JP2014148549A - ヒトＭ２ｅペプチド免疫原 - Google Patents

Abstract

【課題】インフルエンザ感染に対する新規治療薬を提供する。
【解決手段】本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのＭ２ｅ標的ペプチドに対する抗体を誘導することができる合成ペプチド免疫原に関する。特に、本発明のペプチド免疫原は１つ以上のエピトープを含む。場合により、ペプチド免疫原は一般的免疫刺激因子をさらに含む。本発明のこれらのペプチド免疫原は、インフルエンザＡ型ウイルスによる感染を予防するために有効であり、インフルエンザＡ型ウイルスに対する抗体を誘導することができる。
【選択図】なし

Description

関連出願
この出願は、２００８年１１月１２日に出願された、仮出願ＵＳＳＮ第６１／１１３，８８０号（この内容は、その全体が参考として本明細書に援用される）に関する。

本発明は、一般にインフルエンザウイルス感染に対するワクチンおよび治療薬に関する。本発明は、特にインフルエンザマトリックス２タンパク質特異的抗体を生成するのに適したペプチド免疫原ならびにそれらの製造および使用に関する。

インフルエンザウイルスは、米国において毎年人口の５〜２０％が感染し、３０，０００〜５０，０００人の死亡をもたらす。インフルエンザワクチンは主要な感染予防の方法であるが、米国では４つの抗ウイルス薬：アマンタジン、リマンタジン、オセルタミビルおよびザナミビルも利用可能である。２００５年１２月現在、インフルエンザＡ型ウイルスのＭ２タンパク質におけるアミノ酸置換から生じたアマンタジンおよびリマンタジン（ｒｉｍａｎｔｉｄｉｎｅ）に対する上記ウイルスの耐性上昇により、オセルタミビル（ＴＡＭＩＦＬＵ（商標））だけがインフルエンザＡ型の処置のために推奨されている。最近、ベトナムにおいて１４歳の少女に薬剤耐性鳥ウイルスが発見された。Ｔａｍｉｆｌｕへの耐性も、ヒトインフルエンザで同様に認められている（非特許文献１）。

インフルエンザワクチンはインフルエンザ感染に対して防御効果があることが実証されてきた。しかし、循環ウイルス株と同時に、毎年出現するインフルエンザウイルスの抗原性変異体を監視する必要がある。一部の場合には、新しい変異体株の予測が難しいことがワクチンのタイムリーな生産を妨げてきた（非特許文献２）。近年、南アジアにおけるＨ５Ｎ１のような鳥インフルエンザウイルスの出現により、鳥インフルエンザの世界的な流行が深刻な脅威となりつつある。現在入手可能なワクチンは鳥ウイルスに対して無効であろう（非特許文献３；非特許文献４）。現在のワクチンが抱える第三の問題は、免疫系の機能低下を有する特定の集団、たとえば未熟児、高齢者、ＡＩＤＳ患者および移植患者において効果がないことである。

Ｍａｉ Ｌｅら、Ｎａｔｕｒｅ（２００５）４３７：１１０８ Ｆｒａｃｅら，Ｖａｃｃｉｎｅ（１９９９）１７：２２３７ Ｌｉｐａｔｏｖら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（２００４）７８：８９５１ Ｏｓｔｅｒｈｏｌｍら，Ｎ Ｅｎｇｌ．Ｍｅｄ．（２００５）３５２：１８３９

インフルエンザＡ型ウイルス感染によって引き起こされる疾患はその周期性を特徴とする。抗原ドリフトおよびシフトにより、毎年異なるＡ型株が出現することが可能となる。それに加えて、高病原性株が一般集団に入り込む脅威により、インフルエンザ感染に対する新規治療薬の必要性が強調されている。

本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのＭ２ｅ標的ペプチドに対する抗体を誘導することができる合成ペプチド免疫原に関する。特に、本発明のペプチド免疫原は１つ以上のエピトープを含む。場合により、ペプチド免疫原は一般的免疫刺激因子をさらに含む。本発明のこれらのペプチド免疫原は、インフルエンザＡ型ウイルスによる感染を予防するために有効であり、インフルエンザＡ型ウイルスに対する抗体を誘導することができる。

本発明のペプチド免疫原は、以下の式：［Ｘａａ_０］_ｍ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−［Ｘａａ_６］_ｐ−［Ｘａａ_７］_ｑ−［Ｘａａ_８−［Ｘａａ_０］_ｍ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−［Ｘａａ_６］_ｐ−［Ｘａａ_７］_ｑ］_ｎ（式中、ｍ、ｐおよびｑは、独立して０または１であり、ｎは０〜４の間の任意の数であり、Ｘａａ_０は任意のアミノ酸、好ましくはＣであり、Ｘａａ_６は任意のアミノ酸、好ましくはＶまたはＣであり、Ｘａａ_７は任意のアミノ酸、好ましくはＥであり、Ｘａａ_８はプロリンを含まない任意のアミノ酸、好ましくはＧまたはＡであり、Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−は、Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｅであるか、または配列Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｅ（配列番号：４７）に１個の置換を有するペプチドであって、その置換は、Ｘａａ_１がＣまたはＴであり、Ｘａａ_２がＡ、Ｃ、ＦまたはＫであり、Ｘａａ_３がＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、ＴまたはＶであり、およびＸａａ_５がＤまたはＣである、から成る群より選択される）によって表される。

もう１つの態様では、本発明のペプチド免疫原は、以下の式：［Ｘａａ_０］_ｍ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−［Ｘａａ_６］_ｐ−［Ｘａａ_７］_ｑ−［Ｘａａ_８−［Ｘａａ_０］_ｍ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−［Ｘａａ_６］_ｐ−［Ｘａａ_７］_ｑ］_ｎ（式中、ｍ、ｐおよびｑは、独立して０または１であり、ｎは０〜４の間の任意の数であり、Ｘａａ_０は任意のアミノ酸、好ましくはＣであり、Ｘａａ_６は任意のアミノ酸、好ましくはＶまたはＣであり、Ｘａａ_７は任意のアミノ酸、好ましくはＥであり、Ｘａａ_８はプロリンを含まない任意のアミノ酸、好ましくはＧまたはＡであり、Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−は、Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｅであるか、または配列Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｅ（配列番号：４７）に１個の置換を有するペプチドであって、その置換は、Ｘａａ_１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｌ、ＴまたはＶであり、Ｘａａ_２がＡ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、ＷまたはＹであり、Ｘａａ_３が任意のアミノ酸であり、Ｘａａ_４がＭ、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＷであり、およびＸａａ_５がＡ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、ＹまたはＣである、から成る群より選択される）によって表される。

本発明の一部の態様では、１つ以上のアミノ酸はＤ−アミノ酸である。

本発明の一部の態様では、ペプチド免疫原は環状（ｃｙｃｉｃ）である。ペプチド免疫原の環化は、ペプチド中に存在するシステイン残基を架橋することによってまたは化学的手段によって実施できる。

本発明の一部の態様では、ペプチド免疫原は、分子間架橋を介してＫＬＨなどのキャリアタンパク質に結合している。

本発明は、ペプチド免疫原ならびにミョウバン、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、エマルシゲンモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ポリソルベート８０、ＱＳ２１、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６およびＩＳＡ７２０から成る群より選択される薬学的に許容され得るアジュバントおよび／またはキャリアを含む組成物に関する。

本発明は、本発明のペプチド免疫原を含む組成物を投与することによってインフルエンザウイルス感染に関連する疾患を予防するまたは処置することに関する。

本発明は、本発明のペプチド免疫原を含む組成物を投与することによってインフルエンザマトリックス２（Ｍ２）タンパク質に反応性の抗体を生成するための方法に関する。Ｍ２タンパク質に対して高親和性の抗体の高いレベルの生成を可能にする免疫原を開発することが本発明の１つの目的である。

本発明の１つの態様は、本発明に従った免疫学的有効量のペプチド免疫原組成物および１つ以上の薬学的に許容され得るキャリアを含むワクチンを提供する。適切な投与量で投与した場合、ワクチンは、インフルエンザＡ型ウイルスに対する免疫治療抗体を生成する。

本発明は、インフルエンザの予防および処置のためのヒトまたは動物での使用に適するワクチン送達ビヒクルを提供する。

本発明ならびに本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の本発明の詳細な説明および付属の図面および実施形態においてさらに明らかになるであろう。
本発明はまた、以下の項目を提供する。
（項目１）
［Ｘａａ_０］_ｍ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−［Ｘａａ_６］_ｐ−［Ｘａａ_７］_ｑ−［Ｘａａ_８−［Ｘａａ_０］_ｍ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−［Ｘａａ_６］_ｐ−［Ｘａａ_７］_ｑ］_ｎ
（式中、ｍ、ｐおよびｑは、独立して０または１であり、
ｎは０〜４の間の任意の数であり、
Ｘａａ_０、Ｘａａ_６、Ｘａａ_７およびＸａａ_８は、独立して任意のアミノ酸であり、
Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５は、Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｅであるか、または上記配列Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｅに１個の置換を有するペプチドであって、上記置換は、
Ｘａａ_１がＣまたはＴであり、
Ｘａａ_２がＡ、Ｃ、ＦまたはＫであり、
Ｘａａ_３がＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、ＴまたはＶであり、および
Ｘａａ_５がＤまたはＣである
から成る群より選択される）
の配列を含むペプチド免疫原。
（項目２）
Ｘａａ_０がＣである、項目１に記載のペプチド免疫原。
（項目３）
Ｘａａ_６がＶまたはＣである、項目１に記載のペプチド免疫原。
（項目４）
Ｘａａ_７がＥである、項目１に記載のペプチド免疫原。
（項目５）
Ｘａａ_８がＧまたはＡである、項目１に記載のペプチド免疫原。
（項目６）
［Ｘａａ_０］_ｍ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−［Ｘａａ_６］_ｐ−［Ｘａａ_７］_ｑ−［Ｘａａ_８−［Ｘａａ_０］_ｍ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−［Ｘａａ_６］_ｐ−［Ｘａａ_７］_ｑ］_ｎ
（式中、ｍ、ｐおよびｑは、独立して０または１であり、
ｎは０〜４の間の任意の数であり、
Ｘａａ_０、Ｘａａ_６、Ｘａａ_７およびＸａａ_８は、独立して任意のアミノ酸であり、
Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５は、Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｅであるか、または上記配列Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｅに１個の置換を有するペプチドであって、上記置換は、
Ｘａａ_１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｌ、ＴまたはＶであり、
Ｘａａ_２がＡ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、ＷまたはＹであり、
Ｘａａ_３が任意のアミノ酸であり、
Ｘａａ_４がＭ、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＷであり、および
Ｘａａ_５がＡ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、ＹまたはＣである
から成る群より選択される）
の配列を含むペプチド免疫原。
（項目７）
Ｘａａ_０がＣである、項目６に記載のペプチド免疫原。
（項目８）
Ｘａａ_６がＶまたはＣである、項目６に記載のペプチド免疫原。
（項目９）
Ｘａａ_７がＥである、項目６に記載のペプチド免疫原。
（項目１０）
Ｘａａ_８がＧまたはＡである、項目６に記載のペプチド免疫原。
（項目１１）
上記ペプチドが非線状である、項目１または６に記載のペプチド免疫原。
（項目１２）
上記ペプチドが環状（ｃｙｌｉｃ）である、項目１１に記載のペプチド免疫原。
（項目１３）
上記ペプチドが環状（ｃｙｌｉｃ）であり、およびｎが１〜４の間の任意の数である、項目１１に記載のペプチド免疫原。
（項目１４）
上記ペプチドが、ＨｕＭｅ２抗体８Ｉ１０または２３Ｋ１２に特異的に結合する、項目１または６に記載のペプチド免疫原。
（項目１５）
上記ペプチドがＤ−アミノ酸を含む、項目１または６に記載のペプチド免疫原。
（項目１６）
上記ペプチドが、配列ＳＬＬＴＥＶＧＳＬＬＴＥＶ（配列番号：３２０）を有する線状または環状ペプチドである、項目１または６に記載のペプチド免疫原。
（項目１７）
上記ペプチドが、配列ＣＳＬＬＴＥＶＧＳＬＬＴＥＶ（配列番号：２８３）を有する線状または環状ペプチドである、項目１または６に記載のペプチド免疫原。
（項目１８）
上記ペプチドが、配列ＣＳＬＬＴＥＣＧＳＬＬＴＣＶ（配列番号：４６３）を有する線状または環状ペプチドである、項目１または６に記載のペプチド免疫原。
（項目１９）
上記ペプチドが抗体Ｚ３Ｇ１に結合しない、項目１または６に記載のペプチド免疫原。
（項目２０）
上記ペプチドがキャリアに結合している、項目１または６に記載のペプチド免疫原。
（項目２１）
上記キャリアが、ヒト血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、インフルエンザ赤血球凝集素、ＰＡＮ−ＤＲ結合ペプチド（ＰＡＤＲＥポリペプチド）、マラリアサーカムスポロゾイド（ＣＳ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ_{１９〜２８}、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６５、カルメット‐ゲラン杆菌（ＢＣＧ）、コレラ毒素、毒性を低下させたコレラ毒素変異体、ジフテリア毒素、ジフテリア毒素と交差反応性であるＣＲＭ_１９７タンパク質、組換え連鎖球菌性Ｃ５ａペプチダーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＯＲＦ１２２４、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＯＲＦ１６６４、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＯＲＦ２４５２、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＯＲＦ Ｔ３６７、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＯＲＦ Ｔ８５８、破傷風トキソイド、ＨＩＶ ｇｐ１２０ Ｔ１、接着マトリックス分子を認識する微生物表面成分（ＭＳＣＲＡＭＭＳ）、増殖因子／成長ホルモン、サイトカインまたはケモカインである、項目２０に記載のペプチド免疫原。
（項目２２）
項目１または６に記載のペプチド免疫原を含むワクチン組成物。
（項目２３）
無機塩類、ＧＭ−ＣＳＦ、５２９ＳＥ、ＩＬ−１２、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、結核菌、百日咳菌、細菌リポ多糖類、アミノアルキルグルコサンホスフェート化合物、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ）、ポリペプチド、Ｑｕｉｌ Ａ、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１、百日咳毒素（ＰＴ）、大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βならびにフロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）から成る群より選択されるアジュバントをさらに含む、項目２２に記載のワクチン組成物。
（項目２４）
１つ以上の薬学的に許容され得る賦形剤、希釈剤および／またはアジュバントと共に、項目１または６に記載のペプチド免疫原を含む、免疫原性組成物。
（項目２５）
上記薬学的に許容され得るアジュバントおよび／またはキャリアが、ミョウバン、リポシン、サポニン、スクアレン、Ｌ１２１、エマルシゲンモノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、ポリソルベート８０、ＱＳ２１、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５１、ＩＳＡ３５、ＩＳＡ２０６およびＩＳＡ７２０から成る群より選択される、項目２４に記載の免疫原性組成物。
（項目２６）
項目１または６に記載のペプチド免疫原を哺乳動物に投与することによってインフルエンザウイルス媒介性疾患を予防するまたは治療する方法。
（項目２７）
項目２２のいずれかに記載のワクチン組成物を哺乳動物に投与することによってインフルエンザウイルス媒介性疾患を予防するまたは治療する方法。
（項目２８）
項目２４のいずれかに記載の免疫原性組成物を哺乳動物に投与することによってインフルエンザウイルス媒介性疾患を予防するまたは治療する方法。
（項目２９）
項目１または６に記載のペプチド免疫原を含むキット。

図１は、遊離Ｍ２ペプチドの存在下または不在下で、Ｍ２発現構築物または対照ベクターでトランスフェクトした２９３−ＨＥＫ細胞への３つの抗Ｍ２抗体および対照ｈｕ１４Ｃ２抗体の結合を示す。 図２Ａおよび２Ｂは、インフルエンザＡ／ＰＲ／３２へのヒトモノクローナル抗体の結合を示すグラフである。 図３Ａは、Ｍ２変異体の細胞外ドメインのアミノ酸配列を示す図表である。 図３Ｂおよび３Ｃは、図３Ａに示すＭ２変異体へ結合するヒトモノクローナル抗インフルエンザ抗体の結合を示す棒グラフである。 図３Ｂおよび３Ｃは、図３Ａに示すＭ２変異体へ結合するヒトモノクローナル抗インフルエンザ抗体の結合を示す棒グラフである。 図４は、ＣＨＯ細胞系統ＤＧ４４において安定に発現されたインフルエンザ株Ａ／ＨＫ／４８３／１９９７配列を示すＭ２タンパク質へのＭＡｂ ８Ｉ１０および２３Ｋ１２の結合を示す一連の棒グラフである。 図５は、抗Ｍ２抗体が、Ｍ２ｅのＮ末端の高度に保存された領域に結合することを示す図解である。 図６Ａおよび６Ｂは、高（６Ａ）および低（６Ｂ）ストリンジェンシー条件下で抗Ｍ２ｅ ｈｕＭＡｂ ８Ｉ１０および２３Ｋ１２に結合するうえで有効なコアペプチド免疫原およびアミノ酸変異体を表す概略図である。図６Ｃは、コア配列の変異体を表す概略図である。 図６Ｄ、６Ｅおよび６Ｆは、本発明のコア配列を含む特異的線状および環状ペプチド免疫原を表す概略図である。

本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのマトリックス２（Ｍ２）ポリペプチドの細胞外ドメインに対する抗体を誘導することができる合成ペプチド免疫原を含む免疫原性組成物に関する。本発明は、インフルエンザＡ型ウイルスのマトリックス２（Ｍ２）ポリペプチドの細胞外ドメインに対して特異的なヒトモノクローナル抗体に結合するペプチドを提供する。

中和抗体の主要画分は、赤血球凝集素およびノイラミニダーゼタンパク質の多型領域を対象とする。Ａ型インフルエンザウイルスの３番目の膜貫通タンパク質であるマトリックスタンパク質２（Ｍ２）は、ウイルス感染細胞によって豊富に発現され、ウイルス複製のために必須の膜透過性プロトンフラックスを提供すると考えられている（Ｃｉａｍｐｏｒら、Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：２４７（１９９２）；ＧｒａｍｂａｓとＨａｙ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １９０：１１（１９９２）；Ｓｕｇｒｕｅら、ＥＭＢＯ Ｊ．９：３４６９（１９９０））。ＨＡおよびＮＡと異なり、Ｍ２は保存されており、インフルエンザ患者のための抗体に基づく受動免疫治療薬の開発の標的となり得る（Ｉｔｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ６５：５４９１（１９９１）；Ｓｌｅｐｕｓｈｋｉｎら、Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１３９９（１９９５）；Ｎｅｉｒｙｎｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．５：１１５７（１９９９））。従って、そのような中和ＭＡｂは、おそらく１つまたは数種の株だけを標的とする。近年、比較的不変のマトリックス２（Ｍ２）タンパク質が注目を集めてきた。潜在的に、Ｍ２に対する中和ＭＡｂは、すべてのインフルエンザＡ型株に対する適切な治療薬となる。

Ｍ２タンパク質は、イオンチャネルを形成するホモ四量体として認められ、細胞内に入ったときウイルスの脱外被を助けると考えられる。感染後、Ｍ２は細胞表面で大量に認めることができる。その後Ｍ２はビリオン外被内に組み込まれ、そこではＭ２は総外被タンパク質の約２％しか構成しない。Ｍ２細胞外ドメイン（Ｍ２ｅ）は短く、アミノ末端の２〜２４アミノ酸が細胞の外にあらわれる。

これまで抗Ｍ２モノクローナル抗体はこの線状配列を対象としてきた。従って、それらは、天然Ｍ２上の高次構造決定基を含む、細胞で発現されるＭ２に対して所望の結合特性を示さないことがあり得る。

最近のワクチン開発は、キャリアタンパク質に結合した免疫原性ペプチドを利用してきた。しかし、キャリアタンパク質は、部位特異的標的に対する抗体応答を促進するのに使用するためには複雑すぎる。キャリア分子の質量は、機能的に重要な標的ペプチド部位の質量よりもはるかに大きい。その結果として、主要な免疫応答は、ペプチド免疫原の標的部位よりもむしろキャリアタンパク質に対して誘導される。さらに、ハプテン−キャリア複合体による免疫は、しばしばキャリア誘導性免疫抑制を導く（Ｓｃｈｕｔｚｅら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１９８５，１３５：２３１９）。ペプチド−キャリアタンパク質複合体に関する難点は、これらの分子が高度に複雑で、特徴づけが困難であり、製造工程についての有効な品質管理手順を開発するのが難しいことである。

有効であるためには、ペプチド免疫原は単に抗ペプチド応答を惹起する以上の働きをしなければならない。有効なペプチド免疫原はまた、機能的免疫応答を惹起しなければならない、すなわち、産生される抗体が真の標的に対して免疫学的交差反応性を有していなければならない。ペプチド免疫原が概して好ましい構造を保持しないことは公知である。それ故、構造的拘束を導入することがペプチド標的部位を設計するうえで重要である。しかし、課せられる構造的拘束は、惹起された抗体が真性分子上のその部位に対して交差反応性であるように標的エピトープの高次構造を模倣することができなければならない（Ｍｏｏｒｅ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２ ｉｎ Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ Ａ Ｕｓｅｒ’ｓ ｇｕｉｄｅ，Ｇｒａｎｔ編集、ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９２，ｐｐ ６３−６７）。ペプチド免疫原は、雑多なＴｈエピトープ、インベーシンドメインを用いて、およびＨＩＶのためのペプチドベースのワクチンに対する構造的拘束を課して設計されてきた（米国特許第６，０９０，３８８号）。

細胞で発現されるＭ２および天然Ｍ２上の高次構造決定基に結合する新しい抗体への長年にわたる切実な必要性が当技術分野に存在する。従って、インフルエンザウイルスに対するワクチンおよび治療薬を生成するためには、Ｍ２を模倣する適切なペプチドベースの免疫原が必要である。望ましくないＴ細胞応答によるエピトープ抑制を伴わずに部位特異的免疫応答を生じさせる合成ペプチド免疫原を提供することは望ましい。ペプチドベースの抗Ｍ２ｅ免疫原は、キャリアが誘導する有害な免疫抑制を伴わずに防御免疫のためのヒトにおける早期かつ強力な免疫応答を惹起すべきである。ペプチド免疫原はまた、安定で化学的に明確であるべきであって、製造および品質管理を容易にするため、複雑な下流処理を必要とすることなしに、複雑な生産プラントの必要性を回避するべきである。

Ｍ２は、インフルエンザウイルスの表面およびウイルスに感染した細胞にホモ四量体として存在する９６アミノ酸の膜貫通タンパク質である。Ｍ２は、インフルエンザＡ型株全体にわたって高度に保存されている２３アミノ酸のエクトドメイン（Ｍ２ｅ）を含む。１９１８年の汎流行株以来、ほとんどアミノ酸変化が起こっておらず、従ってＭ２ｅはインフルエンザ治療のための魅力的な標的である。Ｍ２ｅの免疫原性エピトープを組み込んだペプチドは、本発明の好ましい態様を形成する。

これらのエピトープと同じ特徴を有するミモトープ、およびＩｇＥ分子に関連してＩｇＥエピトープと交差反応する、免疫応答を生じさせるそのようなミモトープを含む免疫原も、本発明の一部を形成する。

本発明は、それ故、これらのＩｇＥエピトープ自体、およびそれらの任意のミモトープを包含する単離ペプチドを含む。ミモトープの意味は、天然Ｍ２ｅエピトープを認識する抗体によって認識され得るように（Ｇｈｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．ら、１９８６，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｓ ａｎｔｉｇｅｎｓ．Ｗｉｌｅｙ，Ｃｈｉｃｈｅｓｔｅｒ，Ｃｉｂａ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ １１９，ｐｌ３０−１４９；Ｇｈｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．，１９８６，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２３，７，７０９−７１５）、または適切なキャリアと結合した場合、天然Ｍ２ｅエピトープと交差反応する抗体を惹起することができるように、天然Ｍ２ｅエピトープに十分に類似する実体と定義される。

Ｍ２ｅペプチド免疫原をスクリーニングするためのモノクローナル抗体
ペプチド免疫原をスクリーニングするために使用される抗体を、本明細書ではｈｕＭ２ｅ抗体と称する。使用されるモノクローナル抗体は、Ｍ２エクトドメイン（Ｍ２ｅ）に特異的であり、細胞系統において発現される完全長Ｍ２に由来する。ｈｕＭ２ｅ抗体は、Ｍ２トランスフェクト細胞上の高次構造決定基、ならびにインフルエンザ感染細胞またはウイルス自体の天然Ｍ２に結合する。ｈｕＭ２ｅ抗体は線状Ｍ２ｅペプチドに結合しないが、細胞系統へのｃＤＮＡトランスフェクション後に発現されるいくつかの自然Ｍ２変異体には結合する。ヒトモノクローナル抗体は、非常に広い範囲のインフルエンザＡ型ウイルス株に対して特異性を示す。

ｈｕＭ２ｅ抗体は以下の特徴の１つ以上を有する：ｈｕＭ２ｅ抗体は、ａ）インフルエンザウイルスのマトリックス２（Ｍ２）ポリペプチドの細胞外ドメイン内のエピトープに結合する；ｂ）インフルエンザＡ型感染細胞に結合する；および／またはｃ）インフルエンザＡ型ウイルス（すなわちビリオン）に結合する。本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、ＡＤＣＣなどの免疫エフェクター機構を介してインフルエンザ感染細胞を除去し、インフルエンザビリオン（ｖｉｒｏｎ）への結合によって直接のウイルス排除を促進する。本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、Ｍ２ｅポリペプチドのアミノ末端領域に結合する。好ましくは、本発明のｈｕＭ２ｅ抗体は、Ｎ末端メチオニン残基が存在しないＭ２ｅポリペプチドのアミノ末端領域に結合する。例示的なＭ２ｅ配列は、以下の表１に列挙される配列を含む。

１つの実施形態では、本発明のペプチド免疫原は、Ｍ２ｅの２位から７位までのアミノ酸残基（ＳＬＬＴＥＶ）を全面的にまたは部分的に含有するＭ２ｅペプチドを含む。ｈｕＭ２ｅ抗体は、本発明のペプチド免疫原を含むアミノ酸配列ＳＬＬＴＥ（配列番号：４７）に全面的にまたは部分的に結合する。

ペプチド免疫原に結合する例示的なｈｕＭ２ｅモノクローナル抗体は、本明細書に記載する８Ｉ１０、２１Ｂ１５および２３Ｋ１２抗体である。

８Ｉ１０抗体は、配列番号：８９において以下に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号：８８）、および配列番号：９１に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号：９０）を含む。

以下の配列において、Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ら（１９８９，Ｎａｔｕｒｅ，３４２：８７７−８８３）によって定義されたＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を付し、Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ら（１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ｎｏ．９１−３２４２ Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．）によって定義されたものを太字で強調する。

８Ｉ１０抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義に従った以下の配列：ＮＹＹＷＳ（配列番号：９２）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号：９３）およびＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号：９４）を有する。８Ｉ１０抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義に従った以下の配列：ＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号：９５）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号：９６）およびＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号：９７）を有する。

８Ｉ１０抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａの定義に従った以下の配列：ＧＳＳＩＳＮ（配列番号：９８）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫ（配列番号：９９）およびＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号：９４）を有する。８Ｉ１０抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａの定義に従った以下の配列：ＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号：９５）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号：９６）およびＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号：９７）を有する。

２１Ｂ１５抗体は、配列番号：１０１において以下に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号：１００）、および配列番号：１０３に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号：１０２）を含む。

以下の配列において、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９によって定義されたＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を付し、Ｋａｂａｔら、１９９１によって定義されたものを太字で強調する。

２１Ｂ１５抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義に従った以下の配列：ＮＹＹＷＳ（配列番号：９２）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫＹＮＰＳＬＫＳ（配列番号：９３）およびＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号：９４）を有する。２１Ｂ１５抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義に従った以下の配列：ＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号：９５）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号：９６）およびＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号：９７）を有する。

２１Ｂ１５抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａの定義に従った以下の配列：ＧＳＳＩＳＮ（配列番号：９８）、ＦＩＹＹＧＧＮＴＫ（配列番号：９３）およびＡＳＣＳＧＧＹＣＩＬＤ（配列番号：９４）を有する。２１Ｂ１５抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａの定義に従った以下の配列：ＲＡＳＱＮＩＹＫＹＬＮ（配列番号：９５）、ＡＡＳＧＬＱＳ（配列番号：９６）およびＱＱＳＹＳＰＰＬＴ（配列番号：９７）を有する。

２３Ｋ１２抗体は、配列番号：１０５において以下に示す核酸配列によってコードされる重鎖可変領域（配列番号：１０４）、および配列番号：１０７に示す核酸配列によってコードされる軽鎖可変領域（配列番号：１０６）を含む。

以下の配列において、Ｃｈｏｔｈｉａら、１９８９によって定義されたＣＤＲを包含するアミノ酸に下線を付し、Ｋａｂａｔら、１９９１によって定義されたものを太字で強調する。

２３Ｋ１２抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義に従った以下の配列：ＳＮＹＭＳ（配列番号：１０８）、ＶＩＹＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫ（配列番号：１０９）およびＣＬＳＲＭＲＧＹＧＬＤＶ（配列番号：１１０）を有する。２３Ｋ１２抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｋａｂａｔの定義に従った以下の配列：ＲＴＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号：１１１）、ＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦ（配列番号：１１２）およびＱＱＳＹＳＭＰＡ（配列番号：１１３）を有する。

２３Ｋ１２抗体の重鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａの定義に従った以下の配列：ＧＦＴＶＳＳＮ（配列番号：１１４）、ＶＩＹＳＧＧＳＴＹ（配列番号：１１５）およびＣＬＳＲＭＲＧＹＧＬＤＶ（配列番号：１１０）を有する。２３Ｋ１２抗体の軽鎖ＣＤＲは、Ｃｈｏｔｈｉａの定義に従った以下の配列：ＲＴＳＱＳＩＳＳＹＬＮ（配列番号：１１１）、ＡＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦ（配列番号：１１２）およびＱＱＳＹＳＭＰＡ（配列番号：１１３）を有する。

特に定義されない限り、本発明に関連して使用される学術および技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。さらに、特に文脈によって要求されない限り、単数の用語は複数を含み、複数の用語は単数を含むものとする。一般に、本明細書に記載する細胞および組織培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド化学およびハイブリダイゼーションに関連して、およびその技術に関連して使用される名称は、当技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養および形質転換（たとえば電気穿孔、リポフェクション）には標準的な技術を使用する。酵素反応および精製技術は、製造者の仕様書に従ってまたは当技術分野において一般的に行われるようにまたは本明細書に記載するように実施する。本発明の実施は、特に異なる指示がない限り、当技術分野の技術範囲内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用し、それらの多くを例示のために以下に記載する。そのような技術は文献において十分に説明されている。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（第２版、１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ ＆ ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編集）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編集、１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集、１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集、１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）参照。

本明細書に記載する分析化学、合成有機化学、ならびに医化学および薬化学に関連して、ならびにそれらの実験手順および技術に関連して使用される名称は、当技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、薬剤の調製、製剤および送達、ならびに患者の処置には標準的な技術を使用する。

定義
以下の定義は本発明を理解するうえで有用である：
本明細書で使用される「抗体」（Ａｂ）という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（たとえば二重特異性抗体）、および所望の生物活性を示す限り、抗体フラグメントを含む。「免疫グロブリン」（Ｉｇ）という用語は、本明細書では「抗体」と交換可能に使用される。

「単離された抗体」は、その天然環境の成分から分離されたおよび／または回収されたものである。その天然環境の夾雑成分は、抗体の診断的または治療的使用を妨げる物質であり、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。好ましい実施形態では、抗体を、（１）ローリー法によって測定した場合に抗体の９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで；（２）スピニングカップ配列決定装置を使用することによってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで；または（３）クマシーブルーもしくは、好ましくは銀染色を用いて還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで、精製する。単離された抗体は、抗体の天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないので、組換え細胞内にインサイチュで抗体を含む。しかし通常は、単離された抗体は少なくとも１つの精製工程によって調製される。

基本的な４本鎖の抗体ユニットは、２本の同一の軽（Ｌ）鎖および２本の同一の重（Ｈ）鎖から成るヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＭ抗体は、基本的なヘテロ四量体ユニットとそれに付随するＪ鎖と呼ばれる付加的なポリペプチドの５個から成り、それ故１０の抗原結合部位を含み、一方分泌型ＩｇＡ抗体は、重合して、基本的４本鎖ユニットと付随するＪ鎖の２〜５個を含む多価集合体を形成することができる。ＩｇＧの場合、４本鎖ユニットは一般に約１５０，０００ダルトンである。各々のＬ鎖は１つのジスルフィド共有結合によってＨ鎖に連結され、一方２本のＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに依存して１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。各々のＨ鎖およびＬ鎖はまた、規則的な間隔の鎖内ジスルフィド架橋も有する。各々のＨ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）を有し、続いてα鎖およびγ鎖の各々について３つの定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）、そしてμおよびεアイソタイプについて４つのＣ_Ｈドメインを有する。各々のＬ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を有し、続いてその他方の末端に定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を有する。Ｖ_ＬはＶ_Ｈと整列し、Ｃ_Ｌは重鎖の第１定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）と整列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖および重鎖可変ドメインの間の界面を形成すると考えられている。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌが一緒に対合して単一抗原結合部位を形成する。抗体の種々のクラスの構造および特性については、たとえば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，第８版、Ｄａｎｉｅｌ Ｐ．Ｓｔｉｔｅｓ，Ａｂｂａ Ｉ．Ｔｅｒｒ ａｎｄ Ｔｒｉｓｔｒａｍ Ｇ．Ｐａｒｓｌｏｗ（編集）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ ＆ Ｌａｎｇｅ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃｏｎｎ．，１９９４，ｐａｇｅ ７１，ａｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ ６参照。

任意の脊椎動物種からのＬ鎖は、それらの定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）のアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２つの明確に異なる型のうちの１つに割り当てることができる。それらの重鎖定常ドメイン（Ｃ_Ｈ）のアミノ酸配列に基づき、免疫グロブリンを種々のクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。免疫グロブリンの５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、それぞれアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と称される重鎖を有する。γおよびαクラスは、Ｃ_Ｈ配列および機能の比較的小さな相違に基づきサブクラスへとさらに分類され、たとえば、ヒトは以下のサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２を発現する。

「可変」という用語は、Ｖドメインの特定のセグメントが、抗体間で配列に大きな相違があるという事実を指す。Ｖドメインは抗原結合を媒介し、特定の抗体の、その特定の抗原に対する特異性を規定する。しかし、可変性は、可変ドメインの１１０アミノ酸の長さ全体にわたって均一に分布しているわけではない。そうではなく、Ｖ領域は、各々９〜１２アミノ酸長の「超可変領域」と呼ばれる極めて可変性のより短い領域によって分けられた、１５〜３０アミノ酸のフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変の範囲から成る。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々、大部分がβシート構造をとり、３つの超可変領域によって連結された４つのＦＲを含み、それらは、βシート構造を連結し、一部の場合にはβシート構造の一部を形成するループを形成する。各々の鎖内の超可変領域は、ＦＲによって極めて近接して一緒に保持され、他方の鎖からの超可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）参照）。定常ドメインは、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）への抗体の関与などの、様々なエフェクター機能を示す。

本明細書で使用される場合「超可変領域」という用語は、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（たとえばＶ_Ｌ中のおよその残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）付近、ならびにＶ_Ｈ中のおよそ１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）付近；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））ならびに／または「超可変ループ」からの残基（たとえばＶ_Ｌ中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）、ならびにＶ_Ｈ中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）；ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在し得る、天然に生じる可能性がある変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一抗原部位に対して誘導される。さらに、種々の決定基（エピトープ）に対して誘導される種々の抗体を含むポリクローナル抗体調製物と対照的に、各々のモノクローナル抗体は抗原上の単一決定基に対して誘導される。その特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の抗体によって汚染されずに合成し得るという点で有利である。「モノクローナル」という修飾語は、任意の特定方法による抗体の生産を必要とすると解釈されるべきではない。たとえば、本発明において有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記述されたハイブリドーマ法によって調製し得るか、または細菌細胞、真核動物細胞もしくは植物細胞中で組換えＤＮＡ法を用いて作製し得る（たとえば米国特許第４，８１６，５６７号参照）。「モノクローナル抗体」はまた、たとえばＣｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離し得る。

本明細書中のモノクローナル抗体は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であり、一方、鎖（１つ以上）の残りの部分は、別の種に由来するまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラ」抗体、ならびに、所望の生物活性を示す限り、そのような抗体のフラグメントを包含する（米国特許第４，８１６，５６７号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４）参照）。本発明は、ヒト抗体に由来する可変ドメイン抗原結合配列（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎａｎｔｉｇｅｎ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｅｑｕｅｎｃｅ）を提供する。従って、本明細書における（ｈｊｅｒｅｉｎ）主要対象のキメラ抗体は、１つ以上のヒト抗原結合配列（たとえばＣＤＲ）を有し、且つ非ヒト抗体に由来する１つ以上の配列、たとえばＦＲまたはＣ領域配列を含む抗体を包含する。加えて、本明細書における主要対象のキメラ抗体は、１つの抗体クラスまたはサブクラスのヒト可変ドメイン抗原結合配列、および別の抗体クラスまたはサブクラスに由来する別の配列、たとえばＦＲまたはＣ領域配列を含むものを包含する。本明細書における対象のキメラ抗体はまた、本明細書に記載するものに関連するまたは非ヒト霊長動物（たとえば旧世界ザル、類人猿等）のような異なる種に由来する可変ドメイン抗原結合配列を含むものも包含する。キメラ抗体はまた、霊長動物化およびヒト化抗体を包含する。

さらに、キメラ抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも認められない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能をさらに改良するために行われる。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）参照。

「ヒト化抗体」は、一般に、非ヒトであるソースから１つ以上のアミノ酸残基がその中に導入されたヒト抗体であるとみなされる。これらの非ヒトアミノ酸残基はしばしば「輸入」残基と称され、典型的には「輸入」可変ドメインから取られる。ヒト化は、伝統的にＷｉｎｔｅｒと共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って、輸入超可変領域配列でヒト抗体の対応する配列を置換することによって実施される。従って、そのような「ヒト化」抗体は、無傷ヒト可変ドメインよりも実質的に少ない部分が非ヒト種からの対応する配列によって置換されたキメラ抗体である（米国特許第４，８１６，５６７号）。

「ヒト抗体」は、ヒトによって天然に産生される抗体中に存在する配列だけを含む抗体である。しかし、本明細書で使用される場合、ヒト抗体は、本明細書に記載する改変および変異体配列を含む、天然に存在するヒト抗体では認められない残基または改変を含み得る。これらは、典型的には抗体性能をさらに改良するまたは増強するために行われる。

「無傷」抗体は、抗原結合部位ならびにＣ_Ｌおよび少なくとも重鎖定常ドメイン、Ｃ_Ｈ１、Ｃ_Ｈ２およびＣ_Ｈ３を含むものである。定常ドメインは、天然配列定常ドメイン（たとえばヒト天然配列定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であり得る。好ましくは、無傷抗体は１つ以上のエフェクター機能を有する。

「抗体フラグメント」は、無傷抗体の一部、好ましくは無傷抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２およびＦｖフラグメント；ダイアボディ；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号；Ｚａｐａｔａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］参照）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体フラグメントから形成される多重特異性抗体を包含する。

抗体の「機能的フラグメントまたは類似体」という語句は、完全長抗体と共通の定性的生物活性を有する化合物である。たとえば、抗ＩｇＥ抗体の機能的フラグメントまたは類似体は、ＩｇＥ免疫グロブリン分子が高親和性受容体、Ｆｃ_εＲＩに結合する能力を有することを防止するまたは前記能力を実質的に低減するようにＩｇＥ免疫グロブリンに結合することができるものである。

抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれる２つの同一の抗原結合フラグメント、および残りの「Ｆｃ」フラグメントを生成し、Ｆｃフラグメントの名称は、容易に結晶化する能力を反映する。Ｆａｂフラグメントは、Ｌ鎖の全長、およびＨ鎖の可変領域ドメイン（Ｖ_Ｈ）と１本の重鎖の第１定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）から成る。各々のＦａｂフラグメントは抗原結合に関して一価である、すなわち単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合したＦａｂフラグメントにおおよそ対応し、まだ抗原を架橋することができる、単一の大きなＦ（ａｂ’）_２フラグメントを生成する。Ｆａｂ’フラグメントは、Ｃ_Ｈ１ドメインのカルボキシ末端に、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む付加的な数個の残基を有することによって、Ｆａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（１つ以上）が遊離チオール基を担持するＦａｂ’についての本明細書における名称である。Ｆ（ａｂ’）_２抗体フラグメントは、もともと、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として作製された。抗体フラグメントの他の化学的カップリングも公知である。

「Ｆｃ」フラグメントは、ジスルフィドによって共に保持される両方のＨ鎖のカルボキシ末端部分を含む。抗体のエフェクター機能はＦｃ領域の配列によって決定され、この領域はまた、特定の細胞型上で認められるＦｃ受容体（ＦｃＲ）によって認識される部分でもある。

「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含む最小抗体フラグメントである。このフラグメントは、密接に非共有結合した１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインとの二量体から成る。これらの２つのドメインの折りたたみから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に対する抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖およびＬ鎖から各々３つのループ）が生じる。しかし、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを含むＦｖの半分）でも、結合部位全体より低い親和性であるが、抗原を認識してそれに結合する能力を有する。

「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略記される「一本鎖Ｆｖ」は、１本のポリペプチド鎖に連結されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌ抗体ドメインを含む抗体フラグメントである。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの間に、ｓＦｖが抗原結合のために所望構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーをさらに含む。ｓＦｖの総説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ｉｎ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，ＲｏｓｅｎｂｕｒｇとＭｏｏｒｅ編集、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）；Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ １９９５、下記参照。

「ダイアボディ」という用語は、Ｖドメインの鎖内ではなく鎖間の対合が達成されて、二価フラグメント、すなわち２つの抗原結合部位を有するフラグメントを生じるように、Ｖ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインの間に短いリンカー（約５〜１０残基）を有するｓＦｖフラグメント（前の段落参照）を構築することによって調製される小さな抗体フラグメントを指す。二重特異性ダイアボディは、２つの抗体のＶ_ＨドメインとＶ_Ｌドメインが異なるポリペプチド鎖上に存在する、２つの「クロスオーバー」ｓＦｖフラグメントのヘテロ二量体である。ダイアボディは、たとえば欧州特許第ＥＰ ４０４，０９７号；国際公開公報ＷＯ ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）においてより詳細に説明されている。

本明細書で使用される、「内部移行する」抗体は、哺乳動物細胞上の抗原（たとえば細胞表面ポリペプチドまたは受容体）に結合したとき細胞によって取り込まれる（すなわち進入する）ものである。内部移行する抗体は、言うまでもなく、抗体フラグメント、ヒトまたはキメラ抗体、および抗体コンジュゲートを含む。特定の治療適用に関しては、インビボでの内部移行が企図される。内部移行する抗体分子の数は、細胞、特に感染細胞を死滅させるまたはその成長を阻害するのに十分であるまたは適切である。抗体または抗体コンジュゲートの効力に依存して、一部の場合には、１個の抗体分子の細胞内への取り込みが、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。たとえば、特定の毒素は死滅させることに関して極めて強力であり、抗体に結合した毒素の１個の分子の内部移行が感染細胞を死滅させるのに十分である。

本明細書で使用される、抗体は、検出可能なレベル、好ましくは約１０^４Ｍ^−１以上、または約１０^５Ｍ^−１以上、約１０^６Ｍ^−１以上、約１０^７Ｍ^−１以上、または１０^８Ｍ^−１以上の親和性定数Ｋ_ａで抗原と反応する場合、「免疫特異的」である、抗原に「特異的」である、または抗原に「特異的に結合する」と言われる。抗体のその同系の抗原に対する親和性はまた、一般に解離定数Ｋ_Ｄとしても表され、ある実施形態では、ＨｕＭ２ｅ抗体は、１０^−４Ｍ以下、約１０^−５Ｍ以下、約１０^−６Ｍ以下、１０^−７Ｍ以下、または１０^ー８Ｍ以下のＫ_Ｄで結合する場合、Ｍ２ｅに特異的に結合する。抗体の親和性は、従来の技術、たとえばＳｃａｔｃｈａｒｄら（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ５１：６６０（１９４９））によって記述されている技術を用いて容易に決定することができる。

抗原、細胞またはその組織への抗体の結合特性は、一般に、たとえば免疫組織化学（ＩＨＣ）および／または蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの免疫蛍光に基づくアッセイを含む免疫検出方法を用いて決定および評価され得る。

指定された抗体の「生物学的特徴」を有する抗体は、その抗体を他の抗体から区別するその抗体の生物学的特徴のうちの１つ以上を保有するものである。たとえば、ある実施形態では、指定された抗体の生物学的特徴を有する抗体は、指定された抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合するおよび／または指定された抗体と共通のエフェクター機能を有する。

「アンタゴニスト」抗体という用語は、最も広い意味で使用され、それが特異的に結合するエピトープ、ポリペプチドまたは細胞の生物活性を部分的にまたは完全にブロックする、阻害する、または中和する抗体を含む。アンタゴニスト抗体を同定するための方法は、候補アンタゴニスト抗体が特異的に結合するポリペプチドまたは細胞を候補アンタゴニスト抗体と接触させること、および前記ポリペプチドまたは細胞に通常関連する１つ以上の生物活性の検出可能な変化を測定することを含み得る。

「感染細胞の増殖を阻害する抗体」または「増殖阻害性」抗体は、抗体によって結合されるＭ２ｅエピトープを発現するまたは発現することができる感染細胞に結合し、その測定可能な増殖阻害をもたらすものである。好ましい増殖阻害性抗体は、感染細胞の増殖を、適切な対照と比較して２０％を超えて、好ましくは約２０％〜約５０％、さらに一層好ましくは５０％を超えて（たとえば約５０％〜約１００％）阻害し、前記対照は、典型的には試験される抗体で処理していない感染細胞である。増殖阻害は、細胞培養物中約０．１〜３０μｇ／ｍｌまたは約０．５ｎＭ〜２００ｎＭの抗体濃度で測定することができ、感染細胞を抗体に曝露した１〜１０日後に増殖阻害を測定する。インビボでの感染細胞の増殖阻害は、当技術分野で公知の様々な方法で測定できる。約１μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の抗体の投与が、抗体の最初の投与から約５日〜３か月以内、好ましくは約５〜３０日以内に、感染細胞の割合または感染細胞の総数の減少を生じさせる場合、抗体はインビボで増殖阻害性である。

「アポトーシスを誘導する」抗体は、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞の収縮、小胞体の拡張、細胞の断片化、および／または膜小胞（アポトーシス小体と呼ばれる）の形成によって測定される、プログラムされた細胞死を誘導するものである。好ましくは、細胞は感染細胞である。様々な方法が、アポトーシスに関連する細胞事象を評価するために利用可能である。たとえば、ホスファチジルセリン（ＰＳ）のトランスロケーションはアネキシン結合によって測定でき、ＤＮＡの断片化はＤＮＡラダリング（ｌａｄｄｅｒｉｎｇ）を介して評価でき、そしてＤＮＡ断片化を伴う核／クロマチン凝縮は、低二倍体細胞の何らかの増加によって評価することができる。好ましくは、アポトーシスを誘導する抗体は、アネキシン結合アッセイにおいて、未処理細胞と比較して約２〜５０倍、好ましくは約５〜５０倍、最も好ましくは約１０〜５０倍の、アネキシン結合の誘導を生じさせるものである。

抗体の「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域（天然配列Ｆｃ領域またはアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域）に起因する生物活性を指し、抗体アイソタイプによって異なる。抗体エフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（たとえばＢ細胞受容体）の下方調節；ならびにＢ細胞活性化を含む。

「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」は、特定の細胞傷害性細胞（たとえばナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌型Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原担持標的細胞に特異的に結合し、その後標的細胞を細胞毒で死滅させることを可能にする、細胞傷害性の形態を指す。抗体は細胞傷害性細胞を「強化し」、そしてそのような死滅のために必要である。ＡＤＣＣを媒介するための主要細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩだけを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血系細胞上でのＦｃＲ発現は、ＲａｖｅｔｃｈとＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）の４６４ページの表３に要約されている。対象とする分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または米国特許第５，８２１，３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施し得る。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいはまたは加えて、対象とする分子のＡＤＣＣ活性をインビボで、たとえばＣｌｙｎｅｓら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されているような動物モデルにおいて感知できる。

「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を表す。ある実施形態では、ＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）に結合するものであり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、これらの受容体の対立遺伝子変異体および選択的にスプライシングされた形態を包含する。ＦＣγＲＩＩ受容体は、主としてその細胞質ドメインが異なる類似のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン内に免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン内に免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含む（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：２０３−２３４（１９９７）における総説Ｍ．参照）。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈとＫｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌら、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ ４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ Ｈａａｓら、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．１２６：３３０−４１（１９９５）において総説されている。将来同定されるものを含む、他のＦｃＲは、本明細書における「ＦｃＲ」という用語に包含される。この用語はまた、母性ＩｇＧの胎児への移行の役割を担う、新生児受容体ＦｃＲｎも包含する（Ｇｕｙｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））。

「ヒトエフェクター細胞」は、１つ以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を遂行する白血球である。好ましくは、細胞は少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を遂行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は、ＰＢＭＣ、ＮＫ細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球を含み、ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。エフェクター細胞は天然のソースから、たとえば血液から単離し得る。

「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」は、補体の存在下での標的細胞の溶解を指す。古典補体経路の活性化は、補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）が、その同系の抗原に結合している（適切なサブクラスの）抗体に結合することによって開始される。補体の活性化を評価するために、たとえばＧａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０２：１６３（１９９６）に記載されているような、ＣＤＣアッセイを実施し得る。

「インフルエンザＡ型」および「インフルエンザウイルスＡ型」という用語は、ウイルスのＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科の属を指す。インフルエンザウイルスＡ型は、１つの種、すなわち鳥類、ヒト、ブタおよびウマにおいてインフルエンザを引き起こすインフルエンザＡ型ウイルスだけを含む。インフルエンザＡ型ウイルスのすべての亜型の株が野鳥類から単離されているが、疾患はまれである。インフルエンザＡ型ウイルスの一部の分離株は、家禽および、まれに、ヒトの両方において重篤な疾患を引き起こす。

感染症を処置することを目的とする「哺乳動物」は、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ等のような、家畜および農場動物（ｄｏｍｅｓｔｉｃ ａｎｄ ｆａｒｍ ａｎｉｍａｌｓ）、ならびに動物園動物、競技用動物またはペット動物を含む、任意の哺乳動物を指す。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

「処置すること」または「処置」または「緩和」は、治療的処置および予防的または防御的手段の両方を指し、その目的は、標的とする病的状態または障害を予防するまたは鈍化（軽減）させることである。処置を必要とするものは、既に障害を有するものならびに障害に罹患しやすいものまたは障害が予防されるべきであるものを含む。被験者または哺乳動物は、本発明の方法に従って治療量の抗体を摂取した後、患者が以下の１つ以上の観測可能および／または測定可能な低減または不在を示す場合、感染症に関して成功裏に「処置」される：感染細胞の数の減少もしくは感染細胞の不在；全細胞中の感染細胞の割合の低下；および／または特定の感染症に関連する１つ以上の症状のある程度の軽減；罹患率および死亡率の低下、ならびに生活の質の問題の改善。処置の成功および疾患の改善を評価するための上記パラメーターは、医師が精通する常套的手順によって容易に測定可能である。

「治療有効量」という用語は、被験者または哺乳動物において疾患または障害を「処置する」ために有効な抗体または薬剤の量を指す。「処置すること」の前記の定義参照。

「長期」投与は、初期治療効果（活性）を長期間にわたって維持するための、急性方式に対して、連続的な方式での薬剤（１つ以上）の投与を指す。「間欠的」投与は、連続的には行われないが、中断を伴わない、むしろ実際には周期的な治療である。

１つ以上のさらなる治療剤「と組み合わせた」投与は、同時（並行）投与および任意の順序での連続投与を含む。

本明細書中で使用される「キャリア」は、使用される投与量および濃度で、それに曝露される細胞または哺乳動物に対して無毒性である、薬学的に許容され得るキャリア、賦形剤または安定剤を含む。しばしば、生理的に許容され得るキャリアはｐＨ緩衝水溶液である。生理的に許容され得るキャリアの例は、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンもしくはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースもしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトールもしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤を含む。

本明細書で使用される「標識」は、「標識された」抗体を生成するために抗体に直接または間接的に結合される検出可能な化合物または組成物を指す。標識は、それ自体で検出可能であり得るか（たとえば放射性同位体標識もしくは蛍光標識）または、酵素標識の場合は、検出可能な基質化合物もしくは組成物の化学変換を触媒し得る。

本明細書で使用される「エピトープタグ化された」という用語は、「タグポリペプチド」に融合したポリペプチドを含むキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、それに対する抗体を作製できるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、それが融合されるポリペプチドの活性を妨げない程度に十分に短い。タグポリペプチドはまた、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に少なくとも６アミノ酸残基を有し、通常は約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは約１０〜２０アミノ酸残基）を有する。

「低分子」は、本明細書では約５００ダルトンより低い分子量を有すると定義される。

「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、一本鎖または二本鎖ＲＮＡ、ＤＮＡ、または混合ポリマーを指す。ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現するまたはポリペプチドを発現するように適合され得るゲノム配列、ゲノム外配列およびプラスミド配列、ならびにより小さな操作された遺伝子セグメントを含み得る。

「単離された核酸」は、他のゲノムＤＮＡ配列ならびに天然配列に天然に付随するリボソームおよびポリメラーゼなどのタンパク質または複合体から実質的に分離された核酸である。この用語は、その天然に存在する環境から取り出された核酸配列を包含し、組換えまたはクローン化されたＤＮＡ単離物および化学合成された類似体または異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な核酸は、単離された形態の核酸を含む。言うまでもなく、これは、最初に単離されたままの核酸を指し、単離された核酸に後から人為的に付加された遺伝子または配列を排除しない。

「ポリペプチド」という用語は、その従来の意味で、すなわち、アミノ酸の配列として使用される。ポリペプチドは、生成物の特定の長さに限定されない。ペプチド、オリゴペプチドおよびタンパク質はポリペプチドの定義内に含まれ、そのような用語は、特に他を指示しない限り、本明細書では交換可能に使用され得る。この用語はまた、ポリペプチドの発現後改変、たとえばグリコシル化、アセチル化、リン酸化等、ならびに天然に存在するものおよび天然には存在しないものの両方の、当技術分野で公知の他の改変を指さないかまたは排除しない。ポリペプチドは、タンパク質全体またはそのサブ配列であり得る。本発明に関連して対象とする特定のポリペプチドは、ＣＤＲを含み、抗原またはインフルエンザＡ型感染細胞に結合することができるアミノ酸サブ配列である。

「単離されたポリペプチド」は、その天然環境の成分から同定され、分離され、および／または回収されたものである。好ましい実施形態では、単離されたポリペプチドを、（１）ローリー法によって測定した場合にポリペプチドの９５重量％を超えるまで、最も好ましくは９９重量％を超えるまで；（２）スピニングカップ配列決定装置を使用することによってＮ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで；または（３）クマシーブルーもしくは、好ましくは銀染色を用いて還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで、精製する。単離されたポリペプチドは、ポリペプチドの天然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内にインサイチュでポリペプチドを含む。しかし通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程によって調製される。

「天然配列」のポリヌクレオチドは、天然に由来するポリヌクレオチドと同じヌクレオチド配列を有するものである。「天然配列」のポリペプチドは、天然に由来する（たとえば任意の種に由来する）ポリペプチド（たとえば抗体）と同じアミノ酸配列を有するものである。そのような天然配列のポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、天然から単離することができるか、または組換えもしくは合成手段によって生産できる。

ポリヌクレオチド「変異体」は、この用語が本明細書で使用される場合、典型的には、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において本明細書で具体的に開示するポリヌクレオチドと異なるポリヌクレオチドである。そのような変異体は、天然に生じ得るか、または、たとえば本発明のポリヌクレオチド配列の１つ以上を改変し、コードされるポリペプチドの１つ以上の生物活性を本明細書に記載するようにおよび／もしくは当技術分野で周知の多くの技術のいずれかを用いて評価することにより、合成によって生成し得る。

ポリペプチド「変異体」は、この用語が本明細書で使用される場合、典型的には、１つ以上の置換、欠失、付加および／または挿入において本明細書で具体的に開示するポリペプチドと異なるポリペプチドである。そのような変異体は、天然に生じ得るか、または、たとえば本発明の上記ポリペプチド配列の１つ以上を改変し、ポリペプチドの１つ以上の生物活性を本明細書に記載するようにおよび／もしくは当技術分野で周知の多くの技術のいずれかを用いて評価することによって、合成によって生成し得る。

本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの構造に改変を行ってもよく、それでもなお望ましい特徴を有する変異体または誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子が得られ得る。本発明のポリペプチドの等価物、さらには改善された変異体または本発明のポリペプチドの一部を作製するためにポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることを所望する場合、当業者は、典型的にはコードＤＮＡ配列のコドンの１つ以上を変化させる。

たとえば、タンパク質構造において、他のポリペプチド（たとえば抗原）または細胞に結合するその能力の感知できるほどの損失を伴わずに特定のアミノ酸で他のアミノ酸を置換し得る。タンパク質の生物学的機能活性を規定するのはタンパク質の結合能力および性質であるので、特定のアミノ酸配列置換をタンパク質配列内で、および、言うまでもなくその基礎となるＤＮＡコード配列内で行うことができ、それでもなお同様の特性を有するタンパク質を得ることができる。従って、開示される組成物のペプチド配列、または前記ペプチドをコードする対応するＤＮＡ配列において、その生物学的有用性または活性の感知できるほどの損失を伴わずに様々な変更を行い得ることが企図される。

多くの場合、ポリペプチド変異体は１つ以上の保存的置換を含む。「保存的置換」は、ペプチド化学の分野の当業者がポリペプチドの二次構造およびヒドロパシー特性が実質的に変化しないと予想するような、１つのアミノ酸で、同様の特性を有する別のアミノ酸を置換するものである。

そのような変更を行う場合、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮し得る。タンパク質に相互作用性の生物学的機能を付与するうえでのヒドロパシーアミノ酸指数の重要性は、当技術分野において一般的に理解されている（ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。アミノ酸の相対的ヒドロパシー特性が、生じるタンパク質の二次構造に寄与し、ひいてはそれがタンパク質と他の分子、たとえば酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原等との相互作用を規定することは広く認められている。各々のアミノ酸は、その疎水性および電荷特徴に基づいてヒドロパシー指数が割り当てられている（ＫｙｔｅとＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。これらの値は、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。

特定のアミノ酸を、類似のヒドロパシー指数またはスコアを有する他のアミノ酸によって置換してもよく、それでもなお類似の生物活性を有するタンパク質を生じ得る、すなわち、まだ生物学的機能において等価のタンパク質を得られ得ることは当技術分野において公知である。そのような変更を行う場合、ヒドロパシー指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに一層好ましい。また、類似のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて有効に実施できることも理解されている。米国特許４，５５４，１０１号は、その隣接アミノ酸の親水性によって支配される、タンパク質の最大局所平均親水性がタンパク質の生物学的特性と相関すると述べている。

米国特許４，５５４，１０１号に詳述されるように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。１つのアミノ酸で類似の親水性値を有する別のアミノ酸を置換することができ、それでもなお生物学的に等価の、特に免疫学的に等価のタンパク質を入手できることは理解されている。そのような変更においては、親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のものが特に好ましく、±０．５以内のものがさらに一層好ましい。

上記で概説したように、アミノ酸置換は、それ故、一般にアミノ酸側鎖置換基の相対的類似度、たとえばそれらの疎水性、親水性、電荷、大きさ等に基づく。様々な上記特徴を考慮に入れた例示的な置換は当業者に周知であり、アルギニンとリシン；グルタメートとアスパルテート；セリンとトレオニン；グルタミンとアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンを含む。

アミノ酸置換は、さらに、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性および／または両親媒性特性の類似度に基づいて行い得る。たとえば、負に荷電したアミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含み；正に荷電したアミノ酸は、リシンおよびアルギニンを含み；そして類似の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸は、ロイシン、イソロイシンおよびバリン；グリシンおよびアラニン；アスパラギンおよびグルタミン；ならびにセリン、トレオニン、フェニルアラニンおよびチロシンを含む。保存的変化を示し得るアミノ酸の他の群は、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ；（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ；（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ；および（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓを含む。変異体は、同様にまたは選択的に、非保存的変化を含み得る。好ましい実施形態では、変異体ポリペプチドは、５個以下のアミノ酸の置換、欠失または付加によって天然配列と異なる。変異体は、同様に（または選択的に）、たとえばポリペプチドの免疫原性、二次構造およびヒドロパシー特性に最小限の影響を及ぼすアミノ酸の欠失または付加によって改変され得る。

ポリペプチドは、翻訳と同時にまたは翻訳後にタンパク質の移動を指令する、タンパク質のＮ末端のシグナル（またはリーダー）配列を含み得る。ポリペプチドはまた、ポリペプチドの合成、精製もしくは同定を容易にするため（たとえばポリ−Ｈｉｓ）、またはポリペプチドの固体支持体への結合を増強するためにリンカーまたは他の配列に結合し得る。たとえば、ポリペプチドを免疫グロブリンＦｃ領域に結合し得る。

ポリヌクレオチド配列およびポリペプチド配列を比較する場合、２つの配列内のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が、以下に記載するように、最大一致するように整列したとき同じであれば、２つの配列は「同一」であると言われる。２つの配列間の比較は、典型的には配列を比較ウインドウにわたって比較することによって実施され、配列類似性に関する局所領域を特定しそして比較する。本明細書で使用される「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０の連続する位置、通常は３０〜約７５、４０〜約５０のセグメントを指し、１つの配列を、それと同じ数の連続する位置の参照配列と、それら２つの配列を最適に整列した後に比較し得る。

比較のための配列の最適アラインメントは、バイオインフォマティクスソフトウエア（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＬａｓｅｒｇｅｎｅパッケージソフト中のＭｅｇａｌｉｇｎプログラムを用いて、デフォルトパラメーターを使用して実施し得る。このプログラムは、以下の参考文献に記載されているいくつかのアラインメントスキームを統合している：Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（１９７８）Ａ ｍｏｄｅｌ ｏｆ ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎｓ−Ｍａｔｒｉｃｅｓ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｔ ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ．Ｉｎ Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．（編集）Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ ＤＣ Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ． ３，ｐｐ．３４５−３５８；Ｈｅｉｎ Ｊ．（１９９０）Ｕｎｉｆｉｅｄ Ａｐｐｒｏａｃｈ ｔｏ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ａｎｄ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｓ ｐｐ．６２６−６４５ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ｖｏｌ．１８３，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ；Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｄ．Ｇ．とＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１−１５３；Ｍｙｅｒｓ，Ｅ．Ｗ．とＭｕｌｌｅｒ Ｗ．（１９８８）ＣＡＢＩＯＳ ４：１１−１７；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｅ．Ｄ．（１９７１）Ｃｏｍｂ．Ｔｈｅｏｒ １１：１０５；Ｓａｎｔｏｕ，Ｎ．Ｎｅｓ，Ｍ．（１９８７）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｅｖｏｌ．４：４０６−４２５；Ｓｎｅａｔｈ，Ｐ．Ｈ．Ａ．とＳｏｋａｌ，Ｒ．Ｒ．（１９７３）Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ−ｔｈｅ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｎｕｍｅｒｉｃａｌ Ｔａｘｏｎｏｍｙ，Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ｗｉｌｂｕｒ，Ｗ．Ｊ．とＬｉｐｍａｎ，Ｄ．Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．，Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０：７２６−７３０。

あるいは、比較のための配列の最適アラインメントは、ＳｍｉｔｈとＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１）Ａｄｄ．ＡＰＬ．Ｍａｔｈ ２：４８２の局所同一性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の同一性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎとＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムをコンピュータで実行することによって（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、または検査によって実施し得る。

配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの１つの好ましい例は、それぞれＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２およびＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０に記載されている、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０は、たとえば本明細書に記載するパラメーターを用いて、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドについての配列同一性パーセントを決定するために使用できる。ＢＬＡＳＴ解析を実施するためのソフトウエアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公的に入手可能である。

１つの説明例では、累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメーターＭ（マッチする残基の対についての報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算することができる。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下した場合；１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、ＴおよびＸがアラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１および期待値（Ｅ）１０を使用し、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５参照）アラインメントは、（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両方の鎖の比較を使用する。

アミノ酸配列に関しては、累積スコアを計算するためにスコアリング行列が使用できる。各方向へのワードヒットの伸長は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下した場合；１つ以上の負のスコアの残基アラインメントの蓄積により、累積スコアがゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメーターＷ、ＴおよびＸがアラインメントの感度および速度を決定する。

１つのアプローチでは、「配列同一性のパーセンテージ」は、少なくとも２０の位置の比較ウインドウにわたって２つの最適に整列された配列を比較することによって決定され、比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントについての参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、２０％以下、通常は５〜１５％、または１０〜１２％の付加または欠失（すなわちギャップ）を含み得る。このパーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列内で生じる位置の数を決定し、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を参照配列内の位置の総数（すなわちウインドウサイズ）で除し、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。

「相同性」は、最大の相同性パーセントを達成するように配列を整列し、必要に応じてギャップを導入した後の、非変異体配列と同一であるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列変異体内の残基のパーセンテージを指す。特定実施形態では、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド変異体は、本明細書に記載するポリヌクレオチドまたはポリペプチドと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％のポリヌクレオチドまたはポリペプチド相同性を有する。

「ベクター」は、シャトルベクターおよび発現ベクターを含む。典型的には、プラスミド構築物はまた、それぞれ細菌中でのプラスミドの複製および選択のために、複製起点（たとえばＣｏｌＥ１複製起点）および選択マーカー（たとえばアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性）を含む。「発現ベクター」は、細菌細胞または真核細胞における、本発明の抗体フラグメントを含む抗体の発現のために必要な制御配列または調節エレメントを含有するベクターを指す。適切なベクターを以下に開示する。

本明細書および付属の特許請求の範囲において使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容によって明らかに異なる指示が為されない限り、複数の言及を包含する。

競合的阻害によってｍＡｂの特異性および親和性を決定するための好ましい方法は、Ｈａｒｌｏｗら、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８８）、Ｃｏｌｌｉｇａｎら編集、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．，（１９９２，１９９３）、およびＭｕｌｌｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．９２：５８９−６０１（１９８３）に認めることができ、これらの参考文献は全体が参照により本明細書に組み込まれる。

遊離もしくは複合形態の、または大型タンパク質に関連して天然配列として提示される場合の小さなペプチド配列を認識し、それらの配列に結合する、前記配列に対する本発明の抗体を惹起する技術は、当技術分野において周知である。そのような抗体は、当技術分野で公知のハイブリドーマまたは組換え技術によって作製されるマウス、マウス−ヒトおよびヒト−ヒト抗体を含む。

８ｉ１０または２３Ｋ１２への特異的結合に関するペプチド免疫原のスクリーニング
本発明は、ＨｕＭ２ｅ抗体に結合するペプチド免疫原に関する。１つの実施形態では、抗体は、本明細書で８ｉ１０、２１Ｂ１５または２３Ｋ１２と称する抗体である。これらの抗体は、同じ細胞型の非感染対照細胞と比較してインフルエンザＡ型感染細胞への優先的または特異的結合を示すことが公知である。

特定実施形態では、ＨｕＭ２ｅ抗体は、天然高次構造でのみ存在する、すなわち細胞中で発現されるＭ２ｅ内のエピトープに結合する。特定実施形態では、これらの抗体は、単離されたＭ２ｅポリペプチド、たとえば２３アミノ酸残基のＭ２ｅフラグメントには特異的に結合することができない。これらの抗体がＭ２ペプチドの非線状（すなわち高次構造）エピトープ（１つ以上）を認識することは理解されている。Ｍ２エクトドメイン（Ｍ２ｅ）は、アミノ酸配列ＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮＤＳＳＤ（配列番号：３２６）およびその変異体（Ｔｈｅ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）インフルエンザＡ型データベース、ｗｗｗ．ｆｌｕ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／）を含むまたはそれらから成る。

Ｍ２タンパク質内、特にＭ２ｅ内の特異的高次構造エピトープは、被験者におけるインフルエンザ感染の発症を予防するためのワクチンとして使用できるペプチド免疫原として同定された。

ペプチド免疫原配列は、合成ペプチドの生物学的機能を改善するために開発された、ＣＬＩＰＳ（商標）（Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ Ｌｉｎｋｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ｏｎ Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ；ＰｅｐＳｃａｎ）技術を用いた不連続エピトープマッピングによって同定された。ＣＬＩＰＳは、１つ以上のペプチドをその上に結合できる小さな化学的「足場」を使用する。ワクチン開発において、これらはタンパク質の天然構造に極めて類似するので、高次構造（または「不連続」）エピトープをマッピングするために理想的である。

変異体Ｍ２ペプチドへの抗Ｍ２抗体の結合活性を、種々のＭ２ペプチドを使用してＥＬＩＳＡアッセイで分析した。ヒト抗Ｍ２抗体番号Ｚ３Ｇ１、８Ｉ１０および２３Ｋ１２を試験で使用した。Ｍ２ｅ配列を含むペプチドを、ＨｕＭ２ｅ抗体８Ｉ１０および２３Ｋ１２に特異的に結合する能力に関してスクリーニングし、広いＭ２結合スペクトルを有する抗Ｍ２ヒトモノクローナル抗体Ｚ３Ｇ１（ＡＴＣＣ寄託番号ＰＴＡ−５９６７）に結合する能力と区別した。８Ｉ１０および２３Ｋ１２を、天然高次構造に類似する条件下でＭ２およびＭ２ｅに結合する能力に関して特徴づけた。アッセイは、ペプチドの０．０１μｇ／ｍＬおよび０．００１μｇ／ｍＬ濃度の両方で実施した。０．０１μｇ／ｍＬでは、１０００以上のシグナルレベルを有意として選択し、０．００１μｇ／ｍＬでは、３００以上のシグナルレベルを有意として選択した。８Ｉ１０および２３Ｋ１２に強く結合する大部分のペプチドは、Ｚ３Ｇ１にも結合する。

さらに、ペプチドを、２３Ｋ２１および８Ｉ１０に特異的に結合するが、Ｚ３Ｇには結合しない能力に関してスクリーニングした。１つのセットでは、Ｚ３Ｇ１によっては認識されない、２３Ｋ２１および８Ｉ１０に対して高い結合値を有するペプチドを同定した。２番目のセットでは、２３Ｋ２１および８Ｉ１０によっては認識されない、Ｚ３Ｇ１に対して高い結合値を有するペプチドを同定した。

Ｚ３Ｇ１には結合しない、２３Ｋ１２およびＢＩ１０に対して高い結合値を有するペプチド配列を低ストリンジェンシー（０．０１μｇ／ｍＬ）条件（表４Ａ）および高ストリンジェンシー（０．００１μｇ／ｍＬ）条件（表４Ｂ）について同定した。

種々のストリンジェンシー条件でＨｕＭ２ｅ抗体２３Ｋ１２／ＢＩ１０に特異的に結合するペプチドの特性を分析した。抗体８ｉ１０および２３ｋ１２は、ＳＬＬＴＥをそのコア配列とする高次構造エピトープに結合する。最も良好な２３ｋｌ２結合体はＳＬＬＴＥＶＧＳＬＬＴＥＶ（配列番号：３２０）であり、これはＺ３Ｇ１によっても認識される。最も良好な８ｉ１０結合体はＣＳＬＬＴＥＶＧＳＬＬＴＥＶ（配列番号：２８３）であり、これはＺ３Ｇ１によっても認識される。最高の特異的結合体はＣＳＬＬＴＥＣＧＳＬＬＴＣＶ（配列番号：４６３）である。結合配列は著しく高い数のシステインを含む。

２３Ｋ１２およびＢＩ１０には結合しない、Ｚ３Ｇ１に対して高い結合値を有するペプチド配列を低ストリンジェンシー（０．０１μｇ／ｍＬ）条件（表５Ａ）および高ストリンジェンシー（０．００１μｇ／ｍＬ）条件（表５Ｂ）について同定した。

抗体８ｉ１０／２３ｋ１２とＺ３Ｇ１の間には結合特異性の明らかな相違が存在する。極めて最良の特異的結合体は、２３ｋ１２／８ｉ１０より長い配列であり、二量体トポロジーを有さず、ＣＬＩＰＳも有さない。極めて最良の特異的結合体の中で、大部分は全長天然配列、ＭＳＬＬＴＥＶＥＴＰＩＲＮＥＷＧＣＲＣＮ（配列番号：１１４９）である。０．０１μｇ／ｍｌでの結果は、ＬＬＸＥＶＥＸＰＩＲＮ（配列番号：１５９４）がＺ３Ｇ１結合エピトープのコアであることを示す。

特異的結合モチーフは、０．００１μｇ／ｍｌスクリーニングから導くことができる。従って、ｍＡｂ ２３ｋ１２／８ｉ１０は、ＳＬＬＴＥをエピトープのコアとするＭ２ｅペプチドを認識する。Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｅ中のＴ残基は、２３ｋ１２／８ｉ１０とＺ３Ｇ１の間で、結合に差違をなす。これに対し、ｍＡｂ Ｚ３Ｇ１は、ＬＬＸＥＶＥＸＰＩＲＮ（配列番号：１５９４）をエピトープのコアとするＭ２ｅを認識する。（表６Ａおよび６Ｂ）。

ペプチド免疫原
特に、ＨｕＭ２ｅ ２３ｋ１２／８ｉ１０に結合する本発明のペプチド免疫原は、Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｅのコア配列ならびにその変異体、改変型および多量体を含む。結合データから導かれる低ストリンジェンシー（０．０１μｇ／ｍＬ）条件（図６Ａ）および高ストリンジェンシー（０．００１μｇ／ｍＬ）条件（図６Ｂ）についてのコア配列およびその変異体を図６Ａおよび６Ｂに示す。

一部の実施形態では、コア配列は、Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｅ−Ｘａａ_６（式中、Ｘａａ_６は任意のアミノ酸、好ましくはＶまたはＣである）のＣ末端に第１付加アミノ酸を含む（図６Ｃ）。

さらに、一部の実施形態では、コア配列は、Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｅ−Ｘａａ_６−Ｘａａ_７（式中、Ｘａａ_７は任意のアミノ酸であるが、好ましくはＥである）のＣ末端に第１付加アミノ酸を含む（図６Ｃ）。

一部の実施形態では、ペプチド免疫原は、アミノ酸、好ましくはＧまたはＡなどの低分子アミノ酸によって連結された複数のコア配列を含む。しかし、αへリックスおよびβシートなどの規則的な二次構造エレメントの中央で構造破壊物質として働き得る、プロリンのようなアミノ酸はあまり望ましくない。本発明のペプチド免疫原中のコア配列の数は、１、２、３、４、５以上であり得る（図６Ｄ）。

一部の実施形態では、Ｎ末端アミノ酸Ｘａａ_０がペプチド免疫原中に存在する。Ｘａａ_０は任意のアミノ酸であり得るが、好ましくはシステインである。一部の実施形態では、ペプチド免疫原を環化するためにＮ末端システインを利用する（図６Ｅ）。

２３Ｋ１２／８Ｉ１０結合に対して特に強い親和性を有するペプチド免疫原（線状または環状）を図６Ｆに示す。

高ストリンジェンシー条件下でｈｕＭ２ｅモノクローナル抗体に結合する本発明のペプチド免疫原は、以下の式：
［Ｘａａ_０］_ｍ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−［Ｘａａ_６］_ｐ−［Ｘａａ_７］_ｑ−［Ｘａａ_８−［Ｘａａ_０］_ｍ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−［Ｘａａ_６］_ｐ−［Ｘａａ_７］_ｑ］_ｎ
（式中、ｍ、ｐおよびｑは、独立して０または１であり、
ｎは０〜４の間の任意の数であり、
Ｘａａ_０は任意のアミノ酸、好ましくはＣであり、
Ｘａａ_６は任意のアミノ酸、好ましくはＶまたはＣであり、
Ｘａａ_７は任意のアミノ酸、好ましくはＥであり、
Ｘａａ_８はプロリンを含まない任意のアミノ酸、好ましくはＧまたはＡであり、
Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５は、Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｅであるか、
または配列Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｅに１個の置換を有するペプチドであって、その置換は、
Ｘａａ_１がＣまたはＴであり、
Ｘａａ_２がＡ、Ｃ、ＦまたはＫであり、
Ｘａａ_３がＡ、Ｃ、Ｅ、Ｆ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｑ、Ｓ、ＴまたはＶであり、そして
Ｘａａ_５がＤまたはＣである
から成る群より選択される）
によって表される。

低ストリンジェンシー条件下でｈｕＭ２ｅモノクローナル抗体に結合する本発明のペプチド免疫原は、以下の式：
［Ｘａａ_０］_ｍ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−［Ｘａａ_６］_ｐ−［Ｘａａ_７］_ｑ−［Ｘａａ_８−［Ｘａａ_０］_ｍ−Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５−［Ｘａａ_６］_ｐ−［Ｘａａ_７］_ｑ］_ｎ
（式中、ｍ、ｐおよびｑは、独立して０または１であり、
ｎは０〜４の間の任意の数であり、
Ｘａａ_０は任意のアミノ酸、好ましくはＣであり、
Ｘａａ_６は任意のアミノ酸、好ましくはＶまたはＣであり、
Ｘａａ_７は任意のアミノ酸、好ましくはＥであり、
Ｘａａ_８はプロリンを含まない任意のアミノ酸、好ましくはＧまたはＡであり、
Ｘａａ_１−Ｘａａ_２−Ｘａａ_３−Ｘａａ_４−Ｘａａ_５は、Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｅであるか、または
配列Ｓ−Ｌ−Ｌ−Ｔ−Ｅに１個の置換を有するペプチドであって、その置換は、
Ｘａａ_１がＡ、Ｃ、Ｄ、Ｌ、ＴまたはＶであり、
Ｘａａ_２がＡ、Ｃ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、Ｔ、ＷまたはＹであり、
Ｘａａ_３が任意のアミノ酸であり、
Ｘａａ_４がＭ、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＷであり、そして
Ｘａａ_５がＡ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｍ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｗ、ＹまたはＣである
から成る群より選択される）
によって表される。

線状および環状ペプチド免疫原の調製
線状ペプチド免疫原は、合成によって調製し、次に様々な生物学的アッセイにおいて特定の特徴に関してスクリーニングすることができる。たとえば、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．とＧ．Ｐ．Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６，１９９０；Ｄｅｖｌｉｎ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４：４０４，１９９０；Ｆｕｒｋａ，Ａ．ら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．３７：４８７，１９９１；Ｌａｍ，Ｋ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３５４：８２，１９９１。

環状ペプチドは、線状ペプチド免疫原と比較して優れた免疫原性活性を有することがしばしば認められる。３以上のコア配列を含む線状ペプチド免疫原は、末端配列とのみ結合することが認められるが、環化により、ペプチド免疫原中に存在するすべてのコア配列による結合が可能となる。環状ペプチドを作製するための様々な方法が記述されている。１つは、溶液相または液相ペプチド合成を含み、この方法では、溶液中のアミノ酸残基を、適切な保護基によって保護された、Ｎ末端残基のアミノ基、Ｃ末端残基のカルボキシ基、システイン残基上のスルフヒドリル基およびアミノ酸側鎖中の類似のまたは他の反応性基などの、ペプチド結合の形成に関与しない反応性基と、ペプチド結合によって連結する。

１つの実施形態では、環状ペプチド免疫原を、末端システイン残基を使用して、ジスルフィド架橋を形成するチオール基の還元によって形成する。

もう１つのアプローチは、合成が不溶性固体マトリックス上で実施される、固相ペプチド合成を含む。反応性側鎖には保護基を用いる。固相合成の一般的な方法は当技術分野において周知である。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｒ．Ｂ．，Ｓｏｌｉｄ ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎｏｂｅｌ ｌｅｃｔｕｒｅ）．Ａｎｇｅｗ Ｃｈｅｍ ２４：７９９−８１０（１９８５）およびＢａｒａｎｙら、Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２，Ｇｒｏｓｓ，Ｅ．とＭｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｊ．編集、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ １−２８４（１９８０）。たとえば、米国特許第４，０３３，９４０号および同第４，１０２，８７７号に記載されているような化学反応プロトコールは、環化されたペプチドを作製するために考案された。他の技術においては、生物学的方法と化学的方法を組み合わせて環状ペプチドを作製する。これらの後者の方法は、最初に細胞（たとえば細菌）において環状ペプチドの線状前駆体を発現させ、環状ペプチドの線状前駆体を作製して、次にプロテアーゼまたは求核試薬などの外因性因子を添加して、これらの線状前駆体を環状ペプチドに化学変換することを含む。たとえば、Ｃａｍｅｒｅｒｏ，Ｊ．Ａ．とＭｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃｉｅｔｙ．１２１：５５９７（１９９９）；Ｗｕ，Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：９２２６（１９９８）参照。

頭−尾（ｈｅａｄ−ｔｏ−ｔａｉｌ）（骨格）ペプチド環化は、低分子生物活性ペプチドの構造を堅固にし、インビボでの安定性を改善するために使用されてきた（ＣａｍａｒｅｒｏとＭｕｉｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２１：５５９７−５５９８（１９９９）参照）。ペプチド環化の重要な結果は、生物活性の保持および／または新しいクラスの薬理学的因子の同定である。骨格環化型のウシ膵臓トリプシン阻害因子を調製するために化学的架橋アプローチが使用された（ＧｏｌｄｅｎｂｕｒｇとＣｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１６５：４０７−４１３（１９８３））。他のアプローチは、水性条件下で線状合成ペプチドを効率的に環化することを可能にする化学的分子内連結法（Ｃａｍａｒｅｒｏら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．，３７：３４７−３４９（１９９８）；ＴａｍとＬｕ，Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．，７：１５８３−１５９２（１９９８）；ＣａｍａｒｅｒｏとＭｕｉｒ，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ，１９９７：１３６９−１３７０（１９９７）；およびＺｈａｎｇとＴａｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９：２３６３−２３７０（１９９７））および酵素的（Ｊａｃｋｓｏｎら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１７：８１９−８２０（１９９５））分子内連結法を含む。

天然の化学的連結アプローチは、インビボでのペプチドおよびタンパク質の頭−尾結合を触媒するためにインテイン（ｉｎｔｅｉｎ）（内部タンパク質）を利用する（たとえば、Ｅｖａｎｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１８３５９−１８３６３（１９９９）；ＩｗａｉとＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４５９．１６６−１７２（１９９９）；Ｗｏｏｄら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １７：８８９−８９２（１９９９）；ＣａｍａｒｅｒｏとＭｕｉｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：５５９７−５５９８（１９９９）；およびＳｃｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：１３６３８−１３６４３（１９９９）参照）。

本発明はまた、本発明のＭ２ｅペプチド免疫原をコードする配列を含む単離された核酸分子を包含する。また、Ｍ２ｅペプチド免疫原の少なくとも１つのエピトープ特徴を有する、Ｍ２ｅペプチドをコードするそのような核酸およびその変異体を含む核酸発現構築物および宿主細胞も本発明によって提供される。本発明のこの態様は、本明細書に記載するＭ２ｅ配列またはＭ２ｅペプチド免疫原配列をコードする単離核酸配列、ならびに、たとえば相補的配列、逆配列および逆配列の相補物などの、単離核酸分子から容易に誘導される配列に関する。

関連実施形態は、本明細書に記載するＭ２ｅペプチド免疫原またはＭ２ｅペプチド免疫原を含む融合タンパク質が宿主細胞において発現されるように、単離核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含む核酸発現構築物を包含する。もう１つの実施形態では、本発明は、そのような核酸発現構築物を含む宿主細胞を提供する。関連実施形態では、本発明は、記述された宿主細胞を、核酸発現構築物によってコードされるペプチド免疫原を発現するのに十分な時間増殖させることを含む、ペプチド免疫原を作製するための方法を提供する。

結合ペプチド免疫原
小さな免疫原性分子を大きな「キャリア」分子に結合することによって、その小さな免疫原性分子の免疫原性を高めるアプローチは、数十年間にわたって成功裏に使用されてきた（たとえばＧｏｅｂｅｌら（１９３９）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．６９：５３参照）。たとえば、多くの免疫原性組成物が記述されており、精製莢膜ポリマー（ｃａｐｓｕｌａｒ ｐｏｌｙｍｅｒ）をキャリアタンパク質に結合し、この「キャリア効果」を利用することによってより有効な免疫原性組成物が開発されてきた（Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら（１９８４）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．４５：５８２−５９１）。

本発明の１つの態様では、Ｍ２ｅペプチド免疫原を、ペプチド免疫原のアミノ酸残基の反応性基を介して、１つ以上の官能基を有するタンパク質／ポリペプチドキャリアに結合するための方法が提供される。タンパク質／ポリペプチドキャリアは、ヒト血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、免疫グロブリン分子、サイログロブリン、オボアルブミン、インフルエンザ赤血球凝集素、ＰＡＮ−ＤＲ結合ペプチド（ＰＡＤＲＥポリペプチド）、マラリアサーカムスポロゾイド（ｃｉｒｃｕｍｓｐｏｒｏｚｉｔｅ）（ＣＳ）タンパク質、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢＳＡｇ_{１９〜２８}、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）６５、カルメット‐ゲラン杆菌（ＢＣＧ）、コレラ毒素、毒性を低下させたコレラ毒素変異体、ジフテリア毒素、ジフテリア毒素と交差反応性であるＣＲＭ_１９７タンパク質、組換え連鎖球菌性Ｃ５ａペプチダーゼ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＯＲＦ１２２４、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＯＲＦ１６６４、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ ＯＲＦ２４５２、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＯＲＦ Ｔ３６７、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ ＯＲＦ Ｔ８５８、破傷風トキソイド、ＨＩＶ ｇｐ１２０ Ｔ１、接着マトリックス分子を認識する微生物表面成分（ＭＳＣＲＡＭＭＳ）、増殖因子／成長ホルモン、サイトカインまたはケモカインであり得る。

１つ以上のインフルエンザ株／分離株または亜型による感染から被験者を保護するまたは感染に対する被験者の感受性を低下させるための方法、すなわち予防方法がさらに提供される。１つの実施形態では、方法は、１つ以上のインフルエンザ株／分離株または亜型による感染から被験者を保護するために有効な量の、または感染に対する被験者の感受性を低下させるために有効な量の、インフルエンザＭ２に特異的に結合するＭ２ｅペプチド免疫原を被験者に投与することを含む。

軽減するまたは低下させることができるインフルエンザ感染症の症状または合併症は、たとえば悪寒、熱、咳、咽喉炎、鼻うっ血、副鼻腔うっ血、鼻感染、副鼻腔感染、身体痛、頭痛、疲労、肺炎、気管支炎、耳感染、耳痛または死亡を含む。

ワクチンとしてのペプチド免疫原
ペプチド免疫原は、インフルエンザ感染を予防するために抗インフルエンザＭ２媒介性免疫応答を生じさせるワクチンとして使用できる。合成ペプチドは、インビボで有効な免疫応答を誘導するために安定化とアジュバント添加（ａｄｊｕｖａｎｔａｔｉｏｎ）の両方を必要とする。化学的および物理的経路を含む様々なプロセスによって媒介される、インビトロおよびインビボでの分解に対して合成ペプチド免疫原を保護するために様々な方法が用いられてきた。（Ｍａｎｎｉｎｇ Ｍ Ｃら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，６：９０３−９１８）。

ヒトまたは動物用ワクチンに関する使用を予定した数多くのアジュバントおよび／またはデポーベースの非経口、粘膜または経皮送達システムが、免疫応答を増強するために開発されてきた。これらは、無機塩、油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョン、リポソーム、ポリマー微粒子、ナノ粒子およびゲル／ヒドロゲルの使用を含む。（Ｃｏｘ Ｊ Ｃら、Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９７，１５：２４８−２５６）。界面活性剤を含有する鉱油中の熱死滅化ヒト型結核菌の懸濁液である、フロイント完全アジュバント（ＦＣＡ）は、最も強力なアジュバントの１つとして認識されてきた。アジュバントは当技術分野において周知である（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｄｅｓｉｇｎ−Ｔｈｅ Ｓｕｂｕｎｉｔ ａｎｄ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ａｐｐｒｏａｃｈ，１９９５，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ６，Ｐｏｗｅｌｌ，Ｍ．Ｆ．とＮｅｗｍａｎ，Ｍ．Ｊ．編集、Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ａｎｄ Ｌｏｎｄｏｎ，ＩＳＢＮ ０−３０６−４４８６７−Ｘ）。本発明の免疫原と共に使用するための好ましいアジュバントは、アルミニウム塩またはカルシウム塩（水酸化物またはリン酸塩）を含む。アジュバントは、ＧＭ−ＣＳＦ、５２９ＳＥ、ＩＬ−１２、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、結核菌、百日咳菌、細菌リポ多糖類、アミノアルキルグルコサン（ａｍｉｎｏａｌｋｙｌ ｇｌｕｃｏｓａｎｅ）ホスフェート化合物、ＭＰＬ（商標）（３−Ｏ−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ）、ポリペプチド、Ｑｕｉｌ Ａ、ＳＴＩＭＵＬＯＮ（商標）ＱＳ−２１、百日咳毒素（ＰＴ）、大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、インターフェロン−α、インターフェロン−β、インターフェロン−γ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−βから選択され得る。

さらなる他のアジュバントは、鉱油および水エマルジョン、リン酸カルシウムなどのカルシウム塩、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム等のようなアルミニウム塩（ミョウバン）、Ａｍｐｈｉｇｅｎ、Ａｖｒｉｄｉｎｅ、Ｌ１２１／スクアレン、Ｄ−ラクチド−ポリラクチド／グリコシド、プルロニック酸（ｐｌｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ）、ポリオール、ムラミルジペプチド、死滅Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ、参照３により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，０５７，５４０号に記載されている、Ｓｔｉｍｕｌｏｎ（商標）ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓ．）などのサポニン、およびＩＳＣＯＭＳ（免疫刺激複合体）のようなそれらから生成される粒子、結核菌、細菌リポ多糖類、ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオチドなどの合成ポリヌクレオチド（参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２０７，６４６号）、百日咳毒素（ＰＴ）、または大腸菌易熱性毒素（ＬＴ）、特にＬＴ−Ｋ６３、ＬＴ−Ｒ７２、ＰＴ−Ｋ９／Ｇ１２９を含む；たとえば、すべての目的に関して参照により本明細書に組み込まれる、国際公開公報ＷＯ９３／１３３０２および同ＷＯ９２／１９２６５参照。

コレラ毒素および、国際公開公報ＷＯ００／１８４３４に記載されているもの（アミノ酸位置２９のグルタミン酸が別のアミノ酸（アスパラギン酸以外、好ましくはヒスチジン）によって置換されている）を含む、その変異体もアジュバントとして有用である。類似のＣＴ毒素または変異体が、国際公開公報ＷＯ０２／０９８３６８（アミノ酸位置１６のイソロイシンが、単独でまたはアミノ酸位置６８のセリンの別のアミノ酸による置換と組み合わせて、別のアミノ酸によって置換されている；および／またはアミノ酸位置７２のバリンが別のアミノ酸によって置換されている）に記載されている。他のＣＴ毒素は、国際公開公報ＷＯ０２／０９８３６９（アミノ酸位置２５のアルギニンが別のアミノ酸によって置換されている；および／または１個のアミノ酸がアミノ酸位置４９に挿入されている；および／または２個のアミノ酸がアミノ酸位置３５および３６に挿入されている）に記載されている。

合成ペプチドベースの免疫原を増強するために様々な方法を使用し得るが、通常、有効な長期的免疫原性応答のためにはキャリアまたはデポーシステムが必要である。注目すべき例は、免疫原を無機塩またはゲルに吸着させることを含む。たとえば、ペプチド免疫原をポリマーマトリックス（モノリシックマトリックス）またはゲル内に被包すること、またはペプチド免疫原（コアシェル）の周囲にポリマー材料を層化することは、有効な方策であり得る。または、免疫原をリポソームまたは小胞型の製剤に組み込んで、免疫原を脂質マトリックスに包埋するかまたは内部水相に物理的に捕捉させてもよい。もう１つの方策は、無機物ベース、植物ベースまたは動物ベースの油を様々な比率の免疫原の水溶液と共に使用して、油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョンまたは水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）二重エマルジョンを調製し得る。Ｐｏｗｅｌｌ Ｍ Ｆら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９５。

キット
調査中の免疫原に特異的であることが公知の定義されたエピトープ配列に対応する、抗体結合配列をキットにおいて使用することは特に有用である。このキットは、現在使用されているキットよりも特異的な回答を導き、それ故個々の患者のための免疫原ワクチン療法のより良い選択をもたらす。

このアプローチの延長として、前記方法を用いてランダムディスプレイライブラリーの中で対応する抗体結合ペプチドを同定することによって患者の血清を特徴づけることもできる。これもやはり、エピトープ情報の最適化を導き、従ってより良い診断を導き得る。

さらに、個々の抗体結合配列を、より特異的な（免疫原）ワクチンをもたらす（免疫原）ワクチンとして使用することができる。これらの抗体結合配列は、単離された形態で投与する、またはファージディスプレイシステムの膜タンパク質もしくは、抗体結合ペプチドの免疫防御作用のために有益な影響を及ぼし得る、別のキャリアタンパク質に融合することができる（Ｄａｌｕｍら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．６６６−６６９（１９９９））。

本発明は、少なくとも１つの潜在的免疫原への特異的抗体の結合を予測するためのキットに関する。本発明のキットはまた、エピトープ変異体などのペプチド配列への抗体結合を試験することが望ましい、他のスクリーニング目的のためにも有用である。

１つの実施形態では、ペプチド免疫原を固体支持体に固定化し得る。適切な固体支持体は、マイクロタイタープレート、ビーズ、毛細管または膜を含む、任意の化学的支持体であり得る。これらの支持体の各々は、活性化されて、共有結合、イオン結合もしくは疎水性結合、キレート化もしくは親和性結合を支持し得るか、または不活性化されて、イオン結合もしくは疎水性結合を促進し得る。固定化は、共有結合、イオン結合もしくは疎水性結合、キレート化、親和性結合を介した、またはファンデルワールス結合（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌ ｂｏｎｄ）を介した結合によって起こり得る。固体支持体はまた、ファージ、細菌、赤血球または異種タンパク質もしくはペプチドの提示を可能にする任意の関連システムなどの、生物学的性質のものであり得る。

キットはまた、構造的エピトープに対応する種々の抗原ペプチド配列を同時にスクリーニングするためにも使用できる。上記キットはまた、たとえばヒトまたは動物から得た、多くの試料を同時にスクリーニングし、それによっていずれのヒトまたは動物が特定の免疫原に対して免疫原性応答を示すかを予測するためのハイスループットスクリーニング法においても使用できる。抗原ペプチド配列の数とヒトまたは動物の数の任意の実際的な組合せが可能である。

以下の実施例は本発明の実施形態を説明するものである。以下の実施例において開示される技術が、本発明の実施において良好に機能することが本発明者によって発見された技術を表すことは当業者に認識される。しかし、当業者は、本開示を考慮して、開示される特定実施形態に多くの変更を加えることができ、それでもなお本発明の精神と範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果が得られることを認識すべきである。

（実施例１）
Ｍ２特異的抗体の同定
ヒト血清において同定されたＭＡｂの３つを発現する単核細胞またはＢ細胞をクローン集団に希釈し、抗体を産生するように誘導した。抗体を含有する上清を、インフルエンザ株であるインフルエンザＨ３Ｎ２亜型からの完全長Ｍ２Ｅタンパク質で安定にトランスフェクトした２９３ＦＴ細胞への結合に関してスクリーニングした。陽性染色／結合を示した上清を、インフルエンザ株、インフルエンザＨ３Ｎ２亜型からの完全長Ｍ２Ｅタンパク質で安定にトランスフェクトした２９３ＦＴ細胞に関しておよび対照としてベクター単独でトランスフェクトした細胞に関して再びスクリーニングした。

次に、抗体の可変領域を、上清が陽性結合を示したＢ細胞のウエルからレスキュークローニングした。これらの抗体を再構成し、産生するために２９３ＦＴ細胞において一過性トランスフェクションを実施した。再構成した抗体上清を、レスキューされた抗Ｍ２Ｅ抗体を同定するために上記で詳述した完全長Ｍ２Ｅタンパク質で安定にトランスフェクトした２９３ＦＴ細胞への結合に関してスクリーニングした。３つの異なる抗体：８ｉ１０、２１Ｂ１５および２３Ｋ１２を同定した。

抗体２１Ｂ１５、２３Ｋ１２および８Ｉ１０は、Ｍ２タンパク質を安定に発現する２９３−ＨＥＫ細胞の表面に結合したが、ベクターでトランスフェクトした細胞には結合しなかった（図１参照）。加えて、これらの抗体の結合は、５ｍｇ／ｍｌの２４マーのＭ２ペプチドの存在によって競合されなかったが、線状Ｍ２ペプチドに対して生成した対照キメラマウスＶ領域／ヒトＩｇＧ１κ１４Ｃ２抗体（ｈｕ１４Ｃ２）の結合は、Ｍ２ペプチドによって完全に阻害された（図１参照）。これらのデータは、これらの抗体が、線状Ｍ２ｅペプチドと異なり、細胞またはウイルス表面で発現されるＭ２ｅ中に存在する高次構造エピトープに結合することを確認する。

（実施例２）
ヒト抗インフルエンザモノクローナル抗体のウイルス結合
ＵＶ不活化インフルエンザＡ型ウイルス（Ａ／ＰＲ／８／３４）（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、ＰＢＳ中１．２μｇ／ｍｌ、２５μｌ／ウエルで３８４ウエルＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）にまき、４℃で一晩インキュベートした。次に、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、５０μｌ／ウエルのＰＢＳ中１％脱脂粉乳でブロックして、その後室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳによる２回目の洗浄後、３組のＭＡｂを指示された濃度で添加し、プレートを室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳでさらに洗浄した後、各々のウエルに、２５μｌの、ＰＢＳ／１％乳中の１／５０００希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ（Ｐｉｅｒｃｅ）を添加し、プレートを室温で１時間放置した。最終的なＰＢＳ洗浄後、ＨＲＰ基質である１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を２５μｌ／ウエルで添加し、暗所にて室温で反応を進行させた。２５μｌ／ウエルの１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４でアッセイを停止させ、４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）をＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ Ｐｌｕｓプレートリーダーで読み取った。データを１０μｇ／ｍｌでのＭＡｂ ８Ｉ１０結合の吸光度に正規化する。結果を図２Ａおよび２Ｂに示す。

（実施例３）
完全長Ｍ２変異体へのヒト抗インフルエンザモノクローナル抗体の結合
Ｍ２変異体（インビボで高病原性表現型を有するものを含む）を分析のために選択した。配列については図３Ａ参照。

Ｍ２ ｃＤＮＡ構築物をＨＥＫ２９３細胞において一過性にトランスフェクトし、以下のように分析した：一過性トランスフェクタントをＦＡＣＳによって分析するために、１０ｃｍ組織培養プレート上の細胞を０．５ｍｌの細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理し、採取した。１％ＦＢＳ、０．２％ＮａＮ_３を含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中で細胞を洗浄し、１００μｇ／ｍｌのウサギＩｇＧを添加した０．６ｍｌのＦＡＣＳバッファー中に再懸濁した。各々のトランスフェクタントを、０．２ｍｌのＦＡＣＳバッファー中１μｇ／ｍｌの指示されたＭＡｂと混合し、試料当たり５×１０^５〜１０^６細胞とした。細胞をＦＡＣＳバッファーで３回洗浄し、各々の試料を、１μｇ／ｍｌのａｌｅｘａｆｌｕｏｒ（ＡＦ）６４７−抗ヒトＩｇＧ Ｈ＆Ｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有する０．１ｍｌ中に再懸濁した。細胞を再び洗浄し、ＦＡＣＳＣａｎｔｏデバイス（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）でフローサイトメトリーを実施した。データは、Ｍ２−Ｄ２０一過性トランスフェクタントの平均蛍光のパーセンテージとして表わす。変異体結合に関するデータは、２つの実験を代表する。アラニン変異体に関するデータは、標準誤差を伴う３つの別々の実験からの平均読み出しである。結果を図３Ｂおよび３Ｃに示す。

（実施例４）
エピトープブロッキング
ＭＡｂ ８Ｉ１０および２３Ｋ１２が同じ部位に結合するかどうかを決定するために、インフルエンザ株Ａ／ＨＫ／４８３／１９９７配列を示すＭ２タンパク質をＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞株ＤＧ４４において安定に発現させた。細胞解離バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を処理し、採取した。１％ＦＢＳ、０．２％ＮａＮ_３を含有するＰＢＳ（ＦＡＣＳバッファー）中で細胞を洗浄し、１００μｇ／ｍｌのウサギＩｇＧを添加したＦＡＣＳバッファー中に１０^７細胞／ｍｌで再懸濁した。細胞を、１０μｇ／ｍｌのＭＡｂ（または２Ｎ９対照）によって４℃で１時間あらかじめ結合させ、次にＦＡＣＳバッファーで洗浄した。次に、直接結合したＡＦ６４７−８Ｉ１０またはＡＦ６４７−２３Ｋ１２（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ（登録商標）６４７タンパク質標識キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した）を使用して、あらかじめブロックした３つの細胞試料を、試料当たり１０^６細胞について１μｇ／ｍｌで染色した。フローサイトメトリー分析を、ＦＡＣＳＣａｎｔｏを用いて前記のように進行させた。データは、標準誤差を伴う３つの別々の実験からの平均読み出しである。結果を図４に示す。

（実施例５）
Ｍ２変異体およびトランケート型Ｍ２ペプチドへのヒト抗インフルエンザモノクローナル抗体の結合
他のＭ２ペプチド変異体に対するｍＡｂ ８ｉ１０および２３Ｋ１２の交差反応性をＥＬＩＳＡによって評価した。ペプチド配列を表７Ａおよび７Ｂに示す。加えて、同様のＥＬＩＳＡアッセイを用いてＭ２トランケート型ペプチドに対する結合活性を測定した。

簡単に述べると、各々のペプチドを、２５μＬ／ウエルのＰＢＳバッファー中、４℃で一晩、平底３８４ウエルプレート（Ｎｕｎｃ）に２μｇ／ｍＬで被覆した。プレートを３回洗浄し、室温で１時間、１％乳／ＰＢＳでブロックした。３回洗浄した後、ＭＡｂの複数の力価（ＭＡｂ ｔｉｔｅｒｓ）を添加し、室温で１時間インキュベートした。希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ヒト免疫グロブリンＦＣ特異的（Ｐｉｅｒｃｅ）を、３回の洗浄後に各々のウエルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、３回洗浄した。１−Ｓｔｅｐ（商標）Ｕｌｔｒａ−ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ（Ｐｉｅｒｃｅ）を２５μｌ／ウエルで添加し、暗所にて室温で反応を進行させた。２５μｌ／ウエルの１Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４でアッセイを停止させ、４５０ｎｍの吸光度（Ａ４５０）をＳｐｅｃｔｒｏＭａｘ Ｐｌｕｓプレートリーダーで読み取った。結果を表７Ａおよび７Ｂに示す。

他の実施形態
本明細書において引用したすべての公表文献および特許出願は、各々の公表文献または特許出願が具体的且つ個別に参照により組み込まれると指示されているかのごとくに、参照により本明細書に組み込まれる。

前記発明を、理解の明瞭さのために説明と実施例によってある程度詳細に述べたが、付属の特許請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなくそれらに特定の変更および修正を行い得ることは、本発明の教示を考慮して当業者には容易に明白である。

Claims (1)

1. 明細書中に記載の発明。