JP2014076045A - 栄養価の改善されたブラシカ・オレラセア(BrassicaOleracea)植物 - Google Patents
栄養価の改善されたブラシカ・オレラセア(BrassicaOleracea)植物 Download PDFInfo
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Abstract
【解決手段】ブラシカ・ビロサからのMyb28アレルおよび該Myb28アレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのELONGアレルの欠失を含む、ブラシカ・オレラセア植物であって、該Myb28アレルは、Myb28アレルを欠く植物と比較して、上昇したグルコシノレートを与える、植物。
【選択図】なし
Description
本願は、2012年1月31日出願の米国仮出願第61/700,762号に基づく優先権を主張し、該仮出願の全開示事項は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表の組み込み
マイクロソフトウィンドウズ(登録商標)オペレーティングシステムで8キロバイトと計測され、2012年9月13日に生成された「SEMB008US_ST25」と名付けられたファイルに含まれる配列表が電子的に提出され、参照により本明細書に組み込まれる。
1.発明の分野
本発明は、組換え染色体部分のあるブラシカ・オレラセア(Brassica Oleracea)植物の開発および使用に関する。
グルコシノレートは、植物種の16種の科、特に、ブロッコリーがその典型例であるアブラナ科(Brassicaceae)に存在する作用物質である。現実に同定された120種以上の異なるグルコシノレートがあるが、密接に関連づけられた分類群は通常そのような小さい数の化合物だけを含む。グルコラファニンやグルコイベリンなどのブロッコリーで有意なグルコシノレートは、アミノ酸メチオニンから生化学的に得られる。グルコシノレート経路では、各回で単一の炭素単位をテールに加えることによる、ELONG(伸長)遺伝子座の活性により、メチオニンがホモメチオニンおよびジホモメチオニンに変換される。ジホモメチオニンが4−メチルチオブチルグルコシノレート(グルコラファニン;「MSB」)に変換される一方で、ホモメチオニンは最終的に3−メチルチオプロピルグルコシノレート(グルコイベリン;「MSP」)に変換される。これらのグルコシノレート(グルコイベリンおよびグルコラファニン)は、グルタチオン−S−トランスフェラーゼおよびキノンレダクターゼなどの、代謝および潜在性発がん物質の排泄を促進する、フェーズII解毒酵素の強力な誘導因子である。
一つの態様において、本発明はブラシカ・ビロサ(Brassica villosa)からのMyb28アレルおよび該Myb28アレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのELONGアレルの欠失を含む、ブラシカ・オレラセア植物を提供し、ここで、Myb28アレルは、Myb28アレルを欠く植物と比較して、上昇したグルコシノレートを与える。
本発明は上昇した、グルコラファニンとしても知られる4−メチルスルフィニルブチルグルコシノレート(MSB)を与えることができるブラシカ・ビロサからの新規組み換え遺伝子移入を含むブラシカ・オレラセア植物の植物、種子および派生物(derivative)に関連する方法および組成(composition)を提供する。ブラシカ・ビロサからのMyb28およびELONGアレルを含む、雑種PS05151639(米国特許出願公開番号2011/0055945)のMyb28ドナー親の場合のように、非組み換え遺伝子移入を含む親系統を用いるときに、実質的により可変になる一方で、遺伝子移入を含む植物が常にグルコイベリンに比較して上昇したグルコラファニン含量を示す雑種を生成することは驚くべきことであった。雑種品種を生産するために利用可能な優れたブラシカ・オレラセア親系統の数が限られているので、上昇したグルコラファニン含量および/またはグルコラファニンのグルコイベリンに対する比をもつ複数の優れた雑種後代を生成する能力は重要である。したがって、減少した遺伝子移入は自殖の有用性を実質的に増加させ、例えば潜在的に異なる生育環境、最終消費者、または他の評価基準に適合された、それぞれ所望のグルコラファニン含量を有する複数の雑種の生産を許容する。
本発明の一つの態様は、本明細書にて提供される減少したMyb28/ELONG遺伝子移入を含む植物のそれ自身または第二の植物との交雑を含む方法、およびそのような方法により生産された種子および植物に関する。これらの方法は、MSBおよび/またはMSP含量を含む、所望のグルコシノレート組成を示す栽培種ブラシカ・オレラセア植物の生産および繁殖に使用できる。またさらに、上昇したグルコシノレート含量を有する本発明の植物は、上昇したグルコシノレートのない植物に対して、改善された植物の栄養価を含む。方法はまた、雑種ブラシカ・オレラセア種子およびそこから生育した植物を生産するためにも用いることができる。雑種種子は、そのような系統を第二のブラシカ・オレラセア植物系統と交雑することにより作出される。雑種は減少した遺伝子移入についてヘテロ接合性またはホモ接合性である。
戻し交雑によって、および直接的に植物に導入することができる多くの有用な形質は、遺伝的形質転換技術によって導入されるものである。そのため、遺伝的形質転換は、選択された導入遺伝子をブラシカ(Brassica)植物に挿入するために用いることができ、あるいは戻し交雑によって導入し得る導入遺伝子の調製のために用いることができる。ブラシカ(Brassica)を含む植物の形質転換方法は当業者に周知である。
本明細書中の説明および表において、多くの用語が用いられる。明細書および特許請求の範囲の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下の定義を提供する:
寄託は、本明細書に記載される、ブラシカ・ビロサ(Brassica villosa)からのMyb28アレルおよびブラシカ・オレラセア(Brassica Oleracea)からのELONGアレルを含む減少した遺伝子移入を含む、ブロッコリー雑種RX 05991199の少なくとも2500個の種子で行われた。寄託は、アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection)(ATCC)、10801 University Boulevard.、Manassas、VA 20110−2209 USA、に行った。寄託は、ATCC受託番号PTA−13165を与えられた。寄託を行った日は、2012年8月24日であった。寄託へのアクセスは、出願が係属している間、資格者に請求に応じて利用可能となるであろう。寄託は公共の寄託機関であるATCC寄託機関において、30年の期間、または最後の請求の後5年間、または特許の有効期間のいずれか長い期間の間維持され、その期間中において必要であれば交換される。出願人は、本願特許または植物新種保護法(7U.S.C.2321以下参照)を含むいかなる他の形式の様々な保護で与えられたそれらの権利のどんな侵害も放棄しない。
改善されたMSBプロファイルをもつ親系統の開発
現在の発明の1つの利点は、親系統が本発明の減少している遺伝子移入を含みながら作成され得、ここで、それに由来する系統および雑種が、MSB/MSPの増加する割合、および/または、MSB発現の、よりよい安定性を示す。Myb28/ELONGの減少した遺伝子移入を含むブロッコリー系統の開発は以下の通りまとめることができる:
上昇したグルコラファニンを有する雑種ブロッコリー系統の分析
自殖および異系交配は、表1に示すように、以下との交雑において雌性親として異なる標準ブロッコリー系統を用いて行われた:(1)(1)FT69(ブラシカ・ビロサからのELONGおよびMyb28をもつ高いグルコイベリン系統)、(2)SNP13−580333(上記で記載された、ブラシカ・オレラセアからのELONGおよびブラシカ・ビロサからのMyb28をもつ高いグルコラファニン系統)、および(3)SNP88−BRM51−1210(ブラシカ・ビロサからのELONGおよびMyb28をもつ高いグルコイベリン系統)。読み取れるように、通常のブロッコリー系統は比較的低い量の全グルコシノレートを有する。MSBおよびMSPの間の比率は、ブラシカ・ビロサからELONGおよびMyb28アレルを含むFT69(428−11−69)の場合において、通常のブロッコリー雌性系統に依存していることを特に示す。対照的に、SNP13−580333があるすべての交雑では、グルコシノレートの大部分はグルコラファニンである。このことは、複数の異なる第二の親との交雑における上昇したグルコラファニンを含む雑種を継続して生産することにおける減少した遺伝子移入の利益を示す。
ブロッコリー雑種の作出
上述のとおり、本発明の一つの実施形態は、一つまたは両方の、雑種の親がMyb28減少遺伝子移入を含み、その結果、遺伝子移入を含む親を欠く雑種に対して上昇したMSB含量および/またはより安定なMSB含量を有する、ブロッコリー雑種を生産することを含む。そのような雑種の一例は雑種RX−05991199である。この雑種は親BRM 53−3934 SIおよびBRM 56−3907 CMS、典型的にはBRM 53−3934 SIを雄性親として交雑することにより作出される。BRM 53−3934 SIの作出は上記実施例1に記載される。説明したとおり、この親はMyb28減少遺伝子移入を含む。雌性親BRM 56−3907 CMSは市販の雑種「アイアンマン」の親としての役割を果たす既知の自殖系統である。BRM 56−3907 CMSは、2007年6月18日に認められた、EU植物品種保護権認証番号#20341の対象であり、そこに記載される。
減少した遺伝子移入の同定および追跡のための遺伝子マーカーの使用
遺伝子マーカーアッセイはMyb28およびELONGアレルの遺伝子型に開発された。その結果、アッセイは本発明に従った減少した遺伝子移入の同定ならびにいかなる他の遺伝子型への減少した遺伝子移入のマーカー利用導入を可能にする。
QTL1−BoGLS−ELONGに設計されたマーカーが開発され、ブラシカ・ビロサELONGアレルの存在または不存在の検出を可能にする。このマーカーは、プライマー対AF399834F2:5’−cggattttcaaattttctcg−3’(配列番号:1)およびAF399834R2:5’−atttcgcatgaccactaggc−3’(配列番号:2)を使用して検出できる。マーカーを検出するために、プレートが2μL容量での20ngのDNAテンプレート(試料)でロードされた。3μLのマスターミックス(0.437μLの水、2.5μLのQ PCR(ROX)ミックス、0.063μLのアッセイミックス)が各々のウェルに最終容量5μLで添加された。PCR条件は以下のとおり:95℃15分間の後、95℃15秒間、60℃1分間、を40サイクル。図4はこのマーカーを使用した異なるELONGアレルのアッセイ結果を示す。Vアレルはブラシカ・ビロサELONGアレルを示し、一方でA、BおよびCアレルはブラシカ・ビロサELONGアレルのないブロッコリーで見出されるアレルの例である。
Myb28アレルでの遺伝的多型の識別および遺伝子マーカーとしてのそれらの使用は、本願と同時に出願され、その内容全体が参照として本明細書に組み込まれる米国仮出願第61/700,731で説明される。特に、配列アラインメントは、選択のMyb28アレルのためのマーカーベースの選択に使用できる多型を同定するためにブラシカ・オレラセアアレルに対応するMyb28系列の間でそこで説明される。結果を図5に示す。図5は、ブロッコリー品種FT69に含まれるブラシカ・ビロサからのMyb28遺伝子座のコンセンサス配列および増加したレベルのグルコシノレートのないブロッコリー、例えば、ブラシカ・オレラセア(Oleracea)からの対応する場所のコンセンサス配列の間のアラインメントである。示されているのは、全長2202bpの配列内で検出された26の多型(例えば、16のSNPと10のインデル(indel)がある一塩基多型(SFP))である。これらか他の同定された多型のいずれかは、ブラシカ・オレラセアまたはブラシカ・ビロサからの所望のMyb28の存在または不在のための遺伝子マーカーとして使用され得る。
NBOLI009111370配列(配列番号:3):GACCACCTAAAGACAAGAATAGTGAAAGAGATAAGATGGAAGACCAAAGTTAATCAAATTTATTTTGAAGCTTTT[C/T]TATGGAATAGAGACTAAAATGATGTGTGCTATTGCAATTTTTAGTCACATATTGCTAATCAAACACATATTTTGCATCAGAGAATTGTCAAATACATGAAAAAAATAAAGAATAATTTTT
フォワードプライマー(配列番号:4):GTGAAAGAGATAAGATGGAAGACCAAAGT
リバースプライマー(配列番号:5):GTGACTAAAAATTGCAATAGCACACATCA
Vicプローブ(配列番号:6):CTATTCCATAGAAAAGC
Famプローブ(配列番号:7):CTATTCCATAAAAAAGC
アッセイは、以下の標準手順を使用することで行われた:5μL容量での20ngDNAテンプレートをプレートにロードする。10μLのマスターミックス(各々2部の1×PCRミックス、0.437μLの水、2.5μLのQ PCR(ROX)ミックス、0.063μLのアッセイミックス、2μLの5ng/μLのプライマー)を各々のウェルに最終容量15μLで加える。
PCR条件は以下のとおり:50℃2分間の後、95℃2分間とし、その後95℃15秒間、60℃1分間を40サイクル。
Claims (29)
- ブラシカ・ビロサ(Brassica villosa)からのMyb28アレルおよび該Myb28アレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのELONGアレルの欠失を含む、ブラシカ・オレラセア(Brassica Oleracea)植物であって、該Myb28アレルは、Myb28アレルを欠く植物と比較して、上昇したグルコシノレートを与える、植物。
- 植物がブロッコリー植物である、請求項1に記載の植物。
- 植物が自殖である、請求項1に記載の植物。
- 植物が雑種である、請求項1に記載の植物。
- 植物がブラシカ・ビロサからの該Myb28アレルとホモ接合性である、請求項1に記載の植物。
- 植物がブラシカ・ビロサからの該Myb28アレルとヘテロ接合性である、請求項1に記載の植物。
- ELONGアレルがブラシカ・オレラセア由来である、請求項1に記載の植物。
- 請求項1に記載の植物の植物体の部分。
- 該部分が、葉、胚珠、小花、花粉、花らい球または細胞である、請求項8に記載の植物体の部分。
- 請求項1に記載の植物を生成する種子。
- ブラシカ・ビロサからのMyb28アレルおよび該Myb28アレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのELONGアレルの欠失を含む、染色体部分を含むブラシカ・オレラセア植物であって、該染色体部分は、Myb28アレルを欠く植物と比較して、上昇したグルコシノレートを与え、染色体部分を含む種子のサンプルがATCC受託番号PTA−13165の下に寄託されている、植物。
- 請求項11に記載の植物を生成する種子。
- 請求項11に記載の植物の植物体の部分。
- 該部分が、葉、胚珠、小花、花粉、花らい球または細胞である、請求項13に記載の植物体の部分。
- ブラシカ・ビロサからのMyb28アレルおよびブラシカ・オレラセアからのELONGアレルを含む、組換えDNA断片。
- 細胞内に含まれるものとしてさらに定義される、請求項15に記載のDNA断片。
- 種子内に含まれるものとしてさらに定義される、請求項15に記載のDNA断片。
- 植物内に含まれるものとしてさらに定義される、請求項15に記載のDNA断片。
- 所望のグルコシノレート組成を含むブラシカ植物を得るための方法であって、
a)上昇したグルコシノレートを与え、ブラシカ・ビロサからのELONGアレルと植物内で遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのMyb28アレルとヘテロ接合性である植物を得る;
b)前記植物の後代を得る;および
c)後代がブラシカ・ビロサからのMyb28アレルを含むがELONGアレルを含まないように組換えが生じた少なくとも第一の後代植物を選抜することを含み、後代植物がブラシカ・ビロサからのMyb28アレルが存在し、ELONGアレルが存在しないことにより、所望のグルコシノレート組成を有することとなる、
工程を含む、方法。 - 後代植物の選抜が、(1)ブラシカ・ビロサのMyb28アレルと遺伝的に連結したマーカーを含む、および/または該ブラシカ植物の対応する遺伝子座に存在する遺伝子マーカーを欠く、および(2)ブラシカ・ビロサからのELONGアレルと遺伝的に連結した遺伝子マーカーを欠く、および/または該ブラシカ植物の対応する遺伝子座に存在する遺伝子マーカーを含む、後代植物を同定することを含む、請求項19に記載の方法。
- 後代植物の選抜が、配列番号:1および配列番号:2の相補体に隣接した(flanked)該植物のゲノム中に見出された多型を検出することを含む、請求項20に記載の方法。
- 該アレルが、オリゴヌクレオチドプライマー対を使用するPCRベースの方法で検出される、請求項21に記載の方法。
- 後代植物の選抜が、図5に示される該後代植物中の多型を検出することを含む、請求項20に記載の方法。
- 該ブラシカ植物が、ブラシカ・オレラセア植物である、請求項19に記載の方法。
- ブラシカ・ビロサからのMyb28アレルを含むがELONGアレルを含まない、請求項19に記載の方法によって生産された植物。
- 請求項25に記載の植物の部分であって、該植物の部分は細胞、種、根、茎、葉、花らい球、花および花粉からなる群から選択される、部分。
- 第一のブラシカ・オレラセア親植物を異なる遺伝子型の第二のブラシカ・オレラセア親植物と交雑することを含む上昇したグルコシノレートをもつ雑種ブラシカ・オレラセア植物を生産する方法であって、第一の親植物はMyb28アレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのELONGアレルを欠く、ブラシカ・ビロサからのMyb28アレルを含み、Myb28アレルは、Myb28アレルを欠く植物と比較して、上昇したグルコシノレートを与える、方法。
- 第一のブラシカ・オレラセア親植物を複数の異なる遺伝子型の第二のブラシカ・オレラセア親植物と交雑することを含む、複数の雑種ブラシカ・オレラセア植物を作出することをさらに含む、請求項27に記載の方法。
- ブラシカ・ビロサからのMyb28アレルを含み、Myb28アレルに遺伝的に連結したブラシカ・ビロサからのELONGアレルを欠く染色体部分を植物に遺伝子導入することを含む、所望の上昇したグルコシノレート含量をもつブラシカ・オレラセア植物を作出する方法であって、該部分はその部分を欠く植物と比較して所望のグルコシノレート含量を与え、その染色体部分を含む種子のサンプルがATCC受託番号PTA−13165の下に寄託されている、方法。
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