JP2013538064A5

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Publication number: JP2013538064A5
Application number: JP2013500188A
Authority: JP
Filing date: 2011-03-16
Publication date: 2015-04-02
Anticipated expiration: 2031-03-16

Description

本発明の線維芽細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞は、血管チューブへの形成のために、多細胞体へ組み合わせられる前に別々に培養され得る。例えば、線維芽細胞、平滑筋細胞および内皮細胞は、組織培養フラスコ中の培養物において別々に増殖され、コンフルエントであるときに、１つの培養物へと一緒に継代および混合されることで、混合した細胞懸濁液を形成するために遠心分離にかけられ、上清が取り除かれることで、混合した細胞ペーストのための高密度の及びコンパクトな細胞ペレットを形成し得る。適切な混合した細胞懸濁液は、線維芽細胞と平滑筋細胞、線維芽細胞と内皮細胞、および平滑筋細胞と内皮細胞の組み合わせを含む。混合した細胞懸濁液中の細胞は、例えば、オービタルシェーカー上のインキュベーションによって、互いに凝集し、細胞−細胞接着を開始することが可能となる。混合した細胞ペーストは、例えば、キャピラリーチューブへの吸収によって、多細胞体へと形成され得る。その後、細胞シリンダーは、例えば、プランジャーを使用することによって、キャピラリーチューブからモールドの溝へと押し出され得る。あるいは、線維芽細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞は、例えば、細長い細胞体を含む多細胞体に、別々に組み込まれ得る。細長い細胞体は、細胞とあらかじめ混合された１つより多くの細胞外マトリックス成分を含み得る。その後、多細胞体は、生物印刷機の使用を介する血管チューブへの後の取り込みのために３７℃および５％のＣＯ２で、インキュベートされ得る。

本発明の線維芽細胞は、例えば、組織培養フラスコ中で培養され得る。コンフルエントであるときに、線維芽細胞は、継代される且つ遠心分離にかけられることで、上清が取り除かれ、単細胞ペーストを形成し得る。線維芽細胞ペーストは、例えば、キャピラリーチューブへの吸収によって、細長い細胞体へと形成され得る。その後、細長い細胞体は、例えば、プランジャーを使用することによって、キャピラリーチューブからモールドの溝へと押し出され得る。その後、細長い細胞体は、生物印刷機の使用を介する血管チューブへの後の取り込みのために３７℃および５％のＣＯ２で、インキュベートされ得る。

本発明の平滑筋細胞も、例えば、組織培養フラスコ中で培養され得る。コンフルエントであるときに、平滑筋細胞は、継代される且つ遠心分離にかけられることで、上清が取り除かれ、単細胞ペーストを形成する。平滑筋細胞ペーストは、例えば、キャピラリーチューブへの吸収によって、細長い細胞体へと形成され得る。その後、細長い細胞体は、例えば、プランジャーを使用することによって、キャピラリーチューブからモールドの溝へと押し出され得る。その後、細長い細胞体は、生物印刷機の使用を介する血管チューブへの後の取り込みのために３７℃および５％のＣＯ２で、インキュベートされ得る。

本発明の内皮細胞も、例えば、組織培養フラスコ中で培養され得る。コンフルエントであるときに、内皮細胞は、継代される且つ遠心分離にかけられることで、上清が取り除かれ、単細胞ペーストを形成する。内皮細胞ペーストは、例えば、キャピラリーチューブへの吸収によって、細長い細胞体へと形成され得る。その後、細長い細胞体は、例えば、プランジャーを使用することによって、キャピラリーチューブからモールドの溝へと押し出され得る。その後、細長い細胞体は、生物印刷機の使用を介する血管チューブへの後の取り込みのために３７℃および５％のＣＯ２で、インキュベートされ得る。

人工的に作られた多層の血管チューブは、当該技術分野で既知の任意の方法によって形成され得る。例えば、人工的に作られた多層の血管チューブは、微量ピペットによるなどの手動で、または特殊目的の生物印刷機（米国特許出願第１０／５９０，４４６号に記載されるものなど）によるなどの自動で、ゲルマトリックスの細長い及び／又は略球状の細胞体および細長い体を置くことによって形成され得る。

Claims

分化した成人の線維芽細胞の少なくとも１つの層、および分化した成人の平滑筋細胞の少なくとも１つの層を含む、人工的に作られた多層の血管チューブであって、ここで、任意の層は、分化した成人の内皮細胞をさらに含み、前記人工的に作られた多層の血管チューブは、約１：９９から約４５：５５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合を有し、前記人工的に作られた多層の血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがなく、少なくとも１つの層が生物印刷されるという条件で、前記人工的に作られた多層の血管チューブは、以下の特徴：（ａ）前記人工的に作られた多層の血管チューブが生理学的な血圧に抵抗できるように柔軟である；（ｂ）前記人工的に作られた多層の血管チューブの内部径が、約６ｍｍまたはそれ以下である；（ｃ）前記人工的に作られた多層の血管チューブの長さが約３０ｃｍまでである；および（ｄ）前記人工的に作られた多層の血管チューブの厚さが、前記人工的に作られた多層の血管チューブの領域にわたって略均一である、のうちの１又は２以上を有することを特徴とする、人工的に作られた多層の血管チューブ。
分化した成人の線維芽細胞の外側層、および分化した成人の平滑筋細胞の少なくとも１つの内側層を含むことを特徴とする、請求項１に記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。
分化した成人の平滑筋細胞、分化した成人の内皮細胞、および分化した成人の線維芽細胞を含む、人工的に作られた多層の血管チューブであって、前記人工的に作られた多層の血管チューブは、約１：９９から約４５：５５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合を有し、ここで、前記平滑筋細胞、前記内皮細胞、および前記線維芽細胞は互いに凝集し、前記人工的に作られた多層の血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがなく、少なくとも１つの層が生物印刷されるという条件で、前記人工的に作られた多層の血管チューブは、以下の特徴：（ａ）前記人工的に作られた多層の血管チューブの内部径が、約６ｍｍまたはそれ以下である；（ｂ）前記人工的に作られた多層の血管チューブの長さが約３０ｃｍまでである；および（ｃ）前記人工的に作られた多層の血管チューブの厚さが、前記人工的に作られた多層の血管チューブの領域にわたって略均一である、のうちの１又は２以上を有することを特徴とする、人工的に作られた多層の血管チューブ。
前記人工的に作られた多層の血管チューブが、生理学的な血圧に抵抗するのに十分である破裂強さを有することを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。
内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合が、約５：９５から約２５：７５までであり、随意に内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合が、約１５：８５であることを特徴とする、請求項１乃至３に記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。
前記人工的に作られた多層の血管チューブの内部径が、約０．５ｍｍまたはそれ以下であることを特徴とする、請求項１乃至５のいずれかに記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。
前記人工的に作られた多層の血管チューブの厚さが、前記人工的に作られた多層の血管チューブの長さにわたって略均一であることを特徴とする、請求項１乃至６のいずれかに記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。
前記人工的に作られた多層の血管チューブには、分化していない成人の線維芽細胞、分化していない成人の平滑筋細胞、及び／又は分化していない成人の内皮細胞が本質的になく、及び／又は前記人工的に作られた多層の血管チューブが、分枝した構造を有することを特徴とする、請求項１乃至７のいずれかに記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。
前記人工的に作られた多層の血管チューブが神経交配されないものであり、及び／又は前記分化した成人の線維芽細胞が、非血管性の線維芽細胞であることを特徴とする、請求項１乃至８のいずれかに記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。
ａ）薬物検査、または随意にステントである、心血管装置の検査；又は
ｂ）破損した血管の修復；又は
ｃ）冠状動脈バイパスまたは末端バイパスまたは動静脈のアクセスを必要とする患者の処置；又は
ｄ）末期腎疾患、糖尿病、動脈硬化症、または先天性の心臓疾患を有する患者の処置に使用するための、請求項４に記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。
前記人工的に作られた多層の血管チューブの線維芽細胞、平滑筋細胞、及び／又は内皮細胞が自己由来の細胞であることを特徴とする、請求項１０に記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。
人工的に作られた多層の血管チューブを形成する方法であって、該方法は、
あらかじめ形成されたスキャフォールドがいかなる時も使用されなく、少なくとも１つの層が生物印刷されるという条件で、所望の血管チューブ構造を形成するために、充填マトリックスの少なくとも１つの体、互いに凝集した平滑筋細胞の少なくとも１つの多細胞体、互いに凝集した内皮細胞の少なくとも１つの多細胞体、および互いに凝集する線維芽細胞の少なくとも１つの多細胞体を位置決めする工程を含み、人工的に作られた多層の血管チューブにおける内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合が、約１：９９から約４５：５５までであり、ここで、１以上の充填マトリックス体は、前記人工的に作られた多層の血管チューブの内腔を形成し、複数の充填マトリックス体は、前記人工的に作られた多層の血管チューブを囲み、および該方法はさらに、前記人工的に作られた多層の血管チューブの多細胞体が凝集するのを可能にする工程を含むことを特徴とする方法。
前記人工的に作られた多層の血管チューブ内での内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合は、約５：９５から約２５：７５までであり、及び／又は前記人工的に作られた多層の血管チューブの内腔の直径が約６ｍｍまたはそれ以下であることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
熟成チャンバーにおいて前記人工的に作られた多層の血管チューブを培養する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
細胞の多細胞体の１以上が細長いことを特徴とする、請求項１２乃至１４に記載の方法。
加圧された腔内の液体灌流によって、凝集した人工的に作られた多層の血管チューブを調整する工程をさらに特徴とする、請求項１２に記載の方法。
前記腔内の液体灌流が、約６０ｍｍＨｇから約２００ｍｍＨｇまでの圧力で行われることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
前記腔内の液体灌流が、拍動力を含むことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
分化した成人の線維芽細胞の少なくとも１つの層、分化した成人の平滑筋細胞の少なくとも１つの層を含む、人工的に作られた多層の血管チューブであって、前記分化した成人の線維芽細胞の少なくとも１つの層または前記分化した成人の平滑筋細胞の少なくとも１つの層のいずれかは、分化した成人の内皮細胞をさらに含み、前記人工的に作られた多層の血管チューブは、柔軟であり且つ生理学的な血圧に抵抗するのに十分である破裂強さを有し、および前記人工的に作られた多層の血管チューブには、あらかじめ形成されたスキャフォールドがなく、少なくとも１つの層が生物印刷されるという条件で、前記人工的に作られた多層の血管チューブは、以下の特徴：（ａ）約１：９９から約４５：５５までの内皮細胞の平滑筋細胞に対する割合；（ｂ）前記人工的に作られた多層の血管チューブの内部径が、６ｍｍまたはそれ以下である；（ｃ）前記人工的に作られた多層の血管チューブの長さが３０ｃｍまでである；および（ｄ）前記人工的に作られた多層の血管チューブの厚さが、前記人工的に作られた多層の血管チューブの領域にわたって均一である、のうちの１又は２以上を有することを特徴とする、人工的に作られた多層の血管チューブ。
前記人工的に作られた多層の血管チューブが、少なくとも約１００ｍｍＨｇである生理学的な血圧に抵抗するのに十分である破裂強さを有することを特徴とする、請求項１９に記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。
前記分化した成人の内皮細胞が、ヒト大動脈の内皮細胞であることを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の人工的に作られた多層の血管チューブ。