2−R4−カルバメート−;−(C=O)−R4−アミド−;−(C=O)−R4−スルホンアミド−;−(C=O)−R4−トリアゾール−;−(C=O)−R4−尿素−;−(C=O)−R4−アミン−;−(C=O)−R4−カルバメート−;−(C=O)−O−R4−アミド−;−(C=O)−O−R4−スルホンアミド−;−(C=O)−O−R4−トリアゾール−;−(C=O)−O−R4−尿素−;−(C=O)−O−R4−アミン−;−(C=O)−O−R4−カルバメート−;−(C=O)−N−R4−アミド−、−(C=O)−N−R4−スルホンアミド−;−(C=O)−N−R4−トリアゾール−;−(C=O)−N−R4−尿素−;−(C=O)−N−R4−アミン−;−(C=O)−N−R4−カルバメート−;−R4−アミド−、−R4−スルホンアミド−;−R4−トリアゾール−;−R4−尿素−;−R4−アミン−;−R4−カルバメート−を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
m、n及びoは、各々独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり、
Yは、検出可能な標識を表す)
の化合物、又はその立体異性体、互変異性体、ラセミ体、代謝体、プロドラッグ若しくはプレドラッグ、塩、水和物、又は溶媒和物。 - 前記式中、
R1及びR2は、−H及び−NH−(C=O)−CH3を含む群から各々独立して選択され;
R3は、グアニジノでり、パラ位にあり;
Lは、−(C=O)−O−R4−トリアゾール−又は−(C=O)−R4−トリアゾール−であり;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
mは、1、2、3又は4であり;
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり;
oは、1、2、3又は4であり;
Yは、検出可能な標識を表す、請求項1に記載の化合物。 - 前記検出可能な標識が、磁気共鳴画像法、X線画像法、超音波、核医学画像法、マルチモーダル画像法、蛍光画像法、生物発光画像法、顕微鏡検査、質量検出器、波長検出器、燐光画像法、化学発光画像法等を含む一覧から選択される方法によって機器により検出することができる基である、請求項1又は2に記載の化合物。
- 前記検出可能な標識が、放射性同位体、蛍光色素分子、MRI用造影剤(即ち常磁性金属)、X線反応剤、及びビオチン標識又はそれらの派生物から選択される、請求項1〜3のいずれかに一項に記載の化合物。
- 請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物の調製への式II:
R1及びR2は、−H、OH、−ハロ、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、−NR5R6、−(C=O)−R7及びSO2−R8を含む群から各々独立して選択され;
R5、R6、R9及びR10は、−H、−O、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル及び−(C=O)−C1〜6アルキルを含む群から各々独立して選択され;
R7及びR8は、−ハロ、−OH、C1〜6アルキル、−O−C1〜6アルキル、S−C1〜6アルキル、及び−NR9R10を含む群から各々独立して選択され;
R3は、−グアニジノであり;
Aは、直接結合及びC1〜6アルキルを含む一覧から選択され;
Bは、−(C=O)−O−R4−アルキン、−(C=O)−O−R4−N3、−(C=O)−R4−アルキン、又は−(C=O)−R4−N3を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
m、n及びoは、各々独立して1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10である)
の中間体。 - 前記式中、
R1及びR2は、−H及び−NH−(C=O)−CH3を含む群から各々独立して選択され;
R3は、グアニジノであり、パラ位にあり;
Bは、−(C=O)−O−R4−アルキン、−(C=O)−O−R4−N3、−(C=O)−R4−アルキン−、又は−(C=O)−R4−N3を含む一覧から選択され;
R4は、−(CH2)n−、−(C1〜4アルキル−O)m−、又は−(C1〜4アルキル−O)m−(CH2)o−を含む一覧から選択され;
mは、1、2、3又は4であり;
nは、1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10であり;
oは、1、2、3又は4である、請求項5に記載の中間体。 - 請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物を含む組成物。
- トリプシン様セリンプロテアーゼを対象とする活性依存型プローブとして使用される、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項7に記載の組成物。
- 種においてトリプシン様セリンプロテアーゼ活性の検出への、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項7に記載の組成物の使用。
- 種においてトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素活性の解析への、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項7に記載の組成物。
- 種においてトリプシン様セリンプロテアーゼの酵素活性の可視化への、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項7に記載の組成物。
- ヒト又は動物においてがん細胞の可視化への、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項7に記載の組成物。
- ヒト又は動物においてがん細胞を可視化する方法であって、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項7に記載の組成物を、前記ヒト又は動物に投与することと、標識化化合物により発生するシグナルを検出することとを含む、方法。
- がん細胞がトリプシン様セリンプロテアーゼを発現する、請求項12に記載の化合物若しくは組成物、又は請求項13に記載の方法。
- 種において活性トリプシン様セリンプロテアーゼを可視化する方法であって、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項7に記載の組成物を、前記種に投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含む、方法。
- 種においてトリプシン様セリンプロテアーゼを阻害することを目的とする治療の効果をモニタリングする方法であって、請求項1〜4のいずれか一項に記載の化合物、又は請求項7に記載の組成物を種々の時間点(即ち、治療前、治療中及び/又は治療後)に前記種に投与することと、標識化化合物によって発生するシグナルを検出することとを含み、発生するシグナルの経時的な減少が前記治療が効果的であることを示す、方法。
- 前記種が、タンパク質含有材料、細胞溶解物、細胞、組織溶解物、組織、動物及びヒトを含む一覧から選択される、請求項9に記載の使用、請求項10若しくは11に記載の化合物若しくは組成物、又は請求項15若しくは16いずれか一項に記載の方法。
- 前記トリプシン様セリンプロテアーゼがウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子(uPA)である、請求項9に記載の使用、請求項8、10若しくは11に記載の化合物若しくは組成物、請求項12に記載の化合物、組成物若しくは方法、又は請求項13若しくは14に記載の方法。
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