JP2014003986A - Gpnmbに対する抗体およびその使用 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子、特にフレームワーク領域および/または相補性決定領域(CDR)に及ぶ連続する重鎖および軽鎖配列に対応する配列を含むアミノ酸配列およびそれらをコードする塩基配列が提供される。また、本発明は抗GPNMB抗体を含む免疫複結合体およびそのような免疫結合体を使用する方法を提供する。さらに、本発明は抗GPNMB抗体成分と抗CD3成分とを含む二重特異性抗体およびそのような二重特異性抗体を使用する方法を提供する。
【選択図】図1
Description
本発明は、GPNMBに対する特異性を有する抗体、およびそのような抗体の使用に関する。特に、本発明はGPNMBに特異的に結合する完全ヒトモノクローナル抗体およびその使用を提供する。重鎖および軽鎖免疫グロブリン分子、特にフレームワーク領域および/または相補性決定領域(CDR)に及ぶ連続した重鎖および軽鎖配列に対応する配列を含むアミノ酸配列およびそれをコードする塩基配列が提供される。また、本発明は抗GPNMB抗体を含む免疫結合体およびそのような免疫結合体を使用する方法を提供する。さらに、本発明は抗GPNMB抗体成分と抗CD3成分とを含む二重特異性抗体およびそのような二重特異性抗体を使用する方法を提供する。
GPNMB
「nmb」(アクセッション番号X76534 EMBL)と呼ばれる推定膜貫通糖タンパク質(以下、GPNMBと称する)が同定され、高悪性度の黒色腫細胞系に比較して低転移性のヒト黒色腫癌細胞系と異種移植片において異なる形で発現すると非特許文献1に記載されている。GPNMBはpMel17黒色腫に特異的なタンパク質の前駆体と、33%の同一性を共有する(Kwon et al., 1991, PNAS 88:9228−9232)。GPNMBは樹状細胞結合型膜貫通タンパク質であるDC−HILに対して71%相同である(Shikano et al., 2001 Biol.
Chem. 276:8125−8134)。GPNMBは、造血成長因子によって誘導されるニューロキニン−1タンパク質HGFIN(Bandari et al, Reg. Peptides 111:169−178)または骨関連遺伝子オステオアクチビン(Owen et al. Crit Rev Eukaryot Gene Expr 2003, 13(2−4):205−220)としても知られている。
免疫グロブリンとしても知られる抗体は、典型的には、2本の軽(L)鎖(約25kDa)と2本の重(H)鎖(約50〜70kDa)からなる四量体グリコシル化タンパク質である。各鎖のアミノ末端部分は、主に抗原認識に関与する約100〜110以上のアミノ酸からなる可変領域を含む。LおよびH鎖のカルボキシ末端部分はそれぞれエフェクター機能に主に関与する1つおよび3つまたは4つの定常領域を有する。カッパとラムダとに分類される2種類のヒトL鎖が存在する。H鎖は、抗体のアイソタイプをそれぞれIgM、IgD、IgG、IgAおよびIgEと定義する定常領域アミノ酸配列に基づくミュー、デルタ、ガンマ、アルファまたはエプシロンとして分類される。さらに、アイソタイプは例えばIgG1、IgG2、IgG3、IgG4のサブクラスに分割してよい。
al, 1988 Science 239:1534−1536; Vauglum, et al, 1998 Nature Biotechnol. 16:535−539);および抗体の単鎖scFvsまたはFab断片のファージディスプレイライブラリー(de Haard, et al, 1999 J Biol. Chem. 274: 18218−18230; Knappik, et al, 2000 J. Mol. Biol. 296:57−86; Sheets, et al, 1998 PNAS USA 95:6157−6162; Vaughan, et al, 1994 Nature Biotechnol 14:309−314, 1996; Griffiths et al EMBO J. 13:3245−3260)に対する技術が開発された。さらに、完全ヒトモノクローナル抗体の免疫化と産生に関して、ヒト免疫グロブリン遺伝子と非機能性内在性遺伝子を有するトランスジェニック動物が開発された(Fislrwild, et al, 1996 Nature Biotechnol 14:845−851; Mendez, et al, 1997
Nature Genet. 15:146−156; Nicholson, et
al, 1999 J. Immunol 163, 6898−6906)。
85:5879−5883(1988))。典型的には長さが5〜27アミノ酸残基の範囲のポリペプチドリンカーを用いて、可変軽鎖領域のC末端(VL)を可変重鎖領域のN末端(VH)に結合させる。もしくは、リンカーはVHのC末端をVLのN末端に結合させる。両形式(VL−VHおよびVH−VL)が文献においてうまく使用されてきた。文献で使用された最も一般的なリンカーは(Gly4Ser)3の15アミノ酸のリンカーであるが、205Cと呼ばれる25アミノ酸のリンカー等、利用された他の幾つかのリンカーが存在する(Pantoliano et al., Biochemistry
30:10117−10125(1991))。一本鎖抗体が専門病院で現在利用されている:最も進んだものの1つがh5G1.1またはパキセリズマブである。このscFvはヒトC5補体に対して特異的であり、心肺バイパス手術を受けた心臓病患者の臨床試験に使用されている(Shernan et al., Ann. Thorac Surg. 77:942−949(2004))。
Pavlinkova et al., Clin Cancer Res. 5:2613−1619(1999))。
組換え技術は、インビボ効能を高めることを目的に抗体分子のさらなる向上を可能とするために利用されている。そのような技術は、例えば、分子サイズ、親和性、薬物動態、毒性、特異性、結合価、エフェクター機能、直接または間接のアーミング、併用療法および多様なプロドラッグ手法の最適化を提供する。
GPNMBを発現する病態のインビボ標的化に適する抗体を有し、治療効力を可能とすることが望ましいであろう。
本発明は、GPNMBに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体、ならびにそのような抗体の改変体、誘導体および抗原結合断片を提供する。
本開示のさらなる態様が一部は下記の説明に示され、一部は説明から明らかとなり、また本発明を実施することによって理解されるだろう。
例えば、本発明は以下の項目を提供する。
(項目1)
GPNMBに特異的に結合する、単離されたヒト抗体。
(項目2)
前記抗体がモノクローナル抗体である、項目1記載の抗体。
(項目3)
前記抗体が、107M−1よりも高い親和定数でGPNMBに特異的に結合する、項目1記載の抗体。
(項目4)
VH1−2、VH2−5、VH3−11、VH3−21、VH3−30、VH3−33、VH4−31、VH4−59およびVH5−51からなる群から選択される領域を含む、項目1記載の抗体。
(項目5)
さらに、A2、A3、A20、A27、A30、L2およびO1からなる群から選択される領域を含む、項目4記載の抗体。
(項目6)
VH1−2、VH2−5、VH3−11、VH3−21、VH3−30、VH3−33、VH4−31、VH4−59およびVH5−51からなる群から選択される領域に由来する領域を含む、項目1記載の抗体。
(項目7)
さらに、A2、A3、A20、A27、A30、L2およびO1からなる群から選択される領域に由来する領域を含む、項目6記載の抗体。
(項目8)
配列番号2、20、38、56、74、92、110、128、146、164、182、200、218、236、253、256、260、265、270、274、277、281および285からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目1記載の抗体。
(項目9)
さらに、配列番号11、29、47、65、83、101、119、137、155、173、191、209、227および245からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、項目8記載の抗体。
(項目10)
配列番号4、6、8、13、15、17、22、24、26、31、33、35、40、42、44、49、51、53、58、60、62、67、69、71、76、78、80、85、87、89、94、96、98、103、105、107、112、114、116、121、123、125、130、132、134、139、141、143、148、150、152、157、159、161、166、168、170、175、177、179、184、186、188、193、195、197、202、204、206、211、213、215、220、222、224、229、231、233、238、240、242、247、249、251、254、257、261、266、271、278、282、286、255、258、262、267、272、275、279、283、287、259、263、264、268、269、273、276、280、284および288からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むCDRを含む、項目1記載の抗体。
(項目11)
抗体が、Mab1.10.2、Mab1.15.1、Mab1.2.2、Mabl.7.1、Mab2.10.2、Mab2.15.1、Mab2.16.1、Mab2.17.1、Mab2.21.2、Mab2.22.1、Mab2.24.1、Mab2.3.1、Mab2.7.1およびMab2.8.1からなる群から選択される、項目1記載の抗体。
(項目12)
抗体がIgG1抗体である、項目1〜11のいずれかに記載の抗体。
(項目13)
項目1記載の抗体と細胞毒性薬とを含む、免疫結合体。
(項目14)
前記抗体がMab1.15.1である、項目13記載の免疫結合体。
(項目15)
前記細胞毒性薬がオーリスタチンE(ドラスタチン−10)またはその誘導体である、項目13記載の免疫結合体。
(項目16)
項目13記載の免疫結合体を含む、医薬組成物。
(項目17)
項目12記載の抗体と免疫調節物質とを含む、医薬組成物。
(項目18)
ヒトフレームワーク領域とGPNMBに対する特異的な結合手段とを含む、抗体。
(項目19)
前記手段が、配列番号4、6、8、13、15、17、22、24、26、31、33、35、40、42、44、49、51、53、58、60、62、67、69、71、76、78、80、85、87、89、94、96、98、103、105、107、112、114、116、121、123、125、130、132、134、139、141、143、148、150、152、157、159、161、166、168、170、175、177、179、184、186、188、193、195、197、202、204、206、211、213、215、220、222、224、229、231、233、238、240、242、247、249、251、254、257、261、266、271、278、282、286、255、258、262、267、272、275、279、283、287、259、263、264、268、269、273、276、280、284および288を含むか、またはそれらに由来するCDRを含む、項目18記載の抗体。
(項目20)
項目1記載の抗体をコードする、単離された核酸。
(項目21)
項目20記載の核酸を含む、発現ベクター。
(項目22)
項目21記載のベクターを含む、宿主細胞。
(項目23)
宿主細胞が、大腸菌、チャイニーズハムスター卵巣細胞、HeLa細胞またはNSO細胞である、項目22記載の宿主細胞。
(項目24)
前記核酸が、配列番号2、20、38、56、74、92、110、128、146、164、182、200、218、236、253、256、260、265、270、274、277、281および285からなる郡から選択されるアミノ酸配列をコードする、項目23記載の核酸。
(項目25)
前記核酸が、配列番号1、19、37、55、73、91、109、127、145、163、181、199、217、235、10、28、46、64、82、100、118、136、154、172、190、208、226および244からなる郡から選択される塩基配列を含む、項目24記載の核酸。
(項目26)
GPNMBに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体の製造方法において、(a)置換されるCDR3を含むか、もしくはCDR3をコードする領域を欠く可変領域をコードする核酸の出発レパートリーを提供し;(b)配列番号8、26、44、62、80、98、116、134、152、170、188、206、224、242、259、263、264、268、269、273、276、280、284および288からなる群から選択される配列に実質的に示されるアミノ酸配列をコードするドナー核酸に該レパートリーを組み合わせて、可変領域をコードする核酸の産物レパートリーを提供するようにドナー核酸をレパートリー中のCDR3領域に挿入し;(c)産物レパートリーの核酸を発現し;(d)GPNMBに対して特異的な結合断片を選択し;(e)特異的な抗原結合断片または結合断片をコードする核酸を回収することを含む、方法。
(項目27)
項目26記載の方法により産生される、抗体。
(項目28)
GPNMBに結合する抗体またはその結合断片であって、該抗体またはその結合断片がGPNMB誘導性活性を中和し、かつ該抗体またはその結合断片が、Mab1.2.1、Mab1.10.1およびMab2.22.1からなる群から選択された完全ヒト抗GPNMB抗体、または完全ヒト抗GPNMB抗体Mab1.2.1、Mab1.10.1またはMab2.22.1と同一の抗原結合性ビン中の抗体に交差反応する、抗体またはその結合断片。
(項目29)
GPNMBに結合する抗体またはその結合断片であって、該抗体またはその結合断片がGPNMB誘導性活性を中和し、かつ該抗体またはその結合断片が、Mab2.3.1およびMab1.15.1からなる群から選択された完全ヒト抗GPNMB抗体、または完全ヒト抗GPNMB抗体Mab2.3.1またはMab1.15.1と同一の抗原結合性ビン中の抗体に交差反応する、抗体またはその結合断片。
(項目30)
GPNMBに結合する抗体またはその結合断片であって、該抗体またはその結合断片がGPNMB誘導性活性を中和し、かつ該抗体またはその結合断片が、完全ヒト抗GPNMB抗体Mab2.10.1、または完全ヒト抗GPNMB抗体Mab2.10.1と同一の抗原結合性ビン中の抗体に交差反応する、抗体またはその結合断片。
(項目31)
モノクローナルヒト抗GPNMB抗体のVL領域を該抗GPNMB抗体のVH領域に結合させた、一本鎖Fv抗体。
(項目32)
さらに、抗CD31抗体のVH領域を該抗CD3抗体のVL領域に結合させた、項目31記載の一本鎖Fv抗体。
(項目33)
項目31記載の一本鎖Fv抗体と細胞毒性薬とを含む、免疫結合体。
(項目34)
さらに、シグナルペプチドまたはフラグタグを含む、項目31または32記載の一本鎖Fv抗体。
(項目35)
配列番号355のアミノ酸配列を含む、項目31記載の一本鎖Fv抗体。
(項目36)
配列番号357または配列番号359のアミノ酸配列を含む、項目32記載の一本鎖Fv抗体。
(項目37)
GPNMBの過剰発現に関連する疾患を治療または予防する方法であって、(a)項目12記載の抗体、(b)項目13または33記載の免疫結合体、または(c)項目32記載の一本鎖Fv抗体を含有する有効量の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、方法。
(項目38)
前記疾患が、黒色腫またはCNS系の新生物である、項目37記載の方法。
(項目39)
前記CNS系の新生物が、星細胞腫、神経膠芽腫、髄芽腫または新生物性髄膜炎である、項目38記載の方法。
(項目40)
前記被験体がヒトである、項目37記載の方法。
(項目41)
前記方法が、項目12記載の免疫結合体を被験体に投与することを含み、有効量が2〜4回の投与で0.1mg/kg〜10mg/kgの単位用量である、項目37記載の方法。(項目42)
前記有効量が0.1mg/kg〜2mg/kgの単位用量である、項目41記載の方法。(項目43)
前記有効量が約1mg/kgの単位用量である、項目41記載の方法。
(項目44)
生物試料中のGPNMBの過剰発現細胞を検出する方法であって、該試料と項目1〜11のいずれかに記載の抗体を含有する組成物とを接触させることを含む方法。
(項目45)
前記方法が免疫組織化学である、項目44記載の方法。
本明細書中で使用される「抗体」との用語は、免疫グロブリンまたはその断片または誘導体を指し、インビトロまたはインビボで産生するかにかかわらず抗原結合部位を含有するポリペプチドを包含する。この用語には、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体、非特異的抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、合成抗体、組換え抗体、ハイブリッド抗体、突然変異抗体、改変抗体およびグラフト化抗体が含まれるが、これらに限定されない。「インタクトな抗体」等の「インタクトな」との用語によって特に修飾されていない限り、本開示の目的のための「抗体」との用語は、Fab、F(ab’)2、Fv、scFv、bi−scFv、bi−Ab、Fd、dAb等の抗体断片および抗原結合機能(すなわち、GPNMBに特異的に結合する能力)を保持する他の抗体断片も包含する。
N Y. 1989を参照)。ここに記載の分析化学、合成有機化学および医薬品化学と製薬化学に関連して利用される用語および実験手順と技術は当分野でよく知られており、慣用されるものである。標準的な技術が、化学合成、化学分析、医薬品、製剤および投与ならびに患者の治療のために用いられる。
79: 315−321; Kostelny et al., 1992 J. Immunol. 148:1547−1553を参照)。二重特異性抗体は、単一結合部位を有する断片の形態(例えば、Fab、Fab’およびFv)では存在しない。
scFv成分はジェンバンクに寄託された配列(受託番号CAE85148)から得られた。CD3または他のT細胞抗原を標的とすることが知られている別の抗体は、一本鎖骨格にあろうが、完全なIgGにあろうが、抗GPNMBに結合させた場合に悪性腫瘍を治療するために同様に有効であろう。
表1:ヒト抗GPNMB抗体生殖細胞系列領域組合せ
表2A:抗体の塩基(DNA)配列とアミノ酸配列
特定の実施態様において、本発明のGPNMB結合性ヒト抗体は、生殖細胞系V重鎖領域VH4−31を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する:
特別な実施態様において、本発明のGPNMB結合性ヒト抗体は、生殖細胞系V重鎖領域VH1−2を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する:
特別な実施態様において、本発明のGPNMB結合性ヒト抗体は、生殖細胞系V重鎖領域VH2−5を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する:
X2はYまたはFである;および
X3はYまたはNである
(配列番号263)。
(配列番号264)
特定の実施態様において、本発明の抗GPNMB抗体は、配列番号44のCDR3アミノ酸配列を含む。
特別な実施態様において、本発明のGPNMB結合性ヒト抗体は、生殖細胞系V重鎖領域VH3−33を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する:
(配列番号269)
特定の実施態様は、配列番号98のCDR3アミノ酸配列を有する抗GPNMB抗体2.15.1である。
特別な実施態様において、本発明のGPNMB結合性ヒト抗体は、生殖細胞系V重鎖領域VH3−11を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する:
X2はSまたはYである;
X3はSまたはTである;
(配列番号271)
特定の実施態様において、本発明の抗GPNMB抗体は、配列番号112のCDR1配列を含む。
X5はTまたはIである;
X6はTまたはIである;
X7はYまたはHである;
(配列番号272)
特定の実施態様において、本発明の抗GPNMB抗体は、配列番号114のCDR2配列を含む。
X2はIまたはGである;
(配列番号273)
特定の実施態様は、配列番号116のCDR3アミノ酸配列を有する抗GPNMB抗体2.16.1である。
特別な実施態様において、本発明のGPNMB結合性ヒト抗体は、生殖細胞系V重鎖領域VH3−21を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する:
X2はVまたはEである;
X3はEまたはQである;
X4はFまたはLである;
X5はSまたはFである;
(配列番号274)
特定の実施態様において、配列番号274はD1−26に組み合わされ、さらにJH4bと組み合わされる。特定の実施態様において、親和性成熟後に、これらのGPNMB結合性ヒト抗体、例えば、Mab2.21.1は配列番号146のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号145の塩基配列によりコードされうる。
(配列番号275)
特定の実施態様において、本発明の抗GPNMB抗体は、配列番号150のCDR2配列を含む。
X2はIまたはWである;
(配列番号276)
特定の実施態様は、配列番号152のCDR3アミノ酸配列を有する抗GPNMB抗体2.21.1である。
特別な実施態様において、本発明のGPNMB結合性ヒト抗体は、生殖細胞系V重鎖領域VH3−30を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する:
X2はSまたはNである;
(配列番号277)
特定の実施態様において、配列番号277がD3−10に組み合わされ、さらにJH6bと組み合わされる。特定の実施態様において、親和性成熟後に、これらのGPNMB結合性ヒト抗体、例えば、Mab2.10.2は配列番号74のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号73の塩基配列によりコードされうる。
(配列番号278)
特定の実施態様において、本発明の抗GPNMB抗体は、配列番号76のCDR1配列を含む。
(配列番号279)
特定の実施態様において、本発明の抗GPNMB抗体は、配列番号78のCDR2配列を含む。
X2はTまたはLである;
X3はMまたはVである;
X4はVまたはIである;
X5はIまたはRである;
X6はIまたはGである;
(配列番号280)
特定の実施態様は、配列番号80のCDR3アミノ酸配列を有する抗GPNMB抗体2.10.2である。
特別な実施態様において、本発明のGPNMB結合性ヒト抗体は、生殖細胞系V重鎖領域VH4−59を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する:
X2はSまたはNである;
X3はIまたはFである;
(配列番号281)
特定の実施態様において、配列番号281がD6−19に組み合わされ、さらにJH4bと組み合わされる。特定の実施態様において、親和性成熟後に、これらのGPNMB結合性ヒト抗体、例えば、Mab1.10.2は配列番号2のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号1の塩基配列によりコードされうる。
X2はSまたはNである;
(配列番号282)
特定の実施態様において、本発明の抗GPNMB抗体は、配列番号4のCDR1配列を含む。
(配列番号283)
特定の実施態様において、本発明の抗GPNMB抗体は、配列番号6のCDR2アミノ酸配列を含む。
X2はSまたはRである;
(配列番号284)
特定の実施態様は、配列番号8のCDR3アミノ酸配列を有する抗GPNMB抗体1.10.2である。
特別な実施態様において、本発明のGPNMB結合性ヒト抗体は、生殖細胞系V重鎖領域VH5−51を含むか、またはそれに由来し、下記のアミノ酸配列を有する:
X2はSまたはIである;
X3はSまたはNである;
X4はIまたはVである;
X5はGまたはDである;
X6はMまたはIである;
(配列番号285)
特定の実施態様において、配列番号285がD5−24に組み合わされ、さらにJH4bと組み合わされる。特定の実施態様において、親和性成熟後に、これらのGPNMB結合性ヒト抗体、例えば、Mab2.24.1は配列番号182のアミノ酸配列を有し、かつ配列番号181の塩基配列によりコードされうる。
X3はSまたはNである;
(配列番号286)
特定の実施態様において、本発明の抗GPNMB抗体は、配列番号184のCDR1配列を含む。
X5はGまたはDである;
(配列番号287)
特定の実施態様において、本発明の抗GPNMB抗体は、配列番号186のCDR2アミノ酸配列を含む。
X2はLまたはHである;
(配列番号288)
特定の実施態様は、配列番号188のCDR3アミノ酸配列を有する抗GPNMB抗体2.24.1である。
in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.)が挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、本開示はGPNMBに対して特異的な抗体を得るための方法を提供する。そのような抗体中のCDRは、表1に同定されたHおよびL可変領域の特定の配列に限定されず、GPNMBに特異的に結合する能力を保持する配列の改変体を含んでよい。そのような改変体は、表1に示される配列から、当業者によって当分野でよく知られた技術を用いて得てよい。例えば、アミノ酸置換、欠失または付加をFRおよび/またはCDRに対して行なうことができる。FRの変更は通常抗体の安定性と免疫原性を向上させるように設計するが、CDRの変更は典型的には抗体の、その標的に対する親和性を高めるように設計する。FRの改変体は、天然の免疫グロブリンアロタイプも含む。そのような親和性を高める変更は、CDRの変更と抗体のその標的に対する親和性の試験を伴う日常的な技術により実験的に決定してよい。例えば、保存アミノ酸置換は開示されたCDRのいずれか1つで行なうことができる。多様な変更は当分野に記載される方法にしたがって行なうことができる(Antibody Engineering, 2.sup.nd ed., Oxford University Press, ed. Borrebaeck, 1995)。これらのものとして、機能的に等しいアミノ酸配列をコードする異なるコドンを配列内で置換して、「サイレント」変化を作って変化させた塩基配列が挙げられるが、これらに限定されない。例えば、非極性アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸として、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷(塩基性)アミノ酸として、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷(酸性)アミノ酸として、アスパラギン酸とグルタミン酸が挙げられる。配列内のアミノ酸の置換物は、該アミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択してよい(表3を参照)。さらに、ポリペプチド内の天然の残基はアラニンと置換してもよい(Acta Physiol. Scand. Suppl. 643:55−67, 1998; Adv. Biophys.
35:1−24, 1998)。
Nature(1994)370:389−391)。さらなる実施態様において、1つ以上の選択されたH可変および/またはL可変遺伝子のランダム変異導入法、例えば変異性PCR(Proc.Nat.Acad.Sci U.S.A.(1992)89:3576−3580)を用いて、ここに記載の配列から得られた1つ以上の配列を保有する新規なH可変またはL可変領域を作ってよい。使用してよい別の方法は変異誘発をH可変またはL可変遺伝子のCDRに直接向けることである(Proc.Nat.Acad.Sci U.S.A.(1994)91:3809−3813; J.MoI.Biol.(1996)263: 551−567)。同様に、一つ以上か、または3つのすべてのCDRをH可変またはL可変領域のレパートリーにグラフトしてよく、次に、これらの可変領域をGPNMBに対して特異的な抗原結合性断片に関してスクリーニングする。
Int. J. Cancer(Suppl.)7:51−52)。このようにして作られた二特異性抗体は、GPNMBを発現する細胞を選択的に死滅させる。
さらに、本開示は、開示された抗体をコードする単離された核酸を提供する。核酸はDNAまたはRNAからなり、全体的または部分的に合成または組換えであってよい。ここに示される塩基配列への言及は、その特定された配列を有するDNA分子も包含し、文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、UがTに置換されている特定された配列を有するRNA分子も包含する。
al., 1999)。手短に言えば、適当な宿主細胞として、細菌、植物細胞、哺乳類の細胞および酵母およびバキュロウイルスが挙げられる。異種ポリペプチドの発現のために当分野で利用可能な哺乳類の細胞系として、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞、HeLa細胞、ベビーハムスター腎細胞、NSOマウスミエローマ細胞およびその他多数が挙げられる。通常の細菌宿主は大腸菌である。本発明に適合するタンパク質発現系を用いて、開示された抗体を作ってもよい。適当な発現系としてトランスジェニック動物も挙げられる(Gene Expression Systems, Academic Press, eds. Fernandez et at, 1999)。
別の態様において、本発明の抗体は、別の治療物質または細胞毒性物質を、GPNMBを発現する細胞に送達するターゲッティング剤として用いることができる。この方法は、治療物質または細胞毒性物質に結合させた抗GPNMB抗体を、該抗体をGPHNMBに結合させる条件下に投与することを含む。
et al., 1987 in Controlled Drag Delivery, Robinson et al. eds., Marcel Dekker, Inc., 2nd ed. 1987; Thorpe 1985, in Monoclonal Antibodies ’84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et al. eds., EDITOR, 1985; Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy, Baldwin
et al. eds., Academic Press 1985; and Thorpe et al., 1982, Immunol. Rev. 62:119−58を参照)。
al., 1995, Bioorg−Med−Chem.3(10):1305−1312)であってよい。
本発明の抗体は、それらの使用方法に応じて、GPNMBのアゴニストかアンタゴニストのいずれかとして作用することができる。抗体は、被験体、特にヒトにおいて、内科的疾患を予防、診断または治療するために用いることができる。本発明の抗体はGPNMBまたはGPNMBを発現する細胞の単離にも使用することができる。さらに、抗体は、疾患の危険性があるか、疾患を受けやすい被験体または異常なGPNMB発現または機能に関連した疾患を有する被験体を治療するために用いることができる。本発明の抗体はそのような被験体においてGPNMBを検出するために用いることができる。
Binding Assay Bioanalytical Focus Group(LBABFG)の推奨 Pharm Res. 2003 Nov;20(ll):1885−900を参照)。抗体を用いる検出方法は当分野でよく知られ、例えば、ELISA、放射性免疫測定法、免疫ブロット、ウエスタンブロット、IHC、免疫蛍光法、免疫沈降法が挙げられる。抗体は、GPNMBを検出するためにこれらの一種類以上の技術を取り込んだ診断キットにて提供してよい。そのようなキットは、タンパク質の検出を助ける他の成分、詰め込み、使用説明書または他の材料を含んでよい。特定の実施態様において、本発明の抗体は放射性同位元素に結合体化してよく、GPNMBを過剰発現する細胞を検出するために被験体に注射する。
GPNMBの異常な発現および/または活性により関連するか、またはそれにより特徴付けられる疾患の予防および/または治療に効果的な本発明の予防薬または治療薬または組成物の量は標準的臨床方法により決定することができる。例えば、癌の治療および/または予防に効果的な組成物の投与量は組成物を動物模型に投与することにより決定できる。さらに、インビトロアッセイを任意に用いて最適な投与量範囲の同定に役立ててよい。予備的な投与量を例えば動物試験に基づいて決定し、ヒト投与のための投与量のスケーリングを当分野で受け入れられたプラクティスにしたがって実施する。毒性と治療効力は細胞培養物または実験動物での標準的な製薬手順により決定することができる。細胞培養アッセイまたは動物研究から得られたデータはヒトに使用される投与量範囲を明確に表すのに用いることができる。1つの動物模型で得られる治療効果のある投与量は、他の動物、例えばヒトに使用するために当分野で知られている変換因子を用いて変換することができる(例えば、Freireich et al.(1966)Cancer Chemother. Reports, 50(4):219−244を参照)。
本開示は、抗GPNMB抗体を含有する組成物を提供する。そのような組成物は、薬学的用途と患者への投与に適するものだろう。典型的に、組成物は本発明の1つ以上の抗体と薬学的に許容される賦形剤を含有する。「薬学的に許容される賦形剤」との語句は、医薬品投与に適合性のある、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗かび剤、等張剤および吸収遅延剤等を含む。薬学的に活性のある物質のそのような媒体や薬剤の使用は当分野でよく知られている。組成物は、追加治療機能、付加治療機能または増強治療機能を提供する他の有効化合物を含んでもよい。医薬組成物は、容器、パックまたはディスペンサーに、投与の指示説明書とともに含まれてもよい。
組換えヒトGPNMB(配列番号289)、特に細胞外領域(ECD)を、免疫原として使用するために調製した。一般的に、C末端V5−HISタグを有するGPNMBのECDをコードするcDNAはHEK293細胞にトランスフェクトして、発現させて、POROS HS 50(Applied Biosystems, Foster City, CA)による陽イオン交換クロマトグラフィーを用いて精製する。試料を1MのNaClでpH5.5にて溶出した後に、金属アフィニティークロマトグラフィー(ファルマシア金属キレート、5mL)を行なった。試料を10CV(カラム体積)にわたる10〜500mMのイミダゾールのリニアグラジエントに対して溶出させた。20mMトリス/50mM NaCl、pH7.4(2L×2)を用いて透析した。次に、試料を0.22μmのフィルターでろ過した。
完全ヒト抗体を作るために好ましい方法は、ヒト重鎖遺伝子座とカッパ軽鎖遺伝子座の245kbと190kbの大きさの生殖細胞系列配置を含むように設計されたマウスのXenoMouse(登録商標)株を用いる(Green et al. 1994 Nature Genetics 7:13−21; Mendez et al. 1997 Nature Genetics 15:146−156; Green and Jakobovits, 1998 J. Exp. Med. 188:483−495;米国特許第6,162,963号、米国特許第6,150,584号、米国特許第6,114,598号、米国特許第6,075,181号および米国特許第5,939,598号)。別法であるミニ遺伝子座法では、外因性Ig遺伝子座を、Ig遺伝子座からの断片(個々の遺伝子)を包含させることにより模倣する。例えば、1つ以上のVH遺伝子、1つ以上のDH遺伝子、1つ以上のJH遺伝子、ミュー定常領域、および第2定常領域(好ましくはガンマ定常領域)を、動物に挿入される構築物に形成する(Taylor et al, 1992, Chen et al, 1993, Tuaillon et al, 1993, Choi et al, 1993, Lonherg et al,(1994), Taylor et al, (1994), and Tuaillon et al.,(1995), Fishwild et al,(1996);米国特許第5,545,807号、米国特許第5,545,806号、米国特許第5,625,825号、米国特許第5,625,126号、米国特許第5,633,425号、米国特許第5,661,016号、米国特許第5,770,429号、米国特許第5,789,650号、米国特許第5,814,318号、米国特許第5,877,397号、米国特許第5,874,299号、米国特許第6,255,458号、米国特許第5,591,669号、米国特許第6,023,010号、米国特許第5,612,205号、米国特許第5,721,367号、米国特許第5,789,215号、米国特許第5,643,763号、米国特許第5,981,175号)。λκXenoMouse(登録商標)は、ラムダV領域を利用して抗GPNMB抗体を作るために用いてよいことがわかっている。そのような抗体は本発明の範囲にある。
(実施例1で調製された)GPNMB−V5His免疫原を抗原として用いた。GPNMBに対するモノクローナル抗体はXenoMouse(登録商標)マウス(XenoMouse(登録商標)XMG2株)、Abgenix社、フレモント、カリフォルニア州を連続的に免疫化することにより発達させた。XenoMouse(登録商標)動物は、すべての注射について足蹠経路によって免疫を行なった。各注射の全体積は1マウスあたり50μlであり、1足蹠あたり25μlであった。
免疫化XenoMouse(登録商標)マウスからの血清中の抗GPNMB抗体力価はELISAにより決定した。簡単に説明すれば、3セットのELISAを設定した。1μg/mLのGPNMB(+NMB)、1μg/mLのGPNMB(−NMB)および1μg/mLのNMBを、抗原コーティング緩衝液(0.1M炭酸緩衝液、pH9.6、NaHCO3(分子量84)8.4g/L)中、Costar Labcoatユニバーサルバインディングポリスチレン96ウエルプレート(Corning、Acton、MA)に一晩、4℃でコーティングした。翌日、プレートを、Biotekプレート洗浄器を用いて洗浄緩衝液(1×PBS中、0.05%Tween20)で3回洗浄した。次に、プレートを200μl/ウエルのブロッキング緩衝液(1×PBS中、0.5%BSA、0.1%Tween20、0.01%チメロサール)でブロックし、室温で1時間インキュベートした。一時間のブロッキング後、プレートを、Biotekプレート洗浄器を用いて洗浄緩衝液で3回洗浄した。GPNMBで免疫したXenoMouse(登録商標)マウスまたは未処置XenoMouse(登録商標)動物を、0.5%BSA/PBS緩衝液中で、1:100の最初の希釈物からデュプリケートで1:3希釈にて滴定した。最後のウエルをブランクとして残した。これらのプレートを室温で2時間インキュベートし、次にプレートを、Biotekプレート洗浄器を用いて洗浄緩衝液で3回洗浄した。ヤギ抗ヒトIgG Fcに特異的な西洋ワサビパーオキシダーゼ(HRP、Pierce、Rockford、IL)結合体化抗体を1μg/mLの最終濃度で加え、1時間室温でインキュベートした。プレートを、Biotekプレート洗浄器を用いて洗浄緩衝液で3回洗浄した。洗浄後、TMB発色基質(BioF×BSTP−0100−01)を加えることにより、10〜20分間または陰性コントロールウエルが色を示し始めるまでプレートを展開した。次に、ストック溶液(1ボトルあたり100mLのH2Oで再構成したTMB用650nMのストック試薬(BioF×BSTP−0100−01))を加えることによりELISAを停止した。各XenoMouse(登録商標)動物の特定の力価を650nmでの光学密度から決定し、下記の表2と表3に示す。力価の値は、バックグランドの2倍のODの読みを有する血清の最大希釈の逆数である。したがって、数値が高ければ高いほど、GPNMBに対する液性免疫反応が高かった。結果を表5に示す。
ハイブリドーマ細胞系を、慣用の技術を用いて抗GPNMB力価を有することが示された免疫化マウスから作った(Mendez et al, 1997, Nat Genet. 15:146−156を参照)。
表6.ハイブリドーマ抗GPNMB活性
ここに記載の一定の抗体は、米国特許出願第20030157730号に記載されているプロトコールにしたがってグループ化した。MxhIgG結合体化ビーズを一次抗体に対する結合のために調製する。必要とされる上清の容量は式:(n+10)×50μL(式中、n=プレート上の試料の総数)を用いて計算される。濃度が知られている場合、0.5μg/mLを用いる。ビーズ貯蔵物を穏やかにボルテックスで攪拌し、次に上清中で、1ウエルあたり各ビーズの2500の濃度まで、または0.5×105/mLまで希釈し、シェーカーで暗所、室温で一晩、または0.5μg/mLの知られている濃度の場合、2時間インキュベートする。吸引後、50μLの各ビーズをフィルタープレートの各ウエルに加え、次に、100μL/ウエル洗浄緩衝液を加え、吸引することにより一回洗浄した。抗原とコントロールをフィルタープレートに50μL/ウエルで加え、次にカバーをかぶせて、暗所で1時間、シェーカー上でインキュベートする。洗浄工程後、未知の二次抗体を、一次抗体に用いられたのと同じ希釈(または知られている場合は同じ濃度)を用いて、50μL/ウエルで加える。次に、プレートを暗所で2時間、シェーカー上、室温でインキュベートした後、洗浄工程に供する。次に、1:500で希釈した50μL/ウエルのビオチニル化mxhIgGを加えて、暗所で1時間、シェーカー上、室温にてインキュベートする。洗浄工程後、50μL/ウエルのストレプトアビジン−PEを1:1000で加え、暗所で15分間、シェーカー上、室温にてインキュベートする。洗浄工程後、各ウエルを80μLのブロッキング緩衝液に再懸濁し、Luminexを用いて読む。結果は、モノクローナル抗体は異なるグループに属することを示す。異なるグループ(bin)からの抗体による競争結合は類似または隣接するエピトープに対する抗体特異性を支持する。非競争的結合は独自のエピトープに対する抗体特異性を支持する。
抗GPNMBモノクローナル抗体を、冷凍され固定化された組織試料に対する反応性に関して評価した。組織片(5μm)をホルマリンとパラフィンに包埋された組織試料から切り出し、キシレン、およびPBSで終わる段階的なエタノール系中でインキュベートすることにより再水和した。内因性のパーオキシダーゼ活性を、メタノール中の過酸化水素の3%溶液でクエンチした。
表11:抗GPNMB Mab染色頻度
抗GPNMB抗体は、一般的な腫瘍組織マイクロアレイにおける肺扁平上皮癌(SCC)の14試料のうち10試料を染色し、SCCに特異的なアレイ中で60試料のうち24試料が陽性であった。
黒色腫癌細胞系UACC−62により発現する細胞膜結合性GPNMBタンパク質に対する抗GPNMB抗体の特異性をFACS分析によって分析した。GPNMB抗原を発現しない腎臓癌細胞系TK10を陰性コントロールとして用いた。アイソタイプにマッチする抗体pK16.3を陰性コントロールして用いた。細胞を、PBS(CaとMgとを含まない)で2回洗浄し、細胞が脱離するまで37℃でヴェルセンとともにインキュベートし、カウントし、1アッセイチューブあたり100万細胞を分注した。次に、細胞を2回洗浄し、氷冷FACS緩衝液(0.01M HEPES、0.15M NaCl、0.1%NaN3および4%FBS)に再懸濁した。1μg/mLの一次抗体を細胞に加えた。細胞を氷上で30分間インキュベートし、2〜3回洗浄し、1mLの氷冷FACS緩衝液に再懸濁した。R−PE結合体化ヤギ抗ヒト抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratory)を1:100希釈で加え、細胞を氷上で30分間インキュベートした。1mLの氷冷FACS緩衝液により3回洗浄した後、細胞をPBS中の0.5〜1mLの1%ホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーにより分析した。
造血悪性細胞の表面上のGPNMBの相対的な発現を測定するために、多様なリンパ腫と白血病に由来する細胞系を抗GPNMB抗体とともにインキュベートし、FACSにより分析した。リンパ腫と白血病に由来する細胞を氷冷FACS緩衝液で2回洗浄し、アッセイチューブあたり100万細胞を再懸濁した。1μg/mLのMAb1.15.1抗体を細胞に加え、細胞を氷上で30分間インキュベートした。次に、細胞を2〜3回洗浄し、1mLの氷冷FACS緩衝液に再懸濁した。R−PE結合体化ヤギ抗ヒト抗体を1:100希釈で加え、細胞を氷上で30分間インキュベートした。細胞を1mLの氷冷FACS緩衝液で3回洗浄し、PBS中の0.5〜1mLの1%ホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーにより分析した。
細胞を、PBS(CaとMgとを含まない)で2回洗浄し、細胞が脱離するまで37℃でヴェルセンとともにインキュベートし、カウントし、集め、溶解緩衝液(0.15M NaCl、0.02Mトリス塩酸、10%グリセロール、1%NP−40、0.01M EDTAおよび膵臓抽出物、プロナーゼ、サーモリシン、キモトリプシンおよびパパインを含むプロテアーゼ阻害剤(Roche、Germany))中で、30分間氷上で溶解した。上清を集めて、タンパク濃度をBCAタンパク質アッセイキット(Pierce,USA)により決定した。一次抗体を細胞溶解物に加え、氷上で3時間インキュベートした後、プロテインGアガロース(Amersham,USA)を2時間加えた。免疫沈澱タンパク質を洗浄し、試料緩衝液中で沸騰させ、4〜20%ゲルにより分離した。免疫ブロットのために、タンパク質をPVDF膜(Invitrogen,USA)に移し、抗GPNMB抗体(0.5μg/mL)をプローブに用いて調べた後、HRP結合体化ヤギ抗ヒト抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratory)の1:4000希釈物で調べた。免疫結合体をECLウエスタンブロット検出試薬(Amersham,USA)により検出した。
GPNMB抗原を発現する細胞系UACC−62および非発現細胞系TK10を平底96ウエル組織培養プレート(Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ、USA)にウエルあたり3000細胞の密度で塗布した。細胞がおよそ25%の密集度に一度達したら、100ng/ウエルの二次抗体−毒素結合体(ヤギ抗ヒトIgGサポリン;Advanced Targeting Systems、San Diego、USA、HUM−ZAP;cat.#IT−22)を加えた。抗GPNMB
MAbs2.10.2、2.22.1、1.15.1またはアイソタイプコントロールmAb(pK16.3)を各ウエルに10または50ng/mLの最終濃度で加えた。抗EGFRモノクローナル抗体(MS−269−PABX、NeoMarkers、Fremont、CA、USA)を陽性一次抗体コントロールとして用いた。600μMの化学療法剤5−FUを陽性試薬コントロールとして用いた。5日目に、細胞をトリプシン処理し、6ウエル組織培養プレートに移し、37℃でインキュベートした。プレートを毎日調べ、8〜10日の間にすべてのプレートをギムザ染色し、コロニーをカウントした。
UACC−62とTK10細胞を平底96ウエル組織培養皿(Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ、USA)に塗布した。2日目または細胞がおよそ25%の密集度に達したら、アイソタイプコントロール、EGFR(NeoMarkers MS−269−PABX、Fremont、CA、USA)、2.22.1または2.10.2等の多様な濃度(1〜1000ng/mL)の未結合体化およびオーリスタチンE結合体化抗体(Seattle Genetics、Bothell、WA、USA)を細胞に加えた。MAb2.3.1はFACS分析により示されるようにGPNMB発現細胞に結合しないので本研究におけるアイソタイプコントロールのために選択された。EGFレセプターに対して作られたモノクローナル抗体を用いて、AE結合体化抗体が仲介する特異的な死滅を示した。5日目に、細胞をトリプシン処理し、6ウエル組織培養プレートに移し、37℃でインキュベートした。プレートを毎日調べた。8〜10日目に、すべてのプレートをギムザ染色し、プレート上のコロニーをカウントした。
黒色腫細胞系を平底96ウエル組織培養プレート(Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ、USA)に塗布した。2日目または細胞がおよそ25%密集度に達するまで、多様な濃度の未結合体化およびオーリスタチンE結合体化1.15.1を細胞に加えた。MAb2.6.2−AEも、この研究で結合体化アイソタイプコントロールとして用いた。5日目、細胞をトリプシン処理し、6ウエル組織培養皿に移し、37℃でインキュベートした。プレートを毎日調べた。8〜10日目、すべてのプレートをギムザ染色し、プレート上のコロニーをカウントした。
6ウエル組織培養プレート(Becton Dickinson、Franklin Lakes、NJ、USA)への被覆前に、リンパ腫と白血病細胞系を、メチルセルロース基本培地(R&D Systems、USA)と混合し、多様な濃度の非結合体化およびオーリスタチンE結合体化1.15.1抗体と混合した。さらに、Mab2.6.2−AEはGPNMBを発現する細胞に結合しないので、本研究の結合体化アイソタイプコントロールとして含めた。プレートを37℃でインキュベートし、毎日調べた。14〜18日目に、プレート上のコロニーをカウントした。
研究N−386は、胸腺欠損マウスに定着したヒトSK−MEL−2黒色腫異種移植片に対する抗体−医薬結合体CR011−vcMMAEの効力と治療的効能を評価するために実施された。
試験動物:ヒト腫瘍異種移植片のために用いられる5〜6週齢の胸腺欠損マウス(CD−1nu/nuメス)はHarlan Laboratories(Indianapolis、IN)から得た。動物は、実験動物保護の評価認定のための国際協会(Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International(AAALACインターナショナル))のガイドラインにしたがって特定のパソゲンフリー条件で収容した。試験動物にはペレット状の餌と水を自由に与え、調節換気(暖房・換気および空調)、温度(22±2℃)、相対湿度(55%±15%)および明期(12時間)を有する部屋に保持した。すべての研究は承認された施設の動物保護と使用のプロトコールにより実施した。
SK−MEL−2黒色腫に対するインビボ抗腫瘍効果。GPNMBを発現する細胞に対してCR011−vcMMAEのインビトロでの効力と細胞毒性に基づいて、抗腫瘍効果をインビボで調べた。
vivo evaluation of new antitumor drugs,
in Immunodeficient mice in Oncology, vol.42(Fiebig HH and Berger DPe eds)pp 1−22, Contrib. Oncol. Basel, Karger(1992))。
CR011−vcMMAEは、腫瘍成長の阻害として始まるが、すぐに定着ヒト黒色腫異種移植片の完全な退縮を導く実質的で、用量依存的な再現性のある抗腫瘍効果を生じる;この退縮は長く続き、成功した治療後の腫瘍の再成長は観察されなかった。
ハイブリドーマからのヒトGPNMB mAb由来の重鎖とκ鎖の転写物の配列は、poly(A+)DNAから生じたPCR生成物の直接の配列決定により得られた。さらに、PCR生成物は、TAクローニングキット(Invitrogen)を用いてpCRIIにクローニングし、Prismダイターミネーター配列決定キットおよびABI377配列決定装置を用いて両鎖の配列を決定した。各PCR反応は、下記表17に示される5’センスプライマーの混合物を用いた。
Centre for Protein Engineering, Cambridge, UK)との配列比較により分析した。
表17に示された抗体の可変重鎖および可変軽鎖の配列を決定してそれらのDNAとタンパク質配列を決定した。
抗体−1.10.2
重鎖可変領域
塩基配列
軽鎖可変領域
塩基配列
抗体−1.15.1
重鎖可変領域
塩基配列
軽鎖可変領域
塩基配列
抗体−1.2.2
重鎖可変領域
塩基配列
軽鎖可変領域
塩基配列
抗体−1.7.1
重鎖可変領域
塩基配列
軽鎖可変領域
塩基配列
抗体−2.10.2
重鎖可変領域
塩基配列
軽鎖可変領域
塩基配列
抗体−2.15.1
重鎖可変領域
塩基配列
軽鎖可変領域
塩基配列
抗体−2.16.1
重鎖可変領域
塩基配列
軽鎖可変領域
塩基配列
抗体−2.17.1
重鎖可変領域
塩基配列
軽鎖可変領域
塩基配列
抗体−2.21.1
重鎖可変領域
塩基配列
軽鎖可変領域
塩基配列
抗体−2.22.1
重鎖可変領域
塩基配列
軽鎖可変領域
塩基配列
抗体−2.24.1
重鎖可変領域
塩基配列
軽鎖可変領域
塩基配列
抗体−2.3.1
重鎖可変領域
塩基配列
軽鎖可変領域
塩基配列
抗体−2.6.1
重鎖可変領域
塩基配列
軽鎖可変領域
塩基配列
抗体−2.7.1
重鎖可変領域
塩基配列
軽鎖可変領域
塩基配列
抗体−2.8.1
重鎖可変領域
塩基配列
軽鎖可変領域
塩基配列
(実施例16:診断剤としての抗GPNMB抗体の使用)
試料中のGPNMB抗原の検出:
下記は、試料中のGPNMB抗原を検出するための酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)のプロトコールである。この測定法において、96ウエルマイクロタイタープレートや384ウエルマイクロタイタープレート等のマイクロタイタープレートのウエルをGPNMBに対する第一の完全ヒトモノクローナル抗体により数時間吸着させる。固定化抗体は、試験試料に存在するかもしれないGPNMBのいずれかに対する捕捉抗体として働く。ウエルをすすぎ、分析物の非特異的吸着を妨げるために、乳タンパク質やアルブミン等のブロッキング剤で処理する。
サンドイッチELISAはヒト血清中のGPNMBレベルを定量するために用いることもできる。サンドイッチELISAに使用される2種類の完全ヒトモノクローナル抗GPNMB抗体はGPNMB分子上の異なるエピトープを認識する。このELISAは下記の通り実施する:コーティング緩衝液(0.1M NaHCO3,pH9.6)中、2μg/mLの濃度で50μlの捕捉用抗GPNMB抗体をEISAプレート(Fisher)にコートする。4℃で一晩のインキュベーション後、プレートを200μlのブロッキング緩衝液(PBS中、0.5%BSA、0.1%Tween20、0.01%チメロサール)で1時間、25℃で処理する。プレートをPBS中の0.05%のTween20(洗浄緩衝液WB)で洗浄する(3×)。正常血清または患者血清(Clinomics、Bioreclaimation)を、50%ヒト血清を含むブロッキング緩衝液で希釈する。プレートを血清試料とともに一晩、4℃でインキュベートし、WBで洗浄し、次に100μl/ウエルのビオチニル化検出用抗GPNMB抗体とともに1時間、25℃でインキュベートする。洗浄後、プレートをHRP−ストレプトアビジンとともに15分間インキュベートし、前と同じように洗浄し、次に色の発生のためにH2O2中の100μl/ウエルのo−フェニレンジアミン(Sigma展開溶液)で処理する。反応は50μl/ウエルのH2SO4(2M)で停止させ、ELISAプレートリーダーを用いて492nmで分析した。血清試料中のGPNMBの濃度は4パラメーター曲線適合プログラムを用いて精製GPNMB抗原の希釈物と比較することにより計算する。
患者の癌の段階付け:
上記診断例で示され、論じられた結果に基づいて、GPNMB抗原の発現レベルに基づき被験体の癌の段階付けができることが理解されよう。癌の一定の種類(例えば、黒色腫)について、疾患の進行の多様な段階および/または癌の治療的処置における多様な時点で診断される患者からの血液試料を採取する。血液試料に存在するGPNMB抗原の濃度を、存在する抗原の量を特異的に決定する方法を用いて決定する。そのような方法には、ELISA法、例えば前記の診断例に記載した方法がある。進行または治療の各段階に関する統計的に有意な結果を提供する試料集団を用いて、各段階に特徴的と見なされる抗原の濃度範囲が明確に示される。
卵巣癌腫瘍を有すると疑われる被験体を同定し、疑われた腫瘍からの組織試料を試験するために取り出す。次に、取り出された組織を、比色分析用標識を有する抗GPNMB抗体に接触させる。抗GPNMB抗体が取り出された組織に特異的に結合するかどうかを決定する。結合は癌性組織を示す一方で、結合の欠如は非癌性組織を示す。このように患者の状態を診断して、引き続く試験、カウンセリングおよび/または治療を容易にする。
腫瘍細胞上のGPNMBの標的化は癌の危険があるか、または癌に苦しむ被験体を治療するために有用である。そのような被験体は、本発明の抗GPNMB抗体による治療から恩恵を受けるだろう。典型的には、抗体は、外来患者の設定で、ゆっくりとした静脈内(IV)注射により約0.1〜1.0mg/kgの用量にて週1回の投与で投与する。抗体の適当な治療効果のある用量は治療を行う医師により選択され、おおよそ1μg/kg〜20mg/kg、1μg/kg〜10mg/kg、1μg/kg〜1mg/kg、10μg/kg〜1mg/kg、10μg/kg〜100μg/kg、100μg/kg〜1mg/kgおよび500μg/kg〜5mg/kgの範囲にあるだろう。
この研究は抗体−医薬結合体の構成成分とその製剤の抗腫瘍効果を決定し、これらの結果をインタクトな免疫結合体の抗腫瘍効果に関連付けるために行なった。
SK−ME−2黒色腫の断片を外套針によりマウスに移植し、腫瘍が定着した後、CR011−vcMMAEと多様な成分による治療を調べて、この物質の抗腫瘍効果の特異性を示した。リン酸緩衝食塩水(ベヒクル)または免疫結合体調製物の成分(3%DMSO、スクロース、リン酸媒体)のいずれかが投与されたコントロールグループは腫瘍サイズを最大2,000mgまで絶えず増加させて、この時点でそれら動物を研究から排除した。明らかな、または統計的に有意な抗腫瘍効果は観察されなかった。しかし、CR011−vcMMAE治療(5mg/kg/治療、q4d×4)は最初の2投与後に測定可能な阻害を生じた。腫瘍成長阻害は、認識可能な腫瘍がすべての6試験動物で検出されなくなるまで続いた(図4)。予備試験において、腫瘍退縮は完全であり、長期にわたる観察期間(200日まで)にもかかわらず腫瘍の再増殖がその後に起こることはなかった。
免疫結合体により生じる退縮は、免疫結合体の個々の成分によるものではなく、また該免疫結合体の製剤の成分によるものでもない。このことは、CR011抗体のみの処理(グループ3)または遊離モノメチルオーリスタチンEによる処理(グループ4)(適用される用量はインタクトな免疫結合体に含まれるものと同一である)の後に腫瘍成長の阻害がないことにより示される。さらに、遊離のMMAEで注意された抗腫瘍効果の欠如は、抗体−医薬結合体からの持続放出の結果としてのMMAEの抗腫瘍効果が免疫結合体の抗腫瘍効果を説明するものではないと示唆する。抗体−MMEA結合体からのMMAEの放出は、インビトロで非常に遅いプロセスであることが示され(抗CD30抗体−オーリスタチンE免疫結合体の場合でT1/2β=6.0日(Sanderson et at.,Clin. Cancer Res.11:843−852(2005))、ヒト黒色腫異種移植片の成長を低減するのに効果的ではなかった本研究に用いられた「大量瞬時投与量」よりもさらにかなり低い血漿または血清濃度を提供するにちがいない。
この研究は、定着したヒト黒色腫であるSK−MEL−5異種移植片の第2モデルに対する抗体−医薬結合体であるCR011−vcMMAEの効力と治療有効性を評価するために実施された。
起源は無関係であるが、SK−MEL−5は細胞膜の表面上でGPNMBを発現し、CR011−vcMMAEによりインビトロで死滅させられる。この研究において、ベヒクルPBSと食塩水および参照薬剤のビンブラスチンとパクリタキセルとともに、CR011免疫結合体の抗腫瘍効果を調べた。SK−MEL−2腫瘍と同じように、ビンブラスチンは、食塩水とPBSコントロールグループと比較した場合に、目立つが、有意ではない腫瘍成長阻害(P≦0.21)を生じた(図5)。しかし、パクリタキセルによる治療の開始後すぐに、有意な腫瘍成長阻害が治療開始の3日後には観察され(P≦0.039)、この抗腫瘍効果が続いて、100%成長阻害(静止)を生じた。SK−MEL−5を有する試験動物のビンブラスチンとパクリタキセルに対する応答は短いものであった。最大許容用量での治療の休止後、腫瘍は迅速な進行性の成長を再開した。長期で無腫瘍の一匹の生存動物がパクリタキセルグループに存在し、一つの自然退行が食塩水で処理されたグループに存在した。
CR011−vcMMAEは、SK−MEL−5ヒト黒色腫の定着異種移植片に対して実質的で用量依存性の抗腫瘍効果を及ぼす。一回または二回だけの処置後、有意な腫瘍成長の阻害が注意され、長期の腫瘍のない生存動物を導く。完全な退縮が≧2.5mg/kgの静脈内(q4d×4)用量で生じた。
この研究の目的は、予想される臨床的投与経路である静脈内注射の後のCR011−vcMMAEのインビボ安定性を示すことにあった。
CR011−vcMMAEのCR011抗体成分をサンドイッチタイプの酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)により測定した。このELISAでは、血清を、CR011抗体に対する同種抗原(GPNMB、CG56972−03)で被覆したマイクロタイタープレートのウエルに加え、ヒト抗体の量を信号発生剤(西洋ワサビパーオキシダーゼ)に結合体化させた抗グロブリンにより検出した。
薬物動態。CR011−vcMMAEの抗体成分の化合物利用性の持続性を胸腺欠損マウスにおける薬物動態研究で調べた(研究CR011−PK−1、図6)。抗体−医薬結合体の血清濃度−時間プロフィールを、CR011−vcMMAEの静脈内投与後に胸腺欠損マウスで決定し、その結果を図6に示す。1または10mg/kgを静脈内で受けた胸腺欠損マウスはサンプリング時間の全期間(42日間)にわたって用量に比例する血清濃度を示した。濃度−時間のパターンは二相性であった。しかし、初期相(α)は全AUCの<2%に寄与するだけの小さいものであった。それにもかかわらず、化合物は末梢血液から非常にゆっくりと消失し(T1/2β=10.3日間)、1μg/mLと10μg/mLの血清濃度が投与後6週間血液に残存した。
Clin. Pharmacokinet 44: 331− 347 (2005);またはLobo et al. J. Pharm. Sci. 93: 2645−2668(2004)を参照)、類似の医薬負荷を有する抗体−オーリスタチンE免疫結合体について得られた値に一致する(Hamblett et al., Clin. Cancer Res. 10:7063−7070(2004))。
表48.静脈内投与後のCR011−vcMMAEに関するPKパラメーター。
薬物動態パラメーターの推定を表48に示す。一つのパラメーターが注目に値する。定常状態での分配量(Vss)は理論的最小値に近づいている。これらのデータは、化合物が血管外空間の外側に分布しないことを示唆する。総合すれば、これらのデータは、−vcMMAE細胞毒性部分を有する他の免疫結合体に関するデータと十分一致する(Hamblett et al., Clin. Cancer Res.10:7063−7070(2004)を参照)。
CR011−vcMMAE抗体−医薬結合体は、黒色腫異種移植片の破壊と根絶に十分な連続的な曝露を好ましいとする血清−濃度プロフィールを有する。静脈内投与後の免疫結合体は、腫瘍細胞の長期間の曝露を確実にする十分に長い半減時間(T1/2β=10.3日間)を有し、頻繁な投与を必要としないだろう。CR011−vcMMAEのインビボ(例えば、胸腺欠損マウス)での持続性は他のオーリスタチンE免疫結合体に匹敵する。
本研究の目的は、CR011抗体−医薬結合体の治療的抗腫瘍効果が投与計画に依存する程度を決定し、可能であれば、この異種移植モデルの最適投与間隔を決定することであった。
本研究のプロトコールを表49に示す。治療的抗腫瘍効果が投与スケジュールにより影響されるとの仮説を調べるために、CR011−vcMMAEの抗腫瘍効果を5つの異なる投与間隔(すなわち、治療間の0、1、4、8および16日間)で測定し、各投与間隔で3つの投与量レベルを用いた(すなわち、2、8および32mg/kgの蓄積量);各グループに関して、n=6匹の胸腺欠損マウス。
表49.投与間隔研究のプロトコール(CR011−PHM−2)
この研究のために、5つの異なる投与間隔を実験的に調べた後(すなわち、治療間の0、1、4、8および16日間)、長期の腫瘍のない生存動物による完全な完全退縮の頻度を決定した。1つの組が、段階的な用量レベルであるが一つの投与間隔の3グループと定義される(グループ5、6および7が1組を表し、これらのすべてのグループが1日の投与間隔で処置された)グループの各組の総合応答を図7に示す。CR011−vcMMAEに応答する試験動物の総合応答は、大量瞬時投与と1日と4日の投与間隔とが、投与間の8日や16日等の長い間隔と比較して治癒比率にごくわずかな利点を提供することを示唆するように思える。しかし、この効果は有意ではなかった(P<0.2904)。したがって、これらのデータは、SK−MEL−2モデルにおけるCR011−vcMMAEの抗腫瘍効果がスケジュールに左右されないことを示唆する。この結論は、他のグループよりもおよそ4倍も高い血漿濃度にさらされた大量瞬時投与組の試験動物(グループ2、3および4)が治癒被験体の高い比率を示さなかったことから支持される。
投与間隔研究からのデータは、SK−MEL−2黒色腫異種移植片の応答がCR011−vcMMAEの投与スケジュールに依存しないことを示す。大量瞬時投与または低い投与間隔による投薬計画には何の利点も示すことができなかったが、一定の閾値累積用量未満では、複数の処置を単一の大量瞬時投与へと組み合わせることには幾つかの利点が存在するとの示唆がある。
GPNMBは、神経膠芽腫で発現し、神経膠芽腫由来の腫瘍細胞のインビトロとインビボでの侵襲性を仲介することが最近示された(例えば、Loging et al., Genome Res. 10:1393−1402(2000);およびRich et al., J. Biol. Chem. 278:15951−15975(2003))。これらの発見を確認し、これら発見をさらなる癌型まで拡張するために、ヒト癌細胞系と組織中のGPNMB転写物の発現を調べた。
DNase消化工程を有するRNeasyキット(Qiagen Inc.、Valencia CA)を用いて、全RNAを単離した。ワンステップRT−PCRキット(Qiagen)を用いてRT−PCRを下記のように実施した。RT:1サイクルにつき50℃で45分間および95℃で15分間。PCR:95℃で1分間、50℃で1分間および72℃で2分間を30サイクル、72℃で10分間の最終伸長。生成物は、2%アガロース/0.33%低融点アガロースゲルで分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。各RNA試料の統合性を、GAPDHを増幅するために設計されたプライマーを用いたRT−PCRにより検証した。使用された特定のプライマー(5’−3’)は以下の通りである:
我々の転写物発現分析は、GPNMBが高い比率のヒト転移性黒色腫試料中で強く発現することを示した。GPNMBは、調べられた5/7黒色腫細胞系および5/5黒色腫の臨床種で高度に発現(CT<27.0)していることがRTQ−PCRを用いてわかった(表50)。対照的に、GPNMBは、我々の実験で陰性コントロールとして用いられた腎臓癌細胞TK−10では発現しなかった。
表50:ヒト黒色腫細胞系と臨床種におけるGPNMB転写物の発現
材料と方法
フローサイトメトリー:細胞系の細胞表面上のGPNMB発現の定量的分析はフローサイトメトリーにより決定した。約1×106個の細胞を収集し、洗浄し、PBS(pH7.4)、4%FBSおよび0.1%NaN3を含む染色緩衝液中のCR011またはアイソタイプ対応コントロール抗体のいずれかの飽和量(10μg/mL)とともに30分間氷上でインキュベートした後、洗浄し、1:100のR−フィコエリトリン(PE)結合体化ヤギ抗ヒト抗体(Jackson ImmunoResearch Laboratories、Inc、West Grove、PA)による30分間の氷上の染色を行なった。細胞を1%パラホルムアルデヒド/PBSに固定化し、Becton Dickinson FACSCaliburフローサイトメーターにより調べた。データ分析をBecton Dickinson Cell Questソフトウエアバージョン3.3を用いて実施し、幾何学的蛍光強度比(GMR)を細胞タイプのそれぞれで決定した。
内部移行比率=全表面結合(4℃)−全表面結合(37℃)/全表面結合(4℃)×100
免疫沈降および免疫ブロット分析:細胞を採取し、1%NP−40、0.15M NaCl、0.02Mトリス塩酸、10%グリセロール、0.01M EDTAおよび完全プロテアーゼ阻害剤混合物(Roche Molecular Biochemicals、Indianapolis、IN)を含む溶解緩衝液中、30分間氷上で溶解した。上清を集め、タンパク質濃度をBCAプロテインアッセイキット(Pierce、Rockford、IL)で決定した。免疫沈降のために、2μgの一次抗体を0.5〜1mgの全細胞溶解物に加え、4℃で3時間インキュベートした後、プロテインAアガロース(Amersham Biosciences、Upsala、Sweden)とともに氷上で2時間インキュベートした。アガロースビーズを氷冷TBST(0.1%Tween−20を有するPBS)中で洗浄した。免疫沈降物を、Laemmli試料緩衝液中で沸騰させ、遠心した後、上清から回収した。
Prismバージョン4ソフトウエアを用いたコントロールの比率として表した。IC50は、未処理のコントロール培養物に比較してコロニー形成の50%の減少をもたらす濃度と定義した。
CR011−vcMMAE成長阻害活性がGPNMB発現に依存することを示すために、全長GPNMBタンパク質をHEK293細胞中に異所的に発現させた。免疫ブロット(図9A)およびFACS(図9B)分析により、GPNMBがGPNMB/プラスミド移入細胞で発現したことを確認した。CR011−vcMMAEによる細胞の処理とそれに続くクローン形成アッセイにより、GPNMBを発現するHEK293細胞は、GPNMB発現を欠くコントロール細胞よりも、CR011−vcMMAE仲介成長阻害に対してさらに感受性があることを示した(図9C)。
成長阻害のCR011−vcMMAEの機構を評価するために、細胞周期分析を実施した。
CR011−vcMMAEの細胞周期効果は、細胞を完全成長培地で24時間または48時間処理した後に評価した。簡単に説明すると、示された時間間隔で30μMのブロモデオキシウリジン(BrdU,Sigma)のパルスを細胞に30分間与え、細胞を固定し、メタノール中で透過処理した。新生DNA合成を抗ブロモデオキシウリジン−FITC(BD Biosciences、San Jose、CA)染色により検出した。全DNA含量はヨウ化プロピジウム(PI、Sigma)を用いて検出した。アポトーシス分析のために、細胞を上記のように処理し、アネキシンV−FITCで標識した後、製造者のプロトコールにしたがってアネキシンV−FITCアポトーシス検出キットI(BD
PharMingen、San Diego、CA)を用いてヨウ化プロピジウムを排除した。(以前の実施例に記載した)フローサイトメトリーを用いて、細胞周期とアポトーシス研究を評価した。
GPNMB陽性SK−Mel−2細胞または陰性TK−10コントロール細胞を、CR011−vcMMAEで多様な時間処理した後、ブロモデオキシウリジンで30分間処理して、新生DNA合成を検出し、最後にヨウ化プロピジウムで処理して、全DNA含量を検出した。DNA合成と細胞周期進行をフローサイトメトリーで決定した(表52)。
表52.CR011−vcMMAE処理細胞の細胞周期の分析
表53.CR011−vcMMAEによるヒト黒色腫細胞におけるアポトーシスの誘導
さらに、CR011−vcMMAE処置後の二重染色(アネクチン−V+/PI+)細胞の増加はCR011免疫結合体が細胞死を増強することを示した。総合すると、これらの結果はCR011−vcMMAEがG2/M細胞周期停止を選択的に誘導した後にアポトーシス性の細胞死をもたらすことを示唆する。
黒色腫と脳腫瘍細胞の表面に顕著に観察される抗原であるCG56972/GPNMBに対する完全ヒトモノクローナル抗体(mAb)−IgG2を作った。裸のCR011 IgG2 mAb(mAb1.15)は、CG56972を発現する細胞に対してインビトロでもインビボでも効果を持たなかった。よって、IgG2からIgG1にスイッチするアイソタイプは、mAbに、ADCCエフェクター機能によりヒト黒色腫細胞を死滅させることができるのかどうかを調べた。
CR011mAb1.15.1成熟重鎖(IgG2):
星細胞腫/神経膠芽腫は、満たされていない顕著な医療ニーズを代表する医薬難治性腫瘍である。これらのヒト癌組織と癌細胞系で高度に発現するヒト遺伝子(GPNMBとしても知られる)としてCG56972を同定した。CG56972はヒト脳において非常に限定された発現パターンを有する小胞輸送に潜在的に関与するタイプIの膜貫通タンパク質である。我々は、CG56972細胞外領域(アミノ酸23〜480)に対する完全ヒトモノクローナル抗体を作った。CR011−vcMMAEと命名した我々の主要なモノクローナル抗体は生物化学的に特性付けられ、星細胞腫、神経膠芽腫、髄芽腫または神経外胚葉起源のヒト脳腫瘍に由来する細胞系に対する治療活性について調べられた。
mAbが脳腫瘍細胞系の成長を阻害することを示した。
細胞系と培養条件:すべてのヒト細胞系であるSK−MEL−2、XF−498、SNB−78、U−118−MG、SF−539、H79MG、D392−MG、D534−MG、SK−N−SH、U−251、SF−295、D450−MG、U87MG、SF−268、T98GおよびSW−1783はアメリカ培養細胞系統保存機関(Manassas、VA)から得るか、またはNCI(Bethesda、MD)からから購入した。細胞は、10%FBS(Gemini Bio−Products、Woodland、CA)およびペニシリン−ストレプトマイシンを含有するDMEMまたはRPMI(Invitrogen、Carlsbad、CA)中に維持した。
City、CA)を用いたABI Prism7700配列決定システムにより行なった。下記プライマー(5’−3’)が用いられた:
Laboratories、Inc、West Grove、PA)により30分間、氷上で染色した。細胞を1%パラホルムアルデヒド/PBSで固定し、Becton Dickinson FACSCaliburフローサイトメーターで調べた。データ分析はBecton Dickinson Cell Questソフトウエア、バージョン3.3を用いて実施し、各細胞タイプの幾何平均蛍光強度比(GMR)を決定した。
1.ヒト星細胞腫、神経膠芽腫、髄芽腫、および神経外胚葉起源の腫瘍におけるCG56972転写物の発現
ヒト癌細胞系および組織におけるCG56972転写物の発現を調べた(図13Aと13B)。この転写物発現分析は、CG56972が、調べられた全ての(15/15)ヒト脳癌細胞系において強く発現することを示した(図13A)。RTQ−PCRを用いて、CG56972が、混合された神経膠芽腫/星細胞腫起源、神経膠芽腫/神経膠腫、星細胞腫および転移性神経芽細胞腫の細胞で発現することがわかった。脳またはCNSの腫瘍細胞系のほとんどがCT<27の高レベルの発現を示した。注目すべきは、CG56972が、XF−498、U−118−MG、SNB−78およびSF−539の各細胞において高度に発現する(CT<27.0)ことがわかった。図13Bに示されているように、CG56972は、4/5の神経膠腫ヒト生検および1/4の髄芽腫ヒト生検でも高レベルで発現した。ヒト遺伝子の大きな一団(図13C)を含むインハウスチップからのマイクロアレイ分析を用いて、CG56972は星細胞腫または神経膠芽腫起源の5/9の脳腫瘍ならびに4/9の乏突起細胞腫に高度に発現することがわかった。これらの腫瘍発現プロフィールの分析は、CG56972メッセージが正常な脳組織においてかなり低い程度まで検出されることを示した。これらのデータは、ニューロンやグリア細胞等の正常なヒト脳におけるCR011染色の欠如を示した我々の免疫組織化学的データとも一致する。総合すると、これらのデータは、CG56972転写物は脳腫瘍や乏突起細胞腫細胞系、およびヒト腫瘍から単離された試料において非常に高い量で発現していることを示す。
2.CG56972/GPNMBに対する完全ヒトCR011モノクローナル抗体の産生
CG56972タンパク質はタイプ1の膜貫通糖タンパク質であると予想されている。CG56972転写物の高度発現と、ヒト癌試料におけるこのタンパク質の潜在的な細胞表面局在化は、モノクローナル抗体(mAb)を潜在的な癌治療剤として作る自信を我々に与えた。したがって、我々はヒトCG56972細胞外領域(ECD;アミノ酸23〜480)をクローニングした。クローニングされたcDNAの配列決定は、エキソン6/7境界での選択的スプライシングのためによると思われるインフレームの36塩基挿入の存在を明らかにし、これは、公になったGPNMBタンパク質配列の339残基後にさらなる12アミノ酸(ATTLKSYDSNTP)(配列番号343)を付加した。36塩基挿入の確実性をRT−PCRにより実証した。次に、このcDNAをヒトHEK293細胞に発現した。得られたタンパク質を回収し、馴化培地から精製し、免疫原として用いて、CG56972−ECDに対する完全ヒトmAbを作った。XenoMouse(登録商標)の免疫後、CG56972−ECDタンパク質をELISAにより特異的に認識するmAbを作った。1.15と命名された我々の主要なmAb、すなわち精製CG56972−ECDに対するCR011は、精製CG56972−ECDタンパク質に対して52nMのKdを示し、詳細な特性付けのために選択され、この実例の残り部分の焦点となるだろう。
3.ヒト脳腫瘍におけるCG56972タンパク質発現のCR011 mAb1.15による検出
多様な脳腫瘍細胞系上のCG56972タンパク質の表面発現をフローサイトメトリーで調べるために、CR011モノクローナル抗体をさらに用いた(図14と表54)。FACS分析は、脳腫瘍細胞系であるXF−498、U−118−MG、SNB−78およびSF−539(これらすべてはCG56972転写物発現に対して陽性である)が、CR011モノクローナル抗体により、アイソタイプコントロールmAbバックグランドを超える少なくとも1.5倍の表面染色を示した(図14)。CG56972転写物発現に対して特に弱く陽性(CT>32)であった細胞系SF−268(図13Cおよび表54)はコントロールmAbバックグランドを超える約1.5倍と予想される最小表面染色を示した。CG56972発現に対する陽性コントロールであるSK−MEL−2黒色腫細胞系は強い細胞表面染色を示した。
4.CR011−vcMMAEによる星細胞腫/神経膠芽腫細胞系のインビトロ成長阻害
CG56972は非常に限定されたヒト組織発現パターンを有する。予備研究では、CR011は、直接に用いられた場合、CG56972を発現する癌細胞系の成長を阻害することはなかった(データは示さず)。CG56972は脳腫瘍と黒色腫上の細胞表面分子であり、CR011はCG56972を発現する細胞とともにインキュベーションした後は内部移行したので、我々は、タンパク質合成阻害剤(サポリン)結合体化第2抗体と組み合わせた場合にCR011が癌細胞の成長を阻害するかどうかを調べた。CR011は、CG56972を発現する癌細胞の成長を特異的に阻害することができることを我々の結果はしめした(データは示さず)。よって、高度に安定であるが、細胞内プロテアーゼにより分解されるバリン−シトルリン(vc)リンカーを用いて、CR011を細胞毒性医薬のモノメチルオーリスタチンE(MMAE)に直接結合した。得られた抗体−医薬結合体をCR011−vcMMAEと命名した。
表54.RTQ PCR、FACS、およびCR011−mAbによるヒト癌細胞系の成長のインビトロ阻害
これらのデータは、CR011−vcMMAEが、星細胞腫/神経膠芽腫およびそれらの転移ならびに髄芽腫と神経外胚葉起源の脳腫瘍の治療に非常に強力で選択的な物質であることを示す。CR011−vcMMAEは黒色腫の脳への転移や新生物性髄膜炎等の他の脳新生物の治療にも有用でありうる。
本研究のCR011 bi−scFv(図17を参照)は細胞毒性ヒトTリンパ球上のT細胞レセプターのCD3エピトープに結合し、同時にGPNMBを発現する異常細胞を標的とするように設計され、異常細胞の溶解または破壊を容易にする最終結果をもたらす。
(1)CR011一本鎖抗体(CR011 scFv)
(2)CR011×抗CD3二重特異性一本鎖抗体(bi−scFv)リンカーセットL4−L2−L4
(3)CR011×抗CD3二重特異性一本鎖抗体(bi−scFv)リンカーセットL4−L4−L4
CR011 scFvタンパク質の成分は、シグナルペプチド−VL(CR011)−リンカー4−VH(CR011)−フラグタグであった。CR011×抗CD3 bi−scFv(リンカーセットL4−L2−L4)タンパク質の成分は、シグナルペプチド−VL(CR011)−リンカー4−VH(CR011)−リンカー2−VH(抗CD3)−リンカー4−VL(抗CD3)−フラグタグであった。CR011×抗CD3 bi−scFv(リンカーセットL4−L4−L4)タンパク質の成分は、シグナルペプチド−VL(CR011)−リンカー4−VH(CR011)−リンカー4−VH(抗CD3)−リンカー4−VL(抗CD3)−フラグタグであった。
1.CR011 scFvおよびCR011×抗CD3 bi−scFv種の発現用DNAプラスミド構築物
CR011 scFvフラグタグ:CR011 scFvの発現構築物を生じさせるPCR増幅産物は、製造業者の指示通りにF1/R1プライマーを用いた後、F1ネステッド/R1プライマー対(表55)とPfu Turbo DNAポリメラーゼ(Stratagene、cat#600322)を用いたネステッドPCRにより合成DNA鋳型(Blue Heron)から作成した。CR011 scFvカセットをコードするSal I/EcoRI PCR断片は、Fast−Link DNA Ligationキット(Epicentre、cat#LK11025)を用いてpCTNベクター(CuraGen Corporation、哺乳類用発現ベクター)の対応する制限部位にクローニングした。
表55
Ligationキット(Epicentre、cat#LK11025)を用いてpCTNベクターの対応する制限部位にクローニングした。
PCR断片は、Fast−Link DNA Ligationキット(Epicentre、cat#LK11025)を用いてpEE14.4FL2発現ベクター(Lonza Biologies plc、228 Bath Road、Slough、Berkshire SLl 4Dx、UK)の対応する制限部位にクローニングした。
2.CHOK1細胞におけるCR011改変抗体のタンパク質産生
接着性チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHOK1)細胞(ATCC catalog#CCL−61)を、10%ウシ胎児血清(Gemini、cat#100106)、GSサプリメント(JRH Biosciences、cat# 58672−100M)および50mg/Lゲンタマイシン(Invitrogen、cat#15750078)を補ったDMEM培地(Invitrogen、cat#10564−011)にて成長させた。
scFvおよびCR011×抗CD3 bi−scFv(L4−L2−L4リンカーセット)系の選択は選択培地A(表56)中で実施した一方で、分泌された安定なCR011×抗CD3 bi−scFv(L4−L4−L4リンカーセット)系は選択培地B(表57)中で実施した。
3.CR011改変抗体のタンパク質精製
CR011 scFvフラグとCR011×抗CD3(L4−L2−L4リンカーセット)bi−scFvフラグに関するタンパク質精製は、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを含むクロマトグラフィーの3工程で達成された。CR011×抗CD3(L4−L4−L4リンカーセット)bi−scFvフラグタンパク質の精製には、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを用いた。
(1)CR011 scFv: 1.0mg
(2)CR011×抗CD3(L4−L2−L4リンカーセット)bi−scFv: 0.5mg
(3)CR011×抗CD3(L4−L4−L4リンカーセット)bi−scFv: 1.5mg
精製タンパク質のN末端アミノ酸配列は、エドマン分解により当業者に公知の方法を用いて決定した。最初の5アミノ酸の配列はいずれの場合(CR011 VLタンパク質の成熟N末端)もEIVMTであり、シグナルペプチドによる正確なプロセシングが起こって、予想された配列と大きさの可溶性分泌産物が得られたことを示す。
CR011 scFv−(VL−L4−VH)フラグの配列番号。ヒトカッパ軽鎖のシグナルペプチドはKabat等 45CLL−CL)に記載されたように用いた。C末端に含まれるFLAGタグが存在した。Kozak配列CCACCは5’PCRプライマーに含まれた。
ELISA:CR011改変抗体の精製組換えGPNMB(2μg/mL)への結合を、一晩4℃で被覆されたプレートを用いて測定した。次に、プレートをブロックし、洗浄した。CR011改変抗体の多様な希釈物をウエルに加えた。プレートを1時間インキュベートし、洗浄した。HRP結合体化抗FLAG M2 mAb(Sigma、St. Louis、MO)をウエルに1時間加え、洗浄し、反応物を、TMB基質試薬を製造業者(Pharmingen、San Jose、CA)に記載されたように展開した。
M2(Sigma)を用いて検出した。図18からわかるように、記載の両抗GPNMB抗体種は組換えGPNMBタンパク質に結合し、改変抗GPNMB抗体の特異性と結合活性が、この例に記載された方法を用いて保存されたことを示している。
CR011×抗CD3(L4−L2−L4リンカーセット)bi−scFvは、Tリンパ球によるSK−Mel−5腫瘍細胞の死滅を有意に高めた(図20)。対照的に、単一特異的抗GPNMB svFvの付加はSK−Mel−5腫瘍の死滅を高めなかった。さらに、腫瘍細胞を、CR011×抗CD3(L4−L2−L4リンカーセット)bi−scFvとともに、Tリンパ球なしに培養した場合、細胞毒性は観察されなかった(図20)。これらのデータはCR011×抗CD3(L4−L2−L4リンカーセット)bi−scFvが、T細胞とSK−Mel−5細胞との間に十分な橋渡しを提供して、細胞死を誘導すること、およびこの改変CR001二重特異性抗体の両成分に生物活性があることを示す。したがって、本発明のCR011×抗CD3(L4−L2−L4リンカーセット)bi−scFv改変抗体を、黒色腫、および存在するGPNMBとT細胞の上方制御されたレベルが存在する場合の他の癌等の疾患を治療する治療薬として用いてよい。
CR011AEは、プロテアーゼ切断性リンカーにより毒素オーリスタチンEに結合体化させた抗GPNMB(CG56972)完全ヒト抗体CR011からなる抗体−医薬結合体である。抗体に対する毒素の比率は約4.0であるが、3.5〜4.2の範囲であってよい。CR011抗体はIgG2であるが、遊離のチオールを反応部位として用いて、1個の抗体分子あたり12個までの毒素分子を付加することができる。
1.前結合体化UF/DF:スクロースの除去
UF/DF中のスクロースの除去速度をエルマンアッセイによりモニターし、かつ1Abあたりの最大SH比を達成するために必要とされるダイア体積を予想するために、実験を行なった。
2.結合体化反応における凝集に対するDMSO比率の効果
結合体化反応において、(1)凝集および(2)医薬:Abモル比(すなわち、結合体化の完全性)に対するDMSOの効果を決定するために実験を実施した。
5.vcMMAEに対するCR011の結合体化中の副反応の研究
実験を行なって、(1)不完全な結合体化と低医薬負荷をもたらす、マレイミド−医薬を未反応副産物に変換する副反応の程度と速度論を調べ、(2)副反応に影響を与える因子を決定し、(3)古いvcMMAEロット(SGD1006−0−04)が新しいロット(SGD1006−0−06)と比較して反応性が異なったかどうかを決定した。
副生成物は、pH7.4(PBS)の代わりにpH9で実施された結合体化の結果である。副生成物の形成はTCEPの存在下で大きき増強させられる。主要な安定副生成物はLC−MSによりスクシンイミジル−vcMMAEと同定された。少数で安定性の低い副生成物は依然として同定されていない。vcMMAEの両ロットは類似した挙動を示した。
6.vcMMAEに対するCR011の結合体化中の副反応の克服
大過剰の医薬を結合体化に提供することにより副反応が克服できるかどうかを調べるために実験を実施した。
20%過剰に対する10%過剰のvcMMAEの使用を100mg結合体化において比較した。さらに過剰のvcMMAEは予測された値にさらに近いAbに対する医薬の比を与えたために、最適であると決定された。
上述の説明および実施例は、抗体の一定の好ましい実施態様を詳細に示し、本発明の意図する最良の態様を説明する。しかし、上述のものが本文中にどのように詳細に説明されようと、ここに記載の抗体の製造方法および使用方法は多くの方法で実施しされ得るものであって、本発明は添付の請求の範囲とその等価物にしたがって理解されなければならない。前記の書かれた明細書は当業者がここに記載の明細書を実施することを可能とするには十分であると見なされる。
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Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
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