JP2014503575A - 超常磁性のナノ粒子を用いて、興味対象生成物のリポソームからの放出をモニターする方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a) T2*を測定する工程、
b) Tmで又はTm以上でリポソームを加熱する工程、
c) 工程b)の後にT2*を測定する工程、
d) 工程a)および工程c)から得られたT2*値からr2*値を得る工程、
e) Tmで又はTm以上での加熱工程の後に、Tmで又はTm/r2*以上での加熱工程の前に、r2*の比率を決定する工程、ここで1.5以上の比率はリポソーム膜透過性上昇、および興味対象生成物の付帯的な放出を示唆し、その結果、リポソーム膜透過性上昇をモニターする工程。
a) T2*およびT1を測定する工程、
b) Tmで又はTm以上でリポソームを加熱する工程、
c) 工程b)の後にT2*およびT1を測定する工程、
d) 工程a)および工程c)から得られたT2*およびT1値からr2*およびr1値を得る工程、
e) Tmで又はTm以上での加熱工程の前および後に、r2*/r1の比率を決定する工程、ここで2以上の加熱工程b)の前のr2*/r1の比率及び加熱工程b)の後のr2*/r1の比率はリポソーム膜透過性上昇、および興味対象生成物の付帯的な放出を示唆し、その結果、リポソーム膜透過性上昇をモニターする工程。
MR画像中の異なる組織のコントラストを発生するのは主にこれらの2つの緩和過程の相対的な大きさである。及び用いられるパルスシーケンスの詳細に依存して、(即ち、エコー時間TE(それはパルス及びエコーの頂点間の時間、繰り返し時間TR(それはパルス間の時間である))重みは主としてT1またはT2の差を示すために画像に加えることができる。
1/Ti,平均 = 1/Ti,中間 + ri x [CA] (i=1または i=2)、から決定され、ここで、Ti,平均は測定された緩和時間であり、Ti,中間は、造影剤を持たない関心領域の緩和時間である。そして、[CA]は造影剤濃度を指す(Martina et al., J. Am. Chem. Soc. 2005; 127:10676-10685)。次に、緩和能は造影剤濃度当たりs-1で表現される。造影剤は縦方向及び横方向の緩和能を増加する(「T1に比重を置いた(T1-weighted)」画像又は「T2に比重を置いた(T2-weighted)」画像)。しかしそれらの性質、適用された磁界および用いられるパルスシーケンスに依存する可変な程度である。
それらの高い磁化率により、超常磁性のナノ粒子はさらに局所的磁界不均質を発生し、かくして、角度で静磁界に適応したスピン中の位相のコヒーレンスの損失に導く。この現象は、横方向磁化の迅速な損害の結果と共に別の型の緩和時間(T2*)(それは一般に磁界不均質およびスピンスピン横方向緩和の組み合わせによる)に帰着する。T2*は次のように定義される:1/T2*= 1/T2 + 1/T不均一性 = 1/T2 + γΔB0、ここで、γは磁気回転比を表し、及びΔB0はローカルに可変なフィールドの強さの差を表わす。超常磁性体造影剤は、次に、T2*に比重を置いた走査に高度に敏感である。
a) T2*を測定する工程、
b) Tmで又はTm以上でリポソームを加熱する工程、
c) 工程b)の後にT2*を測定する工程、
d) 工程a)および工程c)から得られたT2*値からr2*値を得る工程、
e) Tmで又はTm以上での加熱工程の後に、Tmで又はTm/r2*以上での加熱工程の前に、r2*の比率を決定する工程、ここで1.5以上の比率はリポソーム膜透過性上昇、および興味対象生成物の付帯的な放出を示唆し、その結果、リポソーム膜透過性上昇をモニターする工程。
a) T2*およびT1を測定する工程、
b) Tmで又はTm以上でリポソームを加熱する工程、
c) 工程b)の後にT2*およびT1を測定する工程、
d) 工程a)および工程c)から得られたT2*およびT1値からr2*およびr1値を得る工程、
e)T mで又はTm以上での加熱工程の前および後に、r2*/r1の比率を決定する工程、ここで2以上の加熱工程b)の前のr2*/r1の比率及び加熱工程b)の後のr2*/r1の比率はリポソーム膜透過性上昇、および興味対象生成物の付帯的な放出を示唆し、その結果、リポソーム膜透過性上昇をモニターする工程。
より具体的には、r2*/r1比率は、1.2〜20まで一様でない、好ましくは、r2*/r1比率は2以上、より好ましくは、5以上である。
二重層を構成する両親媒性分子は脂質(特に、リン脂質)である。リン脂質分子の両親媒性の特性は、リン酸基およびグリセロールグループから構成された親水性ヘッド、および1つ又は2つの脂肪酸から構成された疎水性テールの存在にある。
ホスファチジルコリンの場合には、脂肪アシル鎖の構造および構成が特別の関連性がある(Koynova et al., Biochim. Biophys. Acta 1998;1376:91-145)。
脂肪酸の鎖長の増加は主要な相転移温度を増加する。例えば、9から24炭素原子までわたる鎖長を持った飽和したジアシルホスファチジルコリンについては、Tmが1/n(nは脂肪のアシル鎖中の炭素原子の数である)に線形従属することが示された。即ち、Tmが、n=16に対する41℃からn=24に対する80℃まで増加する。
コレステロールの存在がリポソームの浸透性を減少させて、血漿または血清蛋白質の攪乱効果からリポソームを保護することが一般に認識されるので、コレステロールはリポソームの脂質の配合物中でしばしば用いられる。
コレステロール分子は3つの良く識別された部位を含んでいる:小さな極性水酸基、剛性プレート様のステロイド環およびアルキル鎖テールである。コレステロールが膜へインターカレートする場合、その極性水酸基はホスファチジルコリン分子のグリセロール骨格部位の中間近くに位置した(Kepczynski M. et al., Chemistry and Physics of Lipids, 2008;155:7-15)。脂質二重層中へのコレステロールの様な改質剤の取り込みは、リポソーム膜の構造的又は物理的性質(その構成、自由容積、厚さ、流動性(粘度)および極性(疎水性)等)を大幅に変える。
Papahadjopoulosらは、血清または血漿に接している場合、リポソームとしてのコレステロールの保護効果が脂質膜の物理的状態、即ち「ゲル」又は「流体」に依存することを示した。ゲル状態では、コレステロールの存在は、二重層内でリン脂質アシル鎖の配列するパラメーターに影響し、捕捉された分子の放出を増強する。流体状態では、コレステロールはリポソームを安定させて、カプセル化された物質の漏出を予防する(Papahadjopoulos et al. Pharm. Research, 1995;12(10):1407-1416)。
ホスファチジルコリンは、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジステアリルホスファチジルコリン(DSPC)、水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)、モノパルミトイルホスファチジルコリン(MPPC)、モノシテアリルホスファチジルコリン(MSPC)およびそのいかなる混合物から選択されてもよい。
特別の実施形態では、先に特定された化合物のモル比には100:50:30:6または100:33:27:7が好適である。
特別の実施形態では、先に特定された化合物のモル比には100:12:5が好適である。
特別の実施形態では、先に特定された化合物のモル比には100:12:5が好適である。
簡単に云えば、脂質フィルム水和法では、脂質は有機溶媒(クロロホルム等)中で可溶化する。溶液の均質化の後、有機溶媒は窒素気流下で蒸発する。次に、かくして得られた乾燥した脂質フィルムは、100から800nmにわたる寸法を持った多層ベシクルの生成に導く主要な相転移温度Tm以上の温度で水性媒体によって水和される(Mills J.K. et al. Methods in Enzymology 2004;387:82-113)。脱水及び再水和のサイクルは、それぞれに凍結し(液体窒素中で)および溶液を解凍する(Tm以上で温度で)ことによって、単層の小胞の形成により水性の内部体積を増加することを可能にする。次に、小胞に寸法較正を可能にするプロセスが、均質の粒度分布を得るために適用される。音波処理は20から50nmにわたる寸法で小さな単層のベシクル(Small Unilamellar Vesicles)(SUV)を製造する。しかし、フィルター膜による押し出し法は、フィルター気孔の寸法に依存して、50から500nmにわたる寸法で大きな単層のベシクル(Large Unilamellar Vesicles)(LUV)を製造する。Tm以上の温度で両方のプロセス(音波処理及び押出)を実行しなければならない。
生物学的適合のコーティングは、生物学的適合の懸濁液(生理液(血液、血漿、血清、など)、いかなる等張媒体又は生理的媒体(例えばグルコース(5%)および(または)NaCl(0.9%)を含んでなる媒体))でのリポソーム安定性を許容するか容易にする。それは医薬投与に必要である。
そのような生物学的適合のコーティングは表面処理剤でリポソームを処理することにより得られる。
安定性は生体適合性の懸濁液でリポソームの動的光散乱によって確認されてもよい。
前記コーティングは、有利にはリポソームの完全性を生体内で保存し、その生物学的適合性を保証するか、改善し、及び、その随意の機能化(例えばスペーサー分子、生体適合性のポリマー、標的化剤、タンパク質、などで)を促進する。
非生物分解性のコーティングの例は、糖(アガロース等)、飽和炭素ポリマー(ポリエチレンオキサイド等)、架橋された又はされない、変性された又はされない(ポリメタクリレート又はポリスチレン等)、同様にそれらの組み合わせ、から成るグループ中で選択された一以上の材料又は表面処理剤である。
標的化剤の構成が標的との相互作用に責任があるように、前記標的化剤の密度は当業者によって知られた方法によって注意深くコントロールされることになっている。その高密度は確かに標的化剤構成を混乱させ、及び、その結果として標的細胞によるその認識を混乱させる可能性がある。(例えば、J. A. Reddy et al. Gene therapy 2002;9:1542; Ketan B. Ghaghada et al. Journal of Controlled Release 2005;104:113を参照)。更に、高い標的剤密度は、脈管構造における循環中に細網内皮系(RES)によるリポソームクリアランスを容易にし得る。
「ナノ粒子の寸法」、「ナノ粒子の最大の寸法」という用語は、ここでは、「ナノ粒子のコアの最大の寸法」を指す。
「コア」は単一粒子(結晶または結晶子)又は粒子(結晶または晶子の集合体)の集合体を指すことができる。
透過型電子顕微鏡(TEM)又は低温TEMはコアが単一粒子にある場合に、ナノ粒子、とりわけコアの寸法を測定するために有利に用いることができる(図2を参照)。同様に、動的光散乱(DLS)は前記コアが粒子、又は粒子の集合にある場合に、溶液でのナノ粒子のコアの流体力学的径を測定するために用いることができる。寸法尺度を比較し、かつ前記寸法を確認するために、これらの2つの方法は、互いの後にさらに用いられてもよい。
物質は無機質原料である。
ターゲットとされたサイト上で一度送達されると、粒子の形がそれらの「生体適合性」に影響を及ぼす場合があるので、全く均質な形を有する粒子が好ましい。したがって、薬物動態学的理由で、形として本質的に球状、円形、卵形であるナノ粒子が好ましい。球状か円形の形が特に好ましい。
それは、有利には、約2nm及び約50nmの間で、例えば約2nm及び30nmの間で又は約2nm及び約20nmの間で、好ましくは約2nm及び約10nmの間で、典型的には、約5nm及び約10nmの間で、約4nm及び約8nmの間で又は約30nm及び50nmの間で包含される。
静電コーティングは有利には、「十分なコーティング」(完全な単層)である。これは、ナノ粒子のすべての表面上で適切で均質の電荷を生み出す分子のまさに高密度の存在を意味する。
コーティングは無機又は有機表面被覆になりえる。
無機の場合、コーティングは、オキシド、水酸化物およびオキシヒドロキシドから成るグループから選択されてもよい。無機物被覆は例えば、ケイ素、アルミニウム、カルシウムおよび(または)マグネシウムを包含してもよい。
例えばマグネシウム、カルシウムからなるグループから選択された無機の剤は、pH 7でプラス荷電(+20mV以上)をナノ粒子の表面へもたらすであろう。
別の実施態様において、ケイ素グループはpH 7で負電荷(-20mV未満の )をナノ粒子の表面へもたらすために用いられてもよい。
表面被覆有機分子には2つのグループ、RおよびXがある。Xの機能はナノ粒子表面と相互作用することである。そして、Rの機能はナノ粒子の表面にその特有性を与えることである。
Xは、例えばカルボキシラート(R-COO -)、シラン(R-Si(OR)3)、ホスホン(R-PO(OH)2)、リン酸(R-O-PO(OH)2)、ホスフェート(R-PO43 -)およびチオール(R-SH)グループから選択されてよい。
Rは生理的なpHで水性懸濁液におけるナノ粒子に少なくともに電子的な表面電荷をもたらす。
Rがプラス荷電をナノ粒子の表面へもたらす場合、Rはアミン(NH2-X)であってよい。
Rが負電荷をナノ粒子の表面へもたらす場合、Rはホスフェート(PO43(X)又はカルボキシラート(COO)X)であってよい。
ナノ粒子表面へ負電荷(-20mV未満)を付与する有機物被覆は、例えばポリリン酸塩、メタ燐酸塩、ピロ燐酸塩、など、又は例えばクエン酸塩又はジカルボン酸(特にコハク酸)から選択されてもよい。
再び、静電コーティングは有利には「十分なコーティング」である。
この立体的なグループは、生物学的適合の懸濁液(生理液(血液、血漿、血清、など)、いかなる等張の媒体又は生理学的媒体(例えばグルコース(5%)および(または)NaCl(0.9%)を含んでなる媒体)でのナノ粒子安定性を増加する。
超常磁性の材料は、例えば、鉄、ニッケル、コバルト、ガドリニウム、サマリウム、ネオジムを、好ましくはオキシド、水酸化物又は金属の形で、及びそのいかなる混合物をも含む。
特別の例において、コアを形成する物質は、酸化第一鉄及び酸化第二鉄から成るグループから選択される。本発明の好ましい実施態様において、オキシドナノ粒子は磁鉄鉱またはマグヘマイトからなる。
混合原料も磁界及びナノ粒子の間の相互作用を最適化するために用いることができる。固溶体形態(いくつかの材料の任意の混合物としての当業者によって周知)(CoFe2O4)は、例えば混合材料として用いることができる。混合解除された相中の固溶体形態(例えば、Fe2O3/Co)は、さらに用いることができる。
非限定的な例のリストは、抗微生物薬(抗菌剤、特に抗生物質、抗ウイルス物質および抗真菌剤を含む);抗腫瘍剤、特に抗癌性化学療法剤(細胞増殖抑制等)、細胞毒性剤、及び癌を治療するように意図された他の生物学的又は無機的生成物(治療上の核酸等)、特にミクロのRNA(miRNA)、短鎖ヘアピンRNA(shRNA)および/または小型干渉RNA(siRNA)を含む。
本発明における薬物はさらにプロドラッグであってもよい。
そのような興味対象生成物のいかなる組み合わせもさらに用いられてもよい。
熱感受性リポソーム、熱感受性リポソームの集団又は発明の本方法によって組成物を用いることに対して、生成物を用いるための指示を提供するラベリングノーティス(labelling notice)をさらに提供することができる。
5nmに集中した粒度分布を持った酸化鉄ナノ粒子は、(US4329241; Bacri et al., J. Magn. Magn. Mat., 1986; 62:36-46)から適用された、鉄および鉄イオンの共沈によって合成される。
簡単には、反応させる媒体は、制御されたイオン強度を持った、pH 12で維持された硝酸ナトリウム3Mの溶液に存する。モル比Fe(III)/Fe(II)が2と等しい第一鉄及び第二鉄イオンの3M硝酸ナトリウム溶液を調製し、混合下に反応させる媒体に徐々に添加する。それは急速に黒くなる。次に、全体の溶液は混合下に周囲温度で一晩熟成する。
次に、フェライトナノ粒子は磁石上で沈殿する。そして、上澄液は反応媒体を除くために除去する。次に、ナノ粒子表面のペプチゼーション(酸性化)および酸化は、激しい混合の下、室温で硝酸HNO3 2Mの溶液で顆粒剤を希釈することにより実行する。
ナノ粒子コアの酸化は、激しい混合下に高温(>90℃)で硝酸鉄(III)溶液中での顆粒剤の培養によって実行する。
次に、ナノ粒子は遠心分離によって洗浄する。
顆粒剤は、酸化鉄中で150g/lの濃度に達する様に、酸性の水中で最終的に希釈する。その溶液は超音波処理によって均質化する。そして次に、pHはpH 2に調節する。
ナノ粒子のモルフォロジー(寸法及び形)は透過型電子顕微鏡によって観察した(図1)。酸化鉄ナノ粒子の結晶構造はX線回折分析によって確認した。
ヘキサメタリン酸ソーダの懸濁液を、実施例1(添加されたヘキサメタリン酸ソーダの量はLD50/5未満)からの酸化鉄ナノ粒子の懸濁液に添加する。そして、懸濁液のpHは6及び8の間に含まれるpHに調節する。
電子的な表面電荷(<-20mV)はZetasizer NanoZS(Malvern Instruments)上でゼータ電位測定によって決定される。該測定は、633nmのHeNeレーザーを用いて、0.2〜2g/lの間で可変な濃度のナノ粒子懸濁液上で実行し、ナノ粒子は、6及び8の間に含まれるpHで水性媒体中に懸濁する。
3.1. 酸化鉄ナノ粒子をカプセル化する熱感受性リポソーム(TLS)の調製:
酸化鉄ナノ粒子をカプセル化する熱感受性のリポソームは、脂質のフィルム再水和方法を用いて調製される(Bangham et al., J. Mol. Bio., 1965;13:238-252; Martina et al., J. Am. Chem. Soc., 2005;127:10676-10685):
a) 脂質はクロロホルム中で可溶化する。クロロホルムは、最終的に窒素フローの下で蒸発する。脂質のフィルムの再水和は、実施例2において記載されている酸化鉄溶液の2mLで55℃で実施する。その結果、脂質の濃度は50mMである。
以下の脂質の組成物を用いた:ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)、コレステロール(Chol)およびPEG化ジステアリルホスファチジルエタノールアミン(DSPE-PEG2000)をモル比100:33:27:7(DPPC:HSPC:Chol: DSPE-PEG2000)。
b) 次に、凍結融解サイクルは、液体窒素および55℃で調整された水浴へ連続的にサンプルを注入することにより、20回実行する。
c) Thermobarrel押出機(LIPEXTM Extruder, Northern Lipids)は制御された温度および圧力の下で、ナノ粒子含んでいるリポソームの寸法を検定するために用いた。いかなる場合でも、押出は2から20バールにわたる圧力の下で55℃で実行した。
d) 非カプセル化粒子の分離はセファクリルS1000濾過ゲル上でサイズ排除クロマトグラフィーによって実行する。
e) 溶出プロフィルは、Che et al., Journal of Chromatography B, 1995;669:45-51, and Nigo et al., Talanta, 1981;28:669-674から適用された第一鉄イオン/フェナントロリンの比色定量反応を介して(図2)、UV可視分光法(Cary 100 Varian spectrometer)による磁気的なナノ粒子の定量化によって決定する。リポソーム含有画分を収集する(図2、第1のピーク)。リポソームにおける酸化鉄の濃度は1から2.5g/lまでわたる。組成物のTmは43℃である。
酸化鉄含有リポソーム内部でのドキソルビシン(DOX)の活性な装填を、pH勾配を介して用いた。一旦リポソームの内部水性コア中に閉じ込められたならば、ドキソルビシン漏出はアンモニウム塩でのアントラサイクリン分子の錯化によって防がれる:
a) 酸化鉄含有リポソーム(実施例3.1において説明した様に調製した)は、1時間、およそpH5で、アンモニウム水素ホスフェート(NH4)2HPO4の120mM溶液中で培養する。
b) 透析工程は、外側の(NH4)2HPO4を除くために、HEPES緩衝液食塩水(HEPES 20mM、NaCl 140mM、pH 7.4)中で実施する:4℃で一晩、1回、次に周囲温度で3時間、2回(250*250*250の最終希釈比)。
c) 1.55mg/mLのドキソルビシン濃度を得るために、NaCl 140mM中7mg/mLのドキソルビシン原液 284μLを、酸化鉄含有リポソーム溶液の1mLに添加する。組成物は一晩の間、37℃で培養する。
d) 次に、カプセル化されていないドキソルビシンを、セファデックスG50濾過ゲル(カラム高さ: 5cm; 溶離剤: HEPES緩衝液食塩水)上のサイズ排除(size-exclusion)クロマトグラフィーによって除く。ゲル上に析出した、ドキソルビシンが担持されたリポソームの体積は700μLである。500μLの画分を収集する。
e) 溶出プロフィルは、各画分中のドキソルビシン濃度の定量により実施する(480nmでの吸光度測定による)。リポソーム/ドキソルビシン含有画分を収集する。
f) 最終のリポソームドキソルビシン濃度は、UV可視分光法によって480nmでのドキソルビシンの吸光度を測定することにより決定する。
工程a)で以下の脂質の組成物を用いた以外は、前述の操作(実施例3.1を参照)を続けた:水素化大豆ホスファチジルコリン(HSPC)、コレステロール(Chol)およびPEG化ジステアリルホスファチジルエタノールアミン(DSPE-PEG2000)が、モル比100:65:7(HSPC:Chol:DSPE-PEG2000)で。
工程a)、b)およびc)において、脂質フィルムの再水和、解凍サイクルおよび押出し法は、62℃で実施する。
図3は、実施例3.2において調製されるようなドキソルビシン(DOX)担持酸化鉄を含んでいる熱感受性リポソーム(TSL)の放出動力学プロファイルを示す。ドキソルビシン放出は、温度及び時間の関数として、蛍光測定によって決定する。
ドキソルビシン放出プロファイルは、ドキソルビシンの自動消光特性を用いて特徴付けられる(Jeffrey K. Mills et al. Biochimica et Biophysica Acta 2005; 1716:77-96)。簡単には、DOXがリポソームの内部で高度に濃縮される場合、蛍光強度はクエンチされるが、DOXが外部媒体中で放出され、次に、希釈される場合は、蛍光強度は増加する。
蛍光測定は、λ励起 = 480nmおよびλ発光 =590nmで、Cary Eclipse (Varian)分光光度計で実施する。リポソームは、50%体積のウシ胎仔血清(FBS)で補足された、リン酸緩衝液食塩水(PBS)中で200倍希釈する。最初の蛍光強度I0は、時間t=0、およびT0=25℃で測定した。温度T(37℃、41℃、43℃、45℃)に達する様に、薄められたサンプルを水浴中に注入する。異なるタイムポイントにおいては、サンプルが最初の温度(T0)に達する様に氷浴中に収集し注入する。次に、蛍光強度I放出光を測定する。次に、トリトンTX100(蒸留水中の10%体積)の0.1%体積を、ドキソルビシンの総量に対応するI全量を得るために、脂質膜をばらばらに壊すために添加する。t=0およびT0=25℃で存在するDOXの外側の%は、I0/I全量として計算される。そして、DOXの放出された%(温度の関数)は、I放出光/I全量として計算される。
r1およびr2*の緩和能の決定は、緩和時間T1およびT2*の測定によって行った。その測定は、1.5テスラの臨床用MRI Philips Achievaを用い、ヘッドSENSEコイルを使用し、熱感受性のリポソーム(TSL)(実施例3.1)および非熱感受性のリポソーム(NTSL)(実施例3.3)(両方とも5nmサイズの酸化鉄ナノ粒子を装填したもの)について行ない、およびカプセル化されていない酸化鉄ナノ粒子(遊離NP(又は、遊離NP))(実施例1)についても行なった。各サンプルの一連の稀釈は、酸化鉄における40、20、10および5μg/mLにそれぞれ対応して行なった。稀釈はアガロースゲル(4%)中で行った。サンプルは、最初に37℃、その後45℃で、水浴を使用して加熱した。また、各稀釈の緩和時間T1およびT2*は37℃、および45℃で測定した。
T1測定については、反転回復法シーケンスを使用した(TR/TI最初/ΔTI = 2000/50/ 100ミリセカンド、TE = 10ミリセカンド、NEX = 2、FOV =(1×1×3 mm)3、マトリックス= 128×168、ここで、TR =繰り返し時間、IT = 反転時間、TE =エコー時間、NEX =励起回数、FOV =vueのフィールド)。
速い勾配エコーシーケンスを、フリップ角= 40、10エコー、TR/TE最初/ΔTE = 300/10 / 10ミリセカンド、NEX = 4で、T2*測定に使用した。
図4は、主要なゲル-液晶相転移温度Tm(この温度で、脂質膜はその後流体状態にある)以上の温度に対応する45℃で加熱することによる緩和能値r1(図4A)およびr2*(図4B)の修正(modification)を示す。
加熱により、r2*/r1値の驚くほど著しい減少が、TSLについて実証される。しかし、NTSLおよび遊離NPとしての重要な進展は観察されない(k値を参照)。
図6において、超音波実験は、1.5TのMRIシステムのベッドに組み込まれた、手作りのモノラル焦点超音波振動子(Imasonic SA)で行なった。変換器は、1.5MHzのシヌソイド(sinusoidal)のシグナルと共に、80mmの焦点距離を有している。加温は60秒の間に20Wの音響出力で行なった。
アガロースゲル(4% - 2%シリカ)に含まれた酸化鉄ナノ粒子(20μg/ml)を含んでいるTSLを使用した。
加熱により、熱感受性リポソームは、HIFU焦点(赤い矢印)ではっきり目に見える変化と共に、正確なMR信号およびT2*緩和時間増強を示した。平均では、ポジティブな増強は約51%であった。加温の前にT2*は4.9±0.4ミリセカンドで、HIFU加熱の後に54±31.4ミリセカンドまで増加した(赤い矢印)。
Claims (13)
- リポソームであって、pH 6及び8の間の水性媒体中で測定されたときに、その静電気表面電荷は−20mV未満又は+20mV以上であり、超常磁性のナノ粒子をカプセル化する熱感受性の脂質膜を含んでなり、リポソーム膜透過性上昇および興味対象生成物の付帯的な放出をモニターする方法で使用するためのリポソームであり、該方法は、次の工程:
a) T2*を測定する工程、
b) Tmで又はTm以上でリポソームを加熱する工程、
c) 工程b)の後にT2*を測定する工程、
d) 工程a)および工程c)から得られたT2*値からr2*値を得る工程、
e) Tmで又はTm以上での加熱工程の後に、Tmで又はTm/r2*以上での加熱工程の前に、r2*の比率を決定する工程、ここで1.5以上の比率はリポソーム膜透過性上昇および興味対象生成物の付帯的な放出を示唆し、その結果、リポソーム膜透過性上昇をモニターする工程、を含んでなる、リポソーム。 - リポソームであって、pH 6及び8の間の水性媒体中で測定されたときに、その静電気表面電荷は−20mV未満又は+20mV以上であり、超常磁性のナノ粒子をカプセル化する熱感受性の脂質膜を含んでなり、リポソーム膜透過性上昇および興味対象生成物の付帯的な放出をモニターする方法で使用するためのリポソームであり、該方法は、次の工程:
a) T2*およびT1を測定する工程、
b) Tmで又はTm以上でリポソームを加熱する工程、
c) 工程b)の後にT2*およびT1を測定する工程、
d)工程a)および工程c)から得られたT2*およびT1値からr2*およびr1値を得る工程、
e) Tmで又はTm以上での加熱工程の前および後に、r2*/r1の比率を決定する工程、ここで2以上の加熱工程b)の前のr2*/r1の比率及び加熱工程b)の後のr2*/r1の比率はリポソーム膜透過性上昇および興味対象生成物の付帯的な放出を示唆し、その結果、リポソーム膜透過性上昇をモニターする工程、を含んでなるリポソーム。 - リポソームが、加熱工程b)の間に、T2*、又はT2およびT2*を測定する少なくとも1つの工程をさらに含んでなる請求項1で規定される方法で使用するためである、請求項1に記載のリポソーム。
- リポソームが、加熱工程b)の間に、T2*およびT1、および随意にT2を測定する少なくとも1つの工程をさらに含んでなる請求項2で規定される方法で使用するためである、請求項2に記載のリポソーム。
- Tmが39℃及び45℃の間にある、前の請求項のいずれか1つに記載のリポソーム。
- 熱感受性の脂質膜が、少なくともホスファチジルコリンを含んでなる、前の請求項のいずれか1つに記載のリポソーム。
- 熱感受性の脂質膜が、さらにコレステロールを含んでなる、請求項5に記載のリポソーム。
- 熱感受性の脂質膜が、さらにジステアリルホスファチジルエタノールアミン−メトキシポリエチレングリコールを含んでなる、請求項6または7に記載のリポソーム。
- リポソームの最大の寸法が50〜500nmの間、好ましくは50〜250nmの間である、前の請求項のいずれか1つに記載のリポソーム。
- ナノ粒子が、カルボン酸、ホスフェートおよびアミン剤から選択された剤で静電気的に又は共有結合で完全にコーティングされている、前の請求項のいずれか1つに記載のリポソーム。
- ナノ粒子が磁鉄鉱および(または)磁赤鉄鉱の様な酸化鉄から調製されている、前の請求項のいずれか1つに記載のリポソーム。
- ナノ粒子の最大の寸法が2〜30nmの間、好ましくは2〜20nmの間である、前の請求項のいずれか1つに記載のリポソーム。
- 興味対象生成物が、治療上の核酸、細胞増殖抑制化合物および細胞毒性化合物から選択される、前の請求項のいずれか1つに記載のリポソーム。
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