JP2014510048A

JP2014510048A - Ｅｃｌ用の新規イリジウムベース錯体

Info

Publication number: JP2014510048A
Application number: JP2013552934A
Authority: JP
Inventors: ツィシュースキ，ロベルト; コーラ，ルイザデ; フェルナンデス・エルナンデス，ヘスス・ミゲル; ヨーゼル，ハンス−ペーター; ロペス−カレ，エロイーザ; ツァルント，トラルフ
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2011-02-09
Filing date: 2012-02-07
Publication date: 2014-04-24
Also published as: EP2673283A1; ES2644816T3; CA2822902A1; PL2673283T3; WO2012107420A1; JP2015214543A; CN103370330A; US20130323857A1; CA2822902C; EP2673283B1; US8772486B2; CN103370330B

Abstract

本発明は、新規のイリジウムベースのＩｒ（ＩＩＩ）発光性錯体、上記錯体を標識として含んでなるコンジュゲート、及び、例えば、分析物の電気化学発光ベースの検出におけるそれらの応用に関する。

Description

電気発生化学発光（電気化学発光とも呼ばれて、ＥＣＬと略される）は、電極で発生する分子種が高エネルギー電子転移反応を受けて、光を発射する励起状態になるプロセスである。初めて詳述されたＥＣＬ研究は、Hercules と Bard らによって１９６０年代中期に記載された。約４０年の研究の後で、ＥＣＬは、今日、きわめて強力な分析技術となって、例えば、イムノアッセイ、食品及び水の検査、及び生物兵器剤の検出の分野で広く使用されている。

有機発光デバイス（ＯＬＥＤ）における使用に興味深いと思われるきわめて多くの化合物がある。これらの化合物は、固体材料における使用に適正であるか、又は有機流体に溶ける可能性がある。しかしながら、例えば、生体試料由来の分析物の検出のために求められるような、水性媒体におけるそれらの有用性に関しては、結論が導かれていない。

一般に、ＥＣＬベースの検出法は、Ｒｕ（ＩＩ＋）を金属イオンとして含んでなる水溶性ルテニウム錯体の使用に基づく。
過去の数十年にわたってなされた重大な改良にも拘らず、より高感度の電気化学発光ベースの in vitro 診断アッセイには、依然としてとても大きなニーズが存在する。

今回、驚くべきことに、ある種のイリジウムベースのＩｒ（ＩＩＩ＋）発光性錯体が将来の高感度ＥＣＬベース検出法にきわめて有望な標識となることが見出された。

本発明は、式Ｉ：

［Ｒ１〜Ｒ１２は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基、又はＲ１９であり、ここでＲ１９は、アリール、置換アリール、アルキル、置換アルキル分岐鎖アルキル、置換分岐鎖アルキル、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニルであり、ここで該置換基は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基より選択され；
式中、Ｒ１３〜Ｒ１６は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基、−Ｑ−Ｙ、又はＲ１９であり、ここでＲ１９は、アリール、置換アリール、アルキル、置換アルキル分岐鎖アルキル、置換分岐鎖アルキル、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニルであり、ここで該置換基は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基より選択され；
式中、Ｒ１７〜Ｒ１８は、水素、アルキル、アリール、置換アリール及びアルキル、複素芳香族環系、非芳香族環若しくは環系、イミダゾリウム、シクロデキストリン、又はＱ−Ｙ−である、又は
ここでＲ１〜Ｒ１２の内部又は／及びＲ１３〜Ｒ１６の内部のそれぞれで、２つの隣接する前記Ｒは、芳香族環又は置換芳香族環を形成し得て、ここで該置換基は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基より選択される、又は
ここでＲ１〜Ｒ１２の内部又は／及びＲ１３〜Ｒ１６の内部のそれぞれで、２つの隣接する前記Ｒは、脂肪族環又は置換脂肪族環を形成し得て、ここで該置換基は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基より選択され、
ここでＸは、Ｃ又はＮを表し、
ここでＹは、Ｃ又はＮを表し、
ここでＲ１３〜Ｒ１８の少なくとも１つは、−Ｑ−Ｙであり、
ここでＱは、リンカーを表して、Ｙは、官能基である］のイリジウムベースの発光又は電気化学発光化合物を開示する。

本発明はまた、上記化合物とそれへ共有結合した親和性結合剤を含んでなるコンジュゲートを開示する。
さらに本発明は、本発明に開示する化合物又はコンジュゲートの、発光測定又は電気化学発光反応を水溶液において、特に電気化学発光デバイス又は電気化学発光検出システムにおいて実施するための使用に関する。

さらに本発明は、分析物を in vitro の方法によって測定するための方法を開示し、該方法は、（ａ）該分析物を含むことが疑われるか又は知られている試料を提供する工程、（ｂ）本発明によるコンジュゲートと前記試料を、分析物−コンジュゲート錯体の生成に適した条件の下で接触させる工程、及び（ｃ）工程（ｂ）で生成した錯体を測定して、それにより分析物の測定値を得る工程を含んでなる。

本発明は、式Ｉ：

［式中、Ｒ１〜Ｒ１２は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基、又はＲ１９であり、ここでＲ１９は、アリール、置換アリール、アルキル、置換アルキル分岐鎖アルキル、置換分岐鎖アルキル、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニルであり、ここで該置換基は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基より選択され；式中、Ｒ１３〜Ｒ１６は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基、−Ｑ−Ｙ、又はＲ１９であり、ここでＲ１９は、アリール、置換アリール、アルキル、置換アルキル分岐鎖アルキル、置換分岐鎖アルキル、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニルであり、ここで該置換基は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基より選択され；式中、Ｒ１７〜Ｒ１８は、水素、アルキル、アリール、置換アリール及びアルキル、複素芳香族環系、非芳香族環若しくは環系、イミダゾリウム、シクロデキストリン、又はＱ−Ｙ−であり、ここでＲ１〜Ｒ１２の内部又は／及びＲ１３〜Ｒ１６の内部のそれぞれで、２つの隣接する前記Ｒは、芳香族環又は置換芳香族環を形成し得て、ここで該置換基は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基より選択され、ここでＲ１〜Ｒ１２の内部又は／及びＲ１３〜Ｒ１６の内部のそれぞれで、２つの隣接する前記Ｒは、脂肪族環又は置換脂肪族環を形成し得て、ここで該置換基は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基より選択され、ここでＸは、Ｃ又はＮを表し、ここでＹは、Ｃ又はＮを表し、ここでＲ１３〜Ｒ１８の少なくとも１つは、−Ｑ−Ｙであり、ここでＱは、リンカーを表して、Ｙは、官能基である］のイリジウムベースの発光又は電気化学発光化合物に関する。

１つの態様では、Ｒ１７又はＲ１８の少なくとも１つが−Ｑ−Ｙである。
１つの態様では、Ｒ１３〜Ｒ１８の１つがシクロデキストリンである。好ましくは、そのシクロデキストリンは、β−シクロデキストリンである。また好ましくは、そのシクロデキストリンは、ペルメチル化されている。

１つの態様では、式Ｉによる化合物のＲ１〜Ｒ１６の少なくとも１つが少なくとも１つの親水基によって置換されている。
好ましい親水基は、アミノ、アルキルアミノ（アルキルは、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル鎖のような直鎖、又はイソプロピル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチルのような分岐鎖アルキル鎖を意味し、好ましくは、メチル又はエチルのような直鎖アルキルである）、置換アルキルアミノ（これは、例えば、Ｎ原子へ結合した１又は２の分岐鎖又は直鎖を含有し、ヒドロキシル又はスルホのような追加の親水基によって置換され、好ましくはこの置換アルキルアミノは、２つのヒドロキシプロピル又はヒドロキシエチル残基を含有する）、アリールアミノ（アリールは、フェニル又はナフチルのような芳香族基、好ましくはフェニルを意味する）、置換アリールアミノ（アリールは、上記に定義される通りであって、追加の残基は、親水基によって形成される）、アルキルアンモニウム（アルキルは、上記に定義される通りであって、好ましくは、トリメチルアンモニウム残基又はトリエチルアンモニウム残基である）、置換アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボン酸エステル（好ましくは、メチル若しくはエチルエステルのようなアルキルエステル）、カルバモイル、ヒドロキシ、置換又は未置換アルキルオキシ（アルキルと置換アルキルは、上記に定義される通りである）、又はアリールオキシ又は置換アリールオキシ（アリールと置換アリールは、上記に定義される通りである）、スルファニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホンアミド、スルホキシド、スルホジオキシド、ホスホネート、ホスフィネートである。

好ましくは、そのような親水基は、適用可能な場合に、アミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アリールアミノ、置換アリールアミノ、アルキルアンモニウム、置換アルキルアンモニウム、カルボキシ、ヒドロキシ、スルホ、スルフェノ、スルホンアミド、スルホキシド、スルホジオキシド、及びホスホネートより選択され、それぞれ好ましくは、上記パラグラフに定義される通りである。

１つの態様において、親水基は、アミノ、アルキルアミノ、置換アルキルアミノ、アリールアミノ、置換アリールアミノ、アルキルアンモニウム、置換アルキルアンモニウム、カルボキシ、カルボン酸エステル、カルバモイル、ヒドロキシ、置換又は未置換アルキルオキシ、置換又は未置換アリールオキシ、スルファニル、アルキルスルホニル、アリールスルホニル、スルホ、スルフィノ、スルフェノ、スルホンアミド、スルホキシド、スルホジオキシド、ホスホネート、ホスフィネートより選択される。

１つの態様において、置換アルキルオキシに好ましい置換基は、１〜４０個のエチレンオキシ単位を含んでなる、１〜２０個のエチレンオキシ単位を含んでなる、又は１〜１０個のエチレンオキシ単位を含んでなるエチレンオキシ鎖である。

さらなる態様において、親水基は、スルホ、スルホンアミド、スルホジオキシドより選択される。
１つの態様では、式Ｉの基：Ｒ１〜Ｒ１２の少なくとも１つがスルホ基である。

１つの態様では、式Ｉに含まれるフェニルフェナントリジン残基のＲ１〜Ｒ１２の少なくとも１つが少なくとも１つの親水基によって置換されている。
１つの態様において、式Ｉに含まれるフェニルフェナントリジン残基は、下記に示される置換フェニルフェナントリジンより選択される。

本発明による化合物において、リンカーＱは、好ましくは、１個と２０個の間の原子の骨格長さを有する。言い換えると、式Ｉのピリジル環と官能基Ｙの間の最短の連結は、１〜２０個の原子からなる。１つの態様において、本発明の電気化学発光錯体中のリンカーＱは、直鎖又は分岐鎖で、飽和、不飽和、未置換、置換のＣ１〜Ｃ２０アルキル鎖であるか又は炭素原子とＯ、Ｎ、及びＳより選択される１以上のへテロ原子からなる骨格がある１〜２０個の原子鎖である。

１つの態様において、本発明によるイリジウムベースの錯体に含まれる官能基Ｙは、カルボン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アミノ基、ハロゲン、スルフヒドリル、マレイミド、アルキニル、アジド、及びホスホラミダイトからなる群より選択される。

本明細書において上記に開示されて定義されるような式Ｉのイリジウムベースの電気化学発光化合物とそれへ共有結合した生体物質を含んでなるコンジュゲート。好適な生体物質の例は、細胞、ウイルス、亜細胞粒子、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、オリゴ糖、多糖、リポ多糖、細胞代謝産物、ハプテン、ホルモン、薬理物質、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、及び糖類である。

１つの態様において、本発明によるコンジュゲートの（即ち、式Ｉによる化合物へ共有結合した）生体物質は、親和性結合剤である。当業者が理解するように、本発明によるコンジュゲートにおいて、式Ｉによる化合物の官能基Ｙは、親和性結合剤上の基と共有結合を形成するために使用されている。親和性結合試薬がＹ基と結合するか又は反応するのに適した基をそれ自体の中に決して含有しない場合、十分に確立された手順に依拠することによって、そのような基を親和性結合剤の中へ容易に導入することができる。

さらに限定されることを望まないが、明確性のために言えば、親和性結合剤は、以下のいずれも含んでよい；抗原、タンパク質、抗体、ビオチン又はビオチン類似体とアビジン又はストレプトアビジン、糖とレクチン、酵素、ポリペプチド、アミノ基、核酸又は核酸類似体と相補性核酸、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、多糖、金属イオン捕捉剤、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、又はこれらのあらゆる組合せ。例えば、親和性結合剤は、特異的結合対の一方の相手であり得て、ここで前記結合対の他の相手は、細胞表面又は細胞内構造と会合しているか又はその上の標的である。

好ましくは、親和性結合剤は、親和性結合対の相手又は成員であるか、又は当業者によってまた呼ばれるように、特異的結合対の相手又は成員である。
親和性結合剤は、その標的に対して少なくとも１０^７ｌ／モルの親和性を有する（例えば、抗体のような特異的結合対の一方の成員が、その抗原のような特異的結合対の他の成員に対するように）。親和性結合剤は、その標的に対して、好ましくは１０^８ｌ／モルの親和性、またなおより好ましくは１０^９ｌ／モルの親和性を有する。

１つの態様において、本発明は、親和性結合剤が、抗原、抗体、ビオチン又はビオチン類似体、アビジン又はストレプトアビジン、糖、レクチン、核酸又は核酸類似体と相補性核酸、受容体及びリガンドからなる群より選択されるコンジュゲートに関する。

１つの態様において、本発明は、親和性結合剤が、抗体、ビオチン又はビオチン類似体、アビジン又はストレプトアビジン、及び核酸からなる群より選択されるコンジュゲートに関する。

１つの態様において、本発明に記載のコンジュゲートは、共有結合した、本明細書において上記に開示されて定義されるような式Ｉによる化合物と、オリゴヌクレオチド又は抗体のいずれかである親和性結合剤を含む。

ビオチン類似体は、アミノビオチン、イミノビオチン、又はデスチオビオチンである。
本明細書に使用する「オリゴヌクレオチド」又は「核酸」という用語は、少なくとも８個のヌクレオチドと多くとも約１０００個のヌクレオチドを含む、短くて、概して一本鎖のポリヌクレオチドを概ね意味する。好ましい態様では、オリゴヌクレオチドが少なくとも９、１０、１１、１２、１５、１８、２１、２４、２７、又は３０個のヌクレオチドの長さを有する。好ましい態様では、オリゴヌクレオチドが２００、１５０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４５、４０、３５、又は３０個以下のヌクレオチドの長さを有する。

オリゴヌクレオチドという用語は、広義に理解されるべきであって、ＤＮＡとＲＮＡ、並びにその類似体及び修飾体が含まれる。
核酸類似体は、例えば、標準塩基のデオキシアデノシン（ｄＡ）、デオキシグアノシン（ｄＧ）、デオキシシトシン（ｄＣ）、デオキシチミジン（ｄＴ）、デオキシウラシル（ｄＵ）に置換基を担う置換ヌクレオチドを含有してよい。そのような置換ヌクレオ塩基の例は：５−メチルｄＣ、アミノアリルｄＵ若しくはｄＣ、５−（アミノエチル−３−アクリルイミド）−ｄＵ、５−プロピニル−ｄＵ若しくはｄＣ、５位ハロゲン化−ｄＵ若しくはｄＣのような５位置換ピリミジン；Ｎ４−エチル−ｄＣのようなＮ置換ピリミジン；Ｎ６−エチル−ｄＡ、Ｎ２−エチル−ｄＧのようなＮ置換プリン；８−［６−アミノ）−ヘクス−１−イル］−８−アミノ−ｄＧ若しくはｄＡ、８位ハロゲン化ｄＡ若しくはｄＧ、８−アルキル−ｄＧ若しくはｄＡのような８位置換プリン；及び、２−アミノ−ｄＡのような２位置換ｄＡである。

核酸類似体は、ヌクレオチド若しくはヌクレオシド類似体を含有してよい。即ち、５−ニトロインドール−ｄ−リボシド；３−ニトロピロール−ｄ−リボシド、デオキシイノシン（ｄＩ）、デオキサントシン（ｄＸ）；７−デアザ−ｄＧ、−ｄＡ、−ｄＩ又は−ｄＸ；７−デアザ−８−アザ−ｄＧ、−ｄＡ、−ｄＩ又は−ｄＸ；８−アザ−ｄＡ、−ｄＧ、−ｄＩ又は−ｄＸ；ｄ−ホルミシン；シュードｄＵ；シュードイソｄＣ；４−チオｄＴ；６−チオｄＧ；２−チオｄＴ；イソｄＧ；５−メチル−イソｄＣ；Ｎ８−連結８−アザ−７−デアザ−ｄＡ；５，６−ジヒドロ−５−アザ−ｄＣ；及びエテノ−ｄＡ又はピロロ−ｄＣのようなヌクレオ塩基類似体を使用することによって、天然に存在するヌクレオ塩基を交換することができる。当業者に明らかであるように、相補鎖中のヌクレオ塩基は、二重鎖形成が特異的であるようなやり方で選択されなければならない。例えば、５−メチル−イソｄＣが一方の鎖（例、（ａ））に使用されるならば、イソｄＧが相補鎖（例、（ａ’））に有らねばならない。

核酸類似体において、オリゴヌクレオチド骨格は、置換された糖残基、糖類似体、ヌクレオシド間リン酸エステル部分における修飾物を含有するように修飾されてよい、及び／又はＰＮＡであってよい。

オリゴヌクレオチドは、例えば、２’−メトキシ、２’−フルオロ、２’−メチルセレノ、２’−アリルオキシ、４’−メチルｄＮ（ここでＮは、ヌクレオ塩基、例えば、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵである）のような置換デオキシリボースのあるヌクレオチドを含有してよい。

糖類似体は、例えば、キシロース；（２’−Ｏ，４’−Ｃメチレン）−（ＬＮＡとして知られるオリゴマー）又は（２’−Ｏ，４’−Ｃエチレン）−（ＥＮＡとして知られるオリゴマー）のような２’，４’−架橋リボース；Ｌ−リボース、Ｌ−ｄ−リボース、ヘキシトール（ＨＮＡとして知られるオリゴマー）；シクロヘキセニル（ＣｅＮＡとして知られるオリゴマー）；アルトリオール（ＡＮＡとして知られるオリゴマー）；シクロプロパン環へ縮合しているエチレン架橋によってＣ３’及びＣ５’の原子が連結している三環系リボース類似体（トリシクロＤＮＡとして知られるオリゴマー）；グリセリン（ＧＮＡとして知られるオリゴマー）；グルコピラノース（ホモＤＮＡとして知られるオリゴマー）；カルバリボース（シクロペンタンがテトラヒドロフランサブユニットの代わりにある）；ヒドロキシメチル−モルホリン（モルホリノＤＮＡとして知られるオリゴマー）である。

ヌクレオシド間リン酸エステル部分の数多くの修飾も、ハイブリダイゼーション特性に干渉しないことが知られていて、そのような骨格修飾も、置換ヌクレオチド若しくはヌクレオチド類似体と組み合わせることができる。例は、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミダート、及びメチルホスホネートのオリゴヌクレオチドである。

ＰＮＡ（リン酸エステルとｄ−リボースのない骨格を有する）も、ＤＮＡ類似体として使用することができる。
上記に言及した、修飾ヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、並びにオリゴヌクレオチド骨格修飾は、本発明の意味でのオリゴヌクレオチドにおいて所望されるように組み合わせることができる。

本明細書の「抗体」という用語は、最も広義で使用されて、具体的には、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクト抗体より生成される多重特異性抗体（例、二重特異性抗体）、及び抗体断片（それらが所望される生物活性を明示する限りにおいて）が含まれる。

「単離」抗体は、その本来の環境の成分より同定及び分離された、及び／又は回収された抗体である。その本来の環境の混在成分は、該抗体の研究、診断、又は療法上の使用に干渉するはずの物質であって、酵素、ホルモン、及び他のタンパク性又は非タンパク性の溶質を含めてよい。いくつかの態様では、抗体を（１）例えば、ローリー法によって定量されるような抗体の９５重量％より高くまで、そしていくつかの態様では、９９重量％より高くまで；（２）例えば、スピニングカップ配列決定装置の使用により、少なくとも１５残基のＮ末端又は内部アミノ酸配列が得られるのに十分な度合いまで、又は（３）例えば、クマシーブルー又は銀染色を使用する還元又は非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均質性まで精製する。単離抗体には、その抗体の本来環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞内の in situ 抗体が含まれる。しかしながら、通常、単離抗体は、少なくとも１回の精製工程によって製造される。

「ネイティブ抗体」は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖と２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体の糖タンパク質である。それぞれの軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖へ連結しているが、ジスルフィド連結の数は、異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変動する。それぞれの重鎖と軽鎖にも、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋がある。それぞれの重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）を有して、いくつかの定常ドメインがそれに続く。それぞれの軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有して、その他端に定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一定常ドメインと並置して、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと並置している。特別なアミノ酸残基が軽鎖及び重鎖の可変ドメインの間のインターフェイスを形成すると考えられている。

抗体の「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗体の重鎖又は軽鎖のアミノ末端ドメインに関連する。重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」と呼ばれる場合がある。軽鎖の可変ドメインは、「ＶＬ」と呼ばれる場合がある。一般に、これらのドメインは、抗体の最も変化する部分であって、抗原結合部位を含有する。

「可変」という用語は、可変ドメインのある部分が配列において抗体間で広汎に異なって、それぞれの特別な抗体のその特別な抗原への結合と特異性において使用されるという事実に関連する。しかしながら、この可変性は、抗体の可変ドメイン全体で均等に分布しているわけではない。それは、軽鎖と重鎖の両方の可変ドメインにおいて超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブな重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域（主にβシート配置を採って、３つのＨＶＲによって連結している）を含み、このβシート構造を連結して、ある場合はその構造の一部となるループを形成する。各鎖中のＨＶＲは、ＦＲ領域によってごく近接して一緒になって、他の鎖由来のＨＶＲと一緒に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Kabat et al．「免疫学的に興味深いタンパク質の配列（Sequences of Proteins of Immunological Interest）」第５版、米国立衛生研究所、メリーランド州ベセスダ（1991）を参照のこと）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接的には関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の参画のような、様々なエフェクター機能を明示する。

抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」は、どの脊椎動物種に由来しても、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる、２つの明瞭に別々の種類のうち１つへ帰属させることができる。

その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依拠して、抗体（免疫グロブリン）を異なるグラスへ帰属させることができる。免疫グロブリンには５種の主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあって、このいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２へさらに分類することができる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置についてはよく知られていて、例えば、Abbas et al．「細胞及び分子免疫学（Celluular and Mol. Immunology）」第４版、W. B. Saunders 社（2000）に一般的に記載されている。抗体は、１以上の他のタンパク質又はペプチドと該抗体の共有結合的又は非共有結合的な会合によって形成される、より大きな融合分子の一部であってよい。

「全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」という用語は、本明細書において可換的に使用されて、下記に定義されるような抗体断片ではなくて、その実質的にインタクトな形態での抗体を意味する。この用語は、特に、Ｆｃ領域を含有する重鎖がある抗体に言及する。

「抗体断片」は、インタクト抗体の一部を含み、好ましくは、その抗原結合領域を含んでなる。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；二重特異性抗体；線状抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片より形成される多重特異性抗体が含まれる。

抗体のパパイン消化は、それぞれに単一の抗原結合部位がある、Ｆａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片と、残余の「Ｆｃ」断片（この名称は、容易に結晶するその能力を反映する）を産生する。ペプシン処理は、２つの抗原結合部位を有して、依然として抗原と交差結合することが可能であるＦ（ａｂ’）_２断片を生じる。

「Ｆｖ」は、完全な抗原結合部位を含有する最小の抗体断片である。１つの態様では、２本鎖Ｆｖ種が、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが緊密に非共有結合的に会合した二量体からなる。単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）種では、１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインが、この軽鎖と重鎖が２本鎖Ｆｖ種におけるそれに類似した「二量体」構造で会合し得るように、柔軟なペプチドリンカーによって共有結合的に連結され得る。それぞれの可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面に抗原結合部位を規定するのは、この配置においてである。集合的に、この６つのＨＶＲは、抗体へ抗原結合特異性を付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つだけのＨＶＲを含んでなる、Ｆｖの半分）でも、完全な結合部位より低い親和性であっても、抗原を認識して結合する能力を有する。

Ｆａｂ断片は、重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインを含有して、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１以上のシステインが含まれる重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端の数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書において、定常ドメインのシステイン残基（複数）がフリーチオール基を担うＦａｂ’の表記である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は、元来、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングについても知られている。

「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨドメインとＶＬドメインを含み、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖で存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによりｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成することが可能になる。ｓｃＦｖの概説については、例えば、「モノクローナル抗体の薬理学（The Pharmacology of Monoclonal Antibodies）」第113巻、Rosenburg and Moore (監修)、Springer-Verlag, ニューヨーク (1994)中の Plueckthun の概説（269-315頁）を参照のこと。

「二重特異性抗体」という用語は、２つの抗原結合部位がある抗体断片を意味し、この断片は、同一のポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）へ連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一の鎖上の２つのドメインの間で対合を可能にするにはあまりに短いリンカーを使用することによって、このドメインは、無理やり別の鎖の相補性ドメインと対合して、２つの抗原結合部位を創出する。二重特異性抗体は、二価又は二重特異性であり得る。二重特異性抗体については、例えば、ＥＰ０４０４０９７；ＷＯ１９９３／０１１６１；Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134; 及び Holliger, P. et al., PNAS USA 90 (1993) 6444-6448 により詳しく記載されている。Hudson, P.J. et al., Nat. Med. 9 (2003) 129-134 には、三重特異性抗体（triabodies）と四重特異性抗体（tetrabodies）についても記載されている。

本明細書に使用する「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団より入手された抗体を意味する。即ち、この集団を含んでなる個別の抗体は、微量で存在し得る、可能な突然変異体（例、天然に存在する突然変異体）を除けば、同一である。このように、「モノクローナル」という修飾語は、別個の抗体の混合物ではないという、抗体の特徴を示す。ある態様において、そのようなモノクローナル抗体には、典型的には、標的へ結合するポリペプチド配列を含んでなる抗体が含まれて、ここで標的結合性のポリペプチド配列は、複数のポリペプチド配列からの単一の標的結合性ポリペプチド配列の選択が含まれる方法によって入手された。例えば、この選択方法は、ハイブリドーマクローン、ファージクローン、又は組換えＤＮＡクローンのプールのような、複数のクローンからのユニーククローンの選択であり得る。選択された標的結合配列を、例えば、標的への親和性を高める、標的結合配列をヒト化する、細胞培養におけるその産生を向上させる、その in vivo 免疫原性を低下させる、多重特異性抗体を創出する、等のようにさらに改変することができること、そしてこの改変された標的結合配列を含んでなる抗体も本発明のモノクローナル抗体であることが理解されるべきである。異なる決定基（エピトープ）に対して向けられる異なる抗体が典型的には含まれるポリクローナル抗体とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、典型的には他の免疫グロブリンがそれらに非混在であるという点で有利である。

言及したように、本明細書に開示するような化合物及びコンジュゲートには、きわめて好ましい特質がある。例えば、開示される化合物又はコンジュゲートは、それぞれ、高いＥＣＬ効率を示す。この高効率性はまた、有機溶媒中で分析されるときにのみ高いＥＣＬ効率を示してきた実に多くのＥＣＬ標識に比較して、対応する測定を水系で実施する場合も存在する。例えば、多くのＯＬＥＤ色素は、通常、アセトニトリル中で分析されて、水溶液には溶けないか、又は溶ける場合でも、水溶液中では効率的な電気化学発光を示さない。

１つの好ましい態様において、本発明は、本発明において開示されるような化合物又はコンジュゲートそれぞれの、水溶液中で電気化学発光を実施することへの使用に関する。水溶液は、少なくとも９０％（重量／重量）の水を含んでなる、あらゆる溶液である。明らかに、そのような水溶液は、緩衝化合物、界面活性剤のような追加成分と、例えば、ＥＣＬ反応中の電子ドナーとしてのトリプロピルアミンのような三級アミンを含有してよい。

１つの態様において、本発明は、本発明に開示するような化合物又はコンジュゲートそれぞれの、電気化学発光ベースの検出法における使用に関する。
１つの態様において、本発明は、本発明に開示するような化合物又はコンジュゲートそれぞれの、分析物の検出における使用に関する。

本発明による分析物は、対象のあらゆる生体物質を含めて、どの無機又は有機分子でもよい。本発明の意味における分析物を代表する好適な生体物質の例は、細胞、ウイルス、亜細胞粒子、タンパク質、リポタンパク質、糖タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、オリゴ糖、多糖、リポ多糖、細胞性代謝産物、ハプテン、ホルモン、薬理物質、アルカロイド、ステロイド、ビタミン、アミノ酸、及び糖類である。

分析物は、ポリペプチド、炭水化物、及び無機若しくは有機医薬分子からなる群より選択され得る。
ポリペプチド又はタンパク質は、本質的にアミノ酸から構成されて、ペプチド結合によって連結された少なくとも２つのアミノ酸を有する分子である。対象の分析物が本明細書に開示の方法で検討される場合、ポリペプチドは、好ましくは、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１２、１５、２０、２５、及び３０から約１０，０００までのアミノ酸からなる。好ましくは、ポリペプチドは、５〜２０００、また好ましくは１０〜１，０００のアミノ酸を含有する。

分析物が核酸である場合、これらの核酸は、好ましくは、天然に存在するＤＮＡ又はＲＮＡのオリゴヌクレオチドである。
１つの態様において、本発明は、分析物を in vitro の方法によって測定するための方法に関し、該方法は、（ａ）該分析物を含むことが疑われるか又は知られている試料を提供する工程、（ｂ）前記試料を、親和性結合剤と本発明に開示されるような式Ｉによる化合物を含んでなるコンジュゲートと分析物−コンジュゲート錯体の生成に適した条件の下で接触させる工程、及び（ｃ）工程（ｂ）で生成した錯体を測定して、それにより分析物の測定値を入手する工程を含んでなる。

１つの態様において、分析物の検出のための上記方法における測定は、電気化学発光ベースの検出手順を使用することによって実施する。この方法が水溶液中で実施されることも好ましい。

以下の実施例を提供するのは本発明の理解を助けるためであって、本発明の真の範囲は、付帯の特許請求項において説明される。以下に示す手順には、本発明の精神から逸脱することなく種々の変更を施すことができると理解される。

実施例１：
置換フェニル−フェナントリジン類の合成
実施例１．１：
置換２−アミノビフェニル類の合成の一般手順：
Tetrahedron Lett. 50 (2009) 4598-4601 において Youn, S.W.によって記載されたような Suzuki-Miyaura（鈴木−宮浦）カップリング反応を市販の２−ブロモアニリン誘導体と対応のアリールボロン酸の間で行って、適正な２−アミノビフェニル類を合成することができて、これはフェナントリジン類へのさらなる反応に必要とされる。

典型的な手順：

実施例：

実施例１．２：
置換フェナントリジン類の合成の一般手順：
２−アリールアニリン（１）（０．０１モル）の氷冷クロロホルム（２０ｍｌ）溶液へアリール酸クロリド（２）（０．０１モル）を加えて、不活性条件下に室温で３０分間撹拌した。生じる混合物を次の２時間撹拌しながら還流させた。この反応混合物を６０分の時間にわたるピリジン（１０ｍｌクロロホルム中０．０２モル）の滴下によって処理した。この混合物をそのまま室温へ冷やして、一晩撹拌した。この混合物を０．５ＭＨＣｌでよく洗浄し、ＭｇＳＯ_４で乾燥させて、真空中で濃縮した。この粗生成物をシリカゲル（３：２ヘキサン／酢酸エチル）でのフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、純粋な生成物（３）を収率６６％で得た。

Bull. Soc. Chim. Belg. 98 (1989) 557-566 中の Lion, C. による記載の手順に従って、２０ｍｌのトルエン中のベンズアミド−２−ビフェニル（３）（０．０１モル）及びＰＯＣｌ_３（５ｍｌ）を窒素下に１８時間還流させて撹拌した。この冷やした反応混合物をＣＨ_２Ｃｌ_２（３０ｍｌ）で希釈して氷中へ注ぎ、２５％ＮＨ_４ＯＨと蒸留水で洗浄した。有機層をＭｇＳＯ_４で乾燥させて真空中で濃縮し、フラッシュクロマトグラフィー（シリカゲル、１：１ヘキサン／酢酸エチル）を続けて、生成物：４，６−フェニルフェナントリジンを得た。

収率：５２％。白色の固形物。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 7.54-7.85 (m, 9H), 8.10 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 7.9 Hz, 1H), 8.62 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.67 (d, J = 8.4 Hz, 1H)。

実施例１．３：
６−（２−スルホフェニル）フェナントリジンの合成手順
６−（２−スルホフェニル）フェナントリジンは、Chem. Pharm. Bull. 42 (1994) 1617-1630 中のNicolai, E. による記載の手順を使用して、アリールアニリン（０．０１モル）を２−スルホ安息香酸環状無水物（０．０１モル）とともにＣＨ_３ＣＮ中で６時間穏やかに加熱することによって合成することができる。

精製後、この生成物は、実施例１．２に記載の方法に基づいて、適正なフェナントリジンへ変換することができる。

実施例１．４：
６−フェニル−アルキルスルホニルフェナントリジンの合成手順
６−フェニル−アルキルスルホニルフェナントリジンは、Bull. Soc. Chim. Belg. 98 (1989) 557-566 中の Lion, C. による記載の手順を使用して、アルキルスルホニル−アリールアニリン（０．０１モル）を安息香酸クロリド（０．０１モル）とともにクロロホルム中で穏やかに加熱することによって合成することができる。実施例２を参照のこと。

６−（４−メチルスルホフェニル）フェナントリジンはまた、J. Chem. Soc. (1949) 703-707 中の Cymerman, J. による記載の手順に従うことによって製造することができる。

実施例２：
クロロ−交差連結二量体錯体の合成の一般手順：
この一般手順は、Nonoyama, M., J. Organomet. Chem. 86 (1975) 263-267 によって公表された。

このイリジウム二量体は、以下のように合成した：２−エトキシエタノール／水混合物（３：１，ｖ／ｖ）中のＩｒＣｌ_３・３Ｈ_２Ｏと２．５当量の６−フェニルフェナントリジンを窒素下に１２０℃で１８時間加熱した。室温へ冷却後、沈殿を濾過して取って、メタノールとＥｔ_２Ｏで連続的に洗浄し、乾燥させて、所望の二量体を得た。

実施例：

［（６−フェニルフェナントリジン）_２ＩｒＣｌ］_２収率：７１％。茶褐色の固形物。¹H NMR (DMSO-d₆, 400 MHz) δ 6.45 (d, J = 6.8, 4H), 6.58 (t, J = 7.1, 13.9 Hz, 4H), 6.95 (t, J = 7.1, 14.2 Hz, 4H), 7.56 (t, J = 7.4, 16.0 Hz, 4H), 7.68 (t, J = 8.1, 16.2 Hz, 4H), 7.93 (t, J = 8.0, 14.6 Hz, 4H), 8.07-8.13 (m, 8H), 8.80 (d, J = 7.3 Hz, 4H), 8.93-9.01 (m, 12H)。

実施例３：
イリジウム錯体の合成の一般手順
クロロ−交差連結二量体錯体（０．５ミリモル）、ピコリン酸エステル（１．２５ミリモル）、及びＮａ_２ＣＯ_３（３ミリモル）を２−エトキシエタノール（１２ｍｌ）中へ混合して、１２０℃で１５時間加熱した。この冷やした混合物へ蒸留水（２５ｍｌ）を加えてから、この粗生成物を濾過して取って水に続いて数分量のｎ−ヘキサンとＥｔ_２Ｏで洗浄した。生成物をカラムクロマトグラフィー（シリカ、ｎ−ヘキサン／ジクロロメタン）によって精製して、赤色の粉末を得た。

（Lamansky, S., Inorg. Chem. 40 (2001) 1704-1711 に基づく）

Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）_２Ｃ_９Ｈ_１０Ｎ_４Ｏ。収率：６８％。赤色の固形物。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 3.95-3.97 (m, 2H), 4.53-4.55 (m, 2H), 6.77-6.93 (m, 4H), 7.03-7.30 (m, 5H), 7.37-7.66 (m, 4H), 7.82-7.95 (m, 5H), 8.07 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 8.23 (d, J = 7.8 Hz, 1H), 8.34 (t, J = 7.8, 14.4 Hz, 3H), 8.46 (d, J = 5.5 Hz, 1H), 8.56 (t, J = 7.6, 14.2 Hz, 2H), 9.07 (dd, J = 8.2, 16.0 Hz, 2H), 9.46 (s, 1H)。

Ｉｒ（６−フェニルフェナントリジン）_２Ｃ_１１Ｈ_１３Ｎ_３Ｏ。収率：７１％。赤色の固形物。¹H NMR (CDCl₃, 400 MHz) δ 1.47-1.49 (m, 2H), 2.35-2.49 (m, 2H), 3.30-3.35 (m, 2H), 5.76 (s, 1H), 6.71-6.74 (m, 3H), 6.81-6.99 (m, 3H), 7.07-7.31 (m, 6H), 7.37-7.41 (m, 1H), 7.73-7.85 (m, 5H), 8.25-8.35 (m, 5H), 8.45-8.54 (m, 3H), 9.09 (d, J = 8.2 Hz, 1H), 9.29-9.32 (m, 1H).

Claims

式Ｉ：

［式中、Ｒ１〜Ｒ１２は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基、又はＲ１９であり、ここでＲ１９は、アリール、置換アリール、アルキル、置換アルキル分岐鎖アルキル、置換分岐鎖アルキル、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニルであり、ここで該置換基は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基より選択され；
式中、Ｒ１３〜Ｒ１６は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基、−Ｑ−Ｙ、又はＲ１９であり、ここでＲ１９は、アリール、置換アリール、アルキル、置換アルキル分岐鎖アルキル、置換分岐鎖アルキル、アリールアルキル、置換アリールアルキル、アルキルアリール、置換アルキルアリール、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニルであり、ここで該置換基は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基より選択され；
式中、Ｒ１７〜Ｒ１８は、水素、アルキル、アリール、置換アリール及びアルキル、複素芳香族環系、非芳香族環若しくは環系、イミダゾリウム、シクロデキストリン、又はＱ−Ｙ−である、又は
ここでＲ１〜Ｒ１２の内部又は／及びＲ１３〜Ｒ１６の内部のそれぞれで、２つの隣接する前記Ｒは、芳香族環又は置換芳香族環を形成し得て、ここで該置換基は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基より選択される、又は
ここでＲ１〜Ｒ１２の内部又は／及びＲ１３〜Ｒ１６の内部のそれぞれで、２つの隣接する前記Ｒは、脂肪族環又は置換脂肪族環を形成し得て、ここで該置換基は、水素、ハロゲン化物、シアノ若しくはニトロ基、親水基より選択され、
ここでＸは、Ｃ又はＮを表し、
ここでＹは、Ｃ又はＮを表し、
ここでＲ１３〜Ｒ１８の少なくとも１つは、−Ｑ−Ｙであり、
ここでＱは、リンカーを表して、Ｙは、官能基である］のイリジウムベースの発光又は電気化学発光化合物。
リンカーＱが、直鎖又は分岐鎖で、飽和、不飽和、未置換、又は置換Ｃ１〜Ｃ２０アルキル鎖であるか又は炭素原子とＯ、Ｎ、及びＳより選択される１以上のへテロ原子からなる骨格がある１〜２０個の原子鎖である、請求項１に記載の化合物。
リンカーＱが、飽和Ｃ１〜Ｃ１２アルキル鎖であるか又は炭素原子とＯ、Ｎ、及びＳより選択される１以上のへテロ原子からなる骨格がある１〜１２個の原子鎖である、請求項１に記載の化合物。
官能基Ｙが、カルボン酸、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、アミノ基、ハロゲン、スルフヒドリル、マレイミド、アルキニル、アジド、及びホスホラミダイトからなる群より選択される、請求項１〜３のいずれかに記載の化合物。
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物とそれへ共有結合した親和性結合剤を含んでなるコンジュゲート。
親和性結合剤が、抗原と抗体、ビオチン又はビオチン類似体とアビジン又はストレプトアビジン、糖とレクチン、核酸又は核酸類似体と相補性核酸、及び受容体とリガンドからなる群より選択される、請求項５のコンジュゲート。
前記親和性結合剤が核酸又は抗体である、請求項５又は６に記載のコンジュゲート。
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又は請求項５〜７のいずれかに記載のコンジュゲートの、電気化学発光反応を水溶液において実施するための使用。
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又は請求項５〜７のいずれかに記載のコンジュゲートの、電気化学発光ベースの検出法における使用。
請求項１〜４のいずれかに記載の化合物又は請求項５〜７のいずれかに記載のコンジュゲートの、分析物の検出における使用。
分析物を in vitro の方法によって測定するための方法であって、
ａ）該分析物を含むことが疑われるか又は知られている試料を提供する工程、
ｂ）請求項５〜７のいずれかに記載のコンジュゲートと前記試料を、分析物−コンジュゲート錯体の生成に適した条件の下で接触させる工程、及び
ｃ）工程（ｂ）で生成した錯体を測定して、それにより分析物の測定値を得る工程を含んでなる、前記方法。