JP2014508540A - 正常ヒト管状卵巣上皮およびヒト管状卵巣腫瘍由来の細胞を培養するための組成物および方法 - Google Patents
正常ヒト管状卵巣上皮およびヒト管状卵巣腫瘍由来の細胞を培養するための組成物および方法 Download PDFInfo
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Abstract
本明細書には、細胞培養培地、細胞培養培地を調製するためのキットおよび方法、ならびに女性生殖器官の細胞および腫瘍細胞などの細胞を培養するための方法が記載されている。本発明の細胞培養培地と、細胞であって、該細胞が、不死化卵巣細胞および/または前記卵管細胞である、細胞とを含む組成物もまた提供される。候補治療剤を同定する方法であって、本発明の方法に従って細胞を培養するステップと、該細胞を作用物質と接触させるステップと、該細胞の1つまたは複数の生理的特徴を測定するステップとを含み、該細胞の該1つまたは複数の生理的特徴を調節する作用物質が候補治療剤である方法もまた提供される。
Description
関連出願の引用
本願は、2011年3月24日に出願された米国仮出願第61/467,363号および2011年3月25日に出願された米国仮出願第61/467,949号の利益を主張する。これらの出願の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本願は、2011年3月24日に出願された米国仮出願第61/467,363号および2011年3月25日に出願された米国仮出願第61/467,949号の利益を主張する。これらの出願の開示は、その全体が参照により本明細書に援用される。
発明の背景
細胞株をex vivoで培養することは、ヒト疾患の研究および治療の著しい助けとなっている。今日、多くの障害の機構的起源が、培養細胞株において特徴付けられており、細胞株は、スクリーニングするため、および治療薬を製造するために使用されている。癌および女性の性と生殖に関する健康の分野では、女性生殖器官由来の正常細胞および腫瘍細胞を培養することによって研究が強化されている。しかし、多くの細胞型は、利用可能な培地および現行の技法を用いて培養することが難しいことが証明されている。例えば、正常な卵巣細胞を培養するための現行の方法では、卵巣細胞のサブタイプを区別すること、例えば、線毛細胞と無線毛細胞、または卵巣表面上皮と封入体嚢胞上皮を区別することができない。さらに、悪性度が高い乳頭状漿液性腺癌に推定起源細胞として関係づけられている卵管上皮細胞はex vivoでは培養されていない。卵巣腫瘍に由来する腫瘍細胞も、培養物中で成長させることが難しいことが証明されている。少数の卵巣癌細胞株が存在するが(非特許文献1(Verschraegen CFら、Clin Cancer Res. 2003年2月;9巻(2号):845〜52頁)および特許文献1(米国特許第5,710,038号))、これらの細胞株は、集団倍加情報、起源腫瘍組織の臨床的−病理学的サブタイプ、悪性起源の検証、または表現型に関しては十分に特徴付けられていない。したがって、当技術分野では、卵巣組織、卵管細胞、および腫瘍細胞由来の細胞株を樹立するための培養細胞培地、キット、および方法が依然として必要である。
細胞株をex vivoで培養することは、ヒト疾患の研究および治療の著しい助けとなっている。今日、多くの障害の機構的起源が、培養細胞株において特徴付けられており、細胞株は、スクリーニングするため、および治療薬を製造するために使用されている。癌および女性の性と生殖に関する健康の分野では、女性生殖器官由来の正常細胞および腫瘍細胞を培養することによって研究が強化されている。しかし、多くの細胞型は、利用可能な培地および現行の技法を用いて培養することが難しいことが証明されている。例えば、正常な卵巣細胞を培養するための現行の方法では、卵巣細胞のサブタイプを区別すること、例えば、線毛細胞と無線毛細胞、または卵巣表面上皮と封入体嚢胞上皮を区別することができない。さらに、悪性度が高い乳頭状漿液性腺癌に推定起源細胞として関係づけられている卵管上皮細胞はex vivoでは培養されていない。卵巣腫瘍に由来する腫瘍細胞も、培養物中で成長させることが難しいことが証明されている。少数の卵巣癌細胞株が存在するが(非特許文献1(Verschraegen CFら、Clin Cancer Res. 2003年2月;9巻(2号):845〜52頁)および特許文献1(米国特許第5,710,038号))、これらの細胞株は、集団倍加情報、起源腫瘍組織の臨床的−病理学的サブタイプ、悪性起源の検証、または表現型に関しては十分に特徴付けられていない。したがって、当技術分野では、卵巣組織、卵管細胞、および腫瘍細胞由来の細胞株を樹立するための培養細胞培地、キット、および方法が依然として必要である。
Verschraegen CFら、Clin Cancer Res. 2003年2月;9巻(2号):845〜52頁
本発明の一態様は、アデノシン三リン酸;担体タンパク質(例えば、ウシ血清アルブミンなどのアルブミン);コレステロール、リノール酸、およびリポ酸;グルタチオン;ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基(キサンチンおよび/またはヒポキサンチンが好ましい);ホスホエタノールアミン;セレン;トランスフェリン;トリヨードサイロニン;ビタミンA、ビタミンC、およびビタミンD;Zn、Mg、およびCu;細胞内cAMPを増加させる作用物質(コレラ毒素が好ましい);上皮成長因子(EGF);ヒドロコルチゾン;インスリン;および血清を含む細胞培養培地、または細胞培養培地を調製するためのキットに関する。細胞培養培地は、アデノシン一リン酸、ビタミンE、ビタミンK3、ナイアシン、およびナイアシンアミドのうちの1つまたは複数も含んでよい。
細胞内cAMPを増加させる作用物質がコレラ毒素である特定の実施形態では、細胞培養培地は、10ng/mLから70ng/mLまでの間、好ましくは15ng/mLから30ng/mLの間、例えば、20ng/mLから25ng/mLの間などのコレラ毒素を含んでよい。ある特定の好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約20ng/mLのコレラ毒素を含む。他の好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約25ng/mLのコレラ毒素を含む。
ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、3ng/mLから50ng/mLの間のEGF、好ましくは約8〜12ng/mL、例えば、10ng/mLなどのEGFを含む。
ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、0.005μg/mLから1.5μg/mLの間のヒドロコルチゾンおよび/または1.0μg/mLから75.0μg/mLの間のインスリンを含む。
ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、0.2%v/vから4.0%v/vの間の血清を含む。ある特定の実施形態では、細胞培養培地は、0.2%v/vから10.0%v/vの間または0.2%v/vから5.0%v/vの間の血清を含む。
本発明のいくつかの実施形態は、腫瘍細胞(例えば、卵巣腫瘍細胞など)を培養するために適し、1.0%v/vから10.0%v/vの間の血清、1.0%v/vから4.0%v/vの間の血清、好ましくは1.8%v/vおよび2%v/vの血清、最も好ましくは約1.8%v/vの血清を含む細胞培養培地に関する。いくつかのそのような実施形態では、細胞培養培地は、0.15μg/mLから0.3μg/mLの間のヒドロコルチゾン、好ましくは約0.15μg/mLのヒドロコルチゾンおよび/または5.0μg/mLから50.0μg/mLの間のインスリン、好ましくは約15.0μg/mLのインスリンを含む。腫瘍細胞を培養するために適した例示的な培地はWIT−ocである。
類内膜腫瘍および粘液性腫瘍由来のものなどの特定の卵巣腫瘍細胞を培養するために適したそのような実施形態では、細胞培養培地は、エストロゲンをさらに含み、例えば、エストロゲン(例えば、17−ベータ−エストラジオール)を、30nMから300nMの間の17−ベータ−エストラジオール、好ましくは約100nMの17−ベータ−エストラジオールと等しい効力の濃度で含む。特定の卵巣腫瘍細胞、例えば、乳頭状漿液腫、明細胞腫瘍、癌肉腫、および未分化胚細胞腫由来の腫瘍細胞などを培養するために適した実施形態などの他の実施形態では、細胞培養培地はエストロゲンを実質的に含まない。例示的な培地WIT−ocは、その中で培養する細胞型に応じて、エストロゲンを含んでもよく、エストロゲンを実質的に含まなくてもよい。
WIT−ocおよび卵巣腫瘍細胞などの腫瘍細胞を培養するために適した細胞培養培地により、卵巣腫瘍細胞の増殖をin vitroにおいて少なくとも約14、25、またはさらには35回の集団倍加(PD)にわたって支持することができる。
正常な卵巣細胞および卵管細胞を培養するために適したさらに他の実施形態では、細胞培養培地は、0.25%v/vから0.75%v/vの間の血清、好ましくは約0.5%v/vの血清を含む。この細胞培養培地では、ヒドロコルチゾンの濃度は、好ましくは0.25μg/mLから0.50μg/mLの間、例えば、約0.5μg/mLのヒドロコルチゾンであり、および/または5.0μg/mLから50.0μg/mLの間、好ましくは約20.00μg/mLのインスリンである。上皮細胞などの正常な卵巣細胞および卵管細胞を培養するために適した例示的な培地はWIT−foである。
WIT−foおよび正常な卵巣細胞および卵管細胞を培養するために適した細胞培養培地により、卵巣細胞および/または卵管細胞の増殖をin vitroにおいて少なくとも約14、25、またはさらには35回の集団倍加(PD)にわたって支持することができる。いくつかの実施形態では、卵巣細胞および/または卵管細胞は不死化細胞である。不死化細胞はテロメラーゼの触媒サブユニット、例えばヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)を過剰発現していてよい。本発明の1つの態様は、hTERTが過剰発現している細胞を含む培養物であって、hTERTの過剰発現が、細胞に、少なくとも14、25、または35回の集団倍加を行う能力を持たせるために十分である培養物である。ある特定の実施形態では、培養物は、細胞の実質的に精製された培養物である。
本発明の1つの態様は、卵巣細胞の実質的に精製された培養物であって、卵巣細胞がプローブセットDOK5、CD47、HS6ST3、DPP6、OSBLP3を過剰発現しており、培養物が、細胞を少なくとも103個含み、細胞が、少なくとも14、25、または35回の集団倍加を行う能力を有する培養物に関する。同様に、一態様は、卵管細胞の実質的に精製された培養物であって、卵管細胞がプローブセットSTC2、SFRP1、SLC35F3、SHMT2、TMEM164を過剰発現しており、培養物が細胞を少なくとも103個含み、細胞が、少なくとも14、25、または35回の集団倍加を行う能力を有する培養物に関する。本発明の別の態様は、本明細書に記載の細胞培養培地を調製するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、アデノシン三リン酸;担体タンパク質;コレステロール、リノール酸、およびリポ酸;グルタチオン;ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基;ホスホエタノールアミン;セレン;トランスフェリン;トリヨードサイロニン;ビタミンA、ビタミンC、およびビタミンD;Zn、Mg、およびCuを含む第1の1つまたは複数の容器と、細胞内cAMPを増加させる作用物質;上皮成長因子(EGF);ヒドロコルチゾン;インスリン;および血清;ならびに場合によってエストロゲンを含む第2の1つまたは複数の容器とを含んでよく、したがって、第1の容器の内容物と第2の容器の内容物(または第1の容器のセットと第2の容器のセット)を適切な割合で組み合わせることにより、例えば、本明細書において多様に定義されている細胞培養培地がもたらされる。いくつかの実施形態では、このキットにより、細胞の増殖をin vitroにおいて少なくとも14、25、またはさらには少なくとも35回の集団倍加(PD)にわたって支持することができる。
本発明のさらに別の態様は細胞培養培地補助剤であり、この補助剤は、細胞内cAMPを増加させる作用物質;上皮成長因子(EGF);ヒドロコルチゾン;インスリン;血清;および場合によってエストロゲンを相対的な濃度で含み、したがって、適切な割合の補助剤を基本細胞培養培地に添加することにより、本明細書に記載の細胞培養培地がもたらされる。例えば、補助剤を細胞培養培地に添加することにより、例えば、本明細書において多様に記載されている通り0〜70ng/mLの細胞内cAMPを増加させる作用物質、少なくとも3ng/mLのEGF、0.015〜0.5μg/mLのヒドロコルチゾン;少なくとも10.00μg/mLのインスリン、0.2%v/v〜4.0%v/vの血清補助剤、および場合によって、30〜300nMのエストロゲンがもたらされる。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の細胞培養培地を調製する方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、アデノシン三リン酸;担体タンパク質;コレステロール、リノール酸、およびリポ酸;グルタチオン;ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基;ホスホエタノールアミン;セレン;トランスフェリン;トリヨードサイロニン;ビタミンA、ビタミンC、およびビタミンD;Zn、Mg、およびCu;細胞内cAMPを増加させる作用物質;上皮成長因子(EGF);ヒドロコルチゾン;インスリン;および血清;ならびに場合によってエストロゲンを組み合わせることを含み、それにより、内容物を適切な割合で組み合わせることにより、本明細書に多様に記載されている細胞培養培地がもたらされる。いくつかの実施形態では、1つまたは複数の成分(例えば、第1の11種の成分である、アデノシン三リン酸;担体タンパク質;コレステロール、リノール酸、およびリポ酸;グルタチオン;ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基;ホスホエタノールアミン;セレン;トランスフェリン;トリヨードサイロニン;ビタミンA、ビタミンC、およびビタミンD;Zn、Mg、およびCu)が第1の1つまたは複数の容器から添加され、1つまたは複数の追加成分、例えば、後者の5種の成分および場合によってエストロゲンが第2の1つまたは複数の容器から添加される。
本発明のさらに別の態様は、卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞を培養するための方法である。この方法は、卵巣または卵管から卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞を得るステップと、細胞を本明細書に記載の細胞培養培地中で培養するステップとを含み、卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞は、細胞培養培地中で少なくとも14、25、またはさらには35回の集団倍加を行うことができる。細胞は、卵巣表面に由来するものなどの卵巣上皮細胞であってよい。細胞は、卵管の采状表面に由来するものなどの卵管上皮細胞であってよい。
同様に、本発明の態様は、腫瘍細胞を培養するための方法に関する。この方法は、腫瘍細胞を得るステップと、腫瘍腫細胞を、本明細書に記載されており、WIT−ocによって例示される腫瘍細胞を培養するために適した細胞培養培地中で培養するステップとを含み、細胞内cAMPを増加させる作用物質はコレラ毒素であり、細胞培養培地は25ng/mLのコレラ毒素、10ng/mLの上皮成長因子(EGF)、0.15μg/mLのヒドロコルチゾン;15.00μg/mLのインスリン;および1.8%の血清補助剤(好ましくはエストロゲンを実質的に含まない)を含み、腫瘍細胞は、細胞培養培地中で少なくとも14、25、またはさらには35回の集団倍加を行うことができる。いくつかの実施形態では、この方法は、培養プレートを、最初の1〜5回の細胞継代にわたってトリプシンで処理し、それにより、癌細胞を富化するステップをさらに含む。他の実施形態では、腫瘍細胞は卵巣癌細胞、ヒト乳癌細胞、膵癌細胞、腺様嚢胞癌細胞、および/または肺または胃腸管由来の神経内分泌腫瘍(カルチノイド)細胞である。例えば、腫瘍細胞は卵巣癌細胞であってよい。卵巣癌細胞は、患者の一次固形卵巣組織または腹水から、または動物モデルにおいて成長させた腫瘍異種移植片から得ることができる。さらなる実施形態では、腫瘍細胞は乳頭状漿液性腫瘍細胞、明細胞腫瘍細胞、癌肉腫細胞、または未分化胚細胞腫細胞である。他の実施形態では、例えば、類内膜腫瘍細胞または粘液性腫瘍細胞を培養するために、細胞培養培地は、100nMの17−ベータ−エストラジオールまたは等しい効力の量の別のエストロゲンをさらに含んでよい。
本発明の追加的な態様は、候補治療剤を同定する方法であって、細胞(すなわち、乳頭状漿液性腫瘍、明細胞腫瘍、癌肉腫、未分化胚細胞腫、類内膜腫瘍、または粘液性腫瘍のうちの少なくとも1つである卵巣腫瘍などの原発腫瘍に由来する細胞)を培養するステップと、細胞を作用物質と接触させるステップと、細胞の生理機能を測定するステップとを含み、細胞の生理機能を調節する作用物質が候補治療剤である方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、細胞を作用物質と接触させる前に細胞を試験動物内で成長させることをさらに含む。
詳細な説明
I.細胞培養培地
A.培養培地の組成
本発明は、in vitroにおける初代細胞(卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞を含む)および腫瘍細胞(卵巣腫瘍細胞を含む)の成長および増殖を長期にわたって支持する細胞培養培地に関する。「細胞培養培地(cell culture medium)」、「培養培地(culture medium)」(それぞれの場合の複数形の「培地(media)」)および「培地処方」という句は、細胞を培養(cultivate)するための栄養溶液を指し、これらは互換的に使用することができる。
I.細胞培養培地
A.培養培地の組成
本発明は、in vitroにおける初代細胞(卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞を含む)および腫瘍細胞(卵巣腫瘍細胞を含む)の成長および増殖を長期にわたって支持する細胞培養培地に関する。「細胞培養培地(cell culture medium)」、「培養培地(culture medium)」(それぞれの場合の複数形の「培地(media)」)および「培地処方」という句は、細胞を培養(cultivate)するための栄養溶液を指し、これらは互換的に使用することができる。
本明細書に記載の培地中で培養される細胞は、少なくとも4週間(または15回の集団倍加)、数ヶ月に至るまで、そのような培養培地において分化能を失うことなく成長することができる。一実施形態では、対象培地により、卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞、ならびに/またはテロメラーゼをトランスフェクトした卵巣細胞および卵管細胞の長期の成長および増殖が、いかなる追加的な検出可能な遺伝学的変更も伴わずに、または分化能を失うことなく、in vitroにおいて少なくとも約15週間または少なくとも約35回の集団倍加(PD)にわたって支持される。別の実施形態では、対象培地により、これらの細胞の成長および増殖が、培養物中で少なくとも5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間、13週間、14週間、15週間またはそれ以上支持される。同様に、対象培地により、ヒトの腫瘍組織、悪性体液中の腫瘍細胞、および/または動物モデルにおいて成長させた腫瘍の一次異種移植片に由来する初代細胞株の成長を、in vitroにおいて、少なくとも約15週間または少なくとも約14、25またはさらには35回の集団倍加(PD)にわたって、いかなる追加的な検出可能な遺伝学的変更も伴わずに、またはその表現型(形態学的、構造的、および/または分子など)および/または組織病理を失うことなく支持することができる。別の実施形態では、対象培地により、これらの細胞の成長および増殖が、培養物中で少なくとも5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間、13週間、14週間、15週間またはそれ以上支持される。
本発明の細胞培養培地は水ベースであり(しかし、乾燥粉末および/または凍結させた構成成分から再構成することができる)、水、液体、および/または水溶液中にいくつもの成分を含む。
「成分」という用語は、化学的起源か生物学的起源かに関わらず、細胞の成長または増殖を維持または促進するために細胞培養培地に使用することができる任意の化合物を指す。「構成成分」、「栄養分」および「成分」という用語は互換的に使用することができ、これらは全て、そのような化合物を指すものとする。細胞培養培地に使用される典型的な成分としては、アミノ酸、塩、金属、糖、脂質、核酸、ホルモン、ビタミン、脂肪酸、タンパク質などが挙げられる。細胞のex vivoにおける培養(cultivation)を促進または維持する他の成分は、当業者が特定の必要性に応じて選択することができる。
「細胞培養」または「培養」とは、人工的なin vitroの環境において細胞を維持することを意味する。しかし、「細胞培養」という用語は総称であり、個々の細胞だけでなく、組織、器官、器官系、または生物体全体の培養(cultivation)も包含するために使用することができ、「組織培養」、「器官培養」、「器官系培養」または「器官型培養」という用語を場合によって「細胞培養」という用語と互換的に使用することができることが理解されるべきである。
いくつかの実施形態では、培地は、1種または複数種の特定の構成成分を実質的に含まない。ある特定の実施形態では、「実質的に含まない」とは、構成成分が細胞の成長および/または分化の状態に対して統計的に有意な効果を持たない少量であることを指す。いくつかの実施形態では、「実質的に含まない」とは、液体の1%v/v未満、0.1%v/v未満、0.01%v/v未満、0.001%v/v未満、または0.0001%v/v未満であることまたは溶質の1%w/v未満、0.1%w/v未満、0.01%w/v未満、0.001%w/v未満、または0.0001%w/v未満であることを指す。いくつかの実施形態では、「実質的に含まない」とは、0.001mg/L未満、0.0001mg/L未満、0.00001mg/L未満、0.000001mg/L未満、または0.0000001mg/L未満の濃度であることを指す。いくつかの実施形態では、「実質的に含まない」とは、10nM未満、1nM未満、100pM未満、10pM未満、または1pM未満の濃度であることを指す。
本発明の一態様では、対象細胞培養培地は、(1)1種または複数種の抗酸化剤;(2)1種または複数種のヌクレオチドサルベージ経路合成前駆体;(3)1種または複数種の脂質合成前駆体;(4)1種または複数種のタンパク質合成前駆体;(5)1種または複数種の炭水化物合成およびエネルギー代謝の前駆体;(6)1種または複数種の緩衝液(必須ではない);(7)1種または複数種の陽イオン(一価および/または二価)、イオン、微量金属および酵素補因子;(8)1種または複数種の担体タンパク質(例えば、ウシ血清アルブミンなど);(9)1種または複数種の界面活性剤(例えば、tween80など);(10)1種または複数種の、細胞内の3’−5’環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルの上昇を誘導する作用物質;(11)1種または複数種のホルモンおよび成長因子、ならびに/または(12)血清を含む。他の実施形態では、生じた培地により、正常な卵巣細胞および卵管細胞などの細胞ならびに/または卵巣腫瘍細胞などの腫瘍細胞などの成長および/または増殖がin vitroにおいて少なくとも約4週間または少なくとも約15、25、またはさらには35回の集団倍加(PD)にわたって支持されるのであれば、上で列挙されている構成成分カテゴリーのうちの1つまたは複数を省くことができる。
したがって、本発明の培地は、1種または複数種の抗酸化剤;ヌクレオチド合成およびサルベージ経路の前駆体;脂質合成前駆体;細胞内cAMPレベルのアゴニスト;ホルモンおよび成長因子;ならびに血清を含む。培地は、他の構成成分、例えば、アミノ酸補助剤、細胞の成長/増殖に必要なビタミン、微量鉱質、無機塩、エネルギーの供給源(例えば解糖のため)など、および他の構成成分、例えば、pH指示薬などをさらに含んでよい。言い換えれば、本発明の成分は、アミノ酸、ビタミン、無機塩、アデニン、D−グルコース、N−[2−ヒドロキシエチル]ピペラジン−N’−[2−エタンスルホン酸](HEPES)、ヒドロコルチゾン、インスリン、リポ酸、フェノールレッド、ホスホエタノールアミン、プトレシン、ピルビン酸ナトリウム、トリヨードサイロニン(T3)、チミジンおよびトランスフェリンを含んでよい。これらの成分はそれぞれ、例えばSigma(Saint Louis、MO)から購入することができる。
任意の特定の理論に縛られることを望むものではないが、抗酸化剤は、一般に、一般に細胞の成長に有害であると考えられているフリーラジカルのクエンチを補助する。本発明の抗酸化剤としては、これらだけに限定することなく、以下の1つまたは複数を挙げることができる:ベータカロテン、ビタミンE、ビタミンC(アスコルビン酸)、ビタミンK3、グルタチオン(還元型)、ナイアシン(またはナイアシンアミド)、またはDTT(ジチオスレイトール)。抗酸化剤には、場合によって、Zn、Se、Cr、Cu、Mg、またはMnを含めた微量金属を補充することができる。
さらに、理論に縛られることを望むものではないが、特定の酵素を構成するために微量鉱物が必要な場合がある。例えば、グルタチオンペルオキシダーゼは補因子としてセレンを使用し、グルタチオン超酸化物は補因子として銅を使用する。フリーラジカル負荷量が大きい疾患では、特定の微小環境においてこれらの微量要素が欠損する可能性があることが仮定された。微量鉱物が存在することは、酵素的抗酸化剤(補因子を欠く可能性がある)に役立つ可能性がある。したがって、微量鉱物が存在することにより、宿主が酵素的抗酸化剤を有効に使用することが可能になり得る。亜鉛により超酸化物ジスムターゼを上方制御することができ、セレンによりグルタチオンペルオキシダーゼを上方制御することができることが公知であるので、所与の微小環境において微量鉱物を増加させることにより、微小環境における酵素的抗酸化剤の正味の増加がもたらされる。酵素的抗酸化剤の正味の増加および両親媒性抗酸化剤の増加により、組織または細胞の酸化による損傷、ならびにフリーラジカルに起因する他の有害作用がさらに減少する。
したがって、本発明の培地において有益であり得る多くの無機塩成分、陽イオン、イオン、微量金属、およびビタミンとしては、カルシウム塩(例えばCaCl2)、CuSO4、FeSO4、KCl、マグネシウム塩(例えばMgCl2)、酢酸ナトリウム、NaCl、NaHCO3、Na2HPO4、Na2SO4ならびに微量元素であるセレンおよび亜鉛のイオンが挙げられる。場合によっては、追加的な無機塩成分として、マンガン塩(例えばMnCl2)、ケイ素、モリブデン、バナジウム、ニッケル、およびスズを挙げることができる。
これらの微量元素は、種々の形態で提供することができ、Na2SeO3、およびZnSO(または任意選択の塩としてNa2SiO3、(NH4)6Mo7O24、NH4VO3、NiSO4、SnCl2)などの塩の形態が好ましい。これらの無機塩および微量元素は、例えばSigma(Saint Louis、MO)から購入することができる。
本発明の培地に含めることができるビタミン成分としては、ビオチン、塩化コリン、D−Ca++−パントテン酸、葉酸、i−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、チアミン、ビタミンAおよびビタミンB12が挙げられる。これらのビタミンは、例えばSigma(Saint Louis、MO)から購入することができる。
タンパク質合成前駆体としては、アミノ酸成分が挙げられる。一実施形態では、本発明の培地に含めることができるアミノ酸成分としては、L−アラニン、L−アルギニン、L−アスパラギン、L−アスパラギン酸、L−システイン、L−グルタミン酸、L−グルタミン、グリシン、L−ヒスチジン、L−イソロイシン、L−ロイシン、L−リシン、L−メチオニン、L−フェニルアラニン、L−プロリン、L−セリン、L−トレオニン、L−トリプトファン、L−チロシンおよびL−バリンが挙げられる。これらのアミノ酸は、例えばSigma(Saint Louis、MO)から購入することができる。
あるいは、いくつかの他の実施形態では、必須アミノ酸のみが本発明の培地に含まれる。ヒト細胞などの特定の細胞は、生存するために適量の9種のアミノ酸を有さなければならない。これらのいわゆる「必須」アミノ酸は他の前駆体から合成することができない。しかし、システインがメチオニンの必要性を部分的に満たす場合があり(どちらも硫黄を含有する)、また、チロシンをフェニルアラニンと部分的に置換することができる。そのような必須アミノ酸としては、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン(および/またはシステイン)、フェニルアラニン(および/またはチロシン)、トレオニン、トリプトファン、およびバリンが挙げられる。ある特定の実施形態では、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、トレオニン、トリプトファン、およびバリンのみが含まれる。
上記の成分の一部または全部を溶液中で混和すると、「基本培地」を形成することができる。この基本培地に、他の構成成分、例えば、少なくとも1種のヌクレオチド合成前駆体および/またはサルベージ経路前駆体(例えばヒポキサンチン)、上皮成長因子(EGF)、少なくとも1種の、細胞内環状アデノシン一リン酸(cAMP)レベルを上昇させる作用物質、および少なくとも1種のホルモン、および少なくとも1種のタンパク質などを加えて、本発明の完全な培養培地を処方する。これらの後者の添加される構成成分、例えば、EGFおよびcAMPを上昇させる作用物質(複数可)などは、新たに処方した基本培地に加えることができる、または、本発明の完全培地を処方するために基本培地に加えるまで好ましくは約−20℃〜約−70℃で凍結貯蔵した貯蔵用液として混和することができる。この完全培地は、所望の細胞の成長および増殖を実現するために動物細胞培養培地中にBPEまたは他の器官/腺抽出物を含んでもよく、動物細胞培養培地中にBPEまたは他の器官/腺抽出物を実質的に含まなくてもよい。混和物は、1〜1000×処方として、最も好ましくは1×、100×、500×または1000×処方として調製することもでき、次いで、これを培養培地中に適切に希釈して、本発明の完全培地中1×最終処方をもたらす。
本発明の培地は、プロゲステロン、テストステロン、ヒドロコルチゾン、もしくはエストロゲンなどの1種または複数種のホルモン、および/またはインスリンおよびEGF(上皮成長因子)などの1種または複数種の成長因子も含んでよい。
例えば、本発明の培地は、EGFを含んでよく、これは天然型であっても組換え型であってもよく、ヒトのものであってもげっ歯類のものであってもよい。EGFは、市販されており(例えば、GIBCO/LTI、Gaithersburg、MDから)、天然の供給源から単離されるか、当技術分野において常套的である方法体系に従って組換えDNA技法によって作製される(米国特許第4,743,679号)。本発明の培地を処方するために、好ましい実施形態では、EGFを培地(例えば、表3に示されている培地など)に、最終濃度が約0.00001〜10mg/L、好ましくは約0.0005〜1mg/Lになるように加える。
本発明の培地は、ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニン、およびチミジンなどの、ヌクレオチドのサルベージ経路による合成において使用することができるヌクレオチド類似体または前駆体も含んでよい。
本発明の培地は、コレステロール、リノール酸、リポ酸、またはO−ホスホリルエタノールアミンなどの脂質合成前駆体も含んでよい。
本発明の培地は、1種または複数種のcAMPアゴニストまたは細胞内cAMPレベルを上昇させる作用物質も含む。種々のそのような作用物質を、本発明の培地の処方において使用することができる。細胞内cAMP(例えば、ジブチリルcAMP)レベルの直接的な上昇を誘導する作用物質、細胞のGタンパク質(例えば、コレラ毒素およびフォルスコリン)と相互作用することによって細胞内cAMPレベルの上昇を引き起こす作用物質、β−アドレナリン作動性受容体(例えば、イソプロテレノール)のアゴニストとして作用することによって細胞内cAMPレベルの上昇を引き起こす作用物質、およびcAMPホスホジエステラーゼ(例えば、イソブチルメチルキサンチン(IBMX)およびテオフィリン)の活性を阻害することによって細胞内cAMPレベルの上昇を引き起こす作用物質が含まれる。本発明の培地の処方において使用するために最も好ましいのはコレラ毒素である。これらのcAMPを上昇させる作用物質は、例えばSigma(St.Louis、Mo.)から購入することができ、Green(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 15巻:801〜811頁(1978年))に記載の濃度に近い濃度で使用することができる。例えば、上記の基本培地に、コレラ毒素を約0〜0.01mg/L、好ましくは約0〜0.001mg/L、最も好ましくは約0〜0.0001mg/Lの濃度で加える。ジブチリルcAMP、IBMX、イソプロテレノールなどを加えて、コレラ毒素と同じレベルのcAMPを実現することができる。
コレラ毒素、フォルスコリン、Gタンパク質−共役受容体アゴニスト、PKCアゴニストなどの作用物質を使用することによって細胞内cAMPレベルを上昇させることも望ましい。さらに、ベータ−アドレナリン作動性のアゴニストであるイソプロテレノール(Iso)、プロスタグランジンE(2)(PGE(2))、特定のプロスタノイド受容体選択的アゴニスト(ベラプロスト、ブタプロスト)、およびアデノシン受容体アゴニストに応答して細胞のcAMPが上昇する可能性がある。さらに、6型ACまたは環状ヌクレオチドホスホジエステラーゼを阻害する作用物質が過剰発現することにより、細胞のcAMPレベルが上昇した。
対象培地は、D−グルコース、ピルビン酸ナトリウムなどの1種または複数種の炭水化物合成およびエネルギー代謝の前駆体も含んでよい。
対象培地は、ウシ血清アルブミンなど(BSA)の1種または複数種の担体タンパク質も含んでよい。担体タンパク質は、それが包埋している細胞膜を通り、細胞内に特定の物質を輸送するタンパク質であってよい。担体タンパク質は、それぞれがただ1つの物質または同様の物質の群を認識するように設計されているので、異なる物質を輸送するためには異なる担体タンパク質が必要になる場合がある。特定の担体タンパク質は1種または複数種の培地構成成分(例えば、成長因子など)に結合し、それらに培地における追加的な安定性を付与すること、または特定の生物学的プロセスを容易にすることができる(例えば、アシル−担体タンパク質、ステロール担体タンパク質、ホルモン担体タンパク質など)。
対象培地は、非イオン性界面活性物質であるTween60またはTween80などの1種または複数種の界面活性物質も含んでよい。さらに、いかなる特定の理論に縛られることなく、そのような界面活性剤構成成分は、特定の培地構成成分を湿らすため、可溶化するため、乳化するため、または分散させるために役立ち得る。例えば、界面活性剤構成成分により、BSAなどのタンパク質の凝集を妨げること、特定の構成成分の溶解性を増大させること、および、さらには特定の酵素の機能を増強することができる。
必須であるとはみなされないが、対象培地は、長期培養において平衡pHが維持されるように、HEPESおよび炭酸水素ナトリウム緩衝系などの1種または複数種の緩衝系をさらに含んでよい。培養培地を頻繁に、一定に、または連続的に交換することによっても、急速に成長している細胞の培地pHを回復させることができる。
例示するために、以下の表3には、(1)乳頭状漿液性腫瘍、明細胞腫瘍、癌肉腫、または未分化胚細胞腫に由来する卵巣腫瘍細胞株、(2)類内膜腫瘍または粘液性腫瘍に由来する卵巣腫瘍細胞株、および(3)正常な卵巣細胞または卵管細胞の長期にわたる成長および増殖を支持する3つの本発明の培地処方の例示的な組成物が示されている。これらの培地により、これらの細胞型の成長および増殖がin vitroにおいて少なくとも約4週間または少なくとも約15回の集団倍加(PD)にわたって支持され、それらの表現型(形態学的、構造的、および/または分子など)および/または組織病理はその細胞が由来する起源腫瘍と区別できない。
線維芽細胞および他の間質細胞の百分率は、数回の継代および集団倍加の後に、評価できる量の線維芽細胞および間質細胞の分化マーカー(例えばビメンチン)を検出することができない程度まで急激に低下する。例えば、上皮の分化マーカーとしては、ケラチン8、ケラチン10、ケラチン14、ケラチン18、ケラチン19、E−カドヘリン、p63、SMA(平滑筋アクチン)、およびβ−カテニンを挙げることができる。
ex vivoにおいて組織培養することにより、細胞が酸化による損傷、代謝ストレスおよびDNA損傷に曝露され、それによりp53遺伝子およびp16遺伝子が誘導され、それにより今度は細胞周期の停止、老化および/またはアポトーシスが誘導され、培養細胞の寿命が限定される。別の実施形態では、本発明の培地により、初代細胞の長期にわたるストレスのない成長および増殖が支持される。対象培地におけるそのようなストレスのない成長の1つの指標は、CDK阻害物質であるp16および腫瘍抑制因子であるp53の発現レベルが低いこと/検出不可能であることによって示される。これらの2つのタンパク質は、一般には、組織培養培地中のストレスを受けた細胞において高レベルで発現されるように誘導されるが、健康的に成長している細胞ではそのように誘導されない。この実施形態では、細胞を、37℃、5%CO2および変動するO2濃度、例えば、1%、2%、3%、または周囲空気で成長させることができる。
別の実施形態では、本発明の培地は、ヘパリン、線維芽細胞増殖因子(FGF)、およびウシ下垂体抽出物(BPE)からなる群から選択される少なくとも1つのメンバーを実質的に含まない。ある特定の実施形態では、上で列挙されている構成成分のいずれも対象培地中に存在しない。
しかし、そのような構成成分が、初代細胞の成長および増殖を支持することに関して培地の性能に実質的に影響を及ぼさない限りでは、ある特定の実施形態では、対象培地はそのような構成成分のうちの1つまたは複数を含んでよく、その存在を許容してよい。
本発明は、濃度範囲の下限が0である構成成分の任意の1つまたは複数が存在しない表3の培地の実施形態、およびそのような構成成分が存在する実施形態を提供する。表3に列挙されている本発明の培地は、ただ単に例示するためのものであることが理解されるべきである。培地自体は特定の意図された目的のため、特に本明細書で関連づけられる細胞型を各処方で培養するために十分であるが、これらの表に列挙されている構成成分の全てがそれらの意図された目的のために必要またはさらには最適である可能性があるわけではない。当業者は、当該特定の初代細胞の必要性に部分的に応じて、列挙されている任意の構成成分が必要であるかおよび/または最適であるかを、例えば、一回に1つの構成成分を排除し、または1つの構成成分の濃度を変化させ、そのような改変培地における特定の種類の培養細胞の成長/増殖を起源の培地と比較することによって容易に決定することができる。必要な場合、1つまたは複数の構成成分を同様の性質の他の化学物質で置換することもできる。1つまたは複数の非必須の/不必要な構成成分を伴わないそのような改変培地は本発明の範囲内である。同様に、当業者は、特定の細胞型に対する任意の所与の構成成分の最適レベルも、例えば、さまざまな濃度(例えば、10%、25%、50%、75%、100%、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍高い、または10%、25%、50%、75%、100%、2倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍低い)を、列挙されている各構成成分に対して、その特定の構成成分の列挙されている濃度に基づいて、またそこから開始して試験することによって決定することができる。一部の構成成分は列挙されている範囲の濃度を有する。任意の特定の細胞型に対して適切または最適な濃度は、列挙されている濃度から開始して同様に決定することもできる。そのような試験の実施では、最初の広範囲の濃度試験は、その後で最初の実験の結果に基づいて範囲を絞り込むことができる。例えば、最初の試験について、1つの対象の構成成分の濃度を表3に列挙されている濃度の10−3、10−2、10−1、10倍、100倍、および1000倍に変化させることができる。10−2試験では依然として所望の成長が支持されるが10−3では所望の成長が支持されない場合、試験の第2ラウンドでは10−2と10−3の間の10倍の濃度差についてさらに探究して、最良の範囲を正確に示すことができる。したがって、特定の細胞型に対してそのように最適化された培地も本発明の範囲内に入る。
当業者には容易に明らかになる通り、所与の成分の濃度は、開示されている範囲を超えて上昇または低下させることができ、濃度の上昇または低下の効果は常套的な実験のみを用いて決定することができる。任意の特定の細胞型に対する本培地処方の最適化は、Ham(Ham、Methods for Preparation of Media,Supplements and Substrata for Serum-Free Animal Culture、Alan R.Liss.Inc.、New York、3〜21頁、1984年)およびWaymouth(Waymouth、C.、Methods for Preparation of Media,Supplements and Substrata for Serum-Free Animal Culture、Alan R. Liss.Inc.、New York、23〜68頁、1984年)に記載されている手法を用いて行うことができる。培地成分についての最適な最終濃度は、一般には、単一の構成成分の滴定試験における経験的試験によって、または歴史的科学文献および現行の科学文献を解釈することによって同定される。動物細胞を使用する単一の構成成分の滴定試験では、単一の培地構成成分の濃度を変動させ、他の全ての構成物および変数は一定に保ち、動物細胞の生存能力、成長または健康の持続に対する単一の構成成分の効果を測定する。
本明細書において列挙されている特定のビタミンおよびホルモンは、当技術分野で公知の異なる形態(例えば、種々の天然に存在する形態または天然に存在しない形態)で存在してよく、互いに代替品として使用することができることが理解されよう。本出願にビタミンまたはホルモンが開示されている場合、本発明は、同様の生物活性を有するそのようなビタミンまたはホルモンの任意の形態(または、細胞培養培地または細胞内で修飾または代謝されて、生物学的に活性な形態をもたらす可能性がある化合物(複数可))が本発明の培地および/または方法(複数可)において使用される実施形態を包含するものと理解されるべきであることも理解されよう。
エストロゲン、プロゲステロン、甲状腺ホルモン、ヒドロコルチゾン、インスリンなどの化合物を、それぞれエストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、甲状腺ホルモン受容体、グルココルチコイド受容体、インスリン受容体のアゴニストである他の化合物(天然に存在するまたは天然に存在しない、天然の供給源から単離された、または少なくとも部分的に化学合成された化合物)で全体的にまたは部分的に置換することができることが理解されよう。いくつものそのような化合物が当技術分野で公知である。
培地成分は、液体担体に溶解させること、または乾燥した形態で維持することができる。上記の好ましい濃度(すなわち、「1×処方」)で液体担体に溶解させる場合、培地のpHは、約7.0〜7.6、好ましくは約7.1〜7.5、最も好ましくは約7.2〜7.4に調整するべきである。培地の容量オスモル濃度も、約275〜350mOsm、好ましくは約285〜325mOsm、最も好ましくは約280〜310mOsmに調整するべきである。成分を溶液に溶解させるために用いる液体担体の種類および方法は変動し、当業者が常套的な実験だけを用いて決定することができる。一般には、培地成分は任意の順序で添加することができる。
細胞培養培地は、いくつもの成分で構成され、これらの成分は、培養培地ごとに変動する。「1×処方」とは、細胞培養培地において見いだされる一部または全ての成分を作用濃度で含有する任意の水溶液を指すものとする。「1×処方」とは、例えば、細胞培養培地またはその培地の成分の任意のサブグループを指す場合がある。1×溶液中の成分の濃度は、細胞をin vitroで維持または培養(cultivate)するために使用する細胞培養処方物において見いだされるその成分の濃度とほぼ同じである。細胞をin vitroで培養(cultivation)するために使用する細胞培養培地は、定義によると1×処方である。いくつもの成分が存在する場合、1×処方の各成分は、細胞培養培地中のそれらの成分の濃度とほぼ等しい濃度を有する。例えば、RPMI−1640培養培地は、他の成分の中でも、0.2g/LのL−アルギニン、0.05g/LのL−アスパラギン、および0.02g/LのL−アスパラギン酸を含有する。これらのアミノ酸の「1×処方」は、溶液中にこれらの成分をほぼ同じ濃度で含有する。したがって、「1×処方」について言及する場合、溶液中の各成分は、記載されている細胞培養培地において見いだされる濃度と同じまたはほぼ同じ濃度であるものとする。細胞培養培地の1×処方中の成分の濃度は、当業者に周知である。その全体が参照により本明細書に組み込まれるMethods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For Serum-Free Animal Cell Culture Allen R. Liss、N.Y.(1984年)を参照されたい。しかし、1×処方における容量オスモル濃度および/またはpHは、特に、1×処方に含有される成分が少ない場合には、培養培地と比較して異なる。
「10×処方」は、溶液中の各成分が、細胞培養培地中の同じ成分よりも約10倍高度に濃縮されている溶液を指すものとする。例えば、RPMI−1640培養培地の10×処方は、他の成分の中でも、2.0g/LのL−アルギニン、0.5g/LのL−アスパラギン、および0.2g/LのL−アスパラギン酸(上記の1×処方と比較されたい)を含有してよい。「10×処方」は、いくつもの追加成分を1×培養培地において見いだされる濃度の約10倍の濃度で含有してよい。容易に明らかになる通り、「25×処方」、「50×処方」、「100×処方」、「500×処方」および「1000×処方」は、成分を1×細胞培養培地と比較してそれぞれ約25倍、50倍、100倍、500倍、または1000倍の濃度で含有する溶液を示す。さらに、培地処方および濃縮溶液の容量オスモル濃度およびpHは変動してよい。
成分を含む溶液は1×培地処方中の同じ成分の濃度よりも高度に濃縮されていることが好ましい。成分は、10倍高度に濃縮されていてよい(10×処方)、25倍高度に濃縮されていてよい(25×処方)、50倍高度に濃縮されていてよい(50×濃度)、または100倍高度に濃縮されていてよい(100×処方)。成分が可溶性かつ安定なままであるのであれば、より高度に濃縮された処方を作出することができる。高濃度の培養培地構成成分を可溶化する方法を対象とする米国特許第5,474,931号(内容全体が参照により本明細書に組み込まれる)を参照されたい。
培地成分を別々の濃縮溶液として調製する場合、適切な(十分な)量の各濃縮物を希釈剤と組み合わせて1×培地処方を作製する。一般には、使用される希釈剤は水であるが、緩衝水溶液、生理食塩水溶液、または他の水溶液を含めた他の溶液を本発明に従って用いることができる。
本発明の培養培地は、一般には、望ましくないコンタミネーションを予防するために滅菌する。滅菌は、例えば、濃縮された成分を混合した後に孔サイズ約0.1〜1.0μMの低タンパク質結合性膜フィルター(例えば、Millipore、Bedford、Mass.から市販されている)を通して濾過して滅菌培養培地を作製することによって実現することができる。あるいは、濃縮された成分のサブグループを濾過滅菌し、滅菌溶液として貯蔵することができる。次いで、これらの滅菌濃縮物を無菌条件下で滅菌希釈剤と混合して、濃縮された1×滅菌培地処方を作製することができる。本培養培地の構成成分の多くが熱に不安定であり、例えば大多数の熱による滅菌方法の間に達する温度によって不可逆的に分解されるので、オートクレーブまたは他の温度の上昇に基づく滅菌方法は好ましくない。
当業者には容易に明らかになる通り、培養培地の構成成分はそれぞれ、溶液中の1種または複数種の他の構成成分と反応する可能性がある。したがって、本発明は、上記の通り補充した、表3に開示されている処方、ならびにこれらの成分を組み合わせた後に形成される任意の反応混合物を包含する。
多くの組織培養培地は、一般には、1種または複数種の抗生物質を含有し、これは、細胞の成長/増殖自体には必要ないが、細菌および/または真菌などの望ましくない微生物の成長を阻害するために存在する。
抗生物質は、細菌(Bacillus種を含む)、放線菌類(Streptomycesを含む)および真菌などの微生物の種々の種によって産生される、他の微生物の成長を阻害する、またはそれを破壊する比較的分子量が低い天然の化学物質である。構造および作用様式が同様の物質を化学的に合成することができる、または天然化合物を修飾して半合成抗生物質を作製することができる。これらの生合成誘導体および半合成誘導体も同様に抗生物質として有効である。抗生物質の主要なクラスは、(1)ペニシリン、セファロスポリンおよびモノバクタムを含めたβ−ラクタム系;(2)アミノグリコシド系、例えば、ゲンタマイシン、トブラマイシン、ネチルマイシン、およびアミカシン;(3)テトラサイクリン系;(4)スルホンアミド系およびトリメトプリム;(5)フルオロキノロン系、例えば、シプロフロキサシン、ノルフロキサシン、およびオフロキサシン;(6)バンコマイシン;(7)例えば、エリスロマイシン、アジスロマイシン、およびクラリスロマイシンを含むマクロライド系、;ならびに(8)他の抗生物質、例えば、ポリミキシン、クロラムフェニコールおよびリンコサミドである。
抗生物質はいくつかの作用機構を通じてそれらの抗細菌効果を実現し、一般に以下の通り群分けすることができる:(1)細菌の細胞壁に作用する作用物質、例えば、バシトラシン、セファロスポリン、サイクロセリン、ホスホマイシン、ペニシリン、リストセチン、およびバンコマイシンなど;(2)細胞膜に影響を及ぼす、または界面活性剤効果を発揮する作用物質、例えば、コリスチン、ノボビオシンおよびポリミキシンなど;(3)リボソームに対する効果によって複製、情報伝達、およびタンパク質合成の細胞機構に影響を及ぼす作用物質、例えば、アミノグリコシド、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、シクロヘキシミド、フシジン(fucidin)、リンコマイシン、ピューロマイシン、リファンピシン、他のストレプトマイシン、およびマクロライド系抗生物質、例えば、エリスロマイシンおよびオレアンドマイシンなど;(4)核酸代謝に影響を及ぼす作用物質、例えば、フルオロキノロン、アクチノマイシン、エタンブトール、5−フルオロシトシン、グリセオフルビン、リファマイシン;および(5)中間代謝に影響を及ぼす薬物、例えば、スルホンアミド、トリメトプリム、および抗結核薬であるイソニアジドおよびパラ−アミノサリチル酸など。一部の作用物質は、特に高濃度では、2種以上の主要な作用機構を有する可能性がある。さらに、多くの場合、抗菌薬の一次効果の後に細菌の細胞の構造または代謝の二次的変化が起こる。
したがって、便宜上および他の実用的な理由で、対象培地に、望ましくない細菌/真菌/ウイルスの成長/増殖を阻害する1種または複数種の抗生物質または他の物質をさらに補充することができる。しかし、他の実施形態では、対象培地は、初代細胞の最適な成長を確実にするために、いかなる抗生物質も含まない場合がある。抗生物質を含まない培地で成長している細胞を取扱う際には、可能性のあるコンタミネーションを回避するために特別の注意を払うべきである。
表3に列挙されている濃度は絶対的ではなく、また、不変ではない。異なる細胞型は異なる成長要求を有する可能性があるので、一般に、各値について2〜10倍の変動(増加または減少)が許容できる濃度範囲であることが意図されている。一部の構成成分については、さらに大きな最終濃度の変動が許容される可能性がある。これらの出発濃度を用いてさらなる最適化を実現することができる。
いくつかの実施形態では、添加される構成成分の任意の1つまたは複数の最終濃度は、表3に列挙されている濃度とは最大10倍異なり、これは、関連する濃度が表3に列挙されている濃度の0.1〜10倍にわたってよいことを意味する。いくつかの実施形態では、添加される構成成分の任意の1つまたは複数の最終濃度は、表3に列挙されている濃度とは最大3倍異なり、これは、関連する濃度が表3に列挙されている濃度の0.3〜3倍にわたってよいことを意味する。いくつかの実施形態では、添加される構成成分の任意の1つまたは複数の最終濃度は、表3に列挙されている濃度とは最大2倍異なり、これは、関連する濃度が表3に列挙されている濃度の0.5〜2倍にわたってよいことを意味する。いくつかの実施形態では、添加される構成成分の任意の1つまたは複数の添加濃度は、表3に列挙されている濃度とは異なり、それぞれ表3に列挙されている値から最大で10%、20%、または50%異なる。
本発明は、1種、2種、3種、4種、または5種の構成成分のいずれも培地に添加しない実施形態を包含する。いくつかの実施形態では、培地にインスリン、EGF、ヒドロコルチゾン、コレラ毒素、および血清を補充する。場合によって、培地にエストロゲンをさらに補充する。
B.正常な卵巣細胞および卵管細胞の培養
卵巣は、卵母細胞(卵細胞)、卵母細胞を支持する間質細胞および卵巣表面を覆う上皮で構成される女性生殖器である。排卵の間、卵母細胞(卵細胞)は卵巣表面を突き破り、卵管の采状末端によって捕捉される。これらの卵母細胞は卵管を移動して子宮内膜腔に入り、そこで着床する(図1A〜C)。
卵巣は、卵母細胞(卵細胞)、卵母細胞を支持する間質細胞および卵巣表面を覆う上皮で構成される女性生殖器である。排卵の間、卵母細胞(卵細胞)は卵巣表面を突き破り、卵管の采状末端によって捕捉される。これらの卵母細胞は卵管を移動して子宮内膜腔に入り、そこで着床する(図1A〜C)。
内臓の上皮は乳管、腸内腔、気管支内腔などの中心内腔を限定する。上皮細胞の機能的な違いは、内腔内に物質を分泌するか、または内腔から物質を吸収するかである;例えば、唾液、母乳、肺粘液、胃酸、膵臓酵素の分泌、または胃腸管および腎臓上皮による水および栄養分の吸収など。内腔を取り囲む組織構造全体は、時には「管」または「腺」と称される。これらの細胞に共有される一般的な機能により、これらの細胞に独特の性質が与えられ、それによりこれらの細胞は体内の他の全ての細胞とは異なる別個の群になる。
卵巣の表面は単層上皮で覆われており、その下に、時には「卵巣皮質」と称される帯域に卵母細胞が存在する。卵母細胞は、卵巣の大部分を構成するホルモン的に活性な卵巣間質細胞によって支持されている。各サイクルの間、卵管および卵巣の表面に形成され、通常は卵巣表面上皮によって修復される間隙内にいくつかの卵母細胞が放出される。しかし、いくつかの場合には、小嚢胞は、排卵部位で形成され、表面上皮とは別個の上皮によって裏打ちされている。卵巣皮質内のこれらの嚢胞は「封入体嚢胞」と称される(図1D)。卵管の内腔は、頂端表面に繊毛が存在するかしないかによって形態学的に区別される2つの細胞型で構成される単層上皮で裏打ちされている。
腫瘍は卵巣および卵管の細胞から生じる。特に、内臓の腺上皮および導管上皮から生じ、かつ/またはそれを模倣する腫瘍は集合的に腺癌と称される。癌(cancer)または癌(carcinoma)という用語は、病理医により使用され、上皮の表現型を有する腫瘍を指す。したがって、「卵巣癌(ovarian cancer)」、「卵巣癌(ovarian carcinoma)」および「卵巣腺癌」という用語は、互換的に使用することができる。
特に、卵管卵巣腫瘍、ならびに肺、乳房、結腸、前立腺、胃腸、内分泌器官、および婦人科の腫瘍を含めたヒト腫瘍の大部分は上皮腺癌である。これらの腫瘍は、集合的に、ヒトの癌による死亡の90パーセント超を占める。血液細胞、免疫細胞、筋肉細胞、骨細胞、神経細胞、内皮細胞、および線維芽細胞などの他の全ての細胞から生じる腫瘍は、上皮癌と比較して非常にまれである。
卵巣および卵管の上皮から生じる卵管卵巣腺癌は、大多数の卵巣癌に関連する死亡を引き起こす悪性卵巣腫瘍のほぼ90パーセントを占める。卵巣内の間質細胞および生殖細胞から生じる腫瘍はまれであり、卵巣腫瘍による死亡の5パーセント未満を占める。
卵巣の腺癌は、別個の細胞の特徴、形態学的特徴、および臨床的特徴を有する少なくとも6種の主要な組織病理学的サブタイプで構成される不均一な疾患である。卵巣腺癌の主要なサブタイプとしては、乳頭状漿液性型、粘液性型、類内膜型、明細胞型、扁平上皮型および移行性型が挙げられ、これらが卵巣腺癌の90パーセント超を占める。
どの細胞が卵管卵巣腫瘍の推定前駆病変であるか?乳管癌(DCIS)、結腸の腺腫性ポリープ、子宮頸部の扁平上皮内病変(SIL)、または子宮内膜上皮内新形成(EIN)などの初期の非浸潤性の前駆病変を同定および検出することは、これらの器官において生じる癌の発病の理解に著しく役立っている。推定起源細胞および初期の前駆病変を同定することにより、早期検出ツールを開発すること、およびこれらの器官における腫瘍の自然の進行をより良く理解することが可能になった。大多数の卵巣癌はそれらの進行の非常に後期に症候性になるので、それらの前駆病変を適切に試験することは可能ではなかった。残念ながら、現時点ではこの癌を早期検出するための常套的なスクリーニングツールは存在しない。
ヒト卵巣腺癌の起源について、3種類の起源正常細胞が提唱されている;歴史的に、卵巣癌は、卵巣表面上皮(OSE)または卵巣皮質内の上皮に裏打ちされた封入体嚢胞(OC)から生じると考えられてきた。しかし、卵巣の推定前癌性病変はほとんど同定されておらず、正常な卵巣において観察される卵巣上皮内新形成などの変化が前癌状態の新生物病変を真に示すかどうかを決定することは難しい。ごく最近の研究では、卵管上皮(FTE)、詳細には采状末端が、高悪性度乳頭状漿液性腺癌の半分に対する推定起源細胞として関係づけられた。これは、同じ女性由来の卵管前駆病変および腫瘍組織が一般的なp53突然変異を共有するというデータによって裏付けられる。
したがって、本発明の1つの態様は、正常な卵巣細胞および卵管細胞、例えば、卵巣表面上皮(OSE)、上皮に裏打ちされた封入体嚢胞(OC)、および卵管上皮(FTE)の成長および/または増殖を、in vitroにおいて少なくとも約4週間または少なくとも約15、25、またはさらには35回の集団倍加(PD)にわたって支持する細胞培養培地を含む。
正常な卵巣細胞および/または卵管細胞(OSE、OC、および/またはFTE)などの上皮細胞は、細胞の寿命を延長するために不死化することができる。細胞は、例えば、正常細胞を化学的突然変異原、放射線照射、または他の発癌性作用物質に曝露させることによって、および/またはウイルス癌遺伝子(例えば、H−Ras、ヒトパピローマウイルスE6/7(HPV E6/7)、サルウイルス40ラージT/スモールt(SV40T/t)抗原、および/またはアデノウイルスタンパク質(E1A))を発現させることによって正常細胞を形質転換することによって、発癌性形質転換によって不死化することができる。細胞は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)などのテロメラーゼの触媒サブユニットを過剰発現させることによっても不死化することができる。いくつかの実施形態では、hTERTを過剰発現している卵巣細胞および/または卵管細胞を正常な卵巣細胞および卵管細胞の成長および/または増殖に適した細胞培養培地中で培養する。hTERTの過剰発現と本明細書に記載の細胞培養培地を組み合わせることが、卵巣細胞および/または卵管細胞を不死化するために十分であり得る。
いくつかの実施形態では、培養物は、hTERTが過剰発現している細胞を含み、hTERTの過剰発現は、細胞に、少なくとも14、25、または35回の集団倍加を行う能力を持たせるために十分である。培養物は、実質的に精製された培養物であってよい。培養物は、細胞を少なくとも103個、少なくとも104個、少なくとも105個、または少なくとも106個含んでよい。hTERTの過剰発現は、例えば、ウイルスを用いたトランスフェクションまたは形質転換によるものであってよい。
不死化細胞などの卵巣細胞および卵管細胞を腫瘍形成性細胞に形質転換することができる。形質転換された腫瘍形成性卵巣細胞および/または卵管細胞は、本節に記載のものおよび本開示のWIT−fo(表3)によって例示されるなどの、正常な卵巣細胞および卵管細胞の成長および/または増殖に適した培地中で培養することができる。
無線毛卵管細胞または卵巣封入体嚢胞細胞を発癌性形質転換した後、これらの細胞型を、プローブの発現と関連づける。ある特定の実施形態では、形質転換された無線毛卵管細胞は、プローブセットDOK5、CD47、HS6ST3、DPP6、OSBLP3を過剰発現し、形質転換された卵巣封入体嚢胞細胞は、プローブセットSTC2、SFRP1、SLC35F3、SHMT2、TMEM164を過剰発現する。
本発明の1つの態様は、卵巣細胞および/または卵管細胞の培養物に関し、卵巣細胞は、プローブセットDOK5、CD47、HS6ST3、DPP6、OSBLP3を過剰発現し、卵管細胞は、プローブセットSTC2、SFRP1、SLC35F3、SHMT2、TMEM164を過剰発現し、培養物は、細胞を少なくとも103個含み、細胞は、少なくとも14、25、または35回の集団倍加を行う能力を有する。いくつかの実施形態では、培養物は、細胞を少なくとも104個、105個、106個、107個、108個、109個、および/または1010個含む。
前述のいずれかの特定の実施形態では、細胞の実質的に精製された培養物は、培養物中の細胞の少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または98%超が対象の特定の細胞型である培養物である。
したがって、本発明は、上記の通り、正常な卵巣上皮細胞および正常な卵管細胞を培養するために有用な培養培地を提供する。いくつかの実施形態では、正常な卵巣上皮細胞および正常な卵管細胞を培養するために有用な細胞培養培地は、アデノシン三リン酸;担体タンパク質;コレステロール、リノール酸、およびリポ酸;グルタチオン;ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基;ホスホエタノールアミン;セレン;トランスフェリン;トリヨードサイロニン;ビタミンA、ビタミンC、およびビタミンD;Zn、Mg、およびCu;細胞内cAMPを増加させる作用物質;上皮成長因子(EGF);ヒドロコルチゾン;インスリン;および血清を含む。培養培地は、少なくとも1つの アデノシン一リン酸およびビタミンEをさらに含んでよい。培養培地は、ビタミンK3、ナイアシン、またはナイアシンアミドのうちの少なくとも1つを含んでよい。培養培地中の担体タンパク質はアルブミンであってよい。培養培地中のヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基はキサンチンおよび/またはヒポキサンチンであってよい。
細胞内cAMPを増加させる作用物質はコレラ毒素であってよい。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、コレラ毒素を1〜100ng/mL;1〜75ng/mL;1〜50ng/mL;1〜25ng/mL;1〜15ng/mL;1〜10ng/mL;10〜100ng/mL;10〜75ng/mL;10〜50ng/mL;10〜25ng/mL;10〜15ng/mL;15〜100ng/mL;15〜75ng/mL;15〜50ng/mL;15〜25ng/mL;15〜20ng/mL;20〜100ng/mL;20〜75ng/mL;20〜25ng/mL;25〜100ng/mL;25〜75ng/mL;または25〜50ng/mLにわたる濃度で含む。好ましくは、細胞培養培地は、約20ng/mLのコレラ毒素、あるいは、約25ng/mLのコレラ毒素を含んでよい。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、EGFを含む。EGFの濃度は、0.5〜50ng/mL;0.5〜25ng/mL;0.5〜15ng/mL;0.5〜10ng/mL;0.5〜5.0ng/mL;0.5〜1.0ng/mL;1.0〜50ng/mL;1.0〜25ng/mL;1.0〜15ng/mL;1.0〜10ng/mL;1.0〜5ng/mL;5.0〜50ng/mL;5.0〜25ng/mL;5.0〜15ng/mL;5.0〜10ng/mL;10〜50ng/mL;10〜25ng/mL;または10〜15ng/mLにわたってよい。好ましくは、細胞培養培地は、3ng/mLから50ng/mLの間のEGFを含んでよい、または、最も好ましくは、約10ng/mLのEGFを含んでよい。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ヒドロコルチゾンを含む。ヒドロコルチゾンの濃度は、0.01〜5.0μg/mL;0.01〜2.5μg/mL;0.01〜1.0μg/mL;0.01〜0.5μg/mL;0.01〜0.30μg/mL;0.01〜0.25μg/mL;0.01〜0.10μg/mL;0.01〜0.05μg/mL;0.05〜5.0μg/mL;0.05〜2.5μg/mL;0.05〜1.0μg/mL;0.05〜0.5μg/mL;0.05〜0.30μg/mL;0.05〜0.25μg/mL;0.05〜0.10μg/mL;0.05〜0.05μg/mL;0.15〜5.0μg/mL;0.15〜2.5μg/mL;0.15〜1.0μg/mL;0.15〜0.5μg/mL;0.15〜0.30μg/mL;0.15〜0.25μg/mL;0.15〜0.10μg/mL;および0.15〜0.05μg/mLにわたってよい。細胞培養培地中のヒドロコルチゾンの濃度は0.015μg/mLから5.0μg/mLの間であることが好ましい。正常な卵巣細胞および卵管細胞を培養するために、細胞培養培地は、0.25μg/mLから0.50μg/mLの間のヒドロコルチゾンを含むことが好ましく、約0.5μg/mLのヒドロコルチゾンを含むことが最も好ましい。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、インスリンを含む。インスリンの濃度は、1.0〜75.0μg/mL;1.0〜50.0μg/mL;1.0〜25.0μg/mL;1.0〜10.0μg/mL;10.0〜75.0μg/mL;10.0〜50.0μg/mL;10.0〜25.0μg/mL;および10.0〜15.0μg/mL;15.0〜75.0μg/mL;15.0〜50.0μg/mL;15.0〜25.0μg/mL;および15.0〜20.0μg/mLにわたってよい。いくつかの好ましい実施形態では、インスリンの範囲は15.0〜20.0μg/mLである。正常な卵巣細胞および卵管細胞を培養するために、細胞培養培地は、5.0μg/mLから50.0μg/mLの間のインスリンを含むことが好ましい。細胞培養培地は、約20.00μg/mLのインスリンを含むことが最も好ましい。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、血清を、0.2%〜4.0%v/v;0.5〜3.0%;1.0%〜2.0%v/v;1.5%〜2.0%v/vにわたる濃度で含む。いくつかの好ましい実施形態では、正常な卵巣細胞および卵管細胞を培養するために、細胞培養物は、0.25%v/vから0.75%v/vの間の血清を含む。最も好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約0.5%v/vの血清を含む。いくつかの実施形態では、キットまたは培地は血清を含まず、血清(存在する場合)は、別々に、または使用者が供給することができる。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地により、卵巣細胞および/または卵管細胞の増殖が、in vitroにおいて少なくとも約10回の集団倍加(PD)にわたって支持される。細胞培養培地により、卵巣細胞および/または卵管細胞の増殖を、少なくとも約6PD、8PD、10PD、12PD、14PD、16PD、18PD、20PD、25PD、30PD、35PD、40PD、45PD、または50PDにわたって支持することもできる。集団倍加には、細胞培養の成功の尺度として使用される「二次培養」または「継代」の数とは別個の情報が反映される可能性がある。細胞の二次培養または継代とは、単に細胞をある培養プレートから取り出し、それらを新しい培養プレートに播種することを指す。これは、細胞がプレートから別のプレートへの移動に対する耐容性を示したこと、および、細胞が移動の間生存したままであったことを示す。しかし、細胞継代の数は、必ずしも細胞増殖を示すものではない。
図2では、細胞増殖と継代数の間に相関がないことが例示されている。標準の対照培養条件では、「継代」卵管上皮は、4回の継代の間、ほぼ60日にわたって継代された(図2B、赤色の曲線)。しかし、細胞の成長曲線は、14日後に平らなままであり、細胞の数に正味の増加はなかった。したがって、継代数は、細胞数の正味の増加に関しては情報価値がない。
細胞数の正味の増加は、「集団倍加」(PD)で最も正確に測定される。単一細胞から、10回の集団倍加で細胞1024個が生じる(210=2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024)。したがって、10回の集団倍加のそれぞれは3桁(1,000倍)の細胞数の正味の増加とほぼ等しく、20回の集団倍加とは、ほぼ百万倍の増加ということになり、30回の集団倍加とは、ほぼ10億倍の正味の細胞数の増加ということになる。したがって、PD対時間のチャートは、semi−log2指数関数プロットである。対照的に、細胞継代は、細胞数の正味の増加がほぼないことと等しい可能性がある。
1つの例示的な細胞培養培地が表3のWIT−foと表示された列に記載されている。ある特定の実施形態では、任意の特定の成分を、同じ機能を果たすことができる代替成分と少なくとも部分的に交換する。本発明のある特定の実施形態では、表3に列挙されている任意の特定の成分を、同じ機能を果たすことができる代替成分と少なくとも部分的に交換する。そのような置換は、1種または複数種の列挙されている成分のいずれに関しても行うことができる(例えば、1種、2種、3種、4種、5種、6種、7種、8種、9種、10種、またはそれ以上成分を、同じ機能を果たすことができる代替成分で置換することができる)。一実施形態では、緩衝液構成成分を置換する。別の実施形態では、界面活性剤または界面活性物質の構成成分を置換する。別の実施形態では、担体タンパク質構成成分を置換する。本明細書は、適切な置換の非限定的な例を提供する。
本発明の別の態様は、正常な卵巣上皮細胞および卵管細胞を培養するための方法に関する。一実施形態では、卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞を培養するための方法は、卵巣表面および/または卵管の采状表面から卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞を得るステップと、細胞を上記および表3(WIT−foと表示された列)の細胞培養培地中で培養するステップとを含み、卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞は細胞培養培地において少なくとも14回の集団倍加を行う。
C.腫瘍細胞の培養
本発明の一態様は、(1)ヒト固形腫瘍組織、(2)悪性体液中の腫瘍細胞および(3)マウスにおいて成長させた腫瘍の一次異種移植片由来の腫瘍細胞に由来する初代細胞株を支持する細胞培養培地に関する。培養細胞は実質的に組織内の起源腫瘍細胞の表現型模写として成長し、これによりヒト腫瘍を早期に検出し、診断し、予後判定し、治療するための試薬を発見し、開発するための臨床的に関連性のあるモデルをもたらす。
本発明の一態様は、(1)ヒト固形腫瘍組織、(2)悪性体液中の腫瘍細胞および(3)マウスにおいて成長させた腫瘍の一次異種移植片由来の腫瘍細胞に由来する初代細胞株を支持する細胞培養培地に関する。培養細胞は実質的に組織内の起源腫瘍細胞の表現型模写として成長し、これによりヒト腫瘍を早期に検出し、診断し、予後判定し、治療するための試薬を発見し、開発するための臨床的に関連性のあるモデルをもたらす。
卵管卵巣腫瘍、ならびに肺、乳房、結腸、前立腺、胃腸、内分泌器官、および婦人科の腫瘍を含めたヒト腫瘍の大部分は上皮腺癌である。これらの腫瘍は、集合的に、ヒトの癌による死亡の90パーセント超を占める。血液細胞、免疫細胞、筋肉細胞、骨細胞、神経細胞、内皮細胞、および線維芽細胞などの他の全ての細胞から生じる腫瘍は、上皮癌と比較して非常にまれである。
卵巣および卵管の上皮から生じる卵管卵巣腺癌は、大多数の卵巣癌に関連する死亡を引き起こす悪性卵巣腫瘍のほぼ90パーセントを占める。卵巣内の間質細胞および生殖細胞から生じる腫瘍はまれであり、卵巣腫瘍による死亡の5パーセント未満を占める。
卵巣の腺癌は、別個の細胞の特徴、形態学的特徴、および臨床的特徴を有する少なくとも6種の主要な組織病理学的サブタイプで構成される不均一な疾患である。卵巣腺癌の主要なサブタイプとしては、乳頭状漿液性型、粘液性型、類内膜型、明細胞型、扁平上皮型および移行性型が挙げられ、これらが卵巣腺癌の90パーセント超を占める。
ヒト腫瘍は、悪性腫瘍細胞、ならびに上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞、マクロファージ、平滑筋細胞などの多数の異なる正常細胞型で構成される複雑な組織である。さらに、多くの腫瘍は、非浸潤性(in situ)悪性構成成分および浸潤性悪性構成成分の両方、ならびに浸潤性腫瘍細胞と並んで存在する前悪性過形成性組織で構成される。したがって、培養を腫瘍組織から開始する場合、腫瘍の異なる構成成分由来の多くの細胞型が培養プレート中で増殖する機会を有する。従来の培養条件において正常な間質細胞または正常な上皮細胞、ならびに腫瘍の非浸潤性(in situ)構成成分由来の細胞または前悪性過形成性細胞が浸潤性腫瘍細胞よりも速く成長することは逆説的に見えるが、珍しいことではない。したがって、上首尾の腫瘍細胞の培養を確認するためには、プレート中で増殖している細胞の悪性を検証する追加的な実験が必要である。
軟寒天コロニーアッセイを使用して、培養細胞が実際に悪性腫瘍細胞であることを検証することができる。正常細胞および前悪性細胞は、軟寒天において足場非依存性コロニー形成することができない。したがって、このアッセイでは、コロニーを形成する能力が培養細胞の悪性の指標である。培養細胞の悪性を検証するために用いられる別の方法は、in vivoにおける腫瘍形成能力である。
腫瘍細胞培養の成功は、「継代数」によって表されるが、これは、良く見たところで情報価値に乏しい細胞増殖の計量である。培養細胞の継代とは、細胞が込み合った時点または増殖が遅くなった時点で細胞を培養皿またはフラスコの表面から機械的または酵素的に解離させ、細胞を新しい空のフラスコに移すことを指す。一般には、腫瘍細胞培養の成功は、「継代数」によって表されるが、これは、不完全な細胞増殖の計量であり得る。図10には、継代数は常に細胞数の増加と相関するのではないことが示されている。腫瘍細胞の増殖は、多くの場合、2〜3回の継代後に遅くなり、停止する。細胞は生存したままであり、さらなる回数継代することができるが、それらの数は同じままである可能性がある、または減少さえする可能性がある。したがって、実際の細胞数を伴わずに継代数単独では、細胞数の正味の増加は確認されない。
細胞増殖のより正確かつ客観的な尺度は、細胞の連続的な培養の間に実現される「集団倍加」(PD)の総数である。単一細胞は10回の集団倍加(210=2、4、8、16、32、64、128、256、512、1024)で細胞1024個を生じることができる。したがって、10回の集団倍加のそれぞれは3桁(1,000倍)の細胞数の正味の増加とほぼ等しく、20回の集団倍加とは、ほぼ百万倍の増加ということになり、30回の集団倍加とは、ほぼ10億倍の正味の細胞数の増加ということになる。したがって、PD対時間チャートは、semi−log2指数関数プロットである。
したがって、本発明の1つの態様は、癌細胞、例えば、ATCC(American Type Tissue Collection)またはECACC(the European Collection of Cell Cultures)に寄託されている卵巣腺癌細胞株、または、一次ヒト固形卵巣組織に由来する細胞、腹水に由来する細胞、および/またはマウスにおいて成長させたヒト腫瘍異種移植片に由来する細胞の成長および/または増殖を支持する細胞培養培地を含む。細胞培養培地により、成長が、in vitroにおいて少なくとも約4週間および/または少なくとも約30回の集団倍加(PD)にわたって支持される。
卵管卵巣腫瘍、ならびに肺、乳房、結腸、前立腺、胃腸、内分泌器官、および婦人科の腫瘍を含めたヒト腫瘍の大部分は上皮腺癌であるので、本明細書に記載の培養培地は、ヒト乳癌、膵癌、腺様嚢胞癌、肺由来または胃腸管由来の神経内分泌腫瘍(カルチノイド)、および上皮細胞に関連する他の腫瘍に由来する腫瘍細胞を培養するためにも用いることができる。
一実施形態では、卵管卵巣腫瘍およびそれに由来する細胞を培養するための細胞培養培地は、アデノシン三リン酸;担体タンパク質;コレステロール、リノール酸、およびリポ酸;グルタチオン;ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基;ホスホエタノールアミン;セレン;トランスフェリン;トリヨードサイロニン;ビタミンA、ビタミンC、およびビタミンD;Zn、Mg、およびCu;細胞内cAMPを増加させる作用物質;上皮成長因子(EGF);ヒドロコルチゾン;インスリン;血清;および場合によってエストロゲンを含む。培養培地は、少なくとも1つの アデノシン一リン酸およびビタミンEをさらに含んでよい。培養培地は、ビタミンK3、ナイアシン、またはナイアシンアミドのうちの少なくとも1つを含んでよい。培養培地中の担体タンパク質はアルブミンであってよい。培養培地中のヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基はキサンチンおよび/またはヒポキサンチンであってよい。
細胞内cAMPを増加させる作用物質はコレラ毒素であってよい。いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、コレラ毒素を1〜100ng/mL;1〜75ng/mL;1〜50ng/mL;1〜25ng/mL;1〜15ng/mL;1〜10ng/mL;10〜100ng/mL;10〜75ng/mL;10〜50ng/mL;10〜25ng/mL;10〜15ng/mL;15〜100ng/mL;15〜75ng/mL;15〜50ng/mL;15〜25ng/mL;15〜20ng/mL;20〜100ng/mL;20〜75ng/mL;20〜25ng/mL;25〜100ng/mL;25〜75ng/mL;または25〜50ng/mLにわたる濃度で含む。好ましくは、細胞培養培地は、約20ng/mLのコレラ毒素、あるいは、約25ng/mLのコレラ毒素を含んでよい。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、EGFを含む。EGFの濃度は、0.5〜50ng/mL;0.5〜25ng/mL;0.5〜15ng/mL;0.5〜10ng/mL;0.5〜5.0ng/mL;0.5〜1.0ng/mL;1.0〜50ng/mL;1.0〜25ng/mL;1.0〜15ng/mL;1.0〜10ng/mL;1.0〜5ng/mL;5.0〜50ng/mL;5.0〜25ng/mL;5.0〜15ng/mL;5.0〜10ng/mL;10〜50ng/mL;10〜25ng/mL;または10〜15ng/mLにわたってよい。好ましくは、細胞培養培地は、3ng/mLから50ng/mLの間のEGFを含んでよい、または、最も好ましくは、約10ng/mLのEGFを含んでよい。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、ヒドロコルチゾンを含む。ヒドロコルチゾンの濃度は、0.01〜5.0μg/mL;0.01〜2.5μg/mL;0.01〜1.0μg/mL;0.01〜0.5μg/mL;0.01〜0.30μg/mL;0.01〜0.25μg/mL;0.01〜0.10μg/mL;0.01〜0.05μg/mL;0.05〜5.0μg/mL;0.05〜2.5μg/mL;0.05〜1.0μg/mL;0.05〜0.5μg/mL;0.05〜0.30μg/mL;0.05〜0.25μg/mL;0.05〜0.10μg/mL;0.05〜0.05μg/mL;0.15〜5.0μg/mL;0.15〜2.5μg/mL;0.15〜1.0μg/mL;0.15〜0.5μg/mL;0.15〜0.30μg/mL;0.15〜0.25μg/mL;0.15〜0.10μg/mL;および0.15〜0.05μg/mLにわたってよい。細胞培養培地中のヒドロコルチゾンの濃度は0.015μg/mLから5.0μg/mLの間であることが好ましい。卵管卵巣腫瘍細胞を培養するために、細胞培養培地は、0.15μg/mLから0.30μg/mLの間のヒドロコルチゾンを含むことが好ましく、約0.15μg/mLのヒドロコルチゾンを含むことが最も好ましい。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、インスリンを含む。インスリンの濃度は、1.0〜75.0μg/mL;1.0〜50.0μg/mL;1.0〜25.0μg/mL;1.0〜10.0μg/mL;10.0〜75.0μg/mL;10.0〜50.0μg/mL;10.0〜25.0μg/mL;および10.0〜15.0μg/mL;15.0〜75.0μg/mL;15.0〜50.0μg/mL;15.0〜25.0μg/mL;および15.0〜20.0μg/mLにわたってよい。いくつかの好ましい実施形態では、インスリンの範囲は15.0〜20.0μg/mLである。卵管卵巣腫瘍細胞を培養するために、細胞培養培地は、5.0μg/mLから50.0μg/mLの間のインスリンを含むことが好ましい。細胞培養培地は、約15.00μg/mLのインスリンを含むことが最も好ましい。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地は、血清を、0.2%〜4.0%v/v;0.5〜3.0%;1.0%〜2.0%v/v;または1.5%〜2.0%v/vにわたる濃度で含む。ある特定の実施形態では、血清濃度は、0.2%〜10%v/v;0.2%〜5.0%v/v;または1.0%〜5.0%v/vにわたる。いくつかの実施形態では、血清濃度は、4.0%〜10.0%v/v;4.0〜6.0%v/v;5.0〜7.0%v/v;6.0〜8.0%v/v;7.0〜9.0%v/v;または8.0〜10.0%v/vにわたる。卵管卵巣腫瘍細胞を培養するためのいくつかの好ましい実施形態では、細胞培養物は、1.0%から1.5%v/vの間の血清を含む。最も好ましい実施形態では、細胞培養培地は、約1.2%v/vの血清を含む。
いくつかの実施形態では、腫瘍細胞は、成長するためにエストロゲンを必要としない。エストロゲンを含有しない本明細書に記載の細胞培養培地により、乳頭状漿液性腫瘍、明細胞腫瘍、癌肉腫、および未分化胚細胞腫の成長を支持することができる。
他の実施形態では、特定の種類の腫瘍細胞は、成長するためにエストロゲンを必要とする場合がある。例えば、細胞培養培地は、エストロゲンを、30〜300nM;30〜200nM;30〜100nM;65〜300nM;65〜200nM;65〜100nM;100〜300nM;100〜150nM;および100〜200nMにわたる濃度で含んでよい。類内膜腫瘍および/または粘液性腫瘍を培養するために、細胞培養培地は、エストロゲンを約65〜150nMの濃度範囲でさらに含むことが好ましく、エストロゲンを約100nMの濃度で含むことが最も好ましい。エストロゲンは、17−ベータ−エストラジオールまたはその生物学的同等物であってよい。17−ベータ−エストラジオールの生物学的同等物は、上に列挙されている濃度範囲の17−ベータ−エストラジオールと同じ活性を有する量で存在し、例えば、生物学的同等物の濃度は、100nMの17−ベータ−エストラジオールと同じ活性を有するように選択することができる。
いくつかの実施形態では、細胞培養培地により、卵巣細胞および/または卵管細胞の増殖が、in vitroにおいて少なくとも約30回の集団倍加(PD)にわたって支持される。細胞培養培地により、卵巣細胞および/または卵管細胞の増殖を、少なくとも約6PD、8PD、10PD、12PD、14PD、16PD、18PD、20PD、25PD、30PD、35PD、40PD、45PD、または50PDにわたって支持することもできる。
本発明の別の態様は、卵管卵巣腫瘍細胞を培養するための方法に関する。一実施形態では、卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞を培養するための方法は、固形腫瘍から、腹水から、またはマウスにおいて成長させた腫瘍の一次異種移植片由来の腫瘍細胞から卵管卵巣腫瘍細胞を得るステップと、細胞を上記および表3(WIT−ocと表示された列)の細胞培養培地中で培養するステップとを含み、卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞は細胞培養培地において少なくとも30回の集団倍加を行う。一部の細胞株は、8回以上継代することができた固形腫瘍由来の非連続的細胞株である悪性腹水から樹立することができる。腹膜腹水および肺滲出液などの悪性体液試料は、線維芽細胞および他の間質細胞を含まない。腹水は、一般には、疾患が非常に後期にある患者の小さなサブセットにおいて存在し、すでに化学療法で処置された、再発疾患を有する患者においてより一般的である。したがって、腹水から単離された腫瘍細胞は、無処置の患者由来ではない。これらの処置後の腫瘍細胞は、遺伝毒性薬に曝露されていた可能性があり、したがって、起源腫瘍細胞とは異なる。
いくつかの実施形態では、CO2レベルおよびO2レベルを改変して、特定の細胞型の培養を支持することができる。大多数の細胞培養は、二酸化炭素(CO2)を補充して5%にした周囲空気(18%O2)において行う。他の実施形態では、類内膜腫瘍および粘液性腫瘍は、エストロゲンを補充したWIT−oc培地において、5%に調整した低酸素(O2)および(5%)CO2を含む成長条件下で培養することができる。
II.細胞培養培地を調製するための方法およびキット
本発明の別の態様は、本明細書に記載の細胞培養培地を調製するための方法およびキットに関する。キットを使用して、細胞培養培地を調製することができる。例えば、構成成分は、1つまたは複数の構成成分の貯蔵液として調製し、複数の容器に分割することができる。いくつかの実施形態では、細胞培養培地を調製するためのキットは、アデノシン三リン酸;担体タンパク質;コレステロール、リノール酸、およびリポ酸;グルタチオン;ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基;ホスホエタノールアミン;セレン;トランスフェリン;トリヨードサイロニン;ビタミンA、ビタミンC、およびビタミンD;Zn、Mg、およびCuを含む第1の容器と、細胞内cAMPを増加させる作用物質;上皮成長因子(EGF);ヒドロコルチゾン;インスリン;血清、および場合によってエストロゲンを含む第2の容器とを含む。そのようなキット内の細胞培養培地により、細胞の増殖を、in vitroにおいて少なくとも20回の集団倍加(PD)にわって支持することができる。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の細胞培養培地を調製するための方法およびキットに関する。キットを使用して、細胞培養培地を調製することができる。例えば、構成成分は、1つまたは複数の構成成分の貯蔵液として調製し、複数の容器に分割することができる。いくつかの実施形態では、細胞培養培地を調製するためのキットは、アデノシン三リン酸;担体タンパク質;コレステロール、リノール酸、およびリポ酸;グルタチオン;ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基;ホスホエタノールアミン;セレン;トランスフェリン;トリヨードサイロニン;ビタミンA、ビタミンC、およびビタミンD;Zn、Mg、およびCuを含む第1の容器と、細胞内cAMPを増加させる作用物質;上皮成長因子(EGF);ヒドロコルチゾン;インスリン;血清、および場合によってエストロゲンを含む第2の容器とを含む。そのようなキット内の細胞培養培地により、細胞の増殖を、in vitroにおいて少なくとも20回の集団倍加(PD)にわって支持することができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞培養培地を作製するために、細胞培養培地補助剤を細胞培養基本培地に加えることができる。補助剤は、細胞内cAMPを増加させる作用物質;上皮成長因子(EGF);ヒドロコルチゾン;インスリン;血清;および場合によってエストロゲンを含んでよい。好ましい実施形態では、補助剤を細胞培養培地に添加することにより、0〜70ng/mLの細胞内cAMPを増加させる作用物質、少なくとも3ng/mLのEGF、0.015〜0.5μg/mLのヒドロコルチゾン;少なくとも10.00μg/mLのインスリン、0.2%〜4.0%v/vの血清補助剤、および場合によって、30〜300nMのエストロゲンがもたらされる。
本発明の別の態様は、本明細書に記載の細胞培養培地を調製する方法であって、アデノシン三リン酸;担体タンパク質;コレステロール、リノール酸、およびリポ酸;グルタチオン;ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基;ホスホエタノールアミン;セレン;トランスフェリン;トリヨードサイロニン;ビタミンA、ビタミンC、およびビタミンD;Zn、Mg、およびCu;細胞内cAMPを増加させる作用物質;上皮成長因子(EGF);ヒドロコルチゾン;インスリン;血清、および場合によってエストロゲンを組み合わせることを含む方法に関する。上記の通り、第1の容器および第2の容器から、ならびに/または1つまたは複数の構成成分の濃縮された貯蔵液から構成成分を加えることができる。いくつかの実施形態では、構成成分を任意の数の容器に任意の組み合わせで包装することができる。いくつかの実施形態では、2個、3個、4個または5個の容器、または5個から10個の間の容器を使用する。
III.培養細胞の選択的成長、同定および使用
A.培養細胞の選択的成長
本発明の1つの態様は、不均一な集団由来の選択的な細胞型を成長させるための、細胞培養培地の使用に関する。卵巣組織および/または卵管組織の、例えばこれらの組織の表面をブラシでこすることによる、または生検による最初の採取では、所望よりも多くの細胞型がもたらされる可能性がある。同様に、患者由来の卵巣腫瘍試料は、間質細胞または線維芽細胞などの非癌性細胞を含めた種々の細胞型を含有する可能性がある。本明細書に記載されている細胞培養培地は正常な卵巣細胞、正常な卵管細胞、および/または腫瘍細胞の成長に適しているので、この培地は他の細胞型に対しては選択されない。したがって、正常な卵巣細胞の成長に適した細胞培養培地を使用して、卵巣上皮細胞(表面上皮および/または封入体嚢胞上皮)などの正常な卵巣細胞を含む組織由来の細胞型を培養により選択することができる。正常な卵管細胞に適した細胞培養培地成長を使用して、卵管上皮細胞(線毛卵管細胞および/または無線毛卵管細胞)などの正常な卵管細胞を含む組織由来の細胞型を培養により選択することができる。卵巣腫瘍細胞などの腫瘍細胞の成長に適した細胞培養培地を使用して、腫瘍細胞型を培養により選択することができる。したがって、6種の主要な組織病理学的サブタイプ(乳頭状漿液性型、粘液性型、類内膜型、明細胞型、扁平上皮型、および移行性型)のうちの少なくとも1つなどの腺癌を含む卵巣腫瘍組織は、特定の細胞型を富化するために卵巣腫瘍細胞の成長に適した細胞培養培地において培養することができる。上で詳述されている通り、富化された細胞は、細胞の実質的に精製された培養物として提供することができる。ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書で詳述されている細胞の特性のうちの任意の1つまたは複数(例えば、増殖能力、遺伝子発現、成長特性、など)を有する。
A.培養細胞の選択的成長
本発明の1つの態様は、不均一な集団由来の選択的な細胞型を成長させるための、細胞培養培地の使用に関する。卵巣組織および/または卵管組織の、例えばこれらの組織の表面をブラシでこすることによる、または生検による最初の採取では、所望よりも多くの細胞型がもたらされる可能性がある。同様に、患者由来の卵巣腫瘍試料は、間質細胞または線維芽細胞などの非癌性細胞を含めた種々の細胞型を含有する可能性がある。本明細書に記載されている細胞培養培地は正常な卵巣細胞、正常な卵管細胞、および/または腫瘍細胞の成長に適しているので、この培地は他の細胞型に対しては選択されない。したがって、正常な卵巣細胞の成長に適した細胞培養培地を使用して、卵巣上皮細胞(表面上皮および/または封入体嚢胞上皮)などの正常な卵巣細胞を含む組織由来の細胞型を培養により選択することができる。正常な卵管細胞に適した細胞培養培地成長を使用して、卵管上皮細胞(線毛卵管細胞および/または無線毛卵管細胞)などの正常な卵管細胞を含む組織由来の細胞型を培養により選択することができる。卵巣腫瘍細胞などの腫瘍細胞の成長に適した細胞培養培地を使用して、腫瘍細胞型を培養により選択することができる。したがって、6種の主要な組織病理学的サブタイプ(乳頭状漿液性型、粘液性型、類内膜型、明細胞型、扁平上皮型、および移行性型)のうちの少なくとも1つなどの腺癌を含む卵巣腫瘍組織は、特定の細胞型を富化するために卵巣腫瘍細胞の成長に適した細胞培養培地において培養することができる。上で詳述されている通り、富化された細胞は、細胞の実質的に精製された培養物として提供することができる。ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書で詳述されている細胞の特性のうちの任意の1つまたは複数(例えば、増殖能力、遺伝子発現、成長特性、など)を有する。
B.培養された細胞型の同定
細胞型に関して選択的に培養した後、1種または複数種の分子マーカーを使用して細胞型を同定することができる。正常な卵巣細胞の中で、3種のタンパク質(PAX8、FOXJ1、およびケラチン7(CK7)の発現パターンは細胞型の間で変動する。卵巣表面上皮はCK7(+)、PAX8(−)、およびFOXJ1(−)であるが、卵巣封入体嚢胞上皮はCK7(+)、PAX8(+)、およびFOXJ1(−)である。同様に、卵管線毛細胞(CK7(−)、PAX8(−)、およびFOXJ1(+))と卵管無線毛細胞(CK7(+)、PAX8(+)、およびFOXJ1(−))を区別することができる。
細胞型に関して選択的に培養した後、1種または複数種の分子マーカーを使用して細胞型を同定することができる。正常な卵巣細胞の中で、3種のタンパク質(PAX8、FOXJ1、およびケラチン7(CK7)の発現パターンは細胞型の間で変動する。卵巣表面上皮はCK7(+)、PAX8(−)、およびFOXJ1(−)であるが、卵巣封入体嚢胞上皮はCK7(+)、PAX8(+)、およびFOXJ1(−)である。同様に、卵管線毛細胞(CK7(−)、PAX8(−)、およびFOXJ1(+))と卵管無線毛細胞(CK7(+)、PAX8(+)、およびFOXJ1(−))を区別することができる。
無線毛卵管細胞または卵巣封入体嚢胞細胞を発癌性形質転換した後、これらの細胞型を、プローブの発現と関連づける。形質転換された無線毛卵管細胞は、プローブセットDOK5、CD47、HS6ST3、DPP6、OSBLP3を過剰発現し、形質転換された卵巣封入体嚢胞細胞は、プローブセットSTC2、SFRP1、SLC35F3、SHMT2、TMEM164を過剰発現する。したがって、腫瘍をより卵管様または卵巣様として同定することができる。いくつかの実施形態では、キットは、卵管細胞に関連づけられるプローブセット、および/または卵巣細胞に関連づけられるプローブセットを含んでよい。
本発明の1つの態様は、卵巣細胞および/または卵管細胞の実質的に精製された培養物に関し、卵巣細胞は、プローブセットDOK5、CD47、HS6ST3、DPP6、OSBLP3を過剰発現し、卵管細胞は、プローブセットSTC2、SFRP1、SLC35F3、SHMT2、TMEM164を過剰発現し、培養物は、細胞を少なくとも103個含み、細胞は、少なくとも14、25、または35回の集団倍加を行う能力を有する。いくつかの実施形態では、培養物は、細胞を少なくとも105個、106個、107個、108個、109個、および/または1010個含む。
培養腫瘍細胞の株について、細胞由来のゲノムDNAの発現プロファイルを生成することによってDNA指紋を生成することができる。各腫瘍細胞株についてmRNAの発現プロファイルおよびタンパク質の発現プロファイルも作成することができる。いくつかの実施形態では、本開示は、図13、14、および/または15のプロファイルを有する卵巣癌細胞を提供する。
各細胞株を薬物応答性について試験したら、発現プロファイルを薬物応答と相関させることができる。いくつかの実施形態では、発現プロファイルを患者由来の腫瘍と比較することができ、患者の予後判定に関する知見が既知である場合、培養細胞株からの発現プロファイルにより予後判定を示すことができる。いくつかの実施形態では、患者の腫瘍に対する薬物の効果の可能性の予測を患者の腫瘍の発現プロファイルに基づいて確立し、薬物応答性が既知である参照細胞株と比較することができる。例えば、患者の腫瘍の発現プロファイルが参照細胞の発現プロファイルと実質的に類似しており、参照細胞が薬物治療に応答する場合、患者の腫瘍もその薬物治療に応答すると予測することができる。いくつかの実施形態では、生検または外科手術から得た腫瘍細胞を培養物中で培養し、1種または複数種の治療剤に曝露させる。細胞の増殖または生存に対する作用物質(複数可)の効果を評価して、対象の腫瘍に対する1種または複数種の作用物質の効果の可能性に関する予測を得る。いくつかの実施形態では、少なくとも部分的に、薬物が有益もしくは有効である、または1種または複数種の代替物よりも有効であることを示唆する予測または結果に基づいて、対象に対して治療を選択し、かつ/または施行する。
C.培養細胞の例示的な使用
培養細胞は、例えば、種々のスクリーニング方法において、癌治療薬の候補作用物質、他の治療目的のために有用な候補作用物質(例えば、卵巣、卵管などに影響を及ぼす他の疾患において使用するための候補作用物質)を同定するために、または他の目的のために用いることができる。いくつかの実施形態では、正常細胞を使用する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞を使用する。いくつかの実施形態では、対象の疾患(例えば、生殖系に影響を及ぼす疾患)に罹患している対象から得た細胞を使用する。候補治療剤を同定する方法は、発癌性形質転換した正常な卵巣細胞または卵管細胞、または初代培養物に由来する卵巣腫瘍細胞のいずれかの細胞を適切な培地中で培養することを含む。次いで、細胞を作用物質と接触させ、細胞の生理機能に対する作用物質の効果を測定することができる。細胞の生理機能を調節する作用物質が候補治療剤である。細胞の生理機能は、細胞の成長性、1種または複数種の分子マーカーの発現、形態、および/または測定し数量化することができる他の細胞の性質を含んでよい。候補治療剤は、核酸(例えば、低分子干渉RNA、アプタマー、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド)および/またはタンパク質などの生体分子であってよい、または小有機分子であってよい。ある特定の実施形態では、例えば、細胞の増殖を阻害し、かつ/または生存を阻害する作用物質の能力に基づいて作用物質を同定する。ある特定の実施形態では、例えば、軟寒天において成長する細胞の能力を阻害する作用物質の能力に基づいて作用物質を同定する。
培養細胞は、例えば、種々のスクリーニング方法において、癌治療薬の候補作用物質、他の治療目的のために有用な候補作用物質(例えば、卵巣、卵管などに影響を及ぼす他の疾患において使用するための候補作用物質)を同定するために、または他の目的のために用いることができる。いくつかの実施形態では、正常細胞を使用する。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞を使用する。いくつかの実施形態では、対象の疾患(例えば、生殖系に影響を及ぼす疾患)に罹患している対象から得た細胞を使用する。候補治療剤を同定する方法は、発癌性形質転換した正常な卵巣細胞または卵管細胞、または初代培養物に由来する卵巣腫瘍細胞のいずれかの細胞を適切な培地中で培養することを含む。次いで、細胞を作用物質と接触させ、細胞の生理機能に対する作用物質の効果を測定することができる。細胞の生理機能を調節する作用物質が候補治療剤である。細胞の生理機能は、細胞の成長性、1種または複数種の分子マーカーの発現、形態、および/または測定し数量化することができる他の細胞の性質を含んでよい。候補治療剤は、核酸(例えば、低分子干渉RNA、アプタマー、またはアンチセンスオリゴヌクレオチド)および/またはタンパク質などの生体分子であってよい、または小有機分子であってよい。ある特定の実施形態では、例えば、細胞の増殖を阻害し、かつ/または生存を阻害する作用物質の能力に基づいて作用物質を同定する。ある特定の実施形態では、例えば、軟寒天において成長する細胞の能力を阻害する作用物質の能力に基づいて作用物質を同定する。
追加的なステップにおいて、試験動物において異種移植片腫瘍が成長するように、培養細胞を試験動物に投与または移植することができる。候補治療剤を試験動物に投与することができ、異種移植片腫瘍の性質を測定することができる。候補治療剤により、腫瘍の成長、生理機能、および/または他の性質が調節される。特に、候補治療剤により、腫瘍の成長が阻害され、腫瘍の成長の速度が低下し、腫瘍サイズが縮小し、腫瘍体積が減少し、かつ/または転移が減少する。したがって、ある特定の実施形態では、作用物質を、動物モデルの状況下で腫瘍の成長または進行を阻害するそれらの能力について、in vivoでスクリーニングする。
いくつかの実施形態では、培養細胞を再生医療に使用することができる。例えば、本明細書に記載の通り得た、または培養したヒト細胞(一般には正常細胞)を、後で対象(例えば、ヒト対象または非ヒト対象)に移植するために組織または器官をex vivoにおいて構築することに使用することができる、または疾患にかかっている、傷害を受けた、または変性した組織または器官を増強または修復するために移植することができる。いくつかの実施形態では、細胞を対象から得、ex vivoで培養し、その後、同じ対象(自己)に移植する。いくつかの実施形態では、関連するドナーまたは無関係のドナーを用いる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の通り得た、または培養した細胞を遺伝子改変に供することができる。一般に、細胞を、対象の遺伝子の任意の1つまたは複数が発現される、またはその発現が増加されるように、および/または対象の遺伝子の任意の1つまたは複数の発現が減少する、またはそれが無くなるように、または、対象の特定の突然変異または変更を有するように工学的に操作することができる。例えば、いくつかの実施形態では、細胞、例えば、正常細胞を、1種または複数種の癌遺伝子が発現される、またはその発現が増加するように、または1種または複数種の腫瘍抑制因子遺伝子の発現が減少する、またはそれが無くなるように遺伝子改変することができる。対象の遺伝子は、例えば、タンパク質、マイクロRNA、低分子ヘアピン型RNAなどをコードするものであってよい。1つまたは複数のベクター(例えば、プラスミド、ウイルスベクターなど)を細胞に導入することができる。トランスフェクション、ウイルス感染などのこれを行う種々の方法が当技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、そのような遺伝子改変を用いて、疾患モデルを生成することができる。
いくつかの実施形態では、培養細胞を組換えタンパク質、例えば、治療用タンパク質の作製に使用する。
当技術分野で理解されている通り、スクリーニングは、一般には、1種または複数種の作用物質を試験し、1種または複数種の作用物質の効果を一部の適切な対照と比較することを伴う。対照を使用することにより、研究者が、変化が有意であるかどうかを評価することが可能になる。ある特定の実施形態では、細胞を使用して、化合物のライブラリーを、例えば、ハイスループットな様式などでスクリーニングする。
本発明を一般的に説明したので、出願人らは、一般的に説明された発明の理解を助けるために以下の例示的な実施例を参照する。これらの特定の例は、ただ単に本発明のある特定の態様および実施形態を例示するために含まれており、本発明をいかなる点でも限定するものではない。しかし、実施例に記載の特定の一般原則を、本発明の他の態様または実施形態に一般に適用することができる。本発明は、上記および下記の態様、実施形態および他の特徴の任意の1つまたは複数を組み合わせることができることを意図している。
(実施例1)
正常な卵巣培養物および卵管培養物の樹立。
正常な卵巣培養物および卵管培養物の樹立。
a.WIT−fo培地:正常な卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞は、WIT−fo栄養培地では少なくとも15回集団倍加培養されたが(図2A〜B、青色の線)、標準培地条件下の同じ細胞の反復実験プレートは数回の継代後に成長が停止した(図2A〜B、赤色の線)。
b.標準の卵巣上皮の培養培地:卵巣上皮細胞に対して、5〜10%の範囲のウシ胎児血清、2mm l−グルタミンおよび10ng/mLの上皮成長因子を補充した、MCDB105/培地199の1:1混合物で構成される対照培地を使用した。対照培地としての10〜15%ウシ胎児血清を伴うダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/ハムF−12(1:1混合物)では同様の結果がもたらされた。これらの2つの培地は、過去20年にわたり、卵巣細胞を短期培養するために多くの他の研究者によって使用されてきた。卵巣細胞は、これらの対照培地では数回の集団倍加を超えては繁殖しなかった(図2A、赤色の線)。
c.標準の卵管培養培地:卵管上皮細胞に対して、Cromerらに記載されている、0.1%BSA、5%血清(2.5%ウシ胎児血清プラス2.5%Nu血清の1:1ミックス)および17βエストラジオールを補充した、ダルベッコ改変イーグル培地(DME)とハムF12の1:1混合物で構成される対照培地を使用した。この培地の、Levanonらによってわずかに改変されたバージョンである、2%血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DME)とハムF12の1:1混合物で構成される培地も試験した(図2B、赤色の線)。
WIT−fo培地で成長させた卵巣細胞は7継代(42日間)で14回の集団倍加に到達し、これは、正味の細胞数の8,192倍の増加である(図2B)。標準の対照培地(DME:F12)では、同じ細胞は同様に7回継代されたが(42日間)、7継代(42日間)でたった2.4回の集団倍加であり、これは、5.3倍の細胞数の正味の増加と等しい。したがって、細胞の数の正味の増加がWIT−foでは標準のDME:F12培地よりも1,526倍多かった(8,192÷5.3=1,526)(図2B)。
卵巣細胞を培養するために利用可能な細胞培養培地のいくつかの変形を試験した。以下に列挙されている培地では、卵巣細胞および卵管細胞は3〜5週間以内に分裂を停止し、細胞数の正味の増加は観察されなかった。
− 10%ウシ胎児血清、および10ng/mLの上皮成長因子を伴うMCDB105/培地199(1:1混合物)
(Karlanら、American J. of Obs. Gyn. 173巻(1号)、97〜104頁、1995年)。
(Karlanら、American J. of Obs. Gyn. 173巻(1号)、97〜104頁、1995年)。
− 5%ウシ胎児血清を伴うMCDB105/培地199(1:1混合物)
(Auerspergら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96巻、6249〜6254頁、1999年)。
(Auerspergら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、96巻、6249〜6254頁、1999年)。
− 15%ウシ胎児血清を伴うダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)/ハムF−12(1:1混合物)
(Nittaら、Gynecologic Oncology、81巻、1号、10〜17頁、2001年)。
(Nittaら、Gynecologic Oncology、81巻、1号、10〜17頁、2001年)。
− 10%ウシ胎児血清、2mm l−グルタミンおよび10ng/mLの上皮成長因子を伴うMCDB105/培地199(1:1混合物)。
(Liuら、Cancer Res. 1;64巻(5号):1655〜63頁、2004年)。
(Liuら、Cancer Res. 1;64巻(5号):1655〜63頁、2004年)。
(実施例2)
WIT−foで培養した正常な卵巣細胞および卵管細胞の特徴付け。
WIT−foで培養した正常な卵巣細胞および卵管細胞の特徴付け。
培養細胞の系列および起源を同定するために、正常なヒト卵巣組織および卵管組織の免疫組織化学的な特徴付けを実施し、正常な卵管組織および卵巣組織の上皮細胞の異なるサブセットをin vivoで区別するマーカーパネルを開発した。
正常なヒト卵巣組織および卵管組織のホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)切片の、異なる細胞を認識する抗体を用いた免疫組織化学的検査により、正常細胞サブセットを定義した。いくつもの抗体をスクリーニングした後、3種の抗体−PAX8、FOXJ1およびケラチン7(CK7)−のパネルを、卵巣の表面上皮と封入体嚢胞上皮とを区別すること、および卵管の線毛細胞と無線毛細胞とを区別することを可能にするものと決定した。卵巣上皮の全ておよび卵管上皮のサブセットがケラチン7陽性(+)であると決定された。卵巣表面上皮はPAX8陰性(−)であるが、卵巣封入体嚢胞上皮はPAX8陽性(+)であった。さらに、卵管上皮の無線毛サブセットはPAX8陽性(+)およびFOXJ1陰性(−)であり、これにより、FOXJ1陽性(+)であるがPAX8陰性(−)であった線毛細胞と区別された(図3A〜E)。
正常な卵管采由来の培養細胞は、CK7(+)、PAX8(+)タンパク質を発現したが、FOXJ1(−)については陰性であった。このプロファイルは、卵管上皮の無線毛細胞と一致する。これらの培養細胞を以後FN細胞(卵管無線毛細胞)と称する(図3G)。
(実施例3)
hTERTにより不死化した正常な卵巣培養物および卵管培養物の樹立。
hTERTにより不死化した正常な卵巣培養物および卵管培養物の樹立。
a.正常な卵巣培養物および卵管培養物の不死化。正常なヒト上皮細胞は、従来の培養培地では、細胞培養物中でよく成長せず、寿命に限りがある。対照的に、全てのげっ歯類細胞型および非上皮ヒト細胞型を培養することはより簡単である。
連続的な正常なヒト上皮細胞培養物を樹立するために、発癌性形質転換を用いて、連続的に培養することができる細胞株を創出する。この手法では、正常上皮細胞の発癌性形質転換を、正常なヒト細胞を化学的突然変異原、放射線照射または他の発癌性作用物質に曝露させることによって実現する。これらの作用物質により、広範にわたる突然変異、DNA破壊および染色体の再配置が引き起こされ、細胞は、もはや完全な正常細胞とみなすことができない。正常細胞を形質転換するための代替方法では、ウイルス癌遺伝子を使用して正常細胞を形質転換する。これらとしては、ヒトパピローマウイルスE6/7(HPV E6/7)遺伝子、サルウイルス40ラージT/スモールt(SV40T/t)抗原、およびアデノウイルスタンパク質(E1A)があるが、これらの方法には問題がある場合がある。
正常なヒト細胞の寿命を延長するための、遺伝学的不安定性またはDNA突然変異を引き起こさない、侵入性が低い方法は、テロメラーゼ触媒サブユニット(hTERT)を過剰発現させることである。hTERTを発現させることにより、ゲノムが実際に安定化し、細胞は、ほぼ、正常細胞と同様の二倍体のままである。
WIT−fo培地(表3参照、「WIT−fo」と表示された列)では、正常な卵巣封入体嚢胞(OC)と卵管無線毛(FN)上皮細胞はどちらもhTERT単独で不死化した。これらの不死化したOC細胞およびFN細胞は、以後、それぞれOCE細胞およびFCE細胞と称される(図3A〜E)。これらの細胞は、40回の集団倍加を超えて連続的に培養され、細胞数の正味の増加がほぼ1012倍であり、これにより、それらの不死化が実証されている。対照的に、標準培地条件下の、hTERTを発現している同じ細胞の反復実験プレートは、hTERTが過剰発現していても数回の継代後に成長が停止した(図4A〜E)。
(実施例4)
卵巣封入体嚢胞(OC)および無線毛卵管(FN)正常上皮の腫瘍形成性形質転換:
hTERTにより不死化したOCE細胞およびFNE細胞を、以前に記載されている通りSV40T/tおよびH−Rasを用いて形質転換した(図5A)。SV40T/tを発現させることにより、正常なヒト細胞は形質転換されたが、これらの細胞はマウスでは腫瘍形成性にはならない。マウスではH−Rasなどの癌遺伝子をさらに発現させることにより、これらの形質転換細胞が腫瘍形成性になる。形質転換された腫瘍形成性形質転換OC細胞(OCLER)およびFN細胞(FNLER)はPAX8タンパク質およびケラチン7タンパク質を発現し、FOXJ1については陰性であり、これにより、これらの細胞が、それらの起源である、それぞれ卵巣封入体嚢胞および卵管無線毛の表現型を保持したことが確認される。同等数のOVLER細胞およびFNLER細胞を免疫無防備状態のヌードマウスの腹膜腔に注射した。5〜9週間後にマウスを剖検分析することにより、両群で同様のサイズの腹腔内原発腫瘍が明らかになった。OCLER腫瘍およびOVLER腫瘍はどちらも低分化型の形態を有したが、限局的に小さな微乳頭様構造を同定することができた(図6A〜B)。腫瘍細胞は同様にPAX8+であり(図6、C〜D)、膵臓などの周囲の腹腔内組織に対して局所的に浸潤性であった(図7A〜B)。
卵巣封入体嚢胞(OC)および無線毛卵管(FN)正常上皮の腫瘍形成性形質転換:
hTERTにより不死化したOCE細胞およびFNE細胞を、以前に記載されている通りSV40T/tおよびH−Rasを用いて形質転換した(図5A)。SV40T/tを発現させることにより、正常なヒト細胞は形質転換されたが、これらの細胞はマウスでは腫瘍形成性にはならない。マウスではH−Rasなどの癌遺伝子をさらに発現させることにより、これらの形質転換細胞が腫瘍形成性になる。形質転換された腫瘍形成性形質転換OC細胞(OCLER)およびFN細胞(FNLER)はPAX8タンパク質およびケラチン7タンパク質を発現し、FOXJ1については陰性であり、これにより、これらの細胞が、それらの起源である、それぞれ卵巣封入体嚢胞および卵管無線毛の表現型を保持したことが確認される。同等数のOVLER細胞およびFNLER細胞を免疫無防備状態のヌードマウスの腹膜腔に注射した。5〜9週間後にマウスを剖検分析することにより、両群で同様のサイズの腹腔内原発腫瘍が明らかになった。OCLER腫瘍およびOVLER腫瘍はどちらも低分化型の形態を有したが、限局的に小さな微乳頭様構造を同定することができた(図6A〜B)。腫瘍細胞は同様にPAX8+であり(図6、C〜D)、膵臓などの周囲の腹腔内組織に対して局所的に浸潤性であった(図7A〜B)。
腫瘍を担持するマウス由来の肺を検査することにより、OC由来の腫瘍形成性細胞とFN由来の腫瘍形成性細胞との間の著しい差異が明らかになった。各マウスの肺を、まず、解剖顕微鏡の下でgfp+腫瘍細胞について検査し(図7C)、同じ肺のFFPE切片を、H&E切片を用いて非定型的な腫瘍細胞について顕微鏡で(図7D)、ならびにp53およびSV40T/tの免疫組織化学的染色を用いて(図7E〜F)検査した。
形質転換された無線毛卵管細胞(FNLER)では、マウスの67%(4/6)の肺で転移が形成されたが、同じ癌遺伝子を用いて形質転換した同質遺伝子型の正常な卵巣細胞(OCLER)では、マウスの13%(1/8)で転移が形成された(図6G)。これらの細胞は、同じ患者から単離し、同一の癌遺伝子を用いて形質転換したので、これは、OCにおいて生じた腫瘍と、FNにおいてにおいて生じた腫瘍における転移の潜在力の差異を示す。
(実施例5)
予測起源細胞遺伝子発現サインの発見:
a.起源細胞であるFNE(卵管)とOCE(卵巣)の発現サイン。これらの実験的試験から得られた遺伝子サインを使用して、患者由来の原発性卵巣腫瘍組織を、卵管(FT)様および卵巣(OV)様として分類した。1,017種のプローブの発現レベルは、正常な不死化細胞の間(FNE対OCE)で有意に変動した(FDR調整P<0.05)。卵巣癌データセット内でFT様およびOV様の細区分を作製するために、全体的な遺伝子発現プロファイルに基づいて患者をクラスタリングするための以前の広く使用されている戦略とは異なる手法を適用した。そうではなく、この手法は、FNE(DOK5、CD47、HS6ST3、DPP6、OSBPL3)またはOCE(STC2、SFRP1、SLC35F3、SHMT2、TMEM164)のいずれかで過剰発現された独特の遺伝子記号を有する5種の最も高度に有意なプローブセットを選択し、2つの卵巣癌データセットにおけるこれらの遺伝子の正規化された発現値の合計を、FNE遺伝子を(+1)で、OCE遺伝子を(−1)で重み付けすることによって算出すること、詳細には、OCE遺伝子の正規化された発現値の合計をFNE遺伝子の発現値の合計から引き算して、各腫瘍についてのスコアを算出することを伴った。したがって、スコアが高いことは、よりFT様であることを意味する。このスコアに混合モデリングを使用してガウス曲線の二峰性分布を当てはめて、データセット内の2つの亜集団;よりOV様の亜集団およびよりFT様の亜集団を同定した。
予測起源細胞遺伝子発現サインの発見:
a.起源細胞であるFNE(卵管)とOCE(卵巣)の発現サイン。これらの実験的試験から得られた遺伝子サインを使用して、患者由来の原発性卵巣腫瘍組織を、卵管(FT)様および卵巣(OV)様として分類した。1,017種のプローブの発現レベルは、正常な不死化細胞の間(FNE対OCE)で有意に変動した(FDR調整P<0.05)。卵巣癌データセット内でFT様およびOV様の細区分を作製するために、全体的な遺伝子発現プロファイルに基づいて患者をクラスタリングするための以前の広く使用されている戦略とは異なる手法を適用した。そうではなく、この手法は、FNE(DOK5、CD47、HS6ST3、DPP6、OSBPL3)またはOCE(STC2、SFRP1、SLC35F3、SHMT2、TMEM164)のいずれかで過剰発現された独特の遺伝子記号を有する5種の最も高度に有意なプローブセットを選択し、2つの卵巣癌データセットにおけるこれらの遺伝子の正規化された発現値の合計を、FNE遺伝子を(+1)で、OCE遺伝子を(−1)で重み付けすることによって算出すること、詳細には、OCE遺伝子の正規化された発現値の合計をFNE遺伝子の発現値の合計から引き算して、各腫瘍についてのスコアを算出することを伴った。したがって、スコアが高いことは、よりFT様であることを意味する。このスコアに混合モデリングを使用してガウス曲線の二峰性分布を当てはめて、データセット内の2つの亜集団;よりOV様の亜集団およびよりFT様の亜集団を同定した。
このクラスタリングは、Wuらのデータセット(GEO GSE6008)において実施した。この試験により、99の新鮮な凍結した、顕微解剖した上皮性卵巣癌(多くの非漿液性組織学的サブタイプを含む)が同様のアレイプラットフォーム上でプロファイリングされた。プラットフォームの差異に起因して、10種の遺伝子のうち8種が分析のために利用可能であった。グローバルテストでは、これらの8種の遺伝子は、組織学的サブタイプ(P=9.93×10−11)、悪性度(P=2.03×10−7)および病期(P=9.55×10−12)に強力に関連した。これらの臨床的因子に最も強力に関連づけられた特定の遺伝子を同定するために、ロジスティック回帰を適用し、これにより、DOK5、CD47、およびSFRP1が、この関連性を駆動すると思われることが明らかになった(図8a)。8種の遺伝子サインを用いて、Wuデータ内のFT様亜集団およびOV様亜集団を定義し、いくらか二峰性の分布を例示している密度プロット内のスコアを可視化し(図8b)、2つの群(OV様およびFT様)への分離を裏付けた。特に、このスコアリングシステムを使用して、Wuデータセット内にアレイした4つの正常な卵巣表面上皮試料は、全てOV様に分類された。起源細胞分類は患者の腫瘍の臨床的差異と関連した;FT様亜集団は、病期(P=3.27×−6)、悪性度(P=4.46×10−4)が有意に高い腫瘍を含み、主に漿液腫で構成された(P=1.83×10−8)(図8c)。対照的に、OV様腫瘍は、類内膜腫瘍、明細胞腫瘍および粘液性腫瘍などの種々の漿液性組織学的サブタイプを含み、悪性度がより低い腫瘍を含んだ。
10種の遺伝子サインを、同じプラットフォームに246の漿液性悪性腫瘍および20の類内膜悪性腫瘍由来の新鮮な凍結腫瘍片(顕微解剖していない)がアレイされたTothillデータセット(GEO GSE9891)においてさらに検証した;重要なことに、これらの組織を患者の生存データと関連づけることができた。同じガウス混合モデリングを適用することにより、OV様スコアおよびFT様スコアが同定され、これらは、はっきり二峰性ではなかったが、わずかな左寄りが観察され、これは、OV様腫瘍の小さな亜集団を示している(図8d)。FT様亜集団は、漿液腫について有意に富化されており(P=0.0109)、病期がより高度な腫瘍を含有し(これは有意ではなかった、P=0.0691)、悪性度との関連性は示されなかった(P=0.876)(図8e)。FT様腫瘍は、有意に悪い無病生存(P=0.000297)および全生存(P=0.0495)を有した(図8f)。Tothillデータセットでは明白な二峰性が欠如しているので、腫瘍がOV様またはFT様と誤分類されている可能性がある。しかし、WuデータセットとTothillデータセットの結果の組み合わせに基づいて、起源細胞サインが卵管卵巣腫瘍に存在し、この分類により、以前は認識されていなかった卵管卵巣細胞腫の臨床的に別個のサブグループが解明されると思われると結論づけた。
b.形質転換遺伝子サイン対不死化遺伝子サイン。異なる細胞株により、起源細胞に関係なく、正常な不死化細胞サイン(ICS)と、それらの対応する形質転換細胞サイン(TCS)とを比較して遺伝子発現の差異を評価することが可能になった(図9)。これを行うために、hTERTのみを発現している不死化したFNE/OCEのmRNAの発現プロファイル、およびhTERT+LT/stおよびH−Ras癌遺伝子を発現している形質転換されたFNLER/OCLERのmRNAの発現プロファイルを測定した。
結果により、ICS+遺伝子発現サインにより、卵巣癌患者において、TCS+卵巣癌と比較して統計的に有意な悪い臨床転帰予測されることが示された(図9)。
正常な不死化細胞サイン(ICS)は、形質転換細胞サイン(TCS)と比較して、悪い転帰と相関した(図9A)。この結果は、「形質転換細胞サイン」が、化学療法に対する良好な応答と相関する可能性があり、これにより良好な転帰が予測されることを示唆している。腫瘍に近接する正常上皮の顕微鏡検査では、化学療法を用いた処置後の壊死またはアポトーシスの徴候はほぼ示されない。対照的に、腫瘍の化学療法応答には、有意な壊死、アポトーシス、炎症および/または線維症が伴う。腫瘍細胞は、DNA損傷応答、細胞周期制御、ヌクレオチドおよびエネルギー代謝に関与する多数の経路が不完全であるので、化学療法に対する感度がより高い。
さらに、Tothillによってそれらのデータセットにおいて同定された、経験的に定義された不良転帰群と、それらのデータセットを検査することによって同定されたICSサインとの間に著しい重複が観察された。ICSに分類された51例のうち3例のみが、Tothillで予後不良(C1)として分類された。対照的に、ISC腫瘍85例のうち46例が、Tothillによって予後不良(C1)として分類された(図9B)。
(実施例6)
標準の培養培地における腫瘍細胞の成長カイネティクス
腫瘍は、多くの細胞型で構成される複雑な組織であり、細胞型としては、腫瘍細胞と混じった線維芽細胞、内皮細胞、リンパ球、白血球、マクロファージ、正常上皮細胞などなどの多くの間質細胞が挙げられる。これらの中で、線維芽細胞は、歴史的に、標準の培養培地で成長させることが最も容易である。腫瘍組織を培養プレートに入れたとき、一般には、線維芽細胞が爆発的に成長し、その結果、数週間のうちに線維芽細胞は培養物を完全に追い越し、間もなく腫瘍細胞を含めた他の全ての細胞型が培養物から排除される。血清を補充したRPMI培地、DMEM培地、F12MCDB105/M199培地を使用したほとんど全ての場合で同様の結果が得られ、線維芽細胞は増殖した主要な細胞型であった。したがって、これらの培地では、間質細胞は、完全に腫瘍細胞よりも速く成長し、純粋な癌細胞株を樹立することは不可能であった。
標準の培養培地における腫瘍細胞の成長カイネティクス
腫瘍は、多くの細胞型で構成される複雑な組織であり、細胞型としては、腫瘍細胞と混じった線維芽細胞、内皮細胞、リンパ球、白血球、マクロファージ、正常上皮細胞などなどの多くの間質細胞が挙げられる。これらの中で、線維芽細胞は、歴史的に、標準の培養培地で成長させることが最も容易である。腫瘍組織を培養プレートに入れたとき、一般には、線維芽細胞が爆発的に成長し、その結果、数週間のうちに線維芽細胞は培養物を完全に追い越し、間もなく腫瘍細胞を含めた他の全ての細胞型が培養物から排除される。血清を補充したRPMI培地、DMEM培地、F12MCDB105/M199培地を使用したほとんど全ての場合で同様の結果が得られ、線維芽細胞は増殖した主要な細胞型であった。したがって、これらの培地では、間質細胞は、完全に腫瘍細胞よりも速く成長し、純粋な癌細胞株を樹立することは不可能であった。
非腫瘍細胞の過成長が起こらない希少な試料では、標準培地において短期の腫瘍細胞の成長を実現することが可能である。しかし、これらの最初の成功の希少な場合でさえも、腫瘍細胞の成長は、卵巣細胞株を培養するために最も頻繁に使用されている標準の培養培地(例えば、DMEM、F12、RPMIおよびMCDB105/M199など)では一般に数週間後に停止した。この後、一般には、細胞死が広範に及ぶ。ほとんどの場合、連続細胞株は樹立されず、培養物はこの時点で廃棄される。非常に希少な場合には、サブクローンが出現し、連続細胞株が生じる可能性がある。
標準培地において連続腫瘍細胞株を樹立することができるこれらの希少な場合には、一般に、4つの病期が観察される;数週間にわたる短時間の急速な成長(a)、その後の成長プラトー(b)、その後の広範に及ぶ細胞死(c)および希少な細胞クローンの出現。
この事象の連続は図10に最もよく例示されている。ヒト卵巣腫瘍試料をRPMI培地にプレーティングすると、腫瘍細胞の成長はおよそ5回の集団倍加で停止した(図10Aおよび10C、20〜40日目の前の赤色の線および緑色の線の平らな部分)。この後に、細胞死が広範に及び、これは、細胞数の減少に反映される(図10Aおよび10C、40〜50日目の赤色の線および緑色の線の下向きの部分)。この種類の成長カイネティクスは、従来の培地で行われるヒト腫瘍培養の大部分に典型的である。
従来の細胞培養培地を使用したほぼ3ダースの試みでただ1つの腫瘍細胞株が樹立された。この1つの場合では、腫瘍細胞のクローンはRPMI培地において、上記の通りほとんど全ての他の細胞が死滅した後に増殖を開始した(図10A、赤色の線、90日目)。
培養していない腫瘍DNAと比較して有意な変化が起こり、RPMI培地において90日後に生じた腫瘍細胞クローンのゲノムを検査した(図10B)。対照的に、WIT−ocにおいて成長した腫瘍細胞は起源腫瘍と非常に類似した(図10B)。
要約すると、例外が1つあったが、標準の細胞培養培地では、腫瘍細胞は最終的に死んだ、または培養物は線維芽細胞に追い越され、したがって、連続細胞株を樹立することはできなかった。同様に、Verschraegenらは、67の患者由来の90の異なる卵巣癌(ovarian carcinoma)検体をRPMI培地にプレーティングし、90のうち11のみを(12%、11/90)たった15継代にわたって培養することができたことが観察された。
継代数対集団倍加:
継代の数は集団倍加とは等しくない。この例は図10Aにおいて提供される。腫瘍細胞をMCDB−105/M199においてほぼ20週間にわたって継代した。典型的な継代頻度は週に1回であり、これは全部で20継代と同等である。しかし、これらの細胞の集団倍加曲線は7継代後には平らであった。したがって、7回目の継代と20回目の継代との間に正味の増加はなかった。したがって、これらの細胞により、任意の意味のある実験を行う実用的なプラットフォームを提供することはできなかった。これらの細胞は、毎週プレート間で標準培地に継代され、それらの細胞数の増加はわずかであった。
継代の数は集団倍加とは等しくない。この例は図10Aにおいて提供される。腫瘍細胞をMCDB−105/M199においてほぼ20週間にわたって継代した。典型的な継代頻度は週に1回であり、これは全部で20継代と同等である。しかし、これらの細胞の集団倍加曲線は7継代後には平らであった。したがって、7回目の継代と20回目の継代との間に正味の増加はなかった。したがって、これらの細胞により、任意の意味のある実験を行う実用的なプラットフォームを提供することはできなかった。これらの細胞は、毎週プレート間で標準培地に継代され、それらの細胞数の増加はわずかであった。
培養物樹立の遅延時間:
我々のRPMIにおいて細胞株が出現する前に90日の遅延時間が観察された(図10A)。この遅延時間は、一般には、2つのプロセスに起因して観察される;この遅延期の間に、細胞の大部分が死に、その代わりに、新しい突然変異を獲得した希少なサブクローンが出現し、成長が速い連続細胞株を起こすことが可能になる。しかし、図10において例示されているように、これは、細胞培養物において獲得される遺伝学的変更を犠牲にして起こる。したがって、そのような細胞株は、起源腫瘍細胞集団から著しく逸脱したクローンの集団になる。
我々のRPMIにおいて細胞株が出現する前に90日の遅延時間が観察された(図10A)。この遅延時間は、一般には、2つのプロセスに起因して観察される;この遅延期の間に、細胞の大部分が死に、その代わりに、新しい突然変異を獲得した希少なサブクローンが出現し、成長が速い連続細胞株を起こすことが可能になる。しかし、図10において例示されているように、これは、細胞培養物において獲得される遺伝学的変更を犠牲にして起こる。したがって、そのような細胞株は、起源腫瘍細胞集団から著しく逸脱したクローンの集団になる。
(実施例7)
WIT−oc培地における腫瘍細胞の成長カイネティクス
WIT−oc培地における腫瘍細胞の成長は即時であり、遅延時間はなかった。成長速度は一定であり、成長プラトーまたは広範に及ぶ細胞死は観察されなかった(図10AおよびC、青色の線)。これらの結果は、WIT−oc培地では、プレーティングした腫瘍細胞の大部分が、有意なin vitroにおけるクローン選択を伴わずに増殖することができることを示唆している(図10AおよびC、青色の線)。これは、一般には、我々が樹立した全ての細胞株の成長カイネティクスであった。
WIT−oc培地における腫瘍細胞の成長カイネティクス
WIT−oc培地における腫瘍細胞の成長は即時であり、遅延時間はなかった。成長速度は一定であり、成長プラトーまたは広範に及ぶ細胞死は観察されなかった(図10AおよびC、青色の線)。これらの結果は、WIT−oc培地では、プレーティングした腫瘍細胞の大部分が、有意なin vitroにおけるクローン選択を伴わずに増殖することができることを示唆している(図10AおよびC、青色の線)。これは、一般には、我々が樹立した全ての細胞株の成長カイネティクスであった。
以後、WIT−oc培地において樹立された卵巣癌細胞株はOCI細胞株と称する。
25種の連続OCI細胞株を樹立した;これらのうちの14種は一次ヒト固形卵巣組織由来であり、7種は腹水由来の連続OCI細胞株であり、5種はマウスにおいて最初に生長させたヒト腫瘍異種移植片由来のOCI細胞株であった(表1)。
(実施例8)
卵巣腫瘍および卵管腫瘍の異なるサブタイプの培養:
卵巣の腺癌は、別個の細胞の特徴、形態学的特徴、および臨床的特徴を有する少なくとも6種の主要な組織病理学的サブタイプで構成される不均一な疾患である。卵巣腺癌の主要なサブタイプとしては、乳頭状漿液性型、粘液性型、類内膜型、明細胞型、扁平上皮型および移行性型が挙げられ、これらが卵巣腺癌の90パーセント超を占める。上皮表現型と間葉系表現型の混合物である多数の他の希少な卵巣腫瘍サブタイプ、例えば、癌肉腫、および未分化胚細胞腫などの生殖起源細胞の腫瘍などが存在する。
卵巣腫瘍および卵管腫瘍の異なるサブタイプの培養:
卵巣の腺癌は、別個の細胞の特徴、形態学的特徴、および臨床的特徴を有する少なくとも6種の主要な組織病理学的サブタイプで構成される不均一な疾患である。卵巣腺癌の主要なサブタイプとしては、乳頭状漿液性型、粘液性型、類内膜型、明細胞型、扁平上皮型および移行性型が挙げられ、これらが卵巣腺癌の90パーセント超を占める。上皮表現型と間葉系表現型の混合物である多数の他の希少な卵巣腫瘍サブタイプ、例えば、癌肉腫、および未分化胚細胞腫などの生殖起源細胞の腫瘍などが存在する。
成長させることが特に難しい腫瘍型、例えば、類内膜癌および明細胞癌などを含めた、ヒト卵巣癌の6種の異なるサブタイプ由来の連続腫瘍細胞株が樹立されている(表1および2)。完全に最適化された方法および培養条件を用いた26の試みにおいて25種のOCI株が樹立され、これらのOCI株の全てが、90%超の成功率で長期(>30回の集団倍加)にわたって培養された。25種の腫瘍株の全てが軟寒天コロニーを形成することができた(表2)。
標準の培養培地では、異なるサブタイプの卵巣癌を効率的に成長させることは不可能であった。連続腫瘍株の大部分は高度に侵攻性の乳頭状漿液性卵巣癌から樹立され、他のサブタイプはめったに培養されない。
さらに、我々が樹立した細胞系のうち4種の腫瘍細胞株は、原発性卵管細胞腫に由来した。最近まで、大多数の原発性ミュラー管骨盤内腫瘍が、卵巣癌(ovarian carcinoma)と称されていた。我々が開発した培養系を用いて、卵管原発性および卵巣原発性の両方の細胞株が樹立された。
(実施例9)
標準培地におけるOCI細胞株の培養
OCI株の成長を種々の標準培地において検査した。卵巣癌細胞に対してAmerican Type Tissue Collection(ATTC)およびECACCによって推奨される培地を使用した。ATCCから入手可能な7種のヒト卵巣腺癌の中で、3種のみが利用可能なサブタイプ情報を有した;明細胞癌1種、乳頭状漿液性細胞腫1種および類内膜細胞腫細胞株1種。
標準培地におけるOCI細胞株の培養
OCI株の成長を種々の標準培地において検査した。卵巣癌細胞に対してAmerican Type Tissue Collection(ATTC)およびECACCによって推奨される培地を使用した。ATCCから入手可能な7種のヒト卵巣腺癌の中で、3種のみが利用可能なサブタイプ情報を有した;明細胞癌1種、乳頭状漿液性細胞腫1種および類内膜細胞腫細胞株1種。
これらの細胞株に対してATCCによって推奨される培地は10〜15%血清を補充したMCDB−105/M199、またはダルベッコ改変イーグル(DMEM)培地またはRPMI培地である。OCI株はこれらの培地では成長することができなかった。OCI株を用いたこれらの実験の例が図11(上の3つのパネル)に示されている。対照的に、我々が試験したATCC細胞株の全てがWIT−oc培地において成長することができた(図11、下の3つのパネル)。これらの結果は、標準培地は、WIT−OCと置き換えるために使用することができないことを例示している。
(実施例10)
起源腫瘍の組織病理とOCI腫瘍株の組織病理の比較:
生物学において、形状と機能との間には強力な関係がある。腫瘍サブタイプの特定の組織病理(形状)は、腫瘍細胞の遺伝的プログラムとそれらの微小環境および全身性因子との間の複雑な相互作用から生じる。
起源腫瘍の組織病理とOCI腫瘍株の組織病理の比較:
生物学において、形状と機能との間には強力な関係がある。腫瘍サブタイプの特定の組織病理(形状)は、腫瘍細胞の遺伝的プログラムとそれらの微小環境および全身性因子との間の複雑な相互作用から生じる。
ATCC/ECACC卵巣腫瘍株からは、ヒト卵巣腫瘍サブタイプのいずれとも似ていない低分化型腫瘍が生じる(図12A〜12B)。対照的に、WIT−oc培地で成長したOCI株(OCI)からは、起源のヒト腫瘍と組織病理が区別できない腫瘍異種移植片が生じる(図12C〜12F)。
典型的なヒト卵巣乳頭状漿液性細胞腫(PSC)では、血管を含有する中心の間質核によって乳頭状構造が形成される。これらのコアにより、最終的に間質核をほとんど有さない腫瘍細胞のクラスターによって形成される最小の枝を形成する悪性上皮によって裏打ちされた徐々に小さくなる乳頭が生じる(図12E)。これは、子宮および卵巣PSCにおいてのみ見られる非常に特異的な構成的特徴であり、この腫瘍に特徴的である。OCI−P9a株はヒトPSCから樹立され、これを免疫無防備状態のマウスに注射すると、ヒトPSCの特異的構成が再現される(図12C)。大多数の異種移植片腫瘍では起源腫瘍の組織病理学的特徴は再現されないので、これは注目すべき結果である。
卵巣の別の別個の腫瘍サブタイプは、一般には、中心内腔の周囲に組織化された連続した腺を形成する類内膜腺癌である。これらの腫瘍は、一般には乳頭状構造を欠く。これらの腫瘍はまた、一般には、エストロゲン受容体およびムチンを発現する。類内膜腺癌から樹立されたOCI−E1p株は腺状構成を有する腫瘍を形成し、エストロゲン受容体およびムチンを発現し、これは腫瘍の起源の表現型を再現している。
要約すると、OCI株は、ヒト卵巣癌と似た腫瘍を生じないATCC/ECACC標準の卵巣癌(ovarian carcinoma)株とは異なり、ヒト卵巣癌(ovarian carcinoma)の形態的な表現型模写である腫瘍を組織病理学的レベルで創出する。
(実施例11)
起源腫瘍のDNAとOCI腫瘍株のDNAの比較:
一塩基多型(SNP)チップにより、培養した卵巣腫瘍細胞のDNAと、それらの起源である培養していない原発性腫瘍組織のDNAを比較するための高分解能の方法が可能になる。この分析により、染色体のコピー数の変化、再配置および異型接合性の損失(LOH)をゲノムワイドに検出することが可能になる。
起源腫瘍のDNAとOCI腫瘍株のDNAの比較:
一塩基多型(SNP)チップにより、培養した卵巣腫瘍細胞のDNAと、それらの起源である培養していない原発性腫瘍組織のDNAを比較するための高分解能の方法が可能になる。この分析により、染色体のコピー数の変化、再配置および異型接合性の損失(LOH)をゲノムワイドに検出することが可能になる。
12種のOCI株および対応する起源腫瘍組織、ならびに9種のATCC卵巣癌(ovarian carcinoma)株のゲノムDNAを検査した。細胞株およびそれらの親の腫瘍由来のゲノムDNAをAffymetrix 250K SNPアレイにハイブリダイズさせ、正常な参照DNAと対照して解析した。これらのデータをヒートマップにプロットし、そこでは異常な変化があるDNA領域が青色で強調表示されており、検出可能な変化のない領域は黄色で強調表示されている。これらの交互の黄色および青色のSNPバンドのゲノム全域にわたるパターンにより、各腫瘍についての独特のDNA指紋がもたらされ、起源腫瘍と比較した培養腫瘍細胞を検証することが可能になる。
培養していない原発腫瘍組織由来のゲノムDNAのCGHプロファイルとWIT−ocで成長した細胞由来のゲノムDNAのCGHプロファイルには注目すべき類似性があった。データの教師なし階層クラスタリングにより、各OCI株クラスターがその親の腫瘍組織の隣にくることが示されている。OCI株は、起源腫瘍のゲノムサインの大半を保持し、したがって、起源腫瘍DNA参照の隣に正確に同定することができる。ヒト腫瘍は、各サブクローンとは別個のDNAの変更のスペクトルを有する多数のサブクローンを含有する。したがって、腫瘍のゲノム全域にわたってSNPをトレースすることは、起源腫瘍の完全なゲノム不均一性を解析するための優れた方法である。これらの結果により、細胞培養の際にこの不均一性の大半を保持することができたことが示されている。
ゲノムの変更の規模は、OCI株の間で2つの別個の群に分離された。OCI株のうちの2種(OCI−U1pおよびP3a)およびそれらの対応する腫瘍は、最大で全染色体腕が関与する大規模な変更を有した(図13、赤色のバー、左の4レーン)。対照的に、他の10種のOCI株およびそれらの対応する腫瘍のゲノムの変更には狭い領域の染色体が関与した(図13、中央の20レーン、赤色のバー)。これらの変更はゲノム全体にわたって分布し、明白なホットスポットはなかった。
ATCC卵巣腫瘍株については、対応する患者由来の対応する腫瘍DNAを公的に入手することができない。これらの株の多くは数十年前に樹立され、起源腫瘍と比較するために腫瘍組織の培養していない部分の位置を確認することができるかどうかは確実ではない。結果として、ATCC/ECACC株を起源腫瘍組織と比較することはできなかった。しかし、それでも、ATCC/ECACC株におけるDNAの変更の分布は、例外を除いた全てのATCC/ECACC株が、大規模な1型のゲノムの変更を有し(図13、青色のバー、右の9レーン)、それとは対照的に、OCI株のパターンの大部分は細かい小規模な変更パターンを有したので、情報価値がある。
SNPプロファイルにより、各腫瘍について異なり、独特である指紋がもたらされ、これにより、各細胞株を起源腫瘍と対照して試験し、同定することが可能になる(図13)。
(実施例12)
OCI腫瘍株のmRNAの発現プロファイル:
異なる卵巣腫瘍サブタイプから樹立されたOCI株のmRNAの発現プロファイルは、別個のmRNAの発現サインを有した。12種のOCI株、5種の正常な卵巣および卵管株ならびに5種のATCC/ECACC株由来のmRNAをAffymetrix U133Plusチップにハイブリダイズさせた。データの教師なし階層クラスタリングにより、乳頭状漿液性癌、類内膜癌および明細胞癌から樹立された腫瘍細胞株がそれらの腫瘍起源に基づいて別々の別個の群を形成することが明らかになった(図14)。さらに、mRNAの発現サインは正常な卵巣上皮(OCE)および卵管上皮(FNE)、ならびにATCC/ECACC卵巣癌細胞株とは別個であった。
OCI腫瘍株のmRNAの発現プロファイル:
異なる卵巣腫瘍サブタイプから樹立されたOCI株のmRNAの発現プロファイルは、別個のmRNAの発現サインを有した。12種のOCI株、5種の正常な卵巣および卵管株ならびに5種のATCC/ECACC株由来のmRNAをAffymetrix U133Plusチップにハイブリダイズさせた。データの教師なし階層クラスタリングにより、乳頭状漿液性癌、類内膜癌および明細胞癌から樹立された腫瘍細胞株がそれらの腫瘍起源に基づいて別々の別個の群を形成することが明らかになった(図14)。さらに、mRNAの発現サインは正常な卵巣上皮(OCE)および卵管上皮(FNE)、ならびにATCC/ECACC卵巣癌細胞株とは別個であった。
これらの結果により、OCI株が、培養物においてこれらの腫瘍型を互いに区別するために十分な、有意なレベルの起源腫瘍の遺伝子発現プロファイルを保持することが確認される。さらに、ATCC株とOCI株との間で、数百の遺伝子の発現の有意差があることが示されている。
(実施例13)
OCI腫瘍株のタンパク質の発現プロファイル:
異なる卵巣腫瘍サブタイプから樹立されたOCI株のタンパク質の発現プロファイルは別個のタンパク質の発現サインを有した。OCI株のタンパク質抽出物を、逆相タンパク質アッセイ(RPPA)を用いて検査し、これにより、OCI株が再度それらの腫瘍起源に応じてクラスター化されることが明らかになった。乳頭状漿液性癌、類内膜癌および明細胞癌から樹立されたOCI株は別々のクラスターを形成した(図15)。さらに、タンパク質の発現サインは正常な卵巣上皮(OCE)および卵管上皮(FNE)、ならびにATCC卵巣癌細胞株とは別個であった。
OCI腫瘍株のタンパク質の発現プロファイル:
異なる卵巣腫瘍サブタイプから樹立されたOCI株のタンパク質の発現プロファイルは別個のタンパク質の発現サインを有した。OCI株のタンパク質抽出物を、逆相タンパク質アッセイ(RPPA)を用いて検査し、これにより、OCI株が再度それらの腫瘍起源に応じてクラスター化されることが明らかになった。乳頭状漿液性癌、類内膜癌および明細胞癌から樹立されたOCI株は別々のクラスターを形成した(図15)。さらに、タンパク質の発現サインは正常な卵巣上皮(OCE)および卵管上皮(FNE)、ならびにATCC卵巣癌細胞株とは別個であった。
これらの結果により、OCI株が、培養物においてこれらの腫瘍型を互いに、および正常細胞と正確に区別するために十分な、有意なレベルの起源腫瘍のタンパク質の発現プロファイルを保持することが確認される。また、これらの結果により、ATCC/ECACC株とOCI株との間で多数のタンパク質の発現に有意差があることが示されている。
(実施例14)
OCI株の薬物応答:
上記の通り、OCI株のDNA、RNAおよびタンパク質のプロファイルはATCCおよびECACC腫瘍細胞株貯蔵所から入手可能な従来の卵巣癌株とは劇的に異なる。これにより、結果として、OCI腫瘍株の薬物応答もATCC/ECACC卵巣腫瘍株とは異なり得るという可能性が生じた。
OCI株の薬物応答:
上記の通り、OCI株のDNA、RNAおよびタンパク質のプロファイルはATCCおよびECACC腫瘍細胞株貯蔵所から入手可能な従来の卵巣癌株とは劇的に異なる。これにより、結果として、OCI腫瘍株の薬物応答もATCC/ECACC卵巣腫瘍株とは異なり得るという可能性が生じた。
UO126は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)を阻害する薬物の例である。MAPKは、「細胞外シグナル調節キナーゼ」(ERK)とも称されるマイトジェン活性化キナーゼのメンバーである。EGFおよび他の受容体チロシンキナーゼなどの多くの成長因子は、しばしば、癌において増幅され、過剰発現され、MAPK/ERK経路を活性化する。さらに、Rasなどの多くの突然変異癌遺伝子によりMAPK/ERKが活性化され、これにより、この中心的な経路が多くの種類の癌において発生する。したがって、MAPK/ERK経路の多くの構成成分が抗癌薬開発の活性な領域である。
ATCC/ECACC株(SKOV3、OV90、TOV−1120およびA2780)およびOCI卵巣腫瘍株(C5x、P9a1、P7aおよびFCI−P1p)の、MAPK阻害薬であるUO126に対する応答を検査した。OCI細胞株およびATCC/ECACC細胞株をどちらも、96ウェルプレート中、WIT−oc培地に3連でプレーティングした(ウェル当たり細胞5000個)。次の日に、MAPK阻害薬であるUO126の段階希釈物をプレートに加えた。薬物と一緒に144時間インキュベートした後、Alamar Blueアッセイを用いて、590/530蛍光を尺度として生存細胞を測定した。
OCI細胞に対するMAPK阻害薬の効果とATCC/ECACCに対するMAPK阻害薬の効果には有意差があった。予測通り、5μMのUO126により、ATCC/ECACCC細胞株の増殖が50%阻害された(LD50)。対照的に、OCI株において50%阻害を実現するためにはおよそ5倍のUO126が必要であった(LD50>30uM)(図16A)。
パクリタキセルは、微小管の集合を阻害する薬物の例である。微小管は、細胞分裂および小胞輸送に関与する細胞骨格の一部であるフィラメントである。有糸分裂の間に染色体を娘細胞に分離する紡錘繊維を築くためには微小管の集合が必要である。したがって、微小管を阻害する薬物により、腫瘍細胞の増殖も阻害される。
OCI卵巣腫瘍株(P7a、P2a、C2p)およびATCC/ECACC卵巣腫瘍株(ES2およびOV90)を、96ウェルプレート中のWIT−oc培地に3連でプレーティングした(ウェル当たり細胞5000個)。次の日に、パクリタキセルの段階希釈物をプレートに加えた。薬物と一緒に72時間インキュベートした後、生存細胞を、Alamar Blueアッセイを用いて590/530蛍光として測定した。
OCI細胞に対するパクリタキセルの効果とATCC/ECACCに対するパクリタキセルの効果には劇的な差異があった。腫瘍細胞数の50%の減少(LD90)を生じたパクリタキセルの濃度は、OCI株ではATCCC/ECACC株と比較して5倍高かった(図16B)。
シスプラチンは、DNAの架橋結合を引き起こす化学療法薬の例である。シスプラチンはDNAに結合し、2つの鎖と化学的に架橋結合し、これにより、細胞分裂の間にDNA損傷が引き起こされる。これにより、修復機構が引き出され、今度は、修復が不可能であることが分かるとアポトーシスが活性化される。OCI卵巣腫瘍株(P7a、P2a、C2p)およびATCC/ECACC卵巣腫瘍株(ES2およびOV90)をプレート中のWIT−oc培地に3連でプレーティングした(ウェル当たり細胞5000個)。次の日に、シスプラチンの段階希釈物をプレートに加えた。薬物と一緒に72時間インキュベートした後、生存細胞を、Alamar Blueアッセイを用いて590/530蛍光として測定した。
OCI細胞株に対するシスプラチンの効果とATCC/ECACC細胞株に対するシスプラチンの効果には劇的な差異があった。腫瘍細胞数の50%の低下を生じたこれらの薬物の濃度(LD90)は、OCI株ではATCCC/ECACC株と比較して6倍高かった(図7C)。
したがって、OCI株は多様な作用機構を有する3つの全く異なるクラスの制癌剤に対する抵抗性が、従来の卵巣癌細胞株(ATCC/ECACC)と比較して高い。
パクリタキセルおよびシスプラチンは、卵巣癌の治療において一般に使用される第一選択薬物であり、したがって、上記の結果はよりよい治療の開発に非常に関連性がある。現存の腫瘍細胞株の1つの欠点は、それらの抗癌薬に対する感度が高レベルであることである。この感度により、薬物の開発の間に多くの「偽陽性」結果が導かれる、すなわち;培養物中の細胞株を死滅させることができる薬物が前臨床的開発および臨床開発のためにさらに選定される。しかし、現存の腫瘍細胞株に対して有効なこれらの薬物の多くは、診療所で患者において試験した時に有効であることが証明されない。腫瘍細胞株の薬物感受性と患者の薬物感受性との間に相関がないことが、有効な癌治療の急速な開発の主要な障害である。OCI様遺伝子発現サインを有する卵巣腫瘍の患者の生存:OCI様遺伝子発現プロファイルを有する腫瘍を有する卵巣腫瘍患者は、ATCC様発現プロファイルを有する腫瘍よりも統計的に有意に悪い生存を有する(図17)。これは、OCI株が、卵巣癌(ovarian carcinoma)患者を治療するために最も一般的に使用される薬物、例えばパクリタキセルおよびシスプラチンなどに対してより抵抗性であるという上記のin vitroにおける薬物応答の結果と一致する。これらの結果により、患者の治療応答に関して、OCI株により、現存の腫瘍細胞株と比較してより関連性のある情報がもたらされることが示唆されている。
(実施例15)
卵管卵巣起源以外の腫瘍型はWIT−oc培地において首尾よく成長した。
卵管卵巣起源以外の腫瘍型はWIT−oc培地において首尾よく成長した。
いくつかの腫瘍試料を、ヒト乳癌、膵癌、腺様嚢胞癌、肺由来または胃腸管由来の神経内分泌腫瘍(カルチノイド)から取り出し、WIT−oc培地において試験した。本明細書に記載の方法および培養培地により、これらの腫瘍を培養することが可能になる(図18)。
表
表1. 異なる腫瘍サブタイプから樹立された連続卵巣腫瘍細胞株の数の要約。この表には、原発性固形腫瘍、悪性腹水または異種移植片腫瘍、ならびに異なる卵管卵巣サブタイプから樹立された主要な卵管卵巣細胞腫細胞株の数が示されている。
表1. 異なる腫瘍サブタイプから樹立された連続卵巣腫瘍細胞株の数の要約。この表には、原発性固形腫瘍、悪性腹水または異種移植片腫瘍、ならびに異なる卵管卵巣サブタイプから樹立された主要な卵管卵巣細胞腫細胞株の数が示されている。
材料および方法
1)組織の採取
良性の婦人科状態に対する外科手術を受けている患者から、外科的キットを使用して正常な卵巣表面および卵管の采状末端からブラシでこすり取ったものを採取した。2人のドナー患者は56歳および65歳であり、いかなる種類の婦人科の癌も有していなかった。
1)組織の採取
良性の婦人科状態に対する外科手術を受けている患者から、外科的キットを使用して正常な卵巣表面および卵管の采状末端からブラシでこすり取ったものを採取した。2人のドナー患者は56歳および65歳であり、いかなる種類の婦人科の癌も有していなかった。
2)卵巣表面および卵管上皮の単離および培養
細胞を細胞培養培地に懸濁し、改変表面処理した組織培養フラスコ(Primaria、BD Biosciences、Bedford、MA)に移し、5%CO2、37℃でインキュベートした。培地を2〜3日ごとに交換しながら10〜15日後、0.05%トリプシンを用いて細胞をはがし、細胞を最低でも1×104/cm2の密度で播種することによって二次培養物を樹立した。10%血清を含有する培地を用いてトリプシンを不活化し、その後、細胞をポリプロピレンチューブに入れて遠心分離して(500×g、4分)、過剰なトリプシンおよび血清を除去した。細胞を再プレーティングした24時間後、およびその後48〜72時間ごとに栄養培地を交換した。正常な卵巣表面および卵管上皮を、これらの細胞に最適な栄養培地(WIT−fo)で培養した。
細胞を細胞培養培地に懸濁し、改変表面処理した組織培養フラスコ(Primaria、BD Biosciences、Bedford、MA)に移し、5%CO2、37℃でインキュベートした。培地を2〜3日ごとに交換しながら10〜15日後、0.05%トリプシンを用いて細胞をはがし、細胞を最低でも1×104/cm2の密度で播種することによって二次培養物を樹立した。10%血清を含有する培地を用いてトリプシンを不活化し、その後、細胞をポリプロピレンチューブに入れて遠心分離して(500×g、4分)、過剰なトリプシンおよび血清を除去した。細胞を再プレーティングした24時間後、およびその後48〜72時間ごとに栄養培地を交換した。正常な卵巣表面および卵管上皮を、これらの細胞に最適な栄養培地(WIT−fo)で培養した。
3)レトロウイルスの感染
広宿主性レトロウイルスを、293T産生細胞株を、Fugene6(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)を使用してレトロウイルスベクター1μgならびに8:1の比率のパッケージングプラスミド(pUMVC3)およびエンベローププラスミド(pCMV−VSV−G)合計1μgでトランスフェクションすることによって作製した。24時間および48時間の時点でウイルスの上清を回収し、8μg/mLのポリブレンと一緒に使用して一次卵巣表面細胞および卵管上皮細胞に感染させた。レトロウイルスをレシピエント細胞に以下の順序で、個々のステップで導入した:pmig−GFP−hTERT、pBABE−zeo−SV40−ERおよびpBABE−puro−H−ras V12。各感染後に、感染細胞の選択を段階的に実施し、薬物選択(500μg/mLのゼオシン(zeo)および1μg/mLのピューロマイシン(puro))を用いてポリクローナル感染集団を精製した。一次卵巣表面上皮細胞を、2回目の継代から6回目の継代の間にhTERTで不死化し、26回目の継代から30回目の継代の間に形質転換した。一次卵管上皮細胞には1回目の継代から4回目の継代の間にhTERTを形質導入し、16回目の継代時に形質転換した。hTERTを用いて不死化した細胞およびSV40および/またはH−rasを用いて形質導入した細胞を、Primaria組織培養物製品上、定義済みの培地で培養した。レトロウイルスの使用を伴う全てのプロトコールはCommittee on Microbiological Safetyにより承認されたものであった。
広宿主性レトロウイルスを、293T産生細胞株を、Fugene6(Roche Applied Science、Indianapolis、IN)を使用してレトロウイルスベクター1μgならびに8:1の比率のパッケージングプラスミド(pUMVC3)およびエンベローププラスミド(pCMV−VSV−G)合計1μgでトランスフェクションすることによって作製した。24時間および48時間の時点でウイルスの上清を回収し、8μg/mLのポリブレンと一緒に使用して一次卵巣表面細胞および卵管上皮細胞に感染させた。レトロウイルスをレシピエント細胞に以下の順序で、個々のステップで導入した:pmig−GFP−hTERT、pBABE−zeo−SV40−ERおよびpBABE−puro−H−ras V12。各感染後に、感染細胞の選択を段階的に実施し、薬物選択(500μg/mLのゼオシン(zeo)および1μg/mLのピューロマイシン(puro))を用いてポリクローナル感染集団を精製した。一次卵巣表面上皮細胞を、2回目の継代から6回目の継代の間にhTERTで不死化し、26回目の継代から30回目の継代の間に形質転換した。一次卵管上皮細胞には1回目の継代から4回目の継代の間にhTERTを形質導入し、16回目の継代時に形質転換した。hTERTを用いて不死化した細胞およびSV40および/またはH−rasを用いて形質導入した細胞を、Primaria組織培養物製品上、定義済みの培地で培養した。レトロウイルスの使用を伴う全てのプロトコールはCommittee on Microbiological Safetyにより承認されたものであった。
不死化した卵巣表面および卵管上皮細胞株(pmig−GFP−hTERTベクターのみを含有する)は以後OCEおよびFNEと称し、hTERT(E)、SV40初期領域(L)およびHRas(R)をコードするベクターを導入した後の完全に形質転換された誘導体はOCLERおよびFNLERと称する。
4)ウェスタンブロット法
タンパク質の発現を、総細胞タンパク質30マイクログラムを4〜12%のNuPAGEビス−トリスゲル(Invitrogen、Carlsbad、CA)で分離し、その後、PVDF膜に転写することにより、免疫ブロッティングによって決定した。膜をSV40LTに特異的な一次抗体(Pab101)(Santa Cruz Biotechnology Inc、Santa Cruz、CA)、Rasに特異的な一次抗体(clone RAS10)およびCytokeratin7に特異的な一次抗体(MAB3554)(Millipore、Billerica、MA)、PAX8に特異的な一次抗体(10336−1−AP、ProteinTech Group、Inc、Chicago、IL)、FOXJ1に特異的な一次抗体(HPA005714)およびβ−Actinに特異的な一次抗体(clone AC−15)(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)でプローブした。
タンパク質の発現を、総細胞タンパク質30マイクログラムを4〜12%のNuPAGEビス−トリスゲル(Invitrogen、Carlsbad、CA)で分離し、その後、PVDF膜に転写することにより、免疫ブロッティングによって決定した。膜をSV40LTに特異的な一次抗体(Pab101)(Santa Cruz Biotechnology Inc、Santa Cruz、CA)、Rasに特異的な一次抗体(clone RAS10)およびCytokeratin7に特異的な一次抗体(MAB3554)(Millipore、Billerica、MA)、PAX8に特異的な一次抗体(10336−1−AP、ProteinTech Group、Inc、Chicago、IL)、FOXJ1に特異的な一次抗体(HPA005714)およびβ−Actinに特異的な一次抗体(clone AC−15)(Sigma−Aldrich、St.Louis、MO)でプローブした。
5)免疫蛍光法
無処理の12mmカバーガラス(Warner Instruments、Hamden、CT)上で2日間成長させた細胞のタンパク質の発現を、SV40およびRasに対してそれぞれ2%パラホルムアルデヒド/0.1%トリトンX100および2%パラホルムアルデヒド/アセトンを用いて固定し、SV40LTに特異的な一次抗体(sc−147、Santa Cruz Biotechnology)およびRas(clone Ras10、Millipore)に特異的な一次抗体と一緒にインキュベートした後に、免疫蛍光法によって測定した。画像を、Nikon TE2000−U倒立顕微鏡およびSPOT−RTソフトウェア(Diagnostic Instruments、Sterling Heights、MI)を使用して、油浸、40×拡大率で取得した。
無処理の12mmカバーガラス(Warner Instruments、Hamden、CT)上で2日間成長させた細胞のタンパク質の発現を、SV40およびRasに対してそれぞれ2%パラホルムアルデヒド/0.1%トリトンX100および2%パラホルムアルデヒド/アセトンを用いて固定し、SV40LTに特異的な一次抗体(sc−147、Santa Cruz Biotechnology)およびRas(clone Ras10、Millipore)に特異的な一次抗体と一緒にインキュベートした後に、免疫蛍光法によって測定した。画像を、Nikon TE2000−U倒立顕微鏡およびSPOT−RTソフトウェア(Diagnostic Instruments、Sterling Heights、MI)を使用して、油浸、40×拡大率で取得した。
6)生細胞画像および蛍光活性化細胞選別
細胞を、無処理のfluorodish(World Precision Instruments、Sarasota、FL)上で2日間成長させ、生細胞の画像を、油浸、Nikon TE2000−U倒立顕微鏡および画像取得用のEZ−C1 ソフトウェア(Nikon)を使用して、40×拡大率で取得した。FACS Aria multicolor high speed sorter(BD Biosciences、San Jose、CA)を使用した蛍光活性化細胞選別(FACS)分析を適用して、pmig−GFP−hTERTを感染させた後にGFP陽性の卵巣細胞および卵管細胞の割合を決定した。
細胞を、無処理のfluorodish(World Precision Instruments、Sarasota、FL)上で2日間成長させ、生細胞の画像を、油浸、Nikon TE2000−U倒立顕微鏡および画像取得用のEZ−C1 ソフトウェア(Nikon)を使用して、40×拡大率で取得した。FACS Aria multicolor high speed sorter(BD Biosciences、San Jose、CA)を使用した蛍光活性化細胞選別(FACS)分析を適用して、pmig−GFP−hTERTを感染させた後にGFP陽性の卵巣細胞および卵管細胞の割合を決定した。
7)腫瘍形成性および転移の分析
免疫無防備状態のマウスにおける腫瘍形成実験のプロトコールはHarvard Standing Committee on Animalsによって承認されたものであった。全ての実験を、関連施設および国家のガイドラインおよび規制に従って実施した。単一細胞懸濁液をマトリゲル:WIT−fo混合物(1:1)中に調製し、体積100μl当たり細胞百万個を、マウス当たり腹腔内部位1箇所および皮下部位2箇所に注射した。腫瘍細胞の注射を、6〜8週齢の雌の免疫不全ヌード(Nu/Nu)マウス(Charles River Laboratories International、Inc、Wilmington、MA)に実施した。腫瘍形成性細胞を組織培養物からヌードマウスの腹腔内部位および皮下部位に移植した5〜9週間後に腫瘍を回収した。ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織由来のヘマトキシリン・エオシン染色切片から腫瘍の組織病理を評価した。FFPE組織に対して、細胞型特異的マーカー(CK7、FOXJ1、PAX8)を使用して免疫組織学的検査を行って、マウスのOCLER異種移植片およびFTLER異種移植片ならびに正常なヒト卵巣および卵管において免疫染色パターンを決定した(免疫染色手順の完全な詳細についてはオンライン)。従来のABC技法を用いて免疫染色を行った。GFP発現腫瘍細胞の肺への転移を、最初にOlympus SZX16 Stereo蛍光顕微鏡を使用して新鮮な組織で解析し、その後、ホルマリン固定パラフィン包埋組織のヘマトキシリン・エオシン染色切片を顕微鏡検査した。マウス肺に腫瘍細胞が存在することを、SV40LT免疫染色(Pab 101)およびp53免疫染色(FL−393、Santa Cruz Biotechnology Inc)によって確認した。
免疫無防備状態のマウスにおける腫瘍形成実験のプロトコールはHarvard Standing Committee on Animalsによって承認されたものであった。全ての実験を、関連施設および国家のガイドラインおよび規制に従って実施した。単一細胞懸濁液をマトリゲル:WIT−fo混合物(1:1)中に調製し、体積100μl当たり細胞百万個を、マウス当たり腹腔内部位1箇所および皮下部位2箇所に注射した。腫瘍細胞の注射を、6〜8週齢の雌の免疫不全ヌード(Nu/Nu)マウス(Charles River Laboratories International、Inc、Wilmington、MA)に実施した。腫瘍形成性細胞を組織培養物からヌードマウスの腹腔内部位および皮下部位に移植した5〜9週間後に腫瘍を回収した。ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織由来のヘマトキシリン・エオシン染色切片から腫瘍の組織病理を評価した。FFPE組織に対して、細胞型特異的マーカー(CK7、FOXJ1、PAX8)を使用して免疫組織学的検査を行って、マウスのOCLER異種移植片およびFTLER異種移植片ならびに正常なヒト卵巣および卵管において免疫染色パターンを決定した(免疫染色手順の完全な詳細についてはオンライン)。従来のABC技法を用いて免疫染色を行った。GFP発現腫瘍細胞の肺への転移を、最初にOlympus SZX16 Stereo蛍光顕微鏡を使用して新鮮な組織で解析し、その後、ホルマリン固定パラフィン包埋組織のヘマトキシリン・エオシン染色切片を顕微鏡検査した。マウス肺に腫瘍細胞が存在することを、SV40LT免疫染色(Pab 101)およびp53免疫染色(FL−393、Santa Cruz Biotechnology Inc)によって確認した。
8)RNA抽出および発現プロファイリング
RNeasy Mini kit(Qiagen、Valencia、CA)を製造者の説明書に従って使用して、各細胞株から全RNAを3連で(同じ細胞株由来の異なる継代)抽出した。キャピラリー電気泳動計器(Bioanalyzer 2100、Agilent Technologies、Santa Clara、CA)を使用したサイズ分画手順でRNAを確認して高品質を確実にし、Nanodrop ND−1000(NanoDrop Technologies Inc、Wilmington、DE)を使用してRNA濃度を推定した。5〜15μgのRNAを用いて、ビオチン化cDNA標的を生成し、それをその後、Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0(Affymetrix Inc.、Santa Clara、California)に標準のプロトコールに従ってハイブリダイズさせた。全ての試料を同じマイクロアレイコア設備で同時にプロファイリングして、バッチの影響を最小限にした。
RNeasy Mini kit(Qiagen、Valencia、CA)を製造者の説明書に従って使用して、各細胞株から全RNAを3連で(同じ細胞株由来の異なる継代)抽出した。キャピラリー電気泳動計器(Bioanalyzer 2100、Agilent Technologies、Santa Clara、CA)を使用したサイズ分画手順でRNAを確認して高品質を確実にし、Nanodrop ND−1000(NanoDrop Technologies Inc、Wilmington、DE)を使用してRNA濃度を推定した。5〜15μgのRNAを用いて、ビオチン化cDNA標的を生成し、それをその後、Affymetrix Human Genome U133 Plus2.0(Affymetrix Inc.、Santa Clara、California)に標準のプロトコールに従ってハイブリダイズさせた。全ての試料を同じマイクロアレイコア設備で同時にプロファイリングして、バッチの影響を最小限にした。
9)マイクロアレイデータの正規化および解析
細胞株(OCE、FNE、OCLER、FNLER)のAffymetrixマイクロアレイおよび公的に入手可能なWuらによる卵巣癌データセット(GEO Series受託番号GSE6008)およびTothillらによる卵巣癌データセット(GEO Series受託番号GSE9891)を、R(バージョン2.10.1)において分散安定化方法(vsnrma)を用いてそれぞれ独立に正規化した。細胞株間の遺伝子発現の比較を、24Human Genome U133 Plus 2マイクロアレイ(HG−U133Plus2、Affymetrix)を使用して実施し、54,675種のプローブを測定した。アレイした試料は各細胞型について4つの生物学的反復(2人の患者由来の不死化細胞および形質転換細胞)および3つの実験的反復(異なる継代)を含んだ。
細胞株(OCE、FNE、OCLER、FNLER)のAffymetrixマイクロアレイおよび公的に入手可能なWuらによる卵巣癌データセット(GEO Series受託番号GSE6008)およびTothillらによる卵巣癌データセット(GEO Series受託番号GSE9891)を、R(バージョン2.10.1)において分散安定化方法(vsnrma)を用いてそれぞれ独立に正規化した。細胞株間の遺伝子発現の比較を、24Human Genome U133 Plus 2マイクロアレイ(HG−U133Plus2、Affymetrix)を使用して実施し、54,675種のプローブを測定した。アレイした試料は各細胞型について4つの生物学的反復(2人の患者由来の不死化細胞および形質転換細胞)および3つの実験的反復(異なる継代)を含んだ。
最初に、全体的な遺伝子発現プロファイルに基づいて教師なし階層クラスタリング解析を行い、不死化細胞と形質転換細胞が強力に分離されることを観察した。不死化クラスターおよび形質転換クラスターのそれぞれの中で、試料を次に患者(1または2)によって細区分し、次いで細胞型(卵巣または卵管起源)によって細区分した。
マイクロアレイデータ(Limma)に対して線形モデルを使用した改変t検定(P<0.05)を適用し、偽発見率(FDR)について補正して、卵管起源の細胞と卵巣起源の細胞の間で示差的に発現された遺伝子を同定した。これらの比較を、不死化細胞群内および形質転換細胞群内で別々の対比として行った(例えばFNE対OCE;FNLER対OCLER)。FDR調整P値を0.05に設定したころ、正常な不死化細胞間(FNE対OCE)または形質転換細胞間(FNLER対OCLER)で、それぞれ1,017種または300種のプローブが有意に変動していた。患者間の差異を説明するために、Limmaを用いて第2の解析を行い、今回は患者間の差異を説明するためにduplicateCorrelation機能を使用した。これにより、第1の比較および第2の比較(duplicateCorrelation)によって同定された示差的に発現された遺伝子の間に強力な重複が確認された;したがって、第1の遺伝子サインのセットをその後の解析に使用した。
ヒト卵巣腫瘍を卵管(FT)様および卵巣(OV)様に分類するために、発癌性形質転換の手順は卵管上皮細胞と卵巣上皮細胞の間の固有の差異を不明確にする可能性があるという仮説を立てたので、1,017種のプローブ(FNE対OCE)サイン(以後、「起源細胞」サインと称する)から遺伝子を選択した。2つの卵巣癌データセット内でFT様およびOV様の細区分を同定するために、以前の広く使用されている全体的な遺伝子発現プロファイルに基づいて患者をクラスタリングする戦略とは異なる手法を適用した。その代わりに、FNE細胞(DOK5、CD47、HS6ST3、DPP6、OSBPL3)またはOCE細胞(STC2、SFRP1、SLC35F3、SHMT2、TMEM164)のいずれかにおいて過剰発現された独特の遺伝子記号を有する5つの最も高度に有意なプローブセットを選択し、2つの卵巣癌データセット内のこれらの10種の遺伝子の正規化された発現値の合計を、FNE遺伝子を(+1)で重み付けし、OCE遺伝子を(−1)で重み付けすることによって算出した;詳細には、OCE遺伝子の正規化された発現値の合計をFNE遺伝子の発現値の合計から引き算して、各腫瘍についてのスコアを算出した(例えば、スコアが高い腫瘍はよりFT様である)。次いで、混合モデリングを使用してこのスコアにガウス曲線の二峰性分布を当てはめて、各データセット内のよりOV様の腫瘍とFT様の腫瘍の2つの腫瘍を同定した。
最初に、同様のプラットフォーム(HG−U133A)にアレイされた99の新鮮な凍結し顕微解剖した上皮性卵巣癌(多くの非漿液性組織学的サブタイプを含む)の発現プロファイルを含有するWuら、データセット(GEO GSE6008)においてこのクラスタリングを実施した。アレイプラットフォームの差異に起因して、選択した遺伝子の10種のうち8種が解析のために利用可能であった。グローバルテストを適用して、これらの8種の遺伝子とWuデータセット内の臨床的因子(組織学的サブタイプ、悪性度および病期)との間の関連性を決定した。次いで、線形ロジスティック回帰を適用して、これらの臨床的変数に最も強力に関連づけられる特定の遺伝子を同定した。
この8種の遺伝子の起源細胞サインを使用して、Wuデータ(上記の通り)においてFT様亜集団およびOV様亜集団を定義し、密度プロットを用いてこれらのスコアの分布を可視化して、この分類の有効性を決定した。FT様/OV様分類の臨床的特性を評価し、順序ロジスティック回帰(悪性度、病期)またはフィッシャーの直接検定(組織学的サブタイプ)を用いてそれらの関連するP値を算出した。
10種の遺伝子の起源細胞サインを、Tothillデータセット(GEO GSE9891)においてさらに検証した;これは、同じHG−U133Plus2プラットフォームにアレイされた246の漿液性および20の類内膜性の新鮮な凍結悪性腫瘍片(顕微解剖していない)を含み、患者の生存と関連づけることができた。Wuに関して記載されているガウス混合モデリングおよび腫瘍分類の方法をTothillデータセットに適用した。さらに、FT様/OV様分類が、患者の無病生存率と全生存の差異と関連するかどうかを評価するために、カプラン・マイヤープロットを構築し、コックス比例ハザード試験を適用し、悪性度、病期および組織学的サブタイプについて調整して統計的有意性を決定した。マイクロアレイおよび生存解析は全て、R バージョン2.11.1を使用して行った。
10)腫瘍細胞培養
新鮮な腫瘍組織断片を細かく切り、1mg/mlのコラゲナーゼを用いて消化する前、および消化した後にPrimariaプレートにプレーティングした。腫瘍細胞を最適な栄養培地(WIT−oc)で培養した。腫瘍細胞を約1:3の比率で週に1回継代し、新しいフラスコに1cm2当たり細胞およそ1×104個でプレーティングした。培養の最初の数週間は、プレートは腫瘍細胞ならびに種々の正常な上皮細胞および間質細胞を含有する。これらの非腫瘍細胞は、トリプシンに対してより感受性が高く、0.05%トリプシン処理でプレートからはがれる。したがって、初期の継代(約1〜5)の間は最初にプレートを0.05%トリプシンで処理する。培地で何回か洗浄して、プレートからはがれた間質細胞および正常細胞を除去した。それでも培養プレートに付着している残りの細胞を、0.25%トリプシンで処理した。一般に、腫瘍培養物は、4〜6継代では他の細胞型を含まなかった。乳頭状漿液性腫瘍、明細胞腫瘍、未分化胚細胞腫腫瘍、癌肉腫腫瘍由来の細胞を5%CO2中、37℃で、培養プレートに付着した単層として培養した。類内膜腫瘍および粘液性腫瘍由来の腫瘍細胞を5%CO2および5%O2、37℃で、培養プレートに付着した単層として培養した。類内膜腫瘍および粘液性腫瘍に対しては17β−エストロゲンを補充したWIT−oc栄養培地。ATCC/ECACC細胞株をベンダーの説明書の通り成長させた。
新鮮な腫瘍組織断片を細かく切り、1mg/mlのコラゲナーゼを用いて消化する前、および消化した後にPrimariaプレートにプレーティングした。腫瘍細胞を最適な栄養培地(WIT−oc)で培養した。腫瘍細胞を約1:3の比率で週に1回継代し、新しいフラスコに1cm2当たり細胞およそ1×104個でプレーティングした。培養の最初の数週間は、プレートは腫瘍細胞ならびに種々の正常な上皮細胞および間質細胞を含有する。これらの非腫瘍細胞は、トリプシンに対してより感受性が高く、0.05%トリプシン処理でプレートからはがれる。したがって、初期の継代(約1〜5)の間は最初にプレートを0.05%トリプシンで処理する。培地で何回か洗浄して、プレートからはがれた間質細胞および正常細胞を除去した。それでも培養プレートに付着している残りの細胞を、0.25%トリプシンで処理した。一般に、腫瘍培養物は、4〜6継代では他の細胞型を含まなかった。乳頭状漿液性腫瘍、明細胞腫瘍、未分化胚細胞腫腫瘍、癌肉腫腫瘍由来の細胞を5%CO2中、37℃で、培養プレートに付着した単層として培養した。類内膜腫瘍および粘液性腫瘍由来の腫瘍細胞を5%CO2および5%O2、37℃で、培養プレートに付着した単層として培養した。類内膜腫瘍および粘液性腫瘍に対しては17β−エストロゲンを補充したWIT−oc栄養培地。ATCC/ECACC細胞株をベンダーの説明書の通り成長させた。
11)軟寒天コロニーアッセイ
樹立培養物(6〜8回の継代)由来の細胞を回収し、0.4%寒天にプレーティングした。12ウェルプレートのウェルの底部を、WIT−oc培地中に調製した0.6%寒天で密閉して単層形成を妨げた。WIT−oc培地中0.4%寒天中の単一細胞懸濁液を加え、室温に置き、5%CO2、37℃のインキュベーターに入れた。2週間の時点で細胞にWIT−oc中0.4%寒天を流加し、プレーティングの2〜4週間後にコロニー形成を観察した。
樹立培養物(6〜8回の継代)由来の細胞を回収し、0.4%寒天にプレーティングした。12ウェルプレートのウェルの底部を、WIT−oc培地中に調製した0.6%寒天で密閉して単層形成を妨げた。WIT−oc培地中0.4%寒天中の単一細胞懸濁液を加え、室温に置き、5%CO2、37℃のインキュベーターに入れた。2週間の時点で細胞にWIT−oc中0.4%寒天を流加し、プレーティングの2〜4週間後にコロニー形成を観察した。
あるいは、腫瘍細胞を、懸濁培養物において成長させた。腫瘍スフェアを、2%B27、20ng/mLのEGF、20ng/mLのbFGF(BD Biosciences)、4μg/mlのヘパリン、および0.5%メチルセルロースを伴うWIT−oc培地で成長させた。スフェア形成実験のために、ウェル当たり細胞15,000〜20,000個を6ウェルの超低付着プレート(Corning)にプレーティングし、1日目、3日目、および5日目に流加し、7日目にスフェアを計数した。
12)タンパク質、DNAおよびRNAの分析
腫瘍組織のゲノムDNAをパラフィン切片、または入手可能な場合は新鮮な組織から抽出した。新鮮な腫瘍組織を直接RTL+細胞溶解緩衝液(Quiagen)中でホモジナイズした。細胞株溶解物を直接プレート中で同じ溶解緩衝液を使用して調製した。Qiagen All−Prep miniキットを使用してDNAを溶解物から抽出した。逆相タンパク質分析(RPPA)のために、半集密的な(semi-confluent)細胞単層細胞を、氷上でRPPA溶解緩衝液125μlに3連で(同じ細胞株由来の異なる継代)溶解させた。RPPA抽出物を>200種の抗体を用いてプローブした。全RNAを各細胞株から3連で(同じ細胞株由来の異なる継代)からRNeasy Miniキット(Qiagen、Valencia、CA)を製造者の説明書に従って用いて抽出した。キャピラリー電気泳動計器(Bioanalyzer 2100、Agilent Technologies、Santa Clara、CA)を使用して、サイズ分画手順を用いてRNAを確認して、高品質を確実にし、Nanodrop ND−1000(NanoDrop Technologies Inc、Wilmington、DE)を使用してRNA濃度を推定した。5〜15μgのRNAを用いて、ビオチン化cDNA標的を生成し、その後それをAffymetrix Human Genome U133 Plus2.0(Affymetrix Inc.、Santa Clara、California)に、標準のプロトコールに従ってハイブリダイズさせた。腫瘍および細胞株由来のゲノムDNAを、Affymetrix 250K Styチップを使用して解析した。簡単に述べると、Sty1を用いてDNAを切断し、断片をPCR増幅する。精製した産物を、DNaseIを用いてさらに断片化し、ビオチン化し、チップにハイブリダイズさせ、フィコエリトリン−コンジュゲートしたストレプトアビジンで蛍光標識しシグナル増幅を伴った。SNP推定LOH解析を、dCHIPを使用し、隠れマルコフモードを用いて行った。
腫瘍組織のゲノムDNAをパラフィン切片、または入手可能な場合は新鮮な組織から抽出した。新鮮な腫瘍組織を直接RTL+細胞溶解緩衝液(Quiagen)中でホモジナイズした。細胞株溶解物を直接プレート中で同じ溶解緩衝液を使用して調製した。Qiagen All−Prep miniキットを使用してDNAを溶解物から抽出した。逆相タンパク質分析(RPPA)のために、半集密的な(semi-confluent)細胞単層細胞を、氷上でRPPA溶解緩衝液125μlに3連で(同じ細胞株由来の異なる継代)溶解させた。RPPA抽出物を>200種の抗体を用いてプローブした。全RNAを各細胞株から3連で(同じ細胞株由来の異なる継代)からRNeasy Miniキット(Qiagen、Valencia、CA)を製造者の説明書に従って用いて抽出した。キャピラリー電気泳動計器(Bioanalyzer 2100、Agilent Technologies、Santa Clara、CA)を使用して、サイズ分画手順を用いてRNAを確認して、高品質を確実にし、Nanodrop ND−1000(NanoDrop Technologies Inc、Wilmington、DE)を使用してRNA濃度を推定した。5〜15μgのRNAを用いて、ビオチン化cDNA標的を生成し、その後それをAffymetrix Human Genome U133 Plus2.0(Affymetrix Inc.、Santa Clara、California)に、標準のプロトコールに従ってハイブリダイズさせた。腫瘍および細胞株由来のゲノムDNAを、Affymetrix 250K Styチップを使用して解析した。簡単に述べると、Sty1を用いてDNAを切断し、断片をPCR増幅する。精製した産物を、DNaseIを用いてさらに断片化し、ビオチン化し、チップにハイブリダイズさせ、フィコエリトリン−コンジュゲートしたストレプトアビジンで蛍光標識しシグナル増幅を伴った。SNP推定LOH解析を、dCHIPを使用し、隠れマルコフモードを用いて行った。
13)腫瘍形成能および転移の分析
単一細胞懸濁液をマトリゲル:WIT混合物(1:1)中で調製し、体積100μl当たり細胞百万個をマウス当たり腹腔内部位1箇所および皮下部位2箇所に注射した。腫瘍細胞の注射を6〜8週齢の雌の免疫不全ヌード(Nu/Nu)マウス(Charles River Laboratories International、Inc、Wilmington、MA)に対して実施した。腫瘍形成性細胞を組織培養物からヌードマウスの皮下部位および腹腔内部位に移植した5〜9週間後に腫瘍を回収した。ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織由来のヘマトキシリン・エオシン染色切片から腫瘍の組織病理を評価した。
単一細胞懸濁液をマトリゲル:WIT混合物(1:1)中で調製し、体積100μl当たり細胞百万個をマウス当たり腹腔内部位1箇所および皮下部位2箇所に注射した。腫瘍細胞の注射を6〜8週齢の雌の免疫不全ヌード(Nu/Nu)マウス(Charles River Laboratories International、Inc、Wilmington、MA)に対して実施した。腫瘍形成性細胞を組織培養物からヌードマウスの皮下部位および腹腔内部位に移植した5〜9週間後に腫瘍を回収した。ホルマリン固定パラフィン包埋(FFPE)組織由来のヘマトキシリン・エオシン染色切片から腫瘍の組織病理を評価した。
14)薬物感受性実験
ATCC/ECACC卵巣腫瘍およびOCI卵巣腫瘍株をどちらも96ウェルプレート中のWIT−oc培地に3連でプレーティングした。次の日に、MAPK阻害薬であるUO126の段階希釈物または微小管阻害薬であるパクリタキセルをプレートに加えた。生存細胞の数を、Alamar Blueアッセイを用いて590/530蛍光として測定した。
ATCC/ECACC卵巣腫瘍およびOCI卵巣腫瘍株をどちらも96ウェルプレート中のWIT−oc培地に3連でプレーティングした。次の日に、MAPK阻害薬であるUO126の段階希釈物または微小管阻害薬であるパクリタキセルをプレートに加えた。生存細胞の数を、Alamar Blueアッセイを用いて590/530蛍光として測定した。
参照による組み込み
本明細書において言及されている全ての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が、具体的にかつ個別に、参照により組み込まれることが示されたかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書において言及されている全ての刊行物および特許は、個々の刊行物または特許が、具体的にかつ個別に、参照により組み込まれることが示されたかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明の特定の実施形態が考察されているが、上記の明細書は例示的なものであり、限定的なものではない。本明細書および以下の特許請求の範囲を精査すれば本発明の多くの変形が当業者に明らかになるであろう。本発明の全範囲は、特許請求の範囲を均等物の全範囲と一緒に、および、明細書をそのような変形と一緒に参照することによって決定されるべきである。
Claims (70)
- (a)アデノシン三リン酸;
(b)担体タンパク質;
(c)コレステロール、リノール酸、およびリポ酸;
(d)グルタチオン;
(e)ヒポキサンチン、キサンチン、アデニン、グアニンおよびチミジンから選択されるヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基;
(f)ホスホエタノールアミン;
(g)セレン;
(h)トランスフェリン;
(i)トリヨードサイロニン;
(j)ビタミンA、ビタミンC、およびビタミンD;
(k)Zn、Mg、およびCu;
(l)細胞内cAMPを増加させる作用物質;
(m)上皮成長因子(EGF);
(n)ヒドロコルチゾン;
(o)インスリン;および
(p)血清
を含む、細胞培養培地、または細胞培養培地を調製するためのキット。 - アデノシン一リン酸をさらに含む、請求項1に記載の細胞培養培地。
- ビタミンEをさらに含む、請求項1から2のいずれかに記載の細胞培養培地。
- 前記担体タンパク質がアルブミンである、請求項1から3のいずれかに記載の細胞培養培地。
- 前記ヌクレオチドサルベージ経路前駆塩基がキサンチンまたはヒポキサンチンである、請求項1から4のいずれかに記載の細胞培養培地。
- キサンチンおよびヒポキサンチンを含む、請求項5に記載の細胞培養培地。
- ビタミンK3、ナイアシン、またはナイアシンアミドのうちの少なくとも1つをさらに含む、請求項1から6のいずれかに記載の細胞培養培地。
- 前記細胞内cAMPを増加させる作用物質がコレラ毒素である、請求項1から7のいずれかに記載の細胞培養培地。
- 10ng/mLから70ng/mLの間のコレラ毒素を含む、請求項8に記載の細胞培養培地。
- 20ng/mLから25ng/mLの間のコレラ毒素を含む、請求項9に記載の細胞培養培地。
- 約20ng/mLのコレラ毒素を含む、請求項10に記載の細胞培養培地。
- 約25ng/mLのコレラ毒素を含む、請求項10に記載の細胞培養培地。
- 3ng/mLから50ng/mLの間のEGFを含む、請求項1から12のいずれかに記載の細胞培養培地。
- 約10ng/mLのEGFを含む、請求項13に記載の細胞培養培地。
- 0.005μg/mLから1.5μg/mLの間のヒドロコルチゾンを含む、請求項1から14のいずれかに記載の細胞培養培地。
- 1.0μg/mLから75.0μg/mLの間のインスリンを含む、請求項1から15のいずれかに記載の細胞培養培地。
- 0.2%v/vから10.0%v/vの間の血清を含む、請求項1から16のいずれかに記載の細胞培養培地。
- 1.0%v/vから5.0%v/vの間の血清を含む、請求項17に記載の細胞培養培地。
- 1.8%v/vから2%v/vの間の血清を含む、請求項18に記載の細胞培養培地。
- 約1.8%v/vの血清を含む、請求項19に記載の細胞培養培地。
- 0.15μg/mLから0.3μg/mLの間のヒドロコルチゾンを含む、請求項18から20のいずれかに記載の細胞培養培地。
- 約0.15μg/mLのヒドロコルチゾンを含む、請求項21に記載の細胞培養培地。
- 5.0μg/mLから50.0μg/mLの間のインスリンを含む、請求項18から22のいずれかに記載の細胞培養培地。
- 約15.0μg/mLのインスリンを含む、請求項23に記載の細胞培養培地。
- エストロゲンをさらに含む、請求項1から24のいずれかに記載の細胞培養培地。
- エストロゲンを、30nMから300nMの間の17−ベータ−エストラジオールと等しい効力の濃度で含む、請求項25に記載の細胞培養培地。
- エストロゲンを、約100nMの17−ベータ−エストラジオールと等しい効力の濃度で含む、請求項26に記載の細胞培養培地。
- 前記エストロゲンが17−ベータ−エストラジオールである、請求項24から27のいずれかに記載の細胞培養培地。
- エストロゲンを実質的に含まない、請求項1から23のいずれかに記載の細胞培養培地。
- 0.2%v/vから5.0%v/vの間の血清を含む、請求項17に記載の細胞培養培地。
- 0.25%v/vから0.75%v/vの間の血清を含む、請求項30に記載の細胞培養培地。
- 約0.5%v/vの血清を含む、請求項31に記載の細胞培養培地。
- 0.25μg/mLから0.50μg/mLの間のヒドロコルチゾンを含む、請求項30から32のいずれかに記載の細胞培養培地。
- 約0.5μg/mLのヒドロコルチゾンを含む、請求項33に記載の細胞培養培地。
- 5.0μg/mLから50.0μg/mLの間のインスリンを含む、請求項30から34のいずれかに記載の細胞培養培地。
- 約20.00μg/mLのインスリンを含む、請求項35に記載の細胞培養培地。
- 卵巣腫瘍細胞の増殖をin vitroにおいて少なくとも約15回の集団倍加(PD)にわたって支持する、請求項1から29のいずれかに記載の細胞培養培地。
- 卵巣細胞および/または卵管細胞の増殖をin vitroにおいて少なくとも約15回の集団倍加(PD)にわたって支持する、請求項1から17および30から36のいずれかに記載の細胞培養培地。
- 請求項1から38のいずれかに記載の細胞培養培地を調製するためのキットであって、構成成分(a)〜(k)を含む第1の1つまたは複数の容器と、構成成分(l)〜(p)および場合によってエストロゲンを含む第2の1つまたは複数の容器を含み、それにより、該第1の容器の内容物と該第2の容器の内容物とを適切な割合で組み合わせることにより該細胞培養培地がもたらされるキット。
- (a)細胞内cAMPを増加させる作用物質;
(b)上皮成長因子(EGF);
(c)ヒドロコルチゾン;
(d)インスリン;
(e)血清;および場合によって、
(f)エストロゲン
を含む細胞培養培地補助剤であって、
該補助剤を基本細胞培養培地に添加することによって請求項1から38のいずれかに記載の細胞培養培地がもたらされる補助剤。 - 構成成分(a)〜(p)および場合によってエストロゲンを組み合わせることを含む、請求項1から38のいずれかに記載の細胞培養培地を調製する方法。
- 構成成分(a)〜(k)が第1の1つまたは複数の容器から添加され、構成成分(l)〜(p)、および場合によってエストロゲンが第2の1つまたは複数の容器から添加される、請求項41に記載の方法。
- 卵巣細胞および卵管細胞を培養するための方法であって、
(a)卵巣または卵管から卵巣細胞および/または卵管細胞を得るステップと、
(b)該細胞を請求項1から17、30から36、および38のいずれかに記載の細胞培養培地中で培養するステップと
を含み、該細胞培養培地により、卵巣上皮細胞および卵管上皮細胞の少なくとも15回の集団倍加が支持される方法。 - 腫瘍細胞を培養するための方法であって、
(a)腫瘍細胞を得るステップと、
(b)該腫瘍細胞を請求項1から17、18から29、および37のいずれかに記載の細胞培養培地中で培養するステップと、
を含み、該細胞培養培地により、該腫瘍細胞の少なくとも15回の集団倍加が支持される方法。 - 培養プレートを、最初の1〜5回の細胞継代にわたってトリプシンで処理し、それにより、癌細胞を富化するステップをさらに含む、請求項44に記載の方法。
- 前記腫瘍細胞が、卵巣癌細胞、ヒト乳癌細胞、膵癌細胞、腺様嚢胞癌細胞、および/または肺または胃腸管由来の神経内分泌腫瘍(カルチノイド)細胞である、請求項44に記載の方法。
- 前記腫瘍細胞が卵巣癌細胞である、請求項46に記載の方法。
- 前記卵巣癌細胞が、患者の一次固形卵巣組織または腹水から、または動物モデルにおいて成長させた腫瘍異種移植片から得られる、請求項47に記載の方法。
- 前記腫瘍細胞が乳頭状漿液性腫瘍細胞、明細胞腫瘍細胞、癌肉腫細胞、または未分化胚細胞腫細胞である、請求項47に記載の方法。
- 前記細胞培養培地が、約100nMの17−ベータ−エストラジオールと等しい効力の量のエストロゲンをさらに含み、前記腫瘍細胞が類内膜腫瘍細胞または粘液性腫瘍細胞である、請求項48に記載の方法。
- 前記細胞培養培地により、細胞の増殖が、in vitroにおいて少なくとも15、25、または35回の集団倍加(PD)にわたって支持される、請求項39に記載のキット。
- 請求項1から17、30から36、および38のいずれかに記載の細胞培養培地と、
細胞であって、該細胞が、不死化卵巣細胞および/または前記卵管細胞である、細胞と
を含む組成物。 - 前記不死化細胞がテロメラーゼの触媒サブユニットを過剰発現している、請求項52に記載の組成物。
- 前記テロメラーゼ触媒サブユニットが、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)である、請求項53に記載の組成物。
- 前記卵巣細胞が卵巣上皮細胞である、請求項43に記載の方法。
- 前記卵巣上皮細胞の起源が卵巣表面である、請求項55に記載の方法。
- 前記卵管細胞が卵管上皮細胞である、請求項43に記載の方法。
- 前記卵管上皮細胞の起源が卵管の采状表面である、請求項57に記載の方法。
- 候補治療剤を同定する方法であって、
(a)請求項43から50に記載の方法に従って細胞を培養するステップと、
(b)該細胞を作用物質と接触させるステップと、
(c)該細胞の1つまたは複数の生理的特徴を測定するステップと
を含み、
該細胞の該1つまたは複数の生理的特徴を調節する作用物質が候補治療剤である方法。 - ステップ(a)の細胞を、ステップ(b)の前に試験動物内で成長させることをさらに含む、請求項59に記載の方法。
- 前記細胞が、発癌性形質転換した卵巣細胞および/または卵管細胞である、請求項59および60に記載の方法。
- 前記細胞が原発腫瘍に由来する、請求項59および60に記載の方法。
- 前記原発腫瘍が卵巣腫瘍である、請求項62に記載の方法。
- 前記卵巣腫瘍が、乳頭状漿液性腫瘍、明細胞腫瘍、癌肉腫、未分化胚細胞腫、類内膜腫瘍、または粘液性腫瘍のうちの少なくとも1つである、請求項63に記載の方法。
- 測定される前記生理的特徴が細胞増殖を含み、細胞増殖を阻害する作用物質が候補治療剤である、請求項59から64のいずれかに記載の方法。
- 卵巣細胞の実質的に精製された培養物であって、該卵巣細胞がプローブセットDOK5、CD47、HS6ST3、DPP6、OSBLP3を過剰発現しており、該培養物が少なくとも103個の細胞を含み、該細胞が少なくとも14回の集団倍加を行う能力を有する培養物。
- 卵管細胞の実質的に精製された培養物であって、該卵管細胞がプローブセットSTC2、SFRP1、SLC35F3、SHMT2、TMEM164を過剰発現しており、該培養物が少なくとも103個の細胞を含み、該細胞が少なくとも14回の集団倍加を行う能力を有する培養物。
- hTERTが過剰発現している細胞を含む培養物であって、hTERTの過剰発現が該細胞に少なくとも14回の集団倍加を行う能力を持たせるために十分である培養物。
- hTERTの過剰発現が、前記細胞に少なくとも25回の集団倍加を行う能力を持たせるために十分である、請求項66、67または68に記載の培養物。
- hTERTの過剰発現が、前記細胞に少なくとも35回の集団倍加を受ける能力を持たせるために十分である、請求項66、67または68に記載の培養物。
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