JP2014195439A - 培養器、培養装置及び培養方法 - Google Patents

Abstract

【課題】スケールアップをしても十分効率的に細胞を掻き取ることが可能な培養器及びこれを備えた培養装置、並びに、培養方法を提供する。
【解決手段】本発明に係る培養器は、細胞を培養するための培地を収容するための容器と、容器内に収容されており、容器の底面上の付着物を掻き取るための、２本以上のブレードあるいは途中に切り欠きを有する１本のブレードと、ブレードを支持する１本又は２本以上のスクレーパと、スクレーパに設けられた第１の磁力発生体とを備える。
【選択図】図３

Description

本発明は、細胞を培養するための培養器及びこれを備えた培養装置、並びに、培養方法に関する。

シャーレ等の容器で細胞を培養し、培養後、容器の底面上に付着した細胞を物理的又は化学的に剥離させて回収する培養方法が広く用いられている。例えば、培養した細胞を体内に戻すことを前提とする再生医療などの分野にあっては、薬品で細胞を剥離する化学的な方法よりも、スクレーパで細胞を掻き取る物理的な方法の方が適している。

特許文献１は細胞を物理的手法で剥離するのに使用する装置を開示する。当該装置は、容器内に挿入されるブレードと、ブレードを容器の底面に押し当てるホルダと、ホルダと共にブレードを回転させる回転手段とを備え、ブレードを容器内に挿入して回転させることにより、底面上の細胞を掻き取る。

特開２００６−３２５５１７号公報

ところで、樹状細胞、間葉系幹細胞及び繊維芽細胞などの付着性細胞を培養するにあたっては、培養後の掻き取り作業を効率的に実施するため、また培養器底面に細胞を均一に付着させるため、底面がなるべく平滑な培養器を使用することが望ましい。他方、底面の面積がなるべく大きい培養器を使用し、一つの培養器で十分量の細胞を培養したいという要求もある。しかし、培養器のサイズが大きくなるに従って底面の優れた平面度を確保することが困難となる傾向にある。

本発明は、上記実情に鑑みてなされたものであり、スケールアップをしても十分効率的に細胞を掻き取ることが可能な培養器及びこれを備えた培養装置、並びに、培養方法を提供することを目的とする。

本発明に係る培養器は、細胞を培養するための培地を収容するための容器と、容器内に収容されており、容器の底面上の付着物を掻き取るための２本以上のブレードあるいは途中に切り欠きを有する１本のブレードと、ブレードを支持する１本又は２本以上のスクレーパと、スクレーパに設けられた第１の磁力発生体とを備える。なお、本発明において、細胞の培養とは、微生物を培養することも含む。

上記培養器によれば、２本以上のブレードあるいは途中に切り欠きを有する１本のブレードを採用したことで、ブレードが容器底面の微細な凹凸及び撓みにより確実に追従でき、効率的に底面上の付着細胞を掻き取ることができる。ブレードの材質としてはある程度の弾性を有し、細胞毒性やその他安全性が担保できれば特に制限はない。具体例として、フッ素ゴム、ブチルゴム、イソブレンゴム、ブタジエンゴム、エチレンプロピレンゴム、熱可塑性エラストマー、ポリエチレン、ポリプロピレン、シリコーンゴムが挙げられ、弾性と滑り性からシリコーンゴムが最も好ましい。

磁力を利用して上記ブレードを遠隔操作するため、容器は以下の構成としてもよい。すなわち、上記容器は、略円形の底面と、スクレーパが有する回転軸孔に挿入するための回転軸とを有し、スクレーパは回転軸が挿入される回転軸孔と、回転軸孔から径方向に延びており１本又は２本以上のブレードを支持する支持部とを有し、支持部に第１の磁力発生体が配置されていてもよい。かかる構成を採用することにより、スクレーパの回転によって底面上の細胞を掻き取ることが可能となる。なお、ここでいう「磁力発生体」とは、磁場の発生源である磁石（永久磁石及び電磁石）に加え、磁場の発生源ではないものの磁石との間に引力が生じる部材（鉄板、コバルト板及びニッケル板など）をも包含する概念である。

上記培養器は、２本のスクレーパを備えてもよい。この場合、一方のスクレーパは、回転軸が挿入される回転軸孔と、回転軸孔から径方向に延びており第１のブレードを支持する支持部とを有し、他方のスクレーパは、回転軸が挿入される回転軸孔と、回転軸孔から径方向に延びており第２のブレードを支持する支持部とを有する。第１の磁力発生体は２つの磁力発生体からなり、第１のブレードを支持する支持部に一方の磁力発生体が配置され、第２のブレードを支持する支持部に他方の磁力発生体が配置されることが好ましい。

上記培養器は、１本のスクレーパを備えてもよい。この場合、スクレーパは、回転軸が挿入される回転軸孔と、回転軸孔から径方向に延びており第１のブレードを支持する第１の支持部と、回転軸孔から径方向であり且つ第１の支持部と反対方向に延びており第２のブレードを支持する第２の支持部とを有し、第１の磁力発生体は一対の磁力発生体からなり、第１の支持部に一方の磁力発生体が配置され、第２の支持部に他方の磁力発生体が配置されることが好ましい。

第１のブレードは回転軸孔の近傍から容器の半径ｒ１の位置まで延びており、第２のブレードは容器の半径ｒ２の位置から先端側まで延びており、半径ｒ１と半径ｒ２は式（１）の条件を満たすことが好ましい。
ｒ１≧ｒ２ ・・・（１）

上記培養器は、ブレードが容器の底面から離隔するように容器内においてスクレーパを浮上させるための浮上機構を更に備えてもよい。かかる構成により、細胞の培養時、培地表面よりも高い位置にスクレーパを浮上させることで、スクレーパに細胞が付着することを防止でき、またブレードから化学物質が培地に溶出することを防止できる。

浮上機構は磁力によってスクレーパを浮上させるものとすることができる。スクレーパに配置された第１の磁力発生体は、スクレーパの遠隔操作のみならず、スクレーパを磁力で浮上させるのにも利用できる。例えば、スクレーパが第１の磁力発生体を有し、この第１の磁力発生体が容器の外側に配置される第２の磁力発生体と共に浮上機構を構成してもよい。あるいは、浮上機構が容器の外側に配置された第２の磁力発生体を更に有し、第１及び第２の磁力発生体の間の磁力によってスクレーパが浮上する構成であってもよい。

容器の底面の直径は３０〜４００ｍｍとすることができる。容器の底面の平面度は好ましくは４０〜８００μｍである。なお、ここでいう平面度はＣＮＣ三次元測定機 株式会社ミツトヨ製 FalcioApex910による測定に基づいて得られる値である。すなわち、容器中心から約１０ｍｍ間毎の同心円上の等間隔各８点を測定し、容器の底面の最も高い所と最も低い所を通る二つの平行な平面を想定し、これらの平面間の距離を平面度とする。

本発明の培養器は閉鎖系において細胞を培養するために使用してもよい。この場合、培養器は、容器の上部開口を塞ぐように配置される蓋材を更に備えてもよい。また、容器は、液体ポートと、通気ポートとを側壁に有することが好ましい。

本発明は上記培養器を備える培養装置を提供する。すなわち、本発明の培養装置は、上記培養器と、培養器の底面上の付着物（細胞、細胞シート、培養中の分泌物等）を掻き取れるようにブレードが底面に接した状態でスクレーパを移動させる駆動ユニットとを備える。上述のとおり、スクレーパは容器の底面上の付着物を掻き取るための２本以上又は途中に切り欠きを有する１本のブレード、及び、第１の磁力発生体を有する。駆動ユニットは、培養器の上方、側方又は下方に配置され且つ当該培養器の底面に沿う方向に移動可能な第３の磁力発生体を有し、スクレーパは第１及び第３の磁力発生体の間の磁力によってブレードが底面に接した状態で移動する。

上記培養装置によれば、２本以上のブレードあるいは途中に切り欠きを有する１本のブレードを採用したことで、容器底面に微細な凹凸及び撓みがあっても、ブレードが十分確実に追従でき、効率的に底面上の付着細胞を掻き取ることができる。駆動ユニットは、容器の外側から磁力によってスクレーパを操作することを可能にするため、閉鎖系で培養するのに有用である。

培養器の容器が上記のように略円形の底面と回転軸とを有する場合、本発明の培養装置は以下の構成とすることができる。すなわち、本発明の培養装置は、当該培養器と、培養器の底面上の付着物を掻き取れるようにブレードが底面に接した状態でスクレーパを移動させる駆動ユニットとを備える。駆動ユニットは、培養器の上方、側方又は下方に配置され且つ回転軸に対応する位置を中心として当該培養器の底面に沿って円運動する第４の磁力発生体を有し、スクレーパは第１及び第４の磁力発生体の間の磁力によってブレードが底面に接した状態で回転する。かかる構成を採用することにより、スクレーパの回転によって底面上の付着物を掻き取ることが可能となる。

本発明は細胞の培養方法を提供する。本発明の培養方法は、（Ａ）容器内にスクレーパを有する培養器に細胞又は培地を供給する工程と、（Ｂ）容器内において細胞を培養する工程と、（Ｃ）培養終了後、容器の底面上の付着物をスクレーパが有するブレードで掻き取る工程と、（Ｄ）培養した細胞を容器から排出する工程とを備える。上記スクレーパは、２本以上又は途中に切り欠きを有する１本のブレード、及び、第１の磁力発生体を有する。（Ｃ）工程において、培養器の上方、側方又は下方に配置した第３の磁力発生体を培養器の底面に沿う方向に移動させることによって、第１及び第３の磁力発生体の間の磁力を駆動力としてスクレーパを移動させると共にブレードで底面上の付着物を掻き取る。

上記培養方法によれば、２本以上のブレードあるいは途中に切り欠きを有する１本のブレードを採用したことで、容器底面に微細な凹凸及び撓みがあっても、ブレードが十分確実に底面に追従でき、効率的に底面上の付着細胞を掻き取ることができる。培養器の容器が上記のように略円形の底面と回転軸とを有する場合、上記（Ｃ）工程は以下のように実施してもよい。すなわち、（Ｃ）工程において、培養器の上方、側方又は下方に配置した第４の磁力発生体を回転軸に対応する位置を中心として培養器の底面に沿って円運動させることによって、第１及び第４の磁力発生体の間の磁力を駆動力としてスクレーパを回転させると共にブレードで底面上の付着物を掻き取る。

（Ｂ）工程におけるスクレーパの影響を低減する観点から、第１の磁力発生体と、培養器の外側に配置した第２の磁力発生体との間の磁力によって、容器内において培地よりも高い位置にスクレーパを浮上させた状態で（Ｂ）工程を実施することが好ましい。更に、容器内において培地よりも高い位置にスクレーパを浮上させた状態で（Ａ）工程を実施してもよく、この状態で（Ｄ）工程を実施してもよい。

本発明の培養方法は閉鎖系において実施してもよい。この場合、少なくとも（Ａ）工程の開始から（Ｄ）工程の終了まで、蓋材が容器の上部開口を覆った状態とすることが好ましい。

本発明によれば、スケールアップをしても十分効率的に細胞を掻き取ることが可能な培養器及びこれを備えた培養装置、並びに、培養方法が提供される。

本実施形態に係る培養装置の概略構成を示す断面図である。 培養器の斜視図である。 図２中の冠状部材を取り外した状態を示す斜視図である。 図２中のＩＶ−ＩＶ線に沿う断面図である。 図４中のプレートを挿入した状態を示す断面図である。 図１中のＶＩ−ＶＩ線に沿う断面図である。 本発明に係る培養器の他の実施形態を模式的に示す平面図である。 スクレーパの他の例を示す平面図である。 スクレーパの他の例を示す平面図である。 スクレーパの他の例を示す平面図である。 スクレーパの他の例を示す平面図である。 実施例１及び比較例１で使用した培養器の構成を説明するための平面図である。

以下、本発明の好適な実施形態について図面を参照しつつ詳細に説明する。説明において、同一又は同一機能を有する要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。

＜培養装置＞
図１に示す培養装置１は、培養器内で細胞を培養し、その後、培養器の底面上の付着性細胞を遠隔操作で掻き取ることができる装置である。培養装置１は、培養器２と駆動ユニット３とを備える。培養対象の細胞としては、付着性細胞（樹状細胞、間葉系幹細胞及び繊維芽細胞、ミクログリア細胞、骨芽細胞、心筋細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞など）が挙げられる。例えば、白血球中の単球を培養することによって樹状細胞に分化させることができる。

培養器２は、容器４と、スクレーパ５と、浮力発生ユニット（浮上機構）６とを有する。容器４は、細胞を培養する培地を収容する。スクレーパ５は、培地と共に容器４内に収容されており、細胞の培養後に容器４内で回転して容器４の底面４１ａを掻く。浮力発生ユニット６は、容器４の上部に配置され、スクレーパ５を底面４１ａから離間させる。駆動ユニット３は、容器４外に配置され、細胞の培養後にスクレーパ５を回転させる。

（容器）
容器４は、例えば透明な樹脂材料により構成されており、図２及び図３に示すように、円形の底板４１と、底板４１の周縁に沿って設けられた側壁４２とを有する。底板４１の内面４１ａ（底面４１ａ）の中心には、スクレーパ５を取り付けるための凸部４３が形成されている。容器４の上部は、蓋材としての透明なフィルム（不図示）により塞がれている。フィルムの周縁部は、例えば溶着により、側壁４２の上端部に接合されている。これにより、容器４内に閉鎖空間Ｓ１が構成されている。

容器４の底面４１ａは略円形である。底面４１ａの直径は好ましくは３０〜４００ｍｍであり、より好ましくは１００〜３０００ｍｍであり、更に好ましくは１５０〜２５０ｍｍである。直径が３０ｍｍ以上であれば一つの容器４内で十分量の細胞を培養することができ、他方、４００ｍｍ以下であれば樹脂材料を使用し射出成型等によって十分に高い平面度の容器を作製できる。容器４の底面４１ａの平面度は、好ましくは４０〜８００μｍであり、より好ましくは４０〜５００μｍであり、更に好ましくは４０〜１５０ｍである。平面度が４０μｍ以上の容器であれば樹脂材料を使用してもこの条件を満たす容器を作製でき、他方、８００μｍ以下であれば播種ムラが生じにくい。

側壁４２は、送液ポート４４及び通気ポート４５を有する。送液ポート４４は、培地及び細胞を流入又は流出させるためのポートであり、閉鎖空間Ｓ１に連通している。送液ポート４４は、側壁４２に一体的に形成されており、底板４１の近傍から斜め上方に突出した筒形状を呈している。送液ポート４４には、送液用のチューブ（不図示）が着脱自在に接続される。通気ポート４５は、培地及び細胞の流入及び流出に伴って閉鎖空間Ｓ１内の気体を流入又は流出させるためのポートであり、異物の混入防止用のフィルタ（不図示）を介して閉鎖空間Ｓ１に連通している。通気ポート４５は、側壁４２に一体的に形成されており、側壁４２における底板４１よりも上方の位置から側方に突出した筒形状を呈している。通気ポート４５の位置は、側壁４２の周方向において送液ポート４４の位置と異なっている。通気ポート４５の基端部の位置は、送液ポート４４の基端部の位置に比べ高い。このような配置により、通気ポート４５からの培地及び細胞の漏出が防止される。

（スクレーパ）
図３及び図４に示すように、閉鎖空間Ｓ１内に収容されたスクレーパ５は、棒状の従動回転体５１と、２個のブレード５２と、２個の永久磁石（第１の磁力発生体）５３とを有する。２個の永久磁石５３は、浮力発生ユニット６と共にスクレーパ５の浮上機構を構成する。

従動回転体５１は、例えば容器４の材料と同じ樹脂材料により構成されており、円筒部５４と、円筒部５４の周面から互いに逆側に延出した２本の従動アーム（支持部）５５，５６とを有する。

円筒部５４は、底面４１ａに対して直立し、凸部４３を囲んでいる。円筒部５４の孔（回転軸孔）には、上方からピン（回転軸）２１が挿通されており、ピン２１の下端部は凸部４３に装着されている。ピン２１の上端部にはフランジ部２１ａが形成されている。フランジ部２１ａは円筒部５４の上昇を規制する。従動回転体５１は、ピン２１により底板４１に取り付けられ、底面４１ａに直交する軸線ＣＬ１を中心に回転自在となっている。なお、容器４を覆う蓋材の材質によっては、蓋材にピン２１を設けてもよい。

また、従動回転体５１は、ピン２１をガイドとして浮上可能となっており、その浮上高さはフランジ部２１ａにより制限されている。なお、フランジ部２１ａの下には、回転規制用の凸部２１ｂが形成されており、円筒部５４の上端部には、凸部２１ｂと嵌合可能な凹部５４ａが形成されている。このため、従動回転体５１は、上限まで上昇したときに、凸部２１ｂと凹部５４ａの嵌合により回転不能となる。

従動アーム５５，５６の長さは互いに異なっており、従動アーム５５は従動アーム５６と比べて短い。従動アーム５５の先端部は円筒部５４と側壁４２の間に位置し、従動アーム５５の先端部は側壁４２の近傍に位置している。なお、二本の従動アーム５５，５６のなす角度は、必ずしも１８０°でなくてもよいが、１６０°〜２００°の範囲であることが好ましい。この角度が１６０°〜２００°であれば、回転軸を挟んで互いに異なる側に配置された永久磁石５３の磁力を利用して、スクレーパ５をバランスよく浮上又は降下させることができる。

２個のブレード５２は、従動アーム５５，５６の下にそれぞれ着脱自在に取り付けられている。ブレード５２は、例えばシリコーンゴム等の弾性材料により構成されており、従動アーム５５，５６の延出方向に沿って延在すると共に、従動アーム５５，５６から下方に張り出している。ブレード５２の下端縁には、薄肉の刃先部５２ａが形成されている（図６参照）。刃先部５２ａは底面４１ａに接触し、従動回転体５１の回転に伴って底面４１ａを掻く。また、刃先部５２ａは、従動回転体５１の浮上に伴って底面４１ａから離間する。

短い方の従動アーム５５に取り付けられたブレード５２は、底面４１ａの中心寄りに位置し、円筒部５４の近傍から底面４１ａの半径ｒ１の位置まで延びている。長い方の従動アーム５６に取り付けられたブレード５２は、底面４１ａの外寄りに位置し、底面４１ａの半径ｒ２の位置から先端側まで延びている。ここで、半径ｒ１と半径ｒ２は式（１）の条件を満たす。
ｒ１≧ｒ２ ・・・（１）

上記式（１）は、従動アーム５５のブレード５２が掻く範囲と、従動アーム５６のブレード５２が掻く範囲との一部が重複することを意味する。これにより、スクレーパ５を一回転させるだけで底面４１ａを隙間少なく掻くことができる。

２個の永久磁石５３は、従動アーム５５，５６の上にそれぞれ配置されている。永久磁石５３は、回転軸線ＣＬ１から離間し、ブレード５２の上に位置している。永久磁石５３は、従動アーム５５，５６の突出方向に沿って延伸した直方体である。すなわち、永久磁石５３は、平面視で一方向に延伸した矩形（長方形）を呈する。永久磁石５３のＮ極５３ＮとＳ極５３Ｓは、従動アーム５５，５６の幅方向に並んでいる（図６参照）。永久磁石５３は、従動アーム５５，５６の上にそれぞれ形成された磁石収容部５７に収容されており、磁石収容部５７は蓋部材５８により密封されている。

（浮力発生ユニット）
図２に示すように、浮力発生ユニット６は、プレート６１と、プレート６１を容器４の上に保持する冠状部材６２とを有する。プレート６１は、一方向に延伸した薄板形状を呈し、容器４の径方向に沿って水平に配置される。プレート６１は、その長手方向に並ぶ２個の鉄板（第２の磁力発生体）６３を有している。２個の鉄板６３は、２個の永久磁石５３をそれぞれ引き寄せ、スクレーパ５に浮力を発生させる。なお、上述のとおり、鉄板６３も、永久磁石５３と協働して磁力を発生するので磁力発生体に相当する。

冠状部材固定部材６２は、側壁４２の上端部に装着される環状フレーム６４と、容器４の径方向に沿うように環状フレーム６４に架け渡されたプレートガイド６５とを有する。プレートガイド６５は、送液ポート４４及び通気ポート４５の位置を通らないように延在している。プレートガイド６５の両端部は開口しており、プレート６１の出し入れが可能となっている。

プレート６１及びプレートガイド６５は、容器４の上方に配置されており、スクレーパ５の永久磁石５３とプレート６１の鉄板６３との間の引力によってスクレーパ５を浮上させる。プレートガイド６５からプレート６１を取り出した状態では、スクレーパ５に浮力が発生しないので、図４に示すようにブレード５２は底面４１ａに接触する。一方、プレートガイド６５にプレート６１が挿入され且つスクレーパ５がプレート６１に沿っている状態では、スクレーパ５に浮力が発生するので、図５に示すようにスクレーパ５が浮上してブレード５２が底面４１ａから離間する。このとき、ピン２１の凸部２１ｂと円筒部５４の凹部５４ａとが嵌合し、スクレーパ５が回転不能となる。なお、図４，５において、プレートガイド６５の図示は省略した。

鉄板６３及び永久磁石５３の対はピン２１を挟む２箇所に配置されるので、スクレーパ５の浮力はピン２１を挟む２箇所で発生する。このため、スクレーパ５をよりしっかりと浮上状態に保つことができる。

プレートガイド６５は、送液ポート４４及び通気ポート４５を通らないように延在しているので、プレート６１及びスクレーパ５は、送液ポート４４及び通気ポート４５を通らない状態で保持される。このため、送液ポート４４を介した送液又は通気ポート４５を介した通気がスクレーパ５により妨げられることがない。送液又は送気が妨げられる状態とは、例えば、従動アーム５５の端部により送液ポート４４又は通気ポート４５の一部が閉塞される状態である。

（駆動ユニット）
図１に示すように、駆動ユニット３は、天板３１と、動力源３２と、駆動回転体３３と、２箇所の引力発生部（第３又は第４の磁力発生体）３４とを有する。天板３１は容器４を水平に支持する。以下では、天板３１に支持された容器４を基準にして動力源３２、駆動回転体３３及び引力発生部３４の配置を説明する。

動力源３２は天板３１下方に設けられ、容器４の下方に位置する。動力源３２は上方に突出した回転軸３２ａを有し、回転軸３２ａを回転させるモータ及び減速器（不図示）等を内蔵している。回転軸３２ａの中心軸線ＣＬ２はスクレーパ５の回転軸線ＣＬ１に一致する。

駆動回転体３３は、回転軸３２ａの上端部に固定されており、回転軸３２ａの周面から互いに逆側に延出した２本の駆動アーム３５，３６を有する。駆動アーム３５の長さは従動アーム５５の長さに対応し、駆動アーム３６の長さは従動アーム５６の長さに対応している。

２箇所の引力発生部３４は、駆動アーム３５，３６の上にそれぞれ設けられている。駆動アーム３５，３６が従動アーム５５，５６の下方にそれぞれ位置するときに、引力発生部３４は、従動アーム５５，５６の永久磁石５３の下方に位置する。

図６に示すように、引力発生部３４は、矩形の鉄板３７と、磁力発生体である永久磁石３８，３９とを有する。鉄板３７は、駆動アーム３５，３６上に水平に固定されており、永久磁石３８，３９は鉄板３７上に固定されている。永久磁石３８，３９は、一方向に延伸した直方体であり、その延伸方向が鉄板３７の平行な２辺にそれぞれ沿うように配置されている。このため、永久磁石３８，３９は、平面視で長方形を呈する。

引力発生部３４は、従動回転体５１の回転に伴う永久磁石５３の移動方向で永久磁石３８，３９が永久磁石５３挟むように配置されている。永久磁石５３のＮ極５３Ｎ側に配置される永久磁石３８は、Ｓ極３８Ｓが上、Ｎ極３８Ｎが下となるように配置されている。すなわち、永久磁石３８の極は、永久磁石５３の極のうち永久磁石３８側の極を引き寄せるように上下に並んでいる。永久磁石５３のＳ極５３Ｓ側に配置された永久磁石３９は、Ｎ極３９Ｎが上、Ｓ極３９Ｓが下となるように配置されている。すなわち、永久磁石３９の極は、永久磁石５３の極のうち永久磁石３９側の極を引き寄せるように上下に並んでいる。永久磁石５３と引き合うように配置されている。

３個の永久磁石５３，３８，３９がこのように配置されることで、これらの磁石を繋ぐ磁力線のループＭＬが形成され、引力発生部３４と永久磁石５３の間に強い引力が生じる。鉄板３７は、永久磁石３８，３９を結ぶ磁力線の経路として機能し、引力の強化に寄与している。

図１に示す駆動回転体３３は、引力発生部３４が永久磁石５３の下に位置する状態で動力源３２により回転させられる。これに先立って、プレート６１はプレートガイド６５から取り出され、スクレーパ５が下降してブレード５２が底面４１ａに接触する。駆動回転体３３が回転すると、引力発生部３４及び永久磁石５３を介して従動回転体５１に動力が伝わる。この動力により、スクレーパ５が回転する。すなわち、動力源３２は、駆動回転体３３を回転させると共に、引力発生部３４及び永久磁石５３を介して伝わる動力によりスクレーパ５を回転させる。

引力発生部３４及び永久磁石５３の対はピン２１を挟む２箇所に配置されるので、従動回転体５１にはピン２１の軸線ＣＬ１を中心とする偶力が発生する。この偶力を発生させることにより、軸線ＣＬ１を中心として従動回転体５１をより円滑に回転させることができる。

＜培養方法＞
培養装置１を用いた培養方法について説明する。まず、培養器２を準備する。このとき、図５に示すようにスクレーパ５が浮上した状態、すなわち、プレートガイド６５にプレート６１を入れた状態としておくことが好ましい。

（播種工程）
次に、送液ポート４４に送液チューブを接続し、送液ポート４４を介して培養溶液を容器４内に注入する（（Ａ）工程）。培養溶液は、液状の培地に細胞が分散した混濁液である。細胞の播種は、上記混濁液を容器４内に供給することによって行ってもよいし、予め培地又は細胞を容器４に収容し、その後、容器４内に細胞又は培地を供給することによって行ってもよい。

（培養工程）
培養器２を水平にしてインキュベータに入れ、所定期間放置することで容器４内の細胞を培養する（（Ｂ）工程）。培養工程において、細胞は底面４１ａに付着する。浮力発生ユニット６によりスクレーパ５が浮上させられているため、底面４１ａの全域を細胞の培養に用いることができる。なお、必要に応じ途中で培地の交換を行ってもよい。培地の交換は、送液ポート４４を介して行うことができる。

（スクレープ工程）
培養工程が完了すると、インキュベータから培養器２を取り出し、駆動ユニット３の天板３１上に設置する。このとき、駆動回転体３３と従動回転体５１の位置を揃える。次に、プレートガイド６５からプレート６１を取り出すことでスクレーパ５を下降させ、ブレード５２を底面４１ａに接触させる。次に駆動回転体３３を回転させる。すると、引力発生部３４と永久磁石５３を介して従動回転体５１に動力が伝わってスクレーパ５が回転する。この回転に伴いブレード５２が底面４１ａを掻くことで底面４１ａから細胞が剥離される。すなわち、培養器２の下方に位置する引力発生部３４をピン２１に対応する位置を中心として培養器２の底板４１に沿って円運動させることによって、磁力を駆動力としてスクレーパ５を回転させると共にブレード５２で底面４１ａ上の細胞を掻き取る（（Ｃ）工程）。

スクレーパ５は予め容器４内に収容されているので、スクレーパ５を容器４内に挿入する必要がない。また、スクレーパ５を回転させる動力は、引力発生部３４及び永久磁石５３を介して容器４外から容器４内に伝わる。従って、容器４の閉鎖空間Ｓ１を開放することなく細胞を剥離させることができる。

なお、ブレード５２は、永久磁石５３と引力発生部３４に挟まれている。このため、ブレード５２には、スクレーパ５の自重に加え引力発生部３４と永久磁石５３の間の引力が作用する。これにより、ブレード５２と底面４１ａの接触圧力が高くなるため、細胞をより十分に剥離させることができる。

（回収工程）
スクレープ工程が完了すると、剥離した細胞を、培地と共に送液ポート４４から回収する（（Ｄ）工程）。容器４を駆動ユニット３から離脱させると共に、プレートガイド６５にプレート６１を挿入し、スクレーパ５を浮上させることが好ましい。スクレーパ５を浮上させることにより、スクレーパ５に妨げられることなく培地及び細胞を回収できる。

培養装置１を用いることで、容器４の閉鎖空間Ｓ１を開放することなく、すなわち、播種工程の開始から回収工程の終了まで容器４の上部開口を蓋材で覆った状態で、細胞の培養及び回収を実施できる。つまり、本実施形態によれば、細胞の培養及び回収を閉鎖系で行うことができる。

以上、本発明の好適な実施形態について詳細に説明したが、本発明は上記実施形態に限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲で様々な変更が可能である。例えば、容器４の底面４１ａの形状は略円形に限定されず、他の形状であってもよい。図７に示す容器４Ａは略矩形の底面４ａを有する。スクレーパ５Ａは磁力によって浮上するように構成されている。またスクレーパ５Ａが容器４Ａの一辺４ａ側から対向する一辺４ｂ側に移動するように構成されており、２本のブレード５２Ａによって略矩形の底面４ｃ上の細胞を掻き取ることができる。

ブレードを２本に分けずに、１本の長いブレードを採用した場合、底面の凹凸や撓みに対するブレードの追従性が不十分となりやすい。したがって、使用するブレードの長さを制限して複数のブレードで底面の略全体をカバーできるようにすることで、底面の凹凸や撓みに対する追従性が向上し、より効率的に付着物を掻き取ることができる。ブレードの長さは、培養皿が円形の場合（容器４）、半径の２０〜５０％であることが好ましく、培養皿が矩形の場合（容器４Ａ）、培養皿の幅の１０〜５０％であることが好ましい。複数のブレードを使用し、ブレードの長さの合計を、培養皿の半径又は幅よりも長くすることが好ましい。

図８〜図１１に容器４に装着可能なスクレーパの他の例を示す。図８に示すように、従動アーム５５，５６のなす角は９０°程度、あるいは、９０°以下であってもよい。この角度が９０°以内であると、二本の従動アーム５５，５６間の互いの垂直方向の動きの影響が少なく、容器底面の平面度への対応がしやすい。この角度の下限値は３０°程度である。てこの原理により従動アーム５６（長いアーム）と従動アーム５５（短いアーム）の駆動力を均等に設定しやすい点から、長いアームに配されるブレードは短いアームに配されるブレードよりも短いことが好ましい。なお、ここでは二本の従動アーム５５，５６が一体的に形成されていて同時に回転することを想定しているが、それぞれ独立して回転できるように構成されていてもよい。

図９に示すように、２本の従動アーム５５，５６の長さは互いに均等であってもよい。また、従動回転体５１は、必ずしも２本の従動アーム５５，５６を有していなくてもよく、図１０に示すように、１本の従動アーム５６のみを有していてもよい。図９，１０に示す態様の場合、一本のブレード５２が円筒部５４から側壁４２に亘っていてもよいが、長いブレードを採用すると、底面の凹凸や撓みに対する追従性が不十分となる傾向にある。したがって、図９に示すとおり、複数の短いブレードを採用することが好ましい。あるいは、図１０に示すとおり、ブレードの途中に切り欠き５２ａを入れることで上記追従性を向上させてもよい。図１１に示すスクレーパ５Ｂは、幅の広い１本の従動アーム５７に三本のブレード５２が配置されている。

図３，８〜１１に示すとおり、培養皿が円形である場合、効率的な掻き取り作業を実施する観点から、スクレーパが一回転することによってブレードが培養皿の底面積の９５％以上の領域をカバーすることが好ましい。他方、図７に示すとおり、培養皿が矩形である場合、同様の観点から、スクレーパが培養皿の一方から他方に移動（片道運動）することによってブレードが培養皿の底面積の９５％以上の領域をカバーすることが好ましい。つまり、スクレーパの一回転又は片道運動（スクレーパの単位動作）によって培養皿の底面積の９５％以上の領域の付着物をブレードが掻き取ることが好ましい。

上記実施形態においては、プレート６１及びプレートガイド６５を容器４の上方に配置する場合を例示したが、プレート６１及びプレートガイド６５を容器４の下方に配置し、スクレーパ５の永久磁石５３とプレート６１に配置した磁石（第２の磁力発生体）との間の斥力によってスクレーパ５を浮上させてもよい。

引力発生部３４は必ずしも２個の永久磁石３８，３９を有していなくてよく、永久磁石５３に対応する一つの永久磁石を有していればよい。一方、スクレーパ５が、永久磁石３８，３９に対応する２個の永久磁石を従動アーム５５，５６のそれぞれに有していてもよい。

スクレーパ５と駆動ユニット３の磁力発生体は永久磁石に限られず、浮力発生ユニット６の磁力発生体は鉄板に限られない。プレート６１と従動回転体５１の間に磁力を発生すると共に、駆動回転体３３と従動回転体５１の間に磁力を発生する組み合わせであれば、各部にどのような磁力発生体を採用してもよい。例えば、駆動回転体３３の磁力発生体を鉄板としてもよい。従動回転体５１の磁力発生体を鉄板とし、駆動回転体３３及びプレート６１の磁力発生体を永久磁石としてもよい。更に、電磁石を磁力発生体として採用することも可能である。

本発明者らは、本発明の効果を確認するため、以下の実施例及び比較例を実施した。

（実施例１）
底面の一辺が２３０ｍｍである角型容器、及び、長さ２３０ｍｍのブレードを準備し、図１２に示す培養器を作製した。当該容器の底面は表面処理が施されており、その平面度は７２０μｍであった。ブレードの中央に切り欠き（切れ目）を設けた。上記実施形態に係る培養方法によってＨｅｌａ細胞を培養した後、磁力によってスクレーパを１往復させて細胞の剥離率を測定した。その結果、細胞の剥離率は９４％であった。細胞の剥離率は、スクレーパ剥離なしの場合の容器に接着している細胞数を基準とし、スクレーパ剥離後の容器に接着している細胞数によって算出される値である。

（比較例１）
ブレードの中央に１箇所切り欠きを設けなかったことの他は、実施例１と同様にして培養及び細胞の剥離作業を行った。その結果、細胞の剥離率は５２％であった。

（実施例２）
図３に示す構成の培養器（底面直径：２３０ｍｍ、ピン（回転軸２１）の直径：１４ｍｍ）を作製した。培養器の底面は表面処理が施されており、その平面度は３５０μｍであった。短いアーム（アーム５５）には長さ６０ｍｍのブレードを設け、長いアーム（アーム５６）にも長さ６０ｍｍのブレードを設けた。２つのブレードの軌跡が重なる領域の径方向の長さは１２ｍｍとした。上記実施形態に係る培養方法によってＨｅｌａ細胞を培養した後、磁力によってスクレーパを一回転させて細胞の剥離率を測定した。その結果、細胞の剥離率は９７％であった。

（比較例２）
アーム５５（短いアーム）にはブレードを設けず、アーム５６（長いアーム）のみに長さ１０８ｍｍのブレードを設けたことの他は、実施例２と同様にして培養及び細胞の剥離作業を行った。その結果、細胞の剥離率は８４％であった。

１…培養装置、２…培養器、３…駆動ユニット、４，４Ａ…容器、５，５Ａ，５Ｂ…スクレーパ、６…浮力発生ユニット（浮上機構）、２１…ピン（回転軸）、２１ａ…フランジ部、２１ｂ…凸部、３８，３９…永久磁石（第３又は第４の磁力発生体）、４１ａ…容器の底面、４２…側壁、４４…送液ポート、４５…通気ポート、５１…従動回転体、５２…ブレード、５２ａ…切り欠き、５３…永久磁石（第１の磁力発生体）、５４…円筒部、５４ａ…凹部、５５，５６，５７…従動アーム（支持部）、６１…プレート、６３…鉄板（第２の磁力発生体）、６５…プレートガイド、Ｓ１…閉鎖空間。

Claims (26)

1. 細胞を培養するための培地を収容するための容器と、
   前記容器内に収容されており前記容器の底面上の付着物を掻き取るための２本以上のブレードあるいは途中に切り欠きを有する１本のブレードと、
   前記ブレードを支持する１本又は２本以上のスクレーパと、
   前記スクレーパに設けられた第１の磁力発生体と、
   を備える、培養器。
2. 前記容器は、略円形の底面と、前記スクレーパが有する回転軸孔に挿入するための回転軸とを有し、
   前記スクレーパは、前記回転軸が挿入される前記回転軸孔と、前記回転軸孔から径方向に延びており１本又は２本以上の前記ブレードを支持する支持部とを有し、
   前記支持部に前記第１の磁力発生体が配置されている、請求項１に記載の培養器。
3. ２本の前記スクレーパを備え、
   一方のスクレーパは、前記回転軸が挿入される回転軸孔と、前記回転軸孔から径方向に延びており第１のブレードを支持する支持部とを有し、
   他方のスクレーパは、前記回転軸が挿入される回転軸孔と、前記回転軸孔から径方向に延びており第２のブレードを支持する支持部とを有し、
   前記第１の磁力発生体は２つの磁力発生体からなり、前記第１のブレードを支持する前記支持部に一方の磁力発生体が配置され、前記第２のブレードを支持する前記支持部に他方の磁力発生体が配置されている、請求項２に記載の培養器。
4. １本の前記スクレーパを備え、
   当該スクレーパは、前記回転軸が挿入される回転軸孔と、前記回転軸孔から径方向に延びており第１のブレードを支持する第１の支持部と、前記回転軸孔から径方向であり且つ前記第１の支持部と反対方向に延びており第２のブレードを支持する第２の支持部とを有し、
   前記第１の磁力発生体は一対の磁力発生体からなり、前記第１の支持部に一方の磁力発生体が配置され、前記第２の支持部に他方の磁力発生体が配置されている、請求項２に記載の培養器。
5. 前記第１のブレードは前記回転軸孔の近傍から前記容器の半径ｒ１の位置まで延びており、前記第２のブレードは前記容器の半径ｒ２の位置から先端側まで延びており、
   半径ｒ１と半径ｒ２は式（１）の条件を満たす、請求項３又は４に記載の培養器。
   ｒ１≧ｒ２ ・・・（１）
6. 前記容器の底面の直径は３０〜４００ｍｍである、請求項２〜５のいずれか一項に記載の培養器。
7. 前記ブレードが前記容器の底面から離隔するように前記容器内において前記スクレーパを浮上させるための浮上機構を更に備える、請求項１〜６のいずれか一項に記載の培養器。
8. 前記浮上機構は磁力によって前記スクレーパを浮上させるものであり、前記第１の磁力発生体は前記容器の外側に配置される第２の磁力発生体と共に前記浮上機構を構成する、請求項７に記載の培養器。
9. 前記容器の上部開口を塞ぐように配置される蓋材を更に備える、請求項１〜８のいずれか一項に記載の培養器。
10. 前記容器の底面の平面度が４０〜８００μｍである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の培養器。
11. 前記ブレードの材質はシリコーンゴムである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の培養器。
12. 前記容器は、送液ポートと、通気ポートとを側壁に有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の培養器。
13. 閉鎖系において細胞を培養するために使用される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の培養器。
14. 請求項１〜１３のいずれか一項に記載の培養器と、
    前記培養器の底面上の付着物を掻き取るように前記ブレードが前記底面に接した状態で前記スクレーパを移動させる駆動ユニットと、
    を備え、
    前記駆動ユニットは、前記培養器の上方、側方又は下方に配置され且つ当該培養器の底面に沿う方向に移動可能な第３の磁力発生体を有し、前記スクレーパは前記第１及び第３の磁力発生体の間の磁力によって前記ブレードが前記底面に接した状態で移動する、培養装置。
15. 請求項２〜６のいずか一項に記載の培養器と、
    前記培養器の底面上の付着物を掻き取れるように前記底面に前記ブレードが接した状態で前記スクレーパを移動させる駆動ユニットと、
    を備え、
    前記駆動ユニットは、前記培養器の上方、側方又は下方に配置され且つ前記回転軸に対応する位置を中心として当該培養器の底面に沿って円運動する第４の磁力発生体を有し、前記スクレーパは前記第１及び第４の磁力発生体の間の磁力によって前記ブレードが前記底面に接した状態で回転する、培養装置。
16. （Ａ）２本以上のブレードあるいは途中に切り欠きを有する１本のブレードを備えるスクレーパを容器内に収容した培養器に細胞又は培地を供給する工程と、
    （Ｂ）前記容器内において細胞を培養する工程と、
    （Ｃ）培養終了後、前記容器の底面上の付着物を前記スクレーパが有するブレードで掻き取る工程と、
    （Ｄ）培養した細胞を前記容器から排出する工程と、
    を備え、
    前記スクレーパには第１の磁力発生体が設けられており、
    （Ｃ）工程において、前記培養器の上方、側方又は下方に配置した第３の磁力発生体を前記培養器の底面に沿う方向に移動させることによって、前記第１及び第３の磁力発生体の間の磁力を駆動力として前記スクレーパを移動させると共に前記ブレードで前記底面上の付着物を掻き取る、培養方法。
17. （Ａ）２本以上のブレードあるいは途中に切り欠きを有する１本のブレードを備えるスクレーパを容器内に収容した培養器に培地を供給する工程と、
    （Ｂ）前記容器内において細胞を培養する工程と、
    （Ｃ）培養終了後、前記容器の底面上の付着物を前記スクレーパが有するブレードで掻き取る工程と、
    （Ｄ）培養した細胞を前記容器から排出する工程と、
    を備え、
    前記容器は、略円形の底面と、前記スクレーパの回転軸孔に挿入するための回転軸とを有し、
    前記スクレーパは、前記回転軸が挿入される前記回転軸孔と、前記回転軸孔から径方向に延びており前記ブレードを支持する支持部と、前記支持部に配置された第１の磁力発生体とを有し、
    （Ｃ）工程において、前記培養器の上方、側方又は下方に配置した第４の磁力発生体を前記回転軸に対応する位置を中心として前記培養器の底面に沿って円運動させることによって、前記第１及び第４の磁力発生体の間の磁力を駆動力として前記スクレーパを回転させると共に前記ブレードで前記底面上の付着物を掻き取る、培養方法。
18. 前記容器の底面の直径は３０〜４００ｍｍである、請求項１７に記載の培養方法。
19. 前記培養器の底面の平面度が４０〜８００μｍである、請求項１７又は１８に記載の培養方法。
20. 閉鎖系において細胞を培養する、請求項１６〜１９のいずれか一項に記載の培養方法。
21. 少なくとも（Ａ）工程の開始から（Ｄ）工程の終了まで、蓋材が前記容器の上部開口を覆っている、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の培養方法。
22. 前記ブレードの材質はシリコーンゴムである、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の培養方法。
23. 前記容器は、送液ポートと、通気ポートとを側壁に有する、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の培養方法。
24. 前記第１の磁力発生体と、前記培養器の外側に配置した第２の磁力発生体との間の磁力によって、前記容器内において前記培地よりも高い位置に前記スクレーパを浮上させた状態で（Ｂ）工程を実施する、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の培養方法。
25. 前記容器内において前記培地よりも高い位置に前記スクレーパを浮上させた状態で（Ａ）工程も実施する、請求項２４に記載の培養方法。
26. 前記容器内において前記培地よりも高い位置に前記スクレーパを浮上させた状態で（Ｄ）工程も実施する、請求項２４又は２５に記載の培養方法。
    

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