WO2012039261A1 - 生乾き臭抑制剤のスクリーニング方法及び生乾き臭抑制剤の評価方法 - Google Patents
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- WO2012039261A1 WO2012039261A1 PCT/JP2011/069950 JP2011069950W WO2012039261A1 WO 2012039261 A1 WO2012039261 A1 WO 2012039261A1 JP 2011069950 W JP2011069950 W JP 2011069950W WO 2012039261 A1 WO2012039261 A1 WO 2012039261A1
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- dry odor
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- moraxella
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/025—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
Definitions
- the present invention relates to a screening method for a raw dry odor inhibitor and a method for evaluating a raw dry odor suppressor.
- ⁇ Sanitary goods such as towels and bedding
- textile products such as clothing
- textile products can provide a comfortable feeling of use and wear when kept clean.
- textile products such as sanitary goods and clothing are worn on the human body, and towels and bedding are used in direct contact with the human body, so keeping them clean is important from a hygiene standpoint.
- people's interest in keeping clean textile products such as sanitary goods and clothing is increasing.
- odor adhering to textile products such as sanitary goods such as towels and bedding and clothing includes internal factors derived from the human body caused by repeated use of textile products in addition to external factors such as tobacco.
- Such a dry-dry odor that is likely to recur may occur not only when drying indoors, but also when using a washing machine or dryer equipped with a low-temperature drying function, or even when drying outdoors, even when humid. is there.
- a characteristic feature of a recurrent raw dry odor is that it does not occur after washing and is sufficiently dried, or is almost reduced, but odor is generated only by being damp.
- a recurrent raw dry odor is likely to occur when stored in a chiffon for a long time.
- textile products that are frequently used in contact with human skin, such as underwear, handkerchiefs, or towels, and that are frequently used for a short period of the cleaning-use cycle will smell during use once this dry-dry odor is generated. Often recurs.
- the odor intensity of a freshly dried odor tends to increase as the number of washings increases.
- Development of a method for screening an odor suppressor and a method for evaluating a raw dry odor suppressor is required.
- Non-Patent Document 1 presumes that the main component of raw dry odor is “a mixture of unsaturated fatty acids having a branched structure having 7 to 9 carbon atoms”, and these are also included in odors such as human sweat. It is described.
- An object of the present invention is to provide a screening method for a raw dry odor suppressor that can screen a raw dry odor suppressor with high accuracy and ease. Moreover, this invention makes it a subject to provide the evaluation method of a raw dry odor suppressor which can evaluate a raw dry odor inhibitory effect easily with high precision.
- the present inventors have conducted extensive studies from the viewpoints of causative substances, causative bacteria, and generation mechanisms of raw dry odors.
- the intermediate substances such as 4-methyl-3-hexanoic acid, 4-methyl-3-hexenoic acid, 5-methyl-2-hexanoic acid, and 5-methyl-2-hexenoic acid are the causative substances of raw dry odor.
- Fatty acids were known, but among these, the threshold of 4-methyl-3-hexenoic acid was found to be particularly low compared to other substances, and was found to be the main causative substance.
- raw-dry odors that rebound by being dampened after the textiles are sufficiently dried are those that have certain microorganisms removed even after they have been sufficiently removed after drying.
- the odor that is alive or proliferates in the fiber product and produces a raw dry odor-causing substance from the sebum soil components remaining in the fiber product, or the odor that was trapped in the fiber by drying is restored by the wetness of the fiber product. It was found that it was released and it was easy to feel because of the low threshold.
- a microorganism having 4-methyl-3-hexenoic acid production ability is brought into contact with a test substance in the presence of a sebum soil component, and the production of a raw dry odor-causing substance is detected, thereby suppressing the raw dry odor control action.
- the present invention relates to a screening method for a raw dry odor inhibitor, which selects a test substance having the same.
- the present invention is to contact a microorganism having 4-methyl-3-hexenoic acid producing ability with a test substance in the presence of a sebum soil component, and detect the production of a raw dry odor causing substance by the microorganism.
- the present invention relates to a method for evaluating a raw dry odor inhibitor, which evaluates the action of suppressing the raw dry odor of the test substance.
- the present invention also relates to a screening kit for a raw dry odor inhibitor, which comprises a sebum soil component and a microorganism capable of producing 4-methyl-3-hexenoic acid. Furthermore, the present invention relates to a kit for evaluating a raw dry odor inhibitor, comprising a sebum soil component and a microorganism capable of producing 4-methyl-3-hexenoic acid.
- the screening method for a raw dry odor inhibitor of the present invention it is possible to screen a raw dry odor suppressor with high accuracy and ease. Moreover, according to the evaluation method of the raw dry odor inhibitor of this invention, the raw dry odor inhibitory action of a raw dry odor suppressor can be evaluated easily with high precision.
- the screening method for a raw dry odor inhibitor of the present invention comprises contacting a test substance with a microorganism capable of producing 4-methyl-3-hexenoic acid (also referred to as 4M3H in this specification) in the presence of a sebum soil component.
- the method further comprises the step of selecting a test substance having an action of suppressing the dry odor by detecting the production of the dry odor causing substance by the microorganism.
- the method for evaluating a raw dry odor inhibitor of the present invention comprises contacting a microorganism having 4M3H generating ability with a test substance in the presence of a sebum soil component, and detecting the generation of a raw dry odor causative substance by the microorganism. And a step of evaluating the effect of suppressing the raw dry odor of the test substance.
- the method for evaluating a raw dry odor suppressor of the present invention for example, with respect to a substance selected as a candidate for a raw dry odor suppressor, it is possible to easily perform a highly accurate evaluation of the action of suppressing the raw dry odor.
- the “raw dry odor” refers to an odor generated from a textile product when the used textile product is washed and dried insufficiently or when the textile product is damp.
- the dry odor can be temporarily removed by sufficiently drying the textile, it can be used immediately after drying or after storage, or after using the textile for a while, or after rain, sweat, etc.
- the wet odor like a rag-like odor may reappear from textile products due to moisture, etc.
- the odor-like raw dry odor that recurs when the textile product from which the raw dry odor has been temporarily removed by sufficiently drying is dampened in this specification is referred to as “recurrent raw dry odor” or “recurrent Sometimes called odor.
- Raw dry odors that occur due to insufficient drying after washing textile products include complex odors such as S (sulfur) odor, N (nitrogen) odor, aldehyde odor, lower fatty acid odor, and intermediate branched fatty acid odor including 4M3H odor.
- complex odors such as S (sulfur) odor, N (nitrogen) odor, aldehyde odor, lower fatty acid odor, and intermediate branched fatty acid odor including 4M3H odor.
- the recurrent unpleasant odor of the rag-like odor recurring from the textile product again due to moisture such as rain, sweat, etc. is an intermediate class mainly 4M3H odor Branched fatty acid odor is the majority, and other highly volatile odors such as S odor, N odor, and aldehyde odor hardly occur.
- “raw dry odor suppression” includes suppressing raw dry odor and preventing raw dry odor production.
- “4-Methyl-3-hexenoic acid” has cis / trans isomers as shown below, and in the present invention, compounds having both cis and trans structures are included. It is.
- the action mechanism of the raw dry odor suppressor includes sterilization of microorganisms adhering to the textile product, prevention of conversion to raw dry odor causing substances such as sweat and sebum remaining in the textile product, decomposition of the raw dry odor causing substance into odorless substances Alternatively, conversion, masking of a dry odor, and the like may be mentioned, and the action mechanism of the dry odor suppressor of the present invention may be of any kind.
- the “microorganism having 4M3H-producing ability” includes, in addition to the microorganism itself having 4M3H-producing ability, a crushed microbial cell, a microbial cell culture solution, and a crude extract derived from a microorganism having 4M3H-producing ability and purification. Including treated cells such as enzymes.
- the method for obtaining a microorganism having 4M3H producing ability used in the present invention will be described. There are no particular restrictions on the method of obtaining microorganisms capable of producing 4M3H. (1) Sensory evaluation of textile products, and as a result, methods for collecting microorganisms from textile products that emit a raw dry odor, (2) Existence in textile products Collecting microorganisms, measuring the 4M3H production ability of the collected microorganisms, and selecting a microorganism having 4M3H production ability, (3) measuring the 4M3H production ability of microorganisms separated from the environment or obtained from a microorganism depository Examples include a method of selecting a microorganism having 4M3H producing ability, and (4) a method of selecting a microorganism having high homology by comparing the homology of a specific gene sequence with a microorganism having 4M3H producing ability.
- a microorganism having 4M3H production ability may be selected by any of the above methods, or
- a method for obtaining a microorganism having 4M3H producing ability used in the present invention will be specifically described. However, the present invention is not limited to these.
- First, an outline of the method (1) (method of sensory evaluation of a textile product and collecting microorganisms from the textile product that emits a dry odor) will be described. Collect textile products used after washing or stored after washing (not used after washing) at home, such as towels, T-shirts, pillowcases, underwear, etc. Select the textile product you feel.
- the selected textile product is cut into a certain size (for example, 5 ⁇ 5 cm, 2 ⁇ 2 cm) and added to a lecithin / polysorbate (also referred to as LP in this specification) diluent (manufactured by Nippon Pharmaceutical) or physiological saline Thereafter, the extract obtained by stirring was mixed with lecithin / polysorbate-added soybean / casein digest (also referred to herein as SCD-LP) agar medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical) or potato dextrose agar (also referred to as PDA herein).
- lecithin / polysorbate also referred to as LP in this specification
- SCD-LP soybean / casein digest
- PDA potato dextrose agar
- agar medium such as medium (manufactured by BD) and culture for a certain time (for example, 35 ° C., 24 hours), and then isolate the microorganism from the colonies obtained.
- a certain time for example, 35 ° C., 24 hours
- Each isolated strain is applied to sterilized used fiber products, such as towels that have been confirmed to have a dry odor, cut to a certain size (eg 5 x 5 cm, 2 x 2 cm) and then sterilized.
- a strain that senses a dry odor by sensory evaluation is selected.
- the method is not limited.
- a base sequence of about 500 bp upstream of the 16S rDNA gene and about 200-500 bp in the D2 region of LSU (Large Subunit) in fungi The determination can be made based on the identity between the base sequence and the reference strain. The identity of the base sequence can also be calculated using genetic information processing software ClustalW (http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html) or the like.
- Each isolated strain is applied to sterilized used fiber products, such as towels that have been confirmed to have a dry odor, cut to a certain size (eg 5 x 5 cm, 2 x 2 cm) and then sterilized. Then, after culturing or solid culture or liquid culture in the presence of a sebum soil component, the production of 4M3H is detected to select a strain in which 4M3H production is observed.
- the method is not limited. For example, in the case of bacteria, a base sequence of about 500 bp upstream of the 16S rDNA gene and about 200 to 500 bp in the D2 region of LSU in fungi are determined. , Based on the identity of the base sequence and the reference strain. The identity of the base sequence can also be calculated using genetic information processing software ClustalW or the like.
- strains are purchased from strain distribution agencies such as ATCC (American Type Culture Collection), NBRC (NITE Biological Resource Center), JCM (Japan Collection of Microorganisms), NCIMB (National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria).
- ATCC American Type Culture Collection
- NBRC NITE Biological Resource Center
- JCM Japan Collection of Microorganisms
- NCIMB National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria
- SCD-LP agar medium manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.
- PDA medium manufactured by BD
- each purchased or isolated strain is sterilized after sterilized used fiber products, such as towels that have been observed to produce a dry odor, cut to a certain size (eg 5 x 5 cm, 2 x 2 cm) After being applied and cultured, or after solid culture or liquid culture in the presence of a sebum soil component, a strain having 4M3H production is selected by detecting the production of 4M3H.
- the method is not limited, but for example, about 500 bp upstream region of 16S rDNA gene in bacteria and about 200 to 500 bp in D2 region of LSU in fungi Can be performed based on the identity of the base sequence and the reference strain.
- the identity of the base sequence can also be calculated using genetic information processing software ClustalW or the like.
- the method (4) (a method for comparing the homology of a specific gene sequence with a microorganism capable of producing 4M3H and selecting a microorganism with high homology) will be described.
- the base sequence of a specific gene of a microorganism having the ability to produce 4M3H selected by the method (1), (2) and / or (3) above is determined.
- generation ability used for this invention can be obtained by selecting the microorganisms which have a base sequence with high identity with the determined base sequence.
- “highly identical” means that the identity with the base sequence of the reference sample such as the base sequence shown in any of SEQ ID NOs: 1 to 3 is preferably 95% or more, more preferably 97% or more, Preferably, it means 98% or more, particularly preferably 99% or more.
- Moraxella Sp. 4-1 was commissioned on August 22, 2011 to the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Patent Biological Deposit Center (1-1-1 Tsukuba Center, Tsukuba City Center, Ibaraki Pref.). Deposited under the number FERM BP-11394.
- the base sequence of the microorganism can be determined by a usual method.
- the identity of the base sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 227, 1435, 1985) or the like. Specifically, using the homology analysis (Search homology) program of genetic information processing software Genetyx-Win (software development), the parameter Unit size to compare (ktup) is set to 2 and the calculation is performed. Can do.
- the microorganism used in the present invention is not particularly limited as long as it is a microorganism capable of producing 4M3H, and may be any microorganism that produces 4M3H in the presence of a sebum component.
- Moraxella Moraxella
- Acinetobacter Acinetobacter
- shade MONAS Pseudomonas
- Bacillus Bacillus (Bacillus) bacteria
- Sphingomonas Sphingomonas
- Ralstonia Ralstonia bacteria
- queue pre Avi Das (Cupriavidus) bacteria
- Serratia (Serratia) bacteria Escherichia (Escherichia) bacteria, Staphylococcus (Staphylococcus) bacteria, Burkholderia (Burkholderia) bacteria, Saccharomyces (Saccaromyces) yeasts, and is preferably at least one microorganism selected from the group consisting of
- Microorganism selected from the group consisting of Moraxella sp. And Moraxella osloensis.
- one kind of microorganism may be used as the microorganism having 4M3H producing ability, or two or more kinds of microorganisms may be used in combination.
- “Moraxella sp” means that the base sequence of its 16S rDNA gene is 95% or more, more preferably 97% or more, more preferably the base sequence of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3.
- sebum dirt is the most typical dirt that adheres to textile products such as clothing, and contains a large amount of oils such as free fatty acids and glycerides. What is trapped in mud, exfoliated keratin, etc. is observed in textile products.
- the sebum soil component used in the present invention is not particularly limited as long as it is a sebum soil component usually found in clothing or the like, but a material that can be a precursor of a raw dry odor-causing substance generated from a textile product is preferable.
- Examples of the substance that can be a precursor of a raw dry odor-causing substance produced from a textile product include an anteiso fatty acid having 9 to 21 carbon atoms (preferably 11 to 19 carbon atoms, more preferably 17 to 19 carbon atoms).
- an anteiso fatty acid having 9 to 21 carbon atoms (preferably 11 to 19 carbon atoms, more preferably 17 to 19 carbon atoms).
- these anteiso fatty acids are also included in the sebum soil component.
- the sebum soil component is preferably an anteiso fatty acid.
- the anteiso fatty acid preferably used in the present invention may be either a saturated fatty acid or a fatty acid containing unsaturation, and the anteiso fatty acid includes salts and esters of the anteiso fatty acid.
- 6-methyloctanoic acid, 8-methyldecanoic acid, 12-methyltetradecanoic acid, 14-methylhexadecanoic acid, 16-methyloctadecanoic acid, 14-methylhexadecenoic acid and 16-methyloctadecenoic acid, and these Examples include salts and esters.
- the anteiso fatty acid preferably used in the present invention can be synthesized by an ordinary method (see, for example, JP-A-2009-149546). A commercially available product can also be obtained from Sigma-Aldrich.
- the microorganism having 4M3H generating ability is brought into contact with a test substance in the presence of a sebum soil component, and the microorganism is brought into contact with the test substance and sebum.
- Incubate with soil components Incubation conditions are not particularly limited, but it is preferable to incubate at 25 to 35 ° C. for 3 to 72 hours (preferably 8 to 72 hours) under humidified conditions.
- microorganism when the microorganism is brought into contact with the test substance and / or when the microorganism is incubated, sterilized water, buffer solution, or sugars, casein peptone, soybean peptone, yeast extract, inorganic salts, pH adjuster
- medium components such as agar may be added.
- a commercially available medium may be used as it is or diluted.
- incubating in a liquid state it is preferable to shake, and when incubating in a solid state, it is preferable to leave still.
- the microorganism having 4M3H generating ability used in the present invention and the test substance may be added to and contacted with the textile product to which the sebum soil component is adhered, and the microorganism may be incubated with the test substance and the sebum soil component.
- the incubation conditions are not particularly limited, but it is preferable to incubate at 25 to 35 ° C. for 3 to 48 hours (preferably 8 to 48 hours).
- the sebum stain component may be originally attached to the fiber product, or a sebum stain component such as anteiso fatty acid may be attached to the fiber product. When the sebum soil component is attached to the fiber product, it is preferable to attach the sebum soil component at a ratio of 0.1 to 1 mg per 2 ⁇ 2 cm fiber product.
- the amount of the microorganism added to the fiber product is not particularly limited, but 10 2 to 10 5 CFU / cm 2 is preferably added to the fiber product.
- the material of the fiber product used in the present invention is not particularly limited, and may be any of natural materials such as wool, silk and cotton, chemical fibers such as polyester and polyamide, and combinations thereof.
- the material of the textile product is preferably cotton.
- the fiber product when using by adding a sebum stain component, the fiber product may be unused or used once or more. When using it without adding sebum soil components, it is used as it is or after washing.
- the microorganism and the test substance may be brought into contact with a solid or solution containing a sebum dirt component.
- a test substance is added in advance to an agar medium containing sebum soil components, or is applied onto the medium, and a microorganism having 4M3H-producing ability is smeared, and the microorganism is present in the presence of the test substance.
- a sebum soil component may be contacted, or a liquid medium containing a sebum soil component and a test substance are mixed, and a microorganism having 4M3H-producing ability is inoculated therein, and in the presence of the test substance, the microorganism and Sebum soil components may be contacted. What is necessary is just to select the culture medium used here suitably according to the microorganism species which has 4M3H production
- the contact ratio (mixing ratio) between the microorganism having 4M3H generating ability and the sebum soil component is not particularly limited, but the sebum soil component such as anteiso fatty acid with respect to the microorganism having a final concentration of 10 4 to 10 8 CFU. It is preferable to contact 0.1 to 10 mg.
- a test substance having an action of suppressing the dry odor is selected by detecting the production of the dry odor causing substance by the microorganism.
- the raw dry odor causative substance may be any substance that can be produced by the microorganism having the ability to produce 4M3H, which can be a raw dry odor causative substance, such as 4-methyl-3-hexenoic acid (4M3H), 4-methyl-3-pentenoic acid, 4 -Methyl-3-octenoic acid and the like. In the present invention, it is preferable to detect the production of 4M3H.
- the method for detecting the production of a raw dry odor-causing substance there is no particular limitation on the method for detecting the production of a raw dry odor-causing substance, and it may be performed by a qualitative method such as sensory evaluation or quantitatively using column chromatography or the like. It is also possible to detect the generation of raw dry odor-causing substances. Further, as shown in Japanese Patent Application Laid-Open No. 2009-244094, a chromophore may be introduced into the carboxy group of a raw dry odor causing substance, and the presence or amount of the raw dry odor causing substance may be determined using a color reaction. .
- a calibration curve of raw dry odor-causing substances may be prepared in advance, and instrumental analysis may be performed using this calibration curve, or titration or extraction of raw or dry odor-causing substances is performed. It may be quantified by chemical analysis. Moreover, you may determine by the difference in the odor intensity
- the production of a raw dry odor-causing substance by a microorganism having 4M3H generating ability can be detected, and a test substance having a raw dry odor suppressing action can be selected as a raw dry odor inhibitor.
- a test substance having a raw dry odor suppressing action can be selected as a raw dry odor inhibitor.
- the production of a raw dry odor causative substance by a microorganism having 4M3H generating ability can be detected, and the raw dry odor suppressing action of the test substance can be evaluated.
- test substance used in the screening method and evaluation method of the present invention any substance can be used, and either a low molecular compound or a high molecular compound may be used, and the kind thereof is not particularly limited.
- specific examples of the test substance include, for example, inorganic salts, surfactants, proteins, antibodies, peptides, polypeptides, oligonucleotides, polynucleotides, DNA, RNA, lipids, saccharides, polysaccharides, natural product extracts, fragrances, etc. Or a combination thereof may be mentioned.
- the kit for screening a raw dry odor inhibitor and the kit for evaluating a raw dry odor suppressor of the present invention comprises a sebum soil component and a microorganism having an ability to produce 4-methyl-3-hexenoic acid.
- a sebum soil component and a microorganism having an ability to produce 4-methyl-3-hexenoic acid There are no particular restrictions on specific constitutional examples of the kit of the present invention other than sebum soil components and microorganisms capable of producing 4-methyl-3-hexenoic acid, but examples include the following.
- Test Example 1 Identification of causative substance of raw dry odor
- a cotton towel having a strong raw dry odor after washing and drying was collected from a household, cut into 50 g, extracted from 500 mL of dichloromethane, and concentrated under reduced pressure. Furthermore, 200 mL of 1M sodium hydroxide aqueous solution was added to the extraction solution, the aqueous layer was recovered, and 200 mL of 2M hydrochloric acid was added to make it acidic. To this solution, 200 mL of dichloromethane was added, the organic layer was concentrated under reduced pressure, and the acidic component concentrate was made up to 1 mL.
- the concentrate was fractionated according to the GC retention time under the following conditions to obtain 30 GCs around the target component. It was collected in 200 mg of a filler (trade name: TENAX TA, manufactured by GL Sciences) filled in a glass tube having an inner diameter of 6 mm and a length of 117 mm.
- a filler trade name: TENAX TA, manufactured by GL Sciences
- GC-PFC conditions GC: Agilent 6890N (trade name, manufactured by Agilent)
- TDS-GC-MS conditions a Thermal Desorption system (TDS) manufactured by GUSTER Co. was connected to GC-MS manufactured by Agilent.
- GC Agilent 6890N (trade name, manufactured by Agilent)
- MS Agilent 5973 (trade name, manufactured by Agilent)
- TDS desorption conditions 250 ° C., purge flow rate 50 mL / min, purge time 3 min.
- the raw dry odor-causing substances are intermediate branched fatty acids including 4M3H.
- Test Example 2 Identification of causative bacterium causing dry odor (1) Isolation of strain After washing and drying, a cotton towel or bath towel that had ran dry odor was cut, and LP diluent (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.) was added and stirred. 0.1 mL of the solution was smeared on an SCD-LP agar medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), cultured at 35 ° C. for 24 hours, and then microorganisms were isolated from the obtained colonies.
- LP diluent manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.
- the isolated bacterial strain is identified by determining the base sequence of about 500 bp upstream of the 16S rDNA gene, and the yeast strain is identified by determining the base sequence of the approximately 200 to 500 bp region of the D2 region of LSU. And based on the identity. The identity of the base sequence was calculated using genetic information processing software ClustalW. Moraxella sp. Was identified by determining the base sequence of Moraxella osloensis ATCC19976 and comparing it with the base sequence. The strains isolated from each towel or bath towel are shown in Table 1.
- Moraxella sp. was isolated from all freshly dried odor generating towels and bath towels.
- the isolated Moraxella sp. also had a large number of bacteria.
- the isolated Moraxella sp. was inoculated into a sterilized towel with a fresh odor, it was confirmed that a very strong fresh odor was generated. Therefore, it was clarified that specific microorganisms such as this species are involved in the raw dry odor.
- Test Example 3 Selection of Microorganisms Capable of Generating 4M3H Soybean / Casein Digest (also referred to as SCD in the present specification) agar by a standard method from the strain and environment (soil, house) isolated and identified according to Test Example 2 After separation using a medium or a PDA medium, the 4M3H production ability of the strains isolated and identified and the microorganisms obtained from the microorganism depository were measured.
- the strains obtained from the microorganism depository are as follows.
- Moraxella Osloensis NCIMB10693 strain (purchased from NCIMB (National Collection of industrial and marine bacteria)) Moraxella Oslo Ensis ATCC19976 (purchased from ATCC (American Type Culture Collection)) Cyclo Arthrobacter Inmobirisu (Psychrobacter immobilis) NBRC15733 share, cyclo Arthrobacter Pasi Fi forsythensis NBRC103191 share, cyclo Arthrobacter Gurashinkora NBRC101053 strain, Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa) NBRC13275 strain, Pseudomonas putida (Pseudomonas putida) NBRC14164 share, Sphingomonas Yanoikuyae NBRC15102, Micrococcus luteus NBRC3333, Brevundimonas diminuta NBRC12697, Roseomonas aerilata NBRC
- the identity of the base sequence of the 16S rDNA gene region with the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 was determined.
- the base sequences shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 are the bases of the 16S rDNA gene region of Moraxella sp. 4-1 strain, Moraxella sp. 4-4 strain and Moraxella osloensis ATCC 19976 strain, respectively. Indicates the sequence.
- the identity of the base sequence was calculated using genetic information processing software ClustalW. Moraxella Sp.
- a used cotton towel that has been used and washed in daily life is cut into a 5cm x 5cm square and sterilized, and 0.1 mL of the various bacterial solutions are inoculated and allowed to stand at 37 ° C for 24 hours under humidified conditions. I put it.
- Step 12-Dodecanolide 11.9 g (60.0 mmol), 32% hydrogen bromide / acetic acid solution 24.3 g (96.0 mmol, 1.6 eq) were added to a Teflon-protected 100 mL autoclave.
- the mixture was purged with nitrogen, sealed, and stirred with a magnetic stirrer for 16 hours using an oil bath at 60 ° C.
- 14 mL of water was added, and the mixture was transferred to a separatory funnel using 200 mL of hot hexane.
- Step (b) Next, to a 100 mL four-necked flask equipped with a reflux condenser, a 50 mL dropping funnel, a magnetic stirrer, and a temperature sensor, 5.0 g (17.9 mmol) of 12-bromododecanoic acid and triphenylphosphine (Kanto) 28.2 mg (0.006 eq) was added and dried under reduced pressure.
- 16-methyloctadecanoic acid was replaced with 15-pentadodecanolide in step (a) of the 14-methylhexadecanoic acid synthesis step shown above, and 2-methylbutylmagnesium bromide in step (b). was replaced with sec-butylmagnesium bromide in the same manner, and 16-methyloctadecanoic acid was obtained from 15-pentadodecanolide in a total yield of 84%. The purity was 95%.
- Each strain was inoculated into 5 mL of SCD liquid medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), and cultured with shaking (160 rpm) at 35 ° C. for 24 hours.
- the generated 4M3H was quantified by using the analysis.
- the sample in which the amount of 4M3H produced was greater than 1 ⁇ g, ⁇ the sample greater than 0.1 ⁇ g and 1 ⁇ g or less, ⁇ the sample greater than 0 ⁇ g and 0.1 ⁇ g or less, and the sample not detected at all was evaluated as x.
- Table 4 shows the results when 14-methylhexadecanoic acid was applied, and Table 5 shows the results when 16-methyloctadecanoic acid was applied.
- the evaluation criteria were ⁇ for a sample that felt a strong odor, ⁇ for a sample that felt a odor, ⁇ for a sample that felt a little odor, and x for a sample that did not have any odor at all.
- Table 4 shows the results when 14-methylhexadecanoic acid was applied, and Table 5 shows the results when 16-methyloctadecanoic acid was applied.
- the microorganisms having 4M3H producing ability used in the present invention can be subjected to sensory evaluation of the textile product, and as a result, the microorganism can be collected from the textile product that has produced a raw dry odor. It is also possible to collect an existing microorganism, measure the 4M3H production ability of the collected microorganism, and select a microorganism having 4M3H production ability. Furthermore, as can be seen from Tables 2 to 5, some homologs of 4M3H-producing microorganisms have very high homology of specific gene sequences, so compare the homology of specific gene sequences. Thus, microorganisms having 4M3H production ability can also be selected.
- Example 1 Moraxella Osloensis NCIMB10693, Moraxella SP4-1, Cyclobacter pacificensis NBRC103191, Cyclobacter glassine colla NCIMB101053, Pseudomonas alkogenes No.41, Acinetobacter calcoaceticus HH2BD-49, Saccharomyces -Each strain of cerevisiae NBRC1661 strain, Rhodotorula mushiraguinosa NBRC0909 strain and Rhodotorula sulphie 13c strain was inoculated into 5 mL of SCD liquid medium (manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.), and shake culture (160 rpm) at 35 ° C for 24 hours.
- SCD liquid medium manufactured by Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.
- a solution obtained by dissolving 0.1 mg of 14-methylhexadecanoic acid synthesized in Test Example 3 in 0.1 mL of methanol is applied to a plain weave fabric of autoclaved cut into 2 cm ⁇ 2 cm squares, and then dried with methanol. I did it. Further, 0.1 mL of a 10 ppm or 100 ppm aqueous solution of the compound shown in Table 6 below was applied to the cloth. As a control, a cloth coated with sterilized water instead of the following compound was also prepared.
- Table 7-1 and Table 7-2 The results are shown in Table 7-1 and Table 7-2.
- Example 2 Each strain of Moraxella Osloensis NCIMB10693, Moraxella SP-4, Acinetobacter calcoaceticus HH2BD-49 and Pseudomonas alkaligenes No. 41 is added to 5 mL of SCD liquid medium (Nippon Pharmaceutical Co., Ltd.). Platinum ears were inoculated and cultured at 35 ° C. for 24 hours with shaking (160 rpm).
- a used cotton bath towel or towel after washing in each home was cut into 2 cm ⁇ 2 cm and autoclaved. Furthermore, 0.1 mL of a 10 ppm or 100 ppm aqueous solution of the compound shown in Table 6 was applied to the bath towel or towel. As a control, a cloth coated with sterilized water instead of the following compound was also prepared.
- a solution prepared by dissolving 0.1 mg of 14-methylhexadecanoic acid synthesized in Test Example 3 in 0.1 mL methanol was applied to the SCD agar medium.
- 0.1 mL of a 10 ppm or 100 ppm aqueous solution of the compound shown in Table 6 was applied thereto.
- an agar medium coated with sterilized water instead of the following compound was also prepared.
- the agar medium prepared as described above is inoculated with 0.1 mL of the various bacterial solutions, cultured at 37 ° C. for 24 hours, and subjected to sensory evaluation of the raw dry odor by the same method and evaluation criteria as in Example 1. It was. The results are shown in Table 10.
Abstract
Description
下着、タオル及びハンカチを初めとするヒトの皮膚と直接接触するような繊維製品又は皮脂を含んだ汗や角質などを吸収又は付着する可能性のある繊維製品は、洗濯後、被洗物を洗濯槽内等の湿気の多い場所にしばらく放置した場合、室内干しの場合、雨や汗で濡れた場合、又は乾燥が不十分の場合に、雑巾臭様の特有の臭いを生ずることがある。この臭いは一般に生乾き臭と呼ばれるものであり、十分な乾燥を行うことで大部分を除去することができる。しかしながら、十分な乾燥を行い、生乾き臭が感じられなくなった繊維製品であっても、汗や雨などで繊維製品が湿気を帯びると生乾き臭が生じることがある。繊維製品がこの生乾き臭を一度発生するようになると、洗濯後の十分な乾燥により一時的には生乾き臭を除去できるが、使用時に雑巾臭様の生乾き臭が再発し易くなる。このような再発し易い生乾き臭は、室内干しの場合のみならず、低温乾燥機能を備えた洗濯機又は乾燥機を用いた場合や、室外干し乾燥の場合でさえも湿気を帯びると生じる場合がある。
再発性の生乾き臭の特徴的な点は、洗濯し十分に乾燥した後は発生しない、ないし殆ど低減されるが、湿気を帯びるだけで臭いが発生する点にある。再発性の生乾き臭は、長期間タンスなどに収納した場合に生じ易い。しかしながら、下着、ハンカチ又はタオルなど、ヒトの肌との接触機会が多く、洗浄-使用サイクルの期間の短い使用頻度の多い繊維製品は、一度この生乾き臭が発生するようになると使用中に臭いが再発してくることが多い。さらには、洗濯回数が増えるほど生乾き臭の臭い強度が高まる傾向がある。この生乾き臭を抑制するためには、このような生乾き臭原因物質を産生しないように繊維製品を処理することが重要であり、そのための方法として生乾き臭を抑制する剤が求められており、生乾き臭抑制剤をスクリーニングする方法及び生乾き臭抑制剤を評価する方法の開発が求められている。
本発明はこれらの知見に基づいて完成するに至ったものである。
さらに、本発明は、皮脂汚れ成分、及び4-メチル-3-ヘキセン酸生成能を有する微生物を含んでなる、生乾き臭抑制剤の評価用キットに関する。
また、本発明の生乾き臭抑制剤の評価方法は、皮脂汚れ成分の存在下において、4M3H生成能を有する微生物と被験物質とを接触させ、前記微生物による生乾き臭原因物質の生成を検知することにより、該被験物質の生乾き臭抑制作用を評価する工程を含んでなる。本発明の生乾き臭抑制剤の評価方法によれば、例えば、生乾き臭抑制剤の候補として選択した物質について、その生乾き臭抑制作用の高精度な評価を簡便に行うことが可能となる。
繊維製品を洗濯後乾燥が不十分なため生じる生乾き臭としては、S(硫黄)臭、N(窒素)臭、アルデヒド臭、低級脂肪酸臭、4M3H臭を含む中級分岐脂肪酸臭などの複合臭である。一方、繊維製品を十分に乾燥させて生乾き臭を除去した後、再び雨、汗等の湿気などにより、繊維製品から再発する雑巾様臭の再発性の不快臭は、4M3H臭を主とする中級分岐脂肪酸臭が大部分であり、その他のS臭、N臭、アルデヒド臭などの揮発性の高い臭いはほとんど発生しない。
また、「生乾き臭抑制」とは、生乾き臭を抑制すること、生乾き臭生成を予防することを包含するものである。そして本発明では、生乾き臭として前記再発性の生乾き臭、特には4M3H臭の抑制を特徴的に指すものとする。
まず、前記(1)の方法(繊維製品の官能評価を行い、生乾き臭を発する繊維製品から微生物を採取する方法)の概要について説明する。
家庭等で、洗濯後に使用した、又は洗濯後保管しておいた(洗濯後は未使用)繊維製品、たとえば、タオル、Tシャツ、枕カバー、下着類を回収し、官能評価により生乾き臭を強く感じる繊維製品を選択する。選択した繊維製品を一定の大きさ(たとえば5×5cm、2×2cm)に裁断し、レシチン・ポリソルベート(本明細書においてLPともいう)希釈液(日本製薬社製)又は生理食塩水等に添加後、攪拌により得られた抽出液をレシチン・ポリソルベート添加ソイビーン・カゼイン・ダイジェスト(本明細書においてSCD-LPともいう)寒天培地(日本製薬社製)やポテトデキストロース・アガー(本明細書においてPDAともいう)培地(BD社製)などの寒天培地に塗抹して一定時間(たとえば35℃、24時間)培養後、得られたコロニーから微生物を単離する。
単離した各菌株は、滅菌した使用済み繊維製品、たとえば生乾き臭発生が認められたタオルなどを一定の大きさ(たとえば5×5cm、2×2cm)に切断したのちに滅菌処理したものに塗布して培養、又は皮脂汚れ成分の存在下において固体培養又は液体培養したのちに官能評価により生乾き臭を感知した菌株を選抜する。選抜した各菌株の同定が必要な場合は、その方法に制限はないが、細菌では16S rDNA遺伝子の上流領域約500bp、真菌ではLSU(Large Subunit)のD2領域の約200~500bpの塩基配列を決定し、当該塩基配列と基準株との同一性に基づき行なうことができる。なお、塩基配列の同一性は、遺伝子情報処理ソフトウェアClustalW(http://clustalw.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html)等を用いて算出することもできる。
家庭などで、洗濯後に使用した、あるいは洗濯後保管しておいた(洗濯後は未使用)繊維製品、たとえば、タオル、Tシャツ、枕カバー、下着類などを回収し、一定の大きさ(たとえば5×5cm、2×2cm)に裁断し、LP希釈液(日本製薬社製)、又は生理食塩水などに添加後、攪拌することにより得られた抽出液をSCD-LP寒天培地(日本製薬社製)やPDA培地(BD社製)などの寒天培地に塗抹して一定時間(たとえば35℃、24時間)培養後、得られたコロニーから微生物を単離する。
単離した各菌株は、滅菌した使用済み繊維製品、たとえば生乾き臭発生が認められたタオルなどを一定の大きさ(たとえば5×5cm、2×2cm)に切断したのちに滅菌処理したものに塗布して培養、又は皮脂汚れ成分の存在下において固体培養又は液体培養したのちに4M3Hの生成を検知することにより、4M3H生成が認められた菌株を選抜する。選抜した各菌株の同定が必要な場合は、その方法に制限はないが、たとえば、細菌では16S rDNA遺伝子の上流領域約500bp、真菌ではLSUのD2領域の約200~500bpの塩基配列を決定し、当該塩基配列と基準株との同一性に基づき行なうことができる。なお、塩基配列の同一性は、遺伝子情報処理ソフトウェアClustalW等を用いて算出することもできる。
ATCC(American Type Culture Collection)、NBRC(NITE Biological Resource Center)、JCM(Japan Collection of Microorganisms)、NCIMB(National Collection of Industrial,Marine and Food Bacteria)などの菌株分譲機関から菌株を購入する。あるいは、土壌、植物、河川水、住居内など様々な環境より常法によりSCD-LP寒天培地(日本製薬社製)やPDA培地(BD社製)などに菌株を分離後、単離する。なお、ここで用いる培地に特に制限はない。
購入あるいは単離した各菌株を、滅菌した使用済み繊維製品、たとえば生乾き臭発生が認められたタオルなどを一定の大きさ(たとえば5×5cm、2×2cm)に切断したのちに滅菌処理したものに塗布して培養した後に、又は皮脂汚れ成分の存在下において固体培養又は液体培養したのちに、4M3Hの生成を検知することにより、4M3H生成が認められた菌株を選抜する。環境から分離した菌から選抜した各菌株について同定が必要な場合は、その方法に制限はないが、たとえば、細菌では16S rDNA遺伝子の上流領域約500bp、真菌ではLSUのD2領域の約200~500bpの塩基配列を決定し、当該塩基配列と基準株との同一性に基づき行なうことができる。なお、塩基配列の同一性は、遺伝子情報処理ソフトウェアClustalW等を用いて算出することもできる。
まず、上記(1)、(2)及び/又は(3)の方法等により選択した4M3H生成能を有する微生物の特定の遺伝子の塩基配列を決定する。そして、決定した塩基配列と同一性の高い塩基配列を有する微生物を選択することにより、本発明に用いる4M3H生成能を有する微生物を入手することができる。例えば、後述の実施例でも示すように、モラクセラ・エスピー(Moraxella sp.)4-1株、モラクセラ・エスピー(Moraxella sp.)4-4株及びモラクセラ・オスロエンシス(Moraxella osloensis)ATCC19976等は、生乾き臭の原因菌であるので、4M3H生成能を有する微生物を基準サンプルとして選択する。次に、たとえば、配列番号1、2及び3に示すように、基準サンプルの16S rDNAの領域等の塩基配列を決定する。そして、決定した基準サンプルの塩基配列の全部又は一部と同一性の高い塩基配列を有する微生物を選択する。ここで、「同一性の高い」とは、配列番号1~3のいずれかに示す塩基配列等、基準サンプルの塩基配列との同一性が好ましくは95%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上であることをいう。なお、モラクセラ・エスピー4-1株は、2011年8月22日付で、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター(茨城県つくば市東1-1-1つくばセンター中央第6)に、受託番号FERM BP-11394として寄託された。
微生物の塩基配列は、通常の方法により決定することができる。また、塩基配列の同一性については、Lipman-Pearson法(Science,227,1435,1985)等によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアGenetyx-Win(ソフトウェア開発製)のホモロジー解析(Search homology)プログラムを用いて、パラメーターであるUnit size to compare(ktup)を2として解析を行うことにより算出することができる。
本発明において、4M3H生成能を有する微生物として1種の微生物を用いてもよいし、2種以上の微生物を組み合わせて用いてもよい。なお、本発明において「モラクセラ・エスピー」とは、その16S rDNA遺伝子の塩基配列が、配列番号1、配列番号2又は配列番号3の塩基配列と95%以上、より好ましくは97%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の同一性を有する塩基配列を含む微生物を意味する。
本発明に用いる皮脂汚れ成分としては、衣類等に通常見られる皮脂汚れの成分であれば特に制限はないが、繊維製品から生じる生乾き臭原因物質の前駆体となり得る物質が好ましい。繊維製品から生じる生乾き臭原因物質の前駆体となり得る物質としては、例えば炭素数9~21(好ましくは炭素数11~19、より好ましくは炭素数17~19)のアンテイソ脂肪酸が挙げられる。これらの中には、皮脂汚れ中には実際には存在しない化合物も含まれるが、本明細書においてはこれらのアンテイソ脂肪酸も皮脂汚れ成分に含まれるものとする。本発明において、前記皮脂汚れ成分はアンテイソ脂肪酸であることが好ましい。本発明に好ましく用いられるアンテイソ脂肪酸は、飽和脂肪酸及び不飽和を含有する脂肪酸のいずれであってもよく、アンテイソ脂肪酸の塩及びエステルも前記アンテイソ脂肪酸に含むものとする。具体的には、6-メチルオクタン酸、8-メチルデカン酸、12-メチルテトラデカン酸、14-メチルヘキサデカン酸、16-メチルオクタデカン酸、14-メチルヘキサデセン酸及び16-メチルオクタデセン酸、並びにこれらの塩やエステルなどが挙げられる。
本発明に好ましく用いられるアンテイソ脂肪酸は通常の方法により合成することができる(例えば、特開2009-149546号公報参照)。また、シグマアルドリッチ社等から市販のものを入手して用いることもできる。
生乾き臭原因物質としては、生乾き臭原因物質となり得る前記4M3H生成能を有する微生物が生成する物質であればよく、4-メチル-3-ヘキセン酸(4M3H)、4-メチル-3ペンテン酸、4-メチル-3オクテン酸等が挙げられる。本発明において、4M3Hの生成を検知することが好ましい。
具体的には、生乾き臭原因物質の検量線を予め作成しておき、この検量線を用いて機器分析を行ってもよいし、生乾き臭原因物質の変化体又は未変化体を滴定又は抽出等の化学分析により定量してもよい。また、官能評価により生乾き臭抑制剤の添加の有無によるニオイ強度の差やニオイの種類の変化により判定してもよい。
(1)前記皮脂汚れ成分としての、アンテイソ脂肪酸
(2)4M3H等の前記生乾き臭原因物質を検知する装置
(3)前記皮脂汚れ成分を付着させる繊維製品(例えば、木綿の使用済繊維製品)
(4)前記微生物及び前記被験物質を接触させる、溶液又は固体(例えば生理食塩水、緩衝液、液体培地、固体培地など)
洗濯乾燥の後に生乾き臭が強く発生した木綿のタオルを家庭より回収して50gを裁断し、ジクロロメタン500mLよりニオイ成分を抽出後減圧濃縮した。さらに、1M水酸化ナトリウム水溶液200mLを抽出溶液に添加し、水層を回収し、2M塩酸200mL添加し酸性にした。この溶液に、ジクロロメタン200mLを加え有機層を減圧濃縮し、酸性成分の濃縮物を1mLに定容した。
(GC-PFC条件)
GC:Agilent 6890N(商品名、アジレント社製)
カラム:DB-1(商品名、アジレント社製)、長さ30m、内径0.53mm、膜厚1μm
40℃1min.hold→6℃/min.to 60℃→4℃/min.to 300℃
Injection volume:2μL
PFC:trap time 18min.to 24min.、30times
trap:TENAX TA(商品名、ジーエルサイエンス社製)200mg
(TDS-GC-MS条件)
GC:Agilent 6890N(商品名、アジレント社製)
MS:Agilent 5973(商品名、アジレント社製)
TDS脱着条件:250℃、パージ流量50mL/min、パージ時間 3min.
カラム:DB-FFAP(商品名、アジレント社製)、長さ30m、内径250μm、膜厚0.25μm
40℃1min.hold→6℃/min.to 60℃→2℃/min.to 240℃
(1)菌株の単離
洗濯乾燥の後に生乾き臭が発生した木綿のタオル又はバスタオルを裁断し、LP希釈液(日本製薬社製)を添加後、攪拌した溶液0.1mLをSCD-LP寒天培地(日本製薬社製)に塗沫し、35℃、24時間培養後、得られたコロニーから微生物を単離した。単離した細菌株の同定は、16S rDNA遺伝子の上流領域約500bpの塩基配列、酵母株の同定は、LSUのD2領域の約200~500bp領域の塩基配列を決定し、当該塩基配列と基準株との同一性に基づき行なった。塩基配列の同一性は、遺伝子情報処理ソフトウェアClustalWを用いて算出した。なおモラクセラ・エスピーに関してはモラクセラ・オスロエンシスATCC19976の塩基配列を決定し、その塩基配列と比較することで同定した。
各タオル又はバスタオルから単離された菌株を表1に示す。
上記で単離された各種菌株をそれぞれ生乾き臭が発生した木綿のタオル、あるいは使用後洗濯して保管していた木綿のタオルを滅菌処理したものに接種し、35℃で24時間加湿条件下(湿度100%)で培養後、生乾き臭の発生の有無を下記基準に基づいて、香料評価の訓練を受けた専門評価者(N=3)により、合意により判定した。
1:生乾き臭の発生が非常に強い
2:生乾き臭の発生が強い
3:生乾き臭の発生が弱い
4:生乾き臭が全くしない
その結果を表1に示す。
したがって、生乾き臭には本菌種などの特定の微生物が関与していることが明らかとなった。
前記試験例2に準じて単離、同定した菌株、環境(土壌、住居内)より定法によりソイビーン・カゼイン・ダイジェスト(本明細書においてSCDともいう)寒天培地又はPDA培地を用いて分離した後、単離同定した菌株、及び微生物供託機関から入手した微生物の4M3H生成能を測定した。
なお、微生物供託機関から入手した菌株は下記の通りである。
モラクセラ・オスロエンシスNCIMB10693株(NCIMB(National collection of industrial and marine bacteria)から購入)
モラクセラ・オスロエンシスATCC19976株(ATCC(American Type Culture Collection)から購入)
サイクロバクター・インモビリス(Psychrobacter immobilis)NBRC15733株、サイクロバクター・パシフィセンシスNBRC103191株、サイクロバクター・グラシンコラNBRC101053株、シュードモナス・エルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)NBRC13275株、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)NBRC14164株、スフィンゴモナス・ヤノイクヤエNBRC15102株、ミクロコッカス・ルテウス(Micrococcus luteus)NBRC3333株、ブレブンディモナス・ディミヌタ(Brevundimonas diminuta)NBRC12697株、ロゼオモナス・エリラタ(Roseomonas aerilata)NBRC106435株、キュープリアビダス・オキサラティカスNBRC13593株、シュードキサントモナス・エスピー(Pseudoxanthomonas sp.)NBRC101033株、セラチア・マルセセンスNBRC12648株、エンテロバクター・クロアカ(Enterobacter cloacae)NBRC3320株、コリネバクテリウム・エフィシエンス(Corynebacterium efficiens)NBRC100395株、エシェリキア・コーライNBRC3972株、スタフィロコッカス・アウレウスNBRC13276株、サッカロマイセス・セレビジエNBRC1661株、カンジダ・アルビカンス(Candida albicans)NBRC1061株、アルガリゲネス・フェカリス(Alcaligenes faecalis)NBRC13111株、ブルクホルデリア・セパシアNBRC15124株及びロドトルラ・ムシラギノサNBRC0909株(いずれもNBRC(NITE Biological Resource Center)から購入)
バチルス・セレウスJCM2152株、バチルス・サブティリスJCM1465株及びラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)JCM1149株(JCM(Japan Collection of Microorganisms)から購入)
その結果を表2に示す。
入手した菌株をSCD液体培地(日本製薬社製)5mLに一白金耳接種し、35℃で24時間振とう培養(160rpm)を行なった。培養後の菌体を遠心(8000×g、10分)して上清を取り除いた後、生理食塩水5mLに懸濁し、再度遠心(8000×g、10分)した後上清を取り除き、生理食塩水を用いてOD600=1.0となるように菌液を調製した。
家庭生活の中で使用と洗濯を繰り返した木綿の中古タオルを5cm×5cmの正方形に切断し滅菌したものに前記各種菌液0.1mLを植菌し、加湿条件下で37℃で24時間静置した。
専門評価者(N=3)により、24時間静置後の前記木綿の中古タオルの生乾き臭の有無を合意により判定した。評価基準は、生乾き臭が強く感じられる試料を◎、生乾き臭が感じられる試料を○、生乾き臭が若干感じられる試料を△、生乾き臭が全くない試料を×とした。その結果を表3に示す。
特開2009-149546号公報に準じて、14-メチルヘキサデカン酸を下記の2工程の反応で合成した。
(a)工程
12-ドデカノリド11.9g(60.0mmol)、32%臭化水素/酢酸溶液24.3g(96.0mmol、1.6当量)を、テフロン(登録商標)で保護された100mLオートクレーブに入れ、窒素置換した後密閉し、60℃のオイルバスを用いて、16時間マグネチックスターラーで攪拌した。冷却後、水14mLを加え、熱ヘキサン200mLを用い、分液ロートに移送した。イオン交換水で洗浄後、硫酸マグネシウムで乾燥し、ろ過、n-ヘキサンで晶析することで、12-ブロモドデカン酸14.4g(収率86%)を得た。
(b)工程
次に、還流冷却管、50mL滴下ロート、マグネチックスターラー、温度センサーを備えた100mLの4口フラスコに、12-ブロモドデカン酸5.0g(17.9mmol)及びトリフェニルホスフィン(関東化学社製)28.2mg(0.006eq)を入れ、減圧乾燥した。アルゴン雰囲気下、臭化銅(I)(アルドリッチ社製)77.1mg(0.03当量)、無水テトラヒドロフラン10mLを加えた。室温下、2-メチルブチルマグネシウムブロミド39.5mL(3当量、1.36Nテトラヒドロフラン溶液)を、1時間で滴下した。1時間攪拌した後、1N塩酸水溶液50mLを加え、ヘキサン100mLで2回抽出した。イオン交換水50mLで2回洗浄した後、硫酸マグネシウムで乾燥した。ろ過、減圧濃縮して、粗生成物3.9gを得た。
ガスクロマトグラフィー(カラム:アジレント社製、商品名:Ultra-2、30m×0.2mm×0.33μm、DET300℃、INJ300℃、カラム温度100℃→300℃、10℃/分)で、内標にオクタデカンを用い、定量した結果、収率79%であった。
このようにして、12-ドデカノリドから14-メチルヘキサデカン酸を全収率68%で得た。また純度は98%であった。
2cm×2cmの正方形に切断した木綿の平織り布に、皮脂汚れ成分として、前述の方法で合成した14-メチルヘキサデカン酸又は16-メチルオクタデカン酸0.5mgをメタノール0.1mLに溶解した溶液を塗布し、その後メタノールの乾固を行った。
上記木綿の平織り布に、前記各種菌液0.1mLを植菌し、加湿条件下で37℃で24時間静置し、下記の4M3Hの定量及び生乾き臭の官能評価を行った。
24時間静置後の前記タオルに、メタノール10mLを添加し、そのうちの1mLとADAM(9-Anthrydiazomethanene、フナコシ社製、0.1w/v%)1mLとを混合し、室温で60分放置し、誘導体化を行なった。
その後、10μL溶液について、LC-FL(液体クロマトグラフィー装置:HITACHI ELITE LaChrom(商品名、日立社製)、カラム:Lichrospher 100 RP-8(e)(商品名、アジレント社製、5μm×125mm×4mmφ)、カラム温度:40℃、溶離剤:アセトニトリル/水=7/3(体積比)の混合溶液、流速:1.0mL/min、検出器:励起波長(365nm)、測定波長(412nm))を用いて解析を行うことで、生成した4M3Hの定量を行った。4M3Hの生成量について、生成した4M3Hの量が1μgより多かった試料を◎、0.1μgより多く1μg以下の試料を○、0μgより多く0.1μg以下の試料を△、全く検出されなかった試料を×として評価した。14-メチルヘキサデカン酸を塗布した場合の結果を表4に、16-メチルオクタデカン酸を塗布した場合の結果を表5にそれぞれ示す。
(2)生乾き臭の官能評価
専門評価者(N=3)により、24時間静置後の前記木綿平織り布の生乾き臭の有無を判定した。評価基準は、生乾き臭が強く感じられる試料を◎、生乾き臭が感じられる試料を○、生乾き臭が若干感じられる試料を△、生乾き臭が全くない試料を×とした。14-メチルヘキサデカン酸を塗布した場合の結果を表4に、16-メチルオクタデカン酸を塗布した場合の結果を表5にそれぞれ示す。
さらに、本発明に用いる4M3H生成能を有する微生物は、上記に示すように、繊維製品の官能評価を行い、その結果生乾き臭を発した繊維製品から微生物を採取することもできるし、繊維製品に存在する微生物を採取し、採取した微生物の4M3H生成能を測定し、4M3H生成能を有する微生物を選択することもできる。さらには、表2~5からわかるように、4M3H生成能を有する微生物の中には、特定の遺伝子配列の相同性が非常に高いものがあるので、特定の遺伝子配列の相同性を比較することで、4M3H生成能を有する微生物を選択することもできる。
モラクセラ・オスロエンシスNCIMB10693株、モラクセラ・エスピー4-1株、サイクロバクター・パシフィセンシスNBRC103191株、サイクロバクター・グラシンコラNCIMB101053株、シュードモナス・アルカリゲネスNo.41株、アシネトバクター・カルコアセティカスHH2BD-49株、サッカロマイセス・セレビジエNBRC1661株、ロドトルラ・ムシラギノーサNBRC0909株及びロドトルラ・スルーフィエ13c株の各菌株をSCDの液体培地(日本製薬社製)5mLに一白金耳接種し、35℃で24時間振とう培養(160rpm)を行なった。培養後の菌体を遠心(8000×g、10分)して上清を取り除いた後、生理食塩水5mLに懸濁し、再度遠心(8000×g、10分)した後上清を取り除き、生理食塩水を用いてOD600=0.1となるように菌液を調製した。
さらに、上記布に下記表6に示す化合物の10ppm又は100ppmの水溶液を0.1mL塗布した。コントロールとして、下記化合物の代わりに滅菌水を塗布した布も調製した。
試験例3と同様の方法により、4M3Hの定量を行い、被検物質として滅菌水を塗布したものの4M3H生成量を基準に下記基準に基づいてその他の被検物質塗布時の4M3H生成量を評価した。
A:(被検物質塗布時の4M3H生成量)<(滅菌水塗布時の4M3H生成量の1/100)
B:(滅菌水塗布時の4M3H生成量の1/100)≦(被検物質塗布時の4M3H生成量)<(滅菌水塗布時の4M3H生成量の1/10)
C:(滅菌水塗布時の4M3H生成量の1/10)≦(被検物質塗布時の4M3H生成量)<(滅菌水塗布時の4M3H生成量)
D:(滅菌水塗布時の4M3H生成量)≦(被検物質塗布時の4M3H生成量)
その結果を表7-1及び表7-2に示す。
(2)官能評価
専門評価者(N=3)により、下記基準に基づいて生乾き臭の官能評価を合意により行った。
A:生乾き臭が抑制され、生乾き臭がほとんど感じられなかった。
B:生乾き臭がほぼ抑制された。
C:生乾き臭がやや抑制された。
D:生乾き臭はほとんど抑制されず、生乾き臭が強く感じられた。
その結果を表7-1及び表7-2に示す。
モラクセラ・オスロエンシスNCIMB10693株、モラクセラ・エスピー4-1株、アシネトバクター・カルコアセティカスHH2BD-49株及びシュードモナス・アルカリゲネスNo.41株の各菌株をSCDの液体培地(日本製薬社製)5mLに一白金耳接種し、35℃で24時間振とう培養(160rpm)を行なった。培養後の菌体を遠心(8000×g、10分)して上清を取り除いた後、生理食塩水5mLに懸濁し、再度遠心(8000×g、10分)した後上清を取り除き、生理食塩水を用いてOD600=0.1となるように菌液を調製した。
さらに、上記バスタオル又はタオルに、前記表6に示す化合物の10ppm又は100ppmの水溶液を0.1mL塗布した。コントロールとして、下記化合物の代わりに滅菌水を塗布した布も調製した。
モラクセラ・オスロエンシスNCIMB10693株及びシュードモナス・アルカリゲネスNo.41株の各菌株をSCDの液体培地(日本製薬社製)5mLに一白金耳接種し、35℃で24時間振とう培養(160rpm)を行なった。培養後の菌体を遠心(8000×g、10分)して上清を取り除いた後、生理食塩水5mLに懸濁し、再度遠心(8000×g、10分)した後上清を取り除き、生理食塩水を用いてOD600=0.1となるように菌液を調製した。
上記のように調製した液体培地に、前記各種菌液0.1mLを植菌し、37℃で24時間振とう培養を行い、実施例1と同様の方法及び評価基準により、生乾き臭の官能評価を行った。その結果を表9に示す。
モラクセラ・オスロエンシスNCIMB10693株をSCDの液体培地(日本製薬社製)5mLに一白金耳接種し、35℃で24時間振とう培養(160rpm)を行なった。培養後の菌体を遠心(8000×g、10分)して上清を取り除いた後、生理食塩水5mLに懸濁し、再度遠心(8000×g、10分)した後上清を取り除き、生理食塩水を用いてOD600=0.1となるように菌液を調製した。
上記のように調製した寒天培地に、前記各種菌液0.1mLを植菌し、37℃で24時間培養を行い、実施例1と同様の方法及び評価基準により、生乾き臭の官能評価を行った。その結果を表10に示す。
Claims (18)
- 皮脂汚れ成分の存在下において、4-メチル-3-ヘキセン酸生成能を有する微生物と被験物質とを接触させ、前記微生物による生乾き臭原因物質の生成を検知することにより、生乾き臭抑制作用を有する被験物質を選択する、生乾き臭抑制剤のスクリーニング方法。
- 前記皮脂汚れ成分がアンテイソ脂肪酸である、請求項1記載のスクリーニング方法。
- 前記生乾き臭原因物質が4-メチル-3-ヘキセン酸である、請求項1又は2記載のスクリーニング方法。
- 前記微生物及び前記被験物質を、皮脂汚れ成分が付着している繊維製品に添加して接触させる、請求項1~3のいずれか記載のスクリーニング方法。
- 前記繊維製品が木綿の使用済繊維製品である、請求項4記載のスクリーニング方法。
- 皮脂汚れ成分を含む溶液又は固体において前記微生物及び前記被験物質を接触させる、請求項1~3のいずれか記載のスクリーニング方法。
- 前記微生物が、モラクセラ(Moraxella)属細菌、アシネトバクター(Acinetobacter)属細菌、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌、バチルス(Bacillus)属細菌、スフィンゴモナス(Sphingomonas)属細菌、キュープリアビダス(Cupriavidus)属細菌、ラルストニア(Ralstonia)属細菌、サイクロバクター(Psychorobacter)属細菌、セラチア(Serratia)属細菌、エシェリキア(Escherichia)属細菌、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属細菌、ブルクホルデリア(Burkholderia)属細菌、サッカロマイセス(Saccaromyces)属酵母、及びロドトルラ(Rhodotorula)属酵母からなる群より選ばれる少なくとも1種以上の微生物である、請求項1~6のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
- 前記微生物が、モラクセラ・エスピー(Moraxella sp.)、モラクセラ・オスロエンシス(Moraxella osloensis)、アシネトバクター・レイディオレジステンス(Acinetobacter radioresistens)、アシネトバクター・ジュニイ(Acinetobacter junii)、アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、エシェリキア・コーライ(Escherichia coli)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、シュードモナス・アルカリゲネス(Pseudomonas alcaligenes)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)、サイクロバクター・パシフィセンシス(Psychrobacter pacificensis)、サイクロバクター・グラシンコラ(Psychrobacter glacincola)、スフィンゴモナス・ヤノイクヤエ(Sphingomonas yanoikuyae)、ラルストニア エスピー(Ralstonia sp.)、サッカロマイセス・セレビジエ(Saccaromyces cerevisiae)、ロドトルラ・ムシラギノーサ(Rhodotorula mucilaginosa)、ロドトルラ・スルーフィエ(Rhodotorula slooffiae)、キュープリアビダス・オキサラティカス(Cupriavidus oxalaticus)及びブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)からなる群より選ばれる少なくとも1種以上の微生物である、請求項1~7のいずれか1項記載のスクリーニング方法。
- 皮脂汚れ成分の存在下において、4-メチル-3-ヘキセン酸生成能を有する微生物と被験物質とを接触させ、前記微生物による生乾き臭原因物質の生成を検知することにより、該被験物質の生乾き臭抑制作用を評価する、生乾き臭抑制剤の評価方法。
- 前記皮脂汚れ成分がアンテイソ脂肪酸である、請求項9記載の評価方法。
- 前記生乾き臭原因物質が4-メチル-3-ヘキセン酸である、請求項9又は10記載の評価方法。
- 前記微生物及び前記被験物質を、皮脂汚れ成分が付着している繊維製品に添加して接触させる、請求項9~11のいずれか記載の評価方法。
- 前記繊維製品が木綿の使用済繊維製品である、請求項12記載の評価方法。
- 皮脂汚れ成分を含む溶液又は固体において前記微生物及び前記被験物質を接触させる、請求項9~11のいずれか1項記載の評価方法。
- 前記微生物が、モラクセラ(Moraxella)属細菌、アシネトバクター(Acinetobacter)属細菌、シュードモナス(Pseudomonas)属細菌、バチルス(Bacillus)属細菌、スフィンゴモナス(Sphingomonas)属細菌、キュープリアビダス(Cupriavidus)属細菌、ラルストニア(Ralstonia)属細菌、サイクロバクター(Psychorobacter)属細菌、セラチア(Serratia)属細菌、エシェリキア(Escherichia)属細菌、スタフィロコッカス(Staphylococcus)属細菌、ブルクホルデリア(Burkholderia)属細菌、サッカロマイセス(Saccaromyces)属酵母、及びロドトルラ(Rhodotorula)属酵母より選ばれる少なくとも1種以上の微生物である、請求項9~14のいずれか1項記載の評価方法。
- 前記微生物が、モラクセラ・エスピー(Moraxella sp.)、モラクセラ・オスロエンシス(Moraxella osloensis)、アシネトバクター・レイディオレジステンス(Acinetobacter radioresistens)、アシネトバクター・ジュニイ(Acinetobacter junii)、アシネトバクター・カルコアセティカス(Acinetobacter calcoaceticus)、セラチア・マルセセンス(Serratia marcescens)、エシェリキア・コーライ(Escherichia coli)、スタフィロコッカス・アウレウス(Staphylococcus aureus)、シュードモナス・アルカリゲネス(Pseudomonas alcaligenes)、バチルス・セレウス(Bacillus cereus)、バチルス・サブティリス(Bacillus subtilis)、サイクロバクター・パシフィセンシス(Psychrobacter pacificensis)、サイクロバクター・グラシンコラ(Psychrobacter glacincola)、スフィンゴモナス・ヤノイクヤエ(Sphingomonas yanoikuyae)、ラルストニア エスピー(Ralstonia sp.)、サッカロマイセス・セレビジエ(Saccaromyces cerevisiae)、ロドトルラ・ムシラギノーサ(Rhodotorula mucilaginosa)、ロドトルラ・スルーフィエ(Rhodotorula slooffiae)、キュープリアビダス・オキサラティカス(Cupriavidus oxalaticus)及びブルクホルデリア・セパシア(Burkholderia cepacia)からなる群より選ばれる少なくとも1種以上の微生物である、請求項9~15のいずれか1項記載の評価方法。
- 皮脂汚れ成分、及び4-メチル-3-ヘキセン酸生成能を有する微生物を含んでなる、生乾き臭抑制剤のスクリーニング用キット。
- 皮脂汚れ成分、及び4-メチル-3-ヘキセン酸生成能を有する微生物を含んでなる、生乾き臭抑制剤の評価用キット。
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