JP2014141430A - AGENT FOR INHIBITING PRODUCTION OF RhoGDIβ PROTEIN, AGENT FOR CONTROLLING DIVISION DIRECTION OF EPIDERMAL CELL, SKIN LOTION, AND METHOD FOR CONTROLLING DIVISION DIRECTION OF EPIDERMAL CELL - Google Patents
AGENT FOR INHIBITING PRODUCTION OF RhoGDIβ PROTEIN, AGENT FOR CONTROLLING DIVISION DIRECTION OF EPIDERMAL CELL, SKIN LOTION, AND METHOD FOR CONTROLLING DIVISION DIRECTION OF EPIDERMAL CELL Download PDFInfo
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Abstract
Description
本発明は、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤、皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤、皮膚外用剤、及び、皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法に関する。 The present invention relates to a production inhibitor of RhoGDIβ protein, a skin epidermal cell division direction control agent, a skin external preparation, and a skin epidermal cell division direction control method.
脊椎動物や被子植物などの高等生物は、外界からの刺激及び体内の様々な生理現象に対応して恒常性を維持している。そして、高等生物は、恒常性を維持すべく、神経系や内分泌系などの情報伝達機構を備えている。情報伝達機構においては、細胞内の情報伝達物質としてのＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）などが、体内の様々な情報伝達の役割を担っている。 Higher organisms such as vertebrates and angiosperms maintain homeostasis in response to external stimuli and various physiological phenomena in the body. Higher organisms are equipped with information transmission mechanisms such as the nervous system and endocrine system in order to maintain homeostasis. In the information transmission mechanism, GTP-binding protein (G protein) as an intracellular information transmission substance plays a role in various information transmission in the body.
ＧＴＰ結合タンパク質（Ｇタンパク質）としては、三量体Ｇタンパク質及び低分子量Ｇタンパク質が知られており、このうちの低分子量Ｇタンパク質としては、例えば、Ｒｈｏタンパク質などが知られている。 Trimeric G protein and low molecular weight G protein are known as GTP binding protein (G protein), and Rho protein and the like are known as low molecular weight G protein.
Ｒｈｏタンパク質は、グアノシン三リン酸（ＧＴＰ）結合型（活性期）及びグアノシン二リン酸（ＧＤＰ）結合型（不活性期）の２つの型になることが知られている。この２つの型を繰り返すことを制御するタンパク質の１種として、ＧＤＰ解離抑制因子（ＧＤＩ）が知られている。 Rho proteins are known to be of two types: guanosine triphosphate (GTP) -bound (active phase) and guanosine diphosphate (GDP) -bound (inactive phase). A GDP dissociation inhibitor (GDI) is known as one type of protein that controls the repetition of these two types.
Ｒｈｏタンパク質の型を制御するＧＤＰ解離抑制因子（ＧＤＩ）は、例えば、ＧＤＰ結合型のＲｈｏタンパク質に選択的に結合することにより、ＧＤＰ結合型Ｒｈｏタンパク質を細胞内にとどめて、Ｒｈｏタンパク質がＧＴＰ結合型へ変化することを防止するものとして知られている（非特許文献１）。
そして、ＧＤＰ解離抑制因子（ＧＤＩ）としては、例えば、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質などが知られている。
The GDP dissociation inhibitor (GDI) that controls the type of Rho protein, for example, selectively binds to the GDP-bound Rho protein, so that the GDP-bound Rho protein remains in the cell, and the Rho protein is bound to GTP. It is known as what prevents changing to a type | mold (nonpatent literature 1).
And as a GDP dissociation inhibitory factor (GDI), RhoGDI (beta) protein etc. are known, for example.
ＲｈｏＧＤＩβタンパク質に関しては、例えば、非特許文献２に記載されているように、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の分断化産物であるΔＮ（１−１９）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質が、ガン細胞の細胞死を誘導することなどが知られているものの、生物体内における他の様々な作用が必ずしも十分に明らかにされているわけではない。 Regarding RhoGDIβ protein, for example, as described in Non-Patent Document 2, ΔN (1-19) RhoGDIβ protein, which is a fragmented product of RhoGDIβ protein, is known to induce cell death of cancer cells. However, various other actions in living organisms are not always well clarified.
ＲｈｏＧＤＩβタンパク質は、生物体内の様々な組織においてＲｈｏタンパク質と結合し、細胞内の情報伝達をしていると考えられていることから、例えば、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制すれば、生体における好ましくない生理現象を抑制することができると考えられる。しかしながら、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制できるものは、現状、あまり知られていない。
そこで、生体における生理現象を制御すべく、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制できるものが要望されている。
Since RhoGDIβ protein is considered to bind to Rho protein in various tissues in the organism and transmit intracellular information, for example, if the production of RhoGDIβ protein is suppressed, unfavorable physiology in the living body It is thought that the phenomenon can be suppressed. However, what can suppress the production of RhoGDIβ protein is not well known at present.
Therefore, in order to control physiological phenomena in the living body, there is a demand for those capable of suppressing the production of RhoGDIβ protein.
本発明は、上記の要望点等に鑑み、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制できるＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤を提供することを課題とする。また、本発明は、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することにより皮膚表皮細胞の分裂方向を制御できる皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤及び皮膚外用剤を提供することを課題とする。さらに、本発明は、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することにより皮膚表皮細胞の分裂方向を制御できる皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法を提供することを課題とする。 This invention makes it a subject to provide the production inhibitor of RhoGDI (beta) protein which can suppress production of RhoGDI (beta) protein in view of said request | requirement point. Another object of the present invention is to provide a skin epidermal cell division direction control agent and an external preparation for skin that can control the division direction of skin epidermal cells by suppressing the production of RhoGDIβ protein. Furthermore, an object of the present invention is to provide a skin epidermal cell division direction control method capable of controlling the division direction of skin epidermal cells by suppressing the production of RhoGDIβ protein.
本発明に係るＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、オウゴン抽出物を含むことを特徴としている。 The production inhibitor of RhoGDIβ protein according to the present invention is characterized by containing an orgon extract.
本発明に係る皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤は、オウゴン抽出物を含むことを特徴としている。オウゴン抽出物により、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することができる。 The agent for controlling the direction of division of skin epidermal cells according to the present invention is characterized by containing an extract of urgon. Ougon extract can suppress the production of RhoGDIβ protein.
本発明に係る皮膚外用剤は、オウゴン抽出物を含むことを特徴としている。 The external preparation for skin according to the present invention is characterized by containing an orgon extract.
本発明に係る皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法は、オウゴン抽出物によって皮膚表皮細胞の分裂方向を制御することを特徴としている。 The method for controlling the direction of division of skin epidermal cells according to the present invention is characterized in that the direction of division of skin epidermal cells is controlled by an extract of Augon.
本発明のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制できるという効果を奏する。
また、本発明の皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤、皮膚外用剤、及び皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法は、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制できるため、皮膚表皮細胞の分裂方向を制御できるという効果を奏する。
The production inhibitor of RhoGDIβ protein of the present invention has an effect that production of RhoGDIβ protein can be suppressed.
Further, the agent for controlling the direction of division of skin epidermal cells, the external preparation for skin, and the method for controlling the direction of division of skin epidermal cells according to the present invention can suppress the production of RhoGDIβ protein, so that the division direction of skin epidermal cells can be controlled. Play.
以下に、本発明に係るＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤の実施形態について説明する。 Below, embodiment of the production inhibitor of RhoGDI (beta) protein which concerns on this invention is described.
本実施形態のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、オウゴン抽出物を含むものである。 The RhoGDIβ protein production inhibitor of the present embodiment contains a hornon extract.
前記産生抑制剤は、オウゴン抽出物を含むため、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することができる。
ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することにより、例えば、生物体内において、
ＲｈｏＧＤＩβが引き起こす、アポトーシス（細胞死）といった好ましくない生理現象を抑制することができる。また、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することにより、例えば、後述するように、皮膚表皮細胞の分裂方向を制御することができる。
Since the production inhibitor includes a hornon extract, production of RhoGDIβ protein can be suppressed.
By inhibiting the production of RhoGDIβ protein, for example, in an organism,
Unfavorable physiological phenomena such as apoptosis (cell death) caused by RhoGDIβ can be suppressed. Moreover, by suppressing the production of RhoGDIβ protein, for example, as described later, the division direction of skin epidermis cells can be controlled.
前記オウゴン抽出物は、シソ科タツミナソウ属に属するコガネバナ（学名：Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ Ｇｅｏｒｇｉ.）の根を抽出溶媒で抽出することにより得られるものである。 The Ogon extract is obtained by extracting the roots of Scutellaria baicalensis Georgi belonging to the family Lamiaceae, with an extraction solvent.
前記オウゴンの抽出部分としては、コガネバナの根であれば、特に限定されないが、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生をより抑制できるという点で、根の周皮を取り除いた部分が好ましい。 The extraction part of the ogon is not particularly limited as long as it is root of Scutella niger, but a part from which the pericyte of the root is removed is preferable in that production of RhoGDIβ protein can be further suppressed.
前記オウゴン抽出物は、通常、前記抽出溶媒による抽出液、その希釈液、その濃縮液、又はその抽出溶媒を除去した乾燥物などの態様になり得る。具体的には、各抽出物は、例えば、溶液状、ペースト状、ゲル状、粉末状などの態様になり得る。 The Augon extract can usually be in the form of an extract with the extraction solvent, a diluted solution thereof, a concentrated solution thereof, or a dried product from which the extraction solvent has been removed. Specifically, each extract can be in the form of, for example, a solution, a paste, a gel, or a powder.
前記抽出溶媒としては、水、又は、メタノール、エタノール、プロパノールなどの脂肪族１価アルコール；グリセリン、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコールなどの脂肪族多価アルコール；アセトンなどのケトン類；ジエチルエーテル、ジオキサンなどのエーテル類；アセトニトリルなどのニトリル類；酢酸エチルなどのエステル類；キシレン、ベンゼン、トルエンなどの芳香族類；クロロホルムなどハロゲン化アルキル類などの有機溶媒が挙げられる。
これらの抽出溶媒としては、１種の単独物、又は、２種以上の混合物が採用され得る。２種以上の抽出溶媒が混合されたものにおける混合比は、特に限定されるものではなく、適宜調整される。
Examples of the extraction solvent include water or aliphatic monohydric alcohols such as methanol, ethanol, and propanol; aliphatic polyhydric alcohols such as glycerin, propylene glycol, and 1,3-butylene glycol; ketones such as acetone; And ethers such as dioxane; nitriles such as acetonitrile; esters such as ethyl acetate; aromatics such as xylene, benzene and toluene; and organic solvents such as halogenated alkyls such as chloroform.
As these extraction solvents, one kind of a single substance or a mixture of two or more kinds may be employed. The mixing ratio in the mixture of two or more extraction solvents is not particularly limited, and is appropriately adjusted.
前記抽出溶媒としては、少なくとも水を含む水含有抽出溶媒が好ましい。 The extraction solvent is preferably a water-containing extraction solvent containing at least water.
前記オウゴン抽出物の抽出溶媒としては、脂肪族１価アルコールと水とを含む抽出溶媒が好ましく、脂肪族１価アルコールとしてのエタノールと水とを含む抽出溶媒がより好ましい。
前記オウゴン抽出物の抽出溶媒としては、脂肪族１価アルコールと水とを、脂肪族アルコール：水＝７：３〜３：７の容量比で混合した抽出溶媒が好ましく、エタノールと水とをエタノール：水＝７：３〜３：７の容量比で混合した抽出溶媒がより好ましい。
As the extraction solvent for the ougon extract, an extraction solvent containing an aliphatic monohydric alcohol and water is preferable, and an extraction solvent containing ethanol and water as an aliphatic monohydric alcohol is more preferable.
As the extraction solvent for the ougon extract, an extraction solvent obtained by mixing an aliphatic monohydric alcohol and water in a volume ratio of aliphatic alcohol: water = 7: 3 to 3: 7 is preferable. Ethanol and water are mixed with ethanol. : Extraction solvent mixed at a volume ratio of water = 7: 3 to 3: 7 is more preferable.
前記抽出の方法としては、特に制限されず、従来公知の一般的な抽出方法が採用される。
前記抽出においては、抽出原料としての各植物の抽出部位が、そのまま若しくは乾燥されて用いられ得る。
前記抽出における抽出溶媒量は、通常、抽出原料の５〜１５倍量（質量比）であり、前記抽出における抽出温度は、通常、２０℃〜８０℃であり、前記抽出における抽出時間は、通常、２時間〜３日間である。抽出後の粗抽出物に対しては、必要に応じて、適宜、ろ過、脱臭、脱色などの精製処理が施される。
The extraction method is not particularly limited, and a conventionally known general extraction method is employed.
In the said extraction, the extraction site | part of each plant as an extraction raw material can be used as it is or dried.
The extraction solvent amount in the extraction is usually 5 to 15 times the mass of the extraction raw material (mass ratio), the extraction temperature in the extraction is usually 20 ° C. to 80 ° C., and the extraction time in the extraction is usually 2 hours to 3 days. The crude extract after extraction is appropriately subjected to purification treatment such as filtration, deodorization, and decolorization as necessary.
前記ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、オウゴン抽出物以外の成分を含んでいてもよい。 The production inhibitor of RhoGDIβ protein may contain a component other than the ougon extract.
なお、前記オウゴン抽出物としては、例えば、化粧料用原料、食品原料の用途のために市販されているものが採用され得る。 In addition, as said ougon extract, what is marketed for the use of the raw material for cosmetics and a foodstuff raw material can be employ | adopted, for example.
前記ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤に含まれる上記の抽出物の濃度は、特に限定されず、該濃度としては、例えば、乾燥物換算で０．００１〜５．０質量％が挙げられる。
なお、乾燥物換算とは、抽出物から抽出溶媒を除いた残渣である乾燥物の質量に換算することである。
The density | concentration of said extract contained in the production inhibitor of the said RhoGDI (beta) protein is not specifically limited, As this density | concentration, 0.001-5.0 mass% is mentioned, for example in dry matter conversion.
In addition, dry matter conversion is converting into the mass of the dry matter which is a residue remove | excluding the extraction solvent from the extract.
前記ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、通常、液状である。また、前記ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、上記の抽出物以外に、水やエタノールなどの溶媒、界面活性剤、防腐剤などを含み得る。 The production inhibitor of RhoGDIβ protein is usually liquid. In addition, the RhoGDI β protein production inhibitor may contain a solvent such as water and ethanol, a surfactant, a preservative, and the like in addition to the above extract.
前記ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、例えば、前記オウゴン抽出物の濃度が乾燥物換算で１μｇ／ｍＬ〜１０００μｇ／ｍＬとなるように希釈されて使用される。 The RhoGDI β protein production inhibitor is used, for example, diluted so that the concentration of the Augon extract is 1 μg / mL to 1000 μg / mL in terms of dry matter.
前記ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、例えば、該産生抑制剤を生物組織へ注入すること、生物組織へ塗布すること、動物に摂食させること等によって使用される。 The production inhibitor of RhoGDIβ protein is used, for example, by injecting the production inhibitor into a biological tissue, applying it to a biological tissue, feeding an animal, or the like.
次に、本発明の皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤の実施形態について説明する。 Next, an embodiment of the agent for controlling the direction of division of skin epidermal cells of the present invention will be described.
本実施形態の皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤は、前記オウゴン抽出物を少なくとも含むものである。
前記分裂方向制御剤は、前記オウゴン抽出物を含むため、皮膚表皮細胞の分裂方向を制御することができる。
The agent for controlling the direction of division of skin epidermal cells according to the present embodiment contains at least the above-described extract of Augon.
Since the division direction controlling agent contains the ougon extract, it can control the division direction of skin epidermal cells.
前記皮膚表皮細胞は、皮膚の外方側にある表皮を構成する細胞である。表皮は、生体を防御したり、水分の過剰な蒸発を防いだりするバリア機能を有している。表皮は、通常、最も内方側にある基底層と、該基底層から外方側へ向かって順に配されている有棘層と顆粒層と角質層との４層で構成されている。
前記皮膚表皮細胞は、通常、基底層で生じ、基底層から外方側へ角化過程を経ながら押し出され、最外層の角質層を形成したあと、最終的には角質層から剥がれ落ちる。
また、前記皮膚表皮細胞は、表皮におけるバリア機能を維持するため、基底層で生じ角質層に至って剥がれ落ちるという代謝のサイクルを、通常、約４週間かけて繰り返す。
The skin epidermal cells are cells constituting the epidermis on the outer side of the skin. The epidermis has a barrier function that protects the living body and prevents excessive evaporation of moisture. The epidermis is usually composed of four layers: a basal layer that is the innermost side, and a spiny layer, a granule layer, and a stratum corneum that are arranged in order from the basal layer to the outer side.
The skin epidermis cells usually occur in the basal layer, and are pushed out from the basal layer through a keratinization process to form the outermost stratum corneum, and finally peel off from the stratum corneum.
In addition, the skin epidermis cells usually repeat a metabolic cycle that occurs in the basal layer and peels off to the stratum corneum in order to maintain the barrier function in the epidermis over about 4 weeks.
前記分裂方向制御剤は、前記オウゴン抽出物を含むため、基底層にて細胞分裂する皮膚表皮細胞の分裂方向を制御することができる。
即ち、前記オウゴン抽出物の存在下にて基底層の皮膚表皮細胞が分裂すると、皮膚表皮細胞の分裂方向がより一方向に近くなる。皮膚表皮細胞の分裂方向がより一方向に近くなることにより、角質層における細胞の配列がより整ったものとなり得るため、肌のキメが整うことになり得る。
Since the division direction controlling agent contains the Ougon extract, it can control the division direction of skin epidermal cells that divide in the basal layer.
That is, when the skin epidermis cells of the basal layer divide in the presence of the ougon extract, the division direction of the skin epidermis cells becomes closer to one direction. When the direction of division of the skin epidermal cells is closer to one direction, the cell arrangement in the stratum corneum can be more ordered, and the texture of the skin can be adjusted.
詳しくは、前記分裂方向制御剤は、前記オウゴン抽出物を含むため、皮膚の表皮において、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することができる。
ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生が抑制されると、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の分断化産物であるΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生も抑制される。
ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質は、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質が１９番目のアスパラギン酸部位で分断されＮ末欠損することにより産生し、特に紫外線の照射により産生が促進される。
ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質は、ＲｈｏファミリーＧタンパク質の１種であるＣｄｃ４２と結合する作用を有している。Ｃｄｃ４２は、様々な細胞の形態形成などの過程で重要な役割を担っているタンパク質であり、皮膚表皮細胞の分裂においても、細胞の形態形成に関わっている。詳しくは、Ｃｄｃ４２は、皮膚表皮細胞が２つに分裂する際に、通常、細胞の核を通る直線に沿うように２箇所に配される。そして、細胞は、２つのＣｄｃ４２がその直線に沿って互いに離れるように分裂する。即ち、その直線の延在方向が分裂方向となる。従って、Ｃｄｃ４２がΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質と結合すること等によって、Ｃｄｃ４２の機能が阻害されると、細胞の分裂方向がよりランダムなものとなり得る。
このように、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質が増えると、皮膚表皮細胞の分裂方向の制御に関わっているＣｄｃ４２とΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質との結合が起こりやすくなり、分裂する皮膚表皮細胞のＣｄｃ４２の機能を阻害しやすくなる。従って、細胞の分裂方向がよりランダムなものとなり得る。
これに対して、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制すべく、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することにより、分裂する皮膚表皮細胞でＣｄｃ４２の機能阻害が抑制され、皮膚表皮細胞の分裂方向がより一方向に近くなる。
Specifically, since the agent for controlling the division direction contains the extract of Ougon, production of RhoGDIβ protein can be suppressed in the epidermis of the skin.
When the production of RhoGDIβ protein is suppressed, the production of ΔN (1-19) RhoGDIβ protein, which is a fragmented product of RhoGDIβ protein, is also suppressed.
ΔN (1-19) RhoGDIβ protein is produced when the RhoGDIβ protein is cleaved at the 19th aspartic acid site and is deficient in the N-terminal, and production is particularly promoted by irradiation with ultraviolet rays.
ΔN (1-19) RhoGDIβ protein has an action of binding to Cdc42, which is one of Rho family G proteins. Cdc42 is a protein that plays an important role in various processes such as cell morphogenesis, and is also involved in cell morphogenesis in the division of skin epidermal cells. Specifically, when the skin epidermis cell divides into two, Cdc42 is usually arranged at two locations along a straight line passing through the nucleus of the cell. The cell then divides so that the two Cdc42 are separated from each other along the straight line. That is, the extending direction of the straight line becomes the splitting direction. Therefore, if the function of Cdc42 is inhibited, for example, by binding Cdc42 to ΔN (1-19) RhoGDIβ protein, the cell division direction can be made more random.
Thus, when ΔN (1-19) RhoGDIβ protein increases, binding between Cdc42 and ΔN (1-19) RhoGDIβ protein, which is involved in controlling the division direction of skin epidermal cells, is likely to occur, and the skin epidermis that divides It becomes easy to inhibit the function of Cdc42 of a cell. Therefore, the cell division direction can be more random.
On the other hand, by inhibiting the production of RhoGDIβ protein in order to suppress the production of ΔN (1-19) RhoGDIβ protein, the function inhibition of Cdc42 is suppressed in the dividing skin epidermal cells, and the direction of division of the skin epidermal cells Is closer to one direction.
前記分裂方向制御剤は、通常、液状である。また、前記オウゴン抽出物を乾燥物換算で０．００１〜５．０質量％含む。また、上記の抽出物以外に、ｐＨ緩衝剤、水などの溶媒、界面活性剤、防腐剤などを含み得る。 The splitting direction controlling agent is usually liquid. Moreover, the said Augon extract is contained 0.001-5.0 mass% in conversion of a dry matter. In addition to the above extract, a pH buffer, a solvent such as water, a surfactant, a preservative, and the like may be included.
前記分裂方向制御剤は、例えば、上記の抽出物が乾燥物換算で上述した濃度範囲となるように、希釈されて使用される。 The splitting direction controlling agent is used after being diluted, for example, so that the above extract is in the above-described concentration range in terms of dry matter.
前記分裂方向制御剤は、例えば、該分裂方向制御剤を皮膚表皮細胞へ注入すること、又は、皮膚表皮細胞へ塗布すること等によって使用される。 The division direction controlling agent is used by, for example, injecting the division direction controlling agent into skin epidermal cells or applying it to skin epidermal cells.
続いて、本発明の皮膚外用剤の実施形態について説明する。
本実施形態の皮膚外用剤は、前記オウゴン抽出物を少なくとも含むものである。
また、前記皮膚外用剤は、ヒトの皮膚表面に接触されて使用されるものである。
Then, embodiment of the skin external preparation of this invention is described.
The external preparation for skin according to the present embodiment contains at least the Ougon extract.
The external preparation for skin is used in contact with the human skin surface.
前記皮膚外用剤は、前記オウゴン抽出物を含むため、上述したように、皮膚表皮細胞の分裂方向を制御することができる。 Since the external preparation for skin contains the ougon extract, as described above, the division direction of skin epidermal cells can be controlled.
前記皮膚外用剤は、上記の抽出物以外に、前記分裂方向制御剤と同様に、ｐＨ緩衝剤、水などの溶媒、界面活性剤、防腐剤、油類、多価アルコール類、水溶性高分子化合物などを含み得る。 In addition to the above extract, the external preparation for skin is a pH buffer, a solvent such as water, a surfactant, an antiseptic, an oil, a polyhydric alcohol, a water-soluble polymer, in the same manner as the splitting direction control agent. It may contain compounds and the like.
皮膚外用剤の処方例を以下にしめす。
＜クリームの処方例＞
配合成分 配合量（質量％）
オウゴン抽出物（乾燥物1.5%含有） 3.0
マイクロクリスタリンワックス 0.5
流動パラフィン 2.0
ミリスチン酸オクチルドデシル 2.0
オリーブ油 5.0
親油型モノステアリン酸グリセリン 3.5
モノステアリン酸ポリオキシエチレン 0.5
モノステアリン酸ソルビタン 1.5
メチルポリシロキサン 0.4
セタノール 0.25
1,3-ブチレングリコール 5.0
グリセリン 8.0
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残量
The following are examples of prescription skin preparations.
<Prescription example of cream>
Compounding ingredients Compounding amount (% by mass)
Ougon extract (containing 1.5% dry matter) 3.0
Microcrystalline wax 0.5
Liquid paraffin 2.0
Octyldodecyl myristate 2.0
Olive oil 5.0
Lipophilic glyceryl monostearate 3.5
Polyoxyethylene monostearate0.5
Sorbitan monostearate 1.5
Methyl polysiloxane 0.4
Cetanol 0.25
1,3-butylene glycol 5.0
Glycerin 8.0
Perfume Appropriate amount Preservative Appropriate amount of purified water Remaining amount
＜ジェルの処方例＞
配合成分 配合量（質量％）
オウゴン抽出物（乾燥物1.5%含有） 3.0
酢酸トコフェロール 0.1
1,3-ブチレングリコール 6.0
グリセリン 2.0
アクリル酸・メタクリル酸アルキル共重合体 0.2
クエン酸 0.01
クエン酸ナトリウム 0.03
水酸化ナトリウム 0.08
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残量
<Gel prescription example>
Compounding ingredients Compounding amount (% by mass)
Ougon extract (containing 1.5% dry matter) 3.0
Tocopherol acetate 0.1
1,3-butylene glycol 6.0
Glycerin 2.0
Acrylic acid / alkyl methacrylate copolymer 0.2
Citric acid 0.01
Sodium citrate 0.03
Sodium hydroxide 0.08
Perfume Appropriate amount Preservative Appropriate amount of purified water Remaining amount
＜エッセンスの処方例＞
配合成分 配合量（質量％）
オウゴン抽出物（乾燥物1.5%含有） 3.0
1,3-ブチレングリコール 5.0
グリセリン 4.0
ヒアルロン酸ナトリウム 0.1
エタノール 3.0
クエン酸 0.1
クエン酸ナトリウム 0.1
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残量
<Example of Essence Formula>
Compounding ingredients Compounding amount (% by mass)
Ougon extract (containing 1.5% dry matter) 3.0
1,3-butylene glycol 5.0
Glycerin 4.0
Sodium hyaluronate 0.1
Ethanol 3.0
Citric acid 0.1
Sodium citrate 0.1
Perfume Appropriate amount Preservative Appropriate amount of purified water Remaining amount
＜乳液の処方例＞
配合成分 配合量（質量％）
オウゴン抽出物（乾燥物1.5%含有） 3.0
サフラワー油 3.0
オリーブ油 3.0
モノステアリン酸ポリオキシエチレンソルビタン 1.0
モノステアリン酸ソルビタン 0.5
ステアリンアルコール 0.4
セタノール 0.6
1,3-ブチレングリコール 3.0
グリセリン 5.0
ヒアルロン酸ナトリウム 0.5
クエン酸 0.1
クエン酸ナトリウム 0.5
香料 適量
防腐剤 適量
精製水 残量
<Examples of emulsion formulation>
Compounding ingredients Compounding amount (% by mass)
Ougon extract (containing 1.5% dry matter) 3.0
Safflower oil 3.0
Olive oil 3.0
Polyoxyethylene sorbitan monostearate1.0
Sorbitan monostearate0.5
Stearic alcohol 0.4
Cetanol 0.6
1,3-butylene glycol 3.0
Glycerin 5.0
Sodium hyaluronate 0.5
Citric acid 0.1
Sodium citrate 0.5
Perfume Appropriate amount Preservative Appropriate amount of purified water Remaining amount
前記皮膚外用剤は、通常、オウゴン抽出物を乾燥物換算で０．００１〜5質量％含む。 The external preparation for skin usually contains 0.001 to 5% by mass of an argon extract in terms of dry matter.
前記皮膚外用剤は、例えば、液状、ジェル状、乳液状、クリーム状、固形状などの態様になる。また、前記皮膚外用剤は、例えば、皮膚表面と接するシート状の層を少なくとも備え、該層がオウゴン抽出物を含むように構成されたシート状物の態様であってもよい。 The skin external preparation is in the form of, for example, liquid, gel, emulsion, cream or solid. In addition, the external preparation for skin may be, for example, an embodiment of a sheet-like material configured to include at least a sheet-like layer in contact with the skin surface, and the layer includes an ougone extract.
なお、前記皮膚外用剤は、例えば、ヒトの皮膚に塗布又は貼付されることにより使用される。
また、前記皮膚外用剤は、例えば、化粧品、医薬部外品、又は医薬品などの分野において使用される。
In addition, the said skin external preparation is used by apply | coating or sticking to human skin, for example.
Moreover, the said skin external preparation is used in field | areas, such as cosmetics, a quasi-drug, or a pharmaceutical, for example.
さらに、本発明の皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法の実施形態について説明する。 Furthermore, an embodiment of the skin epidermal cell division direction control method according to the present invention will be described.
本実施形態の皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法は、オウゴン抽出物によって皮膚表皮細胞の分裂方向を制御するものである。 The method for controlling the direction of division of skin epidermal cells according to the present embodiment controls the direction of division of skin epidermal cells using a hornon extract.
前記分裂方向制御方法は、例えば、生体において実施することができる。
前記分裂方向制御方法は、ヒトの生体又はヒト以外の動物の生体において実施することが好ましく、ヒトの生体において、美容上の目的で、非治療的に実施することがより好ましい。
The division direction control method can be performed in a living body, for example.
The division direction control method is preferably performed in a human body or a non-human animal body, and more preferably non-therapeutically in a human body for cosmetic purposes.
前記分裂方向制御方法は、例えば、オウゴン抽出物を含む上記の分裂方向制御剤を皮膚表皮組織に注入する処置を施すことにより実施することができる。 The division direction control method can be carried out, for example, by applying a treatment for injecting the above-mentioned division direction control agent containing an orgon extract into skin epidermis tissue.
また、前記分裂方向制御方法は、例えば、オウゴン抽出物を含む上記の皮膚外用剤を、皮膚の表皮組織（角質層など）に塗布することにより実施することができる。 Moreover, the said division | segmentation direction control method can be implemented by apply | coating said skin external preparation containing an orgon extract to the epidermis tissue (keratin layer etc.) of skin, for example.
前記分裂方向制御方法においては、前記オウゴン抽出物を上述したように乾燥物換算で適当な濃度に希釈すべく、希釈液を用いることができる。希釈液としては、特に限定されるものではなく、例えば、水、生理食塩水、表皮細胞の培養液などを用いることができる。 In the division direction control method, a dilute solution can be used to dilute the Augon extract to an appropriate concentration in terms of dry matter as described above. The diluent is not particularly limited, and for example, water, physiological saline, epidermal cell culture solution, or the like can be used.
前記皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法によれば、前記オウゴン抽出物によって皮膚表皮細胞においてＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制することができる。従って、上述したように、皮膚表皮細胞の分裂方向がより一方向に近くなり、角質層における細胞の配列がより整ったものとなり得るため、肌のキメが整うことになり得る。 According to the method for controlling the direction of division of skin epidermis cells, production of RhoGDIβ protein in skin epidermis cells can be suppressed by the ougon extract. Therefore, as described above, the skin epidermal cell division direction becomes closer to one direction, and the cell arrangement in the stratum corneum can be more arranged, so that the texture of the skin can be adjusted.
本実施形態のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤、皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤、皮膚外用剤、及び皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法は、上記例示の通りであるが、本発明は、上記例示のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤、皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤、皮膚外用剤、及び皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法に限定されるものではない。また、本発明では、一般のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤、皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤、皮膚外用剤、及び皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法において採用される種々の形態を、本発明の効果を損ねない範囲で採用することができる。 The RhoGDIβ protein production inhibitor, skin epidermal cell division direction control agent, skin external preparation, and skin epidermal cell division direction control method of the present embodiment are as exemplified above, but the present invention is exemplified above. It is not limited to RhoGDIβ protein production inhibitor, skin epidermal cell division direction control agent, skin external preparation, and skin epidermal cell division direction control method. Further, in the present invention, various forms employed in general RhoGDIβ protein production inhibitors, skin epidermal cell division direction control agents, skin external preparations, and skin epidermal cell division direction control methods are used in the effects of the present invention. Can be employed within a range that does not impair the process.
次に、実施例を挙げて本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。 Next, although an Example is given and this invention is demonstrated in more detail, this invention is not limited to these.
（実施例）
下記のようにして、オウゴン抽出物を製造した。
即ち、コガネバナ（学名：Ｓｃｕｔｅｌｌａｒｉａ ｂａｉｃａｌｅｎｓｉｓ Ｇｅｏｒｇｉ.）の根（オウゴン）の周皮を取り除いたものを乾燥して細かく砕いたもの２０ｇに５０容量％エタノール水溶液２００ｍＬを加え、室温（２０℃）にて５日間抽出操作をおこない、さらにろ過処理を行うことにより、オウゴン抽出物を製造した。
このオウゴン抽出物は、減圧乾燥によって抽出溶媒を除去したあとの乾燥物質量から計算すると、乾燥物を１．２質量％含むものであった。
(Example)
Ougon extract was produced as follows.
That is, 200 mL of a 50 vol% aqueous ethanol solution was added to 20 g of a dried and finely ground one obtained by removing the periculate of the root of the stag beetle (scientific name: Scutellaria baicalensis Georgi ), and then added at room temperature (20 ° C.). An extraction operation was carried out for 1 day, and further a filtration treatment was carried out to produce an orgon extract.
When calculated from the amount of dry substance after the extraction solvent was removed by drying under reduced pressure, this Ougon extract contained 1.2% by mass of the dried product.
＜紫外線照射によるΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生促進について＞
まず、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の分断化産物であるΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生が、紫外線の照射によって促されることを下記の方法によって確認した。
<Promoting the production of ΔN (1-19) RhoGDIβ protein by UV irradiation>
First, it was confirmed by the following method that the production of ΔN (1-19) RhoGDIβ protein, which is a fragmented product of RhoGDIβ protein, was promoted by ultraviolet irradiation.
紫外線（ＵＶＢ）を照射した正常ヒト表皮細胞におけるΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生をWesternBlotting法（Immunoblot（ＩＢ）法、電気泳動法）により下記のようにして確認した。
正常ヒト表皮細胞としては、ＤＳファーマ社製の製品名「ＫＪＢ−１００」を使用した。表皮角化細胞用培地（Lonza社製、製品名「KGM-Gold Bullet kit」）において正常ヒト表皮細胞を３７℃、５％ＣＯ2濃度の条件下で前培養した。
次いで、前培養した正常ヒト表皮細胞を100mm dishに播き、３日後の細胞にＵＶＢを照射した。ＵＶＢ照射条件は、３０ｍＪ／ｃｍ2とした。その後、１日目、３日目、８日目に細胞を回収した。
なお、コントロールとして、紫外線未照射細胞も同様に準備した。
ＵＶＢを照射した細胞、及び、コントロールとしての紫外線未照射細胞をセルスクレーパーによってディッシュから剥ぎ取って回収し、回収したものを３０００ｒｐｍ、５分間の条件で遠心分離することにより上清液を取り除いた。さらに、リン酸緩衝生理食塩水ＰＢＳ（−）（−は、Ｃａイオン、Ｍｇイオンを含まないことを表す）で洗浄処理を行い、遠心分離後、上清液を取り除き、細胞を−８０℃で保存した。
WesternBlotting法においては、−８０℃で保存した細胞に、SDS-Sample bufferを２０μＬ加え、評価用サンプルを調製した。また、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質検出用抗体としては、D4-GDI Mm Ab（Active Motif ＃40941）を使用した。ＲｈｏＧＤＩβタンパク質抗体としては、Ly GDI（C-20）Goat Ab（Santa Cruz sc-6047）を使用し、ＲｈｏＧＤＩαタンパク質抗体としては、RhoGDI（A-20）Rabbit Ab（Santa Cruz sc-360）を使用した。そして、これら抗体と評価用サンプルとを混合した後に、電気泳動することにより、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質、及び、ＲｈｏＧＤＩαタンパク質の産生の有無を確認した。
Production of ΔN (1-19) RhoGDIβ protein in normal human epidermal cells irradiated with ultraviolet rays (UVB) was confirmed by the Western blotting method (Immunoblot (IB) method, electrophoresis method) as follows.
As normal human epidermal cells, the product name “KJB-100” manufactured by DS Pharma was used. Normal human epidermal cells were pre-cultured in a medium for epidermal keratinocytes (Lonza, product name “KGM-Gold Bullet kit”) under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 concentration.
Subsequently, precultured normal human epidermal cells were seeded in a 100 mm dish, and the cells after 3 days were irradiated with UVB. The UVB irradiation condition was 30 mJ / cm 2 . Thereafter, cells were collected on the first day, the third day, and the eighth day.
As a control, UV-irradiated cells were similarly prepared.
Cells irradiated with UVB and unirradiated UV rays as a control were removed from the dish by a cell scraper and collected, and the collected supernatant was removed by centrifugation at 3000 rpm for 5 minutes. Further, washing with phosphate buffered saline PBS (-) (-indicates that Ca ions and Mg ions are not included) was performed. After centrifugation, the supernatant was removed, and the cells were removed at -80 ° C. saved.
In the WesternBlotting method, 20 μL of SDS-Sample buffer was added to cells stored at −80 ° C. to prepare samples for evaluation. Moreover, D4-GDI Mm Ab (Active Motif # 40941) was used as an antibody for detecting ΔN (1-19) RhoGDIβ protein. Ly GDI (C-20) Goat Ab (Santa Cruz sc-6047) was used as the RhoGDIβ protein antibody, and RhoGDI (A-20) Rabbit Ab (Santa Cruz sc-360) was used as the RhoGDIα protein antibody. . And after mixing these antibodies and the sample for evaluation, the presence or absence of the production | generation of (DELTA) N (1-19) RhoGDI (beta) protein, RhoGDI (beta) protein, and RhoGDI (alpha) protein was confirmed.
上記のごとき方法によって各Ｒｈｏタンパク質を電気泳動させた結果を図１に示す。図１における上段の結果は、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質を特異的に検出する抗体を用いた結果で、中段の結果は、ＲｈoＧＤＩβタンパク質（ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質も含む）を検出する抗体を用いた結果である。
ＵＶＢ照射後、１、３日目の正常ヒト表皮細胞において、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生が確認された。
The result of electrophoresis of each Rho protein by the method as described above is shown in FIG. The upper result in FIG. 1 is a result using an antibody that specifically detects ΔN (1-19) RhoGDIβ protein, and the middle result is a RhoGDIβ protein (including ΔN (1-19) RhoGDIβ protein). It is the result using the antibody to do.
Production of ΔN (1-19) RhoGDIβ protein was confirmed in normal human epidermal cells on days 1 and 3 after UVB irradiation.
＜ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の細胞分裂方向への関与を実証する試験＞
続いて、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質が正常ヒト表皮細胞の細胞分裂方向の乱れに関与することを実証すべく、下記の試験を行った。
<Test to demonstrate the involvement of ΔN (1-19) RhoGDIβ protein in the direction of cell division>
Subsequently, the following test was performed to demonstrate that ΔN (1-19) RhoGDIβ protein is involved in disruption of the cell division direction of normal human epidermal cells.
詳しくは、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子を正常ヒト表皮細胞において過剰発現させ、該細胞の細胞分裂方向を観察した。
まず、表皮における基底膜を再現したマトリゲルコートプレートを準備すべく、次の操作を行った。即ち、６ウェル培養プレート（IWAKI社製）のウェルに、基礎培地（添加物を加えていない表皮角化細胞用培地）で１５倍に希釈したマトリゲル（日本ベクトン・ディッキンソン社製、製品番号「356230」）を加え、ウェルの上にカバーガラスを置き、３時間静置した。余った上清を取り除き、ＰＢＳ（−）で１回洗浄し、マトリゲルコートプレートを作製した。
また、試験に用いる細胞としては、正常ヒト表皮細胞（KURABO社製、製品名「KK-4009」）を使用し、表皮角化細胞用培地としては、Lonza社製の「KGM-Gold Bullet kit」を使用し、３７℃、５％ＣＯ2濃度の条件において正常ヒト表皮細胞を培養した。
続いて、上記のごとく作製したマトリゲルコートプレートに上記の正常ヒト表皮細胞を１００００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2となるように播き、１日後に正常ヒト表皮細胞への遺伝子導入操作を行った。
遺伝子導入操作は、次のようにして行った。即ち、基礎培地にLipofectamine LTX試薬とプラスミド（ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子導入プラスミド、又は、ベクターのみ）とを加えた複合培地を正常ヒト表皮細胞に加えた。６時間後にＰＢＳ（−）で洗浄し、さらに、表皮角化細胞用培地にて遺伝子導入細胞を培養した。なお、ベクターのみを加えたものは、コントロールとした。
次に、細胞を染色すべく、免疫蛍光染色処理を行った。即ち、培養した遺伝子導入細胞をＰＢＳ（−）で洗浄し、さらに、３．７質量％ホルムアルデヒド水溶液で３７℃にて５分間処理した。続いて、細胞をＰＢＳ（−）で洗浄した後、−２０℃メタノールで２０分間処理した。さらに、細胞をＰＢＳ（−）で２回洗浄した後、１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）／ＰＢＳで４℃にて、細胞にブロッキング処理を１時間施した。その後、２００倍希釈したanti γ-Tubulin-Cy3（SIGMA社製）、２００倍希釈したanti α-Tubulin-FITC（SIGMA社製）、及び、２万倍希釈したHoechst33258（Invitrogen社製）で細胞を１．５時間処理した。ＰＢＳ（−）で洗浄した後、６ウェル培養プレートからカバーガラスを取り出し、マウント剤（Invitrogen社製、製品名「ProLong Gold」）を用いてスライドガラス上に細胞を包埋した。
細胞の分裂方向を下記のようにして解析した。詳しくは、共焦点蛍光顕微鏡（OLYMPUS社製、製品名「FV-1000D」）を用いて、細胞分裂中期から後期の細胞を３次元（Ｘ，Ｙ，Ｚ軸）画像で撮影し、Ｘ、Ｚ軸の細胞切片画像を作製した。画像処理ソフトウェア（製品名「image-J」）を用い、作製した細胞切片画像における、分裂細胞の中心体同士を結んだ線の角度を測定した。なお、斯かる角度としては、画像において、２つに分裂しつつあるどちらの細胞の表面にも接する線と、分裂しつつある細胞の中心体同士を結んだ線との間における角度を採用した。なお、画像において評価対象とした細胞の数は、４０〜６０とした。
Specifically, the ΔN (1-19) RhoGDIβ gene was overexpressed in normal human epidermal cells, and the cell division direction of the cells was observed.
First, the following operation was performed to prepare a Matrigel coated plate that reproduced the basement membrane in the epidermis. That is, Matrigel (manufactured by Becton Dickinson Japan, product number “356230”) diluted 15-fold with basal medium (medium for epidermal keratinocytes without additives) into wells of a 6-well culture plate (IWAKI). )) And a cover glass was placed on the well and allowed to stand for 3 hours. The excess supernatant was removed and washed once with PBS (−) to prepare a Matrigel-coated plate.
In addition, normal human epidermal cells (KURABO, product name “KK-4009”) are used as cells used in the test, and “KGM-Gold Bullet kit” manufactured by Lonza is used as the culture medium for epidermal keratinocytes. Normal human epidermal cells were cultured under conditions of 37 ° C. and 5% CO 2 concentration.
Subsequently, the normal human epidermal cells were seeded on the matrigel-coated plate prepared as described above so as to have a density of 10000 cells / cm 2, and a gene transfer operation was performed on normal human epidermal cells one day later.
The gene transfer operation was performed as follows. That is, a complex medium obtained by adding Lipofectamine LTX reagent and a plasmid (ΔN (1-19) RhoGDIβ gene introduction plasmid or vector only) to a basal medium was added to normal human epidermal cells. After 6 hours, the cells were washed with PBS (−), and the gene-introduced cells were further cultured in a medium for epidermal keratinocytes. In addition, what added only the vector was set as control.
Next, in order to stain the cells, immunofluorescence staining treatment was performed. That is, the cultured gene-transferred cells were washed with PBS (−), and further treated with a 3.7 mass% formaldehyde aqueous solution at 37 ° C. for 5 minutes. Subsequently, the cells were washed with PBS (−) and then treated with methanol at −20 ° C. for 20 minutes. Furthermore, after the cells were washed twice with PBS (−), the cells were subjected to blocking treatment with 1% BSA (bovine serum albumin) / PBS at 4 ° C. for 1 hour. Then, the cells were diluted with 200-fold diluted anti γ-Tubulin-Cy3 (SIGMA), 200-fold diluted anti α-Tubulin-FITC (SIGMA) and 20,000-fold diluted Hoechst33258 (Invitrogen). Treated for 1.5 hours. After washing with PBS (−), the cover glass was taken out from the 6-well culture plate, and the cells were embedded on the slide glass using a mounting agent (product name “ProLong Gold” manufactured by Invitrogen).
The cell division direction was analyzed as follows. Specifically, using confocal fluorescence microscope (manufactured by OLYMPUS, product name “FV-1000D”), cells in the middle to late stages of cell division are photographed as three-dimensional (X, Y, Z axis) images, and X, Z An axial cell section image was made. Using the image processing software (product name “image-J”), the angle of the line connecting the centrosomes of dividing cells in the prepared cell slice image was measured. In addition, as such an angle, an angle between a line in contact with the surface of any cell that is dividing in two and a line that connects the centrosomes of the dividing cells is used in the image. . The number of cells to be evaluated in the image was 40-60.
上記の試験結果を図２に示す。なお、図２のグラフにおいては、測定対象とした分裂しつつある細胞の合計数に対する、所定範囲の角度を示す細胞の数の割合が示されている。
図２から把握されるように、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子を過剰に発現させた細胞においては、細胞分裂方向が乱れる。なお、図２の下側の写真は、角度を測定した画像の具体例を示したものである。
The test results are shown in FIG. In the graph of FIG. 2, the ratio of the number of cells showing an angle within a predetermined range to the total number of dividing cells as measurement targets is shown.
As can be seen from FIG. 2, the cell division direction is disturbed in the cells in which the ΔN (1-19) RhoGDIβ gene is excessively expressed. Note that the lower photograph in FIG. 2 shows a specific example of an image whose angle is measured.
＜ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生、及び、ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子の発現量の評価＞
ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質による細胞分裂方向の乱れを抑制するためには、ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の前駆物質であるＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生を抑制すること、又は、ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子の発現を抑制することが必要である。そこで、実施例のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤について、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制性能、及び、ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子の発現性能を評価した。
<Production of RhoGDIβ protein and evaluation of expression level of RhoGDIβ gene>
In order to suppress the disruption of the cell division direction by ΔN (1-19) RhoGDIβ protein, the production of RhoGDIβ protein which is a precursor of ΔN (1-19) RhoGDIβ protein is suppressed, or the expression of RhoGDIβ gene is suppressed. It is necessary to suppress. Thus, the RhoGDIβ protein production inhibitory performance and the RhoGDIβ gene expression performance were evaluated for the RhoGDIβ protein production inhibitor of Examples.
１．正常ヒト表皮細胞の培養
正常ヒト表皮細胞としては、ＤＳファーマ社製、製品名「KJB-100」を使用した。表皮角化細胞用培地としては、Lonza社製の製品名「KGM-Gold Bullet kit」を使用した。そして、正常ヒト表皮細胞を培地中で３７℃、５％ＣＯ2の条件下にて培養した。
その後、１２ウェル培養プレートに２１０００ｃｅｌｌｓ／ｃｍ2となるように正常ヒト表皮細胞を播いた。２４時間培養後、オウゴン抽出物が１質量％（乾燥物換算で１２０μｇ／ｍＬ（０．０１２質量％））となるように調製した同様の培地へと、培地を交換し、さらに細胞を２４時間培養した。なお、比較対照サンプル（コントロール）においては、抽出物を加えていない培地へと交換して、さらに細胞を２４時間培養した。
1. Culture of normal human epidermal cells As the normal human epidermal cells, product name “KJB-100” manufactured by DS Pharma was used. The product name “KGM-Gold Bullet kit” manufactured by Lonza was used as the culture medium for epidermal keratinocytes. Then, normal human epidermal cells were cultured in a medium at 37 ° C. and 5% CO 2 .
Thereafter, normal human epidermal cells were seeded in a 12-well culture plate so as to obtain 21000 cells / cm 2 . After culturing for 24 hours, the medium was changed to the same medium prepared so that the ougon extract was 1% by mass (120 μg / mL (0.012% by mass) in terms of dry matter), and the cells were further replaced for 24 hours. Cultured. In the control sample (control), the medium was replaced with a medium to which no extract was added, and the cells were further cultured for 24 hours.
２．ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生性能の評価
ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の検出は、WesternBlotting法により、下記のようにして行った。即ち、セルスクレーパーで細胞をディッシュから剥ぎ取って回収し、回収したものを３０００ｒｐｍ、５分間遠心分離することにより上清を取り除いた。この上清を取り除いたものをＰＢＳ（−）で洗浄し、遠心分離後、さらに上清を取り除き、−８０℃で保存した。
−８０℃で保存したサンプルにSDS-Sample bufferを２０μＬ加えた。ΔＮ（1-19）ＲｈｏＧＤＩβタンパク質検出用抗体としては、D4-GDI Mm Ab（Active Motif＃40941）を使用した。ＲｈｏＧＤＩβタンパク質抗体としては、LyGDI(C-20)Goat Ab(Santa Cruz sc-6047) を使用した。ＲｈｏＧＤＩαタンパク質抗体としては、RhoGDI(A-20)Rabbit Ab(Santa Cruz sc-360)を使用した。
2. Evaluation of production performance of RhoGDIβ protein RhoGDIβ protein was detected by WesternBlotting as follows. That is, the cells were peeled off from the dish with a cell scraper and recovered, and the recovered material was centrifuged at 3000 rpm for 5 minutes to remove the supernatant. The supernatant was removed and washed with PBS (−). After centrifugation, the supernatant was further removed and stored at −80 ° C.
20 μL of SDS-Sample buffer was added to the sample stored at −80 ° C. As an antibody for detecting ΔN (1-19) RhoGDIβ protein, D4-GDI Mm Ab (Active Motif # 40941) was used. LyGDI (C-20) Goat Ab (Santa Cruz sc-6047) was used as RhoGDIβ protein antibody. As a RhoGDIα protein antibody, RhoGDI (A-20) Rabbit Ab (Santa Cruz sc-360) was used.
３．ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子発現量の評価
一方で、ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子発現量を下記のようにして調べた。
まず、培養した正常ヒト表皮細胞のＲＮＡ抽出処理を次のようにして行った。即ち、培養後の細胞にＲＮＡ抽出液（TaKaRa社製、製品名「RNAiso Plus」）を１ｍＬ加え、細胞をエッペンチューブに回収した。室温で５分間静置した後、クロロホルムを２００μＬ加えて細胞と混合した。混合したものを１２０００×ｇで１５分間、４℃にて遠心分離し、上層の上清を別のエッペンチューブに移した。移した上清にイソプロパノール４００μＬを加えてエッペンチューブを複数回転倒させることによりチューブ内容物を撹拌した後、チューブを１０分間静置した。さらに、１２０００×ｇで１０分間、４℃にて遠心分離した後、上清を取り除き、７５％エタノール水溶液をチューブに１ｍＬ加えることにより洗浄処理を行った。加えて、７５００ｒｐｍ、５分間、４℃にて遠心分離し、上清を取り除いた。その後、室温で１０分間乾燥させ、水２０μＬをチューブに入れて懸濁液を調製した。
さらに、次のようにしてリアルタイムＰＣＲ操作を行った。詳しくは、リアルタイムＰＣＲ試薬（TaKaRa社製、製品名「One Step SYBER PrimeScript RT-PCR Kit PLUS」）を用いて試験サンプルを調製した。
プライマーとしては、
RhoGDIβ Fw（GAGACAGAGGCACCCCGGACA）、primer1（配列番号１）
RhoGDIβ Rv（CAGGGACTTCTGTGGTGGAGGC）、primer2（配列番号２）
βactin Fw（ACAGAGCCTCGCCTTTGCCG）、primer3（配列番号３）
βactin Rv（ACATGCCGGAGCCGTTGTCG）primer4（配列番号４）
を使用した。
また、測定機器としては、Applied Biosystems社製「7300 Fast Real-Time PCR System」を用いた。
3. Evaluation of RhoGDIβ gene expression level On the other hand, the RhoGDIβ gene expression level was examined as follows.
First, RNA extraction treatment of cultured normal human epidermal cells was performed as follows. That is, 1 mL of RNA extract (manufactured by TaKaRa, product name “RNAiso Plus”) was added to the cultured cells, and the cells were collected in an Eppendorf tube. After leaving still at room temperature for 5 minutes, 200 microliters chloroform was added and mixed with the cell. The mixture was centrifuged at 12000 × g for 15 minutes at 4 ° C., and the supernatant of the upper layer was transferred to another Eppendorf tube. To the transferred supernatant, 400 μL of isopropanol was added and the Eppendorf tube was turned over several times to stir the tube contents, and then the tube was allowed to stand for 10 minutes. Furthermore, after centrifuging at 12000 × g for 10 minutes at 4 ° C., the supernatant was removed, and washing was performed by adding 1 mL of 75% ethanol aqueous solution to the tube. In addition, the mixture was centrifuged at 7500 rpm for 5 minutes at 4 ° C., and the supernatant was removed. Then, it was dried at room temperature for 10 minutes, and 20 μL of water was put in a tube to prepare a suspension.
Furthermore, real-time PCR operation was performed as follows. Specifically, a test sample was prepared using a real-time PCR reagent (TaKaRa, product name “One Step SYBER PrimeScript RT-PCR Kit PLUS”).
As a primer,
RhoGDIβ Fw (GAGACAGAGGCACCCCGGACA), primer1 (SEQ ID NO: 1)
RhoGDIβ Rv (CAGGGACTTCTGTGGTGGAGGC), primer2 (SEQ ID NO: 2)
βactin Fw (ACAGAGCCTCGCCTTTGCCG), primer3 (SEQ ID NO: 3)
βactin Rv (ACATGCCGGAGCCGTTGTCG) primer4 (SEQ ID NO: 4)
It was used.
As a measuring instrument, “7300 Fast Real-Time PCR System” manufactured by Applied Biosystems was used.
オウゴン抽出物のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制能、及び、ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子発現抑制能の評価結果を図３に示す。なお、図３においては、コントロールの値を１００としたときの相対値が示されている。
図３から把握されるように、実施例のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、ＲｈｏＧＤＩβ遺伝子の発現抑制能を必ずしも十分に有していないものの、ＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制能を十分に有している。
FIG. 3 shows the evaluation results of RhoGDIβ protein production-suppressing ability and RhoGDIβ gene expression-suppressing ability of ougon extract. In FIG. 3, relative values are shown when the control value is 100.
As can be seen from FIG. 3, the RhoGDIβ protein production inhibitor of the examples does not necessarily have sufficient RhoGDIβ gene expression suppression ability, but has sufficient RhoGDIβ protein production suppression ability.
本発明のＲｈｏＧＤＩβタンパク質の産生抑制剤は、例えば、皮膚表皮細胞の分裂方向を制御するために好適に使用される。また、例えば、細胞のアポトーシス（細胞死）を抑制するために好適に使用される。
本発明の皮膚表皮細胞の分裂方向制御剤は、例えば、皮膚表皮細胞の分裂方向を制御し、肌のキメを整えるために好適に使用される。
本発明の皮膚外用剤は、例えば、皮膚表皮細胞の分裂方向を制御し、肌のキメを整えるために好適に使用される。
本発明の皮膚表皮細胞の分裂方向制御方法は、例えば、皮膚表皮細胞の分裂方向を制御し、肌のキメを整えるために好適に使用される。
The production inhibitor of RhoGDIβ protein of the present invention is suitably used, for example, to control the division direction of skin epidermal cells. In addition, for example, it is suitably used for suppressing cell apoptosis (cell death).
The agent for controlling the direction of division of skin epidermal cells of the present invention is suitably used, for example, for controlling the direction of division of skin epidermal cells and preparing skin texture.
The external preparation for skin of the present invention is suitably used, for example, for controlling the direction of division of skin epidermal cells and preparing the texture of the skin.
The skin epidermal cell division direction control method of the present invention is suitably used, for example, for controlling the division direction of skin epidermal cells and adjusting the texture of the skin.
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|---|---|---|---|---|
| JPH0217113A (en) * | 1988-07-05 | 1990-01-22 | Nonogawa Shoji:Kk | Externally applying agent for skin |
| JPH10273413A (en) * | 1997-01-31 | 1998-10-13 | Shiseido Co Ltd | Skin preparation for external use |
| JP2008094739A (en) * | 2006-10-10 | 2008-04-24 | Ogawa & Co Ltd | Skin texture ameliorant and external preparation, cosmetic, bath medicine and detergent containing the skin texture ameliorant |
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2013
- 2013-01-23 JP JP2013010301A patent/JP2014141430A/en active Pending
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