JP2014224093A - ファージディスプレイ法による花粉症アレルギーの減感作療法ワクチン - Google Patents
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Abstract
【解決手段】花粉アレルゲン特異的IgE抗体エピトープ含有ペプチドを表面上に提示したファージを有効成分として含む花粉症の予防又は治療用ワクチン。
【選択図】図7
Description
1.材料と方法
1)Cry j 1特異的IgE抗体エピトープペプチドをg8pに提示させるためのベクターの構築
i) Cry j 1特異的IgE抗体エピトープ遺伝子断片の設計と合成
Cry j 1特異的IgE抗体エピトープ(VHPQDGDA:配列番号3)の遺伝子断片を設計し、この遺伝子断片をMBL(医学生物学研究所:Nagoya)で合成し、購入した。
以前、Perhamらはプラスミドベクターを用いた発現系を利用して高抗原提示率のファージを作製したことを報告した(Malik P., et al., J. Mol. Biol., 1996年, Vol. 260, pp. 9-21)。この方法に準じて、新たなプラスミドベクター(pGEX-g8p)を作製した。
構築したベクターを大腸菌TG-1 recOに形質転換し、得られた形質転換体にヘルパーファージであるM13KO7をMOI = 10で重感染させた。その後、形質転換体を100μg/mlアンピシリンと200μg/mlカナマイシンを含む2TY(2TYAK)培地で12時間培養し、得られた細胞上清から、ファージを精製した。
作製したファージを、15%ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動に供した。SDS-PAGE後、Silver Stain II Kit(Wako)を使用し、銀染色を行った。
作製したファージを、電子顕微鏡を用いて撮影した。
作製したファージを、ELISA法を用いて検出した。96穴プレートに、作製したファージを1011 virionでコートし、ビオチン化した抗M13抗体(希釈倍率1:2000)を加えた。10%Tween20/PBSで洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識抗マウスIgG一次抗体 (希釈倍率1:2000)を加え、p-ニトロフェニルリン酸ナトリウムを含む基質溶液と反応させ、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダーにより測定した。
1)プラスミドベクターpGEX-g8pへのCry j 1特異的IgE抗体エピトープ遺伝子の導入
図1に示すプラスミドベクターを用いてファージを作製した。以前にコートタンパク質g8p提示においてアミノ酸数が少ない方がファージ発現において効率が良いことが報告されたため、Cry j 1特異的IgE抗体エピトープである8アミノ酸は図2に示す方法でベクターに挿入された。図2において、Cryj1-7/1#1クローンは、Cry j 1特異的IgE抗体エピトープの挿入位置に対してN末端側のコートタンパク質g8pのアミノ酸が1個欠失しており;Cryj1-7/1#2クローンは、Cry j 1特異的IgE抗体エピトープの挿入位置に対してC末端側のコートタンパク質g8pのアミノ酸が1個欠失しており;Cryj1-6/2クローンは、Cry j 1特異的IgE抗体エピトープの挿入位置に対してN末端側のコートタンパク質g8pのアミノ酸が1個欠失し、且つC末端側のコートタンパク質g8pのアミノ酸が1個欠失している。
図2に示す方法で挿入した4種類のベクターを用いて大腸菌TG-1 rec Oに遺伝子導入し、ヘルパーファージM13KO7を重感染させてハイブリッドファージを作製し、SDS-PAGEによりg8p分子を分離しそのN末アミノ酸配列を決定し、挿入エピトープが組み込まれているg8pとヘルパーファージ由来の野生型g8p分子の割合を算定し、ハイブリッドファージ1匹あたりのCry j 1特異的IgE抗体エピトープの提示率を換算した。その結果Cryj1-6/2ファージの場合、SDS-PAGE解析では1匹のファージの有するg8p分子の85%に、又はN末端アミノ酸配列解析では少なくとも1匹のファージの1350分子にCry j 1特異的IgE抗体エピトープが提示されていることがわかった(図3)。
ファージのg8p分子へのペプチド提示はファージの形態に影響するのではないかと考えられたため、電子顕微鏡とELISA法によりファージの形態を調べた。g8pにCry j 1特異的IgE抗体エピトープを提示するファージは野生型ファージと同様に繊維状を保っており(図
4)、抗M13抗体で検出されるエピトープを保っていることがわかった(図5)。
本実験では、ファージミドベクターpCANTAB5Eに組み込まれているg3p遺伝子部分を制限酵素Hind IIIとNot Iで切断し取り除き、その部分にCry j 1特異的IgE抗体エピトープがg8pのN末端に接続するように構築したDNA断片を組み込んでCry j 1-g8p-pCANTAB5Eと呼ぶファージミドベクターを作製した。当該ファージミドベクターを使用し、作製したハイブリッドファージ(以下、「Cry j 1-g8p-ファージ」と称する)をワクチン活性の評価実験に用いた。
1)ファージミドベクターの構築
図6Aにファージミドベクターの構築の模式図を示す。
構築したベクターを大腸菌TG-1 recOに形質転換し、得られた形質転換体にヘルパーファージであるM13KO7をMOI = 10で重感染させた。その後、形質転換体を100μg/mlアンピシリンと200μg/mlカナマイシンを含む2TY(2TYAK)培地で12時間培養し、得られた細胞上清から、ファージ(Cry j 1-g8p-ファージ)を精製した。
日本クレア社から購入したBalb/cマウスを使用した。
図6Bにマウスの免疫スケジュールを示す。
二度目のCry j 1-g8p-ファージ経口投与から14日後(day40)のマウスの血清中に含まれるCry j 1に特異的なIgGを評価した。ELISAプレートを、PBSで希釈した200ngの精製Cry j 1を用いて4℃で一晩コーティングした。次いで、当該プレートを、ブロッキングバッファー(PBS, 1%BSA)を用いて室温で2時間ブロッキング処理に供した。ブロッキング後、ブロッキングバッファーで1:50に希釈したマウスの血清を1ウェル当たり40μl加え、4℃で2時間静置した。2時間の静置後、プレートをPBST(PBS; 0.05%Tween 20)で3回洗浄し、結合したIgG2a抗体を、アルカリフォスファターゼ標識ヤギ抗マウスIgG2a抗体を加え、p-ニトロフェニルリン酸ナトリウムを含む基質溶液と反応させ、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダーにより測定した。
1)Cry j 1-g8p-ファージがファージ表面にCry j 1特異的IgE抗体エピトープを提示している証明実験
この構築法で作製されたCry j 1-g8p-ファージの提示率はSDS-PAGEの分離パターンのイメージ解析から2%以下と評価されたが、このファージを免疫して得られた抗血清が花粉抗原Cry j 1に強い特異的抗体反応を示した事より、エピトープの低い提示率にもかかわらず、このエピトープに特異的な免疫応答を誘導している事を証明した。
Cry j 1-g8p-ファージを経口投与した結果、Cry j 1に対するIgG抗体が誘導された(図6C)。
1.材料と方法
1)マウス
日本クレア社から購入したBalb/cマウスを使用した。
図7Aにマウスの免疫スケジュールを示す。
三度目の感作から14日後(day123)のマウスの血清中に含まれるCry j 1に特異的なIgGを評価するため、96穴イムノプレートにCry j 1を20ng/wellコートし、マウスの血清(1000倍希釈)を加えた。その後、アルカリフォスファターゼ標識一次抗体を加え、p-ニトロフェニルリン酸ナトリウムを含む基質溶液と反応させ、405nmの吸光度をマイクロプレートリーダーにより測定した。
上記のCry j 1-g8p-ファージ経口投与(減感作)、スギ花粉抽出液の腹腔投与(感作)及びCry j 1の経鼻投与によるチャレンジ試験後のマウスについて、惹起された症状(スギ花粉症発作(くしゃみ))をビデオカメラで撮影し、その観察を行った。
1)抗Cry j 1 IgGの誘導
スギ花粉抽出液による三度目の感作から、14日後のマウスの血清中に含まれるCry j 1に特異的なIgGを評価した。その結果、図7Bに見られるように、Cry j 1-g8p-ファージを免疫したマウスの血清ではCry j 1に結合するIgGが誘導されていた。一方、WTファージ又はPBSを免疫したマウスでは、Cry j 1に結合するIgGが誘導されていなかった。
Cry j 1-g8p-ファージ(1×1013v/100μl、1×1012v/100μl、1×1011v/100μl)、WTファージ(1×1012v/100μl)又はPBS100μlの経口投与後、スギ花粉抽出液(150μg/100μl)をAlum(2mg/100μl)と共に腹腔投与したBalb/cマウスに、スギ花粉の抗原であるCry j 1(300 ng/5μl)を経鼻投与し、5分間のくしゃみの回数のカウントを行った。その結果、図7Cに見られるように、Cry j 1-g8p-ファージで前処理されたマウスでは、Cry j 1-g8p-ファージの前処理量に依存的に、統計学的に有意(**: p<0.05)に花粉症の症状の緩和が認められた。
Cry j 1-g8p-ファージを経口投与した結果、Cry j 1に対するIgG抗体が誘導され、当該抗Cry j 1 IgG抗体がスギ花粉(Cry j 1)に特異的なIgEによる好塩基球や肥満細胞の感作の段階を阻害して、アレルギーの発作の症状の緩和(減感作)に働いている可能性を示した。
Claims (4)
- 花粉アレルゲン特異的IgE抗体エピトープ含有ペプチドを表面上に提示したファージを有効成分として含む花粉症の予防又は治療用ワクチン。
- 花粉アレルゲンがCry j 1、Cry j 2及びCry j 3タンパク質から成る群より選択されるスギ花粉アレルゲンである、請求項1記載のワクチン。
- Cry j 1タンパク質特異的IgE抗体エピトープ含有ペプチドが、Asn Gly Asn Ala Thr Pro Gln Leu Thr Lys Asn Ala(配列番号1)で示されるアミノ酸配列、Asn Gly Gly Pro Cys Val Phe Ile Lys Arg Val Ser(配列番号2)で示されるアミノ酸配列、及びVal His Pro Gln Asp Gly Asp Ala(配列番号3)で示されるアミノ酸配列から成る群より選択されるアミノ酸配列を含むペプチドである、請求項2記載のワクチン。
- 花粉アレルゲン特異的IgE抗体エピトープ含有ペプチドがコートタンパク質g8p又はg3p中に挿入されて又はコートタンパク質g8p又はg3pに連結してファージ表面上に提示される、請求項1〜3のいずれか1項記載のワクチン。
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Non-Patent Citations (2)
Title |
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TAKAGI, K. ET AL.: "Determination of Human Linear IgE Epitopes of Japanese Cedar Allergen Cry j 1", BIOL. PHARM. BULL., vol. 28, no. 8, JPN6017034805, August 2005 (2005-08-01), pages 1496 - 1499 * |
泊大介 外3名: "スギ花粉アレルギーの脱感作療法をめざしたM13ファージワクチンの設計", 第85回日本生化学会大会 プログラム・講演要旨集, vol. Vol.85th, JPN6017034804, 2012, JP, pages 7 - 1 * |
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