JP2014164096A

JP2014164096A - 走査型観察装置

Info

Publication number: JP2014164096A
Application number: JP2013034591A
Authority: JP
Inventors: Hironari Fukuyama; 宏也福山
Original assignee: Olympus Corp
Current assignee: Olympus Corp
Priority date: 2013-02-25
Filing date: 2013-02-25
Publication date: 2014-09-08
Anticipated expiration: 2033-02-25
Also published as: JP6037889B2; US20150355094A1; US9513223B2; WO2014129643A1

Abstract

【課題】蛍光検出間隔を短くしても残像を抑えて高分解能の蛍光画像を取得する。
【解決手段】光源２から所定の時間間隔で発生されたパルス状の励起光を標本Ａに対して空間的に走査させる走査部３と、該走査部３により走査された励起光によって標本Ａ内の蛍光物質が励起されることにより発生した蛍光を励起光の発生に同期して検出する蛍光検出部４と、各走査位置において、蛍光検出部４により検出された蛍光強度から、それより以前に蛍光検出部４により検出された時系列の蛍光に基づいて算出された残像蛍光成分を減算して、当該走査位置における蛍光の強度を補正する蛍光補正部５とを備える走査型観察装置１を提供する。
【選択図】図１

Description

本発明は、走査型観察装置に関するものである。

従来、光源から発せられたパルス状の励起光を標本上において走査させ、標本において発生する蛍光を検出し、励起光の走査位置と検出された蛍光強度とを対応づけることにより蛍光画像を取得する走査型観察装置が知られている（例えば、特許文献１参照。）。
このような走査型観察装置においては、高分解能の蛍光画像を取得するためには、パルス状の励起光の照射間隔および蛍光の検出間隔を短くする必要がある。

国際公開第２０１１／０５２２４８号

しかしながら、蛍光物質が励起されることにより発生する蛍光は、励起停止後、蛍光寿命に従って減衰するという性質があるため、蛍光の検出間隔を短くしていくと、蛍光が減衰しきらない内に次の蛍光の検出が行われてしまうという不都合がある。この場合には、各走査位置において発生する蛍光を空間的に十分に分離することができず、観察される像において残像状のノイズを呈するという問題がある。

本発明は、上述した事情に鑑みてなされたものであって、蛍光検出間隔を短くしても残像を抑えて高分解能の蛍光画像を取得することができる走査型観察装置を提供することを目的としている。

上記目的を達成するために、本発明は以下の手段を提供する。
本発明の一態様は、光源から所定の時間間隔で発生されたパルス状の励起光を標本に対して空間的に走査させる走査部と、該走査部により走査された励起光によって前記標本内の蛍光物質が励起されることにより発生した蛍光を前記励起光の発生に同期して検出する蛍光検出部と、各走査位置において、前記蛍光検出部により検出された蛍光強度から、それより以前に前記蛍光検出部により検出された時系列の蛍光に基づいて算出された残像蛍光成分を減算して、当該走査位置における蛍光の強度を補正する蛍光補正部とを備える走査型観察装置を提供する。

本態様によれば、蛍光検出部において、任意の時点で検出された蛍光信号の総量について、そこに含まれる残像蛍光成分を時系列における上記時点より前の蛍光信号に基づいて算出し、これを減算することにより補正するので、上記時点において発生している蛍光信号を精度よく取得することができ、蛍光検出間隔を短くしても残像を抑えて高分解能の蛍光画像を取得することができる。

上記態様においては、前記蛍光補正部が次式に基づいて蛍光の強度を補正してもよい。
Ｓ_Ｏ＝Ｌ^−１・Ｓ_Ｄ

ここで、Ｓ_Ｏ：補正された蛍光の強度、ＳＯ_ｍ：第ｍ番目の補正された蛍光の強度、Ｓ_Ｄ：検出された蛍光の強度、ＳＤ_ｍ：第ｍ番目の検出された蛍光の強度、Δｔ：励起光の時間間隔、Ｔｍ：第ｍ番目の検出に対応する蛍光色素の蛍光寿命、Ｌ：蛍光寿命行列、
ｌ_ｉｊ＝０（ｉ＜ｊ）
ｌｉｊ＝ｅｘｐ（（（ｊ−ｉ）・Δｔ）／Ｔｊ）（ｉ≧ｊ）
である。

このようにすることで、蛍光寿命が空間的に一様ではない場合でも、任意の時点において検出された蛍光よりも前に検出された複数の蛍光信号の総量と、上記時点よりも前の複数の検出に対応する各蛍光色素の蛍光寿命とに基づいて、精度よく補正された上記時点における蛍光の強度を取得することができる。

また、上記態様においては、前記蛍光補正部が、次式に基づいて蛍光の強度を補正してもよい。
ＳＯ_ｍ＝ＳＤ_ｍ−ＳＲ_ｍ
ＳＲ_ｍ＝ｅｘｐ（−Δｔ／Ｔ）・ＳＤ_ｍ−１
ここで、ＳＯ_ｍ：第ｍ番目の補正された蛍光の強度、ＳＤ_ｍ：第ｍ番目の検出された蛍光の強度、ＳＲ_ｍ：第ｍ番目の残像蛍光成分、Δｔ：励起光の時間間隔、Ｔ：蛍光色素の蛍光寿命である。

このようにすることで、蛍光寿命が空間的に一様である場合には、任意の時点において検出された蛍光よりも１つ前に検出された複数の蛍光信号の総量と、上記時点よりも１つ前の検出に対応する各蛍光色素の蛍光寿命とに基づいて、簡易に精度よく補正された上記時点における蛍光の強度を取得することができる。

また、上記態様においては、複数回のパルス状の励起光の照射によって生じる蛍光によって各画素が構成され、複数個の前記画素によって各走査線が構成され、複数本の前記走査線によって構成された複数の分割視野によって１つの視野が構成され、１回のパルス状の励起光が照射される毎に、照射対象としての前記分割視野が所定の順番で切り替えられる場合に、前記蛍光補正部が、次式に基づいて蛍光の強度を補正してもよい。

ここで、ｌ：各画素を構成する蛍光の検出数、ｒ：全分割視野数、ＳＯ_ｉｑ：第ｑ番目の分割視野における第ｉ番目の画素の補正された蛍光の強度、ＳＯ_ｉｋｑ：第ｑ番目の分割視野における第ｉ番目の画素の第ｋ番目のパルス状の励起光照射による補正された蛍光の強度、ＳＤ_ｉｋｑ：第ｑ番目の分割視野における第ｉ番目の画素の第ｋ番目のパルス状の励起光照射による検出された蛍光の強度、ＳＤ_ｉｋ１：第１番目（最初）の分割視野における第ｉ番目の画素の第ｋ番目のパルス状の励起光照射による検出された蛍光の強度、ＳＤ_{（ｉ−１）ｌｒ}：第ｒ番目（最後）の分割視野における第ｉ−１番目の画素の第ｌ番目（最後）のパルス状の励起光照射により検出された蛍光の強度である。

このようにすることで、蛍光寿命が空間的に一様である場合であって、１つの視野が、１回のパルス状の励起光が照射される毎に、所定の順番で切り替えられる複数の分割視野からなるとともに、１つの画素内において複数回の蛍光検出が行われる場合においても、簡易に精度よく補正された蛍光の強度を各時点において取得することができる。

ここで、ｌ：各画素を構成する蛍光の検出数、ｒ：全分割視野数、ＳＯ_ｉｑ：第ｑ番目の分割視野における第ｉ番目の画素の補正された蛍光の強度、ＳＯ_ｉｋｑ：第ｑ番目の分割視野における第ｉ番目の画素の第ｋ番目のパルス状の励起光照射による補正された蛍光の強度、ＳＤ_ｉｑ：第ｑ番目の分割視野における第ｉ番目の画素の検出された蛍光の強度、ＳＤ_ｉ１：第１番目（最初）の分割視野における第ｉ番目の画素の検出された蛍光の強度、ＳＤ_ｉｒ：第ｒ番目（最後）の分割視野における第ｉ番目の画素の検出された蛍光の強度である。

このようにすることで、各画素内において検出された全ての蛍光を加算した後に補正して、高分解能の蛍光画像を取得することができる。

本発明によれば、蛍光検出間隔を短くしても残像を抑えて高分解能の蛍光画像を取得することができるという効果を奏する。

本発明の一実施形態に係る走査型観察装置を示すブロック図である。図１の走査型観察装置における（ａ）光源から発せられる励起光、（ｂ）励起毎に発生する蛍光、（ｃ）現実に検出される蛍光の時間変化を示す図である。図２（ｃ）における各蛍光成分の関係を説明するための図である。図１の走査型観察装置の変形例によるパルス、画素、全視野、分割視野および走査線の一般的な関係を示す図である。図４の変形例を示す図である。

本発明の一実施形態に係る走査型観察装置１について、図面を参照して以下に説明する。
本実施形態に係る走査型観察装置１は、図１に示されるように、光源２から発せられる励起光を標本Ａに対して空間的に走査する走査部３と、該走査部３により励起光が照射されることにより標本Ａにおいて発生した蛍光を検出する蛍光検出部４と、該蛍光検出部４により検出された蛍光の強度を補正する蛍光補正部５と、該蛍光補正部５により補正された蛍光の強度と走査部３による標本Ａ上の走査位置とを対応づけて記憶する記憶部６とを備えている。

光源２は、所定の時間間隔をあけてパルス状の励起光を発生するようになっている。
走査部３は、光源２からの光を導光する光学系（図示略）と、該光学系により導光された光を標本Ａに対して２次元的に走査させる近接ガルバノミラーのような走査手段（図示略）とを備えている。

蛍光検出部４は、光源２から発せられる励起光の標本Ａへの照射に同期して、標本Ａにおいて発生した蛍光を集光する検出光学系（図示略）と、該検出光学系により集光された蛍光を検出する光電子増倍管のような光検出器（図示略）とを備えている。これにより、蛍光検出部４は、光源２からの励起光の発生タイミングに同期したタイミングで励起光と同じ時間間隔を空けた時系列の蛍光信号列を取得することができる。

蛍光補正部５は、取得された時系列の蛍光信号列のうち、全ての１の蛍光信号について、当該蛍光信号より前に取得された蛍光信号に基づいて残像蛍光成分を減算する補正を行うようになっている。
すなわち、図２（ａ）に示されるように、パルス状の励起光が所定の時間間隔で標本Ａに照射されると、励起光照射の直後に、図２（ｂ）に示されるように、標本Ａ内の蛍光物質が励起されることによる蛍光が発生する。しかし、励起光照射毎に発生する蛍光は、その蛍光寿命に従って、それ以降に発生する蛍光と重なる位置まで尾を引いて発生し続けるので、現実に光検出器により検出される蛍光の強度は、図２（ｃ）に示されるように、複数の蛍光が重畳して、各時点での励起光の照射により発生した蛍光よりも高くなる。

ここで、図３に示されるように、時点ｍで現実に検出された蛍光信号をＳＤ_ｍ、時点ｍでの励起光の照射により発生した蛍光信号をＳＯ_ｍ、時点ｍより前の励起光の照射により発生し、時点ｍまで残留しつづけている蛍光信号（残留蛍光成分）をＳＲ_ｍとすると、
ＳＯ_ｍ＝ＳＤ_ｍ−ＳＲ_ｍ
の関係がある。
残留蛍光成分ＳＲ_ｍは、それ以前の複数の蛍光信号の強度と蛍光色素の蛍光寿命とに基づいて決定されるため、上記関係を整理すると以下の関係が成立する。

すなわち、検出された蛍光信号と、補正後の蛍光信号とは以下の関係を有している。
Ｓ_Ｄ＝Ｌ・Ｓ_Ｏ

ここで、Ｓ_Ｏ：補正された蛍光の強度、ＳＯ_ｍ：第ｍ番目の補正された蛍光の強度、Ｓ_Ｄ：検出された蛍光の強度、ＳＤ_ｍ：第ｍ番目の検出された蛍光の強度、Δｔ：励起光の時間間隔、Ｔｍ：第番目の検出に対応する蛍光色素の蛍光寿命、Ｌ：蛍光寿命行列、
ｌ_ｉｊ＝０（ｉ＜ｊ）
ｌｉｊ＝ｅｘｐ（（（ｊ−ｉ）・Δｔ）／Ｔｊ）（ｉ≧ｊ）（１）
である。

ここで、蛍光寿命行列Ｌの性質について考える。
上記関係は、残留蛍光成分が過去の蛍光強度と蛍光寿命とに基づいていることを示しており、（１）式の関係から、蛍光寿命行列Ｌの行列式の値はゼロではなく、行列Ｌは正則である。したがって、行列Ｌには逆行列Ｌ^−１が存在し、唯一の解Ｓ_Ｏが存在するので、
Ｓ_Ｏ＝Ｌ^−１・Ｓ_Ｄ
となる。

これにより、蛍光検出部４において検出された蛍光強度を蛍光補正部５において精度よく補正して、各時点での励起光の照射によって発生した蛍光信号を取得することができる。すなわち、本実施形態に係る走査型観察装置によれば、蛍光検出間隔を短くしても残像を抑えて高分解能の蛍光画像を取得することができるという利点がある。
この場合において、本実施形態は、標本Ａに存在している蛍光物質の蛍光寿命が空間的に一様ではない場合にも適用することができる。

なお、標本Ａに存在している蛍光物質の蛍光寿命が空間的に一様である場合には、上記蛍光寿命行列Ｌは簡略化することができる。

すなわち、
ＳＯ_ｍ＝ＳＤ_ｍ−ＳＲ_ｍ
ＳＲ_ｍ＝ｅｘｐ（−Δｔ／Ｔ）・ＳＤ_ｍ−１
ここで、ＳＯ_ｍ：第ｍ番目の補正された蛍光の強度、ＳＤ_ｍ：第ｍ番目の検出された蛍光の強度、ＳＲ_ｍ：第ｍ番目の残像蛍光成分、Δｔ：励起光の時間間隔、Ｔ：蛍光色素の蛍光寿命である。

これは、ある時点で検出された蛍光信号に含まれる残留蛍光成分をその１つ前に検出された蛍光信号に基づいて定義することができることを示している。この場合には、上記実施形態による場合よりも、簡易に、精度よく蛍光画像を取得することができる。

また、本実施形態においては、単一の視野に蛍光を順次走査させる場合を例示して説明したが、これに代えて、１つの視野を複数の分割視野に分割し、１回のパルス状の励起光の照射毎に、分割視野を所定の順序で切り替えながら複数の分割視野に励起光を走査させていく分割ラスタースキャン方式の走査型観察装置に適用することにしてもよい。

図４は、分割ラスタースキャン方式の励起光の走査について説明する図である。
図４に示す例では、単一の全視野をｒ個（分割視野番号）の分割視野に分割し、各分割視野をｔ本（走査線番号）の走査線によって走査する際に、１回のパルス状の励起光の照射毎に、所定の順序（例えば、分割視野番号に従う順序）で分割視野を切り替えて励起光を照射するようになっている。また、各走査線はｊ個（画素番号）の画素を含んでおり、各画素においては、ｌ回（パルス番号）のパルス状の励起光が照射され、その都度、蛍光検出が同期して行われるようになっている。図４において、走査線に沿う画素の配列方向をＸ走査方向といい、各分割視野内において走査線を切り替える方向をＹ主走査方向といい、分割視野を切り替える方向をＹ副走査方向という。

すなわち、全視野はｒ個の分割視野からなり、各分割視野はｔ本の走査線を含み、各走査線はｊ個の画素を含み、各画素はｌ回検出された蛍光信号を含んでいる。したがって、ｒ回のパルス状の励起光照射によって、各分割視野における第ｓ番目の走査線の第ｉ番目の画素の第ｋ番目の蛍光の検出が完了する。

また、ｒｌ回のパルス状の励起光照射によって、各分割視野における第ｓ番目の走査線の第ｉ番目の画素の蛍光の検出が完了し、かつ、照射対象としての画素が切り替えられる。
さらに、ｒｌｊ回のパルス状の励起光照射によって、各分割視野における第ｓ番目の走査線の蛍光の検出が完了し、かつ、照射対象としての走査線が切り替えられる。
そして、ｒｌｊｔ回のパルス状の励起光照射によって、全視野における蛍光の検出が完了する。

そして、このような走査型観察装置においては、第ｑ番目の分割視野における第ｉ番目の画素の補正された蛍光強度は、次式によって算出することができる。

数５の式（２）は、２≦ｑ≦ｒの条件で、第ｑ番目の分割視野における第ｉ番目の画素の補正後の蛍光強度ＳＯ_ｉｑは、同画素における全ての検出された蛍光の強度ＳＤ_ｉｋｑ（１≦ｋ≦ｌ）および第（ｑ-１）番目の分割視野における第ｉ番目の画素における全ての検出された蛍光の強度ＳＤ_{ｉｋ（ｑ−１）}（１≦ｋ≦ｌ）を用いて算出することを示している。

また、数５の式（３）は、ｑ＝１として、第１番目の分割視野における第ｉ番目の画素の補正後の蛍光強度ＳＯ_ｉ１は、同画素における全ての検出された蛍光の強度ＳＤ_ｉｋ１（１≦ｋ≦ｌ）、第ｒ番目の分割視野における第ｉ−１番目の画素における最後の検出された蛍光の強度ＳＤ_{（ｉ−１）ｌｒ}および第ｒ番目の分割視野における第ｉ番目の画素における最後の１つを除いた全ての検出された蛍光の強度ＳＤ_ｉｋｒ（１≦ｋ≦ｌ−１）を用いて算出することを示している。

なお、分割視野の走査順序は図４に示す例では一方向に切り替わる順番で走査することとしたが、これに代えて、走査部の機構によって定まる任意の順序、例えば、図５に示されるような順序で分割視野を切り替えて走査することにしてもよい。

また、数２においては、検出された蛍光毎に強度を補正した後に加算して、各画素の蛍光強度を算出したが、これに代えて、数３に示されるように、各画素内において検出された蛍光の強度を加算した後に補正してもよい。

Ａ標本
１走査型観察装置
２光源
３走査部
４蛍光検出部
５蛍光補正部

Claims

光源から所定の時間間隔で発生されたパルス状の励起光を標本に対して空間的に走査させる走査部と、
該走査部により走査された励起光によって前記標本内の蛍光物質が励起されることにより発生した蛍光を前記励起光の発生に同期して検出する蛍光検出部と、
各走査位置において、前記蛍光検出部により検出された蛍光強度から、それより以前に前記蛍光検出部により検出された時系列の蛍光に基づいて算出された残像蛍光成分を減算して、当該走査位置における蛍光の強度を補正する蛍光補正部とを備える走査型観察装置。
前記蛍光補正部が次式に基づいて蛍光の強度を補正する請求項１に記載の走査型観察装置。
Ｓ_Ｏ＝Ｌ^−１・Ｓ_Ｄ

ここで、
Ｓ_Ｏ：補正された蛍光の強度
ＳＯ_ｍ：第ｍ番目の補正された蛍光の強度
Ｓ_Ｄ：検出された蛍光の強度
ＳＤ_ｍ：第ｍ番目の検出された蛍光の強度
Δｔ：励起光の時間間隔
Ｔｍ：第ｍ番目の検出に対応する蛍光色素の蛍光寿命
Ｌ：蛍光寿命行列
ｌ_ｉｊ＝０（ｉ＜ｊ）
ｌｉｊ＝ｅｘｐ（（（ｊ−ｉ）・Δｔ）／Ｔｊ）（ｉ≧ｊ）
である。
前記蛍光補正部が、次式に基づいて蛍光の強度を補正する請求項１に記載の走査型観察装置。
ＳＯ_ｍ＝ＳＤ_ｍ−ＳＲ_ｍ
ＳＲ_ｍ＝ｅｘｐ（−Δｔ／Ｔ）・ＳＤ_ｍ−１
ここで、
ＳＯ_ｍ：第ｍ番目の補正された蛍光の強度
ＳＤ_ｍ：第ｍ番目の検出された蛍光の強度
ＳＲ_ｍ：第ｍ番目の残像成分
Δｔ：励起光の時間間隔
Ｔ：蛍光色素の蛍光寿命
である。
複数回のパルス状の励起光の照射によって生じる蛍光によって各画素が構成され、
複数個の前記画素によって各走査線が構成され、
複数本の前記走査線によって構成された複数の分割視野によって１つの視野が構成され、
１回のパルス状の励起光が照射される毎に、照射対象としての前記分割視野が所定の順番で切り替えられる場合に、
前記蛍光補正部が、次式に基づいて蛍光の強度を補正する請求項３に記載の走査型観察装置。

ここで、
ｌ：各画素を構成する蛍光の検出数
ｒ：全分割視野数
ＳＯ_ｉｑ：第ｑ番目の分割視野における第ｉ番目の画素の補正された蛍光の強度
ＳＯ_ｉｋｑ：第ｑ番目の分割視野における第ｉ番目の画素の第ｋ番目のパルス状の励起光照射による補正された蛍光の強度
ＳＤ_ｉｋｑ：第ｑ番目の分割視野における第ｉ番目の画素の第ｋ番目のパルス状の励起光照射による検出された蛍光の強度
ＳＤ_ｉｋ１：第１番目（最初）の分割視野における第ｉ番目の画素の第ｋ番目のパルス状の励起光照射による検出された蛍光の強度
ＳＤ_{（ｉ−１）ｌｒ}：第ｒ番目（最後）の分割視野における第ｉ−１番目の画素の第ｌ番目（最後）のパルス状の励起光照射により検出された蛍光の強度
である。
複数回のパルス状の励起光の照射によって生じる蛍光によって各画素が構成され、
複数個の前記画素によって各走査線が構成され、
複数本の前記走査線によって構成された複数の分割視野によって１つの視野が構成され、
１回のパルス状の励起光が照射される毎に、照射対象としての前記分割視野が所定の順番で切り替えられる場合に、
前記蛍光補正部が、次式に基づいて蛍光の強度を補正する請求項３に記載の走査型観察装置。

ここで、
ｌ：各画素を構成する蛍光の検出数
ｒ：全分割視野数
ＳＯ_ｉｑ：第ｑ番目の分割視野における第ｉ番目の画素の補正された蛍光の強度
ＳＯ_ｉｋｑ：第ｑ番目の分割視野における第ｉ番目の画素の第ｋ番目のパルス状の励起光照射による補正された蛍光の強度
ＳＤ_ｉｑ：第ｑ番目の分割視野における第ｉ番目の画素の検出された蛍光の強度
ＳＤ_ｉ１：第１番目（最初）の分割視野における第ｉ番目の画素の検出された蛍光の強度
ＳＤ_ｉｒ：第ｒ番目（最後）の分割視野における第ｉ番目の画素の検出された蛍光の強度
である。