JP2014047166A - 代謝促進剤 - Google Patents

Abstract

【課題】代謝亢進作用を示すエピカテキンガレートを有効成分とする新たな代謝促進剤、該代謝促進剤を含有する代謝促進剤を用いた遅筋形成促進剤、ミトコンドリア脱共役タンパク質遺伝子発現促進剤、ホルモン感受性リパーゼ遺伝子発現促進剤及び遅筋型ミオシン重鎖遺伝子発現促進剤を提供すること。
【解決手段】エピカテキンガレートを有効成分として含有することを特徴とする代謝促進剤。非重合型カテキンの総含量の５０重量％以上がエピカテキンガレートであるエピカテキンガレート含有組成物からなるものでもよい。
【選択図】なし

Description

本発明は、代謝促進剤に関するものである。また、本発明は、前記代謝促進剤を用いた遅筋形成促進剤、ミトコンドリア脱共役タンパク質遺伝子発現促進剤、ホルモン感受性リパーゼ遺伝子発現促進剤及び遅筋型ミオシン重鎖遺伝子発現促進剤に関する。

現在の社会生活においては、過剰なストレスや食物摂取、運動不足が蔓延している。これらが原因となるメタボリックシンドロームが大きな社会問題になっている。メタボリックシンドロームとは、内蔵脂肪型肥満に加えて高血糖、高血圧、脂質異常のうち二つ以上を併せ持った状態であり、動脈硬化のリスクが高くなる。

メタボリックシンドロームの原因として、過剰な脂肪・糖質の摂取が挙げられる。過剰に摂取されたエネルギー源は体内に脂肪という形で脂肪組織に蓄積される。この脂肪の蓄積がメタボリックシンドロームの原因の一つである。つまり、この脂肪の蓄積を抑制、又は脂肪の消費を亢進させることでメタボリックシンドロームの予防、改善又は治療が可能であるとされている。

生体内のエネルギー消費器官としては主に筋組織と脂肪組織とが挙げられる。
筋組織は組織学上で平滑筋、骨格筋及び心筋の３種類に分類される。このうち骨格筋は主に運動に必要とされる筋肉である。骨格筋はさらに速筋と遅筋に分類することが出来る。速筋は主にエネルギー源としてグルコースを使用する筋肉であり、瞬発力に優れた筋組織である反面、持久力に乏しく、主に無酸素運動時に使用される。一方遅筋は主に脂肪をエネルギー源として使用する筋肉であり、瞬発力には乏しいが持久力に優れ、有酸素運動時に使用される。

一般的に遅筋は速筋に比べエネルギー代謝が高いことが知られている。これは遅筋がホルモン感受性リパーゼ（Ｈｏｒｍｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｌｉｐａｓｅ：ＨＳＬ）の発現量が高いことにより脂肪を積極的にエネルギー源とすること、また体温調節に寄与するミトコンドリア脱共役タンパク質３（ＵＣＰ−３）の発現量が高いことにより脂肪酸からの熱産生量が高いことに起因する。従って、ダイエットを目的としたエクササイズにおいても、遅筋形成を促進する有酸素運動が推奨されている。

一方、脂肪組織はこれまで脂肪を蓄積するのみの組織だと考えられていた。しかし、近年の研究により、脂質蓄積を行う白色脂肪組織とエネルギー代謝を行う褐色脂肪組織の２種に分類されている。

前記褐色脂肪組織においてもＨＳＬの発現量が高いことから脂肪酸生成が促進されており、生成された脂肪酸はミトコンドリア脱共役タンパク質１（ＵＣＰ−１）が最終的に熱に変換している。一方脂肪を多量に蓄積する白色脂肪組織においてＨＳＬの発現促進、ミトコンドリア脱共役タンパク質２（ＵＣＰ−２）の発現促進によって褐色脂肪様組織となり、エネルギー代謝が亢進されることが知られている。

したがって、生体内において、褐色脂肪組織、褐色脂肪様組織及び遅筋型筋線維のいずれか１以上を増加させることは体内のエネルギー代謝を亢進させ、肥満の予防もしくは治療に効果があると考えられる。実際に脂肪組織のＵＣＰ発現量が高い動物では肥満になり難いことが知られている。また、ＵＣＰトランスジェニックマウスでは肥満になり難いことが知られており、遅筋型ミオシン重鎖などの遅筋型筋線維が多い場合も同様である。

以上のように生体内の組織をエネルギー代謝が高い組織に変換させることにより、肥満になり難い体質に改善されると同時に持久力に優れた体質を形成することが可能となる。しかし、運動によってこのような体質を作り上げるためには長期間のトレーニングが必要であり、トレーニングを希望しても様々な原因から現実的に実行できている人はごく僅かである。

このような現状から、遅筋形成や褐色脂肪様細胞の形成を促進するような技術が報告されている。例えば、本わさび等のアブラナ科植物の植物体もしくは抽出物を有効成分とする肥満防止剤（特許文献１）、ウコギ抽出物を有効成分とする熱産生タンパク質発現促進剤（特許文献２）、高分子ポリフェノールを有効成分とする筋肉遅筋化促進剤（特許文献３）、プロアントシアニジンを有効成分とする運動能力向上組成物（特許文献４）などが報告されている。

一方、緑茶抽出物などのカテキンを豊富に含む組成物において抗肥満作用があることは報告がある。しかし、その機能性はエピガロカテキンガレートが主体であり、その他のカテキンに対しては言及されていない。

以上のように脂肪組織および筋組織を標的とした代謝促進作用を示す化合物や素材が提案されているが、更なる新規素材の開発が望まれている。

特開２００６−３２８０５６号公報 特開２００３−１１３１０６号公報 特開２０１０−３７３２３号公報 特開２００５−９７２７３号公報

本発明者らは、脂肪組織や筋組織に関する前記の状況を鑑みて、新規な代謝促進剤を開発すべく鋭意検討を行った。その結果、ガレート型カテキンであるエピカテキンガレートに優れた代謝亢進作用があることを見出し、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明は、代謝亢進作用を示すエピカテキンガレートを有効成分とする新たな代謝促進剤、該代謝促進剤を含有する代謝促進剤を用いた遅筋形成促進剤、ミトコンドリア脱共役タンパク質遺伝子発現促進剤、ホルモン感受性リパーゼ遺伝子発現促進剤及び遅筋型ミオシン重鎖遺伝子発現促進剤を提供することを目的とする。

本発明の要旨は、
〔１〕エピカテキンガレートを有効成分として含有することを特徴とする代謝促進剤、
〔２〕非重合型カテキンの総含量の５０重量％以上がエピカテキンガレートであるエピカテキンガレート含有組成物からなる前記〔１〕記載の代謝促進剤、
〔３〕脂肪細胞及び／又は骨格筋細胞の代謝を促進する前記〔１〕又は〔２〕記載の代謝促進剤、
〔４〕前記〔１〕又は〔２〕記載の代謝促進剤を含有することを特徴とする遅筋形成促進剤、
〔５〕前記〔１〕又は〔２〕記載の代謝促進剤を含有することを特徴とするミトコンドリア脱共役タンパク質遺伝子発現促進剤、
〔６〕前記〔１〕又は〔２〕記載の代謝促進剤を含有することを特徴とするホルモン感受性リパーゼ遺伝子発現促進剤、
〔７〕前記〔１〕又は〔２〕記載の代謝促進剤を含有することを特徴とする遅筋型ミオシン重鎖遺伝子発現促進剤
に関する。

本発明の代謝促進剤は、脂肪組織および筋組織における代謝関連タンパク質であるミトコンドリア脱共役タンパク質やホルモン感受性リパーゼなどの遺伝子発現をいずれも促進する作用を有していることから、新規な代謝促進剤として有用である。

図１は実施例１で行った培養脂肪細胞のＵＣＰ−２遺伝子の発現量を定量した結果を示すグラフである。ＵＣＰ−２は細胞内エネルギーを消費して熱を産生する白色脂肪組織のミトコンドリア局在タンパク質であり、その遺伝子発現量の上昇は細胞内のエネルギー代謝が促進されていることを示す。 図２は実施例１で行った培養脂肪細胞のＨＳＬ遺伝子の発現量を定量した結果を示すグラフである。ＨＳＬは細胞内の中性脂肪を脂肪酸に分解するタンパク質であり、この遺伝子発現量の上昇は細胞内エネルギー量を上昇させていることを示す。 図３は実施例２で行った培養骨格筋細胞のＵＣＰ−３遺伝子の発現量を定量した結果を示すグラフである。ＵＣＰ−３は細胞内エネルギーを消費して熱を産生する白色脂肪組織のミトコンドリア局在タンパク質であり、その遺伝子発現量の上昇は細胞内のエネルギー代謝が促進されていることを示す。 図４は実施例２で行った培養骨格筋細胞のＨＳＬ遺伝子の発現量を定量した結果を示すグラフである。ＨＳＬは細胞内の中性脂肪を脂肪酸に分解するタンパク質であり、この遺伝子発現量の上昇は細胞内エネルギー量を上昇させていることを示す。 図５は実施例２で行った培養骨格筋細胞のＭＹＨ７遺伝子の発現量を定量した結果を示すグラフである。ＭＹＨ７は遅筋型ミオシン重鎖遺伝子であり、この遺伝子発現量の上昇は遅筋の形成が促進されていることを示す。 図６は実施例３で行った培養脂肪細胞のＵＣＰ−２遺伝子の発現量を定量した結果を示すグラフである。また、図中、Ａは茶抽出乾燥物、ＢはＥＧＣｇ等含有組成物、ＣはＥＣｇ高含有組成物を示す。

以下、本発明について詳細に説明する。

本発明において、「代謝促進剤」とは、脂肪細胞の代謝関連タンパク質であるＵＣＰ−２及びＨＳＬの遺伝子発現を上昇させることができると同時に骨格筋細胞の代謝関連タンパク質であるＵＣＰ−３、ＨＳＬの遺伝子発現を上昇させ、さらには遅筋型ミオシン重鎖ＭＹＨ７遺伝子の発現を上昇させることができる薬剤をいう。
前記の各細胞における各遺伝子の発現については、具体的には、後述の実施例に記載の方法により測定することができる。

本発明の代謝促進剤は、エピカテキンガレートを有効成分として含有することを特徴とする。
本発明において、エピカテキンガレートを単独で使用する場合に加えて、その他のカテキン類を含めた組成物の状態（以下、エピカテキンガレート含有組成物ともいう）で使用する場合も含む。前記エピカテキンガレート含有組成物としては、エピガロカテキンガレート、カテキン、エピカテキン、ガロカテキン、エピガロカテキン、カテキンガレート、エピカテキンガレート、ガロカテキンガレートの総量である総カテキン含量の５０重量％以上がエピカテキンガレートであるものをいう。

なお、本発明においては、エピカテキンガレート（ＥＣｇ）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ）、エピカテキン（ＥＣ）、エピガロカテキン（ＥＧＣ）のエピ体カテキン類、および、カテキンガレート（Ｃｇ）、ガロカテキンガレート（ＧＣｇ）、カテキン（Ｃ）、ガロカテキン（ＧＣ）の非エピ体カテキン類をあわせての総称として、「非重合型カテキン類」という。

エピカテキンガレート含有組成物は公知の方法で抽出された緑茶抽出物から合成吸着剤等をもちいたクロマトグラフィーによってＥＣｇを回収・濃縮することによって製造することができる。

エピカテキンガレート含有組成物は市販品を用いてもよいが、例えば、本出願人が先に出願した「緑茶飲料」（特願２０１２−１２４４３２）に記載されるカメリア属の茶葉由来の抽出物を用いてもよい。カメリア属の茶葉由来の抽出物とは、カメリア属に分類される植物の茶葉由来の抽出物であれば制限はない。原料としては、例えば、チャ（カメリア シネンシス）があげられる。なかでも、日常的に飲用されている、不発酵茶である各種緑茶、半発酵茶である烏龍茶、強発酵茶である紅茶、後発酵茶である黒茶、プーアル茶などが、安全性が高く、安心感もあり、また原材料が入手しやすい観点から好ましい。また、一般に、ＥＣｇ含有率が比較的高いほうじ茶や紅茶は、更に好ましい。また、不発酵茶である緑茶においては、ＥＣｇ含量が比較的高い「釜炒り茶」や紅ふうき種が、緑茶風味を有することからもさらに好ましい。

カメリア属の茶葉由来の抽出物の抽出方法は、原料茶葉を水や有機溶媒、あるいはこれらを組み合わせ、公知の方法により実施できる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルムなどが挙げられる。好ましくは、親水性のメタノール、エタノール、アセトンが挙げられ、より好ましくはエタノールが食品用途としては適している。抽出方法としては、浸漬し静置抽出、浸漬し攪拌抽出、加温抽出、加温加圧抽出、還流抽出、あるいはカラムに原料を充填し、繰り返し抽出してもよい。超臨界抽出方法などを適用することもできる。短時間で効率的に抽出する観点からは、加温抽出や加温加圧抽出が望ましい。抽出温度や抽出時間は、茶葉や溶媒の量、茶葉や溶媒の種類、抽出装置や抽出スケールにより適宜選択すればよい。抽出された溶液は、そのまま用いてもよく、濃縮してもよく、溶媒を除去し固形状にしてもよい。すなわち該茶葉由来抽出物は、固体でも液体でもスラリー状でも構わなく、用途やコストに応じて調製すればよい。

カメリア属の茶葉由来の抽出物は、最終的に前記の緑茶飲料ベースに添加されるものであるから、原料として使用する茶葉が緑茶と異なる場合には、緑茶風味を害さないように留意する必要がある。この観点では、複数回の前段階抽出を実施し、使用する茶葉固有の好ましくない風味を除去して得られた茶殻から再度抽出し、目的に応じたガレート型カテキン類を多く含有する抽出物を得ることが望ましい。例えば、前段階の抽出時に得られる抽出液は用いず、ここで回収した茶殻に対し更に抽出を実施して得られた抽出液を回収すれば、好ましくない茶葉固有の風味は低減しつつ、ある程度の目的の成分は回収できる。一般に雑味成分は水で抽出されやすく、目的成分であるガレート型カテキン類は雑味成分に比べると水で抽出されにくい傾向があるために、この手法が有効である。前段階の抽出は水やエタノールなどの有機溶媒や、これらを組み合わせた抽出が有効である。抽出回数については、回収率やコストなどを総合的に考えると２〜３段階の抽出が望ましい。茶飲料製造などで廃棄物として問題になっている大量の茶殻を有効活用できることも本法の利点である。

こうして得られたカメリア属の茶葉由来の抽出物は、その固形分中に非重合型カテキン類を２〜９０重量％含有するのが好ましく、より好ましくは３〜１００重量％、特に好ましくは３．５〜９０重量％がよい。

また、本発明でいうカメリア属の茶葉由来の精製物とは、カメリア属に分類される植物の茶葉由来のＥＣｇ含量を高めた精製物のことを指す。前述のように１回あるいは複数回の抽出で得られたカメリア属の茶葉由来の抽出物の濃縮物や、市販のカテキン高含有原料から公知の精製方法に準じてＥＣｇ含量を高めた精製物を得ることができる。市販のカテキン高含有原料としては、例えば三井農林（株）製「ポリフェノン」、太陽化学（株）製「サンフェノン」などがあり、これらを使用することもできる。公知の精製方法としては、合成吸着剤を使用した方法がある。合成吸着剤をカラムに充填し、カメリア属の茶葉由来の抽出物の濃縮物や、市販のカテキン高含有原料をカラムに負荷し、水や有機溶媒を通液し、目的成分が溶出する画分を回収する精製方法である。カラムを使用しないバッチ法も適用はできるが、効率面からはカラム法が望ましい。本発明に用いる合成吸着剤としては、その母体がスチレン系、例えばダイヤイオンＨＰ２０ 、セパビーズＳＰ７０、ＳＰ８５０ 、ＳＰ８２５、ＳＰ７００（三菱化学（株）製）、アンバーライトＸＡＤ４、ＸＡＤ１６ＨＰ、ＸＡＤ２０００、（オルガノ社）、修飾スチレン系、例えばセパビーズＳＰ２０５（三菱化学（株）製）、メタクリル系、例えばダイヤイオンＨＰ１ ＭＧ（三菱化学（株）製）、アクリル系、例えばアンバーライトＸＡＤ７ＨＰ（オルガノ社）、フェノール系、例えばアンバーライトＸＡＤ７６１（オルガノ社）などが挙げられる。なかでも、スチレン系の合成吸着剤が非重合型カテキン類の分離に実績が多く、コストの点や製造スケールアップしやすい点から好ましい。特に汎用されているダイヤイオンＨＰ２０が望ましい。

前記合成吸着剤を用いてカメリア属の茶葉由来の抽出物をカラム法により分離する手法は、一般的な手法に準じればよい。非重合型カテキン類の分離・溶出に用いる溶離液としては、水や有機溶媒が挙げられる。有機溶媒としては、メタノール、エタノール、アセトン、酢酸エチル、クロロホルムなどが挙げられる。好ましくは、親水性のメタノール、エタノール、アセトンが挙げられ、より好ましくはエタノールが食品用途として好適である。溶離液のｐＨ調整や温度調整は特に必要ないが、目的成分の回収効率が高まるようなら適宜調整可能である。分画手法の一例を以下に示す。はじめに合成吸着剤が充填されたカラムを、例えば９９％エタノール水溶液（ｖ／ｖ）によりＳＶ（空間速度）＝１〜１０で、合成吸着剤の２〜５倍量（ｖ／ｖ）通液し、洗浄を行う。次に分画スタート時の溶媒によりＳＶ＝１〜１０で、合成吸着剤の２〜５倍量（ｖ／ｖ）通液し、平衡化を行う。その後、カメリア属の各種茶葉抽出物をスタート時の溶媒で溶解させカラムに負荷する。目的のカテキン類が合成吸着剤にできる限り吸着するように、ＳＶは１０以下が望ましい。以降は、溶離液をＳＶ＝１〜１０、好ましくは１〜５で通液し、フラクションを得ればよい。溶離液は、アイソクラティックでも、ステップワイズに極性を変化させても、リニアグラジエントに極性を変化させてもよく、適した条件で実施すればよい。一般的には、スチレン系の合成吸着剤では溶離液の極性を低下させることにより、カテキン類の合成吸着剤への吸着能の差異により、順次溶出される。食用目的であるから水−エタノールの溶離液が好適であり、この場合、エタノール濃度を徐々に上げることが好適である。目的成分の溶出の確認は、各種分析機器、例えばＨＰＬＣなどで検出することで判別可能であり、また分画の条件が一定であれば本法の再現性の高さから、回収する画分は毎回一致する。

前記溶出工程において、目的成分が含有される画分を回収・合一することで、目的成分の精製度は顕著に上昇する。精製度を上げるためには、溶媒の極性を厳密にコントロールすることや、分画を細かくすること、回収画分の選定基準を引き上げることで調整可能である。求める精製度に応じて、カラム分画条件や回収条件を適用すればよい。合成吸着剤は、エタノールのような有機溶媒を通液し残存成分を脱離させることにより、再生できる。さらに水酸化ナトリウムなどのアルカリ水溶液を通液し洗浄してもよい。

目的成分、具体的にはＥＣｇが溶出された画分を合一した後、濃縮してエタノールなどの溶媒を除去する。緑茶飲料ベースに添加されるものであるため、エタノールなどの溶媒は除去されることが望ましい。濃縮方法は公知の方法に準じて行えばよい。例えば、常圧加熱乾燥法、減圧加熱乾燥法、凍結乾燥法、スプレードライ法などが挙げられる。加熱による成分変化を最小限に抑えるためとコスト面を考え、産業的には凍結乾燥法、スプレードライ法が好ましい。

本法によってカメリア属の茶葉由来の精製物が得られ、この固形分中には、非重合型カテキン類が５０〜１００質量％含有される。さらには、７０〜１００質量％含有されるのが好ましい。

また、前記精製物中のＥＣｇの総量は、全非重合型カテキン類中で、５０〜１００質量％であるのが好ましい。

本発明の代謝促進剤は、前記のＥＣｇを有効成分として０．１重量％以上含有していればよい。前記エピカテキンガレート含有組成物を代謝促進剤として用いる場合は、ＥＣｇ含有組成物中のＥＣｇの含有量が２０重量％以上となるように調整していればよい。また、含有率の上限値については、特に限定はない。

本発明の代謝促進剤は、脂肪細胞及び／又は骨格筋細胞において、脂肪代謝に関連するタンパク質の遺伝子発現を増大させることにより、これらの細胞における代謝を促進することができる。

また、本発明の代謝促進剤は、骨格筋細胞における遅筋の形成を促進する作用を有することから、遅筋促進剤の有効成分とすることができる。

また、本発明の代謝促進剤は、脂肪細胞や骨格筋細胞におけるミトコンドリア脱共役タンパク質であるＵＣＰ−２、ＵＣＰ−３などの遺伝子発現を促進する作用を有することから、ミトコンドリア脱共役タンパク質遺伝子発現促進剤の有効成分とすることができる。

また、本発明の代謝促進剤は、脂肪細胞や骨格筋細胞におけるホルモン感受性リパーゼの遺伝子発現を促進する作用を有することから、ホルモン感受性リパーゼ遺伝子発現促進剤の有効成分とすることができる。

また、本発明の代謝促進剤は、骨格筋細胞の遅筋型ミオシン重鎖の遺伝子発現を促進する作用を有することから、遅筋型ミオシン重鎖遺伝子発現促進剤の有効成分とすることができる。

上記の代謝促進剤、遅筋形成促進剤、ミトコンドリア脱共役タンパク質遺伝子発現促進剤、ホルモン感受性リパーゼ遺伝子発現促進剤及び遅筋型ミオシン重鎖遺伝子発現促進剤は、いずれも食経験のあるＥＣｇを有効成分とするものであるため、肥満予防や改善・運動補助を目的とした食品、医薬品または医薬部外品に使用することも可能である。

前記食品としては、例えば、飲料、アルコール飲料、ゼリー、菓子等、どのような形態でもよく、菓子類の中でも、その容量等から保存や携帯性に優れた、ハードキャンディ、ソフトキャンディ、グミキャンディ、タブレット等が挙げられるが、特に限定はない。なお、食品には、機能性食品、健康食品、健康志向食品等も含まれる。

また、前記食品には、ヒトが食べる食品だけでなく、例えば、非ヒト動物、例えば、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、サル、チンパンジー等の哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類等の治療剤又は飼料に配合してもよい。飼料としては、例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ニワトリ等に用いる家畜用飼料、ウサギ、ラット、マウス等に用いる小動物用飼料、ウナギ、タイ、ハマチ、エビ等に用いる魚介類用飼料、イヌ、ネコ、小鳥、リス等に用いるペットフードが挙げられる。

前記医薬品としては、散剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤等の固形製剤、懸濁剤、乳剤等の液剤、ゲル剤等が挙げられる。錠剤、丸剤、顆粒剤、顆粒を含有するカプセル剤の顆粒は、必要により、ショ糖等の糖類、マルチトール等の糖アルコールで糖衣を施したり、ゼラチン、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース等でコーティングを施してもよいし、胃溶性若しくは腸溶性物質のフィルムで被覆してもよい。また、製剤の溶解性を向上させるために、前記の製剤を公知の可溶化処理を施すこともできる。常法に基づいて、前記液剤を注射剤、点滴剤に配合して使用してもよい。

医薬部外品としては、口腔に用いられる医薬部外品、例えば、歯磨き、マウスウォッシュ、マウスリンス、ドリンク剤が挙げられる。

本発明の代謝促進剤を用いて食品、医薬品又は医薬部外品を調製する場合、本発明の効果が損なわれない範囲内で食品、医薬品又は医薬部外品に通常用いられる成分を適宜任意に配合することができる。
例えば、食品の場合には、水、アルコール、澱粉質、蛋白質、繊維質、糖質、脂質、ビタミン、ミネラル、着香料、着色料、甘味料、調味料、安定剤、防腐剤のような食品に通常配合される原料又は素材と組み合わせることができる。
医薬品や医薬部外品の場合には、主剤、基材、界面活性剤、起泡剤、湿潤剤、増粘剤、透明剤、着香料、着色料、安定剤、防腐剤、殺菌剤等に組み合わせ、常法に基づいて、液状、軟膏状あるいはスプレー噴射可能な最終形態等にすることができる。

また、本発明の代謝促進剤を食品に添加する場合には、該食品中に対して、有効成分であるエピカテキンガレート換算で０．００１〜２０重量％添加することが好ましい。

本発明の代謝促進剤を医薬用途で使用する場合、例えば、その摂取量は、所望の改善、治療又は予防効果が得られるような量であれば特に制限されず、通常その態様、患者の年齢、性別、体質その他の条件、疾患の種類並びにその程度等に応じて適宜選択される。１日当たり有効成分であるエピカテキンガレート換算で約０．１ｍｇ〜１，０００ｍｇ程度とするのがよく、これを１日に１〜４回に分けて摂取することができる。

本発明の代謝促進剤を医薬部外品に添加する場合には、該医薬部外品中に、有効成分であるエピカテキンガレート換算で０．００１〜３０重量％添加するのが好ましい。

次に本発明を実施例に基づいて詳細に説明するが、本発明はかかる実施例にのみ限定されるものではない。なお、以下の実施例において、「％」は、特に断らない限り、それぞれ「重量％」を意味する。

（実施例１ 脂肪細胞の遺伝子発現定量）
脂肪細胞におけるエピカテキンガレート（ＥＣｇ、和光純薬工業（株）製）、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣｇ、和光純薬工業（株）製）による遺伝子の発現量を評価するために、白色脂肪組織のモデル細胞である３Ｔ３−Ｌ１細胞（マウス由来脂肪前駆細胞）を用いて評価を行った。

試料にはＥＣｇ、ＥＧＣｇの２種類を用い、これらをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）製）に１０ｍＭの濃度で溶解させて試験に使用した。

培養は、１０ｖ／ｖ％ウシ胎児血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社製）及び１ｖ／ｖ％アンチバイオティック−アンチマイコティック（ギブコ（ＧＩＢＣＯ）社製）を含むＤＭＥＭ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ、シグマ（Ｓｉｇｍａ）社製）を用いた。

試験に使用する脂肪細胞は定法に従って調整した。つまり、細胞培養用６ウェルディッシュ（日本ベクトン・ディッキンソン（株）製）に３Ｔ３―Ｌ１細胞を５×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｍＬで２ｍＬ播種して３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ₂条件下で４８時間培養し、１００％コンフルエントしたものを毎日培地交換しながらさらに４８時間培養した。その後、培地を脂肪細胞分化試薬（商品名：ＡｄｉｐｏＩｎｄｕｃｅｒ Ｒｅａｇｅｎｔ、タカラバイオ（株）製）に付属の、インスリン、デキサメタゾン及びイソブチルメチルキサンチンをそれぞれ１ｖ／ｖ％、０．５ｖ／ｖ％及び０．１ｖ／ｖ％添加した分化用ＤＭＥＭ培地２ｍＬに交換し、３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ₂条件下で４８時間分化・培養した。分化させた脂肪細胞の培地を、インスリン１ｖ／ｖ％を含むＤＭＥＭ培地（維持培地）に交換し、７日間培養した脂肪細胞を試験に使用した。

試験は以下のように行った。７日間培養した脂肪細胞にＥＣｇ、ＥＧＣｇの各試料を１０μＬ（終濃度５０μＭ）添加し、２４時間培養した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを０．５ｖ／ｖ％添加したものをコントロールとした。

培養終了後、細胞よりＲＮＡ抽出キット（商品名：ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）ＲＮＡ II、タカラバイオ（株）製）を用いて全量ＲＮＡを抽出・精製した。得られたＲＮＡを２ステップリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用逆転写試薬（商品名：ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ、タカラバイオ（株）製）の取扱説明書に準じて逆転写反応を行った。

つまり５×（Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ）４μＬ及び全量ＲＮＡ １μｇを混合し、ＲＮａｓｅ Ｆｒｅｅ ｄＨ₂Ｏで全量を２０μＬにした。ＰＣＲ用サーマルサイクラー（商品名：ＧｅｎｅＡｍｐ（登録商標）ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ ９７００、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製）を使用して１サイクルが「３７℃×１５分→８５℃×５秒」であるプログラムにて逆転写反応を行った。逆転写反応液をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用希釈試薬（商品名：ＥＡＳＹ Ｄｉｌｕｔｉｏｎ、タカラバイオ（株）製）にて２０倍希釈した希釈液をリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析に使用した。

リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析は定法に従って行った。解析には、ＥＣＯ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ＲＴ―ＰＣＲ ｓｙｓｔｅｍ」（商品名：イルミナ（株）製）を使用した。解析する遺伝子はＵＣＰ−２およびＨＳＬとした。プライマーには、ＵＣＰ２フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１１２９８８−Ｆ）及びＵＣＰ２リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１１２９８８−Ｒ）、ＨＳＬフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０２９２８７−Ｆ）及びＨＳＬリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０２９２８７−Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ−アクチンとし、そのプライマーとして、ＡＣＴＢフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８−Ｆ）及びＡＣＴＢリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８−Ｒ）（前記６種のプライマーはいずれもタカラバイオ（株）製）を使用した。

反応にはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ試薬（商品名：ＳＹＢＲ（登録商標）Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑ II（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ）、タカラバイオ（株）製）を使用した。反応液は４８ウェルＰＣＲプレート（イルミナ（株）製）中に、２×（ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ ＥＸ ｔａｑ ＩＩ（Ｔｌｉ ＲＮａｓｅＨ Ｐｌｕｓ））２．５μＬ、フォワードプライマー（５０μＭ）０．０４μＬ、リバースプライマー（５０μＭ）０．０４μＬ、逆転写反応液１μＬ及び（ｄＨ₂Ｏ）１．４２μＬ（総量１０μＬ）を混合して『９５℃×３０秒→「９５℃×１５秒→６０℃×１分」×４０サイクル→９５℃×１５秒→５５℃×１５秒→９５℃×１５秒』のプログラムにてＰＣＲ反応を行った。

得られた各細胞中のβ−アクチンと目的遺伝子であるＵＣＰ−２もしくはＨＳＬのＣｔ値（Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ Ｃｙｃｌｅ：一定の増幅量（閾値）に達するサイクル数）からＵＣＰ−２もしくはＨＳＬの遺伝子発現量の相対値を算出した。図１にＵＣＰ−２の遺伝子発現量の結果、図２にＨＳＬの遺伝子発現量の結果を示した。

図１及び図２の結果より、ＥＣｇ、ＥＧＣｇを添加した系においてコントロールであるＤＭＳＯと比較したところ、ＥＣｇが優れたＵＣＰ−２及びＨＳＬ発現促進作用を有することが確認された。また、ＥＣｇとＥＧＣｇを比較すると、ＥＣｇは顕著なＨＳＬ遺伝子発現促進効果を有しており、これらの効果には有意な差があることもわかった。
したがって、ＥＣｇは、市販のカテキン含有食品に有効成分として含有されているＥＧＣｇよりも、脂肪細胞において、前記のようにＵＣＰ−２およびＨＳＬの遺伝子発現量を増大させることができ、これにより、ＵＣＰ−２、ＨＳＬの産生を促して、脂肪細胞の代謝促進を顕著に亢進できることがわかる。

（実施例２ 骨格筋細胞の遺伝子発現定量）
次に、筋細胞におけるＥＣｇによる遺伝子の発現量を評価するために、ＳｋＭＣ細胞（正常ヒト骨格筋細胞）を用いて評価を行った。

試料には実施例１と同じＥＣｇを用い、これをジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）製）に１０ｍＭの濃度で溶解させて試験に使用した。

培養は、骨格筋細胞培養キット（商品名：ＳｋＧＭ ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ、ロンザ（Ｌｏｎｚａ）社製）を用いた。

試験に使用する骨格筋細胞は以下のように調整した。細胞は、１００ｍｍ／Ｃｏｌｌａｇｅｎ−Ｃｏａｔｅｄ Ｄｉｓｈ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｔｙｐｅ Ｉ（旭硝子（株）製）
に播種し、３７℃、５ｖ／ｖ％ＣＯ₂条件下で２日間培養して１００％コンフルエントしたものを使用した。

試験は以下のように行った。培養した骨格筋細胞に試料を１０μＬ（終濃度５０μＭ）添加し、２４時間培養した。なお、溶媒であるＤＭＳＯのみを０．５ｖ／ｖ％添加したものをコントロールとした。

ＲＮＡ抽出及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析は実施例１と同様に行った。ただし、逆転写の際の全量ＲＮＡ量は０．２５μｇとし、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ用希釈試薬で５倍に希釈した希釈液を逆転写反応液とした。解析遺伝子はＵＣＰ−３、ＨＳＬ、遅筋型ミオシン重鎖であるＭＹＨ７とした。プライマーには、ＵＣＰ３フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ０３７９７３−Ｆ）及びＵＣＰ３リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ０３７９７３−Ｒ）、ＨＳＬフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１４０４９９−Ｆ）及びＨＳＬリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１４０４９９−Ｒ）、ＭＹＨ７フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１３３５６１−Ｆ）及びＭＹＨ７リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ１３３５６１−Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ−アクチンとし、そのプライマーとして、ＡＣＴＢフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ０６７８０３−Ｆ）及びＡＣＴＢリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＨＡ０６７８０３−Ｒ）（前記８種のプライマーはいずれもタカラバイオ（株）製）を使用した。

得られた各細胞中のβ−アクチンとＵＣＰ−３、ＨＳＬ、ＭＹＨ７のＣｔ値から各遺伝子発現量の相対値を算出した。ＵＣＰ−３の結果を図３、ＨＳＬの結果を図４、ＭＹＨ７の結果を図５に示した。

以上の結果より、ＥＣｇにおいてコントロールであるＤＭＳＯを添加した骨格筋細胞と比較すると、優れたＵＣＰ−３、ＨＳＬ、ＭＹＨ７の各遺伝子の発現を顕著に促進する作用があり、これらの作用には有意な差があることも確認された。
したがって、ＥＣｇは、骨格筋細胞において、前記のようにＵＣＰ−３、ＨＳＬ、ＭＹＨ７の各遺伝子発現量を増大させることができる。ＥＣｇは、骨格筋細胞においてＵＣＰ−３、ＨＳＬの産生を促して、骨格筋細胞の代謝促進を顕著に亢進できることがわかる。また、ＥＣｇは、骨格筋細胞においてＭＹＨ７の遺伝子発現を促進することで、骨格筋細胞の遅筋形成を促進することができることがわかる。

（実施例３ 脂肪細胞の遺伝子発現定量）
脂肪細胞におけるＥＣｇ含有組成物の影響の違いを３Ｔ３―Ｌ１細胞（マウス由来脂肪前駆細胞）を用いて評価した。使用したサンプルは茶抽出乾燥物（ＥＣｇ含量７．７重量％、カメリアエキス３０Ｓ、太陽化学（株）製）、ＥＧＣｇ高含有組成物（ＥＣｇ含量１６．９重量％、サンフェノン９０Ｓ、太陽化学（株）製）を使用した。またＥＣｇ高含有組成物（ＥＣｇ含量５２．８重量％）は緑茶抽出物よりＥＣｇを精製したものを使用した。

各試料を、総カテキン濃度が１０ｍｇ／ｍｌとなるようにジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、和光純薬工業（株）製）に溶解させて試験に使用した。

細胞の培養方法については、実施例１と同様に行った。

試験は以下のように行った。７日間培養した脂肪細胞に各試料を１０μＬ（終濃度５０μｇ／ｍｌ）添加し、２４時間培養した。

ＲＮＡ抽出及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ解析は実施例１と同様に行った。解析する遺伝子はＵＣＰ−２とした。プライマーには、実施例１と同じＵＣＰ２フォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１１２９８８−Ｆ）及びＵＣＰ２リバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ１１２９８８−Ｒ）を使用した。細胞内遺伝子の内部標準はβ−アクチンとし、そのプライマーとして、実施例１と同じＡＣＴＢフォワードプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８−Ｆ）及びＡＣＴＢリバースプライマー（プライマーＩＤ：ＭＡ０５０３６８−Ｒ）を使用した。

得られた各細胞中のβ−アクチンとＵＣＰ−２のＣｔ値から各遺伝子発現量の相対値を算出した。ＵＣＰ−２の結果を図６に示した。図中、Ａは茶抽出乾燥物、ＢはＥＧＣｇ高含有組成物、ＣはＥＣｇ高含有組成物とした。

図６に示す結果より、ＥＣｇ高含有組成物（Ｃ）は、コントロールである茶抽出乾燥物（Ａ）又はＥＧＣｇ高含有組成物（Ｂ）を添加した脂肪細胞と比べて、優れたＵＣＰ−２発現促進作用を有しており、これらの作用には有意な差があることも確認された。

Claims (7)

1. エピカテキンガレートを有効成分として含有することを特徴とする代謝促進剤。
2. 非重合型カテキンの総含量の５０重量％以上がエピカテキンガレートであるエピカテキンガレート含有組成物からなる請求項１記載の代謝促進剤。
3. 脂肪細胞及び／又は骨格筋細胞の代謝を促進する請求項１又は２記載の代謝促進剤。
4. 請求項１又は２記載の代謝促進剤を含有することを特徴とする遅筋形成促進剤。
5. 請求項１又は２記載の代謝促進剤を含有することを特徴とするミトコンドリア脱共役タンパク質遺伝子発現促進剤。
6. 請求項１又は２記載の代謝促進剤を含有することを特徴とするホルモン感受性リパーゼ遺伝子発現促進剤。
7. 請求項１又は２記載の代謝促進剤を含有することを特徴とする遅筋型ミオシン重鎖遺伝子発現促進剤。

Images