JP2014177496A - Ｒｓｖ感染の予防または治療のための方法および組成物 - Google Patents

Ｒｓｖ感染の予防または治療のための方法および組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP2014177496A
JP2014177496A JP2014135582A JP2014135582A JP2014177496A JP 2014177496 A JP2014177496 A JP 2014177496A JP 2014135582 A JP2014135582 A JP 2014135582A JP 2014135582 A JP2014135582 A JP 2014135582A JP 2014177496 A JP2014177496 A JP 2014177496A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
rsv
aln
item
day
administration
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2014135582A
Other languages
English (en)
Inventor
Vaishnaw Akshay
バイシュナウ アクシェイ
Nochur Saraswathy
ノウチャー サラスワシー
Elbashir Sayda
エルバシア サイーダ
Manoharan Muthiah
マノハラン ムーシャ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Alnylam Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Alnylam Pharmaceuticals Inc filed Critical Alnylam Pharmaceuticals Inc
Publication of JP2014177496A publication Critical patent/JP2014177496A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7052—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides
    • A61K31/706—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom
    • A61K31/7064—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines
    • A61K31/7076—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid
    • A61K31/708—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. nucleosides, nucleotides containing six-membered rings with nitrogen as a ring hetero atom containing condensed or non-condensed pyrimidines containing purines, e.g. adenosine, adenylic acid having oxo groups directly attached to the purine ring system, e.g. guanosine, guanylic acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M11/00—Sprayers or atomisers specially adapted for therapeutic purposes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/04—Drugs for disorders of the respiratory system for throat disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/14—Antitussive agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/04—Centrally acting analgesics, e.g. opioids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/14—Type of nucleic acid interfering N.A.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Otolaryngology (AREA)
  • Anesthesiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Transplantation (AREA)

Abstract

【課題】ＲＳＶ感染の予防または治療のための方法および組成物の提供。
【解決手段】本発明は、ＲＳＶがｉＲＮＡ剤の鼻内投与によりならびにこのような作用物質の非経口投与により抑制され得る、というin vitroおよびin vivoにおける実証、そしてＲＳＶのＡおよびＢサブタイプの両方でＲＮＡレベルを低減し得るＲＳＶのＰ、ＮおよびＬ遺伝子からの強力なｉＲＮＡ剤の同定に基づいている。これらの知見に基づいて、本発明は、被験者、例えば哺乳類、例えばヒトにおけるＲＳＶｍＲＮＡレベル、ＲＳＶタンパク質レベルおよびＲＳＶウイルス力価を低減するのに有用である特定の組成物および方法を提供する。経過日数全体に亘る複数用量のｓｉＲＮＡ剤の投与は、改善された結果を提供し得る、ということが示されている。
【選択図】なし

Description

（関連出願の陳述）
本出願は、米国特許仮出願第６１／０１３，４２８号（２００７年１２月１３日出願）、米国特許仮出願第６１／０１４，８８７号（２００７年１２月１９日出願）、米国特許仮出願第６１／０２１，３０９号（２００８年１月１５日出願）、米国特許仮出願第６１／０３４，０８４号（２００８年３月５日出願）および米国特許仮出願第６１／０４９，０７ｘ６号（２００８年４月３０日出願）（これらの記載内容は各々、その全体が、参照により本明細書中で援用される）の利益を主張する。
気道は、その生来の機能のため、種々の呼吸器疾患を引き起こす多数の風媒性病原体に曝露される。気道のウイルス感染は、先進国における小児の入院の最も一般的な原因であり、米国においては年間入院数は９１，０００例と推定され、それに要する経費は３億ドルである。ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）およびパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）は、呼吸器の病気の２つの主要な作因であり、それらは、共に、上および下気道に感染して、クループ、肺炎および細気管支炎をもたらす（非特許文献１、非特許文献２）。
ＲＳＶのみでも、生後１年以内に全乳児の６５％まで、そして実質的に生後２年以内に全乳児に感染する。ＲＳＶは、高齢者においても同様に病気および死亡の重大な原因である。ＲＳＶ感染後の免疫は、完全ではなく、持続性もないので、反復感染が全年齢層で起こる。ＲＳＶ細気管支炎に罹っている小児は、将来、喘鳴および喘息を発症する可能性が高い。ＲＳＶに対する有効な治療およびワクチンに関する研究は、この４０年間継続されてきたが、成功例はほとんどない（非特許文献１、非特許文献３）。
現在、ＲＳＶに関して臨床的に認可されているワクチンはない。ＲＳＶの系統は、非ヒト動物、例えばウシ、ヤギ、ブタおよびヒツジに対しても存在し、農業および酪農ならびに食肉産業に対する損害を引き起こす（非特許文献２）。
ＲＳＶおよびＰＩＶはともに、非分節型マイナス鎖ＲＮＡゲノムを含有し、パラミクソウイルス科に属する。これらのウイルスの多数の特徴が、予防および治療の困難の一因となっている。当該ウイルスゲノムは、ＲＮＡゲノムの複製校正機序の欠如のために高率で変異して、信頼できるワクチンまたは抗ウイルスを設計するに際して重大な問題を提示する（非特許文献４）。ウイルスがＦ遺伝子に対してマッピングされる耐性突然変異を発現したため、ＲＳＶ融合タンパク質（Ｆ）の有望な阻害薬は一部は断念された（非特許文献５、非特許文献６）。両ウイルスは細胞タンパク質と会合し、ワクチン接種のための無細胞性ウイルス物質を得ることの難しさを増大させる（非特許文献７、非特許文献８、非特許文献９）。最後に、両方の免疫反応、特にＲＳＶの免疫反応は、極めて複雑である（非特許文献１０、非特許文献１１）。ワクチンとしての変性ＲＳＶタンパク質の使用は、「免疫強化」またはワクチン増強疾患をもたらす（非特許文献１２）。全体的問題は、多数の抗ＲＳＶ生物製剤プログラムの近年の閉止により強調されている。
ＲＳＶゲノムは、１５，２２２ヌクレオチド長で、１１の主要なタンパク質を産生する一本鎖のマイナスセンスＲＮＡを含む（非特許文献１３）。これらのタンパク質のうちの２つ、すなわちＦ（融合）およびＧ（付着）糖タンパク質は、主要表面タンパク質であり、防御免疫を誘導するために最も重要なものである。ＳＨ（低分子疎水性）タンパク質、Ｍ（マトリックス）タンパク質およびＭ２（２２ｋＤａ）タンパク質は、ウイルスエンベロープに関連するが、しかし防御免疫応答を誘導しない。Ｎ（主要ヌクレオキャプシド関連タンパク質）、Ｐ（リン酸化タンパク質）およびＬ（大型ポリメラーゼタンパク質）タンパク質は、ビリオンＲＮＡと関連して見出される。２つの非構造タンパク質、ＮＳ１およびＮＳ２は、おそらくは、宿主−ウイルス相互作用に関与するが、しかし感染性ビリオン中に存在しない。
ヒトＲＳＶ系統は、２つの主要群、ＡおよびＢに分類されている。Ｇ糖タンパク質は、ＲＳＶタンパク質の中で最も互いに異なることが示されている。２つのＲＳＶ群の間および内のＲＳＶ Ｇ糖タンパク質の可変性は、疾患の毎年の流行を引き起こすＲＳＶの能力にとって重要であると考えられる。Ｇ糖タンパク質は、２８９〜２９９アミノ酸（ＲＳＶ系統によって異なる）を含み、９０ｋＤａの細胞内、膜貫通および高グリコシル化柄構造、ならびにヘパリン結合ドメインを有する。糖タンパク質は、分泌および膜結合形態で存在する。
成功裏にＲＳＶ感染を治療する方法は、現在存在しない（非特許文献3）。ＲＳＶによ
る下気道の感染は、ほとんどの場合、自己限定的病状である。疾患を有する幼児および小児を如何に治療するか、あるいはいつ入院させまたは退院させるかに関する明確な指針または判定基準はない。ＲＳＶに関連して起こり得る低酸素症は、鼻カニューレを介して酸素を用いて治療され得る。呼吸器不全、ショックまたは再発性無呼吸を有する小児のための機械的換気は、死亡率を下げ得る。ステロイドを処方する医師もいる。しかしながら、いくつかの研究は、ステロイド療法は細気管支炎で入院した幼児および小児の臨床経過に影響を及ぼさない、ということを示している。したがって、コルチコステロイドは、単独でも、気管支拡張薬と組合せても、他の点では健康な非換気患者における細気管支炎の管理に役に立たない可能性がある。例えば気管支肺異形成および喘息のような心肺の基礎疾患を有する幼児および小児においても、ステロイドが用いられている。
抗ウイルス活性を有するグアノシン類似体であるリバビリンは、１９８０年代半ばからＲＳＶ細気管支炎を有する幼児および小児を治療するために用いられているが、その使用を評価する多数の研究が相反する結果を示している。大半のセンターでは、リバビリンの使用は、目下、免疫無防備状態患者に、ならびに重症罹患者に制限されている。
ＲＳＶ細気管支炎の重症度は低血清レチノール濃度と関連付けられているが、ＲＳＶ細気管支炎で入院した小児における試験は、ビタミンＡ補足が有益な効果を提供しない、ということを示している。ＲＳＶ下気道感染のための１５００ｍｇ／ｋｇ静脈内ＲＳＶ免疫グロブリンまたは１００ｍｇ／ｋｇ吸入免疫グロブリンの治験も、実質的に有益な効果を示すことが出来なかった。
先進国では、ＲＳＶ下気道感染の治療は、一般的に、対症療法に限定されている。抗ウイルス療法は、その高い経費のため、および効能に関する合意の欠如のために、通常は致命的な状況に限定される。先進国において、酸素は主要な療法（利用可能な場合）であり、死亡率を低下させるための唯一の方法は予防によるものである。
ＲＮＡ干渉または「ＲＮＡｉ」は、蠕虫に導入されると二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）が遺伝子発現を遮断するという観察を説明するために、Fireと共同研究者により最初に作り出された用語である（非特許文献１４）。短いｄｓＲＮＡは、多数の生物体、例えば脊椎動物における遺伝子特異的転写後サイレンシングを指図し、そして遺伝子機能を試験するための新規のツールを提供している。ＲＮＡｉは、新規のクラスの治療薬を開発する一方法として示唆されている。しかしながら今日まで、これらは、依然として、ＲＮＡｉが治療的に用いられ得るという実証的証拠を伴わない示唆の域をほとんど脱していない。
したがって、特に幼児および小児のための、ＲＳＶに対する安全且つ有効なワクチンが必要とされている。すべての年齢での、そして免疫不全の個人におけるＲＳＶ感染を治療するための治療薬および方法も必要とされている。疾患の病因が研究され、治療薬及びワクチンのスクリーニングを促進できるように、ＲＳＶに対する防御的免疫応答の特徴を明らかにするための科学的方法も必要とされている。本発明は、ＲＳＶ感染を調節するかまたは防止するために有効な方法および組成物を提供することにより、当該技術分野における従来の欠点を克服する。具体的には、本発明は、in vitroおよびin vivoでＲＳＶレ
ベルを低減し、ならびにＲＳＶの両主要サブタイプに対して有効であることが示されているｉＲＮＡ剤を提供し、そしてこのクラスの分子の治療的活性を示すことにより、当該技術分野を進歩させる。
Openshaw, P.J.M., Respir. Res. 3 (Suppl 1), S15-S20 (2002) Easton, A.J., et al, Clin. Microbiol. Rev. 17, 390-412 (2004) Maggon, K. et al., Rev. Med. Virol. 14, 149-168 (2004) Sullender, W.M. Clin. Microbiol. Rev. 13, 1-15 (2000) Razinkov, V., et al., Antivir. Res. 55, 189-200 (2002) Morton, C.J. et al., Virology 311, 275-288 (2003) Burke, E., et al, Virology 252, 137-148 (1998) Burke, E., et al, J. Virol. 74, 669-675 (2000) Gupta, S., et al, J. Virol. 72, 2655-2662 (1998) Peebles, R.S., Jr., et al, Viral. Immunol. 16, 25-34 (2003) Haynes, L.M., et al, J. Virol. 77, 9831-9844 (2003) Polack, F.P. et al. J. Exp. Med. 196, 859-865 (2002) Falsey, A.R., and E.E. Walsh, 2000, Clinical Microbiological Reviews 13: 371-84 Fire et al., ‘Nature 391: 806-811, 1998
本発明は、ＲＳＶがｉＲＮＡ剤の鼻内投与によりならびにこのような作用物質の非経口投与により抑制され得る、というin vitroおよびin vivoにおける実証、そしてＲＳＶのＡおよびＢサブタイプの両方でＲＮＡレベルを低減し得るＲＳＶのＰ、ＮおよびＬ遺伝子からの強力なｉＲＮＡ剤の同定に基づいている。これらの知見に基づいて、本発明は、被験者、例えば哺乳類、例えばヒトにおけるＲＳＶｍＲＮＡレベル、ＲＳＶタンパク質レベルおよびＲＳＶウイルス力価を低減するのに有用である特定の組成物および方法を提供する。経過日数全体に亘る複数用量のｓｉＲＮＡ剤の投与は、改善された結果を提供し得る、ということが示されている。例えば、好ましい実施形態では、予め選択された量のｓｉＲＮＡ剤は、１日より長い経過期間に亘って分割用量として投与される場合、遺伝子発現のより良好な抑制をもたらす。
一実施形態では、本発明は、治療的有効量のＡＬＮ−ＲＳＶ０１を含むｓｉＲＮＡ組成物を提供する。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、センス鎖配列（５’から３’に）ＧＧＣＵＣＵＵＡＧＣＡＡＡＧＵＣＡＡＧｄＴｄＴおよびアンチセンス鎖（５’から３’に）ＣＵＵＧＡＣＵＵＵＧＣＵＡＡＧＡＧＣＣｄＴｄＴを有するｓｉＲＮＡ剤である。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１はＡＬＮ−ＤＰ−２０１７と同一であり、これらの用語は本明細書中では互換的に用いられる。ＡＬ−ＤＰ−２０１７（すなわちＡＬＮ−ＲＳＶ０１）の構造およびその製造についての詳細は、共同所有米国特許仮出願第６１／０２１，３０９号（２００８年１月１５日出願）に詳細に記述されており、その記載内容は全ての目的のために、参照により、その全体が本明細書中で援用される。
一実施形態では、本発明は、凍結乾燥粉末を提供する。別の実施形態では、本発明は上記の量のＡＬＮ−ＲＳＶ０１を含む溶液を提供し、別の実施形態では液体懸濁液を、そして別の実施形態では乾燥粉末を提供する。一実施形態では、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の治療的有効量は、１５０ｍｇ以下の無水オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、治療的有効量は、１５０ｍｇの無水オリゴヌクレオチドである。別の実施形態では、治療的有効量は、７５ｍｇの無水オリゴヌクレオチドである。一実施形態では、ヒト被験者への治療的有効量の投与は、その被験者における白血球数の有意の増大をもたらさない。別の実施形態では、ヒト被験者への治療的有効量の投与は、その被験者における炎症性サイトカイン（単数または複数）の濃度の有意な上昇をもたらさない。一実施形態では、それらのサイトカイン（単数または複数）は、ＣＲＰ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ１−ＲＡまたはＴＮＦのうちの1つ以上である。
関連する一実施形態では、溶液は２００〜４００ｍｇＯｓｍ／ｋｇの範囲の重量オスモル濃度を有するよう処方される。ある実施形態では、溶液は緩衝溶液である。ある実施形態では、溶液のｐＨは５〜８である。他の実施形態では、溶液のｐＨは５．６〜７．６である。関連する実施形態では、溶液はリン酸ナトリウム緩衝剤を含む。さらなる他の実施形態では、緩衝剤の濃度は１０〜１００ｍＭ、２０〜８０ｍＭ、３０〜７０ｍＭ、４０〜６０ｍＭ、または約５０ｍＭである。さらなる別の実施形態では、緩衝溶液のｐＨは６．６である。
本発明の一実施形態では、ヒト被験者への治療的有効量のＡＬＮ−ＲＳＶ０１の投与は、上記被験者において、白血球数の有意の増大をもたらさない。別の実施形態では、ヒト被験者への治療的有効量の投与は、上記被験者において、ＣＲＰ濃度、Ｇ−ＣＳＦ濃度、ＩＬ１−ＲＡ濃度またはＴＮＦ濃度の有意の上昇をもたらさない。関連する一実施形態では、ｓｉＲＮＡ組成物は、エキソヌクレアーゼからの保護のための修飾をさらに包含する。別の実施形態では、ｓｉＲＮＡ組成物の修飾は、ホスホロチオエートおよびヒドロキシピロリジン（ｈｐ）リンカーからなる群から選択される。
別の実施形態では、治療用ＡＬＮ−ＲＳＶ０１組成物は局所的に投与される。関連する実施形態では、局所投与は鼻内または肺内投与され、例えば投与は前記組成物の吸入により行われる。さらに他の関連する実施形態では、患者が自分自身に組成物を投与するか、あるいは第三者（例えば保護者または医師等の健康管理の専門家）が組成物を患者に投与し得る。ある実施形態では、組成物は、エーロゾル化液、例えば鼻噴霧剤として投与される。鼻噴霧剤、Becton-Dickinson Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（商標）鼻噴霧系またはその同様なシステムにより投与される。関連する実施形態では、エーロゾル化された液はネブライザーにより生成される。さらなる他の関連する実施形態では、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１を含む０．１ｍｌ〜０．６ｍｌ（例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５または０．６ｍｌ）のエーロゾル化された溶液が、各鼻孔に投与される。複数用量が毎日投与され得るが、この場合、回数は２、３、４または５用量を含む。関連する実施形態では、複数用量の投与は、上記非トの気道の細胞中のＲＳＶタンパク質、ｍＲＮＡまたは力価を、上記複数用量により提供される用量と等しい単一用量の投与と少なくとも同レベルに低減する。さらに他の関連実施形態では、吸入による上記複数用量の投与は、総用量０．１〜０．６ｍｇ／ｋｇの無水オリゴヌクレオチドを上記ヒトに送達する。
ある実施形態では、上記複数用量のうちの初回は、ヒト患者がＲＳＶに感染する前に投与される（例えば予防的に）。
さらに別の実施形態では、本発明は、ＲＳＶ感染を予防するかまたは治療するのに有効である化合物を同定する方法であって、ＲＳＶのメンフィス−３７系統に感染した最初のヒトを規定すること（ここで、上記最初のヒトはＲＳＶ感染の進行中に肺機能の低減を示す）、前記最初のヒトに試験化合物を投与すること（ここで、上記投与はＲＳＶ感染の前または後になされる）、上記最初のヒトにおけるＲＳＶ感染の進行を査定すること、最初のヒトにおけるＲＳＶ感染の進行を、上記試験化合物を投与されていない少なくとも１人の第二番目のヒトにおけるＲＳＶ感染の進行と比較すること、最初のヒト被験者における進行が第二番目のヒトにおける進行と比較して低減される場合、ＲＳＶ感染を予防するかまたは治療するのに有効である化合物として試験化合物を同定することを包含する方法を提供する。関連する一実施形態では、当該方法は、試験化合物の上記同定を記録するかまたは報告することをさらに包含する。さらに別の関連実施形態では、最初のヒト被験者における進行が第二番目のヒトにおける進行と比較して低減される場合、スクリーニング方法は、第三番目のヒトに試験化合物を投与することを包含する。
本発明の一実施形態では、当該方法は、肺移植を受けたヒト患者における呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染を予防するかまたは治療することに関して、例えば治療的有効量のＡＬＮ−ＲＳＶ０１を含む組成物を肺移植を受けたヒト患者に投与することに関して記載される。一態様において、組成物は局所的に投与される。１つの関連する態様では、局所投与は、鼻内または肺内である。別の関連する態様では、局所投与は鼻内である。別の関連する態様では、局所投与は肺内である。１つの関連する態様では、肺内投与は組成物の吸入による。別の態様では、組成物はエーロゾルとして投与される。１つの関連する態様では、エーロゾルは鼻噴霧剤である。別の関連する態様では、エーロゾルはネブライザーにより生成される。１つの関連する態様では、ネブライザーはＰＡＲ１ ｅＦｌｏｗ（登録商標）３０Ｌネブライザーである。
別の実施形態では、方法は、複数用量の組成物を投与することを包含する。一態様では、複数用量のうちの１つが毎日投与される。別の態様では、複数用量は２または３用量である。別の関連する態様では、複数用量が３用量である。
別の実施形態では、肺移植を受けたヒト患者は目下ＲＳＶに感染している。一態様では、複数用量の初回が投与される時に肺移植を受けたヒト患者は目下ＲＳＶに感染している。１つの関連する態様では、投与によって、肺移植を受けたヒト患者の気道の細胞中のＲＳＶタンパク質、ＲＳＶ ｍＲＮＡ、ＲＳＶピークウイルス負荷、ピークＲＳＶウイルス負荷までの時間、ＲＳＶウイルス脱粒の継続時間、ＲＳＶウイルスＡＵＣ、またはＲＳＶ力価が低減する。
別の態様では、複数用量の前記投与は、肺移植を受けたヒト患者の気道の細胞中のＲＳＶタンパク質、ＲＳＶ ｍＲＮＡ、ＲＳＶピークウイルス負荷、ピークＲＳＶウイルス負荷までの時間、ＲＳＶウイルス脱粒の継続時間、ＲＳＶウイルスＡＵＣ、またはＲＳＶ力価を、複数用量により提供される用量と等しい単一用量の投与と少なくとも同レベルに低減する。一態様では、複数用量の投与は吸入によるものであり、総用量０．１〜０．６ｍｇ／ｋｇの無水オリゴヌクレオチドを肺移植を受けたヒト患者に送達する。
別の実施形態では、本発明は、ＲＳＶ感染の特質を確定することをさらに包含する。一態様では、ＲＳＶ感染の特質は、肺移植を受けたヒト患者からの鼻スワブ試料および／または痰試料の定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析により確定される。１つの関連する態様では、ｑＲＴ−ＰＣＲは、ＲＳＶ ｍＲＮＡ、ＲＳＶピークウイルス負荷、ピークＲＳＶウイルス負荷までの時間、ＲＳＶウイルス脱粒の継続時間、ＲＳＶウイルスＡＵＣ、またはＲＳＶ力価を確定するために用いられる。
別の実施形態では、肺移植を受けたヒト患者は気管支拡張薬療法を受けている。１つの関連する態様では、肺移植を受けたヒト患者は、気管支拡張薬療法施療の１時間以内に組成物を投与される。
別の実施形態では、肺移植を受けたヒト患者は標準ケア処置を受けている。１つの関連する態様では、標準ケア処置はリバビリンの投与を包含する。別の態様では、肺移植を受けたヒト患者は、リバビリンの投与の１〜２時間前に前記組成物を投与される。
別の実施形態では、肺移植を受けたヒト患者への組成物の投与は、ＲＳＶ感染の徴候および／または症候の開始の７日以内に開始される。一態様では、徴候および／または症候は、ＦＥＶ1の低減、発熱、新規発症鼻漏、咽喉の痛み、鼻閉、咳、喘鳴、頭痛、筋肉痛
、悪寒または息切れを包含する。
別の実施形態では、０．６ｍｇ／ｋｇの濃度でのエーロゾル化ＡＬＮ−ＲＳＶ０１が、ＰＡＲＩ ｅＦｌｏｗ（登録商標）３０Ｌネブライザーを用いて３日間１日１回、エーロゾル化ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の吸入により肺移植を受けたヒト患者に投与される。
別の実施形態では、治療的有効量のＡＬＮ−ＲＳＶ０１を含む組成物を肺移植を受けたヒト患者に投与することにより肺移植を受けたヒト患者における呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染を予防するかまたは治療することを包含する肺移植を受けたヒト患者における医学的病状の危険を低減するための方法であって、医学的病状が、移植肺の急性拒絶、閉塞性細気管支炎症候群、挿管の発生、ウイルス、細菌または真菌呼吸器感染の発生、ならびに肺機能の不可逆的低下からなる群から選択される方法が記載される。
別の態様では、本発明は、少なくとも２日間持続している再発性咳に罹患しているヒト患者に治療的有効量のＡＬＮ−ＲＳＶ０１を含む組成物を投与することによりＲＳＶ感染を予防するかまたは治療する方法を提供する。関連する一実施形態では、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の投与方法は、少なくとも２日間持続している再発性咳に罹患しているとヒトを診断するステップをさらに包含し、この場合、上記診断は上記組成物の投与前になされる。ヒトは、少なくとも２日持続した再発性咳を有する。関連する一実施形態では、ヒトは少なくとも１８歳未満、２歳未満、生後６ヶ月未満、または生後３ヶ月未満である。別の関連実施形態では、患者は免疫系の弱化を示す。さらに別の関連実施形態では、患者は脱水状態であるかまたは脱水状態になる危険がある。さらに別の実施形態では、患者は上記組成物の投与の６週間以内にシナギス（商標）の一用量を投与される。
別の態様では、治療的用量のＡＬＮ−ＲＳＶ０１の投与は、１０分未満、さらに好ましくは５分またはそれ未満を要する。
別の態様では、本発明は、治療的有効量のＡＬＮ−ＲＳＶ０１を含む組成物をヒト患者に投与することによりＲＳＶ感染を予防するかまたは治療する方法であって、上記ヒトにおけるＲＳＶ Ｎ遺伝子ｍＲＮＡのＡＬＮ−ＲＳＶ０１による切断を測定することをさらに包含する方法を提供する。関連する一実施形態では、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１による切断はＰＣＲにより検出される。別の関連する実施形態では、ＲＳＶ Ｎ遺伝子ｍＲＮＡ切断産物は、上記ヒトの鼻試料中で検出される。さらに別の関連する実施形態では、ＲＮＡｉ媒介性の切断は、一用量の上記組成物の投与後５日未満または３日未満に測定される。さらに別の実施形態では、方法は、上記ヒトにおけるＲＳＶの力価を測定するステップをさらに包含する。
本発明の1つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の説明において示される。本発明の他の特徴、被験者および利点は、この説明、図面から、そして特許請求の範囲から明らかになる。
本発明の好ましい実施形態では、例えば以下が提供される：
（項目１）
治療的有効量のＡＬＮ−ＲＳＶ０１を含むｓｉＲＮＡ組成物。
（項目２）
前記組成物が凍結乾燥粉末を含む項目１記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目３）
前記組成物が、−２０℃で保存される場合、少なくとも２４ヶ月間安定である項目２記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目４）
前記組成物が溶液を含む項目１記載のｓｉＲＮＡ。
（項目５）
前記組成物が、２℃〜８℃で保存される場合、少なくとも２４ヶ月間安定である項目４記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目６）
前記溶液の重量オスモル濃度が２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇである項目４記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目７）
前記溶液が緩衝剤を含む項目４記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目８）
前記緩衝剤がリン酸ナトリウム緩衝剤である項目７記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目９）
前記リン酸ナトリウム緩衝剤の濃度が５０ｍＭである項目８記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目１０）
前記緩衝溶液のｐＨが５〜８である項目８記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目１１）
前記緩衝溶液のｐＨが５．６〜７．６である項目１０記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目１２）
前記緩衝溶液のｐＨが６．６である項目１１記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目１３）
前記ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の濃度が１５０ｍｇ／ｍｌの無水オリゴヌクレオチドである項目８記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目１４）
前記ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の濃度が７５ｍｇ／ｍｌの無水オリゴヌクレオチドである項目８記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目１５）
前記溶液の容積が１．０ｍｌである項目７記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目１６）
前記容積が２つの容器の間で等しく分けられる項目１５記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目１７）
前記組成物が液体懸濁液を含む項目１記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目１８）
前記組成物が乾燥粉末を含む項目１記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目１９）
前記治療的有効量が１５０ｍｇ以下の無水オリゴヌクレオチドである項目１記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目２０）
前記治療的有効量が１５０ｍｇの無水オリゴヌクレオチドである項目１９記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目２１）
前記治療的有効量が７５ｍｇの無水オリゴヌクレオチドである項目１９記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目２２）
ヒト被験者への前記治療的有効量の投与は前記被験者において白血球数の有意の増大を生じさせない項目１記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目２３）
ヒト被験者への前記治療的有効量の投与は前記被験者においてＣＲＰ濃度、Ｇ−ＣＳＦ濃度、ＩＬ１−ＲＡ濃度またはＴＮＦ濃度の有意の増大を生じさせない項目１記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目２４）
前記組成物がエキソヌクレアーゼからの保護のための修飾をさらに含む項目１記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目２５）
前記分子がホスホロチオエートおよびヒドロキシピロリジン（ｈｐ）リンカーからなる群から選択される項目２４記載のｓｉＲＮＡ組成物。
（項目２６）
ヒト被験者におけるＲＳＶ感染の予防または治療のための項目１記載の組成物の使用。
（項目２７）
ヒトにおける呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染を予防するかまたは治療する方法であって、治療的有効量のＡＬＮ−ＲＳＶ０１を含む組成物を前記ヒトに投与することを包含する方法。
（項目２８）
前記組成物が局所投与される項目２７記載の方法。
（項目２９）
前記局所投与が鼻内または肺内である項目２８記載の方法。
（項目３０）
前記局所投与が鼻内である項目２９記載の方法。
（項目３１）
前記局所投与が肺内である項目２９記載の方法。
（項目３２）
前記肺内投与が前記組成物の吸入によるものである項目３１記載の方法。
（項目３３）
前記組成物がエーロゾル化液として投与される項目２９記載の方法。
（項目３４）
前記エーロゾル化液が鼻噴霧剤である項目３３記載の方法。
（項目３５）
前記鼻噴霧剤がBecton-Dickinson Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（商標）鼻噴霧系により作られる項目３４記載の方法。
（項目３６）
前記エーロゾル化液がネブライザーにより作られる項目３３記載の方法。
（項目３７）
項目４〜１６のいずれかの組成物を投与することを包含する項目３３記載の方法。
（項目３８）
前記投与が、０．５ｍｌの前記エーロゾル化液を各鼻孔に投与することを包含する項目３７記載の方法。
（項目３９）
前記組成物の複数用量を投与することを包含する項目２８記載の方法。
（項目４０）
前記複数用量のうちの１つが毎日投与される項目３９記載の方法。
（項目４１）
前記複数用量が２、３、４または５用量である項目４０記載の方法。
（項目４２）
前記複数用量が５用量である項目４１記載の方法。
（項目４３）
前記複数用量の初回が、前記ヒトがＲＳＶに感染する前に投与される項目３９記載の方法。
（項目４４）
前記複数用量の前記投与が、前記ヒトの気道の細胞中のＲＳＶタンパク質、ｍＲＮＡまたは力価を、前記複数用量により提供される用量と等しい単一用量の投与と少なくとも同一レベルに低減する項目３９記載の方法。
（項目４５）
前記複数用量の前記投与が吸入によるものであり、総用量０．１〜０．６ｍｇ／ｋｇの無水オリゴヌクレオチドを前記ヒトに送達する項目３９記載の方法。
（項目４６）
肺移植を受けたヒト患者における呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染を予防するかまたは治療する方法であって、治療的有効量のＡＬＮ−ＲＳＶ０１を含む組成物を前記肺移植を受けたヒト患者に投与することを包含する方法。
（項目４７）
前記組成物が局所投与される項目４６記載の方法。
（項目４８）
前記局所投与が鼻内または肺内である項目４７記載の方法。
（項目４９）
前記局所投与が鼻内である項目４８記載の方法。
（項目５０）
前記局所投与が肺内である項目４８記載の方法。
（項目５１）
前記肺内投与が前記組成物の吸入によるものである項目５０記載の方法。
（項目５２）
前記組成物がエーロゾルとして投与される項目４８記載の方法。
（項目５３）
前記エーロゾルが鼻噴霧剤である項目５２記載の方法。
（項目５４）
前記エーロゾルがネブライザーにより作られる項目５２記載の方法。
（項目５５）
前記ネブライザーがＰＡＲＩ ｅＦｌｏｗ（登録商標）３０Ｌネブライザーである項目５４記載の方法。
（項目５６）
複数用量の前記組成物を投与することを包含する項目４６記載の方法。
（項目５７）
前記複数用量のうちの１つが毎日投与される項目５６記載の方法。
（項目５８）
前記複数用量が２または３用量である項目５７記載の方法。
（項目５９）
前記複数用量が３用量である項目５８記載の方法。
（項目６０）
前記肺移植を受けたヒト患者が目下ＲＳＶに感染している項目４６記載の方法。
（項目６１）
前記複数用量の初回が投与される時点で、前記肺移植を受けたヒト患者が目下ＲＳＶに感染している項目５６記載の方法。
（項目６２）
前記投与が、前記肺移植を受けたヒト患者の気道の細胞中のＲＳＶタンパク質、ＲＳＶ
ｍＲＮＡ、ＲＳＶピークウイルス負荷、ピークＲＳＶウイルス負荷までの時間、ＲＳＶウイルス脱粒の継続時間、ＲＳＶウイルスＡＵＣ、またはＲＳＶ力価を低減する項目４６記載の方法。
（項目６３）
前記複数用量の前記投与が、前記肺移植を受けたヒト患者の気道の細胞中のＲＳＶタンパク質、ＲＳＶ ｍＲＮＡ、ＲＳＶピークウイルス負荷、ピークＲＳＶウイルス負荷までの時間、ＲＳＶウイルス脱粒の継続時間、ＲＳＶウイルスＡＵＣ、またはＲＳＶ力価を、前記複数用量により提供される用量と等しい単一用量の投与と少なくとも同レベルに低減する項目４６記載の方法。
（項目６４）
前記複数用量の前記投与が吸入によるものであり、総用量０．１〜０．６ｍｇ／ｋｇの無水オリゴヌクレオチドを前記肺移植を受けたヒト患者に送達する項目５６記載の方法。
（項目６５）
ＲＳＶ感染の特性を確定することをさらに包含する項目４６記載の方法。
（項目６６）
ＲＳＶ感染の前記特性が前記肺移植を受けたヒト患者からの鼻スワブ試料および／または痰試料の定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析により確定される項目６５記載の方法。
（項目６７）
前記ｑＲＴ−ＰＣＲが、ＲＳＶ ｍＲＮＡ、ＲＳＶピークウイルス負荷、ピークＲＳＶウイルス負荷までの時間、ＲＳＶウイルス脱粒の継続時間、ＲＳＶウイルスＡＵＣ、またはＲＳＶ力価を確定するために用いられる項目６６記載の方法。
（項目６８）
前記肺移植を受けたヒト患者が気管支拡張薬療法を受けている項目４６記載の方法。
（項目６９）
前記肺移植を受けたヒト患者が気管支拡張薬療法施療の１時間以内に前記組成物を投与される項目６８記載の方法。
（項目７０）
前記肺移植を受けたヒト患者が標準ケア処置を受けている項目４６記載の方法。
（項目７１）
前記標準ケア処置がリバビリンの投与を包含する項目７０記載の方法。
（項目７２）
前記肺移植を受けたヒト患者が、リバビリンの投与の１〜２時間前に前記組成物を投与される項目７１記載の方法。
（項目７３）
前記肺移植を受けたヒト患者への前記組成物の前記投与がＲＳＶ感染の徴候および／または症候の開始後７日以内に開始される項目６０記載の方法。
（項目７４）
前記徴候および／または症候がＦＥＶ１の低減、発熱、新規発症の鼻漏、咽喉の痛み、鼻閉、咳、喘鳴、頭痛、筋肉痛、悪寒または息切れを包含する項目７３記載の方法。
（項目７５）
治療的有効量のＡＬＮ−ＲＳＶ０１を含む組成物を前記肺移植を受けたヒト患者に投与することにより肺移植を受けたヒト患者における呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）感染を予防するかまたは治療することを包含する肺移植を受けたヒト患者における医学的病状の危険を低減するための方法であって、前記医学的病状が、移植肺の急性拒絶、閉塞性細気管支炎症候群、挿管の発生、ウイルス、細菌または真菌呼吸器感染の発生、ならびに肺機能の不可逆的低下からなる群から選択される方法。
（項目７６）
０．６ｍｇ／ｋｇの濃度でのエーロゾル化ＡＬＮ−ＲＳＶ０１が、ＰＡＲＩ ｅＦｌｏｗ（登録商標）３０Ｌネブライザーを用いて３日間１日１回、エーロゾル化ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の吸入により肺移植を受けたヒト患者に投与される項目７５記載の方法。
（項目７７）
前記組成物が局所的に投与される項目７５記載の方法。
（項目７８）
前記局所投与が鼻内または肺内である項目７７記載の方法。
（項目７９）
前記局所投与が鼻内である項目７８記載の方法。
（項目８０）
前記局所投与が肺内である項目７８記載の方法。
（項目８１）
前記肺内投与が前記組成物の吸入によるものである項目８０記載の方法。
（項目８２）
前記組成物がエーロゾルとして投与される項目７８記載の方法。
（項目８３）
前記エーロゾルが鼻噴霧剤である項目８２記載の方法。
（項目８４）
前記鼻噴霧剤がＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）により投与される項目８３記載の方法。
（項目８５）
前記組成物の複数用量を投与することを包含する項目７５機差の方法。
（項目８６）
前記複数用量のうちの１つが毎日投与される項目８５記載の方法。
（項目８７）
前記複数用量が５用量である項目８５記載の方法。
（項目８８）
前記移植を受けたヒト患者が目下ＲＳＶに感染している項目２７記載の方法。
（項目８９）
前記移植を受けたヒト患者が、前記複数用量の初回が投与される時に、目下ＲＳＶに感染している項目３９記載の方法。
（項目９０）
前記投与が、前記移植を受けたヒト患者の気道の細胞中のＲＳＶタンパク質、ＲＳＶ ｍＲＮＡ、ＲＳＶピークウイルス負荷、ピークＲＳＶウイルス負荷までの時間、ＲＳＶウイルス脱粒の継続時間、ＲＳＶウイルスＡＵＣ、またはＲＳＶ力価を低減する項目７５記載の方法。
（項目９１）
前記複数用量の前記投与が、前記移植を受けたヒト患者の気道の細胞中のＲＳＶタンパク質、ＲＳＶ ｍＲＮＡ、ＲＳＶピークウイルス負荷、ピークＲＳＶウイルス負荷までの時間、ＲＳＶウイルス脱粒の継続時間、ＲＳＶウイルスＡＵＣ、またはＲＳＶ力価を、前記複数用量により提供される用量と等しい単一用量の投与と少なくとも同レベルに低減する項目３９記載の方法。
（項目９２）
前記複数用量の前記投与が吸入によるものであり、総用量７５ｍｇまたは１５０ｍｇの無水オリゴヌクレオチドを前記移植を受けたヒト患者に送達する項目３９記載の方法。
（項目９３）
ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の抗ウイルス作用を確定することをさらに包含する項目２７記載の方法。
（項目９４）
前記抗ウイルス作用が定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析、定量的培養または回転増強培養により確定される項目９３記載の方法。
（項目９５）
移植を受けたヒト患者のウイルス負荷を確定することをさらに包含する項目９４記載の方法。
（項目９６）
前記ウイルス負荷が定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析、定量的培養またはウイルスＡＵＣにより確定される項目９５記載の方法。
（項目９７）
移植を受けたヒト患者のＲＳＶ疾患測定値を確定することをさらに包含する項目２７記載の方法。
（項目９８）
前記ＲＳＶ疾患測定値が症候、身体検査または粘液重量により測定される項目９７記載の方法。
（項目９９）
７５ｍｇまたは１５０ｍｇの用量での０．５ｍｌ／鼻孔のエーロゾル化ＡＬＮ−ＲＳＶ０１が、エーロゾル化ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の吸入により移植を受けたヒト患者に投与される項目２７記載の方法。
（項目１００）
７５ｍｇまたは１５０ｍｇの用量での０．５ｍｌ／鼻孔のエーロゾル化ＡＬＮ−ＲＳＶ０１が、Becton-Dickinson Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標）を用いて産生されるエーロゾル化ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の吸入により移植を受けたヒト患者に投与される項目２７記載の方法。
（項目１０１）
少なくとも２日間持続する再発性咳に罹患していると前記ヒトを診断するステップをさらに包含する項目２７記載の方法であって、前記診断が前記組成物の投与前になされる方法。
（項目１０２）
前記ヒトが少なくとも２日持続した再発性咳を有する項目２７記載の方法。
（項目１０３）
前記ヒトが少なくとも１８歳未満である項目１０１記載の方法。
（項目１０４）
前記ヒトが弱化した免疫系を有する項目１０１記載の方法。
（項目１０５）
前記ヒトが入院している項目１０１記載の方法。
（項目１０６）
前記ヒトが２歳未満である項目１０３記載の方法。
（項目１０７）
前記ヒトが生後６ヶ月未満である項目１０６記載の方法。
（項目１０８）
前記ヒトが生後３ヶ月未満である項目１０６記載の方法。
（項目１０９）
前記ヒトが脱水状態になるかまたは脱水状態になる危険がある項目２７および１０１〜１０６のいずれかに記載の方法。
（項目１１０）
前記ヒトが前記組成物の投与後６週間以内にシナギス（商標）の一用量を投与される項目２７記載の方法。
（項目１１１）
前記ヒトにおけるＲＳＶ Ｎ遺伝子ｍＲＮＡのＡＬＮ−ＲＳＶ０１定方向切断を測定することをさらに包含する項目１記載の方法。
（項目１１２）
前記ＡＬＮ−ＲＳＶ０１定方向切断がＰＣＲにより検出される項目１１１記載の方法。
（項目１１３）
前記ＲＳＶ Ｎ遺伝子ｍＲＮＡ切断産物が前記ヒトの鼻試料中で検出される項目１１１記載の方法。
（項目１１４）
前記ＲＮＡｉ媒介性切断が一用量の前記組成物の投与後５日未満に測定される項目１１１記載の方法。
（項目１１５）
前記ＲＮＡｉ媒介性切断が一用量の前記組成物の投与後３日未満に測定される項目１１４記載の方法。
（項目１１６）
前記ヒトにおけるＲＳＶの力価を測定することをさらに包含する項目１１１記載の方法。
ｉＲＮＡ剤を用いたＲＳＶのin vitro抑制。表１（ａ〜ｃ）に提示されるｉＲＮＡ剤を、実施例に記載されるプラーク形成検定において抗ＲＳＶ活性に関して試験した。各カラム（バー）は、表１（ａ〜ｃ）で提示されるｉＲＮＡ剤を表し、例えばカラム１は表１ａにおける第一剤等である。活性ｉＲＮＡ剤を同定した。 ｉＲＮＡ剤を用いたＲＳＶのin vitro用量応答抑制。表１からの活性作用物質の例を、４つの濃度で、実施例に記載されるプラーク形成検定において抗ＲＳＶ活性に関して試験した。試験した活性ｉＲＮＡ剤に関して、用量依存性応答が見られた。 ｉＲＮＡ剤を用いたＲＳＶＢサブタイプのin vitro抑制。図２に提示されるｉＲＮＡ剤を、実施例に記載されるプラーク形成検定においてサブタイプＢに対する抗ＲＳＶ活性に関して試験した。試験したｉＲＮＡ剤により、サブタイプＢが抑制された。 ｉＲＮＡ剤を用いたＲＳＶのin vivo抑制。図に記載された作用物質を、実施例に記載されるマウスモデルにおいて抗ＲＳＶ活性に関して試験した。ｉＲＮＡ剤は、in vivoでのウイルス力価の低減に有効であった。 ＡＬ−ＤＰ−１７３０を用いたＲＳＶのin vivo抑制。実施例に提示される方法を用いて、用量依存性活性に関してＡＬ−ＤＰ−１７３０を試験した。当該作用物質は、用量依存性応答を示した。 ｉＲＮＡ剤を用いたＲＳＶのin vivo抑制。実施例に記載されるように、in vivo抗ＲＳＶ活性に関して、図に記載されるｉＲＮＡ剤を試験した。 ｉＲＮＡ剤を用いたＲＳＶのin vivo抑制。実施例に記載されるように、in vivoでの抗ＲＳＶ活性に関して、図に示されるｉＲＮＡ剤を試験した。 臨床分離株からのＲＳＶ Ｎ遺伝子の配列解析。 分離株ＬＡＰ６８２４に対するＡＬＮ−ＲＳＶ０１認識部位における単一塩基変異を示す遅速増殖性ＲＳＶ臨床分離株からのＲＳＶ遺伝子の配列解析。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤物質に関する製造工程を示す流れ図。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤物質の固相合成に関与するステップのサイクルの図解。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤物質の固相合成後の切断および脱保護化反応の図解。 図１３Ａおよび１３Ｂは、エーロゾルにより送達されるｉＲＮＡ剤を用いたＲＳＶのin vivo抑制を示す。実施例に記載されるように、in vivoでの抗ＲＳＶ活性に関して、図に記載されたｉＲＮＡ剤を試験した。 図１３Ａおよび１３Ｂは、エーロゾルにより送達されるｉＲＮＡ剤を用いたＲＳＶのin vivo抑制を示す。実施例に記載されるように、in vivoでの抗ＲＳＶ活性に関して、図に記載されたｉＲＮＡ剤を試験した。 ｉＲＮＡ剤を用いたＲＳＶ感染に対するin vivo防御。防御活性に関して試験するためのＲＳＶ攻撃誘発の前に、図に記載されたｉＲＮＡ剤を試験した。 霧状化ｉＲＮＡ剤のin vitro活性。記載されたｉＲＮＡ剤を霧状化し、ＲＳＶ感染のin vitro検定において活性を保持することが示された。 ＲＳＶを標的とするｓｉＲＮＡであるＡＬＮ−ＲＳＶ０１の吸入後のヒト被験者における用量投与後３０分の肺機能（ＦＥＶ１（Ｌ））。用量は（ｍｇ）／ｋｇ（平均体重７０ｋｇとした）。 吸入後のヒト対非ヒト哺乳類におけるＲＳＶを標的とするｓｉＲＮＡ ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の平均血漿レベル。 多用量投与（総用量０．６ｍｇ／ｋｇで３日間１日１回）のｓｉＲＮＡ ＡＬＮ−ＲＳＶ０１ターゲッティングＲＳＶの吸入後のヒト被験者における白血球数。 ＲＳＶを標的とするｓｉＲＮＡ ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の投与後の肺中のＲＳＶ。ＲＳＶ滴注は鼻内によった（１０６ｐｆｕ）。ｓｉＲＮＡの固定総用量は１２０であった。単一投与は−４時間、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３により示される。３日間に亘る分割用量は、Ｄ１＋Ｄ２＋Ｄ３により示される。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１二重鎖の構造。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、３’末端が２つのチミジン単位でキャップされる２つの部分的相補性一本鎖ＲＮＡのハイブリダイゼーションにより形成される合成二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）オリゴヌクレオチドである。ハイブリダイゼーションは１９リボヌクレオチド塩基対にわたって生じ、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１分子を産生する。ホスホジエステル官能基はすべて、ナトリウムイオンを対イオンとして、中性ｐＨで負荷電される。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１のin vitroＩＣ５０。２４ウェルプレート中のベロ細胞を漸減濃度のＡＬＮ−ＲＳＶ０１でトランスフェクトし、その後、２００〜３００ｐｆｕのＲＳＶ／Ａ２に感染させた。感染後５日目に、細胞を固定し、免疫染色して、計数した。ＰＢＳに対する活性％をプロットし、ＸＬＦｉｔソフトウェアを用いてＩＣ５０を測定した。 ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける単一および多数回用量投与後のＡＬＮ−ＲＳＶ０１のin vivo活性。Ａ）ＡＬＮ−ＲＳＶ０１in vivo用量応答曲線。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１×１０６ｐｆｕのＲＳＶ／Ａ２による感染の４時間前に、漸増濃度（２５ｕｇ、５０ｕｇまたは１００ｕｇ）のＡＬＮ−ＲＳＶ０１、対照ｓｉＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−１７３０またはＰＢＳで鼻内処置した。肺を採取し、標準免疫染色プラーク検定によりウイルスを定量し、ｌｏｇ ｐｆｕ／肺１ｇとしてプロットした。Ｂ）ＡＬＮ−ＲＳＶ０１多用量試験。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、４０ｕｇ、８０ｕｇまたは１２０ｕｇ（単一用量処置）あるいは４０ｕｇ（多用量、毎日処置）で、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはミスマッチｓｉＲＮＡ（１７３０）で鼻内処置した。Ｄ５に肺を採取し、標準免疫染色プラーク検定によりウイルスを定量した。−４、感染４時間前；Ｄ１、感染後１日目；Ｄ２、感染後２日目；Ｄ３、感染後３日目。Ｃ）ＡＬＮ−ＲＳＶ０１同日多用量試験。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＲＳＶ感染後１または２日目の単一用量群に関しては、４０ｕｇ、６０ｕｇ、８０ｕｇまたは１２０ｕｇで、あるいはＲＳＶ感染後１または２日目の多用量群に関しては４０ｕｇ、１日２回または３回（多用量、毎日処置）で、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはミスマッチｓｉＲＮＡ（１７３０）で鼻内処置した。肺を採取し、免疫染色プラーク検定によりウイルスを定量した。 ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける単一および多数回用量投与後のＡＬＮ−ＲＳＶ０１のin vivo活性。Ａ）ＡＬＮ−ＲＳＶ０１in vivo用量応答曲線。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１×１０６ｐｆｕのＲＳＶ／Ａ２による感染の４時間前に、漸増濃度（２５ｕｇ、５０ｕｇまたは１００ｕｇ）のＡＬＮ−ＲＳＶ０１、対照ｓｉＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−１７３０またはＰＢＳで鼻内処置した。肺を採取し、標準免疫染色プラーク検定によりウイルスを定量し、ｌｏｇ ｐｆｕ／肺１ｇとしてプロットした。Ｂ）ＡＬＮ−ＲＳＶ０１多用量試験。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、４０ｕｇ、８０ｕｇまたは１２０ｕｇ（単一用量処置）あるいは４０ｕｇ（多用量、毎日処置）で、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはミスマッチｓｉＲＮＡ（１７３０）で鼻内処置した。Ｄ５に肺を採取し、標準免疫染色プラーク検定によりウイルスを定量した。−４、感染４時間前；Ｄ１、感染後１日目；Ｄ２、感染後２日目；Ｄ３、感染後３日目。Ｃ）ＡＬＮ−ＲＳＶ０１同日多用量試験。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＲＳＶ感染後１または２日目の単一用量群に関しては、４０ｕｇ、６０ｕｇ、８０ｕｇまたは１２０ｕｇで、あるいはＲＳＶ感染後１または２日目の多用量群に関しては４０ｕｇ、１日２回または３回（多用量、毎日処置）で、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはミスマッチｓｉＲＮＡ（１７３０）で鼻内処置した。肺を採取し、免疫染色プラーク検定によりウイルスを定量した。 ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける単一および多数回用量投与後のＡＬＮ−ＲＳＶ０１のin vivo活性。Ａ）ＡＬＮ−ＲＳＶ０１in vivo用量応答曲線。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１×１０６ｐｆｕのＲＳＶ／Ａ２による感染の４時間前に、漸増濃度（２５ｕｇ、５０ｕｇまたは１００ｕｇ）のＡＬＮ−ＲＳＶ０１、対照ｓｉＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−１７３０またはＰＢＳで鼻内処置した。肺を採取し、標準免疫染色プラーク検定によりウイルスを定量し、ｌｏｇ ｐｆｕ／肺１ｇとしてプロットした。Ｂ）ＡＬＮ−ＲＳＶ０１多用量試験。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、４０ｕｇ、８０ｕｇまたは１２０ｕｇ（単一用量処置）あるいは４０ｕｇ（多用量、毎日処置）で、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはミスマッチｓｉＲＮＡ（１７３０）で鼻内処置した。Ｄ５に肺を採取し、標準免疫染色プラーク検定によりウイルスを定量した。−４、感染４時間前；Ｄ１、感染後１日目；Ｄ２、感染後２日目；Ｄ３、感染後３日目。Ｃ）ＡＬＮ−ＲＳＶ０１同日多用量試験。ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ＲＳＶ感染後１または２日目の単一用量群に関しては、４０ｕｇ、６０ｕｇ、８０ｕｇまたは１２０ｕｇで、あるいはＲＳＶ感染後１または２日目の多用量群に関しては４０ｕｇ、１日２回または３回（多用量、毎日処置）で、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはミスマッチｓｉＲＮＡ（１７３０）で鼻内処置した。肺を採取し、免疫染色プラーク検定によりウイルスを定量した。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、in vitroにおいて、ＩＦＮαおよびＴＮＦα対して中程度の刺激性を有する。ｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはミスマッチ陽性対照、７２９６および５０４８）を、末梢血単核球中にトランスフェクトし、感染後２４時間目にサイトカインの誘導に関してＥＬＩＳＡにより検定した。Ａ）ＩＦＮα誘導；Ｂ）ＴＮＦα誘導。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、in vitroにおいて、ＩＦＮαおよびＴＮＦα対して中程度の刺激性を有する。ｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはミスマッチ陽性対照、７２９６および５０４８）を、末梢血単核球中にトランスフェクトし、感染後２４時間目にサイトカインの誘導に関してＥＬＩＳＡにより検定した。Ａ）ＩＦＮα誘導；Ｂ）ＴＮＦα誘導。 ＴＮＦαおよびＩＦＮα刺激性ミスマッチｓｉＲＮＡは、in vivoでＲＳＶを調節しない。Ａ）末梢血単核球中にトランスフェクトされたｓｉＲＮＡを、トランスフェクション後２４時間目にＴＮＦα刺激について検定した。Ｂ）末梢血単核球中にトランスフェクトされたｓｉＲＮＡを、トランスフェクション後２４時間目にＩＦＮα刺激について検定した。Ｃ）０日目にＲＳＶで、そして接種前４時間にＲＳＶ特異的ｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ−ＲＳＶ０１）またはミスマッチ対照免疫刺激性ｓｉＲＮＡ（２１５３および１７３０）で、鼻内用量投与されたマウスからの肺ウイルス濃度。感染後５日目に免疫染色プラーク検定により、肺ＲＳＶ濃度を測定した。 ＴＮＦαおよびＩＦＮα刺激性ミスマッチｓｉＲＮＡは、in vivoでＲＳＶを調節しない。Ａ）末梢血単核球中にトランスフェクトされたｓｉＲＮＡを、トランスフェクション後２４時間目にＴＮＦα刺激について検定した。Ｂ）末梢血単核球中にトランスフェクトされたｓｉＲＮＡを、トランスフェクション後２４時間目にＩＦＮα刺激について検定した。Ｃ）０日目にＲＳＶで、そして接種前４時間にＲＳＶ特異的ｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ−ＲＳＶ０１）またはミスマッチ対照免疫刺激性ｓｉＲＮＡ（２１５３および１７３０）で、鼻内用量投与されたマウスからの肺ウイルス濃度。感染後５日目に免疫染色プラーク検定により、肺ＲＳＶ濃度を測定した。 ＴＮＦαおよびＩＦＮα刺激性ミスマッチｓｉＲＮＡは、in vivoでＲＳＶを調節しない。Ａ）末梢血単核球中にトランスフェクトされたｓｉＲＮＡを、トランスフェクション後２４時間目にＴＮＦα刺激について検定した。Ｂ）末梢血単核球中にトランスフェクトされたｓｉＲＮＡを、トランスフェクション後２４時間目にＩＦＮα刺激について検定した。Ｃ）０日目にＲＳＶで、そして接種前４時間にＲＳＶ特異的ｓｉＲＮＡ（ＡＬＮ−ＲＳＶ０１）またはミスマッチ対照免疫刺激性ｓｉＲＮＡ（２１５３および１７３０）で、鼻内用量投与されたマウスからの肺ウイルス濃度。感染後５日目に免疫染色プラーク検定により、肺ＲＳＶ濃度を測定した。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１のウイルス抑制は、in vivoでのＲＮＡｉにより媒介される。部位特異的切断産物の生成を実証するために用いられた５’−ＲＡＣＥ検定の模式図を示す。マウスに０日目にＲＳＶを接種して、３日目にＡＬＮ−ＲＳＶ０１、ＡＬ−ＤＰ−１７３０またはＰＢＳで処置し、その後、肺をホモジナイズして、感染後５日目にＲＡＣＥにより評価したin vivoウイルス抑制検定から生成されたリンカー適合性ＲＳＶ Ｎ遺伝子ｃＤＮＡの増幅から単離された個々のクローンの配列解析の結果を、枠で囲んで示す。 ＲＳＶ一次分離株の遺伝子型解析。ＲＳＶ Ｇ遺伝子の解析に基づいた（Ａ）ＲＳＶＡおよび（Ｂ）ＲＳＶ Ｂに関する最大有望系統樹。ブートストラップ値＞７０％（１，０００複製）は、対応する節で示される。丸は、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１標的部位で分析された分離株を示す。 ＲＳＶ一次分離株の遺伝子型解析。ＲＳＶ Ｇ遺伝子の解析に基づいた（Ａ）ＲＳＶＡおよび（Ｂ）ＲＳＶ Ｂに関する最大有望系統樹。ブートストラップ値＞７０％（１，０００複製）は、対応する節で示される。丸は、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１標的部位で分析された分離株を示す。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１による一次ＲＳＶ分離株のin vitro抑制。２４ウェルプレート中のベロ細胞を漸減濃度のＡＬＮ−ＲＳＶ０１でトランスフェクトし、その後、２００〜３００ｐｆｕのＲＳＶ一次分離株に感染させた。感染後５日目に、細胞を固定し、免疫染色して、計数した。ＰＢＳに対する活性％をプロットした。 試料症候スコアカードを示す。 ＲＳＶに対して向けられる治療用ｉＲＮＡ（ＡＬＮ−ＲＳＶ０１）の無作為化二重盲検プラセボ対照試験に用いられた被験者の基準特質を示す。 表は、主要効能結果：感染率（群１〜６）を要約する。 表は、感染（ここで、感染は定量的培養により測定される）に及ぼす個々の作用を評価するために用いられた統計学的分析の結果を要約する。 表は、ＲＳＶ０１効能の無作為化試験の経過中に実証された治療下発現有害事象（出現率＞５％）を要約する。 ＲＳＶに実験的に感染した被験者における鼻内ＡＬＮ−ＲＳＶ０１対プラセボの無作為化第ＩＩ相試験に関する試験計画。ｉ．ｎ．：鼻内；ｄ：試験日；ｈ：時間；Ｒｘ：ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボを用いた用量投与；ＲＳＶ：「群１」および「群２〜６」と分類した枠で示された各群における被験者に投与された接種物量で、ＲＳＶを用いた接種。１回の試験薬剤用量投与を受けたがＲＳＶ接種を受けていない３被験者（有効成分１、プラセボ２）を、食餌性胃腸炎のため、群６から撤退させた。したがって、安全性に関しては８８例を、効能に関しては８５例を評価した。被験者を、２日目から１１日目まで隔離した。試験薬剤またはＲＳＶ接種に影響を及ぼさないため−１、０および１日目を除いて、隔離中は毎日、鼻洗浄物を得た。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１およびプラセボについて、逆カプラン・マイヤー曲線を示す。感染は、（Ａ）定量的培養（プラーク検定）、または（Ｂ）ｑＲＴ−ＰＣＲにより確定した。ＲＳＶ接種は０日目に実施したが、一方、鼻内ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボによる毎日処置は、−１日目から３日目まで継続した。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボで処置された被験者における定量的ウイルスおよび疾患測定値。パネルＡ〜Ｄ：示した結果は、各処置アームで重ねられる感染および非感染被験者に関するものであり、感染は定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。パネル（Ａ）および（Ｂ）では、バーは、０日目にウイルス接種後、２〜１１日目の間のウイルスＡＵＣおよびピークウイルス負荷に関する平均および標準誤差を示す。パネル（Ｃ）および（Ｄ）では、曲線は、２〜１１日目の各々の日に負荷されたウイルスに関する平均および標準誤差を示す。パネルＥ〜Ｇ：結果は、各処置アームにおける全被験者に関するものであり、群（水平バー）に関する個々の結果（小点）および平均を、（Ｅ）平均総症候スコア、（Ｆ）平均総指示身体検査（ＤＰＥ）スコア、および（Ｇ）平均粘液重量に関して示す。パネルＨ〜Ｉ：試験日ごとのＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボに関する平均１日症候スコアおよび標準誤差。（Ｈ）全被験者に関する、または（Ｉ）感染被験者に関する結果を示す。定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより感染を確証した。０日目にＲＳＶの接種を実施し、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボを用いた処置の期間を中黒水平バーで示す。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボで処置された被験者における定量的ウイルスおよび疾患測定値。パネルＡ〜Ｄ：示した結果は、各処置アームで重ねられる感染および非感染被験者に関するものであり、感染は定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。パネル（Ａ）および（Ｂ）では、バーは、０日目にウイルス接種後、２〜１１日目の間のウイルスＡＵＣおよびピークウイルス負荷に関する平均および標準誤差を示す。パネル（Ｃ）および（Ｄ）では、曲線は、２〜１１日目の各々の日に負荷されたウイルスに関する平均および標準誤差を示す。パネルＥ〜Ｇ：結果は、各処置アームにおける全被験者に関するものであり、群（水平バー）に関する個々の結果（小点）および平均を、（Ｅ）平均総症候スコア、（Ｆ）平均総指示身体検査（ＤＰＥ）スコア、および（Ｇ）平均粘液重量に関して示す。パネルＨ〜Ｉ：試験日ごとのＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボに関する平均１日症候スコアおよび標準誤差。（Ｈ）全被験者に関する、または（Ｉ）感染被験者に関する結果を示す。定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより感染を確証した。０日目にＲＳＶの接種を実施し、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボを用いた処置の期間を中黒水平バーで示す。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボで処置された被験者における定量的ウイルスおよび疾患測定値。パネルＡ〜Ｄ：示した結果は、各処置アームで重ねられる感染および非感染被験者に関するものであり、感染は定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。パネル（Ａ）および（Ｂ）では、バーは、０日目にウイルス接種後、２〜１１日目の間のウイルスＡＵＣおよびピークウイルス負荷に関する平均および標準誤差を示す。パネル（Ｃ）および（Ｄ）では、曲線は、２〜１１日目の各々の日に負荷されたウイルスに関する平均および標準誤差を示す。パネルＥ〜Ｇ：結果は、各処置アームにおける全被験者に関するものであり、群（水平バー）に関する個々の結果（小点）および平均を、（Ｅ）平均総症候スコア、（Ｆ）平均総指示身体検査（ＤＰＥ）スコア、および（Ｇ）平均粘液重量に関して示す。パネルＨ〜Ｉ：試験日ごとのＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボに関する平均１日症候スコアおよび標準誤差。（Ｈ）全被験者に関する、または（Ｉ）感染被験者に関する結果を示す。定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより感染を確証した。０日目にＲＳＶの接種を実施し、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボを用いた処置の期間を中黒水平バーで示す。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボで処置された被験者における定量的ウイルスおよび疾患測定値。パネルＡ〜Ｄ：示した結果は、各処置アームで重ねられる感染および非感染被験者に関するものであり、感染は定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。パネル（Ａ）および（Ｂ）では、バーは、０日目にウイルス接種後、２〜１１日目の間のウイルスＡＵＣおよびピークウイルス負荷に関する平均および標準誤差を示す。パネル（Ｃ）および（Ｄ）では、曲線は、２〜１１日目の各々の日に負荷されたウイルスに関する平均および標準誤差を示す。パネルＥ〜Ｇ：結果は、各処置アームにおける全被験者に関するものであり、群（水平バー）に関する個々の結果（小点）および平均を、（Ｅ）平均総症候スコア、（Ｆ）平均総指示身体検査（ＤＰＥ）スコア、および（Ｇ）平均粘液重量に関して示す。パネルＨ〜Ｉ：試験日ごとのＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボに関する平均１日症候スコアおよび標準誤差。（Ｈ）全被験者に関する、または（Ｉ）感染被験者に関する結果を示す。定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより感染を確証した。０日目にＲＳＶの接種を実施し、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボを用いた処置の期間を中黒水平バーで示す。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボで処置された被験者における定量的ウイルスおよび疾患測定値。パネルＡ〜Ｄ：示した結果は、各処置アームで重ねられる感染および非感染被験者に関するものであり、感染は定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。パネル（Ａ）および（Ｂ）では、バーは、０日目にウイルス接種後、２〜１１日目の間のウイルスＡＵＣおよびピークウイルス負荷に関する平均および標準誤差を示す。パネル（Ｃ）および（Ｄ）では、曲線は、２〜１１日目の各々の日に負荷されたウイルスに関する平均および標準誤差を示す。パネルＥ〜Ｇ：結果は、各処置アームにおける全被験者に関するものであり、群（水平バー）に関する個々の結果（小点）および平均を、（Ｅ）平均総症候スコア、（Ｆ）平均総指示身体検査（ＤＰＥ）スコア、および（Ｇ）平均粘液重量に関して示す。パネルＨ〜Ｉ：試験日ごとのＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボに関する平均１日症候スコアおよび標準誤差。（Ｈ）全被験者に関する、または（Ｉ）感染被験者に関する結果を示す。定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより感染を確証した。０日目にＲＳＶの接種を実施し、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボを用いた処置の期間を中黒水平バーで示す。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボで処置された被験者における定量的ウイルスおよび疾患測定値。パネルＡ〜Ｄ：示した結果は、各処置アームで重ねられる感染および非感染被験者に関するものであり、感染は定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。パネル（Ａ）および（Ｂ）では、バーは、０日目にウイルス接種後、２〜１１日目の間のウイルスＡＵＣおよびピークウイルス負荷に関する平均および標準誤差を示す。パネル（Ｃ）および（Ｄ）では、曲線は、２〜１１日目の各々の日に負荷されたウイルスに関する平均および標準誤差を示す。パネルＥ〜Ｇ：結果は、各処置アームにおける全被験者に関するものであり、群（水平バー）に関する個々の結果（小点）および平均を、（Ｅ）平均総症候スコア、（Ｆ）平均総指示身体検査（ＤＰＥ）スコア、および（Ｇ）平均粘液重量に関して示す。パネルＨ〜Ｉ：試験日ごとのＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボに関する平均１日症候スコアおよび標準誤差。（Ｈ）全被験者に関する、または（Ｉ）感染被験者に関する結果を示す。定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより感染を確証した。０日目にＲＳＶの接種を実施し、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボを用いた処置の期間を中黒水平バーで示す。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボで処置された被験者における定量的ウイルスおよび疾患測定値。パネルＡ〜Ｄ：示した結果は、各処置アームで重ねられる感染および非感染被験者に関するものであり、感染は定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。パネル（Ａ）および（Ｂ）では、バーは、０日目にウイルス接種後、２〜１１日目の間のウイルスＡＵＣおよびピークウイルス負荷に関する平均および標準誤差を示す。パネル（Ｃ）および（Ｄ）では、曲線は、２〜１１日目の各々の日に負荷されたウイルスに関する平均および標準誤差を示す。パネルＥ〜Ｇ：結果は、各処置アームにおける全被験者に関するものであり、群（水平バー）に関する個々の結果（小点）および平均を、（Ｅ）平均総症候スコア、（Ｆ）平均総指示身体検査（ＤＰＥ）スコア、および（Ｇ）平均粘液重量に関して示す。パネルＨ〜Ｉ：試験日ごとのＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボに関する平均１日症候スコアおよび標準誤差。（Ｈ）全被験者に関する、または（Ｉ）感染被験者に関する結果を示す。定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより感染を確証した。０日目にＲＳＶの接種を実施し、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボを用いた処置の期間を中黒水平バーで示す。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボで処置された被験者における定量的ウイルスおよび疾患測定値。パネルＡ〜Ｄ：示した結果は、各処置アームで重ねられる感染および非感染被験者に関するものであり、感染は定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。パネル（Ａ）および（Ｂ）では、バーは、０日目にウイルス接種後、２〜１１日目の間のウイルスＡＵＣおよびピークウイルス負荷に関する平均および標準誤差を示す。パネル（Ｃ）および（Ｄ）では、曲線は、２〜１１日目の各々の日に負荷されたウイルスに関する平均および標準誤差を示す。パネルＥ〜Ｇ：結果は、各処置アームにおける全被験者に関するものであり、群（水平バー）に関する個々の結果（小点）および平均を、（Ｅ）平均総症候スコア、（Ｆ）平均総指示身体検査（ＤＰＥ）スコア、および（Ｇ）平均粘液重量に関して示す。パネルＨ〜Ｉ：試験日ごとのＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボに関する平均１日症候スコアおよび標準誤差。（Ｈ）全被験者に関する、または（Ｉ）感染被験者に関する結果を示す。定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより感染を確証した。０日目にＲＳＶの接種を実施し、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボを用いた処置の期間を中黒水平バーで示す。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボで処置された被験者における定量的ウイルスおよび疾患測定値。パネルＡ〜Ｄ：示した結果は、各処置アームで重ねられる感染および非感染被験者に関するものであり、感染は定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。パネル（Ａ）および（Ｂ）では、バーは、０日目にウイルス接種後、２〜１１日目の間のウイルスＡＵＣおよびピークウイルス負荷に関する平均および標準誤差を示す。パネル（Ｃ）および（Ｄ）では、曲線は、２〜１１日目の各々の日に負荷されたウイルスに関する平均および標準誤差を示す。パネルＥ〜Ｇ：結果は、各処置アームにおける全被験者に関するものであり、群（水平バー）に関する個々の結果（小点）および平均を、（Ｅ）平均総症候スコア、（Ｆ）平均総指示身体検査（ＤＰＥ）スコア、および（Ｇ）平均粘液重量に関して示す。パネルＨ〜Ｉ：試験日ごとのＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボに関する平均１日症候スコアおよび標準誤差。（Ｈ）全被験者に関する、または（Ｉ）感染被験者に関する結果を示す。定量的培養またはｑＲＴ−ＰＣＲにより感染を確証した。０日目にＲＳＶの接種を実施し、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボを用いた処置の期間を中黒水平バーで示す。 ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボで処置した被験者における鼻内サイトカイン濃度。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１（中黒菱形）またはプラセボ（中白四角）を接種した被験者についての試験−２日目および２〜１１日目での平均１日鼻洗浄物サイトカイン濃度および標準誤差を示す。０日目にＲＳＶの接種を実施し、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボを用いた処置の期間を中黒水平バーで示す。 ヒト患者における特異ｉＲＮＡ媒介による切断産物。（Ａ）は、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１で処置した患者から採取した鼻試料が、プラセボ処置患者に比して増大した特異切断産物レベルを有する、ということを示す。（Ｂ）は、ＲＳＶ力価対正しい切断％のプロット（左）、ならびに正しい切断％対薬剤用量投与後時間の間の関係（右）を示す。 ヒト患者における特異ｉＲＮＡ媒介による切断産物。（Ａ）は、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１で処置した患者から採取した鼻試料が、プラセボ処置患者に比して増大した特異切断産物レベルを有する、ということを示す。（Ｂ）は、ＲＳＶ力価対正しい切断％のプロット（左）、ならびに正しい切断％対薬剤用量投与後時間の間の関係（右）を示す。
本明細書は、以下の略語のうちの1つ以上に言及し得るが、その意味を以下の表２に明
記する。

説明を容易にするために、「ヌクレオチド」または「リボヌクレオチド」という用語は、時として、ＲＮＡ剤の1つまたは複数の単量体サブユニットに関して本明細書中で用いられる。本明細書中での「リボヌクレオチド」または「ヌクレオチド」という用語の使用法は、修飾ＲＮＡまたはヌクレオチドサロゲートの場合、1つまたは複数の位置での、以
下でさらに記載される、修飾ヌクレオチドまたはサロゲート代替部分も指す、と理解される。
「ＲＮＡ剤」は、本明細書中で用いる場合、非修飾ＲＮＡ、修飾ＲＮＡまたはヌクレオシドサロゲートであり、そのすべてが、本明細書中で記載され、あるいはＲＮＡ合成の当該技術分野でよく知られている。多数の修飾ＲＮＡおよびヌクレオシドサロゲートが記載されているが、好ましい例としては、非修飾ＲＮＡよりも大きいヌクレアーゼ分解耐性を有するものが挙げられる。好ましい例としては、２’糖修飾、一本鎖オーバーハング、好ましくは３’一本鎖オーバーハング、または、特に一本鎖の場合、1つまたは複数のリン
酸期またはリン酸基の1つまたは複数の類似体を含む５’修飾を有するものが挙げられる
。
「ｉＲＮＡ剤」（「干渉ＲＮＡ剤」の略語）は、本明細書中で用いる場合、標的遺伝子、例えばＲＳＶの発現を下方調節し得るＲＮＡ剤である。理論に縛られずに考えると、ｉＲＮＡ剤は、時としてＲＮＡｉと当該技術分野で呼ばれる標的ｍＲＮＡの転写後切断、転写前または翻訳前機序を含む多数の機序、のうちの1つ以上により作用し得る。ｉＲＮＡ
剤は、二本鎖（ｄｓ）ｉＲＮＡ剤であり得る。
「ｄｓ ｉＲＮＡ剤」（「二本鎖ｉＲＮＡ剤」に対する略語）は、本明細書中で用いる場合、鎖間ハイブリダイゼーションが二重鎖構造の領域を形成し得る、１つより多い、好ましくは２つの鎖を含むｉＲＮＡ剤である。「鎖」は、本明細書中では、ヌクレオチド（非天然または修飾ヌクレオチドを含む）の連続配列を指す。２またはそれより多くの鎖は、別個の分子であり得るし、またはその一部を各々が形成し得るか、あるいはそれらは、例えばリンカー、例えばポリエチレングリコールリンカーにより共有的に相互連結されて、ただ１つの分子を形成し得る。少なくとも１つの鎖は、標的ＲＮＡと十分に相補的である領域を包含し得る。このような鎖は、「アンチセンス鎖」と呼ばれる。アンチセンス鎖と相補的な領域を含む、ｄｓＲＮＡ剤中に含まれる第二の鎖は、「センス鎖」と呼ばれる。しかしながらｄｓ ｉＲＮＡ剤は、少なくとも部分的に、自己相補性であり、例えばヘアピンまたはフライパンの柄構造、例えば二重鎖領域を形成する単一ＲＮＡ分子からも形成され得る。このような場合、「鎖」という用語は、同一ＲＮＡ分子の別の領域と相補的であるＲＮＡ分子の領域のうちの１つを指す。
哺乳類細胞において、長いｄｓ ｉＲＮＡ剤は、しばしば有害であるインターフェロン応答を誘導し得るが、短いｄｓ ｉＲＮＡ剤は、少なくとも、細胞および／または宿主に対して有害である程度に、インターフェロン応答を誘発することはない。本発明のｉＲＮＡ剤は、それらが哺乳類細胞において有害インターフェロン応答を誘発しない十分に短い分子を包含する。したがって、哺乳類細胞へのｉＲＮＡ剤の組成物（例えば本明細書中に記載されるように処方される）の投与は、有害インターフェロン応答を回避しながら、ＲＳＶ遺伝子の発現を抑制するために用いられ得る。それらが有害インターフェロン応答を誘発しないほど十分に短い分子は、本明細書中ではｓｉＲＮＡ剤またはｓｉＲＮＡと呼ばれる。「ｓｉＲＮＡ剤」または「ｓｉＲＮＡ」は、本明細書中で用いる場合、それがヒト細胞において有害インターフェロン応答を誘導しないほど、例えばそれが３０ヌクレオチド対未満の二重鎖化領域を有するほど十分に短いｉＲＮＡ剤、例えばｄｓ ｉＲＮＡ剤を指す。
本明細書中で記載される単離ｉＲＮＡ剤、例えばｄｓ ｉＲＮＡ剤およびｓｉＲＮＡ剤は、例えばＲＮＡ分解により、遺伝子のサイレンシングを媒介し得る。便宜上、このようなＲＮＡは、本明細書中では、サイレンシングされるべきＲＮＡと呼ばれる。このような遺伝子は、標的遺伝子とも呼ばれる。好ましくは、サイレンシングされるべきＲＮＡは、ＲＳＶ遺伝子の遺伝子産物、特にＰ、ＮまたはＬ遺伝子産物である。
本明細書中で用いる場合、「ＲＮＡｉを媒介する」という語句は、配列特異的に、標的遺伝子をサイレンシングする作用物質の能力を指す。「標的遺伝子をサイレンシングする」とは、当該作用物質と接触しない場合、標的遺伝子のある産物を含有するかおよび／または分泌する細胞が、当該作用物質と接触していない類似の細胞と比較して、当該作用物質と接触した場合、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％少ない、このような遺伝子産物を含有するかおよび／または分泌する。標的遺伝子のこのような産物は、例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、タンパク質または調節素子であり得る。
本発明の抗ウイルス的使用では、標的遺伝子のサイレンシングは、細胞における、または被験者における「ウイルス力価」の低減を生じる。本明細書中で用いる場合、「ウイルス力価の低減」は、ウイルス標的遺伝子のサイレンシングを受けている細胞で産生される、または生体で見出される、測定可能なウイルスの量の低減を指す。産生されるウイルスの細胞内量の低減は、好ましくは、治療を受けている被験者の組織中で産生される測定可能ウイルスの量の低減を、そしてウイルス感染の症候の重症度の低減をもたらす。本発明のｉＲＮＡ剤は、「抗ウイルスｉＲＮＡ剤」とも呼ばれる。
本明細書中で用いる場合、「ＲＳＶ遺伝子」は、ＲＳＶウイルスゲノム中で特定される遺伝子のうちのいずれか１つを指す（Falsey, A.R., and E.E. Walsh, 2000, Clinical Microbiological Reviews 13: 371-84参照）。これらの遺伝子は当該技術分野
で容易に知られ、そして本明細書中で例示されるＮ、ＰおよびＬ遺伝子を包含する。
本明細書中で用いる場合、「相補的な」という用語は、本発明の化合物と標的ＲＮＡ分子、例えばＲＳＶウイルスｍＲＮＡ分子との間に安定且つ特異的な結合が生じるのに十分程度の相補性を示すために用いられる。特異的結合は、特異的結合が所望される条件下で、すなわち、in vivo検定または治療的処置の場合には生理学的条件下で、あるいはin vitro検定の場合には検定が実施される条件下で、オリゴマー化合物と非標的配列との非
特異的結合を回避するのに十分程度の相補性を要する。非標的配列は、典型的には、少なくとも４ヌクレオチド異なる。
本明細書中で用いる場合、ｉＲＮＡ剤が細胞中で標的ＲＮＡによりコードされるタンパク質の産生を低減する場合、ｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡ（例えば標的ＲＳＶｍＲＮＡ）と「十分に相補的」である。ｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡと「正確に相補的」でもあり、例えば標的ＲＮＡおよびｉＲＮＡ剤はアニーリングして、好ましくは、正確な相補性の領域でワトソン・クリック塩基対から専ら成るハイブリッドを形成する。「十分に相補的な」ｉＲＮＡ剤は、標的ウイルスＲＮＡと正確に相補的である（例えば少なくとも１０ヌクレオチドの）内部領域を包含し得る。さらに、いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、具体的には、単一のヌクレオチドの違いを識別する。この場合、ｉＲＮＡ剤は、正確な相補性が単一のヌクレオチドが異なる（例えば７ヌクレオチド内の）領域に見出される場合にのみ、ＲＮＡｉを媒介する。好ましいｉＲＮＡ剤は、実施例で提供されるセンスおよびアンチセンス配列に基づいているか、それらで構成されるかまたはそれらを含む。
本明細書中で用いる場合、「本質的に同一である」とは、第二のヌクレオチド配列と比較して第一のヌクレオチド配列に言及して用いられる場合、１、２または３つまでのヌクレオチド置換（例えばアデノシンがウラシルにより置換される）以外は、第一のヌクレオチド配列が第二のヌクレオチド配列と同一である、ということを意味する。
本明細書中で用いる場合、「被験者」は、ウイルス発現により媒介される障害、例えばＲＳＶ感染のための治療を受けている、あるいはウイルス感染を予防的に防止するための治療を受けている哺乳類生物体を指す。被験者は、任意の哺乳類、例えば霊長類、ウシ、ウマ、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヤギであり得る。好ましい実施形態では、被験者はヒトである。
本明細書中で用いる場合、ＲＳＶ感染を治療することは、１)一部は被験者中のウイル
スの存在により媒介され、ならびに２）その結果が存在するウイルス遺伝子産物のレベルを低減することにより左右され得る任意の生物学的または病理学的終点の改善を指す。
ｉＲＮＡ剤の設計および選択
本発明は、鼻内投与／吸入によるｉＲＮＡ剤の肺および鼻通路への局所投与、あるいは注射による全身的／非経口的投与後のin vivoでの呼吸器ウイルス遺伝子の標的遺伝子サイレンシングの実証と、その結果生じるウイルス感染の治療を基礎にしている。本発明はさらに、１つより多くの呼吸器ウイルスに対するｉＲＮＡ剤の使用、ならびに２またはそれより多くのｉＲＮＡ剤の同時投与を伴う両ウイルス感染の治療に広げられる。
これらの結果に基づいて、本発明は、具体的には、ウイルス感染、特に呼吸器ウイルスおよび特にＲＳＶ感染を治療するのに用いられ得る、単離形態でのおよび下記の製剤組成物としてのｉＲＮＡ剤を提供する。このような作用物質は、ウイルス遺伝子と相補的である少なくとも１５またはそれより多くの連続ヌクレオチドを有するセンス鎖、ならびにセンス鎖配列と相補的である少なくとも１５またはそれより多くの連続ヌクレオチドを有するアンチセンス鎖を包含する。特に有用なのは、表１（ａ〜ｃ）に提示される、Ｐ、ＮおよびＬ遺伝子からのヌクレオチドからなるか、本質的にそれらからなり、またはそれらを含むｉＲＮＡ剤である。
本発明のｉＲＮＡ剤は、表１（ａ〜ｃ）で活性であることが示されているｉＲＮＡ剤のうちの１つからの少なくとも１５またはそれより多くの連続ヌクレオチドを基礎にし、それらを含む。このような作用物質において、作用物質は表中に提示される全配列からなり、または本質的にそれらからなり、またはそれらを含み得るし、あるいは標的遺伝子の連続領域からの付加的ヌクレオチドとともに、表１ａ〜ｃに提示される１５またはそれより多くの連続残基を含み得る。
ｉＲＮＡ剤は、配列情報および所望の特性、ならびに表１（ａ〜ｃ）に提示される情報に基づいて合理的に設計され得る。例えば、ｉＲＮＡ剤は、表に提示される作用物質の配列に従って、ならびに標的遺伝子の全コード配列にかんがみて、設計され得る。
したがって、本発明は、呼吸器ウイルスからの遺伝子の一部、特にＲＳＶのＰ、ＮまたはＬタンパク質遺伝子と、上で定義したように、本質的に同一である少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチドの配列を各々が含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含むｉＲＮＡ剤を提供する。ｉＲＮＡ剤の例としては、表１（ａ〜ｃ）に提示される作用物質のうちの１つからの１５またはそれより多くの連続ヌクレオチドを含むものが挙げられる。
ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０または５０ヌクレオチド長であるかまたは少なくともそれらのヌクレオチド長であるべきである。それは、５０、４０または３０ヌクレオチド長であるかまたはそれ未満であるべきである。好ましい範囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３および１９〜２１ヌクレオチド長である。ｉＲＮＡ剤の例としては、表１（ａ〜ｃ）中の作用物質のうちの１つのアンチセンス鎖のうちの１つからの１５またはそれより多くのヌクレオチドを含むものが挙げられる。
ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０または５０ヌクレオチド長であるかまたは少なくともそれらのヌクレオチド長であるべきである。それは、５０、４０または３０ヌクレオチド長またはそれ未満であるべきである。好ましい範囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３および１９〜２１ヌクレオチド長である。ｉＲＮＡ剤の例としては、表１（ａ〜ｃ）中の作用物質のうちの１つのセンス鎖のうちの１つからの１５またはそれより多くのヌクレオチドを含むものが挙げられる。
ｉＲＮＡ剤の二本鎖部分は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０または５０ヌクレオチド長であるかまたは少なくともそれらのヌクレオチド対長であるべきである。それは、５０、４０または３０ヌクレオチド対長またはそれ未満であるべきである。好ましい範囲は、１５〜３０、１７〜２５、１９〜２３および１９〜２１ヌクレオチド対長である。
表１（ａ〜ｃ）に提示される作用物質は、各鎖に関して２１ヌクレオチド長である。ｉＲＮＡ剤は、当該作用物質の３’末端の各々の上の２ヌクレオチドオーバーハングを伴う１９ヌクレオチド二本鎖領域を含有する。これらの作用物質は、本明細書中に記載されるように修飾されて、これらの配列の少なくとも一部（１５またはそれより多くの連続ヌクレオチド）および／または当該オリゴヌクレオチド塩基および連結に対する修飾を含む等価の作用物質を得る。
一般的には、本発明のｉＲＮＡ剤は、ウイルス遺伝子、例えばＲＳＶのＰ、ＮまたはＬ部分と十分な相補性を有する領域を包含し、ｉＲＮＡ剤またはその断片が特定ウイルス遺伝子の下方調節を媒介し得るヌクレオチドに関して十分な長さを有する。本発明のｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖は、好ましくは、ＲＳＶのＰ、ＬまたはＮタンパク質に関して本明細書中に存在するようなウイルス遺伝子のｍＲＮＡ配列と完全に相補的である。しかしながら、ｉＲＮＡ剤と標的との間に完全相補性が存在する必要はないが、例えばＲＳＶｍＲＮＡのＲＮＡｉ切断により、ｉＲＮＡ剤またはその切断産物が配列特異的サイレンシングを指図できる程、十分な一致がなければならない。
したがって、本発明のｉＲＮＡ剤は、ウイルス遺伝子、特にＲＳＶのＰ、ＮまたはＬタンパク質の配列のうちの１つと、下に定義するように、本質的に同一である少なくとも１６、１７または１８ヌクレオチドの配列を各々が含むセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む作用物質、例えば表１（ａ〜ｃ）に提示される作用物質を包含するが、但し、下で定義されるように、培養ヒト細胞中でのＲＳＶ発現を抑制する能力を本質的に保持しながら、それぞれ鎖当たり１、２または３以下のヌクレオチドは他のヌクレオチドにより置換されている（例えばアデノシンはウラシルに置換される）。したがって、これらの作用物質は、ウイルス遺伝子、特にＲＳＶのＰ、ＬまたはＮタンパク質遺伝子の配列のうちの１つと同一である少なくとも１５またはそれより多くのヌクレオチドを保有するが、標的ウイルスｍＲＮＡ配列に関して、またはセンスおよびアンチセンス鎖間に１、２または３塩基ミスマッチが導入される。特にアンチセンス鎖中の標的ウイルスｍＲＮＡ配列に対するミスマッチは、末端領域で最も耐容され、そして存在する場合、好ましくは、１つ以上の末端領域に、例えば５’および／または３’末端の６、５、４または３ヌクレオチド内に、最も好ましくはセンス鎖の５’末端またはアンチセンス鎖の３’末端の６、５、４または３ヌクレオチド内に存在する。センス鎖は、分子の全体的な二本鎖特性を保持するのに十分なだけ、アンチセンス鎖と相補的であることのみを必要とする。
ｉＲＮＡ剤が分子の一端または両端に一本鎖または非対合領域を包含するよう、センスおよびアンチセンス鎖、例えば表１（ａ〜ｃ）に例示されるものが選択されることが好ましい。したがって、ｉＲＮＡ剤は、好ましくは、オーバーハング、例えば１または２つの５’または３’オーバーハング、しかし好ましくは対合されて、２〜３ヌクレオチドの３’オーバーハングを含有するセンスおよびアンチセンス鎖を含有する。大部分の実施形態が、３’オーバーハングを有する。好ましいｓｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ剤の一端または両端に、１〜４、好ましくは２または３ヌクレオチド長の一本鎖オーバーハング、好ましくは３’オーバーハングを有する。オーバーハングは、一方の鎖が他方より長いことによる、あるいは同一長の２つの鎖が互い違いに交差されることによる結果であり得る。５’末端は、好ましくはリン酸化される。
二重鎖化領域の好ましい長さは、１５〜３０、最も好ましくは１８、１９、２０、２１、２２および２３ヌクレオチド長、例えば上記のｓｉＲＮＡ剤範囲である。ｓｉＲＮＡ剤の２つの鎖が連結される、例えば共有結合される実施形態も、包含される。必要な二本鎖化領域を提供するヘアピンまたは他の一本鎖構造、好ましくは３’オーバーハングも、本発明の範囲内である。
候補ｉＲＮＡ剤の評価
候補ｉＲＮＡ剤は、標的遺伝子発現を下方調節するその能力を評価され得る。例えば、候補ｉＲＮＡ剤が提供され、そして被験者のウイルス、例えば標的遺伝子を含有するウイルスに感染している、または感染されるであろう細胞、例えばヒト細胞と接触され得る。代替的には、細胞は、標的ウイルス遺伝子が発現される構築物でトランスフェクトされ、したがって、ウイルス感染性モデルの必要性を防止する。候補ｉＲＮＡ剤との接触の前および後の標的遺伝子発現のレベルが、例えばＲＮＡ、タンパク質レベルまたはウイルス力価に関して比較され得る。標的遺伝子から発現されるＲＮＡ、タンパク質またはウイルスの量がｉＲＮＡ剤との接触後に低くなることが確定される場合には、ｉＲＮＡ剤が標的遺伝子発現を下方調節する、と結論づけられ得る。細胞中の標的ウイルスＲＮＡまたはウイルスタンパク質のレベルあるいは細胞または組織中のウイルス力価は、所望される任意の方法により測定され得る。例えば、標的ＲＮＡのレベルは、ノーザンブロット分析、ポリメラーゼ連鎖反応と連結される逆転写（ＲＴ−ＰＣＲ）、ｂＤＮＡ分析またはＲＮアーゼ保護検定により測定され得る。タンパク質のレベルは、例えばウエスタンブロット分析または免疫蛍光法により測定され得る。ウイルス力価は、プラーク形成検定により検出され得る。
ｉＲＮＡ剤の安定性試験、修飾および再試験
候補ｉＲＮＡ剤は、被験者の身体中にｉＲＮＡ剤が導入される場合等、安定性、例えばエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼによる切断に対するその感受性に関して、評価され得る。修飾、特に切断、例えば被験者の身体中に見出される構成成分による切断に感受性を有する部位を特定するための方法が用いられ得る。
切断に感受性を有する部位が特定されると、さらなるｉＲＮＡ剤が設計されおよび／または合成され得るが、この場合、潜在的切断部位は、例えば切断の部位における２’修飾、例えば２’−Ｏ−メチル基の導入により、切断に対して耐性にされる。このさらなるｉＲＮＡ剤は安定性に関して再試験され、このプロセスは、ｉＲＮＡ剤が所望の安定性を示すことが見出されるまで、繰り返され得る。
in vivo試験
ウイルス遺伝子発現を抑制し得ると同定されたｉＲＮＡ剤は、実施例に示されるような動物モデルにおいて（例えば哺乳類、例えばマウス、ラットまたは霊長類において）、in
vivoでの機能に関して試験され得る。例えば、ｉＲＮＡ剤は動物に投与され、ｉＲＮＡ剤は、その生体分布、安定性、ならびにウイルス、例えばＲＳＶ遺伝子発現を抑制するかまたはウイルス力価を低減するその能力に関して、評価され得る。
ｉＲＮＡ剤は、例えば注射により、標的組織に直接投与され得るし、あるいはｉＲＮＡ剤は、ヒトに投与されるのと同様に動物モデルに投与され得る。本明細書中で示されるように、当該作用物質は、好ましくは、ウイルス感染を予防するかまたは治療する一手段として、鼻内にまたは吸入により投与され得る。
ｉＲＮＡ剤は、その細胞内分布に関しても評価され得る。評価は、ｉＲＮＡ剤が細胞中に取り込まれるか否かを確定することを包含する。評価は、ｉＲＮＡ剤の安定性（例えば半減期）を確定することも包含し得る。in vivoでのｉＲＮＡの評価は、ｉＲＮＡ剤を追跡可能マーカー（例えば蛍光マーカー、例えばフルオレセイン；放射性標識、例えば３５Ｓ、３２Ｐ、３３Ｐまたは３Ｈ；金粒子；あるいは免疫組織化学のための抗原粒子）と結合させて用いることにより、あるいは他の適切な検出方法により、助長され得る。
ｉＲＮＡ剤は、ウイルス遺伝子発現を下方調節するその能力に関して評価され得る。in
vivoでのウイルス遺伝子発現レベルは、例えばin situハイブリダイゼーションにより、あるいはｉＲＮＡ剤への曝露の前および後に組織からＲＮＡを単離することにより、測定され得る。組織を採取するために動物を屠殺する必要がある場合、未処置対照動物は比較のために用いられる。標的ウイルスｍＲＮＡは、任意の所望の方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、分枝鎖ＤＮＡ検定またはＲＮアーゼ保護検定（これらに限定されない）により、検出され得る。代替的には、または付加的には、ウイルス遺伝子発現は、ｉＲＮＡ剤で処置された組織抽出物に関してウエスタンブロット分析を実施することにより、またはＥＬＩＳＡにより、モニタリングされ得る。ウイルス力価は、ｐｆｕ検定を用いて確定され得る。
ｉＲＮＡ化学
ＲＮＡｉを媒介してウイルス遺伝子、例えばＲＳＶのＰタンパク質の発現を抑制する単離ｉＲＮＡ剤、例えばｄｓＲＮＡ剤が、本明細書中に記載される。
ｉＲＮＡ剤を製造し、精製するための方法は、核酸化学の技術分野の当業者によく知られている。ある実施形態では、製造方法は、市販の核酸合成剤とともにホスホルアミダイト単量体を用いる固相合成を包含し得る（例えば、”Solid-Phase Synthesis: A Practical Guide,” (Steven A. Kates and Fernando Albericio (eds.), Marcel Dekker, Inc., New York, 2000)参照）。ある実施形態では、本発明は、共同所有Ｐ
ＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０１１４９０（２００５年４月５日出願）に記載されたようなオリゴヌクレオチド合成および精製のための工程および試薬を用いて実行される。
本明細書中で考察されるＲＮＡ剤は、別の状況では修飾されないＲＮＡ、および、例えば効能を改善するために修飾されたＲＮＡ、ならびにヌクレオシドサロゲートのポリマーを包含する。非修飾ＲＮＡは、核酸の構成成分、すなわち糖、塩基およびリン酸部分が、自然界に生じるものと、好ましくはヒト身体中で自然に生じるものと同一であるかまたは本質的に同一である分子を指す。当該技術分野では、稀なまたは例外的であるが天然のＲＮＡを修飾ＲＮＡとしている（例えば、Limbach et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22: 2183-2196参照）。（明らかにこれらが典型的には転写後修飾の結果であるた
め）修飾ＲＮＡとしばしば呼ばれるこのような稀なまたは例外的なＲＮＡは、本明細書中で用いる場合、非修飾ＲＮＡという用語の範囲内である。修飾ＲＮＡは、本明細書中で用いる場合、核酸の構成成分、すなわち糖、塩基およびリン酸部分のうちの1つまたは複数が、自然界で生じるものとは異なる、好ましくは、ヒト身体中に生じるものとは異なる。それらは修飾「ＲＮＡ」として言及されるが、一方、それらは、もちろん、修飾のため、ＲＮＡでない分子を包含する。ヌクレオシドサロゲートは、ハイブリダイゼーションが、リボリン酸主鎖で見られるもの、例えばリボリン酸主鎖の非荷電模倣物と実質的に類似するよう、正しい空間的関係で塩基を提示させる非リボリン酸構築物にリボリン酸主鎖が置き換えられる分子である。上記の各々の例は、本明細書中で考察される。
本明細書中に記載される修飾は、本明細書中に記載される任意の二本鎖ＲＮＡおよびＲＮＡ様分子、例えばｉＲＮＡ剤中に組入れられ得る。ｉＲＮＡ剤のアンチセンスおよびセンス鎖の一方または両方を修飾するのが望ましい。核酸はサブユニットまたはモノマーのポリマーであるので、下記の修飾の多くは、核酸内で反復される位置で生じ、例えば塩基またはリン酸部分あるいはリン酸部分の非連結Ｏの修飾である。いくつかの場合、修飾は、核酸中の対象位置のすべてで生じるが、しかし、多くの、そして実際はほとんどの場合、それは生じない。例として、修飾は、３’または５’末端位置で生じ得るだけ、末端領域で、例えば末端ヌクレオチド上の一位置で、あるいは鎖の最後の２、３、４、５または１０ヌクレオチドで生じ得るだけである。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域またはその両方で生じ得る。例えば、非連結Ｏ位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端で生じるだけであり、一末端領域、例えば末端ヌクレオチド上の一位置で、あるいは鎖の最後の２、３、４、５または１０ヌクレオチドで生じ得るだけであり、あるいは二本鎖および一本鎖領域で、特に末端で生じ得る。同様に、修飾は、センス鎖、アンチセンス鎖またはその両方で生じ得る。いくつかの場合、センスおよびアンチセンス鎖は同一の修飾または同一クラスの修飾を有するが、しかし他の場合は、センスおよびアンチセンス鎖は異なる修飾を有し、例えばある場合には、一方の鎖、例えばセンス鎖のみを修飾するのが所望され得る。
ｉＲＮＡ剤中に修飾を導入する２つの主な目的は、生物学的環境における分解に対するそれらの安定化と、薬理学的特性、例えば薬物動態特性の改善であり、これらは以下でさらに考察される。ｉＲＮＡ剤の糖、塩基または主鎖に対する他の適切な修飾は、共同所有ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１９３（２００４年１月１６日出願）に記載されている。ｉＲＮＡ剤は、非天然塩基、例えば共同所有ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１１８２２（２００４年４月１６日出願）に記載されている塩基を包含し得る。ｉＲＮＡ剤は、非天然糖、例えば非炭水化物環状キャリア分子を包含し得る。ｉＲＮＡ剤に用いるための非天然糖の例示的特徴は、共同所有ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／１１８２９（２００３年４月１６日出願）に記載されている。
ｉＲＮＡ剤は、ヌクレアーゼ耐性を増大するために有用なヌクレオチド間結合（例えばキラルホスホロチオエート結合）を包含し得る。さらに、または代替的には、ｉＲＮＡ剤は、ヌクレアーゼ耐性を増大するためにリボース模倣物を包含し得る。ヌクレアーゼ耐性増大のためのヌクレオチド間結合およびリボース模倣物の例は、共同所有ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０（２００４年３月８日出願）に記載されている。
ｉＲＮＡ剤は、オリゴヌクレオチド合成のためのリガンド共役モノマーサブユニットおよびモノマーを包含し得る。モノマーの例は、共同所有米国特許出願１０／９１６，１８５（２００４年８月１０日出願）に記載されている。
ｉＲＮＡ剤は、例えば共同所有ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０（２００４年３月８日出願）に記載されているＺＸＹ構造を有し得る。
ｉＲＮＡ剤は、両親媒性部分と複合体形成され得る。ｉＲＮＡ剤とともに用いるための両親媒性部分の例は、共同所有ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０（２００４年３月８日出願）に記載されている。
別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、モジュラー複合体を特徴づける送達剤と複合体形成され得る。複合体は、以下の：（ａ）縮合剤（例えば、イオンまたは静電的相互作用により、核酸を引きつけ得る、例えば結合し得る作用物質）；（ｂ）融合誘導因子（例えば、細胞膜を介して融合し得るかおよび／または輸送され得る作用物質）；ならびに（ｃ）ターゲッティング群、例えば細胞または組織ターゲッティング剤、例えば特定細胞型と結合するレクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば抗体：のうちの1つまたは
複数（好ましくは２またはそれより多く、さらに好ましくは３つすべて）と連結されるキャリア剤を包含し得る。送達剤と複合体形成されるｉＲＮＡ剤は、共同所有ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０（２００４年３月８日出願）に記載されている。
ｉＲＮＡ剤は、ｉＲＮＡ二重鎖のセンスおよびアンチセンス配列間のような非正規対合を有し得る。非正規ｉＲＮＡ剤の特徴の例は、共同所有ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０７０７０（２００４年３月８日出願）に記載されている。
ヌクレアーゼ耐性増強
ｉＲＮＡ剤、例えばＲＳＶを標的にするｉＲＮＡ剤は、ヌクレアーゼに対する耐性増強を示し得る。
ヌクレアーゼ耐性増大および／または標的に対する結合親和性のために、ｉＲＮＡ剤、例えばｉＲＮＡ剤のセンスおよび／またはアンチセンス鎖は、例えば２’修飾リボース単位および／またはホスホロチオエート結合を包含し得る。例えば、２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多数の異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾されるかまたは置き換えられ得る。
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては、アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えばＲ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；２’ヒドロキシルが、例えばメチレン架橋により、同一リボース糖の４’炭素とつなげられる「ロックされた」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−ＡＭＩＮＥおよびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）が挙げられる。メトキシエチル基（ＭＯＥ）、（ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、ＰＥＧ誘導体）のみを含有するオリゴヌクレオチドは、強固なホスホロチオエート修飾で修飾されたものに匹敵するヌクレアーゼ安定性を示す、ということは注目に値する。
「デオキシ」修飾は、水素（すなわち、デオキシリボース糖、これは、部分的ｄｓＲＮＡのオーバーハング部分に特に適切である）；ハロ（例えば、フルオロ）；アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノまたはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリルアミノ、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノまたはジヘテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；およびアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニル（これらは例えばアミノ官能基で任意に置換され得る）を包含する。
好ましい置換基は、２’Ｏ−メチル（ＯＭｅ）、２＊−メトキシエチル、２＊−ＯＣＨ３、２＊−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリルおよび２’−フルオロ（２’Ｆ）である。一態様において、２’ＯＭｅおよび２’Ｆはともに、ｉＲＮＡ剤上の置換基として用いられる。
耐性を増大するための一方法は、共同所有米国特許出願６０／５５９，９１７（２００４年５月４日出願）に記載されているように、切断部位を特定し、このような部位を修飾して、切断を抑制することである。例えば、ジヌクレオチド５’−ＵＡ−３’、５’ＵＧ３’、５’−ＣＡ−３、５’ＵＵ−３’または５’−ＣＣ−３’は、切断部位となり得る。したがって、ヌクレアーゼ耐性増強は、５’ヌクレオチドを修飾して、例えば少なくとも１つの５’−ウリジン−アデニン−３’（５’−ＵＡ−３’）ジヌクレオチド（ここで、ウリジンは２’修飾ヌクレオチドである）；少なくとも１つの５’−ウリジン−グアニン−３’（５’−ＵＧ−３’）ジヌクレオチド（ここで、５’−ウリジンは２’修飾ヌクレオチドである）；少なくとも１つの５’−シチジン−アデニン−３’（５’−ＣＡ−３’）ジヌクレオチド（ここで、５’−シチジンは２’修飾ヌクレオチドである）；少なくとも１つの５’−ウリジン−ウリジン−３’（５’ＵＵ−３’）ジヌクレオチド（ここで、５’−ウリジンは２’修飾ヌクレオチドである）；または少なくとも１つの５’−シチジン−シチジン−３’（５’−ＣＣ−３’）ジヌクレオチド（ここで、５’シチジンは２’修飾ヌクレオチドである）を生じることにより達成され得る。ｉＲＮＡ剤は、このようなジヌクレオチドのうちの少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４または少なくとも５つを包含し得る。ある実施形態では、ｉＲＮＡ剤のピリミジンはすべて２’修飾を保有し、したがってｉＲＮＡ剤はエンドヌクレアーゼに対する増強された耐性を示す。
ヌクレアーゼ耐性を最大にするために、２’修飾は、1つまたは複数のホスフェートリンカー修飾（例えば、ホスホロチオエート）と組合せて用いられ得る。いわゆる「キメラ」オリゴヌクレオチドは、２またはそれより多くの異なる修飾を含有するものである。
オリゴヌクレオチド主鎖中のフラノース糖の含入も、エンドヌクレアーゼ媒介性ヌクレオチド鎖切断を低減し得る。ｉＲＮＡ剤は、３’陽イオン基を包含することにより、または３’−３’結合を用いて３’末端でヌクレオシドを反転することにより、さらに修飾され得る。別の代替法では、３’末端は、アミノアルキル基、例えば３’Ｃ５−アミノアルキルｄＴで遮断され得る。他の３’共役体は、エキソヌクレアーゼ媒介性３’−５’ヌクレオチド鎖切断を抑制し得る。理論に縛られずに考えると、３’共役体、例えばナプロキセンまたはイブプロフェンは、オリゴヌクレオチドの３’末端との結合からエキソヌクレアーゼを立体的に遮断することによって、エキソヌクレアーゼ媒介性ヌクレオチド鎖切断を抑制し得る。小さなアルキル鎖、アリール基または複素環式共役体または修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコース等）でさえ、３’−５’−エキソヌクレアーゼを遮断し得る。
同様に、５’共役体は、５−３’エキソヌクレアーゼ媒介性ヌクレオチド鎖切断を抑制し得る。理論に縛られずに考えると、５’共役体、例えばナプロキセンまたはイブプロフェンは、オリゴヌクレオチドの５’末端との結合からエキソヌクレアーゼを立体的に遮断することによって、エキソヌクレアーゼ媒介性ヌクレオチド鎖切断を抑制し得る。小さなアルキル鎖、アリール基または複素環式共役体または修飾糖（Ｄ−リボース、デオキシリボース、グルコース等）でさえ、３’−５’−エキソヌクレアーゼを遮断し得る。
ｉＲＮＡ剤は、二重鎖化ｉＲＮＡ剤が少なくとも一端に一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを含む場合、ヌクレアーゼに対する耐性増大を示し得る。好ましい実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１〜４、好ましくは２〜３の非対合ヌクレオチドを包含する。好ましい一実施形態では、末端ヌクレオチド対に直接的に隣接する１本鎖オーバーハングの非対合ヌクレオチドはプリン塩基を含有し、末端ヌクレオチド対はＧ−Ｃ対であるか、または最後の４つの相補的ヌクレオチド対のうちの少なくとも２つはＧ−Ｃ対である。さらなる実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、１または２つの非対合ヌクレオチドを有し得るし、例示的な一実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは５’−ＧＣ−３’である。好ましい実施形態では、ヌクレオチドオーバーハングは、アンチセンス鎖の３’末端上にある。一実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、２−ｎｔオーバーハング５’−ＧＣ−３’が形成されるよう、アンチセンス鎖の３’末端上のモチーフ５’−ＣＧＣ−３’を包含する。
一態様では、ヒドロキシピロリジン（ｈｐ）リンカーは、エキソヌクレアーゼ保護を提供する。
したがって、ｉＲＮＡは、例えば被験者の身体中に見出されるヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼにより分解を抑制するための修飾を包含し得る。これらのモノマーは、本明細書中では、ＮＲＭまたはヌクレアーゼ耐性促進モノマーと呼ばれ、対応する修飾はＮＲＭ修飾と呼ばれる。多くの場合、これらの修飾は、同様にｉＲＮＡ剤の他の特性、例えばタンパク質、例えば輸送タンパク質、例えば血清アルブミン、またはＲＩＳＣの一成員と相互作用する能力、あるいは互いと二重鎖を形成するかまたは別の配列、例えば標的分子と二重鎖を形成する第一および第二配列の能力を調節する。
1つまたは複数の異なるＮＲＭ修飾が、ｉＲＮＡ剤に、またはｉＲＮＡ剤の一配列中に
導入され得る。ＮＲＭ修飾は、一配列中または一ｉＲＮＡ剤中に1回より多く用いられ得
る。
ＮＲＭ修飾は、末端のみに配置され得るものと、任意の位置に配置し得るものを包含する。ハイブリダイゼーションを抑制し得るいくつかのＮＲＭ修飾は、好ましくは末端領域のみで用いられ、さらに好ましくは切断部位では、または特にアンチセンス鎖上の対象配列または遺伝子を標的にする配列の切断領域においては用いられない。ｄｓ ｉＲＮＡ剤の２つの鎖の間の十分なハイブリダイゼーションが保持されるのであれば、それらはセンス鎖中のどこでも用いられ得る。いくつかの実施形態では、オフターゲット・サイレンシングを最小限にし得るので、センス鎖の切断部位にまたは切断領域にＮＲＭを置くことが望ましい。
ほとんどの場合、ＮＲＭ修飾は、それらがセンス鎖上に含まれるか、アンチセンス鎖上に含まれるかによって、異なって分布される。アンチセンス鎖上である場合、エンドヌクレアーゼ媒介性ヌクレオチド鎖切断を妨げるかまたは抑制する修飾は、ＲＩＳＣ媒介性切断に付される領域、例えば切断部位または切断領域に挿入されるべきでない（Elbashir et al, 2001, Genes and Dev. 15: 188に記載（この記載内容は参照により本明細書中で援用される））。標的の切断は、２０または２１ｎｔアンチセンス鎖のほぼ中央部で、あるいはアンチセンス鎖と相補的である標的ｍＲＮＡ上の第一のヌクレオチドの約１０または１１ヌクレオチド上流に生じる。本明細書中で用いる場合、切断部位は、標的ｍＲＮＡ上の、またはそれとハイブリダイズするｉＲＮＡ剤鎖上の切断部位のいずれかの側のヌクレオチドを指す。切断領域は、いずれかの方向での、切断の１、２または３ヌクレオチド以内のヌクレオチドを意味する。
このような修飾は、対象における一配列を標的にする配列、または標的にしない配列の、末端領域中に、例えば末端位置に、または末端の２、３、４または５位置で導入され得る。
テザーリガンド
ｉＲＮＡ剤の特性は、薬理学的特性を含めて、例えば、リガンド、例えばテザーリガンドの導入により影響を及ぼされ、適合され得る。
広範な種々の物質、例えばリガンドは、ｉＲＮＡ剤に、例えばリガンド共役モノマーサブユニットのキャリアに繋留され得る。単リガンド共役モノマーサブユニットに関連して以下に例が記載されるが、それは好ましいというだけで、物質はｉＲＮＡ剤と他の点でも結合され得る。
好ましい部分はリガンドであり、これは、好ましくは共有的に、直接または介在繋留鎖を介して間接的に、キャリアと結合される。好ましい実施形態では、リガンドは、介在繋留鎖を介してキャリアと結合される。リガンド共役モノマーが成長中の鎖中に組み入れられる場合、リガンドまたはテザーリガンドはリガンド共役モノマー上に存在し得る。いくつかの実施形態では、リガンドは、「前駆体」リガンド共役モノマーサブユニットが成長中の鎖中に組み入れられた後、「前駆体」リガンド共役モノマーサブユニット中に組み入れられ得る。例えば、アミノ末端繋留鎖を有するモノマー、例えばＴＡＰ−（ＣＨ２）ｎＮＨ２は、成長中のセンスまたはアンチセンス鎖中に組入れられ得る。その後の作業では、すなわち鎖中への前駆体モノマーサブユニットの組入れ後、求電子性基、例えばペンタフルオロフェニルエステル、またはアルデヒド基を有するリガンドは、次に、リガンドの求電子性基を、前駆体リガンド共役モノマーサブユニット繋留鎖の末端求電子性基と連結することにより、前駆体リガンド共役モノマーと結合され得る。
好ましい実施形態では、リガンドは、それが組み入れられるｉＲＮＡ剤の分布、ターゲッティングまたは寿命を変更する。好ましい実施形態では、リガンドは、例えばこのようなリガンドが存在しない種と比較して、選択される標的、例えば分子、細胞または細胞型、区画、例えば細胞または器官区画、組織、器官または身体領域に対する親和性増大を提供する。
好ましいリガンドは、輸送、ハイブリダイゼーションおよび特異性特性を改善し得、また結果的に生じる天然または修飾オリゴヌクレオチド、あるいは本明細書中に記載されるモノマーの任意の組合せを含む高分子分子、および／または天然または修飾リボヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性も改善し得る。
リガンドは、概して、例えば取込みを増強するための治療用修飾因子、例えば分布をモニタリングするための診断用化合物またはレポーター基、架橋剤、ヌクレアーゼ耐性付与部分、および天然または非通常核酸塩基を包含し得る。一般的例としては、親油性部分、脂質、レクチン、ステロイド（例えば、ウバオール、ヘシゲニン、ジオスゲニン）、テルペン（例えば、トリテルペン、例えばサルササポゲニン、フリーデリン、エピフリーデラノール、リトコール酸誘導体）、ビタミン、炭水化物（例えば、デキストラン、プルルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）、タンパク質、タンパク質結合剤、インテグリン標的分子、ポリカチオン、ペプチド、ポリアミンおよびペプチド模倣物が挙げられる。
リガンドは、天然または組換えまたは合成分子、例えば合成ポリマー、例えば合成ポリアミノ酸であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリＬアスパラギン酸、ポリＬ配布グルタミン酸、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリ（Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）コポリマー、ジビニルエーテル−無水マレイン酸コポリマー、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドコポリマー（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２−エチルアクリル酸）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンが挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリシン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、擬似ペプチド−ポリアミン、ペプチド模倣物ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、陽イオン性部分、例えば陽イオン性脂質、陽イオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩、またはαらせんペプチドが挙げられる。
リガンドは、ターゲッティング群、例えば細胞または組織ターゲッティング剤、例えばチロトロピン、メラノトロピン、サーファクタントタンパク質Ａ、ムチン炭水化物、グリコシル化ポリアミノ酸、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタメート、ポリアスパルテート、あるいはＲＧＤペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣物も包含し得る。
リガンドは、タンパク質、例えば糖タンパク質、リポタンパク質、例えば低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）、またはアルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはペプチド、例えばコリガンドに対する特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば特殊化細胞型、例えば癌細胞、内皮細胞または骨細胞と結合する抗体であり得る。リガンドは、ホルモンおよびホルモン受容体も包含し得る。それらは、非ペプチド種、例えば補因子、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチル−グルコサミン、多価マンノースまたは多価フコースも包含し得る。リガンドは、例えばリポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼの活性剤、またはＮＦ−ｋＢの活性剤であり得る。
リガンドは、例えば細胞の細胞骨格を崩壊することにより、例えば細胞の微小管、微小フィラメントおよび／または中間径フィラメントを崩壊することにより、細胞中へのｉＲＮＡ剤の取込みを増大し得る物質、例えば薬剤であり得る。薬剤は、例えばタキソン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ、インダノシンまたはミオセルビンであり得る。
一態様では、リガンドは、脂質または脂質ベースの分子である。このような脂質または脂質ベースの分子は、好ましくは、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に結合する。ＨＳＡに結合し得る他の分子も、リガンドとして用いられ得る。例えば、ネプロキシンまたはアスピリンが用いられ得る。脂質または脂質ベースのリガンドは、（ａ）共役体の分解に対する耐性を増大し、（ｂ）標的細胞または細胞膜へのターゲッティングまたは輸送を増大し、および／または（ｃ）血清タンパク質、例えばＨＳＡへの結合を調整するために用いられ得る。
脂質ベースのリガンドは、標的組織への共役体の結合を調整する、例えば制御するために用いられ得る。例えばより強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質ベースのリガンドは、余り腎臓に対して標的化される可能性はより少なく、したがって、身体から排出される可能性が少ない。ＨＳＡと余り強力に結合しない脂質または脂質ベースのリガンドは、腎臓との共役体を標的化するために用いられ得る。
好ましい一実施形態では、脂質ベースのリガンドはＨＳＡに結合する。好ましくは、それは、共役体が好ましくは非腎臓組織に分布されるような十分な親和性でＨＳＡに結合する。しかしながら、親和性は、ＨＳＡ−リガンド結合が逆転され得ないほど強力ではない、というのが好ましい。
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば増殖中の細胞により取り込まれる部分、例えばビタミンまたは栄養素である。これらは、例えば悪性または非悪性型の、例えば癌細胞の望ましくない細胞増殖を特徴とする障害を治療するのに特に有用である。ビタミンの例としては、ビタミンＡ、ＥおよびＫが挙げられる。他のビタミンの例としては、ビタミンＢ、例えば葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、あるいは癌細胞により取り込まれるその他のビタミンまたは栄養素が挙げられる。
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、好ましくはらせん状細胞透過剤である。好ましくは、作用物質は両親媒性である。当該剤の例は、ペプチド、例えばｔａｔまたはアンテナペディアのようなペプチドである。当該剤がペプチドである場合、それは、ペプチジル模倣、インバートマー、非ペプチドまたは擬似ペプチド結合、ならびにＤアミノ酸の使用を含めて、修飾され得る。らせん状剤は、好ましくはαらせん剤であり、これは好ましくは親油性および疎油性相を有する。
５’−ホスフェート修飾
好ましい実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、５’リン酸化されるか、または５’末端にホスホリル類似体を包含する。アンチセンス鎖の５’リン酸修飾は、ＲＩＳＣ媒介性遺伝子サイレンシングに適合するものを包含する。適切な修飾としては、５’−モノホスフェート（（ＨＯ）２（０）Ｐ−０−５’）、５’−ジホスフェート（（ＨＯ）２（０）Ｐ−０−Ｐ（ＨＯ）（０）−０−５’）、５’−トリホスフェート（（ＨＯ）２（０）Ｐ−０−（ＨＯ）（０）Ｐ−０−Ｐ（ＨＯ）（０）−０−５’）、５’−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−０−５’−（ＨＯ）（０）Ｐ−０−（ＨＯ）（０）Ｐ−０−Ｐ（ＨＯ）（０）−０−５’）、５’−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、ならびに任意修飾化または非修飾化ヌクレオチドキャップ構造が挙げられる。他の適切な５’−ホスフェート修飾は、当業者の知るとことろなるであろう。
センス鎖を不活性化し、活性ＲＩＳＣの形成を防止して、それによりオフターゲット効果を低減する可能性をもたらすために、センス鎖は修飾され得る。これは、センス鎖の５’−リン酸化を防止する修飾により、例えば５’−０−メチルリボヌクレオチドを用いた修飾により、成し遂げられ得る（Nykanen et al., (2001) ATP requirements and
small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell
107, 309-321参照）。リン酸化を防止する他の修飾、例えばＯ−Ｍｅではなく、単に
Ｈにより５’−ＯＨを置換することも、用いられ得る。代替的には、大型嵩高基が５’−ホスフェートに付加されて、それをホスホジエステル結合に向け得る。
組織および細胞へのｉＲＮＡ剤の送達
処方物
本明細書中に記載されるｉＲＮＡ剤は、被験者への投与のために、好ましくは吸入または鼻内投与を介した肺および鼻道（呼吸組織）への局所的な、あるいは例えば注射による非経口的な投与のために、処方され得る。
説明を容易にするために、この節における処方物、組成物および方法は、主として非修飾ｉＲＮＡ剤に関して考察される。しかしながら、これらの処方物、組成物および方法は、他のｉＲＮＡ剤、例えば修飾ｉＲＮＡを用いて実行され得るし、このような実行は本発明の範囲内である、と理解されるべきである。
処方されるｉＲＮＡ剤組成物は、種々の状態をとり得る。いくつかの例では、組成物は、少なくとも部分的に結晶、均一に結晶、および／または無水（例えば水分量８０、５０、３０、２０または１０％未満）である。別の例では、ｉＲＮＡ剤は、水性相、例えば水を含む溶液中に存在し、この形態が、吸入による投与のための好ましい形態である。
水性相または結晶組成物は、送達ビヒクル、例えばリポソーム（特に水性相用）、または粒子（例えば結晶組成物に適切であり得るような微小粒子）中に組み入れられ得る。一般的には、ｉＲＮＡ剤組成物は、意図される投与方法に適合するように処方される。
ｉＲＮＡ剤調製物は、別の作用物質、例えば別の治療薬、あるいはｉＲＮＡ剤を安定化する作用物質、例えばｉＲＮＡ剤と複合体を形成して、ｉＲＮＰを生じるタンパク質と組合せて処方され得る。さらに他の作用物質としては、キレート化合物、例えばＥＤＴＡ（例えば二価陽イオン、例えばＭｇ２＋を除去するため）、塩、ＲＮアーゼ阻害剤（例えば広特異性ＲＮアーゼ阻害剤、例えばＲＮＡｓｉｎ）等が挙げられる。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤調製物は、別のｉＲＮＡ剤、例えば、第二遺伝子に関してＲＮＡｉを媒介し得る第二ｉＲＮＡ剤を包含する。さらに他の調製物は、少なくとも３、５、１０、２０、５０または１００あるいはそれより多くの異なるｉＲＮＡ種を包含し得る。いくつかの実施形態では、当該剤は、同一ウイルスであるが、異なる標的配列に向けられる。別の実施形態では、各ｉＲＮＡ剤は、異なるウイルスに向けられる。実施例で示されるように、１つより多くのウイルスは、２つのｉＲＮＡ剤を同時に、あるいは短い時間間隔で、共投与することにより抑制され得る（各々が、処置されているウイルスの１つに向けられる）。
治療方法および送達経路
本発明のｉＲＮＡ剤、例えばＲＳＶを標的にするｉＲＮＡを包含する組成物は、種々の経路により被験者に送達され得る。本発明の製剤組成物は、所望されるのが局所治療か全身治療かによって、ならびに治療されるべき領域に応じて、多数の方法で投与され得る。投与は、局所的（例えば鼻内または肺内）、経口または非経口的であり得る。例示的経路としては、吸入、静脈内、鼻または経口送達が挙げられる。
概して、本発明のｉＲＮＡ剤の送達は、感染部位に対して被験者への送達を達成するために実行される。この目的は、吸入、霧状化または鼻内投与による肺または鼻道への、例えば呼吸組織中への局在的（すなわち局所的）投与により、あるいは全身投与、例えば非経口投与により達成され得る。非経口投与としては、静脈内点滴、皮下、腹腔内または筋肉内注射が挙げられる。本発明のｉＲＮＡ剤を投与する好ましい手段は、エーロゾル化液体、例えば霧状化ミスト剤または鼻噴霧剤の吸入による肺および／または鼻道への直接局所投与による。
ｉＲＮＡ剤は、投与に適した製剤組成物中に組み入れられ得る。例えば、組成物は、1
つまたは複数のｉＲＮＡ剤、および製薬上許容可能な担体を含み得る。本明細書中で用いる場合、「製薬上許容可能な担体」という用語は、製剤投与に適合する任意の且つすべての溶媒、分散媒質、コーティング、抗細菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤等を包含するよう意図される。薬学的活性物質のためのこのような媒質および作用物質の使用は、当該技術分野でよく知られている。任意の慣用的媒質または作用物質が活性化合物と不適合である範囲を除いて、組成物中でのその使用が意図される。補足的活性化合物も、組成物中に組み入れられ得る。
吸入、鼻内または非経口投与のための処方物は、当該技術分野でよく知られている。このような処方物は、緩衝剤、希釈剤およびその他の適切な添加剤も含有し得る滅菌水溶液を包含し、一例はＰＢＳまたは水中５％デキストロースである。静脈内使用のためには、溶質の総濃度は調製物を等張にするよう制御されるべきである。
本明細書中に開示される活性化合物は、好ましくは、適切な手段により被験者の肺（単数または複数）または鼻道に投与される。活性化合物は、被験者が吸入する単数または複数の活性化合物で構成される吸い込み可能粒子のエーロゾル懸濁液を投与することにより投与され得る。活性化合物は、種々の形態で、例えば乾燥粉末吸入剤、計量用量吸入剤または液体／液体懸濁液（これらに限定されない）でエーロゾル化され得る。吸い込み可能粒子は、液体または固体であり得る。米国特許第４，５０１，７２９号に記載されているように、粒子は、任意に他の治療用成分、例えばアミロライド、ベンザミルまたはフェナミルを、気道粘液分泌物からの水の再吸収を防止するのに有効な量で含まれる選択化合物とともに含有し得る。
粒状製剤組成物は、任意に、分散または輸送を手助けするために担体と組合せされ得る。適切な担体、例えば糖（すなわちデキストロース、ラクトース、スクロース、トレハロース、マンニトール）は、任意の適切な割合（例えば１：１重量比）で、単数または複数の活性化合物と配合され得る。
一実施形態では、活性化合物は吸入により局所的に投与される。本明細書中で用いる場合、「吸入」による投与は、一般的には、吸い込み可能なサイズを有する活性化合物からなる粒子、すなわち、吸入時に口または鼻および咽頭を通過して、気管支および肺胞に達するのに十分に小さいサイズを有する粒子の吸気作用を指す。概して、サイズが約１〜１０μ（特に、約５μ未満のサイズ）の範囲の粒子が吸い込み可能であり、吸入による投与に適している。
別の実施形態では、活性化合物は鼻内投与により局所的に送達される。本明細書中で用いる場合、「鼻内」投与は、鼻上皮を局所的に治療するために処方され、送達される剤形の投与を指す。鼻内投与のために用いられる粒子または小滴は、一般的には、吸入による投与のために用いられるものより大きい直径を有する。鼻内投与のためには、１０〜５００μの範囲の粒子サイズが、鼻腔中での保持を確実にするために選択される。エーロゾル中に含まれる非吸い込み可能サイズの粒子は、喉中に沈着し、嚥下される傾向があり、エーロゾル中の非吸い込み可能粒子の量は、好ましくは最小限にされる。
エーロゾルを製造するための活性化合物の液体製剤組成物は、活性化合物を適切なビヒクル、例えば発熱物質無含有の滅菌水と組合せることにより調製され得る。ある実施形態では、高張性生理食塩溶液が、本発明を実施するために用いられる。これらは、好ましくは、１〜１５重量％の生理学的に許容可能な塩、さらに好ましくは３〜７重量％の生理学的に許容可能な塩からなる発熱物質無含有滅菌溶液である。
活性化合物を含む液体粒子のエーロゾルは、任意の適切な手段により、例えば圧駆動性ジェットネブライザーまたは超音波ネブライザーを用いて製造され得る（例えば、米国特許第４，５０１，７２９号参照）。ネブライザーは、狭いベンチュリ・オリフィスを通した加圧気体、典型的には空気または酸素の加速により、あるいは超音波撹拌により、活性成分の溶液または懸濁液を治療用エーロゾルミストに変える市販の装置である。
ネブライザーに用いるのに適した処方物は、液体担体中の活性成分からなり、活性成分は４０％ｗ／ｗまで、好ましくは２０％ｗ／ｗの処方物を含む。担体は、典型的には水（最も好ましくは発熱物質無含有滅菌水）または希釈水性アルコール溶液であり、好ましくは等張にされるが、しかし、例えば塩化ナトリウムの付加により体液に対して高張性であり得る。任意の添加剤としては、防腐剤（処方物が滅菌性にされない場合）、例えばメチルヒドロキシベンゾエート、酸化防止剤、香味剤、揮発性油、緩衝剤および界面活性剤が挙げられる。
活性化合物を含む固体粒子のエーロゾルは、同様に、任意の固体粒状治療用エーロゾル発生器を用いて製造され得る。被験者に固体粒状治療薬を投与するためのエーロゾル発生器は、吸い込み可能である粒子を生じ、ヒト投与に適した速度で既定の定量の治療薬を含有する容積のエーロゾルを発生する。固体粒状エーロゾル発生器の一つの実例となる形式は、吹付け器である。吹付け器による投与のための適切な処方物は、吹付け器により送達されるかまたは鼻で吸い込んで鼻腔中に取り込まれ得る微粉砕粉末を包含する。吹付け器中では、粉末（例えば、本明細書中に記載される治療を実行するのに有効な定量）は、典型的にはゼラチンまたはプラスチック製のカプセルまたはカートリッジ（これらはin situで穴を開けられるかまたは開放される）中に含入され、粉末は、吸入時に当該装置を通しての放風により、あるいは手動ポンプにより送達される。吹付け器に用いられる粉末は、活性成分だけで構成されるか、または活性成分、適切な粉末希釈剤、例えばラクトース、および任意の界面活性剤を含む粉末ブレンドからなる。活性成分は、典型的には、処方物の０．１〜１００％ｗ／ｗを占める。
第二の型の例示的エーロゾル発生器は、定量吸入器を含む。定量吸入器は、典型的には、液化噴射剤中の活性成分の懸濁液または溶液処方物を含入する加圧エーロゾルディスペンサーである。使用中、これらの装置は、定量、典型的には１０ｕｌ〜２００ｕｌを送達して、活性成分を含有する微細粒子噴霧を生じるよう適合された弁を通して処方物を射出する。適切な噴射剤としては、ある種のクロロフルオロカーボン化合物、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンおよびその混合物が挙げられる。処方物は、1つまたは複数の補助溶媒、例えばエタノール、界面
活性剤、例えばオレイン酸またはソルビタントリオレエート、酸化防止剤、および適切な香味剤をさらに含有し得る。
投与は、被験者自身により、または別の人、例えば医療従事者により提供され得る。医療従事者は、人に看護を提供するのに携わる任意の事業体、個人、例えば、病院、ホスピス、診察室、外来患者診療所；医療従事者、例えば医者、看護師、またはその他の開業医；あるいは配偶者または保護者、例えば親であり得る。薬物治療は、計量用量で、あるいは定量を送達するディスペンサー中で提供され得る。
「治療的有効量」は、期待される生理学的応答を生じるように、治療されるべき被験者において所望レベルの薬剤を提供するのに要する、組成物中に存在する量である。一実施形態では、治療的有効量の２つまたはそれより多くのｉＲＮＡ剤（各々が異なる呼吸器ウイルス、例えばＲＳＶおよびＦＩＶに向けられる）が、被験者に同時に投与される。
「生理学的有効量」という用語は、所望の対症的または治癒的効果を得る、被験者に送達される量である。
「製薬上許容可能な担体」という用語は、肺に有意の有害な毒物学的作用を及ぼすことなく、担体が肺に取り込まれ得る、ということを意味する。
「同時投与」という用語は、２またはそれより多くの作用物質、特に２またはそれより多くのｉＲＮＡ剤を被験者に投与することを指す。当該剤は、単一製剤組成物中に含入され、同時に投与され得るし、あるいは当該剤は別個の処方物中に含入され、逐次的に被験者に投与され得る。２つの作用物質が被験者において同時に検出され得る限り、２剤は同時投与されるといわれる。
担体として用いられる製剤賦形剤としては、安定剤、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、増量剤、例えば炭水化物、アミノ酸およびポリペプチド；ｐＨ調整剤または緩衝剤；塩、例えば塩化ナトリウム等が挙げられる。これらの担体は、結晶または非晶質形態であるか、あるいはそれらの混合物であり得る。
特に有益である増量剤としては、相溶性の炭水化物、ポリペプチド、アミノ酸またはその組合せが挙げられる。適切な炭水化物としては、単糖、例えばガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボース等；二糖、例えばラクトース、トレハロース等；シクロデキストリン、例えば２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン；ならびに多糖、例えばラフィノース、マルトデキストリン、デキストラン等；アルジトール、例えばマンニトール、キシリトール等が挙げられる。炭水化物の好ましい群は、ラクトース、トレハロース、ラフィノース、マルトデキストリンおよびマンニトールを包含する。適切なポリペプチドとしては、アスパルテームが挙げられる。アミノ酸としてはアラニンおよびグリシンが挙げられるが、グリシンが好ましい。
適切なｐＨ調整剤または緩衝剤としては、有機酸および塩基から調製される有機塩、例えばクエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム等が挙げられる；クエン酸ナトリウムが好ましい。
投与量
ｉＲＮＡ剤は、約７５ｍｇ未満／体重１ｋｇ、または約７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１または０．０００５ｍｇ未満／体重１ｋｇ、ならびに２００ｎｍｏｌ未満のｉＲＮＡ剤（例えば約４．４×１０１６の複製）／体重１ｋｇ、または１５００、７５０、３００、１５０、７５、１５、７．５、１．５、０．７５、０．１５、０．０７５、０．０１５、０．００７５、０．００１５、０．０００７５、０．０００１５ｎｍｏｌのｉＲＮＡ剤／体重１ｋｇの単位用量で投与され得る。単位用量は、例えば、吸入用量投与または霧状化により、あるいは注射により投与され得る。一例では、０．０２〜２５ｍｇ／ｋｇの投与量範囲が用いられる。
肺または鼻道への直接的なｉＲＮＡ剤の送達は、約１ｍｇ〜約１５０ｍｇ／鼻道台の投与量、例えば２５、５０、７５、１００または１５０ｍｇ／鼻道の投与量でなされ得る。
投与量は、疾患または障害を治療するかまたは予防するために有効な量であり得る。
一実施形態では、単位用量は、１日１回投与される。他の使用法では、単位用量は初日に２回、その後、１日１回投与される。代替的には、単位用量投与は、１日１回未満、例えば２、４、８または３０日毎より少ない。別の実施形態では、単位用量は、ある頻度で投与されるわけではない（例えば、定期的頻度ではない）。例えば、単位用量は、単回投与され得る。ｉＲＮＡ剤媒介性サイレンシングはｉＲＮＡ剤組成物を投与した後、数日間存続するため、多くの場合、１日１回未満の頻度で、またはいくつかの場合に関しては、全治療レジメンの間１回だけ、組成物を投与することが可能である。
一実施形態では、被験者は、初回用量、ならびに1つまたは複数回の維持用量のｉＲＮ
Ａ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤（例えば前駆体、例えばｓｉＲＮＡ剤に加工処理され得る大型ｉＲＮＡ剤、あるいはｉＲＮＡ剤、例えば二本鎖ｉＲＮＡ剤、またはｓｉＲＮＡ剤あるいはその前駆体をコードするＤＮＡ）を投与される。単数または複数の維持用量は、一般的には、初回用量より低く、例えば初回用量より２分の１少ない。維持レジメンは、０．０１ｕｇ〜７５ｍｇ／体重１ｋｇの範囲の単数または複数用量、例えば７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、２、１、０．５、０．１、０．０５、０．０１、０．００５、０．００１または０．０００５ｍｇ／体重１ｋｇ／日で被験者を治療することを包含し得る。維持用量は、好ましくは、５〜１４日毎に１回以下で投与される。さらに、治療レジメンは、特定の疾患の性質、その重症度および患者の全体的症状に依って変わる期間の間、継続し得る。好ましい実施形態では、投与量は、１日１回以下、例えば２４、３６、４８またはそれより長い時間につき１回以下、例えば５または８日毎に１回以下で送達され得る。治療後、患者は、彼の症状の変化に関して、ならびに疾患状態の症候の軽減に関してモニタリングされ得る。化合物の投与量は、患者が一般投与量レベルに対して有意に応答しない事象において増量されるか、あるいは疾患状態の症候の軽減が観察される場合、疾患状態が消散された場合、または望ましくない副作用が観察される場合、用量は低減され得る。
一実施形態では、ｉＲＮＡ剤製剤組成物は、複数のｉＲＮＡ剤種を包含する。ｉＲＮＡ剤種は、天然標的配列、例えばＲＳＶ遺伝子の標的配列に関して非重複、且つ非隣接性である配列を有し得る。別の実施形態では、複数のｉＲＮＡ剤種は、異なる天然標的遺伝子に対して特異的である。例えば、ＲＳＶのＰタンパク質遺伝子を標的にするｉＲＮＡ剤は、異なる遺伝子、例えばＮタンパク質遺伝子を標的にするｉＲＮＡ剤と同一の製剤組成物中に存在し得る。別の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、異なるウイルス、例えばＲＳＶに対して特異的である。
ｉＲＮＡ剤組成物の濃度は、障害を治療するかまたは予防するに際して有効であるのに十分な、またはヒトにおける生理学的状態を調節するのに十分な量である。投与されるｉＲＮＡ剤の濃度または量は、当該剤に関して確定されるパラメーターおよび投与方法、例えば鼻、頬または肺に依っている。例えば、鼻処方物は、鼻道の刺激または灼熱感を回避するために、非常に低い濃度のいくつかの成分を要する傾向がある。適切な鼻処方物を提供するためには、時として、経口処方物を１０〜１００倍まで希釈するのが望ましい。
ある種の因子、例えば疾患または障害の重症度、以前の治療、全身の健康状態および／または被験者の年齢、ならびに存在する他の疾患（これらに限定されない）は、被験者を有効に治療するために必要とされる投与量に影響を及ぼし得る。ｉＲＮＡ剤、例えば治療のために用いられるｓｉＲＮＡ剤の有効投与量は、特定の治療の経過の間、増大または低減し得る、ということも理解される。投与量の変化は、診断検定の結果に起因し、それから明らかになり得る。例えば、被験者は、ｉＲＮＡ剤組成物を投与後に、モニタリングされ得る。モニタリングからの情報に基づいて、付加的量のｉＲＮＡ剤組成物が投与され得る。
一般的に言えば、本発明の治療用組成物の投与は病院または臨床環境（「入院患者管理」）で生じ得るし、あるいは「外来患者」環境、例えば患者の家庭で生じ得る。入院患者治療は、患者がＲＳＶの重症症候、例えば無呼吸、呼吸窮迫、低酸素摂取、および／または水分過剰または飢餓に苦しんでいる場合、最も適切である。患者の年齢および能力によって、患者は治療用組成物を自分自身に投与し得る。本発明の治療用組成物による処置は、例えば水分負荷、蒸気、気管支拡張剤（例えば、アルブテラオール）、抗発熱または抗炎症薬（例えば、タイレノール）、ならびに食物、液剤および／またはビタミン剤の摂取を伴い得る。さらに、そして典型的には入院患者環境において、患者は、酸素治療、静脈内水分負荷およびステロイド治療も受け得る。
以下の実施例により本発明をさらに説明するが、実施例は本発明をさらに限定するものではない。
実施例１．ＲＳＶｍＲＮＡに対する抗ウイルスｓｉＲＮＡの設計
ＲＳＶ Ｐ、ＮおよびＬ ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡを、既知の手法を用いて化学的に合成した。下記のようなｓｉＲＮＡ配列および何らかの抑制サブタイプ間活性およびＩＣ５０値を、表１ａ、１ｂおよび１ｃに列挙する。
実施例２．in vitro検定およびウイルス感染
１０％加熱不活性化ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で、ベロＥ６細胞を８０％の集密度に培養した。ｓｉＲＮＡ導入のために、４ｕｌのＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯを５０ｕｌの無血清ＤＭＥＭに付加し、室温で１０分間インキュベートした。次に、指示濃度のｓｉＲＮＡを培地／ＴＫＯ試薬にそれぞれ付加し、室温で１０分間インキュベートした。この混合物を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ ２００ｕｌに、次に単層培養細胞に付加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で６時間、インキュベートした。１×ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で静かに洗浄することによりＲＮＡ混合物を除去し、３００プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ウェルのＲＳＶ／Ａ２（ＭＯＩ＝３０）をウェルに付加し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間、吸着させた。ウイルスを除去し、細胞を１×ＨＢＳＳで洗浄した。１０％ＦＢＳ培地を含有するＤＭＥＭ中の１％メチルセルロースを細胞に被せて、３７℃、５％ＣＯ２で６日間、インキュベートした。抗Ｆタンパク質モノクローナル抗体１３１−２Ａを用いて、プラークに対して細胞を免疫染色した。
実施例３．ｓｉＲＮＡ送達およびin vivoでのウイルス感染
病原体を有しない４週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Harlanから購入した。感染および鼻内滴注（ｉ．ｎ．）中は、マウスを麻酔下に置いた。５ｕｌのＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯと複合体形成されないまたは複合体形成された指示量のｓｉＲＮＡを用いた鼻内滴注により、マウスを免疫化した。１５０ｐｇのシナギス（モノクローナル抗体クローン１４３−６ｃ、抗ＲＳＶ Ｆタンパク質）およびマウスアイソタイプ対照（ＩｇＧ１）を、ＲＳＶ攻撃誘発（１０６ＰＦＵのＲＳＶ／Ａ２）の４時間前に腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。１群あたり１０匹のマウスを用いた。動物の体重を、感染後０、２、４および６日目にモニタリングした。感染後６日目に肺を採取し、免疫染色プラーク検定によりＲＳＶについて検定した。
実施例４．免疫染色プラーク検定
１０％加熱不活性化ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で、２４ウェルプレートのベロＥ６細胞を９０％の集密度に培養した。マウス肺を、１ｍｌ滅菌ダルベッコＰＢＳ（Ｄ−ＰＢＳ）中で手で持てる大きさのホモジナイザーを用いて均質化して、無血清ＤＭＥＭ中で１０倍希釈した。ウイルス含有肺溶解物希釈液を、三重反復実験で２４ウェルプレート上に播き、３７℃、５％ＣＯ２で１時間、吸着させた。１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中の１％メチルセルロースをウェルに被せた。６日後、上に被せた培地を除去し、細胞をアセトン：メタノール（６０：４０）中で１５分間固定した。細胞を、３７℃で１時間、５％乾燥ミルク／ＰＢＳで遮断し、抗ＲＳＶ Ｆタンパク質抗体（１３１−２Ａ）の１：５００希釈液をウェルに付加し、３７℃で２時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ／０．５％トゥイーン２０中で２回洗浄した。ヤギ抗マウスＩｇＧ−アルカリ性ホスファターゼの１：５００希釈液をウェルに付加し、３７℃で１時間インキュベートした。細胞を、ＰＢＳ／０．５％トゥイーン２０中で２回洗浄した。Vectorのアルカリ性ホスファターゼ基質キットＩＩ（Vector Black）を用いて反応を展開し、ヘマトキシリンで対比染色した。
プラークを可視化し、オリンパス倒立顕微鏡を用いて計数した。
実施例５．治療検定
０日目に鼻内滴注によりＲＳＶ（１０６ＰＦＵのＲＳＶ／Ａ２）でマウスを攻撃誘発し、指示ｓｉＲＮＡ５０ｕｇで処置して、指示時間（ウイルス攻撃誘発後１〜４日目）に鼻内滴注により送達した。マウス３〜５匹／群を用いて、上記と同様に、ウイルス攻撃誘発後５日目に、肺溶解物からウイルス力価を測定した。
実施例６．ｉＲＮＡ剤を用いたＲＳＶのin vitro抑制
表１（ａ〜ｃ）に提示したｉＲＮＡ剤を、上記と同様にプラーク形成検定で抗ＲＳＶ活性に関して試験した。結果を図１に示す。各カラム（バー）は、表１（ａ〜ｃ）に示したｉＲＮＡ剤を表し、例えばカラム１は表１ａにおける第一剤であり、第二のカラムは第二剤である。残存するウイルスの％により、活性ｉＲＮＡ剤を同定した。９０％抑制という値を示したいくつかの作用物質を同定した。結果を、表１（ａ〜ｃ）に要約する。
ｉＲＮＡ剤を用いたＲＳＶのin vitro用量応答抑制を確定した。表１からの活性作用
物質の例を、４つの濃度で、上記と同様のプラーク形成検定において抗ＲＳＶ活性に関して試験した。図２）に示し、表１（ａ〜ｃ）に要約するように、試験した活性ｉＲＮＡ剤で、用量依存性応答が見出された。
ｉＲＮＡ剤を用いたＲＳＶ Ｂサブタイプのin vitro抑制を、上記と同様に試験した
。図３に示すように、サブタイプＢに対する抗ＲＳＶ活性に関して、５ｎＭで、図２に示したｉＲＮＡ剤を試験した。試験したｉＲＮＡ剤により、種々の程度で、ＲＳＶサブタイプＢが抑制された。これらの結果も、表１（ａ〜ｃ）に要約する。
実施例７．ｉＲＮＡ剤を用いたＲＳＶのin vivo抑制
ＡＬ１７２９およびＡＬ１７３０を用いたＲＳＶのin vivo抑制を、上記と同様に試験した。図４に記載した作用物質を、マウスモデルにおいて抗ＲＳＶ活性に関して試験した。ｉＲＮＡ剤は、in vivoでのウイルス力価低減に有効であり、対照抗体（Ｍａｂ １４３−６ｃ、ＲＳＶ治療に関して認可されているマウスＩｇＧ１ Ａｂ）より有効であった。
ＡＬ１７３０を、上記の方法を用いて、用量依存性活性に関して試験した。当該剤は、図５に示すように用量依存性応答を示した。
in vitro活性を示すｉＲＮＡ剤を、上で概説したように、in vivoでの抗ＲＳＶ活性
に関して試験した。図６に示すように予防的に投与した場合、いくつかの剤は、４ ｌｏｇ超のウイルス力価の低減を示した。
in vitroおよび／またはin vivo活性を示すｉＲＮＡ剤を、上で概説した治療プロト
コールと同様にin vivoでの抗ＲＳＶ活性に関して試験した。ウイルス感染後１〜２日目に投与した場合、図７に示すように、いくつかの剤は、２〜３ ｌｏｇのウイルス力価の低減を示した。
実施例８．標的配列全体に亘る分離株の配列解析
分離株の成長およびＲＮＡの単離：ジョージア州アトランタの疾病予防管理センター（ＣＤＣ）のLarry Anderson氏から（４株）、ならびにテネシー大学メンフィス校のJohn DeVincenzo氏から（１５株）、ＲＳＶ感染患者からの臨床分離株を入手した。これらをＨＥｐ−２、ヒト上皮細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＣＬ配布２３）細胞中で増殖させたところ、ジョージア州からの４分離株はテネシーからの１５株よりゆっくり増殖したことが認められた。それゆえ、これらを別々に処理し、分析した。手順を手短に以下に記載する。
ベロＥ６、サル腎臓上皮細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ−１５８６）を集密度９５％に増殖させて、一次分離株の１／１０希釈液で感染させた。ウイルスを３７℃で１時間吸着させて、次に、細胞にＤ−ＭＥＭを補足し、３７℃でインキュベートした。毎日、光学顕微鏡により、細胞変性効果（ＣＰＥ）に関して細胞をモニタリングした。９０％ＣＰＥで、細胞を擦り取って採取し、３０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離によりペレット化した。メーカーのプロトコールに従って、標準手法によりＲＮＡ調製を実施した。
ＲＳＶ Ｎ遺伝子の増幅：ＡＬＮ−ＲＳＶ０１認識部位を含有するＲＳＶ Ｎ遺伝子断片の増幅を、２段階ＲＴ−ＰＣを用いて実施した。
先ず、無作為六量体およびＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ逆転写酵素（Invitrogen,
Carlsbad, CA）を用いて、４２℃で１時間、ＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡライブラ
リーを生成した。次に、順方向プライマーＲＳＶ ＮＦ：5’-AGAAAACTTGATGAAAGACA-3’、および逆方向プライマーＲＳＶ ＮＲ：5’-ACCATAGGCATTCATAAA-3’を用いて、５５℃で３０秒間、その後６８℃で１分間を３５サイクル、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑポリメラーゼ（Invitrogen, Carlsbad, CA）を用いて、１２００ｎｔ遺伝子特異的断片を増幅した。Ｐ／ｏアガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を分析した。
結果：最初の１５分離株の配列解析は、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１に関する標的部位がすべての系統全体に亘って完全に保存されるということを確証した。配列アラインメントを、図８に示す。重要なのは、この保存が、ＲＳＶ ＡおよびＢサブタイプの両方からの分離株を含む異なった集団全体で保持されたことである。興味深いことに、４つの増殖速度の遅い分離株を分析した際、４つのうちの１つ（ＬＡＰ６８２４）が、図９の上部に示すように、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１認識部位における単一塩基の変異を有する、ということをわれわれは観察した。この変異は、この分離株中のＲＳＶ Ｎ遺伝子の位置１３のコード配列を、ＡからＧに変えた（図９、下部）。
結論：１９の患者分離株から、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１に対する標的部位のＲＳＶ Ｎ遺伝子の配列を確定した。１９例のうちの１８例（９５％）において、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１に対する認識素子は１００％保存されていることが確定された。分離株のうちの１つにおいて、ＲＳＶ Ｎ遺伝子内で位置１３のヌクレオチドをＡからＧに変える単一の塩基変更が検出された。この変更は、図９（下部）に示すようにＡＬＮ−ＲＳＶ０１のアンチセンス鎖と標的配列との間に単一のＧ：Ｕ揺らぎを作り出す。このようなＧ：Ｕ揺らぎのハイブリダイゼーション能力に関する理解に基づくと、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、この分離株中のＲＳＶ Ｎ遺伝子をサイレンシングするのに有効であると予測される。
実施例９．ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の合成および精製
図１０に示すように、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤物質の製造プロセスは、３‘−０−（２−シアノエチル）ホスホルアミダイトの化学作用を、４，４‘−ジメトキシトリフェニルメチル（ジメトキシトリチル、ＤＭＴ）基で保護される５’−ヒドロキシル、およびリボースヌクレオシドの２’−ヒドロキシル上のｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）保護とともに用いて、従来の固相合成により、２つの一本鎖オリゴヌクレオチド（センスおよびアンチセンス）を合成することからなる。粗製一本鎖オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断し、二段階プロセスで脱保護化して、分取陰イオン交換高速液体クロ
トグラフィー（ＡＸ−ＨＰＬＣ）により精製した。２つの一本鎖を等モル比で組合せて、その後、アニーリングし、凍結乾燥して、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤物質を生じた。
固相合成：固体支持体、例えば制御多孔性ガラス（ＣＰＧ）またはポリスチレン上でのホスホルアミダイト法によるオリゴヌクレオチド鎖のアセンブリーは、図１１に略記した反復プロセスに従った。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１センスおよびアンチセンス一本鎖中間体の合成を、５’−ジメトキシトリチルチミジンを負荷された支持体上で実行した。保護化ヌクレオチドホスホルアミダイトおよび活性剤の付加により、３’から５‘末端に各中間体を集合させた。反応はすべて、充填カラム中の誘導体化支持体上で行われた。各伸長サイクルは、４つの異なるステップで構成された。
５’−ヒドロキシル脱保護化（脱トリチル化、図１１ステップＡ）：合成の開始に際して、ＤＭＴ−チミジン支持体を、５’−ヒドロキシルからの酸不安定性４，４’−ジメトキシトリチル保護基の除去に付した。その後の合成の各サイクルは、支持体結合オリゴヌクレオチドの５’酸素原子からの対応するＤＭＴ保護基の除去で開始した（図１１ステップＡ）。これを、トルエン中のジクロロ酢酸の溶液を用いた処理により成し遂げた。脱トリチル化後、支持体結合物質を、次の反応のための準備においてアセトニトリルで洗浄した。
カップリング（図１１ステップＢ）：活性剤５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾールの存在下で、支持体結合オリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシル基と保護化ヌクレオシドホスホルアミダイトの過剰量の溶液との反応により、成長中のオリゴヌクレオチド鎖の伸長を達成した。各ステップに必要とされるアミダイトを、表１ｃに記載したオリゴヌクレオチド配列により確定した。これにより、亜リン酸三エステルヌクレオチド間結合が形成された。カップリング反応が完了するのに十分な時間をおいた後、過剰のホスホルアミダイトおよび活性剤を、アセトニトリルを用いて反応器からすすぎ落とした。
酸化（図１１ステップＣ）：次に、新規に作られた亜リン酸三エステル結合を、水の存在下でピリジン中のヨウ素の溶液で処理することにより酸化した。これにより、対応するホスホトリエステル結合が形成された（図１１ステップＣ）。酸化完了後、アセトニトリルで支持体をすすぐことにより、カラムから過剰の試薬（ピリジン／水中のヨウ素）を除去した。
キャッピング（図１１ステップＤ）：カップリング反応は非常に高い収率で進行するが、しかしそれは完全に定量的であるというわけではない。任意の所定のサイクルで利用可能な小部分（典型的には１％未満）の５’−ヒドロキシ基は、活性化ホスホルアミダイトとカップリングできない。その後のサイクル中の反応を防止するために、キャッピング試薬（無水酢酸およびＮメチルイミダゾール／２，６ルチジン／アセトニトリル）を用いて、これらの部位を遮断した。その結果、５’−Ｏ−アセチル化（「キャップ化」）支持体結合オリゴヌクレオチド配列が形成された。
切断および脱保護化：適切な保護化ヌクレオシドホスホルアミダイトを用いるこの基本的な４ステップサイクルの反復により、全保護化配列の集合が可能となった。オリゴヌクレオチド鎖の５’末端でヒドロキシルを保護するＤＭＴ基を除去した。シアノエチルホスフェート保護基の除去を伴う水性メチルアミン処理により、粗製オリゴヌクレオチドを固体支持体から切断した。支持体を濾過により除去し、ジメチルスルホキシドで洗浄した。切断溶液および洗浄液を併合して、室温または温度を上げて保持して、図１２ステップＡに示すように、環外アミノ基（ベンゾイル、イソブチリルおよびアセチル）の脱保護化を完了した。次に、２’−ｏ−ＴＢＤＭＳ保護基をピリジン−フッ化水素の溶液を用いて切断して、粗製オリゴヌクレオチドを得た（図１２ステップＢ）。脱保護化の完了時に、溶液を水性緩衝液で希釈して、精製ステップに付した。
ＡＸ−ＨＰＬＣによる精製：各粗生成物溶液の精製を、ＡＸ−ＨＰＬＣにより成し遂げた。粗生成物の溶液を、Ｓｏｕｒｃｅ１５Ｑ媒質を充填した精製カラム上に載せた。約１０％アセトニトリルを含有するリン酸ナトリウム緩衝溶離液を用いて、精製作業を実施した。塩化ナトリウム勾配を用いて、カラムからオリゴヌクレオチドを溶離した。高温（６５〜７５℃）で精製を実行した。ＵＶ吸収分光分析により、溶離プロフィールをモニタリングした。分画を収集し、プールした。標的純度レベルで生成物を含有するプールを、プロセスの次のステップに付した。判定規準を満たさなかった分画を、いくつかの場合には、再精製した。
脱塩：公称１，０００分子量カットオフのポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カセットを用いる接線フロー濾過（ＴＦＦ）を用いて、オリゴヌクレオチド溶液を濃縮した。濃縮ステップからの保持液（ｒｅｔｅｎｔａｔｅ）をｐＨ調節し、水でダイアフィルター処理して、ＡＸ−ＨＰＬＣ精製に用いられた塩および溶媒を除去した。時として、脱塩化産物溶液（保持液）をＴＦＦにより濃縮した後、次のステップに移した。
二重鎖形成：センスおよびアンチセンス鎖の限外濾過溶液を、所望の割合で併合して、２つの中間体の等モル混合物を形成した。各一本鎖ヌクレオチドの必要量を、ＵＶ検定およびそれらの分子量に基づいて算定した。より良好な制御を保証するために、算定量の第一鎖を算定量より少ない第二鎖と混合した。その混合物の試料のＡＸ−ＨＰＬＣ分析は、過剰量の第一鎖に関する明確なピークを、二重鎖に関するピークとともに示した。さらなる量の第二鎖を付加し、試料を再び分析した。ＨＰＬＣクロマトグラフィーで判定して、鎖の過剰量の一方が１面積％未満であると確定されるまで、このプロセスを反復した。次に、制御条件下で溶液を加熱し、冷却して、二重鎖をアニーリングした。
凍結乾燥：二重鎖溶液を０．２μフィルターを通して濾過した後、大量乾燥のために使い捨て１回使用トレー中に入れた。濾過産物溶液を、以下の３ステップからなるサイクルを用いて凍結乾燥した：（１）凍結ステップ、（２）０℃での一次乾燥、ならびに（３）２５℃での二次乾燥。このプロセスの結果は、凍結乾燥粉末、すなわち、液体を凍結し、凍結液体産物を真空下で乾燥して、多少のまたはすべての凍結水昇華により除去するステップを包含するプロセスにより製造される粉末である。
容器閉鎖系：凍結乾燥ＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤物質を、ねじ式の清浄な高密度ポリエチレンボトル中に包装し、ラベルを付けて、出荷まで、−１０〜−２５℃で冷凍庫中に保存した。いくつかの場合、防湿袋を在庫品の包装に加えた。選択した袋（モデルＬＦ４８３５Ｗ、Laminated Films & Packaging製）は、３つの層（白色ＰＥＴ、箔およびポリエチレン）を有し、特に酸素および水分に対するバリアとして推奨される。
薬剤仕上げ：ＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤物質を、密閉容器中の凍結乾燥粉末として、滅菌充填／仕上げサイトに送達した。各容器は、既知の重量のＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤物質を保持した。嵩重量、二重鎖純度および含水量値を用いて、処方物に利用可能なＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤物質を算定した.薬剤物質は吸湿性であるので、全容器を製造プロセスに割
り当てた。用いられる容器のサイズは、薬剤割当を目標ロットサイズに近づけさせた。リン酸緩衝溶液を、目標ロットサイズを調製するために必要とされるものより余分な量で、必要な組成物に調製した。緩衝液のｐＨを、７．４±０．７に調整した。割当ＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤物質は、全バイアル中で、リン酸緩衝溶液の目標バッチ容積の８０％に溶解した。製造段階の試料を取り出して、ＵＶ／ＳＥＣにより効能を測定した。この検定値を用いて、理論的バッチサイズを算定して、１００％効能を得た。残りの調製緩衝液を用いて、ロットをこの理論容積にした。ｐＨをモニタリングし、必要な場合は６．６＋１．０に調整した。次にロットを、２つの０．２２ｕｍ滅菌フィルターに順次通して無菌濾過し、個々の滅菌バイアル中に充填して、栓をして、密閉し、点検し（１００％目視）、ラベルを貼った。全バイアルを、２〜８℃で保存した。
処方物開発：ＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤製品をリン酸ナトリウム緩衝液でｐＨ６．６に処方した。リン酸および水酸化ナトリウムは、必要な場合はｐＨ調節のために利用可能であった。処方物はほぼ等張性であり、したがって、オスモル濃度を調整するために塩化ナトリウムを使う必要はなかった。鼻内投与または吸入に用いられるＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤製品のオスモル濃度は、好ましくは２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲である。
ＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤製品の各バイアルは、０．５ｍＬの容積を含有する。当該製品を透明Ｉ型ガラスバイアル中に充填し、アルミ製フリップオフ上蓋付きのテフロン（登録商標）被覆ブチルゴム栓で密閉した。全バイアルを２〜８℃に保持し、使用前に室温に温めた。いくつかの場合、調剤スタッフが通常生理食塩溶液中で薬剤製品の希釈液を調製した。
薬剤製品の説明および組成：ＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤製品を、１５０ｍｇ／ｍＬの公称濃度で、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６．６中の水溶液として処方した。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤製品の定量的組成を、表３に示す。処方物に関して示した重量は、純無水オリゴヌクレオチドを反映している。バッチ当たりの活性成分の量を算定して、ＵＶにより確定した場合の「そのままの」純度、ＳＥＣによるＡＬＮ−ＲＳＶ０１面積値、および含水量を説明した。
安定性試験：ＡＬＮ−ＲＳＶ０１（ロット番号Ｒ０１）を、貯蔵開始時、１ヵ月後、２ヵ月後、３ヵ月後、６ヵ月後および９ヵ月後に評価し、安定性を示す方法、例えば変性ＡＸ−ＨＰＬＣおよびＳＥを用いて、化学的に安定であることが判明した。追跡試験は、２℃〜８℃で保存した場合の薬剤物質の緩衝水溶液の安定性を確証した。−２０℃で保存した凍結乾燥薬剤物質は、緩衝水溶液と少なくとも同様に安定であると予測される。本明細書中で用いる場合、「安定である」は、ヒト被験者における製品使用を妨げる化学的変化に耐性であることを意味する。安定性は、変性ＡＸ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣを含めた方法を用いて安定性および純度を測定して、センスおよびアンチセンス鎖からなる薬剤製品の全体的割合、ならびに二重鎖形態で見出される薬剤製品の割合の測定値を提供することにより査定され得る。安定性の他の測定としては、発熱物質に関する試験、含水量の分析、Ｔｍの試験（すなわち二重鎖の質）、例えば実施例に例示した試験を用いた、、ＲＳＶ遺伝子発現の抑制に関する検定値、ウイルス力価の低下等を検討するパラメーター等のうちの1つまたは複数が挙げられる。
ＢＤ ＡｃｃｕＳｐｒａｙ（商標）鼻噴霧剤系との適合性：市販のBecton-DickinsonＡｃｃｕｓｐｒａｙ（商標）鼻噴霧剤系を用いた鼻吸入により、２ａ相臨床試験を実施した。周囲温度および冷蔵（２〜８℃）状態の両方で１４日間に亘って当該系と接触したＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤製品の安定性を評価することにより、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１薬剤製品の適合性を確証した。外見、ＳＥＣ、安定性指示変性ＡＸ−ＨＰＬＣ、ｐＨ,オスモル濃度
およびＵＶ検定により測定した場合、周囲温度および冷蔵状態において、１０および１５０ｍｇ／ｍＬで１４日までの保存時に、分解は観察されなかった。
実施例９．分離株に関するサイレンシングデータ
方法：１０％加熱不活性化ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ中で、ベロＥ６細胞を８０％の集密度に培養した。ｓｉＲＮＡ導入のために、４ｕｌのＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯを５０ｕｌの無血清ＤＭＥＭに付加し、室温で１０分間インキュベートした。次に、指示濃度のｓｉＲＮＡを培地／ＴＫＯ試薬にそれぞれ付加し、室温で１０分間インキュベートした。ＲＮＡ混合物を、１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ ２００ｕｌに、次に単層培養細胞に付加した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で６時間、インキュベートした。１×ハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）で静かに洗浄することによりＲＮＡ混合物を除去し、３００プラーク形成単位（ｐｆｕ）／ウェルのＲＳＶ／Ａ２（ＭＯＩ＝３０）をウェルに付加し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間、吸着させた。ウイルスを除去し、細胞を１×ＨＢＳＳで洗浄した。１０％ＦＢＳ培地を含有するＤＭＥＭ中の１％メチルセルロースを細胞に被せて、３７℃、５％ＣＯ２で６日間、インキュベートした。抗Ｆタンパク質モノクローナル抗体１３１−２Ａを用いて、プラークに対して細胞を免疫染色した。
結果：表４に示すように、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１によるサイレンシングを、全分離株に関して観察した。
結論：試験した全臨床分離株は、８５％以上、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１により特異的に抑制された。ミスマッチ対照ｓｉＲＮＡ２１５３により有意に抑制された分離株はなかった。
実施例１０．プラスミドベースの検定におけるサイレンシング
方法：２４ウェルプレートに、ＨｅＬａ Ｓ６細胞を播種し、集密度８０％に増殖させた。各ウェルに対し、１ｕｇのＲＳＶ Ｎ−Ｖ５プラスミドをｓｉＲＮＡ（指示濃度で）と５０ｕｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭ中で混合し、これを次に、メーカーの使用説明書に従って調製したリポフェクタミン２０００（Invitrogen）−Ｏｐｔｉｍｅｍ混合物に付加した。この混合物を、室温で２０分間インキュベートして、ｓｉＲＮＡおよびリポフェクタミン−Ｏｐｔｉｍｅｍ構成成分間の複合体を形成させた。複合体混合物を細胞に付加して、３７℃で一晩インキュベートした。培地を除去し、細胞をリン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ）で洗浄し、次に、５０ｕｌの溶解緩衝液（ＲＩＰＡ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮａでオキシコレート、１％ＮＰ−４０、０．０５％のＳＤＳ））とともに１〜２分間インキュベートすることにより溶解した。溶解物を分析して、抗Ｖ５抗体を用いるウエスタンブロッティングによる検出で、細胞溶解物中のＲＳＶ−Ｎタンパク質のレベルを測定することにより、ＲＳＶ−Ｎタンパク質発現の抑制を定量した。
結果：一過性プラスミド発現は、ＲＮＡｉ剤に関する有効な検定であることが示された（表５）。
結論：ｓｉＲＮＡ２０１７（ＡＬＮ−ＲＳＶ０１）は、ＲＳＶ Ｎ遺伝子を発現するプラスミドと一時的に同時トランスフェクトされた場合、ＲＳＶ Ｎタンパク質の産生を特異的に且つ用量依存的に抑制することが示された。抑制は、ミスマッチ対照ｓｉＲＮＡ２１５３を用いては観察されない。
実施例１１．ｓｉＲＮＡのエーロゾル送達によるＲＳＶのサイレンシング
方法：合計６０秒間、エーロゾル装置を用いて霧状化することにより、ＡＬ−ＤＰ−１７２９またはＡＬ−ＤＰ−１７３０の２ｍｇ／ｍｌ溶液を送達した。上記と同様に肺からウイルス試料を調製して、プラーク検定の代わりにＥＬＩＳＡを用いて測定した。ＥＬＩＳＡは、マウス肺溶解物から得られたウイルス感染細胞中のＲＳＶ Ｎタンパク質の濃度を測定する。
方法：肺溶解物を、炭酸塩−重炭酸塩緩衝液（ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）で１：１希釈して、６〜１０ｕｇ／１００ｕＬの作業濃度にして、各試験ウェルに付加し、３７℃で１時間、または４℃で一晩、インキュベートした。ウェルをＰＢＳ／０．５％トゥイーン２０で３回洗浄し、次に、３７℃で１時間、または４℃で一晩、５％乾燥ミルク／ＰＢＳで遮断した。一次抗体（Ｆタンパク質陽性対照＝クローン１３１−２Ａ、Ｇタンパク質陽性対照＝１３０−２Ｇ、陰性対照＝正常ＩｇＧ１κ（BD Pharmingen、カタログ番号５５３４５４、試験血清またはハイブリドーマ上清））を、１：１０００の最終希釈でウェルに付加し、３７℃で１時間、または４℃で一晩、インキュベートした。ウェルをＰＢＳ／０．５％トゥイーン２０で３回洗浄した。二次抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）全分子−アルカリ性ホスファターゼ接合体）を、１：１０００の最終希釈でウェルに付加し（１００ｕｌ／ウェル）、３７℃で１時間、または４℃で一晩、インキュベートした。ウェルをＰＢＳ／０．５％トゥイーン２０で３回洗浄した。その後、メーカーの使用説明書に従って作成した２００ｕｌのＮｐｐ（Sigmafast）基質（Sigma Aldrich、Ｎ２７７０）
を、ウェルに付加した。この混合物を３７℃で１０〜１５分間インキュベートし、ＯＤ４０５／４９５での吸光度を測定した。
結論：ＲＳＶ特異的ｓｉＲＮＡの送達は、ミスマッチ対照ｓｉＲＮＡと比較して、マウスの肺におけるＲＳＶ Ｎタンパク質のレベルを低減する（図１３ａ〜ｂ）。
実施例１２．３日目のin vivo抑制−予防
方法：上記のin vivo方法を用いて、in vivo予防を試験したが、但し、ｓｉＲＮＡは、３日前から４時間前まで、ＲＳＶ感染前の異なる時点で送達される。ＡＬ−ＤＰ−１７２９（活性）およびＡＬ−ＤＰ−１７３０（ミスマッチ対照）について、結果を得た。
結果：ウイルス攻撃の最大３日前に鼻内送達した活性ｓｉＲＮＡは、図１４に示すように、in vivoにおいて特異的且つ有意のサイレンシングを示す。
実施例１３．Ｐａｒｉ ｅＦｌｏｗ（登録商標）装置によるＡＬＮ−ＲＳＶ０１の霧状化：小滴サイズおよび分析整合性
方法：ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の１５０ｍｇ／ｍｌ溶液（２ｍｉｓのＰＢＳ中）を、Ｐａｒｉ ｅＦｌｏｗ（登録商標）電子装置中に充填し、霧状化が完了するまで作動して、全エーロゾルを収集し、ポリプロピレン管中で液化させた。霧状化後の物質のアリコートを分析して、標準条件下で、レーザー回析（Malvern MasterSizerX）により幾何学的小滴サイズ分布を確定した。霧状化の前および後の物質のアリコートを分析して、陰イオン交換ＨＰＬＣ法を用いた安定性により、分析整合性を確定した。
結果：エーロゾル化ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、３．１（ｉｍ）の質量中央値直径、１．６の幾何学的標準偏差（ＧＳＤ）および８５％の総吸込み可能部分（すなわち、粒子％５μｍ未満）を有し、７５ｍｇ／ｍｌ溶液がエーロゾル化されて、適切な粒子サイズを有する吸込み可能物質を生じる、ということを確証した。霧状化されなかったＡＬＮ−ＲＳＶ０１処方物の対照試料との比較は、整合性クロマトグラムを示し、オリゴヌクレオチドが分解を伴わずにｅＦｌｏｗ（登録商標）により霧状化され得る、ということを実証した。
生物学的活性：ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の２５ｍｇ／ｍｌ溶液（１ｍｌのＰＢＳ中）を調製し、１００ｕｌをＰａｒｉ ｅＦｌｏｗ（登録商標）電子装置による霧状化の前に取り出し（前霧状化アリコート）、氷浴上で冷却５０ｍｌ円錐管中に通すことにより液化後、５００ｕｌの霧状化溶液を収集した（後霧状化アリコート）。両アリコートの連続希釈を、上記のようにわれわれのin vitroトランスフェクション／感染プラーク検定で試験した
が、但し、ｓｉＲＮＡをリポフェクタミン−２０００と複合体形成させた。
結果：霧状化前および後のｓｉＲＮＡは、ベロ細胞プラーク検定におけるＲＳＶウイルス複製を効率的に抑制した。抑制の程度は２つの試料間でほとんど同一であり、用量応答を示して、最高ｓｉＲＮＡ濃度で８０％超のサイレンシングをもたらしたが、これは、霧状化したＡＬＮ−ＲＳＶ０１が生物学的活性を保持する、ということを確証した。結果を、図１５に示す。
実施例１４．吸入可能ｓｉＲＮＡ：ＡＬＮ−ＲＳＶ０１
ｓｉＲＮＡターゲッティングＲＳＶの吸入によるエーロゾル化および送達のin vivo作用、ならびに吸入ｓｉＲＮＡの薬物動態特性を調べるために、ヒト成人被験者における二重盲検無作為化プラセボ対照評価試験を実施した。試験は、通常の血液および臨床的観察、炎症生体マーカー、耐容性および血漿薬物動態を測定した。本明細書中で用いる場合、「吸入」は、肺上皮の局所的治療のために処方され、送達される剤形の投与を指す。上記のように、吸入可能剤形は、吸込み可能サイズの粒子、すなわち、吸入時に口または鼻および喉頭を通過して、気管支および肺胞に入るのに十分に小さい粒子を含む。
当該試験において、増大用量のエーロゾル化ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボを、吸入により１日１回、３連続日間、各群１２名の被験者（ＡＬＮ−ＲＳＶ０１摂取８名およびプラセボ摂取４名）の４群（総被験者４８名）に投与した。完成製品中のＡＬＮ−ＲＳＶ０１最大溶解濃度は、１５０ｍｇ／ｍＬである。したがって、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の１５０ｍｇ／ｍｌ溶液を適切な濃度に希釈して、Ｐａｒｉ ｅＦｌｏｗ（登録商標）電子装置に充填し、霧状化が完了するまで作動させた。
薬物動態（ＰＫ）に関して評価される血液試料は、用量投与前、ならびに０日目における用量投与後２、５、１５および３０分、１時間および２４時間、ならびに３回投与後２、５、１５および３０分、１時間および２４時間（１３試料／被験者）を包含した。ＰＫのための尿採取は、用量投与前、ならびに３回用量投与後０〜６時間、６〜１２時間および１２〜２４時間であった。
血漿ＡＬＮ−ＲＳＶ０１濃度、および得られたパラメーター（Ｃpre、Ｃmax、ｔmax、
ｔｙ２、ＣＬ／Ｆ、Ｖｄ／Ｆ、ＡＵＣｉａｓ）を、ＰＫに関して評価した。
ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、それぞれ３６ｍｇ／ｋｇ／日および３０ｍｇ／ｋｇ／日という高い用量で、ラットおよびサルにおける吸入投与により、毒性に関して従来評価されてきた。最新研究の単一用量投与部分で投与されるべき最高用量は２１０ｍｇ／日（または３ｍｇ／ｋｇ（体重７０ｋｇとして））であった。ｍｇ／ｋｇに関して、この用量は、ラットおよびサルに従来投与された用量の約１０分の１である。
この試験における初回用量は、７．０ｍｇ、２１．０ｍｇおよび７０．０ｍｇで、それぞれ約３００倍、１００倍および３０倍の安全域を提供した。
当該試験の多数回用量投与部分に関する用量レベルは、７．０ｍｇ、２１．０ｍｇ、７０．０ｍｇおよび２１０ｍｇで、３連続日間の毎日送達用量（ＤＤ）として投与された。
当該研究の単一用量投与部分で投与されるべき最高用量は２１０ｍｇ／日（または３ｍｇ／ｋｇ（体重７０ｋｇとして））で選択された。
当該試験の多数回用量投与部分における試験薬剤曝露持続期間は、ＲＳＶ感染が急性であるために短期間であるべきとの考えで意図された治療約投与期間に基づいて、１日１回投与で３日間であることが選択された。
肺機能試験
容量および流量に関して、健常なボランティアを確認するためのスクリーニングで、ＰＦＴを実行した。ＰＦＴは、肺および胸壁の機械的および機能的特性を査定するための客観的方法を提供する。ＰＥＴ測定は以下を測定する。
・肺容量、例えば静的肺活量（ＳＶＣ）および努力性肺活量（ＦＶＣ）。これらは、肺内の種々の区画のサイズの測定値を提供する。
・容積パラメーター（例えば、ＦＥＶ１）および流量（例えば、ＦＥＦ２５〜７５）。これらは気道内の最大流を測定する。
ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボの吸入後の肺機能の連続評価を実行した。付加的ＰＦＴ試験を、０日目用量投与前（約−３０分）、ならびに、１日目に３０分、２時間、６時間および１２時間、１日目および２日目に０日目の投与前と同じ時間に実施した。
ＰＦＴは、肺容量および流量を提供する。ＳＶＣは、完全呼気作用から完全吸入に進む際に徐々に吸入される気体の容積である。ＦＶＣは、出来るだけ激しく且つ速く、完全吸入から完全呼気作用に進む際に吐き出される容積である。ＦＥＶ１は、ＦＶＣ操作の最初の１秒間に吐き出される量である。努力性呼気流量（ＦＥＦ２５〜７５）は、ＦＶＣの中間の半分の間の平均呼気流量である。ＡＴＳ／ＥＲＳガイドラインに従って、ＳＶＣ、ＦＶＣ、ＦＥＶ１およびＦＥＦ２５〜７５を測定した。この試験では、ＦＥＶ１が主要パラメーターであった。
図１６に示すように、肺機能の有意の変化は、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１のエーロゾル投与に関しては観察されなかった。
血漿
単一用量投与に関しては、０日目の用量投与前、ならびに用量投与後（霧状化後）２、５、１５および３０分、１時間および２４時間（７試料／ボランティア）に、血漿中のＡＬＮ−ＲＳＶ０１の分析のために血液を採取した。
多数回用量投与に関しては、０日目の用量投与前、ならびに初回用量投与後（霧状化後）２、５、１５および３０分、１時間および２４時間、ならびに３回目用量投与後（３回目用量の霧状化用量投与後）２、５、１５および３０分、１時間および２４時間に、血漿中のＡＬＮ−ＲＳＶ０１の分析のために血液を採取した。
各々５ｍＬの血液試料を、留置静脈内カテーテルを介して、または抗凝固剤としてＫ３ＥＤＴＡを含有する管中への直接静脈穿刺により、採取した。静脈内カテーテルを通して試料採取した場合、カテーテルを洗浄するために用いられるヘパリンによる血液のいかなる希釈をも防止するために、血液の最初の１ｍＬは破棄した。
結果
ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の安全且つ良好に耐容されるレジメンを、さらなる臨床的開発のために定義した。この目的のために、ヒトにおける所定用量に関する血漿曝露は、非ヒト霊長類より大きい、ということをデータは示す（図１７参照）。３ｍｇ／ｋｇ当量での単一用量投与は、プラセボに比して、インフルエンザ様副作用（咳、頭痛、非心臓性胸痛、咽頭喉頭痛および悪寒）のより高い発生率を伴ったが、ＡＬ−ＤＰ−２０１７の多用量投与は、最大０．６ｍｇ／ｋｇ／用量で、１日１回、３日間投与した場合、安全で且つ良好に耐容された。最高用量群（０．６ｍｇ／ｋｇ）におけるＡＬ−ＤＰ−２１０７の多用量投与後の好中球性白血球増多症の証拠も認められなかった（図１８参照）。
実施例１５．ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の分割用量投与はin vivoでのＲＳＶ力価レベルを低減した
固定用量（１２０ｕｇ）のＡＬＮ−ＲＳＶ０１を、ＲＳＶ滴注（ゼロ時点で１０６ｐｆｕ）の４時間前に、齧歯類に鼻内投与した。次に、滴注後１日目、２日目または３日目に、あるいは滴注後１、２および３日目に亘って等しく３回投与分割で、１２０ｕｇのＡＬＮ−ＲＳＶ０１をマウスに投与した。３日の経過中に投与された用量は、感染後１日目のｓｉＲＮＡの単一用量により観察されたものと同じ肺中のＲＳＶ力価レベル低減を保持した（図１９参照）。
実施例１６：ＲＳＶ標的化ｓｉＲＮＡのＲＮＡｉ特異的活性：材料および方法 動物．６〜８週齢の病原体無含有の雌ＢＡＬＢ／ｃマウスを、Harlan Sprague-Dawley
Laboratories（Indianapolis, Ind.）から購入した。マウスをマイクロアイソレーター・ケージに収容し、滅菌水および食餌を自由に摂取させた。
ウイルスの調製、細胞株およびウイルス力価測定． １０％ウシ胎仔血清（Hyclone, Logan, Utah）を補足したダルベッコ変法イーグル培地（Ｄ−ＭＥＭ、GIBCO Invitrogen, Carlsbad, Calif.）からなる組織培地（ＴＣＭ）中に、ベロＥ６細胞を保持した。ＲＳＶ／Ａ２およびＲＳＶ／Ｂ１を、ベロＥ６細胞中で調製した。要するに、無血清Ｄ−ＭＥＭ中の集密ベロＥ６細胞（American Type Culture Collection, Manassas, VA）を、０．１の多重感染度（ＭＯＩ）でＲＳＶに感染させた。ウイルスを３７℃で１時間吸着させて、その後、ＴＣＭを付加した。９０％超の細胞変性作用（ＣＰＥ）が光学顕微鏡で観察されるまで、感染細胞を３７℃で７２〜９６時間インキュベートした。感染細胞を培地の除去により採取して、最小容積の無血清Ｄ−ＭＥＭと取り替えて、その後、それぞれ−７０および４℃で３回の凍結−解凍サイクルに付した。内容物を収集し、４℃で２０分間、４０００×ｇで遠心分離して細胞破砕屑を除去し、前記と同様に免疫染色プラーク検定により力価を確定した。要するに、ベロＥ６細胞をストックＲＳＶの連続希釈液で感染させて、３７℃で１時間吸着させ、次に、２％メチルセルロース培地（ＤＭＥＭ。２％ウシ胎仔血清、１％抗生物質／抗真菌溶液、２％メチルセルロースを補足）で上を覆った。３７℃／５％ＣＯ２で５日後、プレートを取り出し、細胞を氷冷アセトン：メタノール（６０：４０）で固定した。細胞を、普遍的遮断試薬であるＰｏｗｅｒｂｌｏｃｋ（Biogenix, San Ramon, CA）で遮断し、抗ＲＳＶ Ｆタンパク質モノクローナル抗体１３１−２Ａ希釈物（１：２００）（Millipore-Chemicon）と、その後、ヤギ抗マウスＩｇＧ全分子アルカリ性ホスファターゼ二次抗体ともにインキュベートした。反応をアルカリ性ホスファターゼ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ Ｂｌａｃｋ、Vector Laboratories, Burlingame, CA）で展開させて、プラークを可視化し、光学顕微鏡を用いて計数した。ＲＳＶ一次分離株培養物については、試料は、テネシー大学ミシシッピー校のJohn De Vincenzo博士から入手した。ＲＳＶ分離株は、メンフィスのLe Bonheur Children’s Medical Center Virology Laboratoryにおいて、従来の直接蛍光抗体（ＤＦＡ）法により、
または迅速抗原検出法により診断されたＲＳＶ感染小児から入手した。鼻分泌物を吸引により収集し、ＨＥｐ−２細胞中で増殖させ、継代培養して、細胞変性効果９０％で収穫した。次に、ＲＳＶを含有する上清の個々のアリコートを、メーカーのプロトコール（Qiagen, Valencia, CA）に従ってＱｉＡｍｐウイルスＲＮＡミニキットを用いて、核酸抽出に付した。ＲＳＶ分離株は、Mark Van Ranst（ベルギーのリューベン大学）およびLarry Anderson（疾病管理予防センター、Atlanta, GA）からも入手した。
ＲＳＶ特異的ｓｉＲＮＡ選択． 国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）データベースのうちの１つを用いて、Basic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）を実行した。この分析では、配列比較アルゴリズムを用いて、質問に対する最適局所アラインメントに関して配列データベースを検索する（２）。この場合、クエリーは、ｄＴｄＴオーバーハングを除く、ＲＳＶのセンスまたはアンチセンス鎖を含む１９ｎｔ配列である。データベースReference Sequence（ＲｅｆＳｅｑ）は、包括的統合非冗長組の配列、例え
ばゲノムＤＮＡ、転写体（ＲＮＡ）、およびタンパク質産物を提供し、毎週更新される（４９）。ＲｅｆＳｅｑデータベースからの任意の配列と有意の相同性を示さないｓｉＲＮＡのみを、合成およびさらなる試験のために選択した。
in vitroＲＳＶ抑制検定． ベロ細胞（２４ウェルプレート中）を、１０％ウシ胎仔血清（Life Technologies-Invitrogen, Carlsbad, CA）、１００単位／ｍｌのペニシリンおよび１００ｇ／ｍｌのストレプトマイシン（BioChrom, Cambridge, UK）を補足したＤＭＥＭ中で３７℃で５％ＣＯ２加湿インキュベーター中で集密度８０％に増殖させた。ｓｉＲＮＡを、５０ｕｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ低血清培地（Invitrogen）中で指示濃度に希釈した。別個に、３ｕｌのリポフェクタミン２０００（Invitrogen）を５０ｕｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中で希釈し、室温で５分間、混合し、インキュベートした。ｓｉＲＮＡおよびリポフェクタミン混合物を併合し、室温で２０〜２５分間インキュベートして、次に細胞に付加し、３７℃で一晩インキュベートした。次に混合物を細胞から取り出し、２００〜４００プラーク形成単位のＲＳＶ／Ａ２を、３７℃で１時間、細胞とともにインキュベートした。感染細胞をメチルセルロース培地で被覆し、３７℃で５日間インキュベートして、上記と同様に免疫染色プラーク検定によりプラークを可視化した。
ＲＳＶ特異的ｓｉＲＮＡのin vivoスクリーニング． 予防モデルに関しては、ＢＡＬＢ／ｃマウスを２，２，２−トリブロモエタノール（Avertin）の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与により麻酔して、総容積５０ｊｕ．ｌのＰＢＳでｓｉＲＮＡを鼻内滴注（ｉ．ｎ．）した。ｓｉＲＮＡの鼻内滴注の４時間後に、マウスを麻酔して、５０ｕｌ中の１×１０６ＰＦＵのＲＳＶ／Ａ２で鼻内感染させた。感染後４日目に肺を取り出す前に、右尾動脈を切断することにより麻酔マウスを放血させた。肺組織を、１ｍｌの氷冷リン酸緩衝生理食塩溶液（ＰＢＳ；GIBCO Invitrogen）中に収集した。免疫染色プラーク検定により、肺からのＲＳＶ力価を測定した。肺を、手で持てる大きさのTissumiserホモジナイザー（Fisher Scientfic, Pittsburg, Pa）を用いて均質化して、肺ホモジネートを氷上に５〜１０分間置いて、破砕屑を沈殿させた。清澄化した肺溶解物を、順次、無血清ＤＭＥＭ中で１０倍希釈し、２４ウェルプレート（BD Falcon, San Jose, Calif）中のＤ−ＭＥＭ中で培養した９５％集密ベロＥ６細胞に付加し、上記と同様にプラーク検定を実施した。処置モデルに関しては、ＢＡＬＢ／ｃマウスを上記と同様に麻酔して、５０ｕｌ中の１×１０６ＰＦＵのＲＳＶ／Ａ２で鼻内滴注した。ウイルス感染後１、２、３または４日目に、マウスを再麻酔して、５０ｕｌ中のｓｉＲＮＡを鼻内滴注して、次に、上記と同様に、感染後５日目に肺中でウイルス濃度を測定した。
ｓｉＲＮＡの生成． 標準固相オリゴヌクレオチド合成プロトコール（１３）に従って、２’−０−ｔ−ブチルジメチルシリル保護化ホスホルアミダイトとともに、市販のウリジン（Ｕ）の５’−０−（４，４’−ジメトキシトリチル）’３’０−（２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）ホスホルアミダイトモノマー、４−Ｎ−ベンゾイルシチジン（ＣＢｚ）、６−Ｎ−ベンゾイルアデノシン（Ａｂｚ）および２−Ｎ−イソブチリルグアノシン（ＧＩＢｕ）を用いて、ＲＮＡオリゴヌクレオチドを合成した。切断および脱保護化後、陰イオン交換高速液体クロマトグラフィーによりＲＮＡオリゴヌクレオチドを精製し、ＥＳ質量分光測定により特性分析した。ＲＮＡ一本鎖からｓｉＲＮＡを生成するために、等モル量の相補的センスおよびアンチセンス鎖を混合して、アニーリングし、ｓｉＲＮＡをＣＧＥによりさらに特性分析した。
ＰＢＭＣ検定． インターフェロンα（ＩＦＮα）または腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）を刺激するｓｉＲＮＡの能力を調べるために、Blood Bank Suhl, Institute for Transfusion Medicine, Germanyから入手した白血球の濃縮画分（軟膜）から、ヒト末梢血単核球（ｈＰＢＭＣ）を単離した。軟膜をＰＢＳ中で１：１希釈し、Histopaque（Sigma, St. Louis, MO）の管に付加し、２２００ｒｐｍで２０分間遠心分離して、分別を可能にした。白血球を収集し、ＰＢＳ中で洗浄し、その後、遠心分離した。ＩＦＮα検定のために、１０％ウシ胎仔血清、ＩＬ−３（１０ｎｇ／ｍｌ）（Sigma）およびフィトヘ
マグルチニン−Ｐ（ＰＨＡ−Ｐ）（５ｕｇ／ｍｌ）（Sigma）を補足し、あるいはＴＮＦα検定のためには添加物なしで、ＲＰＭＩ１６４０培地（Invitrogen）中に、１×１０６細胞／ｍｌの濃度で細胞を再懸濁し、９６ウェルプレート上に植えつけて、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。培養中の、対照オリゴヌクレオチドｓｉＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−５０４８二重鎖：５’−ＧＵＣ ＡＵＣ ＡＣ ＡＣＵＧＡＡＵＡＣＣ ＡＡＵ−３’および３’−Ｃ ＡＣ ＡＧＵＡＧＵＧＵＧＡＣＵＵＡＵＧＧＵＵＡ−５’；ｓｉＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−７２９６二重鎖：５’−ＣＵＡＣＡＣＡＡＡＵＣＡＧＣＧＡＵＵＵＣＣＡＵＧＵ−３’および３’−ＧＡＵＧＵＧＵＵＵＡＧＵＣＧＣＵＡＡＡＧＧＵＡＣＡ−５’；ｓｉＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−１７３０二重鎖：５’−ＣＧＡＵＵＡＵＡＵＵＡＣＡＧＧＡＵＧＡｄＴｓｄＴ−３’および３’−ｄＴｓｄＴＧＣＵＡＡＵＡＵＡＡＵＧＵＣＣＵＡＣＵ−５’；およびｓｉＲＮＡ ＡＬ−ＤＰ−２１５３二重鎖：５’−ＧＧＣＵＣＵＡＡＧＣＵＡＡＣＵＧＡＡＧｄＴｄＴ−３’および３’−ｄＴｄＴＣＣＧＡＧＡＵＵＣＧＡＵＵＧＡＣＵＵＣ−５’細胞を、ＯｐｔｉＭＥＭ（Invitrogen）中で前希釈した５００ｎＭのオリゴヌクレオチドまたはＯｐｔｉＭＥＭ中で前希釈した１３３ｎＭのオリゴヌクレオチドと、ならびにＩＦＮα検定にのためにはＧＰ２トランスフェクション試薬であるGeneporter（Genlantis, San Diego, CA）、あるいはＴＮＦα検定のためにはＮ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）（Roche, Switzerland）と併合し、３７℃で２４時間インキュベートした。メーカーの使用説明書に従って、Bender MedSystems（Vienna, Austria）即時ＥＬＩＳＡキットを用いて、ＩＦＮａおよびＴＮＦａを測定した。
in vitroおよびin vivoＲＡＣＥ． in vitroトランスフェクト化ベロＥ６細胞から、またはトリゾール（Invitrogen）を用いて、上記と同様に感染後５日目に採取された肺から、総ＲＮＡを精製し、その後、ＤＮアーゼ処理して、メーカーの使用説明書（Qiagen）に従って、ＲＮｅａｓｙを用いて最終処理した。プールした試料からの５〜１０μｌのＲＮＡ調製物を、前処理なしに、ＧｅｎｅＲａｃｅｒアダプター（５’−ＣＧＡＣＵＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＵＧＡＣＡＵＧＧＡＣＵＧＡＡＧＧＡＧＵＡＧＡＡＡ−３’）と結紮した。結紮ＲＮＡを、遺伝子特異的プライマー（ｃＤＮＡプライマー：５’−ＣＴＣＡＡＡＧＣＴＣＴＡＣＡＴＣＡＴＴＡＴＣ−３’）を用いて逆転写した。ＲＮＡｉ特異的切断産物を検出するために、ＲＮＡアダプターおよびＲＳＶ Ａ２Ｎ遺伝子ｍＲＮＡと相補的なプライマーを用いて、２回の連続ＰＣＲを実施した（初回については（ＧＲ５’プライマー：５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’および逆プライマー：５’−ＣＣＡＣＴＣＣＡＴＴＴＧＣＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡＴＡＴＣＣ−３’）、その後の２回目では、入れ子式ＰＣＲ（ＧＲＮ５’プライマー：ＧＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＡ−３’および逆Ｎプライマー５’−ＧＣＴＴＴＴＡＣＡＴＧＡＴＡＴＣＣＣＧＣＡＴＣＴＣＴＧＡＧ−３’））。増幅産物をアガロースゲル電気泳動により分割して、臭化エチジウム染色により可視化した。正しいサイズで移動する特定切断産物を切り出して、シーケンシングベクター中でクローン化し、標準方法によりシーケンシングした。
ＲＳＶ標的部位保存に関する臨床分離株の配列解析． ２段階ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１認識部位を含有するＲＳＶ Ｎ遺伝子断片の増幅を実施した。要するに、４２℃で１時間、無作為六量体およびSuperscript III逆転写酵素（Invitrogen）を用いて、ＲＮＡを逆転写して、ｃＤＮＡライブラリーを生成した。ＲＳＶ Ｎ順方向プライマー：５’−ＡＧＡＡＡＡＣＴＴＧＡＴＧＡＡＡＧＡＣＡ−３’およびＲＳＶ Ｎ逆方向プライマー：５’−ＡＣＣＡＴＡＧＧＣＡＴＴＣＡＴＡＡＡ−３’を用いて、５５℃で３０秒間を３５サイクル、その後、６８℃で１分間、プラチナＴａｑポリメラーゼ（Invitrogen）を用いて、１２００ヌクレオチド遺伝子特異的断片を増幅した。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル電気泳動により分析した。対照として、ＲＳＶ Ａロングの実験室株を、解析のために同一手順に付した。メーカーのプロトコールに従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キット（Qiagen）を用いて、ＰＣＲ産物を精製し、標準プロトコール（Agencourt Bioscience, Beverly, MA）を用いてシーケンシングした。各クローンに関して、順方向および逆方向配列を得た。Vector NTIソフトウェア（Invitrogen）を用いて、Clustal W and ContigExpressにより、配列を解析し、整列させた。
ＲＳＶウイルス遺伝子型分類． Mark Van Ranst氏から頂いた全２１の分離株の遺伝子型分類を、前記と同様に実施した（７８）。残りの７８（５７はテネシー大学のJohn DeVincenzo博士から、１３は疾病管理予防センターのLarry Anderson博士から、そして８つはエール大学のJeffrey Kahn博士から）の分離株の遺伝子型分類は、エール大学（New Haven, CT）の小児科部門のJeffrey Kahn博士の実験室が実施した。先ず、３７℃で１時間、無作為六量体およびＭ−ＭｕＬ Ｖ逆転写酵素（New England Biolabs, Beverly, MA）を用いて、ｃＤＮＡを生成し、その後、Ｇ遺伝子特異的プライマーＧＴｍＦ：５’−ＣＣＧＣＧＧＧＴＴＣＴＧＧＣＡＡＴＧＡＴＡＡＴＣＴＣＡＡＣ−３’および亜群特異的Ｇ遺伝子特異的プライマーＲＳＶ Ａ−ＧＡＲ２：５’−ＧＣＣＧＣＧＴＧＴＡＴＡＡＴＴＣＡＴＡＡＡＣＣＴＴＧＧＴＡＧ−３’またはＲＳＶ Ｂ−ＧＢＲ：５’−ＧＧＧＧＣＣＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＡＴＴＡＡＴＡＧＣＡＡＧＡＧＴＴＡＧＧＡＡＧ−３’を用いて、９５℃で１５分間、その後、９５℃で１分間、６０℃で１分間および７２℃で１分間を４０サイクル、変性し、その後、ＨｏｔＳｔａｒ ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Qiagen）を用いて７２℃での１０分の伸長を１回実施することにより、ＰＣＲ増幅した。２％アガロースゲル電気泳動により、ＰＣＲ産物を分析した。適切なサイズのＰＣＲ産物が同定された場合（ＲＳＶ Ａ：１２００ｎｔまたはＲＳＶ Ｂ：９００ｎｔ）、メーカーのプロトコールに従って、QIAquick抽出キット（Qiagen）を用いて、当該産物を精製した。精製ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析し、３７３０ＸＬ ＤＮＡアナライザー（Applied Biosystems, Foster City, CA）でシーケンシングした。
ヌクレオチド配列を手動で整列させ、Clustal Wを用いてアラインメントを確証した。Ｇ遺伝子ヌクレオチド配列および実験室標準を比較することにより、ＲＳＶ ＡおよびＲＳＶ Ｂ分離株を区別した。ヌクレオチド位置５０１０〜５４２６に対応するＧ遺伝子の整列４１７ｎｔセグメント（GenBank寄託番号Ｍ７４５６８）を用いて、ＲＳＶ Ａ分離株に関する系統学的解析を実施した。ヌクレオチド位置５０３６〜５３２３に対応するＧ遺伝子の整列２８８ｎｔセグメント（GenBank寄託番号ＡＦ０１３２５４）を用いて、ＲＳＶ Ｂ分離株の系統学的解析を実施した。ＳＥＱＢＯＯＴ（PHYLIP３．６５）を用いて、１０００整列置換ヌクレオチド配列組を含有するBootstrapデータセットを産生した。デフォルト設定およびbootstrapデータセットで、ＤＮＡＭＬ（PHYLIP３．６５）を用いて、最大公算系統樹を得た。ＣＯＮＳＥＮＳＥ（PHYLIP３．６５）を用いて、拡大多数決合意樹を生じ、当該樹はＭＥＧＡ４であった。Bootstrap値、分離株クラスター化および従来の遺伝子型割当を用いて、ＲＳＶ遺伝子型を確定した（図２６）。
結果
ＲＳＶゲノムの生命情報解析およびＡＬＮ−ＲＳＶ０１の選択． ヌクレオキャプシド内に含有される３つのタンパク質（核タンパク質（Ｎ）、リンタンパク質（Ｐ）およびポリメラーゼ（Ｌ））は、ＲＳＶの複製周期内の種々のステップのために必要とされ（Collins, P., K. Mcintosh, and R. Chanock. 1996. Respiratory Syncytial Virus, p.1313-1351, Fields’ Virology）、ＲＳＶゲノムの最高度保存領域の中に数えられる（Sullender, W.M. 2000. Respiratory syncytial virus genetic and antigenic diversity. Clin Microbiol Rev 13:1-15, table of contents；Sullender, W.M., L. Sun, and L.J. Anderson. 1993. Analysis of respiratory syncytial virus genetic variability with amplified cDNAs. J Clin Microbiol 31: 1224-31）。適切なｓｉＲＮＡを選択するために、GenBank配列ＡＦ０３５００６（ＲＳＶ／Ａ２）、ＡＦ０１３２５５（ＲＳＶ／Ｂ１）、ＡＹ９１１２６２（ＲＳＶ Ａロング）およびＤ００７３６（ＲＳＶ／１８５３７）を、Clustal Wアルゴリズムを用いて整列させて、解析されたすべてのＲＳＶ配列のうちの保存１９ｍｅｒを同定した。ヒトゲノム全体の各１９ｍｅｒの一義性を確定するために、Basic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）解析を、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）データベースに対して実施した。ヒトゲノム中のいかなる遺伝子に対しても１６ヌクレオチドあるいはそれ以下の相同性を有するｓｉＲＮＡのみを、さらなる分析のために選択した。
ＲＳＶ Ｎ、ＰおよびＬ遺伝子を標的とする７０のｓｉＲＮＡを、プラーク抑制検定で解析した結果、１９例が、２０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度で、ＰＢＳ対照と比較して、プラーク形成の８０％抑制を示した（データは示されていない）。これらの１９のｓｉＲＮＡのうち、Ｎ遺伝子を標的にする「ＡＬＮ−ＲＳＶ０１」と命名されたｓｉＲＮＡ（図２０）は、最大の抗ウイルス活性を一貫して示した。実際、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、ＲＳＶプラーク抑制検定において、０．７ｎＭのＩＣ５０を示した（図２１）。
ＲＳＶ一次分離株のＡＬＮ−ＲＳＶ０１による抑制． いくつかの異なる遺伝子型がほとんどの季節中、同時循環し、優勢遺伝子型は年毎に変わり得るので、ＲＳＶの臨床的疾患および分子疫学との間の関係は十分に理解されていない。したがって、任意の有望な抗ウイルス剤が、の最も広範な考え得る一連の特定された遺伝子型を標的にすることは重要である。ＲＮＡｉの機序に基づいて、ｓｉＲＮＡおよびその標的間の配列同一性は、機能的なサイレンシングを意味する、と予測される。この理由のために、確証済みのＲＳＶ疾患を有する小児の鼻洗浄物から採取される一連の一次分離株（遺伝子型解析、図２６Ａおよび２６Ｂ）を、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１認識素子全体でシーケンシングした。シーケンシングされたＲＳＶ一次分離株のうち、９４％（８５／９５）が、ＲＳＶ標的部位全体で完全保存を示した。１００％保存されなかった６つの分離株は、各々、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１標的部位内に単一の塩基変更を有した。４つが、ＲＳＶ０１のアンチセンス鎖の５’末端に関して位置４にＣ−Ｕ変異を有し、１つが位置７にＡ−Ｇ変異を有し、そして１つが位置１にＧ−Ａ変異を有した。これら９５の分離株のサブセットを、in vitroウイルス抑制
検定で試験したが、このうち、ある１つの分離株は位置４にミスマッチを有し、もう１つは位置７にミスマッチを有した（表１６）。これらのうち、１２／１２（１００％）は、ＰＢＳ対照と比較して８０ｎＭのＡＬＮ−ＲＳＶ０１で約７０％の抑制を示し、すべてがＡＬＮ−ＲＳＶ０１抑制に関して同様の用量応答曲線を有した（図２７）。
ＡＬＮ−ＲＳＶ０１のin vivo試験． ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＲＳＶ感染に関する十分に確立されたモデルであり、したがって、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の抗ウイルス効能の評価に関するin vivo系として選択された。最初に、予防モデルにおいて、１０６ｐｆｕのＲＳＶ／Ａ２を用いた感染の４時間前に、ｓｉＲＮＡをマウスに鼻内（ｉ．ｎ．）投与した。マウスの肺においてＲＳＶ／Ａ２複製の用量依存性抑制が認められ、１００ｊｕｇ用量のＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、ＰＢＳ対照または非特異ｓｉＲＮＡと比較して、２．５〜３．０ ｌｏｇ１０ ｐｆｕ／肺１ｇに力価を低減した（図２２Ａ）。５０および２５μｇ用量は、それぞれ約２．０および１．２５ ｌｏｇ１０ ｐｆｕ／ｇの低減を生じた（図２２Ａ）。
治療例におけるウイルス抑制の効率を評価するために、感染後１、２および／または３日目に、１日１回または多数回用量投与で、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１を鼻内送達した。単回用量として送達した際、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１による最も有効なサイレンシングは、用量依存的に、予防的（−４時間）用量投与で生じた。ミスマッチ対照ＡＬ−ＤＰ−１７３０と比較して、単回予防的用量としての１２０ｊｕｇのＡＬＮ−ＲＳＶ０１の投与は、最大ウイルス抑制を生じ、肺濃度をこの検定におけるバックグラウンドレベルに低減させた。ウイルス接種後に単回用量として治療レジメンでＡＬＮ−ＲＳＶ０１を投与した場合、抗ウイルス効能は用量依存的方法で保持されたが、しかしウイルス感染後用量投与の時間の関数として低減することが見出された（図２２Ｂ）。実際、感染後３日目まで、１２０μｇという高い単回用量も有意のウイルス抑制を生じなかった。しかしながら、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の多数回４０μｇ用量を１、２および３日目に毎日送達した場合、サイレンシングの高率は保持され、ウイルス力価は再びバックグラウンドレベルに低減された（図２２Ｂ）。
将来的臨床試験に用いられ得る代替的用量投与例をさらに調べるために、付加的多用量レジメンを評価した。この目的のために、ＲＳＶ感染マウスを１２時間に亘って、１日２回または１日３回用量投与レジメンで、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１で処置した。興味深いことに、ＲＳＶ特異的ｓｉＲＮＡ（４０ｊｕｇ ３×／日）のこの多数回１日用量投与レジメンは、単回１２０μｇ用量と同様に有効であることが判明した（図２２Ｃ）。集約すると、これらのデータは、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の多数回用量治療レジメンが関連患者集団におけるヒト臨床試験に容易に適用可能な様式で最大抗ウイルス効能を提供し得る、ということを示す。
ＡＬＮ−ＲＳＶ０１およびサイトカイン誘導． 多数の核酸、例えば二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）およびｓｉＲＮＡは、種々のＲＮＡ結合受容体を介して先天性免疫応答を刺激することが示されている（Robbins, M., A. Judge, L. Liang, K. McClintock, E. Yaworski, and I. MacLachlan. 2007. 2’-0-methyl-modified RNAs act as TLR7 antagonists. Mol Ther 15: 1663-9）。この刺激は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）検定においてin vitroでモニタリングされ得る（Sioud, M. 2005）。二本鎖および一本鎖ｓｉＲＮＡによる炎症性サイトカインおよびインターフェロン応答の誘導は配列依存的であり、エンドソーム局在化を要する（J Mol Biol 348: 1079-90）。ｓｉＲＮＡの免疫刺激特性はウイルス感染の治療に関するＲＮＡ媒介性機序と相乗的に作用し得るが、このような特徴は、ｓｉＲＮＡ処置戦略に関連した結果の解釈を混乱させもする。したがって、前に記載されたように（Hornung, V., M. Guenthner-Biller, C. Bourquin, A. Ablasser, M.Schlee, S. Uematsu, A. Noronha, M. Manoharan, S. Akira, A. de Fougerolles, S. Endres, and G. Hartmann. 2005. Sequence-specific potent induction of IFN-alpha by short interfering RNA in plasmacytoid dendritic cells through TLR7. Nat Med 11: 263-70）、新たに精製された末梢血単核球（ＰＢＭＣ）とともにインキュベートすることにより、in vitroでＩＦＮαおよびＴＮＦαを刺激するその能力に関して、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１を評価した。抗ウイルス作用に対するＩＣ５０を１００倍より多く上回る高濃度のＡＬＮ−ＲＳＶ０１をこの検定に用いた（１３３ｎＭ）。２４時間後、培地単独対照と比較して、それほど高くないレベルのＩＦＮαおよびＴＮＦαのみがともにＥＬＩＳＡにより検出され、平均で約１４７ｐｇ／ｍｌのＩＦＮα（図２３Ａ）および１５００ｐｇ／ｍｌのＴＮＦα（図２３Ｂ）が誘導された。
ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の抗ウイルス活性がサイトカインのこのそれほど高くない誘導により影響を及ぼされないということを立証するために、ＩＦＮαまたはＴＮＦαをより有意に誘導することが前に示されている２つのＲＳＶに非特異のｓｉＲＮＡを、われわれのＢＡＬＢ／ｃマウスモデルで検定した。ＴＮＦα誘導因子であるＡＬ−ＤＰ−１７３０（図２４Ａ）も、ＩＦＮα誘導因子であるＡＬ−ＤＰ−２１５３（図２４Ｂ）も、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１を送達した場合に観察された強力な抑制（図２４Ｃ）と比較して、マウスに鼻内投与（１００ｊｕｇ）した場合、ＲＳＶ／Ａ２を抑制しなかった。１０倍高い用量のＡＬ−ＤＰ−１７３０でさえ、感染の４時間前に、予防的に送達した場合、ＲＳＶレベルに影響を及ぼさなかった（データは示されていない）、ということは重要である。これらのデータは、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１抗ウイルス作用がＲＮＡｉ機序により媒介され、先天的免疫の誘導によっては媒介されない、という結論を支持する。
ＡＬＮ−ＲＳＶ０１切断産物のin vitroおよびin vivoＲＡＣＥ分析． 特定のｍＲＮＡ転写体のＲＩＳＣ媒介性切断は、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖の５’末端から正確に１０ヌクレオチドで生じる。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１に関する作用のＲＮＡｉ媒介性機序を明確に確証するために、ｃＤＮＡ末端の５’迅速増幅（ＲＡＣＥ）検定を用いた。この検定は、in vitroおよびin vivoでのＡＬＮ−ＲＳＶ０１処置後の特定のＲＮＡｉ切断産物ｍＲＮＡ中間体の潜在的捕獲および配列解析を可能にする。ベロ細胞中へのｓｉＲＮＡトランスフェクション（２００ｎＭ）とその後のＲＳＶ／Ａ２による感染の後、ＰＢＳまたは非特異的ｓｉＲＮＡ（ＡＬ−ＤＰ−２１５３）対照と比較して、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１で処置した試料に老いてのみ、特異的切断断片が検出され得た（データは示されていない）。これらの実験では、シーケンシング化クローンの９２％は、部位特異的切断（ＲＳＶ／Ａ２ Ｎ ｍＲＮＡ位置２６／２７間）に起因した（データは示されていない）。in vivoで分析した場合、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１処置ＲＳＶ感染マウスの肺組織から単離したクローンの６０〜８２％が、いち２６／２７間のＮ遺伝子転写体の部位特異的切断を示した（図２５）。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１で処置した動物だけが、ＰＢＳまたはミスマッチ対照で処置したものと対照的に異なり、その配列が予測切断部位と確証された有意数のクローンを生じた（図２５）。
考察
ＲＳＶは、特定される１１の遺伝子すべてで異なる２つの亜群、血清型ＡおよびＢに分類され得る。遺伝子型は、年毎に変わり、ある血清型はいくつかの年には優勢であるが、多数のＲＳＶ株の同時循環が一般的に観察される。ＲＳＶ−Ａは幼児においてより大きなウイルス負荷を生じ、ＲＳＶ−ＡはＲＳＶ−Ｂよりわずかに重篤な疾患を生じ得るが、しかしＲＳＶ−ＡおよびＲＳＶ−Ｂはともに、同様の、且つ臨床的に区別不能な疾患範囲を生じる。ＲＮＡｉ治療薬の場合、その対応するｍＲＮＡ標的部位が種々の循環ＲＳＶウイルス分離株全体で保存されるｓｉＲＮＡ分子を選択することにより、広範囲の活性が達成される。これは、ＧまたはＦのような表面ウイルスタンパク質より突然変異を生じにくい相対的保存ウイルスヌクレオキャプシドを標的とすることにより、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１に対して達成される。実際、ＲＳＶ内では、Ｎ遺伝子は最も保存されるものの１つであり、核酸レベルで約８６％の同一性、アミノ酸レベルで９６％の同一性を有する。標的部位内の配列差は、臨床検体においては低頻度で観察され、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的ＲＳＶｍＲＮＡとの間にＧ：Ｕ揺らぎを大いに作り出した。試験した臨床的分離株はすべて、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１によりin vitroで有効に抑制された（図２７）。２つのＧ：Ｕ
揺らぎ分離株のＩＣ５０は５ｎＭ（範囲の最大値）であったが、しかし、他の分離株、すなわちＲＵＧ０４２０およびＭＯＴ０４７２は、ともに、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１標的部位で１００％配列保存を示し、５ｎＭ ＩＣ５０値も示した、ということに留意すべきである。したがって、非保存単分離株における標的部位多様化は、わずかに高いＩＣ５０を説明しない。これらの分離株の増殖および複製特性は、それらのわずかに高いＩＣ５０値を説明する、と考えられる。これらの一次分離株は遺伝子型ＡおよびＢに及び、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１がすべての一般的に循環する系統に対して活性であると思われる、ということを示す。大規模の一連のin vivo試験では、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、予防及び治療例の両方において強力な抗ウイルス剤であることが見出されたが、これは、ＰＢＳまたは非特異的ｓｉＲＮＡ対照と比較して、３ｌｏｇまでのウイルス低減を示す。Bitkoら及びZhangらも、ここに記載したものと同様の低減を有する、それぞれリンタンパク質（Ｐ）ｍＲＮＡまたは非構造的１（ＮＳ−１）ｍＲＮＡをターゲッティングするＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＲＳＶのｓｉ抑制を以前に実証している。これらの他のｓｉＲＮＡはin vivoでのウイルス複製の有効な阻害剤であるが、何れもＲＮＡｉ治療薬開発のために理想的に適しているものではない。BitkoのＰ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、ＲＳＶ ＡおよびＢ血清型全体で保存されないウイルスの一領域に向けられる。さらに、Zhang等のＮＳ−１を標的とするｓｉＲＮＡは、ＩＦＮ誘導を抑制するＲＳＶタンパク質の産生を抑制することにより、免疫調整因子として（少なくとも一部は）機能すると考えられる。
臨床設定におけるＡＬＮ−ＲＳＶ０１の適用は、用量レベル及び頻度に関して用量投与戦略の最適化を要する。この実施例に記載した試験では、低用量のｓｉＲＮＡの多用量投与は、単回投与で送達される等価の総用量と比較して、等価であるかまたはわずかにより有効であった。したがって、ある状況では、多用量投与は、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１を送達するための好ましい戦略であり得る。
実施例１７．呼吸器合胞体ウイルスに対して向けられるＲＮＡｉ治療薬の無作為化二重盲検プラセボ対照試験 この実施例は、野生型ＲＳＶに感染した成人におけるＡＬＮ−ＲＳＶ０１の有意の抗ウイルス活性を記載する。８８名の健常被験者が、無作為化二重盲検プラセボ対照試験に参加した。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の鼻スプレーまたは生理食塩水プラセボを、ＲＳＶ接種前に２日間、接種後に３日間、毎日投与した。複数の異なるウイルス検定を用いて、鼻洗浄物中でＲＳＶを逐次的に測定した。下記の結果は、鼻内ＡＬＮ−ＲＳＶ０１が十分に耐容され、生理食塩水プラセボと同様の安全性プロフィールを示す、ということを示す。培養限定ＲＳＶ感染の割合は、プラセボ及びＡＬＮ−ＲＳＶ０１を受けた被験者において、それぞれ７１．４％及び４４．２％であった（Ｐ＝０．００９）が、これは感染被験者数の３８％低減および非感染被験者数の９５％増大を表す。経時感染の獲得は、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１を受けた被験者において有意に低かった（Ｐ＝０．００７及びＰ＝０．０３２、それぞれウイルス培養およびＰＣＲ）。多重ロジスティック回帰モデルは、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１抗ウイルス作用が他の因子、例えば先在ＲＳＶ抗体および鼻内前炎症性サイトカイン濃度と無関係である、ということを示した。
材料および方法
被験者
当該試験は、１８〜４５歳の健常男性を包含した。排除判定基準は、喘息、喫煙、発熱、または過去２週間以内の症候性呼吸器感染、過去７日以内の鼻炎のための投薬、重症ＲＳＶの危険を有する人との接触、最近１か月以内のステロイド使用、ならびに慢性副鼻腔炎であった。−２日目のＰＣＲ試験は、ＲＳＶ Ａ−Ｂ、インフルエンザＡ−Ｂ、パラインフルエンザ１、２、３またはヒト・メタニューモウイルス感染を示さなかった。
試験薬剤
ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、合成二本鎖オリゴヌクレオチドである。スタッガード二重鎖中の２つの２１ヌクレオチド鎖は、１９の対合ヌクレオチドおよび３’末端での２つのチミジンヌクレオチドのオーバーハングを有する２つの部分的相補性一本鎖ＲＮＡのハイブリダイゼーションにより形成される。アンチセンス鎖は、ＲＳＶヌクレオキャプシドＮタンパク質をコードするｍＲＮＡの１９ヌクレオチド配列（残基３〜２１）と相補性を有する。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、用量投与前に通常生理食塩水中に希釈された滅菌リン酸緩衝溶液として処方される。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１（７５または１５０ｍｇ）またはプラセボ（滅菌通常生理食塩水）を、鼻スプレー（Becton-Dickinson Ａｃｃｕｓｐｒａｙ（登録商標））、０．５ｍＬ／鼻孔により投与した。
ウイルス（ＲＳＶ）接種
細気管支炎のために入院した幼児からのＲＳＶ−Ａ（メンフィス３７株）を、ＦＤＡ認可ベロ細胞を用いてＧＭＰ製造した。プラーク精製により分離株を単離し、次に、５回以上継代培養した後、被験者に接種した。ＩＦＡ、電子顕微鏡およびＮ遺伝子シーケンシングにより、ＲＳＶ同一性を確証した。外膜作因および他のヒト病原体を含有しないことが確定された。メンフィス３７を２５％スクロース中に希釈した直後に、鼻内滴下（０．５ｍＬ／鼻孔）により被験者に接種した。
試験計画および終点
試験は、単一隔離ユニット（Retrscreen Virology Ltd, UK）で実施される１：１無作為化プラセボ対照二重盲検平行群第ＩＩ相試験であった。地域規制、施設内審査委員会および倫理委員会の認可を得た。被験者はすべて、インフォームドコンセントを提出した。
６連続群全体を通して、被験者を登録した（図３３）。群１（Ｎ＝８）では、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１を７５ｍｇ／日で用量投与した。群２〜６（Ｎ＝８０）では、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１を１５０ｍｇ／日で用量投与した。群２〜６は、それぞれ８、１８、１６、２４および１４名の被験者で構成された。被験者を１４日間、隔離ユニットに入れて、ＲＳＶ接種（０日目）の３２時間前（−１日目）および８時間前（０日目）にＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボを用量投与した。ＲＳＶ接種後１、２および３日目に、１日用量投与を継続した。各群における最初と最後の被験者の接種の正確な時間にＨＥｐ−２細胞中でのプラーク検定により、ＲＳＶ接種物を確定した。ウイルス検定およびサイトカイン測定に関する鼻洗浄物（５ｍＬ通常生理食塩水／鼻孔）を、隔離ユニットへの入院当日（−２日目）および２〜１１日目に毎日得た。上気道徴候および症候の査定のために、医者の指導による毎日の身体検査（ＤＰＥ、２〜１１日目）実施、ならびに１日２回の被験者報告ＲＳＶ症候スコアカード記入（−１〜１１日目）を行った（図２８）。各２４時間期間に関する粘液重量を、−１日目から１１日目まで記録した。２８日目までの追跡訪問により、有害事象を記録した。
主要効能終点は、ＲＳＶ感染した被験者の割合であった。接種後２日目〜８日目に第１回を実施した２連続陽性ＲＳＶ検定として、感染を予め特定した。追加の抗ウイルス効能測定値は、ウイルス曲線下面積（ＡＵＣ）およびピークウイルス負荷を包含した。検査した臨床効能終点は、総症候スコア、総ＤＰＥスコアおよび粘液重量を包含した。
ＲＳＶおよび抗体検定
鼻洗浄物を冷却ＲＳＶ安定化培地中に収集し、氷上に移して、収集の３０分以内にＨＥｐ−２細胞単層上に載せた。ＨＥｐ−２細胞プラーク検定における定量培養を、以前記載されたものと同様に（１８）、鼻洗浄物の三重反復実験１０倍希釈を用いて、１２ウェルプレート中で実施した。ＲＳＶ定量標準（ＲＳＶ−ＡロングＡＴＣＣ ＶＲ−２６）を、各プラーク検定で並行して試験した。定量化の下限未満（ＬＬＯＱ）（１．７ＬｏｇＰＦＵ／ｍｌ未満）を含有する鼻洗浄物を、培養陰性とみなした。
ＡＬＮ−ＲＳＶ０１のものとは異なるＮ遺伝子配列を増幅する定量的実時間ＲＴ−ＰＣＴ（ｑＲＴ−ＰＣＴ）検定を、以前に記載されたのと同様（１９）に実施した。プラーク検定で用いられるような既知のＲＳＶ−Ａロング量を含有する並行アリコートから抽出されたＲＮＡの内部標準を組み入れている９６ウェルプレート中で、二重反復実験検体を試験した。結果は、対数プラーク形成単位等価物／ｍｌ（ＬｏｇＰＦＵ／ｍｌ）での二重反復実験の平均である。
シェルバイアル内のカバーガラス上の集密ＨＥｐ−２細胞単層を用いて、回転増強培養を実施して、２００ｕｌの新鮮な鼻洗浄物を接種し、７００×ｇで６０分間遠心分離した。単層を、２日後にアセトン固定した。ＲＳＶ特異的マウスモノクローナル抗体（Bartels, Trinity Biotech, Wicklow, Ireland）を用いて、直接蛍光抗体技法により、カバーガラスをＲＳＶに関して評価した。
以前に記載されたように、しかし、メンフィス３７株を用いて実施されたのと同様に、ＨＥｐ−２細胞ＲＳＶ５０％微小中和検定により血清ＲＳＶ中和抗体を測定した。感染を最大にするために、７．６７ＭＵ以下の力価を有する被験者のみを含めたが、これは、健常成人における正規分布の下位３分の１を表す（データは示されていない）。
サイトカイン検定
鼻洗浄物アリコートを、Pierce Searchlight化学発光多重サンドイッチＥＬＩＳＡサイトカイン検定（Woburn, Massachusetts, USA）を用いて、無希釈、１：１０および１：５０希釈で分析し、Ｇ−ＣＳＦ（ＬＬＯＱ１．８２ｐｇ／ｍＬ）、ＩＦＮ−α（ＬＬＯＱ７．５ｐｇ／ｍＬ）、ＩＬ−１ＲＡ（ＬＬＯＱ４．４ｐｇ／ｍＬ）およびＴＮＦ−α（ＬＬＯＱ６．７ｐｇ／ｍＬ）を定量した。
統計学的分析
統計学的方法は、医薬品規制調和国際会議ガイドラインを用いた。ＬＬＯＱより低い連続値を、ゼロに設定した。２標本ｔ検定を用いて、連続効能変数を評価した。正規分布しないデータを、ウィルコクソン順位和検定により分析した。異なる群の結果は、群間の未知の因子およびＲＳＶ接種物の差により影響を及ぼされ得るため、感染被験者の割合を比較する主要効能終点を、群に関して制御するコクラン・マンテル・ヘンツェル（ＣＭＨ）両側検定により評価した。分析はすべて、ＳＡＳ（登録商標）ｖ８．２またはそれ以上のバージョン（ウィンドウズ（登録商標）を用いて実施した。
結果
患者
８８名の被験者が試験に参加した（図３３）。８８名全員を安全性に関して評価し、ＲＳＶ接種を受けた８５名を、効能に関して評価した。ＲＳＶ接種を受けた被験者はすべて、全試験薬剤用量投与および評価を受けた。処置群は、基線で良好に釣り合いがとられていた（図２９）。
抗ウイルス作用
プラセボと比較して有意に低い割合のＡＬＮ−ＲＳＶ０１処置被験者が感染した（図３０）。定量的培養により、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、感染被験者数の３８．１％の相対低減、ならびに非感染被験者数の９５．１％増大を伴った（Ｐ＝０．００９）。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１のこの抗ウイルス作用は、ｑＲＴ−ＰＣＲにより、ならびに回転培養法により実証された同様の大きさの作用と、他のウイルス検定全体を通して一貫していた。１５０ｍｇの試験薬剤を接種している被験者のみを評価した場合（群２〜６）、統計学的に有意の処置作用も観察された（データは示されていない）。
抗ウイルス作用の時機も検査した。プラセボ群におけるインキュベーション期間の中央値は、３．５日であった。定量培養およびｑＲＴ−ＰＣＲの両方により、長時間に亘る感染の獲得は、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１群で低減された（それぞれ、Ｐ＝０．００６９およびＰ＝０．０３２１）（図３４）。この低減は、接種後３〜４日以内の早期に観察された。感染獲得のリバウンドは観察されなかった。データが８日目後に検閲削除される場合、統計学的有意は依然として残った（ＰＣＲおよび培養の両方に関してＰ＜０．０５）（データは示されていない）。
この試験は、ウイルス負荷に及ぼす統計学的に有意の作用の検出力はなかった。しかしながら、試験結果は、プラセボと比較して（図３５）、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１レシピエントにおいて、より低いウイルス負荷傾向、例えばより低いウイルスＡＵＣおよびピークウイルス負荷（図３５Ａ〜Ｂ）を一貫して示した。平均１日ウイルス負荷（図３５Ｃ〜Ｄ）も、ウイルス接種後４〜６日目（定量培養）から、または４〜７日目（ｑＲＴ−ＰＣＲ）から低くなり、平均ウイルス負荷の最大差は約１ＬｏｇＰＦＵ／ｍｌであった。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１およびプラセボ間の接種期間またはウイルス脱粒の持続時間の差は認められず、ウイルスリバウンドは観察されなかった（図３５、Ｃ〜Ｄ）。
ＲＳＶ感染に及ぼすＡＬＮ−ＲＳＶ０１の作用が他の変数と無関係であるか否かを確定するために、多重ロジスティック回帰分析を実施して、以下の変数を評価した：処置割当（ＡＬＮ−ＲＳＶ０１対プラセボ）、ＲＳＶ接種、前処置ＲＳＶ微小中和力価および鼻内前炎症性サイトカイン濃度（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、Ｇ−ＣＳＦおよびＩＬ−ＩＲＡ）。サイトカインＡＵＣまたはピークサイトカイン濃度における統計学的有意差は、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１およびプラセボ群間に生じなかった。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１群におけるＧ−ＣＳＦ濃度は、プラセボ群と比較して、観察期間全体を通して少し上昇したように見えたが、一方、他のサイトカイン濃度はすべて、一貫しない傾向を示した（図３６）。それぞれ各々のサイトカインに関して、前処置サイトカイン濃度（−２日目）、ＲＳＶ接種後２〜４日目のサイトカインＡＵＣ、ならびに２〜８日目のサイトカインＡＵＣを用いて、異なるロジスティック回帰モデルを構築することにより、サイトカインを検査した。代表的モデルを、図３１の表に示す。Ｇ−ＣＳＦに関するものを含めて全モデルにおいて、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、独立して感染低減と関連していた（定量培養またはｑＲＴ−ＰＣＲによる、Ｐ＜０．０５）。
臨床的効果
健常ボランティアの実験的ＲＳＶ感染は、軽症〜中等度の上気道疾病のみを生じる。この狭い疾患重症度範囲内で、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボで処置された被験者における疾患測定値の評価は、統計学的有意差を示さなかった（図３５Ｅ〜Ｇ）。全被験者における、またはＲＳＶ感染した被験者における経時の平均症候スコアの分析は、プラセボに比してＡＬＮ−ＲＳＶ０１における症候スコアの最も顕著な低下は、４〜７日目に生じる、ということを示した（図３５Ｈ〜Ｉ）。これは、平均１日ウイルス負荷の最大低減が認められたのと同時期に対応した（図３５Ｃ〜Ｄ）。
安全性
鼻内ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、十分に耐容された。有害事象は、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１およびプラセボ間で良好に釣り合いを保ち（図３２）、中等度の有害事象（そのすべてが隔離所からの退院後に生じた）はほとんどなく、重症または重篤な有害事象はなかった。
要約すると、この無作為化二重盲検プラセボ対照試験では、統計学的に有意の抗ウイルス作用が、ＲＮＡｉ治療薬であるＡＬＮ−ＲＳＶ０１で実証された。２つの異なる培養ベースの検定により診断した場合の感染被験者の割合は、プラセボと比較して、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１のレシピエントでは有意に低かった（Ｐ＜０．０５）（図３０）。さらに、培養またはＰＣＲにより診断した経時の感染の獲得も、有意に低減された（それぞれＰ＜０．０１およびＰ＜０．０５）（図３４）。最後に、多重ロジスティック回帰は、このＡＬＮ−ＲＳＶ０１関連抗ウイルス作用が、他の変数の考え得る作用とは統計学的に無関係であることを示した（図３１）。したがって、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は実証可能な抗ウイルス作用を生じる。
実質的証拠は、ＲＮＡｉがＡＬＮ−ＲＳＶ０１抗ウイルス作用の機構上の基礎である、ということを示す。第一に、ミスマッチｓｉＲＮＡ（４ヌクレオチドという少数のヌクレオチドがＡＬＮ−ＲＳＶ０１と異なる）が抗ＲＳＶ作用を生じないネズミモデルにおいて、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１はＲＳＶを低減する。第二に、ＲＳＶ Ｎタンパク質転写体のＲＮＡｉ媒介性サイレンシングに起因する切断産物は、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１で処置されたＲＳＶ感染マウスの肺で観察されている。第三に、ＲＳＶ Ｎ遺伝子を標的とするイムノサイレントｓｉＲＮＡはマウスにおいてＲＳＶに対して活性であるが、一方、強力なin vitro免疫刺激活性を有するミスマッチｓｉＲＮＡはマウスにおける抗ＲＳＶ活性を示さない
（R. Meyers、未発表データ）。最後に、この試験内の実質的証拠それ自体は、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１が鼻内サイトカイン誘導と無関係に観察された抗ウイルス作用に関与している、ということを示す。多重ロジスティック回帰モデルは、統計学的に有意のＡＬＮ−ＲＳＶ０１抗ウイルス作用が、鼻内サイトカインレベルを含む検査した他の変数と無関係であった、ということを示す。実際、サイトカイン作用が明らかである場合、おそらく、ヒト呼吸器分泌内のサイトカインを刺激するＲＳＶ感染それ自体のために、感染低減よりむしろ増大との関連が認めされた（図３１）。したがって、ＲＮＡｉにより媒介されると強く思われる抗ウイルス作用が示された。
ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の投与時期は、感染が起きた場合、ウイルス負荷またはＲＳＶ疾患測定値の最大低減を達成するために、さらに最適化され得る。ここでは、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、ＲＳＶ接種前に２回、そしてその後３回、用量投与された。ピークウイルス負荷および感染のピーク臨床症候の発生の２〜４日前にＡＬＮ−ＲＳＶ０１を中止した。プラセボアームにおけるＲＳＶのインキュベーション期間は、３．５日という中間値であった；その後、一貫して低い１日ウイルス負荷がＡＬＮ−ＲＳＶ０１を受けた被験者において見出され、抗ウイルス作用は、プラセボと比較して、ウイルス負荷の最大１Ｌｏｇ低減で、接種後６〜７日目を通して継続すると思われた。ウイルス負荷のこの一過性低減と同時に、プラセボに比して最も顕著な症候スコアの低下が、ＡＬＮ−ＲＳＶ０１群に関して、４〜７日目に生じた。小児においては、より低いＲＳＶ負荷は、集中的看護に対する要件の低減、呼吸器不全低減およびより短い入院と関連する。したがって、ＲＳＶ負荷の強い低減は、達成される場合、おそらくは、疾患重症度低減および臨床的利益に結びつく可能性が高い。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の最適用量投与は、活性ウイルス複製の時間を通して投与されるために、ウイルス動力学および臨床結果に及ぼすその作用を最大限にし得る。
天然ＲＳＶ感染においては時間の遅延が存在する。ＲＳＶは、感染し、上気道における症候を引き起こした後、肺に移動する。感染の前および感染中早期に投与される場合の、ＲＳＶ感染の予防に及ぼすここに示される鼻内ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の有意の作用の点から見て、エーロゾル化ＡＬＮ−ＲＳＶ０１が利用されて、下気道への早期ＲＳＶ感染の広がりを変え得る。相対的に低い接種物天然ＲＳＶ曝露による感染後種々の時間間隔での上および下気道の両方への同時的エーロゾル化薬剤の送達は、抗ＲＳＶ療法の最適化を手助けし得る。
実施例１８：５’ＲＡＣＥ検定により分析した、ヒトにおけるＡＬＮ−ＲＳＶ０１特異性
本実施例は、ヒトにおけるＡＬＮ−ＲＳＶ０１の抗ウイルス作用がＲＮＡｉにより媒介される、ということを確証する。５’ＲＡＣＥ検定は、より詳細に上記されている（例えば、図２５およびその説明）。
ＲＮＡ単離：メーカーの使用説明書に従って、ＲＮＡ ＳＴＡＴ−５０ＬＳ試薬（Ｔｅｌ−Ｔｅｓｔ）を用いて、鼻試料から総ＲＮＡを精製した。改変したＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（Invitrogenカタログ番号１５０２−０１）を用いて、５’ＲＡＣＥ検定を実行した。切断産物を検出するために、ＲＮＡアダプターおよびＲＳＶ Ａ２Ｎ遺伝子ｍＲＮＡと相補的なプライマーを用いて、３回の連続ＰＣＲを実施した（初回ＰＣＲのためにＧＲ５’およびＲｅｖ；入れ子式ＰＣＲおよび濃化ＰＣＲのためにＧＲＮ５’およびＲｅｖＮ）。
増幅産物をアガロースゲル電気泳動（２．３％アガロース）により分割し、臭化エチジウム染色により可視化した。ＰＣＲ産物のクローニングおよび個々のクローンのシーケンシングにより、特定切断産物の同一性を確証した。
結果を、図３７に示す。図３７Ａは、処置患者が、特異的ＡＬＮ−ＲＳＶ０１ ｉＲＮＡ媒介性切断により予期される断片の頻度の有意の増大を有する、ということを示す。さらに、特異的切断の増大は、観察されたウイルス力価の低減と強力に相関しており、抗ウイルス作用がＲＮＡｉにより媒介される、というさらなる指標を提供する（図３７Ｂ）。図３７Ｂは、観察された特異的切断％が投与後経時低減することも示す。したがって、薬剤用量投与に近位の時点での患者分析は、薬剤効能のこの特定マーカーを測定する場合、有益であり得る。
実施例１９．エーロゾル化ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の安全性および抗ウイルス活性の多施設無作為化二重盲検プラセボ対照試験ならびにＲＳＶに感染した肺移植片レシピエントにおけるケアの標準
この予測的実施例は、肺移植を受けた患者の治療に関する本発明の実施例を記載する。下記の方法の多数の態様は、肺移植を受けていないが、しかしＲＳＶに感染しているかまたはＲＳＶ感染の危険がある患者を治療するのにも等しく適用可能である、と当業者は認識するであろう。
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に感染した肺移植を受けた患者に対する多用量投与計画（１日１回、３日間）で投与されるエーロゾル化ＡＬＮ−ＲＳＶ０１対プラセボの安全性、耐容可能性および抗ウイルス活性を査定するために、試験を実行する。他の目的としては、肺移植患者におけるＲＳＶ感染の臨床的終点に及ぼすＡＬＮ−ＲＳＶ０１対プラセボの作用を評価すること、鼻スワブおよび痰試料の定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によるＲＳＶ感染特質、例えばピークウイルス負荷、ピークウイルス負荷までの時間、ウイルス脱粒の持続時間およびウイルスの濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）を確定すること、ならびにエーロゾル化ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の血漿薬物動態を特性分析することが挙げられる。
試験計画：無作為化プラセボ対照二重盲検試験を実行して、ＲＳＶに感染した肺移植を受けた患者に投与される鼻内ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の安全性および効能を査定する。合計３用量のＡＬＮ−ＲＳＶ０１を、各被験者に投与する。呼吸器感染の徴候（例えば、ＦＥＶ１の低減および／または発熱）および症候（例えば、新規発症鼻漏、咽喉の痛み、鼻閉、咳、喘鳴、頭痛、筋肉痛、悪寒および／または息切れ）を有する２１名までの肺移植患者が、最初の症候の確認後、出来るだけ早く（例えば、０〜５日以内）スクリーニングのために確定された場所に行くよう指図される。
患者は、ＲＳＶ感染を有することを確認され、ある治療に無作為に割り当てられ、出来るだけ早く、例えばＲＳＶ感染の徴候および症候の開始後、合計７日以下以内に、試験薬剤の投与を受けることを開始する。
ＲＳＶの陽性結果を有する承諾した適格患者は、無作為化（２：１）されて、１日１回、３日間（試験０、１および２日目）、吸入によりＡＬＮ−ＲＳＶ０１またはプラセボ（呼吸器投与のための滅菌通常生理食塩水０．９％（生理食塩水））を摂取する。さらに、全患者が、入院または外来患者ケアを含み得る施設ガイドラインまたは試験研究者実施要綱によるＲＳＶ感染に関する標準治療（ＳＯＣ）を受ける。
治療に無作為に割り当てられる、ＲＳＶ感染を確認された患者は、定量的（ｑ）ＲＴ−ＰＣＲによるＲＳＶ確定のための鼻スワブおよび痰試料を、７日間毎日（０日目から６日目まで）、その後、１４日目まで隔日（８、１０、１２および１４日目）に採取される。
毎日の外来患者安全性査定来診および呼吸器試料採取（鼻スワブおよび痰）は、施設で、または患者の自宅で、試験手法の訓練を受けた訪問看護師の介護下で、実施し得る。安全性の査定は、３０日目来診まで（当日を含めて、±３日）行われ得る。
９０日目（±７日）来診中、以下の事象が査定される：生存、急性肺拒絶、閉塞性細気管支炎（ＢＯＳ）、挿管、他のウイルス、細菌または真菌性呼吸器感染ＦＥＶ１の発生。試験の合計期間は、９３日±７日である。
研究薬剤および対照の投与量、投与経路および治療継続時間：ＡＬＮ−ＲＳＶ０１に無作為割り当てされた患者は、ネブライザー、例えばＰＡＲＩ ｅＦｌｏｗ（商標）３０Ｌネブライザーによりエーロゾル化ＡＬＮ−ＲＳＶ０１（０．６ｍｇ／ｋｇ）を摂取し、１日１回、３日間（０、１および２日目）、吸入により投与される。ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の全用量は、熟練試験職員により試験施設で投与され、初回用量は、現場で研究者により投与される。試験薬剤の用量投与間の間隔は、理想的には約２４時間であるべきであるが、１２時間未満であってはならず、３６時間を越えるべきでない。
気管支拡張療法を受けている患者に対しては、気管支拡張療法の施療後１時間以内に試験薬剤の投与が試みられるべきである。
ＳＯＣ、例えばリバビリン（１日３回（ＴＩＤ）吸入により、１２〜１６時間一晩吸入により、または静脈内（ＩＶ）投与により）を摂取している患者に対しては、試験薬剤は、リバビリンの初回投与前１〜２時間に投与されるべきである。試験薬剤のその後の用量投与は、初回と同時間に、試験薬剤の投与間に約２４時間（１２〜３６時間）の間隔を置いてリバビリンの投与の１〜２時間前に、投与されるべきである。
プラセボについては、無作為に割り当てられた患者は、ＰＡＲＩ ｅＦｌｏｗ（商標）３０Ｌネブライザーによりエーロゾル化滅菌通常生理食塩水を摂取し、１日１回、３連続日間、吸入により投与される。リバビリンおよび気管支拡張薬に関連したプラセボのスケジュールおよび時機は、上記と同一であるべきである。
試験査定および終点：人口学的データおよび医療歴：人口学的データ、肺移植関連情報および完全医療液は、スクリーンニング（−２日目〜０日目）において得られる。
身体検査：完全身体検査（ＰＥ）は、スクリーンニング（−２日目〜０日目）において、１４日目に、ならびに３０日目の追跡調査来診中に実施される。指示身体検査（ＤＰＥ）は、スクリーンニング（−２日目〜０日目）において、ならびに０日目、１日目および２日目の試験薬剤の投与前；３〜６日目に毎日、１４日目に、そして３０日目の追跡調査来診中に実行される。ＤＰＥは、６日を超える入院患者に関して入院期間中に毎日実施される。ＤＰＥは、呼吸器関連および感染関連症候の評価に集中し、ＤＰＥ作業表の使用は、以下の身体系の検討を包含する：頭、目、耳、鼻および咽喉、呼吸器系、心臓血管系および生命徴候。
生命徴候（血圧、脈拍、口腔体温および呼吸数）は、スクリーンニング（−２日目〜０日目）、０、１および２日目前用量投与および１時間後用量投与、３〜６日目、８〜１４日目、そして３０日目の追跡調査来診中に測定される。生命徴候は、６日を超える入院患者に関しては入院期間中、毎日査定される。血圧（収縮期および拡張期）、脈拍および呼吸数が得られる。好ましくは、各患者の血圧は、試験全体を通して同じ腕を用いて計測される。脈拍は、２０秒〜１分間計数されて、拍数／分（ｂｐｍ）で記録される。呼吸は、呼気／分で記録される。体温も測定される。
身長および体重：体重（キログラム）は、スクリーンニング（−２日目〜０日目）において、１４日目に、ならびに３０日目の追跡調査来診中に得られる。身長（センチメートル）は、スクリーンニング（−２日目〜０日目）でのみ得られる。
試験治療下発現有害事象：試験治療下で発現される有害事象は、０日目（用量投与後）から３０日目まで、毎日評価される。３０日目来診後、ＦＥＶ１における新規報告変化（ＦＶＣの最初の１秒の間に吐き出される空気容積（出来るだけ強く且つ出来るだけ速く、完全吸気から完全呼気まで進む場合に吐き出される容積））、あるいは閉塞性細気管支炎（ＢＯＳ）分類における変化が患者症例報告書（ＣＲＦ）に記述されるが、有害事象とみなされない。
併用薬剤：併用免疫抑制薬、呼吸および抗菌薬の使用は、原文書中に、患者のＣＲＦに関して記録される。試験中の前の薬剤または併用薬剤における任意の変化も、ＣＲＦに関して記録される。
心電図：標準１２誘導心電図（ＥＣＧ）は、スクリーンニング（−２日目〜０日目）において、ならびに１４日目に得られる。ＰＩまたは任じられた者は、ＥＣＧの検討に対して責任を有し、ＥＣＧが正常限界内であるかを査定し、結果の臨床的意義を判定する。これらの査定は、ＣＲＦに記録される。任意の臨床的に有意の異常結果に関して、ＰＩまたは副研究者は生体情報モニターに連絡して、試験における患者の継続的参加について話し合わなければならない。
胸部Ｘ線撮影：胸部Ｘ線：標準胸部Ｘ線撮影は、スクリーンニング（−２日目〜０日目）において成される。
肺活量計測：肺活量計測は、スクリーンニング（−２日目〜０日目）、０、１および２日目前用量投与および１時間後用量投与、３〜６日目、ならびに１４、３０および９０日目に実施される。肺活量査定は、生命徴候が測定された後に実施されるべきである。スクリーニング時、３０日目、および９０日目に実施される肺活量計測は、内部一貫性のために、同一較正による同一機械で実施されなければならないし、絶対値ならびに予測％を包含すべきである。６日を超える入院患者に関しては、肺活量計測は１４日目までの入院期間中、または退院まで、どちらか先に来る日数の間、毎日実施される。肺活量計測は、肺および胸壁の機械的および機能的特性を査定するための客観的方法を提供する。肺活量計測値としては、以下のものが挙げられる：肺容量、例えばＦＶＣ（出来るだけ強く且つ出来るだけ速く、完全吸気から完全呼気まで進む場合に吐き出される容積）。これは、肺内の種々の区画のサイズの測定値を提供する；容積パラメーターおよび流量。これらは気道内の最大流を測定する；ＦＶＣは、出来るだけ強く且つ出来るだけ速く、完全吸気から完全呼気まで進む場合に吐き出される容積である。ＦＥＶ１は、ＦＶＣ操作の最初の１秒間に吐き出される量である。ＦＶＣおよびＦＥＶ１は、米国胸部学会／欧州呼吸器学会ガイドラインに従って測定される。患者の手で持てる大きさの肺活量計が上記プロトコール特定パラメーターの各々を記録しない場合、彼等は依然として登録され得る。最低限、ＦＥＶ１は、原文書および症例報告書（ＣＲＦ）に記録される。
パルスオキシメトリー：酸素を飽和したヘモグロビン％を査定するためのパルスオキシメトリー読取値は、スクリーンニング（−２日目〜０日目）、０〜６日目、１４日目に、ならびに３０日目の追跡調査来診中に収集されるべきである。パルスオキシメトリーは、６日を超える入院患者に関しては、入院期間中または退院までのどちらか先に来る日数の間、毎日査定される。
臨床検査試験：血液および尿試料は、スクリーンニング（−２日目〜０日目）、０、１および２日目（前用量投与）に、３日目および６日目に１日１回、ならびに１４日目および３０日目に、臨床検査試験のために得られ、そしてクインタイルズ中央研究所（Morrisville, NC）により分析される。臨床検査査定のために試料を処理するための使用説明書は、Quintiles Laboratory Manual. Hematology, Clinical Chemistryで提供されル。血液学、臨床化学、および尿分析査定は、以下の項目を包含する：血液学：赤血球（ＲＢＣ）数、鑑別血球計数（リンパ球、単球、好酸球、好塩基球、好中球）による白血球（ＷＢＣ）数、平均血球容積（ＭＣＶ）、平均血球ヘモグロビン（ＭＣＨ）、平均血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）、ヘモグロビン（Ｈｇｂ）、ヘマトクリット（Ｈｃｔ）および血小板数；臨床化学：総ビリルビン、アルカリ性ホスファターゼ、γグルタミルトランスフェラーゼ、アスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ［ＳＧＯＴ］）、アラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ［ＳＧＰＴ］）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、クレアチニン、血中尿窒素（ＢＵＮ）、総タンパク質、グルコース、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、カルシウム（Ｃａ）、クロリド（Ｃｌ）；尿分析：外見および色に関する視覚検査；ｐＨ用計量棒、比重、ケトン、タンパク質、グルコース、ビリルビン、硝酸塩、ウロビリノーゲン、潜血。試験薬剤投与後に生じる説明されない臨床的に有意の異常実験室試験の事象では、それが正常範囲に戻るまで、および／またはその異常を適切に説明する診断がなされるまで、主任研究者（ＰＩ）または副研究者の自由裁量で、試験が反復され、追跡調査され得る。臨床検査査定のための試料は、Quintiles Laboratoryマニュアルで提供される使用説明書に従って、分析のために、包装され、中央研究所に輸送されるべきである。
妊娠試験：尿および／または血清妊娠試験は、スクリーンニング（−２日目〜０日目）において実施される。詳細に関しては、Quintiles Laboratoryマニュアルを参照されたい。
他の実験室査定：サイトカイン／Ｃ応答性タンパク質（ＣＲＰ）のための血液試料は、スクリーンニング（−２日目〜０日目）中、ならびに処置期間中の合間に得られる。サイトカインおよびＣＲＰのための血液試料採取時間を、以下に示す：入院患者に関しては、試料は０日目：前用量投与、試験薬剤投与後２、４、６および８時間；１日目：前用量投与；２日目：前用量投与、試験薬剤投与後２、４、６および８時間；ならびに３日目：最終用量投与後２４時間に得られる。外来患者に関しては、試料は、０日目：前用量投与、試験薬剤投与後２、４および６時間；１日目：前用量投与；２日目：前用量投与、試験薬剤投与後２、４および６時間；ならびに３日目：最終用量投与後２４時間に得られる。サイトカイン分析は、以下の事項を包含する：ＣＲＰ（Ｃ応答性タンパク質）、インターフェロン（ＩＦＮ）α、インターロイキン（ＩＬ）Ｉｒａ、ＩＬ−６、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、および顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）。サイトカイン／ＣＲＰパネル用の試料は、Quintiles Laboratoryマニュアルで提供される使用説明書に従って、分析のために、包装され、中央研究所に輸送されるべきである。
患者症候カード：急性呼吸器症候群は、患者症候カードを用いて患者により自己報告される。患者症候カードは、−２日目から１４日目まで、１日２回（朝と夕方）、記入されなければならない。試料患者症候カードは、エラー！参照先が見つかりませんで示される。当該カードは、長期間に亘って特定呼吸器症候に集中する周知の喘息および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）アンケートとは異なり、急性非特異的呼吸器症候をスコアリングするために開発されたため、患者症候カードは、最新研究に用いるために適合された。査定されるべき症候としては、鼻水、鼻づまり、くしゃみ、咽喉の痛み、耳痛、不定愁訴、咳、静止時の息切れ、頭痛、筋肉および関節痛、悪寒、喘鳴、呼吸中の胸痛、ならびに血痰が挙げられる。症候は、以下のように０〜３のスケールで採点される：（０）症候なし；（１）軽度の症候；（２）中等度の症候；ならびに（３）重度の症候。１、２または３のスコアを有する症候は、ＰＩにより有害事象（ＡＥ）として報告される。
急性拒絶／閉塞性細気管支炎：患者は、移植片の急性拒絶の証拠に関して、ならびに９０日目まで全体を通して閉塞性細気管支炎（ＢＯＳ）の存在またはその段階における変化に関して、評価される。
他の細菌、ウイルスまたは真菌性呼吸器感染の発症：患者は、９０日目まで全体を通して、診断され、実証された細菌、ウイルスまたは真菌性呼吸器感染（ＲＳＶ以外）の発症に関して評価される。コロニー化は含まれるべきでない。
ＲＳＶ感染特性：ｑＲＴ−ＰＣＲによるＲＳＶ力価の分析のための鼻スワブおよび痰試料（中央ＲＳＶ研究所）は、スクリーンニング（−２日目〜０日目）、０、１および２日目（前用量投与）に、３日目および６日目に１日１回、次いで８、１０、１２および１４日目に１日１回、得られる。ＢＡＬ液の試料は、利用可能な場合、保存され、ｑＲＴ−ＰＣＲによりウイルス力価に関して試験される。鼻スワブ試料から評価されるべきＲＳＶ動態の特性としては、以下のものが挙げられる：−１日目から試験１４日目までのウイルス脱粒の継続期間（日）；ピークウイルス負荷（プラーク形成単位当量（ＰＦＵｅ）／ｍＬ）；ピークウイルス負荷までの時間（日）；平均１日ウイルス負荷（ＰＦＵｅ／ｍＬ）；ならびに全体的ウイルス負荷（ＰＦＵｅ／ｍＬ／日での濃度−時間曲線下面積［ＡＵＣ］に基づく）。鼻スワブ、痰試料および気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）の試料は、中央ＲＳＶ研究所への輸送のために処理されなければならない；これらの試料の処理および輸送のための使用説明書は、Quintiles Laboratoryマニュアルで提供される。
ＡＬＮ−ＲＳＶ０１の薬物動態：薬物動態査定は、血漿中のＡＬＮ−ＲＳＶ０１濃度の確定、ならびに０日目の０時間目からＡＬＮ−ＲＳＶ０１の最終投与後２４時間までに得られる薬物動態（ＰＫ）パラメーターの算定を包含する。試料採取時間を以下に示す：０日目：前用量投与、試験薬剤投与後２、５、１０、１５および３０分；１日目：前用量投与；２日目：前用量投与、２、５、１０、１５および３０分；ならびに３日目：最終用量投与後２４時間。算定される（データがそれを可能とする場合）ＰＫパラメーターとしては、以下のものが挙げられる：トラフ血漿濃度［Ｃｐｒｅ］；最大血漿濃度［Ｃｍａｘ］；最大血漿濃度を獲得するまでの時間［ｔｍａｘ］；見掛けの末端排除半減期［ｔｌ／２］；見掛けの総身体クリアランス［ＣＬ／Ｆ］；見掛けの分布容積［Ｖｄ／Ｆ］；ならびに濃度−時間曲線下面積［ＡＵＣＯ−ｌａｓｔ］。
安全性分析：試験期間中ならびに３０日目追跡調査：生命徴候、パルスオキシメトリー、肺活量計測、有害事象、併用薬剤、臨床検査試験、サイトカイン／ＣＲＰ用血液試料、完全および指示身体検査が実施される。６および１２名の患者が彼等の６日目査定を完了して、試験の安全性態様を再検討した後、暫定盲検下安全性レビューも実施される。
効能分析：効能査定としては、鼻スワブおよび痰（ならびに入手可能な場合はＢＡＬ試料）の集中化定量ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）分析に基づいたＲＳＶウイルス動態の変化、そして患者症候スコアが挙げられる。
９０日目追跡調査に関しては、生存およびＦＥＶ１が記録される。９０日目来診までの試験中の以下の事象のあらゆる発生が記録される：急性肺拒絶、ＢＯＳ、挿管のための要件、その他のウイルス、細菌または真菌性呼吸器感染。
薬物動態査定は、血漿中ＡＬＮ−ＲＳＶ０１濃度、ならびにＡＬＮ−ＲＳＶ０１の最終投与後０時間目から２４時間までに得られるＰＫパラメーター：トラフ血漿濃度［Ｃｐｒｅ］、最大血漿濃度［Ｃｍａｘ］、最大血漿濃度を獲得するまでの時間［ｔｍａｘ］、見掛けの末端排除半減期［ｔｌ／２］、見掛けの総身体クリアランス［ＣＬ／Ｆ］、見掛けの分布容積［Ｖｄ／Ｆ］；ならびに濃度−時間曲線下面積［ＡＵＣＯ−ｌａｓｔ］を包含する。
結果：ＡＬＮ−ＲＳＶ０１は、肺移植を受けたヒト患者におけるＲＳＶ感染の予防または治療のための安全且つ有効な治療であることが示される。
本出願は、すべての引用参考文献、特許および特許出願の記載内容を、すべての目的のために、その全体を、参照することにより本明細書中で援用する。

Claims (1)

  1. 本願明細書に記載された発明。
JP2014135582A 2007-12-13 2014-07-01 Ｒｓｖ感染の予防または治療のための方法および組成物 Pending JP2014177496A (ja)

Applications Claiming Priority (10)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US1342807P 2007-12-13 2007-12-13
US61/013,428 2007-12-13
US1488707P 2007-12-19 2007-12-19
US61/014,887 2007-12-19
US2130908P 2008-01-15 2008-01-15
US61/021,309 2008-01-15
US3408408P 2008-03-05 2008-03-05
US61/034,084 2008-03-05
US4907608P 2008-04-30 2008-04-30
US61/049,076 2008-04-30

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010538232A Division JP2011506484A (ja) 2007-12-13 2008-12-15 Ｒｓｖ感染の予防または治療のための方法および組成物

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2014177496A true JP2014177496A (ja) 2014-09-25

Family

ID=40756153

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010538232A Withdrawn JP2011506484A (ja) 2007-12-13 2008-12-15 Ｒｓｖ感染の予防または治療のための方法および組成物
JP2014135582A Pending JP2014177496A (ja) 2007-12-13 2014-07-01 Ｒｓｖ感染の予防または治療のための方法および組成物

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010538232A Withdrawn JP2011506484A (ja) 2007-12-13 2008-12-15 Ｒｓｖ感染の予防または治療のための方法および組成物

Country Status (8)

Country Link
US (3) US20090238772A1 (ja)
EP (1) EP2229459B1 (ja)
JP (2) JP2011506484A (ja)
AU (1) AU2008334948B2 (ja)
CA (1) CA2709109A1 (ja)
HK (1) HK1146084A1 (ja)
NZ (1) NZ585784A (ja)
WO (1) WO2009076679A2 (ja)

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2230304B1 (en) 2005-01-07 2012-03-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc. RNAI modulation of RSV and therapeutic uses thereof
BRPI0720219A2 (pt) 2006-12-08 2013-12-24 Univ Iowa State Res Found Inc Genes de planta envolvidos em absorção e metabolismo de nitrato
WO2009132290A2 (en) * 2008-04-25 2009-10-29 Interdigital Patent Holdings, Inc. Method and apparatus for simultaneously receiving on two carriers and performing discontinuous transmission and reception in dual cell high speed downlink packet access
US20100168205A1 (en) * 2008-10-23 2010-07-01 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and Compositions for Prevention or Treatment of RSV Infection Using Modified Duplex RNA Molecules
EP2585467B1 (en) 2010-06-24 2016-03-02 Gilead Sciences, Inc. Pyrazolo[1,5-a]pyrimidines and -triazines as antiviral agents
WO2012019168A2 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
CA2821992A1 (en) 2010-10-01 2012-04-05 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
DE12722942T1 (de) 2011-03-31 2021-09-30 Modernatx, Inc. Freisetzung und formulierung von manipulierten nukleinsäuren
US9464124B2 (en) 2011-09-12 2016-10-11 Moderna Therapeutics, Inc. Engineered nucleic acids and methods of use thereof
EP3492109B1 (en) 2011-10-03 2020-03-04 ModernaTX, Inc. Modified nucleosides, nucleotides, and nucleic acids, and uses thereof
JP2015501844A (ja) 2011-12-16 2015-01-19 モデルナ セラピューティクス インコーポレイテッドＭｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ． 修飾ヌクレオシド、ヌクレオチドおよび核酸組成物
JP6122868B2 (ja) 2011-12-22 2017-04-26 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド 抗ウイルス剤としてのピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン
JP6199540B2 (ja) * 2012-03-14 2017-09-20 ソニー株式会社 認証装置、認証方法、認証システム、収納システム、通信装置および医療機器
EP2833923A4 (en) 2012-04-02 2016-02-24 Moderna Therapeutics Inc MODIFIED POLYNUCLEOTIDES FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS
US9572897B2 (en) 2012-04-02 2017-02-21 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cytoplasmic and cytoskeletal proteins
US9878056B2 (en) 2012-04-02 2018-01-30 Modernatx, Inc. Modified polynucleotides for the production of cosmetic proteins and peptides
US9283287B2 (en) 2012-04-02 2016-03-15 Moderna Therapeutics, Inc. Modified polynucleotides for the production of nuclear proteins
NZ701647A (en) 2012-04-17 2016-05-27 Gilead Sciences Inc Compounds and methods for antiviral treatment
RS62030B1 (sr) * 2012-05-18 2021-07-30 Replicor Inc Kompozicije oligonukleotidni helatni kompleks-polipeptid i postupci
LT2922554T (lt) 2012-11-26 2022-06-27 Modernatx, Inc. Terminaliai modifikuota rnr
US8980864B2 (en) 2013-03-15 2015-03-17 Moderna Therapeutics, Inc. Compositions and methods of altering cholesterol levels
ES2825035T3 (es) 2013-06-26 2021-05-14 Janssen Biopharma Inc Nucleósidos, nucleótidos y análogos de estos sustituidos con 4’-azidoalquilo
UA123854C2 (uk) 2013-08-21 2021-06-16 Аліос Біофарма, Інк. Противірусні сполуки
WO2015048744A2 (en) 2013-09-30 2015-04-02 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding immune modulating polypeptides
EP3052521A1 (en) 2013-10-03 2016-08-10 Moderna Therapeutics, Inc. Polynucleotides encoding low density lipoprotein receptor
WO2016011226A1 (en) 2014-07-16 2016-01-21 Moderna Therapeutics, Inc. Chimeric polynucleotides
GB201502447D0 (en) 2015-02-13 2015-04-01 Univ Liverpool Method and apparatus for sample analysis
MA41614A (fr) 2015-02-25 2018-01-02 Alios Biopharma Inc Composés antiviraux
WO2018134214A1 (en) * 2017-01-23 2018-07-26 Koninklijke Philips N.V. Alignment of breath sample data for database comparisons
EP4162050A1 (en) 2020-06-09 2023-04-12 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai compositions and methods of use thereof for delivery by inhalation
CN112370079B (zh) * 2020-11-18 2022-08-26 景德镇陶瓷大学 一种利用超声多普勒检测血栓的方法
CA3210813A1 (en) * 2021-03-08 2022-09-15 Han-Oh Park Composition for administration of double-stranded oligonucleotide structures using ultrasonic nebulizer for prevention or treatment of respiratory viral infection including covid-19, pulmonary fibrosis caused by viral infection, or respiratory disease

Family Cites Families (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4501729A (en) * 1982-12-13 1985-02-26 Research Corporation Aerosolized amiloride treatment of retained pulmonary secretions
US5693532A (en) * 1994-11-04 1997-12-02 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Respiratory syncytial virus ribozymes
US20020032160A1 (en) * 1995-02-24 2002-03-14 Nyce Jonathan W. Compositions & formulations with an epiandrosterone or a ubiquinone & kits & their use for treatment of asthma symptoms & for reducing adenosine/adenosine receptor levels
US6214805B1 (en) * 1996-02-15 2001-04-10 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services RNase L activators and antisense oligonucleotides effective to treat RSV infections
US5898031A (en) * 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US6506559B1 (en) * 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
WO2002081628A2 (en) * 2001-04-05 2002-10-17 Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated Modulation of gene expression associated with inflammation proliferation and neurite outgrowth, using nucleic acid based technologies
WO2002044321A2 (en) * 2000-12-01 2002-06-06 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Rna interference mediating small rna molecules
US20060287267A1 (en) * 2001-05-18 2006-12-21 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of respiratory syncytial virus (RSV) expression using short interfering nucleic acid (siNA)
US20030170891A1 (en) 2001-06-06 2003-09-11 Mcswiggen James A. RNA interference mediated inhibition of epidermal growth factor receptor gene expression using short interfering nucleic acid (siNA)
WO2003008628A2 (en) * 2001-07-20 2003-01-30 Ribozyme Pharmacuticals, Inc. Enzymatic nucleic acid peptide conjugates
US6881835B2 (en) * 2002-01-04 2005-04-19 Dr. Chip Biotechnology Inc. Detection of respiratory viruses
WO2003062258A1 (en) * 2002-01-22 2003-07-31 The Cleveland Clinic Foundation Rnase l activator-antisense complexes
US20040204420A1 (en) * 2002-08-05 2004-10-14 Rana Tariq M. Compounds for modulating RNA interference
US7923547B2 (en) 2002-09-05 2011-04-12 Sirna Therapeutics, Inc. RNA interference mediated inhibition of gene expression using chemically modified short interfering nucleic acid (siNA)
WO2004028471A2 (en) * 2002-09-28 2004-04-08 Massachusetts Institute Of Technology Influenza therapeutic
US20040242518A1 (en) * 2002-09-28 2004-12-02 Massachusetts Institute Of Technology Influenza therapeutic
EP2305813A3 (en) 2002-11-14 2012-03-28 Dharmacon, Inc. Fuctional and hyperfunctional sirna
EP2216407B1 (en) 2003-03-07 2016-01-13 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Therapeutic compositions
EP1608735A4 (en) 2003-04-03 2008-11-05 Alnylam Pharmaceuticals RNAI CONJUGATES
EP2666858A1 (en) * 2003-04-17 2013-11-27 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Modified iRNA agents
WO2005007623A2 (en) * 2003-07-03 2005-01-27 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Inhibition of syk kinase expression
WO2005097817A2 (en) * 2004-04-05 2005-10-20 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Process and reagents for oligonucleotide synthesis and purification
WO2006085987A2 (en) * 2004-07-09 2006-08-17 University Of Iowa Research Foundation Rna interference in respiratory epitheial cells
US20060089324A1 (en) * 2004-10-22 2006-04-27 Sailen Barik RNAi modulation of RSV, PIV and other respiratory viruses and uses thereof
EP2230304B1 (en) * 2005-01-07 2012-03-28 Alnylam Pharmaceuticals Inc. RNAI modulation of RSV and therapeutic uses thereof
CA2603730A1 (en) 2005-03-31 2006-10-05 Calando Pharmaceuticals, Inc. Inhibitors of ribonucleotide reductase subunit 2 and uses thereof
US20070213293A1 (en) * 2005-04-08 2007-09-13 Nastech Pharmaceutical Company Inc. Rnai therapeutic for respiratory virus infection
KR101362681B1 (ko) 2006-03-31 2014-02-13 알닐람 파마슈티칼스 인코포레이티드 Ｅｇ5 유전자의 발현을 억제하는 조성물 및 억제 방법
US8598333B2 (en) 2006-05-26 2013-12-03 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. SiRNA silencing of genes expressed in cancer
US9051567B2 (en) 2009-06-15 2015-06-09 Tekmira Pharmaceuticals Corporation Methods for increasing efficacy of lipid formulated siRNA

Also Published As

Publication number Publication date
AU2008334948B2 (en) 2014-11-20
CA2709109A1 (en) 2009-06-18
US9127277B2 (en) 2015-09-08
HK1146084A1 (en) 2011-05-13
EP2229459A4 (en) 2011-01-12
JP2011506484A (ja) 2011-03-03
AU2008334948A1 (en) 2009-06-18
NZ585784A (en) 2012-09-28
EP2229459A1 (en) 2010-09-22
EP2229459B1 (en) 2014-08-27
US8410073B2 (en) 2013-04-02
US20130165499A1 (en) 2013-06-27
US20120189555A1 (en) 2012-07-26
US20090238772A1 (en) 2009-09-24
WO2009076679A2 (en) 2009-06-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2014177496A (ja) Ｒｓｖ感染の予防または治療のための方法および組成物
EP2230304B1 (en) RNAI modulation of RSV and therapeutic uses thereof
RU2494745C2 (ru) Iрнк средство для снижения уровней вирусного белка, мрнк или титра респираторного синцитиального вируса в клетке дыхательных путей
US20150337311A1 (en) Methods And Compositions For Prevention Or Treatment Of RSV Infection Using Modified Duplex RNA Molecules
AU2015200545A1 (en) Methods and compositions for prevention or treatment of RSV infection

Legal Events

Date Code Title Description
A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20140701

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20150605

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20150820

A02 Decision of refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02

Effective date: 20160401