JP2014003973A - 生乾き臭抑制評価方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】皮脂汚れ成分存在下において生乾き臭原因物質を産生する微生物と被験物質とを接触させ、前記微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及びβ酸化関連酵素遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種の発現を検知し、前記少なくとも1種の遺伝子の発現量の変化に基づいて該被験物質の生乾き臭抑制作用を評価する、生乾き臭抑制評価方法であって、特定のオリゴヌクレオチド対を用いて前記少なくとも1種の遺伝子の発現を検知する、生乾き臭抑制評価方法。
【選択図】なし
Description
前述した繊維製品はヒトの皮膚と直接接触するため、皮脂を含んだ汗や角質などを吸収又は付着する可能性がある。そのため、これら繊維製品を洗濯後、被洗物を洗濯槽内等の湿気の多い場所にしばらく放置した場合、室内干しの場合、雨や汗で濡れた場合、又は乾燥が不十分の場合に、特有の臭いを生ずることがある。この臭いは一般に生乾き臭と呼ばれるものであり、十分な乾燥を行うことで発生を回避できる場合もある。しかしながら、十分な乾燥を行い、生乾き臭が感じられなくなった繊維製品であっても、汗や雨などで繊維製品が湿気を帯びると雑巾臭様の生乾き臭が生じることもある。すなわち、繊維製品がこの生乾き臭を一度発生するようになると、洗濯により感じなくなった場合であっても、使用時に雑巾臭様臭の生乾き臭が再発し易くなる。このような再発し易い生乾き臭は、室内干しの場合のみならず、低温乾燥機能を備えた洗濯機又は乾燥機を用いた場合や、室外干し乾燥の場合でさえも湿気を帯びると生じる場合がある。
再発性の生乾き臭の特徴的な点は、湿気を帯びるだけで臭いが発生する点にある。再発性の生乾き臭は、長期間タンスなどに収納した場合に生じることもある。ヒトの肌との接触機会が多く、洗浄−使用サイクルの期間の短い使用頻度の多い繊維製品(下着、ハンカチ、又はタオルなど)においては、一度この生乾き臭が発生するようになると使用中に臭いが再発してくることが多い。これらの生乾き臭を抑制するためには、このような生乾き臭原因物質を産生しないように繊維製品を処理することが重要である。そのための方法として生乾き臭を抑制する基材や素材が求められており、生乾き臭抑制剤をスクリーニングするための生乾き臭抑制評価方法の開発が求められている。
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
(a)配列番号13に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号13に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号14に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号14に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号15に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号15に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号16に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号16に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(e)配列番号17に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号17に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号18に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号18に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(g)配列番号19に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号19に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(h)配列番号20に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号20に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(i)配列番号21に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号21に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(j)配列番号22に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号22に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(k)配列番号23に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号23に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(l)配列番号24に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号24に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(m)配列番号25に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号25に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(n)配列番号26に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号26に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(o)配列番号27に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号27に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(p)配列番号28に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号28に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(q)配列番号29に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号29に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(r)配列番号30に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号30に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(s)配列番号31に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号31に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(t)配列番号32に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号32に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(u)配列番号33に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号33に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(v)配列番号34に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号34に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(w)配列番号35に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号35に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(x)配列番号36に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号36に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(y)配列番号37に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号37に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(z)配列番号38に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号38に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(a1)配列番号39に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号39に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(b1)配列番号40に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号40に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(c1)配列番号41に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号41に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(d1)配列番号42に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号42に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
また、本発明は、生乾き臭原因物質を産生する微生物と、皮脂汚れ成分と、少なくとも1種の、前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含んでなる、生乾き臭抑制評価用キット又は生乾き臭抑制剤のスクリーニング用キットに関する。
さらに、本発明は、少なくとも1種の、前記オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含んでなる、生乾き臭原因物質を産生する微生物の検出用キットに関する。
したがって、前記オリゴヌクレオチド対を用いる本発明の生乾き臭抑制評価方法によれば、被験物質の生乾き臭抑制作用を高精度で簡便に評価することができる。また、前記評価方法を利用した本発明の生乾き臭抑制剤のスクリーニング方法によれば、高精度で簡便に生乾き臭抑制剤をスクリーニングすることができる。また、前記オリゴヌクレオチド対を用いる本発明の生乾き臭原因物質を産生する微生物の検出方法によれば、環境に存在している生乾き臭原因物質を産生する微生物を迅速かつ正確に検出することができる。さらに、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対は、前記評価方法、スクリーニング方法及び検出方法において好適に用いることができる。
また、本発明の生乾き臭抑制剤のスクリーニング方法は、前記評価方法に基づき、前記少なくとも1種の遺伝子の発現量を低下させる被験物質を選択する。本発明の生乾き臭抑制剤のスクリーニング方法によれば、原因微生物の殺菌という手段に頼らない高精度な生乾き臭抑制剤のスクリーニングを簡便に行うことが可能となる。
(1)生乾き臭原因物質の前駆体(本明細書において、「基質」ともいう)から4M3Hなどの生乾き臭原因物質が生成する過程において、基質から中間体を生成することが可能な微生物(例えば、皮脂汚れ成分の不飽和化のみに関連する微生物)
(2)中間体から4M3Hなどの生乾き臭原因物質を生成することが可能な微生物(例えば、不飽和脂肪酸のβ酸化のみに関連する微生物)
(3)基質から中間体を経て4M3Hなどの生乾き臭原因物質を生成することが可能な微生物(皮脂汚れ成分の不飽和化と、不飽和脂肪酸のβ酸化のいずれにも関連する微生物)
繊維製品を洗濯後乾燥中又は乾燥後でも乾燥が不十分なため生じる生乾き臭としては、S(硫黄)臭、N(窒素)臭、アルデヒド臭、低級脂肪酸臭、雑巾臭及び4M3H臭を主とする中級分岐脂肪酸臭などの複合臭である。一方、十分に乾燥させて生乾き臭が感じられない繊維製品においても、再び雨、汗、空気中の湿気等などにより、繊維製品から再発する雑巾臭様臭の生乾き臭は、4M3H臭を主とする中級分岐脂肪酸臭が大部分である。これに対し、その他のS臭、N臭、アルデヒド臭などの揮発性の高い臭いはほとんど発生しない。
また、「生乾き臭抑制」とは、生乾き臭を抑制すること、生乾き臭生成を予防すること、生乾き臭原因物質の生成を抑制することを包含するものである。そして本発明では、生乾き臭として雑巾臭様臭を有する生乾き臭、特には4M3H臭の抑制を特徴的に指すものとする。なお、本明細書において「生乾き臭抑制」には、生乾き臭原因物質の生成を抑制することとして以下の(1)〜(3)のいずれをも含むものである。
(1)生乾き臭原因物質の前駆体から中間体の生成の抑制(例えば、皮脂汚れ成分の不飽和化の抑制)
(2)中間体から4M3Hなどの生乾き臭原因物質の生成の抑制(例えば、不飽和脂肪酸のβ酸化の抑制)
(3)基質から4M3Hなどの生乾き臭原因物質の生成の抑制(皮脂汚れ成分の不飽和化、及び不飽和脂肪酸のβ酸化の抑制)
(1)繊維製品の官能評価を行い、その結果生乾き臭を発した繊維製品から微生物を採取する方法
(2)繊維製品に存在する微生物を採取し、採取した微生物の4M3Hなどの生乾き臭原因物質生成能を測定し、生乾き臭原因物質を産生する微生物を選択する方法
(3)環境より分離した又は微生物供託機関から入手した微生物の4M3Hなどの生乾き臭原因物質生成能を測定し、生乾き臭原因物質を産生する微生物を選択する方法
(4)生乾き臭原因物質を産生する微生物との特定の遺伝子配列の相同性を比較し、相同性の高い微生物を選択する方法
前記方法のうちいずれかの方法により生乾き臭原因物質を産生する微生物を選択してもよいし、2つ以上の方法を組み合わせて生乾き臭原因物質を産生する微生物を選択してもよい。
なお、特開2011−254807号公報には、4M3Hなどを生乾き臭原因物質として特定し、4M3Hなどの生乾き臭原因物質を産生する微生物の検出方法が記載されており、本発明では当該公報の記載を参考にすることができる。
まず、前記(1)の方法(繊維製品の官能評価を行い、生乾き臭を発する繊維製品から微生物を採取する方法)の概要について説明する。
家庭等で、洗濯後に使用した、又は洗濯後保管しておいた(洗濯後は未使用)繊維製品(たとえば、タオル、Tシャツ、枕カバー、下着類)を回収し、官能評価により生乾き臭を強く感じる繊維製品を選択する。選択した繊維製品を一定の大きさ(たとえば5×5cm、2×2cm)に裁断する。裁断した繊維製品を、レシチン・ポリソルベート(本明細書においてLPともいう)希釈液(日本製薬社製)又は生理食塩水等に添加後、攪拌により抽出液を得る。得られた抽出液をレシチン・ポリソルベート添加ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト(本明細書においてSCD−LPともいう)寒天培地(日本製薬社製)やポテトデキストロース・アガー(本明細書においてPDAともいう)培地(BD社製)などの寒天培地に塗抹して一定時間(たとえば35℃、24時間)培養する。培養後、得られたコロニーから微生物を単離する。
単離した各菌株は、滅菌した使用済み繊維製品、たとえば生乾き臭発生が認められたタオルなどを一定の大きさ(たとえば5×5cm、2×2cm)に切断したのちに滅菌処理したものに塗布して培養したのちに官能評価により生乾き臭を感知した菌株を選抜する。あるいは、単離した各菌株を皮脂汚れ成分の存在下において固体培養又は液体培養したのちに官能評価により生乾き臭を感知した菌株を選抜する。選抜した各菌株の同定が必要な場合は、その方法に制限はないが、細菌では16S rRNA遺伝子の上流領域約500bp、真菌ではLSU(Large Subunit)のD2領域の約200bp以上約500bp以下の塩基配列を決定し、当該塩基配列と基準株との相同性に基づき行なうことができる。なお、塩基配列の相同性は、遺伝子情報処理ソフトウェアClustalW(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html)等を用いて算出することもできる。
家庭などで、洗濯後に使用した、あるいは洗濯後保管しておいた(洗濯後は未使用)繊維製品(たとえば、タオル、Tシャツ、枕カバー、下着類など)を回収し、一定の大きさ(たとえば5×5cm、2×2cm)に裁断する。裁断後の繊維製品をLP希釈液(日本製薬社製)、又は生理食塩水などに添加後、攪拌することにより抽出液を得る。得られた抽出液をSCD−LP寒天培地(日本製薬社製)やPDA培地(BD社製)などの寒天培地に塗抹して一定時間(たとえば35℃、24時間)培養後、得られたコロニーから微生物を単離する。
単離した各菌株は、滅菌した使用済み繊維製品、たとえば生乾き臭発生が認められたタオルなどを一定の大きさ(たとえば5×5cm、2×2cm)に切断したのちに滅菌処理したものに塗布して培養したのちに官能評価により生乾き臭を感知した菌株を選抜する。あるいは、単離した各菌株を皮脂汚れ成分の存在下において固体培養又は液体培養したのちに官能評価により生乾き臭を感知した菌株を選抜する。選抜した各菌株の同定が必要な場合は、その方法に制限はないが、たとえば、細菌では16S rRNA遺伝子の上流領域約500bp、真菌ではLSUのD2領域の約200bp以上約500bp以下の塩基配列を決定し、当該塩基配列と基準株との相同性に基づき行なうことができる。なお、塩基配列の相同性は、遺伝子情報処理ソフトウェアClustalW等を用いて算出することもできる。
ATCC(American Type Culture Collection)、NBRC(NITE Biological Resource Center)、JCM(Japan Collection of Microorganisms)、NCIMB(National Collection of Industrial,Marine and Food Bacteria)などの菌株分譲機関から菌株を購入する。あるいは、土壌、植物、河川水、住居内など様々な環境より常法によりSCD−LP寒天培地(日本製薬社製)やPDA培地(BD社製)などに菌株を分離後、単離する。なお、ここでは任意の培地を用いることができる。
購入又は単離した各菌株を、滅菌した使用済み繊維製品、たとえば生乾き臭発生が認められたタオルなどを一定の大きさ(たとえば5×5cm、2×2cm)に切断したのちに滅菌処理したものに塗布して培養した後に、4M3Hなどの生乾き臭原因物質の生成を検知することにより、4M3Hなどの生乾き臭原因物質生成が認められた菌株を選抜する。あるいは、購入又は単離した各菌株を皮脂汚れ成分の存在下において固体培養又は液体培養したのちに、4M3Hなどの生乾き臭原因物質の生成を検知することにより、4M3Hなどの生乾き臭原因物質生成が認められた菌株を選抜する。環境から分離した菌から選抜した各菌株について同定が必要な場合は、その方法に制限はないが、たとえば、細菌では16S rRNA遺伝子の上流領域約500bp、真菌ではLSUのD2領域の約200bp以上約500bp以下の塩基配列を決定し、当該塩基配列と基準株との相同性に基づき行なうことができる。なお、塩基配列の相同性は、遺伝子情報処理ソフトウェアClustalW等を用いて算出することもできる。
まず、上記(1)、(2)及び/又は(3)の方法等により選択した4M3Hなどの生乾き臭原因物質生成能を有する微生物の特定の遺伝子の塩基配列を決定する。そして、決定した塩基配列と相同性の高い塩基配列を有する微生物を選択することにより、本発明に用いる4M3Hなどの生乾き臭原因物質生成能を有する微生物を入手することができる。例えば、生乾き臭の原因菌の1種であるモラクセラ・エスピー(Moraxella sp.)KMC4−1株(FERM BP-11394株)を基準サンプルとして選択する。次に、基準サンプルの16S rRNA遺伝子の塩基配列を決定する。そして、決定した基準サンプルの塩基配列の全部又は一部と相同性の高い塩基配列を有する微生物を選択する。ここで、「相同性の高い」とは、基準サンプルの塩基配列との相同性が好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上であることをいう。
微生物の塩基配列は、通常の方法により決定することができる。また、塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法(Science,1985,227,p.1435)等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(ソフトウェア開発製)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出することができる。
なお、本発明において「モラクセラ・エスピー」とは、その16S rRNA遺伝子の塩基配列が、配列番号43又は配列番号44に記載の塩基配列と95%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、特に好ましくは99.2%以上の相同性を有する塩基配列を含む微生物を意味する。または、配列番号43又は配列番号44に記載の塩基配列において1〜75個、好ましくは1〜45個、より好ましくは1〜30個、さらに好ましくは1〜15個の塩基の欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなる16S rRNA遺伝子を有する微生物を意味する。なお、配列番号43及び配列番号44に示す塩基配列は、それぞれ、モラクセラ・エスピーKMC4-1株及びモラクセラ・オスロエンシスATCC19976株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を示す。
本発明に好ましく用いることができる皮脂汚れ成分としては、衣類等の繊維製品に通常見られる皮脂汚れの成分を使用でき、例えば、繊維製品から生じる生乾き臭原因物質の前駆体となり得る物質が好ましい。繊維製品から生じる生乾き臭原因物質の前駆体となり得る物質としては、例えば炭素数9以上(好ましくは11以上、より好ましくは17以上)21以下(好ましくは19以下)のアンテイソ脂肪酸が挙げられる。これらの中には、皮脂汚れ中には実際には存在しない化合物も含まれるが、本明細書においてはこれらのアンテイソ脂肪酸も皮脂汚れ成分に含まれるものとする。本発明において、前記皮脂汚れ成分はアンテイソ脂肪酸であることが好ましい。本発明に好ましく用いられるアンテイソ脂肪酸は、飽和脂肪酸及び不飽和脂肪酸のいずれであってもよく、アンテイソ脂肪酸の塩及びエステルも前記アンテイソ脂肪酸に含むものとする。具体的には、6-メチルオクタン酸、8-メチルデカン酸、12-メチルテトラデカン酸、14-メチルヘキサデカン酸、16-メチルオクタデカン酸、14-メチルヘキサデセン酸及び16-メチルオクタデセン酸、並びにこれらの塩やエステルからなる群より選ばれる1種又は2種以上が挙げられる。本発明において、皮脂汚れ成分は、14-メチルヘキサデカン酸又は16-メチルオクタデカン酸がより好ましい。
本発明に好ましく用いることができるアンテイソ脂肪酸は通常の方法により合成することができる(例えば、特開2009−149546号公報参照)。また、シグマアルドリッチ社等から市販のものを入手して用いることもできる。
前記生乾き臭原因物質を産生する微生物と皮脂汚れ成分との接触比(混合比)について適宜設定することができ、例えば、終濃度104CFU以上108CFU以下の微生物に対してアンテイソ脂肪酸等の皮脂汚れ成分0.1mg以上10mg以下を接触させるのが好ましい。
前記微生物の繊維製品への添加量は適宜設定することができ、例えば、102CFU/cm2以上105CFU/cm2以下を繊維製品へ添加することが好ましい。
繊維製品の素材は適宜設定することができ、ウール、シルク、木綿等の天然素材、ポリエステル、ポリアミド等の化学繊維、及びこれらの組合せのいずれであってもよい。本発明において、繊維製品の素材は木綿であることが好ましい。さらに、皮脂汚れ成分を添加して使用する場合は、繊維製品は未使用であっても、一度以上使用した使用済のもの(使用後未洗濯の繊維製品、使用後洗濯済みの繊維製品等)でもよい。
本発明におけるΔ9デサチュラーゼ遺伝子の塩基配列は、配列番号1に記載の塩基配列に対して70%以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列であってもよく、相同性が80%以上であることが好ましく、90%以上であることがより好ましく、95%以上であることがなお好ましく、96.1%以上であることがさらになお好ましく、97%以上であることがさらになお好ましく、99%以上であることが特に好ましい。また、前記Δ9デサチュラーゼ遺伝子は、配列番号1に記載の塩基配列において1〜351個、好ましくは1〜234個、より好ましくは1〜117個、特に好ましくは1〜59個の塩基の欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、脂肪酸の不飽和活性を有する酵素をコードする遺伝子であってもよい。塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法(Science,1985,227,p.1435)等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(ソフトウェア開発製)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出することができる。なお、本発明における好ましいΔ9デサチュラーゼ遺伝子の塩基配列である配列番号1に記載の塩基配列に対する、Δ9デサチュラーゼ遺伝子の他の例として、モラクセラ・カタラーリス(Moraxella catarrhalis)RH4株のΔ9デサチュラーゼ遺伝子の塩基配列(配列番号2、アクセッション番号:CP002005、遺伝子番号:MCR_0449、Kyoto encyclopedia of genes and genomes(KEGG,http://www.genome.jp/kegg/kegg2.html)参照)、アシネトバクター・エスピー(Acinetobacter sp.)DR1株のΔ9デサチュラーゼ遺伝子の塩基配列(配列番号3、アクセッション番号:CP002080、遺伝子番号:AOLE_06035)、及びサッカロミセス・セルビシエ(Saccaromyces cerevisiae)YGL055W株のΔ9デサチュラーゼ遺伝子の塩基配列(配列番号4、アクセッション番号:Z72577、遺伝子番号:YGL055W)の相同性を表1に示す。
(1)脂肪酸をATP依存的にアシルCoAに変換するfadD
(2)脱水素反応によりα、β−trans二重結合を形成するfadE
(3)二重結合の水和でL-3-ヒドロキシアシルCoAを生成し、NAD+依存的な脱水素反応により3-オキソアシルCoAを生成するfadB
(4)CoAと反応してα位の炭素とβ位の炭素間の結合を開裂し、アセチルCoAと炭素原子が2個少ないアシルCoAを生成するfadA
これらの酵素のうち、fadB及びfadDが特に好ましい。
本発明におけるfadB遺伝子の塩基配列は、配列番号5に記載の塩基配列に対して70%以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列であってもよく、相同性が80%以上であることが好ましく、90%以上であることがより好ましく、95%以上であることがなお好ましく、95.2%以上であることがさらになお好ましく、97%以上であることがさらになお好ましく、99%以上であることが特に好ましい。また、前記fadB遺伝子は、配列番号5に記載の塩基配列において1〜647個、好ましくは1〜431個、より好ましくは1〜216個、特に好ましくは1〜108個の塩基の欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、不飽和脂肪酸のβ酸化活性を有する酵素をコードする遺伝子であってもよい。塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法(Science,1985,227,p.1435)等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(ソフトウェア開発製)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出することができる。なお、本発明における好ましいfadB遺伝子の塩基配列である配列番号5に記載の塩基配列に対する、fadB遺伝子の他の例として、モラクセラ・カタラーリスRH4株のfadB遺伝子の塩基配列(配列番号6、アクセッション番号:CP002005、遺伝子番号:MCR_0091、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/kegg2.html)参照)、アシネトバクター・エスピーDR1株のfadB遺伝子の塩基配列(配列番号7、アクセッション番号:CP002080、遺伝子番号:AOLE_17905)、及び大腸菌(Escherichia coli)K12 MG1655株のfadB遺伝子の塩基配列(配列番号8、アクセッション番号:AP012306、遺伝子番号:b3846)の相同性を表2に示す。
本発明におけるfadD遺伝子の塩基配列は、配列番号9に記載の塩基配列に対して70%以上の相同性を有する塩基配列又はその相補配列であってもよく、80%以上であることが好ましく、90%以上であることがより好ましく、95%以上であることがなお好ましく、95.4%以上であることがさらになお好ましく、97%以上であることがさらになお好ましく、99%以上であることが特に好ましい。また、前記fadD遺伝子は、配列番号9に記載の塩基配列において1〜506個、好ましくは1〜377個、より好ましくは1〜169個、特に好ましくは1〜84個の塩基の欠失、置換、挿入又は付加された塩基配列からなり、不飽和脂肪酸のβ酸化活性を有する酵素をコードする遺伝子であってもよい。塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法(Science,1985,227,p.1435)等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(ソフトウェア開発製)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出することができる。なお、本発明における好ましいfadD遺伝子の塩基配列である配列番号9に記載の塩基配列に対する、fadD遺伝子の他の例として、モラクセラ・カタラーリスRH4株のfadD遺伝子の塩基配列(配列番号10、アクセッション番号:CP002005、遺伝子番号:MCR_1388、KEGG(http://www.genome.jp/kegg/kegg2.html)参照)、アシネトバクター・エスピーDR1株のfadD遺伝子の塩基配列(配列番号11、アクセッション番号:CP002080、遺伝子番号:AOLE_18375)、及び大腸菌K12 MG1655株のfadD遺伝子の塩基配列(配列番号12、アクセッション番号:AP012306、遺伝子番号:b1805)の相同性を表3に示す
生乾き臭原因物質を産生する微生物において、脂肪酸不飽和化酵素により生乾き臭原因物質の前駆体となる脂肪酸の不飽和反応が起こる。そして、この反応により生成した不飽和脂肪酸から、β酸化関連酵素によるβ酸化反応により、生乾き臭原因物質が生成する。
生乾き臭原因物質を産生する微生物による、アンテイソ脂肪酸の1種である16-メチルオクタデカン酸を基質とした生乾き臭原因物質(4M3H)生成のメカニズムの1例を下記に示す。
前記オリゴヌクレオチド(a)〜(l)は、それぞれ配列番号13〜24のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、本発明において脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(特に、Δ9デサチュラーゼ遺伝子)の検出に好ましく用いることができるオリゴヌクレオチドは、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(好ましくはΔ9デサチュラーゼ遺伝子)の検出に使用できる限り配列番号13〜24のいずれかに記載の塩基配列に対する相同性が70%以上であってもよい。相同性は75%以上であることが好ましく、80%以上であることがより好ましく、85%以上であることがさらに好ましく、90%以上であることがさらに好ましく、95%以上であることが特に好ましい。また、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(好ましくはΔ9デサチュラーゼ遺伝子)の検出に好ましく用いることができるオリゴヌクレオチドには、配列番号13〜24のいずれかに記載の塩基配列において1又は数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個の塩基の欠失、置換、挿入又は付加されており、かつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(好ましくはΔ9デサチュラーゼ遺伝子)の検出に使用できるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号13〜24のいずれかに記載の塩基配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。
塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法(Science,1985,227,p.1435)等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(ソフトウェア開発製)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出することができる。
なお、本明細書において、「ストリンジェントな条件」としては、例えばMolecular Cloning−A LABORATORY MANUAL THIRD EDITION[Joseph Sambrook,David W.Russell.,Cold Spring Harbor Laboratory Press]記載の方法が挙げられる。例えば、6×SSC(1×SSCの組成:0.15M塩化ナトリウム、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)、0.5%SDS、5×デンハート及び100mg/mLニシン精子DNAを含む溶液にプローブとともに65℃で8〜16時間恒温し、ハイブリダイズさせる条件が挙げられる。
fadB遺伝子を検出する場合、前記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに前記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)からなるオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いるのが好ましい。fadD遺伝子を検出する場合、前記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに前記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)からなるオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いるのが好ましい。
前記オリゴヌクレオチド(m)〜(z)及び(a1)〜(d1)は、それぞれ配列番号25〜42のいずれかに記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドが好ましい。また、本発明においてβ酸化関連酵素遺伝子(特に、fadB遺伝子又はfadD遺伝子)の検出に好ましく用いることができるオリゴヌクレオチドは、β酸化関連酵素遺伝子(好ましくはfadB遺伝子又はfadD遺伝子)の検出に使用できる限り配列番号25〜42のいずれかに記載の塩基配列に対する相同性が70%以上であってもよい。相同性は75%以上であることが好ましく、80%以上であることがより好ましく、85%以上であることがさらに好ましく、90%以上であることがさらに好ましく、95%以上であることが特に好ましい。また、β酸化関連酵素遺伝子(好ましくはfadB遺伝子又はfadD遺伝子)の検出に好ましく用いることができるオリゴヌクレオチドには、配列番号25〜42のいずれかに記載の塩基配列において1又は数個、好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個の塩基の欠失、置換、挿入又は付加されており、かつβ酸化関連酵素遺伝子(好ましくはfadB遺伝子又はfadD遺伝子)の検出に使用できるオリゴヌクレオチドも包含される。また、配列番号25〜42のいずれかに記載の塩基配列に、適当な塩基配列を付加してもよい。
塩基配列の相同性については、Lipman-Pearson法(Science,1985,227,p.1435)等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(ソフトウェア開発製)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出することができる。
本発明の検出方法で検出される微生物種としては、本発明の評価方法で用いる微生物種が挙げられる。
本発明の生乾き臭原因物質を産生する微生物の検出方法に用いる各オリゴヌクレオチド対については、前述の、本発明の生乾き臭抑制剤のスクリーニング方法及び生乾き臭抑制評価方法に用いる各オリゴヌクレオチド対と同様である。
脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及びβ酸化関連酵素遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種の断片を増幅する方法としては、PCR法、リアルタイムPCR法、LCR(Ligase Chain Reaction)法、SDA(Strand Displacement Amplification)法、NASBA(Nucleic Acid Sequence-based Amplification)法、RCA(Rolling-circle amplification)法、LAMP(Loop mediated isothermal amplification)法など通常の方法を用いることができる。本発明においては、PCR法を用いるのが好ましい。
本発明において、PCR法により遺伝子断片を増幅する方法の具体例について詳しく説明する。
前記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)、前記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)、前記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)、前記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)、前記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)、並びに前記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)は、PCRによって生乾き臭原因物質を産生する微生物の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子(特に、Δ9デサチュラーゼ遺伝子)の断片(一部)を増幅できる。前述のように、脂肪酸不飽和化酵素は、4M3Hなどの生乾き臭原因物質の生成に関連している。したがって、前記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに前記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)からなるオリゴヌクレオチド対は、生乾き臭抑制評価方法やスクリーニング方法における脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現の検知や、生乾き臭原因物質を産生する微生物の検出に好適に用いることができる。
前記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)、前記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)、前記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)、並びに前記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)は、PCRによって生乾き臭原因物質を産生する微生物のβ酸化関連酵素遺伝子(特に、fadB遺伝子)の断片(一部)を増幅できる。また、前記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)、前記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)、前記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)、前記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)、並びに前記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)は、PCRによって生乾き臭原因物質を産生する微生物のβ酸化関連酵素遺伝子(特に、fadD遺伝子)の断片(一部)を増幅できる。前述のように、β酸化関連酵素は、4M3Hなどの生乾き臭原因物質の生成に関連している。したがって、前記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに前記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)からなるオリゴヌクレオチド対は、生乾き臭抑制評価方法やスクリーニング方法におけるβ酸化関連酵素遺伝子の発現の検知や、生乾き臭原因物質を産生する微生物の検出に好適に用いることができる。
例えば、前記少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を核酸プライマーとして用いてPCRを行う場合、2本鎖DNAを1本鎖にする熱変性反応を95℃以上98℃以下で約5秒(好ましくは5秒)以上約60秒(好ましくは60秒)以下行う。次に、プライマー対を1本鎖DNAにハイブリダイズさせるアニーリング反応を55℃以上(好ましくは59℃以上)65℃以下(好ましくは62℃)で約5秒(好ましくは5秒)以上約60秒(好ましくは60秒)以下、より好ましくは61℃で60秒間行う。次に、DNAポリメラーゼを作用させる伸長反応を約72℃で約10秒(好ましくは10秒)以上約60秒(好ましくは60秒)以下行う。これらを1サイクルとしたものを約30以上(好ましくは30以上)約35以下(好ましくは35以下)のサイクルで行う。
検体に検出対象微生物が含まれる場合、本発明のオリゴヌクレオチド対をプライマーセットとして使用してPCRを行い、得られたPCR産物について電気泳動を行うと、特定のサイズでDNA断片が確認される。
このような操作を行うことにより、検体に検出対象微生物が含まれているかを確認することができる。
また、本発明の生乾き臭抑制評価用キット、スクリーニング用キット及び生乾き臭原因物質を産生する微生物の検出用キットは、前記オリゴヌクレオチド(a)〜(z)及び(a1)〜(d1)からなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、又は前記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)、前記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)、前記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)、前記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)、前記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)、前記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)、前記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)、前記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)、前記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)、前記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)、前記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)、前記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)、前記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)、前記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)、若しくは前記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)からなるオリゴヌクレオチド対、の少なくとも1種を含んでなる。
下記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)からなるオリゴヌクレオチド対、下記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)からなるオリゴヌクレオチド対、下記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)からなるオリゴヌクレオチド対、下記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)からなるオリゴヌクレオチド対、下記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)からなるオリゴヌクレオチド対、下記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)からなるオリゴヌクレオチド対、下記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)からなるオリゴヌクレオチド対、下記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)からなるオリゴヌクレオチド対、下記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)からなるオリゴヌクレオチド対、下記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)からなるオリゴヌクレオチド対、下記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)からなるオリゴヌクレオチド対、下記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)からなるオリゴヌクレオチド対、下記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)からなるオリゴヌクレオチド対、下記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに下記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)からなるオリゴヌクレオチド対、からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いて、前記少なくとも1種の遺伝子の発現を検知する、生乾き臭抑制評価方法。
(a)配列番号13に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号13に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号13に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(b)配列番号14に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号14に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号14に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(c)配列番号15に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号15に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号15に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(d)配列番号16に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号16に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号16に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(e)配列番号17に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号17に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号17に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(f)配列番号18に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号18に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号18に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(g)配列番号19に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号19に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号19に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(h)配列番号20に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号20に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号20に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(i)配列番号21に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号21に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号21に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(j)配列番号22に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号22に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号22に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(k)配列番号23に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号23に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号23に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(l)配列番号24に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号24に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号24に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(m)配列番号25に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号25に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号25に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(n)配列番号26に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号26に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号26に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(o)配列番号27に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号27に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号27に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(p)配列番号28に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号28に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号28に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(q)配列番号29に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号29に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号29に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(r)配列番号30に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号30に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号30に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(s)配列番号31に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号31に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号31に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(t)配列番号32に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号32に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号32に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(u)配列番号33に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号33に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号33に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(v)配列番号34に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号34に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号34に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(w)配列番号35に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号35に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号35に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(x)配列番号36に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号36に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号36に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(y)配列番号37に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号37に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号37に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(z)配列番号38に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号38に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号38に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(a1)配列番号39に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号39に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号39に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(b1)配列番号40に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号40に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号40に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(c1)配列番号41に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号41に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号41に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
(d1)配列番号42に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号42に記載の塩基配列において1若しくは数個(好ましくは1〜5個、より好ましくは1〜4個、さらに好ましくは1〜3個、よりさらに好ましくは1又は2個、特に好ましくは1個)の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド、若しくは配列番号42に記載の塩基配列との相同性が、80%以上(好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、さらに好ましくは95%以上)でありかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド。
<3>前記皮脂汚れ成分がアンテイソ脂肪酸、好ましくは炭素数9以上(好ましくは11以上、より好ましくは17以上)21以下(好ましくは19以下)のアンテイソ脂肪酸、より好ましくは6-メチルオクタン酸、8-メチルデカン酸、12-メチルテトラデカン酸、14-メチルヘキサデカン酸、16-メチルオクタデカン酸、14-メチルヘキサデセン酸及び16-メチルオクタデセン酸、並びにこれらの塩やエステルからなる群より選ばれる1種又は2種以上、さらに好ましくは14-メチルヘキサデカン酸及び16-メチルオクタデカン酸からなる群より選ばれる少なくとも1種である、前記<1>又は<2>項記載の評価方法。
<4>前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がΔ9デサチュラーゼ遺伝子、Δ5デサチュラーゼ遺伝子及びΔ6デサチュラーゼ遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種、好ましくはΔ9デサチュラーゼ遺伝子である、前記<1>〜<3>項のいずれか記載の評価方法。
<5>前記Δ9デサチュラーゼ遺伝子の塩基配列が、配列番号1に記載の塩基配列、配列番号1に記載の塩基配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、さらになお好ましくは96.1%以上、さらになお好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列若しくは配列番号1に記載の塩基配列に対して1〜351個、好ましくは1〜234個、より好ましくは1〜117個、特に好ましくは1〜59個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又はこれらの相補配列である、前記<4>項記載の評価方法。
<6>前記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに前記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)からなるオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いて、前記Δ9デサチュラーゼ遺伝子の発現を検知する、前記<4>又は<5>項記載の評価方法。
<7>前記β酸化関連酵素遺伝子がfadD遺伝子、fadE遺伝子、fadB遺伝子及びfadA遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種、好ましくはfadB遺伝子及びfadD遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種である、前記<1>〜<3>項のいずれか記載の評価方法。
<8>前記fadB遺伝子の塩基配列が、配列番号5に記載の塩基配列、配列番号5に記載の塩基配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、さらになお好ましくは95.2%以上、さらになお好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列若しくは配列番号5に記載の塩基配列に対して1〜647個、好ましくは1〜431個、より好ましくは1〜216個、特に好ましくは1〜108個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又はこれらの相補配列である、前記<7>項記載の評価方法。
<9>前記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに前記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)からなるオリゴヌクレオチド対、からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いて、前記fadB遺伝子の発現を検知する、前記<7>又は<8>項記載の評価方法。
<10>前記fadD遺伝子の塩基配列が、配列番号9に記載の塩基配列、配列番号9に記載の塩基配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、さらになお好ましくは95.4%以上、さらになお好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列若しくは配列番号9に記載の塩基配列に対して1〜506個、好ましくは1〜377個、より好ましくは1〜169個、特に好ましくは1〜84個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又はこれらの相補配列である、前記<7>項記載の評価方法。
<11>前記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに前記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)からなるオリゴヌクレオチド対、からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いて、前記fadD遺伝子の発現を検知する、前記<7>又は<10>項記載の評価方法。
<12>前記微生物が、モラクセラ・エスピー又はモラクセラ・オスロエンシスである、前記<1>〜<11>項のいずれか記載の評価方法。
<13>前記モラクセラ・エスピーが、配列番号43又は配列番号44の塩基配列と95%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、特になお好ましくは99.2%以上の相同性を有する16S rRNA遺伝子配列、又は配列番号43又は配列番号44に記載の塩基配列において1〜75個、好ましくは1〜45個、より好ましくは1〜30個、さらに好ましくは1〜15個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなる16S rRNA遺伝子を有する微生物である、前記<12>項記載の評価方法。
<14>前記微生物及び前記被験物質を、皮脂汚れ成分が付着している繊維製品に添加して接触させる、前記<1>〜<13>のいずれか1項記載の評価方法。
<15>皮脂汚れ成分の付着量が繊維製品2×2cmに対して0.1mg以上1mg以下である、前記<14>記載の評価方法。
<16>前記微生物の前記繊維製品への付着量が102CFU/cm2以上105CFU/cm2以下である、前記<14>又は<15>項に記載の評価方法。
<17>前記繊維製品の素材が、ウール、シルク、木綿、ポリエステル、ポリアミド、又はこれらの組合せ、好ましくは木綿である、前記<14>〜<16>のいずれか1項記載の評価方法。
前記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに前記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)からなるオリゴヌクレオチド対、からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いて生乾き臭原因物質を産生する微生物の検出を行う、生乾き臭原因物質を産生する微生物の検出方法。
<21>前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がΔ9デサチュラーゼ遺伝子、Δ5デサチュラーゼ遺伝子及びΔ6デサチュラーゼ遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種、好ましくはΔ9デサチュラーゼ遺伝子である、前記<19>又は<20>項記載の検出方法。
<22>前記Δ9デサチュラーゼ遺伝子の塩基配列が、配列番号1に記載の塩基配列、配列番号1に記載の塩基配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、さらになお好ましくは96.1%以上、さらになお好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列若しくは配列番号1に記載の塩基配列に対して、1〜351個、好ましくは1〜234個、より好ましくは1〜117個、特に好ましくは1〜59個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又はこれらの相補配列である、前記<21>項記載の検出方法。
<23>前記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに前記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)からなるオリゴヌクレオチド対からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いて、前記Δ9デサチュラーゼ遺伝子の断片を増幅する、前記<21>又は<22>項記載の検出方法。
<24>前記β酸化関連酵素遺伝子がfadD遺伝子、fadE遺伝子、fadB遺伝子及びfadA遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種、好ましくはfadB遺伝子及びfadD遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種である、前記<19>又は<20>項記載の検出方法。
<25>前記fadB遺伝子の塩基配列が、配列番号5に記載の塩基配列、配列番号5に記載の塩基配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、さらになお好ましくは95.2%以上、さらになお好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列若しくは配列番号5に記載の塩基配列に対して1〜647個、好ましくは1〜431個、より好ましくは1〜216個、特に好ましくは1〜108個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又はこれらの相補配列である、前記<24>項記載の検出方法。
<26>前記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに前記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)からなるオリゴヌクレオチド対、からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いて、前記fadB遺伝子の断片を増幅する、前記<24>又は<25>項記載の検出方法。
<27>前記fadD遺伝子の塩基配列が、配列番号9に記載の塩基配列、配列番号9に記載の塩基配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、さらになお好ましくは95.4%以上、さらになお好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列若しくは配列番号9に記載の塩基配列に対して1〜506個、好ましくは1〜377個、より好ましくは1〜169個、特に好ましくは1〜84個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又はこれらの相補配列である、前記<24>項記載の検出方法。
<28>前記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)からなるオリゴヌクレオチド対、前記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに前記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)からなるオリゴヌクレオチド対、からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いて、前記fadD遺伝子の断片を増幅する、前記<24>又は<27>項記載の検出方法。
<29>前記微生物が、モラクセラ・エスピー又はモラクセラ・オスロエンシスである、前記<19>〜<28>項のいずれか記載の検出方法。
<30>前記モラクセラ・エスピーが、配列番号43又は配列番号44の塩基配列と95%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、さらに好ましくは99%以上、特に好ましくは99.2%以上の相同性を有する16S rRNA遺伝子配列、又は配列番号43又は配列番号44に記載の塩基配列において1〜75個、好ましくは1〜45個、より好ましくは1〜30個、さらに好ましくは1〜15個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列からなる16S rRNA遺伝子を有する微生物である、前記<29>項記載の検出方法。
<33>前記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)、前記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)、前記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)、前記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)、前記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)、並びに前記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によって、生乾き臭原因物質を産生する微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を検知又は該遺伝子の断片を増幅するための核酸プライマーとして機能し得るものである、前記<32>項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
<34>前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がΔ9デサチュラーゼ遺伝子である、前記<33>項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
<35>前記Δ9デサチュラーゼ遺伝子の塩基配列が、配列番号1に記載の塩基配列、配列番号1に記載の塩基配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、さらになお好ましくは96.1%以上、さらになお好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列若しくは配列番号1に記載の塩基配列に対して、1〜351個、好ましくは1〜234個、より好ましくは1〜117個、特に好ましくは1〜59個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又はこれらの相補配列である、前記<34>項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
<36>前記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)、前記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)、前記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)、並びに前記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によって、生乾き臭原因物質を産生する微生物由来のβ酸化関連酵素遺伝子の発現を検知又は該遺伝子の断片を増幅するための核酸プライマーとして機能し得るものである、前記<32>項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
<37>前記β酸化関連酵素遺伝子がfadB遺伝子である、前記<36>項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
<38>前記fadB遺伝子の塩基配列が、配列番号5に記載の塩基配列、配列番号5に記載の塩基配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、さらになお好ましくは95.2%以上、さらになお好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列若しくは配列番号5に記載の塩基配列に対して1〜647個、好ましくは1〜431個、より好ましくは1〜216個、特に好ましくは1〜108個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又はこれらの相補配列である、前記<37>項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
<39>前記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)、前記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)、前記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)、前記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)、並びに前記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)が、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)法によって、生乾き臭原因物質を産生する微生物由来のβ酸化関連酵素遺伝子の発現を検知又は該遺伝子の断片を増幅するための核酸プライマーとして機能し得るものである、前記<32>項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
<40>前記β酸化関連酵素遺伝子がfadD遺伝子である、前記<39>項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
<41>前記fadD遺伝子の塩基配列が、配列番号9に記載の塩基配列、配列番号9に記載の塩基配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、さらになお好ましくは95.4%以上、さらになお好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列若しくは配列番号9に記載の塩基配列に対して1〜506個、好ましくは1〜377個、より好ましくは1〜169個、特に好ましくは1〜84個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又はこれらの相補配列である、前記<40>項記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
<42>生乾き臭原因物質を産生する微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を検知又は該遺伝子の断片を増幅するための核酸プライマーとしての、前記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)、前記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)、前記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)、前記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)、前記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)、又は前記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)からなるオリゴヌクレオチド対の使用。
<43>生乾き臭原因物質を産生する微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を検知又は該遺伝子の断片を増幅するための核酸プライマーの製造のための、前記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)、前記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)、前記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)、前記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)、前記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)、又は前記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)からなるオリゴヌクレオチド対の使用。
<44>前記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)、前記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)、前記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)、前記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)、前記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)、又は前記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)からなるオリゴヌクレオチド対を、生乾き臭原因物質を産生する微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を検知又は該遺伝子の断片を増幅するための核酸プライマーとして使用する方法。
<45>前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がΔ9デサチュラーゼ遺伝子である、前記<42>〜<44>のいずれか1項記載の使用又は方法。
<46>前記Δ9デサチュラーゼ遺伝子の塩基配列が、配列番号1に記載の塩基配列、配列番号1に記載の塩基配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、さらになお好ましくは96.1%以上、さらになお好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列若しくは配列番号1に記載の塩基配列に対して、1〜351個、好ましくは1〜234個、より好ましくは1〜117個、特に好ましくは1〜59個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又はこれらの相補配列である、前記<45>項記載の使用又は方法。
<47>生乾き臭原因物質を産生する微生物由来のβ酸化関連酵素遺伝子の発現を検知又は該遺伝子の断片を増幅するための核酸プライマーとしての、前記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)、前記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)、前記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)、又は前記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)からなるオリゴヌクレオチド対の使用。
<48>生乾き臭原因物質を産生する微生物由来のβ酸化関連酵素遺伝子の発現を検知又は該遺伝子の断片を増幅するための核酸プライマーの製造のための、前記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)、前記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)、前記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)、又は前記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)からなるオリゴヌクレオチド対の使用。
<49>前記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)、前記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)、前記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)、又は前記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)からなるオリゴヌクレオチド対を、生乾き臭原因物質を産生する微生物由来のβ酸化関連酵素遺伝子の発現を検知又は該遺伝子の断片を増幅するための核酸プライマーとして使用する方法。
<50>前記β酸化関連酵素遺伝子がfadB遺伝子である、前記<47>〜<49>のいずれか1項記載の使用又は方法。
<51>前記fadB遺伝子の塩基配列が、配列番号5に記載の塩基配列、配列番号5に記載の塩基配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、さらになお好ましくは95.2%以上、さらになお好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列若しくは配列番号5に記載の塩基配列に対して1〜647個、好ましくは1〜431個、より好ましくは1〜216個、特に好ましくは1〜108個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又はこれらの相補配列である、前記<50>項記載の使用又は方法。
<52>生乾き臭原因物質を産生する微生物由来のβ酸化関連酵素遺伝子の発現を検知又は該遺伝子の断片を増幅するための核酸プライマーとしての、前記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)、前記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)、前記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)、前記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)、又は前記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)からなるオリゴヌクレオチド対の使用。
<53>生乾き臭原因物質を産生する微生物由来のβ酸化関連酵素遺伝子の発現を検知又は該遺伝子の断片を増幅するための核酸プライマーの製造のための、前記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)、前記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)、前記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)、前記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)、又は前記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)からなるオリゴヌクレオチド対の使用。
<54>前記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)、前記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)、前記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)、前記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)、又は前記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)からなるオリゴヌクレオチド対を、生乾き臭原因物質を産生する微生物由来のβ酸化関連酵素遺伝子の発現を検知又は該遺伝子の断片を増幅するための核酸プライマーとして使用する方法。
<55>前記β酸化関連酵素遺伝子がfadD遺伝子である、前記<52>〜<54>のいずれか1項記載の使用又は方法。
<56>前記fadD遺伝子の塩基配列が、配列番号9に記載の塩基配列、配列番号9に記載の塩基配列に対して70%以上、好ましくは80%以上、より好ましくは90%以上、なお好ましくは95%以上、さらになお好ましくは95.4%以上、さらになお好ましくは97%以上、特に好ましくは99%以上の相同性を有する塩基配列若しくは配列番号9に記載の塩基配列に対して1〜506個、好ましくは1〜377個、より好ましくは1〜169個、特に好ましくは1〜84個の塩基の欠失、置換、挿入若しくは付加された塩基配列、又はこれらの相補配列である、前記<55>項記載の使用又は方法。
<58>少なくとも1種の、前記<31>〜<41>のいずれか記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含んでなる、生乾き臭原因物質を産生する微生物の検出用キット。
特開2009−149546号公報に準じて、14-メチルヘキサデカン酸を下記の2工程の反応で合成した。
(a)工程
12-ドデカノリド11.9g(60.0mmol)、32%臭化水素/酢酸溶液24.3g(96.0mmol、1.6当量)を、テフロン(登録商標)で保護された100mLオートクレーブに入れ、窒素置換した後密閉し、60℃のオイルバスを用いて、16時間マグネチックスターラーで攪拌した。冷却後、水14mLを加え、熱ヘキサン200mLを用い、分液ロートに移送した。イオン交換水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過、n-ヘキサンで晶析することで、12-ブロモドデカン酸14.4g(収率86%)を得た。
(b)工程
次に、還流冷却管、50mL滴下ロート、マグネチックスターラー、温度センサーを備えた100mLの4口フラスコに、12−ブロモドデカン酸5.0g(17.9mmol)及びトリフェニルホスフィン(関東化学社製)28.2mg(0.006eq)を入れ、減圧乾燥した。アルゴン雰囲気下、臭化銅(I)(アルドリッチ社製)77.1mg(0.03当量)、無水テトラヒドロフラン10mLを加えた。室温下、2−メチルブチルマグネシウムブロミド39.5mL(3当量、1.36Nテトラヒドロフラン溶液)を、1時間で滴下した。1時間攪拌した後、1N塩酸水溶液50mLを加え、ヘキサン100mLで2回抽出した。イオン交換水50mLで2回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過、減圧濃縮して、粗生成物3.9gを得た。
ガスクロマトグラフィー(カラム:アジレント社製、商品名:Ultra−2、30m×0.2mm×0.33μm、DET300℃、INJ300℃、カラム温度100℃→300℃、10℃/分)で、内標にオクタデカンを用い、定量した結果、収率79%であった。
このようにして、12-ドデカノリドから14-メチルヘキサデカン酸を全収率68%で得た。また純度は98%であった。
4mLのSCD液体培地(日本製薬)に、前培養したモラクセラ・エスピーKMC4-1株を1白金耳接種し、35℃で24時間振とう培養(160rpm)した。24時間培養した菌液に、皮脂汚れ成分として10mgの16−メチルオクタデカン酸を添加し、さらに35℃で6時間培養し、菌体を回収した。コントロールとして、皮脂汚れ成分を添加しない系についても同様に培養を行い、菌体を回収した。
陰性対照(ネガティブコントロール)として滅菌蒸留水をDNAテンプレートの代わりに混合したPCR反応液も同様に調製した。
2cm×2cmの正方形に切断した木綿の平織り布に、皮脂汚れ成分として、製造例で合成した16−メチルオクタデカン酸0.5mgをメタノール0.1mLに溶解した溶液を塗布し、その後メタノールの乾固を行った。
上記木綿の平織り布に、前記各種菌液0.1mLを植菌し、加湿条件下で37℃で24時間静置し、生乾き臭の嗅ぎ分けが可能な専門評価者による生乾き臭の官能評価を行った。
評価基準は、生乾き臭があるものを「A」、やや生乾き臭があるものを「B」、生乾き臭が全くしないものを「C」として評価した。その結果を表9及び10に示す。
4mLのSCD液体培地(日本製薬)に、下記に示す被検物質(物質(1)〜(7))を添加した。コントロールとして被検物質を何も添加しない系も作成した培地も用意した。これらの培地に、前培養したモラクセラ・エスピーKMC4-1株を1白金耳接種し、35℃で24時間振とう培養(160rpm)した。
24時間培養した菌液に、皮脂汚れ成分として10mgの16−メチルオクタデカン酸を添加し、さらに35℃で6時間培養し、菌体を回収した。コントロールとして、皮脂汚れ成分を添加しない系についても同様に培養を行い、菌体を回収した。
調製した鋳型を無菌蒸留水で20倍希釈した溶液2μL、TaKaRa SYBR Premix EX Taq(商品名、タカラバイオ社製)12.5μL、配列番号13の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(des F1、20pmol/μL)0.5μL、配列番号14の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(des R1、20pmol/μL)0.5μL、無菌蒸留水9.5μL混合することで、25μLのリアルタイムPCR反応液を調製した。
陰性対照(ネガティブコントロール)として滅菌蒸留水をDNAテンプレートの代わりに混合したPCR反応液も同様に調製した。
滅菌処理し、25℃、40%RHで乾燥して一定状態にした綿メリヤス布(色染社、木綿メリヤス、未シルケット加工)を2cm×2cmの正方形に切断し、皮脂汚れ成分として14−メチルヘキサデカン酸0.5mgをメタノール0.1mLに溶解した溶液を塗布した。その後メタノールの乾固を行い、モデル試験布を作成した。
各被検物質のメタノール溶液を調製し、モデル試験布1gに対して各被検物質の塗布量が10μgとなるように、前記メタノール溶液を前記モデル試験布に20℃で塗布し、室温で2時間乾燥させ、メタノール乾固した。上記モデル試験布に前記細菌懸濁液0.1mLを塗布し、シャーレ中で37℃、相対湿度70%の培養庫において24時間培養を行い、細菌定着布を調製した。
一方、表14の結果から明らかなように、生乾き臭原因物質を産生する微生物の1種であるモラクセラ・エスピーKMC4-1株と、物質(1)、物質(2)、物質(3)又は物質(4)とを接触させた場合、生乾き臭抑制効果が認められ、さらに4M3H生成抑制率も高かった。したがって、これらの物質は生乾き臭原因物質の生成に関わる酵素遺伝子の発現を抑制することで、4M3H等の生乾き臭原因物質の生成を抑制し、生乾き臭の発生を抑制していることがわかる。
以上の結果から、生乾き臭原因物質を産生する微生物における脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及び/又はβ酸化関連酵素遺伝子の発現が、生乾き臭の発生に関連していることがいえる。
次に、生乾き臭原因物質を産生する微生物に対する、物質(1)〜(7)の増殖抑制効果及び殺菌効果を検討した。
4mLのSCD液体培地(日本製薬)に、物質(1)〜(7)を表15に記載の終濃度になるように添加した。コントロールとして被検物質を何も添加しない系も作成した培地も用意した。これらの培地に、前培養したモラクセラ・エスピーKMC4-1株を初発が104CFU/mLとなるように接種し、35℃で24時間振とう培養(160rpm)後、LP希釈溶液(日本製薬)を用いて段階希釈後SCD−LP寒天培地(日本製薬)を用いて生残菌数を測定した。
物質(1)〜(7)を表15に記載の終濃度になるように調製した5mLの試験溶液に、106CFU/mLとなるように前培養したモラクセラ・エスピーKMC4-1株を接種し、25℃で2時間振とう(160rpm)後、LP希釈溶液(日本製薬)を用いて段階希釈後SCD−LP寒天培地(日本製薬)を用いて生残菌数を測定した。
このように、本発明によれば、生乾き臭原因物質を産生する微生物に対する増殖抑制効果又は殺菌効果を示す生乾き臭抑制剤だけではなく、4M3Hなどの生乾き臭原因物質の生成に関わる代謝の抑制効果を示す生乾き臭抑制剤についてもスクリーニング又は評価することが可能になる。
(1)ゲノムDNAの調製
表16記載のモラクセラ属細菌及び各種細菌の各菌株を、それぞれSCD寒天培地(日本製薬社製)に接種して35℃で24時間培養後、白金耳を用いて各菌体を寒天培地から回収した。回収した菌体から、ゲノムDNA調製用キット(アプライドバイオシステムズ社製、PrepMan Ultra Reagent(商品名))を用いてゲノムDNA溶液を調製した。
さらに、モラクセラ属細菌については、16S rRNA遺伝子の塩基配列について、配列番号43又は配列番号44に示す塩基配列との同一性について決定した。なお、配列番号43又は配列番号44に示す塩基配列は、それぞれ、モラクセラ・エスピー4-1株及びモラクセラ・オスロエンシスATCC19976株の16S rRNA遺伝子の塩基配列を示す。さらに、塩基配列の同一性は、遺伝子情報処理ソフトウェアClustalWを用いて算出した。
表16記載のモラクセラ属細菌及び各種細菌の各菌株をSCD液体培地(日本製薬社製)5mLに一白金耳接種し、35℃で24時間振とう培養(160rpm)を行なった。培養後の菌体を遠心(8000×g、10分)して上清を取り除いた後、生理食塩水5mLに懸濁し、再度遠心(8000×g、10分)した後上清を取り除き、生理食塩水を用いてOD600=1.0となるように菌液を調製した。
2cm×2cmの正方形に切断した木綿の平織り布に、皮脂汚れ成分として、16−メチルオクタデカン酸0.5mgをメタノール0.1mLに溶解した溶液を塗布し、その後メタノールの乾固を行った。
上記木綿の平織り布に、前記各種菌液0.1mLを植菌し、加湿条件下で37℃で24時間静置し、4M3Hの定量を行った。
24時間静置後の前記タオルに、メタノール10mLを添加し、そのうちの1mLとADAM(9-Anthrydiazomethanene、フナコシ社製、0.1w/v%)1mLとを混合し、室温で60分放置し、誘導体化を行なった。
その後、10μL溶液について、LC−FL(液体クロマトグラフィー装置:HITACHI ELITE LaChrom(商品名、日立社製)、カラム:Lichrospher 100 RP-8(e)(商品名、アジレント社製、5μm×125mm×4mmφ)、カラム温度:40℃、溶離剤:アセトニトリル/水=7/3(体積比)の混合溶液、流速:1.0mL/min、検出器:励起波長(365nm)、測定波長(412nm))を用いて解析を行うことで、生成した4M3Hの定量を行った。4M3Hの生成量について、生成した4M3Hの量が1μgより多かった試料を「A」、0.1μgより多く1μg以下の試料を「B」、0μgより多く0.1μg以下の試料を「C」、全く検出されなかった試料を「D」として評価した。その結果を表16に示す。
DNAテンプレートとして上記で調製したゲノムDNA溶液を無菌蒸留水で100倍希釈した溶液1μL、TaKaRa EX Taq HS(商品名、タカラバイオ社製)0.1μL、4種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)混合液(タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Version(商品名)に付属のdNTP混合液)1.6μL、10倍濃縮反応用バッファー(タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Version(商品名)に付属のバッファー)2μL、配列番号13の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(des F1、20pmol/μL)0.4μL、配列番号14の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(des R1、20pmol/μL)0.4μL、無菌蒸留水14.5μL混合することで、20μLのPCR反応液を調製した。
陰性対照(ネガティブコントロール)として滅菌蒸留水をDNAテンプレートの代わりに混合したPCR反応液も同様に調製した。
PCR後、反応液を2%アガロールゲルにアプライし、TBAバッファー中、100ボルトで30分電気泳動を行った。次いで、ゲルを取り出し、SYBR safe DNA gel stain in 1×TAE(インビトロジェン社製)溶液中に30分浸漬してDNA断片を染色後、UVランプ照射の下ポラロイド(登録商標)カメラで撮影し、約120bpのDNA断片の有無を確認した。DNA断片のサイズは、電気泳動時に、塩基対数が既知のDNA断片を一緒に流しておくことで、移動度の相対的比較によって算出した。目的の遺伝子断片の確認結果を表17〜19に示す。
なお、モラクセラ・エスピーKMC4-1株について、各プライマー対を用いて増幅された遺伝子断片の塩基配列と、配列番号1に記載の塩基配列との相同性を表20に示す。
この結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることで、生乾き臭原因物質を産生する微生物の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の断片を増幅することができ、脂肪酸不飽和化酵素遺伝子を迅速かつ正確に検出することができることがわかった。
(1)PCR反応
DNAテンプレートとして実施例2で調製したゲノムDNA溶液を無菌蒸留水で100倍希釈した溶液)1μL、TaKaRa EX Taq HS(商品名、タカラバイオ社製)0.1μL、4種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)混合液(タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに付属のdNTP混合液)1.6μL、10倍濃縮反応用バッファー(タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに付属のバッファー)2μL、配列番号25の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(fadB F6、20pmol/μL)0.4μL、配列番号26の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(fadB R6、20pmol/μL)0.4μL、無菌蒸留水14.5μL混合することで、20μLのPCR反応液を調製した。
陰性対照(ネガティブコントロール)として滅菌蒸留水をDNAテンプレートの代わりに混合したPCR反応液も同様に調製した。
PCR後、反応液を2%アガロールゲルにアプライし、TBAバッファー中、100ボルトで30分電気泳動を行った。次いで、ゲルを取り出し、SYBR safe DNA gel stain in 1×TAE(インビトロジェン社製)溶液中に30分浸漬してDNA断片を染色後、UVランプ照射の下ポラロイド(登録商標)カメラで撮影し、約150bpのDNA断片の有無を確認した。DNA断片のサイズは、電気泳動時に、塩基対数が既知のDNA断片を一緒に流しておくことで、移動度の相対比較によって算出した。目的の遺伝子断片の確認結果を表21〜23に示す。
なお、モラクセラ・エスピーKMC4-1株について、各プライマー対を用いて増幅されたfadB遺伝子断片の塩基配列と、配列番号5に記載の塩基配列との相同性を表24に、各プライマー対を用いて増幅されたfadD遺伝子断片の塩基配列と、配列番号9に記載の塩基配列との相同性を表25にそれぞれ示す。
また、表25に示すように、増幅されたfadD遺伝子断片の塩基配列と配列番号9に記載の塩基配列とは、95%以上の相同性で一致していた。
これらの結果から、本発明のオリゴヌクレオチドも用いることで、生乾き臭原因物質を産生する微生物のβ酸化関連酵素遺伝子の断片を増幅することができ、β酸化関連酵素遺伝子を迅速かつ正確に検出することができることがわかった。
(1)ゲノムDNAの調製
生乾き臭が発生している3つのタオルT1〜T3及び生乾き臭が発生していない新品のタオル(T4)を細かく裁断し、ゲノムDNA調製用キット(アプライドバイオシステムズ社製、PrepMan Ultra Reagent(商品名))を用いてゲノムDNA溶液を調製した。
DNAテンプレートとして上記で調製したゲノムDNA溶液を無菌蒸留水で100倍希釈した溶液5μL、TaKaRa EX Taq HS(商品名、タカラバイオ社製)0.1μL、4種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNTP)混合液(タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに付属のdNTP混合液)1.6μL、10倍濃縮反応用バッファー(タカラバイオ社製、TaKaRa EX Taq Hot Start Versionに付属のバッファー)2μL、配列番号15の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(des F2、20pmol/μL)0.4μL、配列番号16の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチドからなるプライマー(des R2、20pmol/μL)0.4μL、無菌蒸留水10.5μL混合することで、20μLのPCR反応液を調製した。
陰性対照(ネガティブコントロール)として滅菌蒸留水をDNAテンプレートの代わりに混合したPCR反応液も同様に調製した。
PCR後、反応液を2%アガロールゲルにアプライし、TBAバッファー中、100ボルトで30分電気泳動を行った。次いで、ゲルを取り出し、SYBR safe DNA gel stain in 1×TAE(インビトロジェン社製)溶液中に30分浸漬してDNA断片を染色後、UVランプ照射の下ポラロイド(登録商標)カメラで撮影し、約150bpのDNA断片の有無を確認した。DNA断片のサイズは、電気泳動時に、塩基対数が既知のDNA断片を一緒に流しておくことで、移動度の相対比較によって算出した。目的の遺伝子断片の確認結果を表26に示す。
以上の結果から、本発明のオリゴヌクレオチドを用いることによって、様々な菌種の菌株が存在する環境試料からも生乾き臭原因物質を産生する微生物を検出できる。
Claims (28)
- 皮脂汚れ成分存在下において生乾き臭原因物質を産生する微生物と被験物質とを接触させ、前記微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及びβ酸化関連酵素遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種の発現を検知し、前記少なくとも1種の遺伝子の発現量の変化に基づいて該被験物質の生乾き臭抑制作用を評価する、生乾き臭抑制評価方法であって、
下記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに
下記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)からなるオリゴヌクレオチド対、
からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いて、前記少なくとも1種の遺伝子の発現を検知する、生乾き臭抑制評価方法。
(a)配列番号13に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号13に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号14に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号14に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号15に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号15に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号16に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号16に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(e)配列番号17に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号17に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号18に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号18に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(g)配列番号19に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号19に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(h)配列番号20に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号20に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(i)配列番号21に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号21に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(j)配列番号22に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号22に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(k)配列番号23に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号23に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(l)配列番号24に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号24に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(m)配列番号25に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号25に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(n)配列番号26に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号26に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(o)配列番号27に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号27に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(p)配列番号28に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号28に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(q)配列番号29に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号29に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(r)配列番号30に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号30に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(s)配列番号31に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号31に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(t)配列番号32に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号32に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(u)配列番号33に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号33に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(v)配列番号34に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号34に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(w)配列番号35に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号35に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(x)配列番号36に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号36に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(y)配列番号37に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号37に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(z)配列番号38に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号38に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(a1)配列番号39に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号39に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(b1)配列番号40に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号40に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(c1)配列番号41に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号41に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(d1)配列番号42に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号42に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド - 前記生乾き臭原因物質が4-メチル-3-ヘキセン酸である、請求項1記載の評価方法。
- 前記皮脂汚れ成分がアンテイソ脂肪酸である、請求項1又は2記載の評価方法。
- 前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がΔ9デサチュラーゼ遺伝子である、請求項1〜3のいずれか記載の評価方法。
- 前記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに
前記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)からなるオリゴヌクレオチド対
からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いて、前記Δ9デサチュラーゼ遺伝子の発現を検知する、請求項4記載の評価方法。 - 前記β酸化関連酵素遺伝子がfadB遺伝子及びfadD遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項1〜3のいずれか記載の評価方法。
- 前記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに
前記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)からなるオリゴヌクレオチド対、
からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いて、前記fadB遺伝子の発現を検知する、請求項6記載の評価方法。 - 前記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに
前記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)からなるオリゴヌクレオチド対、
からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いて、前記fadD遺伝子の発現を検知する、請求項6記載の評価方法。 - 前記微生物が、モラクセラ・エスピー(Moraxella sp.)又はモラクセラ・オスロエンシス(Moraxella osloensis)である、請求項1〜8のいずれか記載の評価方法。
- 請求項1〜9のいずれか記載の評価方法に基づき、前記少なくとも1種の遺伝子の発現量を低下させる被験物質を選択する、生乾き臭抑制剤のスクリーニング方法。
- 生乾き臭原因物質を産生する微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子及びβ酸化関連酵素遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種の断片を増幅し、増幅断片の有無を確認することにより、生乾き臭原因物質を産生する微生物の検出を行う、生乾き臭原因物質を産生する微生物の検出方法であって、
下記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)からなるオリゴヌクレオチド対、
下記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに
下記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)からなるオリゴヌクレオチド対、
からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いて生乾き臭原因物質を産生する微生物の検出を行う、生乾き臭原因物質を産生する微生物の検出方法。
(a)配列番号13に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号13に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号14に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号14に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号15に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号15に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号16に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号16に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(e)配列番号17に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号17に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号18に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号18に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(g)配列番号19に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号19に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(h)配列番号20に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号20に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(i)配列番号21に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号21に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(j)配列番号22に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号22に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(k)配列番号23に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号23に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(l)配列番号24に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号24に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(m)配列番号25に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号25に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(n)配列番号26に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号26に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(o)配列番号27に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号27に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(p)配列番号28に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号28に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(q)配列番号29に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号29に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(r)配列番号30に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号30に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(s)配列番号31に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号31に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(t)配列番号32に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号32に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(u)配列番号33に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号33に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(v)配列番号34に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号34に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(w)配列番号35に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号35に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(x)配列番号36に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号36に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(y)配列番号37に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号37に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(z)配列番号38に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号38に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(a1)配列番号39に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号39に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(b1)配列番号40に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号40に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(c1)配列番号41に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号41に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(d1)配列番号42に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号42に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド - 前記生乾き臭原因物質が4-メチル-3-ヘキセン酸である、請求項11記載の検出方法。
- 前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がΔ9デサチュラーゼ遺伝子である、請求項11又は12記載の検出方法。
- 前記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに
前記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)からなるオリゴヌクレオチド対
からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いて、前記Δ9デサチュラーゼ遺伝子の断片を増幅する、請求項13記載の検出方法。 - 前記β酸化関連酵素遺伝子がfadB遺伝子及びfadD遺伝子からなる群より選ばれる少なくとも1種である、請求項11又は12記載の検出方法。
- 前記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記(q)及び(r)のオリゴヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド対、並びに
前記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)からなるオリゴヌクレオチド対、
からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いて、前記fadB遺伝子の断片を増幅する、請求項15記載の検出方法。 - 前記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)からなるオリゴヌクレオチド対、
前記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)からなるオリゴヌクレオチド対、並びに
前記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)からなるオリゴヌクレオチド対、
からなる群より選ばれる少なくとも1種のオリゴヌクレオチド対を用いて、前記fadD遺伝子の断片を増幅する、請求項15記載の検出方法。 - 前記微生物が、モラクセラ・エスピー(Moraxella sp.)又はモラクセラ・オスロエンシス(Moraxella osloensis)である、請求項11〜17のいずれか記載の検出方法。
- 下記オリゴヌクレオチド(a)〜(z)及び(a1)〜(d1)からなる群より選ばれるオリゴヌクレオチド、又は下記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)、下記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)、下記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)、下記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)、下記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)、下記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)、下記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)、下記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)、下記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)、下記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)、下記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)、下記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)、下記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)、下記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)、若しくは下記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)からなるオリゴヌクレオチド対。
(a)配列番号13に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号13に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(b)配列番号14に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号14に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(c)配列番号15に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号15に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(d)配列番号16に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号16に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(e)配列番号17に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号17に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(f)配列番号18に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号18に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(g)配列番号19に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号19に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(h)配列番号20に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号20に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(i)配列番号21に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号21に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(j)配列番号22に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号22に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(k)配列番号23に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号23に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(l)配列番号24に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号24に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつ脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(m)配列番号25に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号25に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(n)配列番号26に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号26に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(o)配列番号27に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号27に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(p)配列番号28に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号28に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(q)配列番号29に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号29に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(r)配列番号30に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号30に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(s)配列番号31に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号31に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(t)配列番号32に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号32に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(u)配列番号33に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号33に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(v)配列番号34に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号34に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(w)配列番号35に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号35に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(x)配列番号36に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号36に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(y)配列番号37に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号37に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(z)配列番号38に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号38に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(a1)配列番号39に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号39に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(b1)配列番号40に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号40に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(c1)配列番号41に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号41に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド
(d1)配列番号42に記載の塩基配列で表されるオリゴヌクレオチド、又は配列番号42に記載の塩基配列において1若しくは数個の塩基が欠失、置換、挿入若しくは付加されておりかつβ酸化関連酵素遺伝子の検出に使用できるオリゴヌクレオチド - 前記オリゴヌクレオチドが核酸プライマーである、請求項19記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
- 前記オリゴヌクレオチド(a)及び(b)、前記オリゴヌクレオチド(c)及び(d)、前記オリゴヌクレオチド(e)及び(f)、前記オリゴヌクレオチド(g)及び(h)、前記オリゴヌクレオチド(i)及び(j)、並びに前記オリゴヌクレオチド(k)及び(l)が、ポリメラーゼ連鎖反応法によって、生乾き臭原因物質を産生する微生物由来の脂肪酸不飽和化酵素遺伝子の発現を検知又は該遺伝子の断片を増幅するための核酸プライマーとして機能し得るものである、請求項20記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
- 前記脂肪酸不飽和化酵素遺伝子がΔ9デサチュラーゼ遺伝子である、請求項21記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
- 前記オリゴヌクレオチド(m)及び(n)、前記オリゴヌクレオチド(o)及び(p)、前記オリゴヌクレオチド(q)及び(r)、並びに前記オリゴヌクレオチド(s)及び(t)が、ポリメラーゼ連鎖反応法によって、生乾き臭原因物質を産生する微生物由来のβ酸化関連酵素遺伝子の発現を検知又は該遺伝子の断片を増幅するための核酸プライマーとして機能し得るものである、請求項20記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
- 前記β酸化関連酵素遺伝子がfadB遺伝子である、請求項23記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
- 前記オリゴヌクレオチド(u)及び(v)、前記オリゴヌクレオチド(w)及び(x)、前記オリゴヌクレオチド(y)及び(z)、前記オリゴヌクレオチド(a1)及び(b1)、並びに前記オリゴヌクレオチド(c1)及び(d1)が、ポリメラーゼ連鎖反応法によって、生乾き臭原因物質を産生する微生物由来のβ酸化関連酵素遺伝子の発現を検知又は該遺伝子の断片を増幅するための核酸プライマーとして機能し得るものである、請求項20記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
- 前記β酸化関連酵素遺伝子がfadD遺伝子である、請求項25記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対。
- 生乾き臭原因物質を産生する微生物と、皮脂汚れ成分と、少なくとも1種の、請求項19〜26のいずれか記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含んでなる、生乾き臭抑制評価用キット又は生乾き臭抑制剤のスクリーニング用キット。
- 少なくとも1種の、請求項19〜26のいずれか記載のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド対を含んでなる、生乾き臭原因物質を産生する微生物の検出用キット。
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