JP2013532967A - 新規なスフィンゴモナス属微生物及びそれを用いたメタン又は悪臭誘発化合物の分解方法 - Google Patents
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Abstract
Description
メタンと悪臭誘発化合物の同時分解細菌コンソーシアムの確保
メタンと悪臭誘発化合物(以下、悪臭と混用して使用する)の同時分解集積培養液を得るために、埋立地と湿地から土壌を採取した。土壌試料は、韓國公州埋立地と加平埋立地の覆土層の表面から約10cmの深さで土壌を採取した。また、公州錦江湿地の表面から約10cmの深さで土壌を採取した。採取した土壌はそれぞれメッシュ(mesh)2mmの篩にかけて小さな粒子のみ選別して運搬し、その後使用するまで4℃で保管した。
メタン及び悪臭誘発化合物に対する分解能を有する細菌の分離及び同定
メタンと悪臭を同時に分解できる細菌を純粋分離するために、前記方法で濃化した培養液を接種源として用いて純粋菌を分離した。0.9%NaCl溶液9mlに集積培養液1mlを入れて希釈し、この希釈液を0.9%NaCl溶液に1/10ずつ連続的に希釈した。このようにして得た希釈液をそれぞれNMS寒天プレート(NMS培地に寒天を15g/L注入して製造)に平板塗抹した。5Lデシケーターの内部を70%エタノールできれいに拭いて消毒し、その後前記平板塗抹したNMS寒天プレートをデシケーターに入れ、デシケーターの蓋からメタンガス(99%)とDMS(99%)をそれぞれ250ml、16.7ml注入し、30℃で静置培養して菌株の成長を観察した。成長したコロニーを形態と色で7種選別し、各コロニーをDifcoTM R2A寒天培地(Becton, Dickinson and Company, USA, Yeast extract 0.5g/L; Proteose Peptone No.3 0.5g/L; Casamino Acids 0.5g/L; Dextrose 0.5g/L; Soluble Starch 0.5g/L; Sodium Pyruvate 0.3g/L; Dipotassium Phosphate 0.3g/L; Magnesium sulfate 0.05g/L; Agar 15.0g/L)に接種してストリークし、30℃で静置培養することにより、各プレートでは1種類のコロニーのみ生成されることが確認された。
本発明によるスフィンゴモナス属MD2菌株と従来のメタン酸化細菌の成長速度の比較
従来のメタン酸化細菌と本発明によるMD2菌株の成長速度を次の方法で比較した。従来のメタン酸化細菌としては第2型メタン資化細菌(type II methanotroph)に属するメチロシスティス属M6(Methylocystis sp. M6, KCTC 11519BP)を対象菌株として実験を行った。メチロシスティス属M6菌株は、炭素が1個のメタン又はメタノールでのみ成長が可能であるので、NMS培地を1L添加した2L発酵槽容器にM6菌株を初期吸光度値(600nm)が0.109±0.0002になるように接種し、20%(v/v)メタンが含まれる空気を連続的に注入して30℃、180rpmで振盪培養した。
本発明によるスフィンゴモナス属MD2のメタン及び悪臭分解能の調査
4−1.メタン及びDMS分解能の調査
本発明によるスフィンゴモナス属MD2菌株のメタン及び悪臭分解能を評価するために、MD2菌株の前培養を次のように行った。600ml血清瓶にNMS培地を20mlずつ添加し、分離したメタン酸化純粋菌を接種してブチルゴム栓で密封した。ゴム栓で密封した血清瓶に、メタンは最終濃度が5%(v/v)となるように、DMS溶液は2μl注入して30℃、200rpmで振盪培養しながら、2日ごとにメタンとDMSの濃度を測定し、注入されたメタンとDMSが検出限界点以下になると、メタンとDMSを同一濃度で注入した。3回のメタンとDMSの再注入後に、メタンとDMSの酸化速度が低下すると、ゴム栓を開いて8000rpmで10分間遠心分離して菌体のみ回収した。回収した菌体にNMSを40ml添加して混濁させ、これを600ml血清瓶にそれぞれ20mlずつ分注して計2本の血清瓶に継代培養した。このような方法で計3回の継代培養を経て計8本の血清瓶に菌株を準備した。
DMS以外の代表的な硫化系悪臭物質であるMTと硫化水素をMD2菌株が分解できるか否かを調査するために、前記条件と同様に準備した120ml血清瓶(MD2菌株が接種されたNMS培地を4ml添加)にメタンガスを最終濃度が5%になるように注入した。これにMTガス(99%, Sigma Aldrich, USA)を最終濃度が1000ppmになるように添加するか、又は硫化水素ガス(99%, Seoul special gas, Korea)を最終濃度が2000ppmになるように添加し、その後血清瓶を30℃、200rpmで振盪培養した。振盪培養しながら、1日に1回ずつ血清瓶上部のヘッドスペースガスをガスタイトシリンジで0.3ml採取し、水素炎イオン化検出器を装着したガスクロマトグラフィーを用いてメタン濃度を分析した。また、血清瓶から0.06mlのガスを採取し、水素炎イオン化検出器を装着したガスクロマトグラフィーを用いてMT又は硫化水素の濃度を分析して表2に示す。
本発明によるスフィンゴモナス属MD2菌株の微生物製剤の製造及び菌株の生存率の評価
本発明によるMD2菌株の微生物製剤は次の方法で製造した。BactoTM Triptic Soy Broth(Becton, Dickinson and Company, USA)を用い、30℃、180rpmの条件で大量培養したMD2菌株培養液を前処理することなくそのまま脱脂糠に吸収させ、45℃の熱風で乾燥させて脱脂糠微生物製剤を製造した。また、MD2菌株培養液を遠心分離して(8,000rpm, 10分)菌体のみ回収し、菌体を培養液と同体積の蒸留水に懸濁し、その後ショ糖を10g/L添加してよく混合した。このMD2菌体混合液をベントナイト又は澱粉に完全に吸収させ、45℃の熱風で乾燥させた。ベントナイトを吸収剤として用いる場合はベントナイト1kgにMD2菌体懸濁液0.4Lを吸収させ(ベントナイト微生物製剤)、澱粉の場合は澱粉1kgに微生物懸濁液1Lを吸収させて微生物製剤(澱粉微生物製剤)を製造した。
本発明によるスフィンゴモナス属MD2菌株を用いたバイオカバーの性能評価
6−1.実験方法
MD2菌株を接種した機能性バイオカバーによるメタンと悪臭の同時除去特性を解明するために、実験室規模のバイオカバーを製作した。実験室規模のバイオカバーはアクリルカラムを用いて製作し、装置の詳細な構成を図4に示す。
実施例6−1で得た、本発明によるスフィンゴモナス属MD2菌株を接種したバイオカバーによるメタンと悪臭の同時分解結果を図5〜図10に示す。
本発明によるスフィンゴモナス属MD2菌株を用いたバイオフィルターの性能評価
7−1.実験方法
MD2菌株を接種した機能性バイオフィルターによるメタンと悪臭の同時除去特性を解明するために、実験室規模のバイオフィルターを製作した。実験室規模のバイオフィルターはアクリルカラムを用いて製作し、装置の詳細な構成を図11に示す。直径8cm、高さ100cmのバイオフィルターと、直径20cm、高さ15cmのドレイン(drain)貯蔵槽と、液体散水装置とから構成される。バイオフィルター下端に流入するガスが充填層に均一に供給されるように多孔網を設け、軽石と活性炭を担体として充填した。バイオフィルターの担体の乾燥を防止し、微生物に無機塩を連続して供給するために、ドレイン貯蔵槽に無機塩培地であるNMS培地を添加した。循環ポンプを用いて、この溶液をバイオフィルターの上部から下部に1日4回1分間噴射した。ドレイン貯蔵槽の無機塩培地は7日に1回交換した。
本発明によるスフィンゴモナス属MD2菌株を接種したバイオフィルターによるメタンと悪臭の同時低減結果を図12〜図17及び表4〜表5に示す。
Claims (15)
- スフィンゴモナス属(Sphingomonas sp.)MD2菌株(KCTC 11845BP)。
- スフィンゴモナス属(Sphingomonas sp.)MD2菌株(KCTC 11845BP)を含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解用組成物。
- 前記悪臭誘発化合物は、硫化水素、メタンチオール(methanethiol)、ジメチルスルフィド(dimethyl sulfide)、ベンゼン及びトルエンからなる群から選択された少なくとも1つの化合物である請求項2に記載の組成物。
- 前記組成物は、土壌、活性炭、真砂土及びミミズ堆肥からなる群から選択された少なくとも1つをさらに含む請求項2に記載の組成物。
- 請求項2の組成物を含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解用バイオカバー。
- 前記バイオカバーは酸素生成剤をさらに含む請求項5に記載のバイオカバー。
- 請求項2の組成物を含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解用バイオフィルター。
- 前記バイオフィルターは酸素生成剤をさらに含む請求項7に記載のバイオフィルター。
- 請求項2〜4のいずれかの組成物をメタン又は悪臭誘発化合物の発生源に処理する段階と、
前記組成物がメタン又は悪臭誘発化合物を分解する段階とを含むメタン又は悪臭誘発化合物を分解する方法。 - 前記メタン又は悪臭誘発化合物の発生源は、廃棄物埋立地、ゴミ埋立地、廃水処理場、糞尿処理場、畜産廃水処理場、生ゴミ処理場、石油化学製品製造場、下水処理場、産業廃水処理場、家畜飼育場、食品加工工場、ペンキ製造工場、鋳物製造工場、石油精製施設、糞尿処理場、屠殺場、肥料製造工場、プラスチック製造焼却施設、塗装施設又はめっき工場である請求項9に記載の方法。
- メタン又は悪臭誘発化合物の発生源にバイオ活性層を設置することにより、メタン又は悪臭誘発化合物を生物学的に分解するメタン又は悪臭誘発化合物の分解システムにおいて、
前記バイオ活性層は、
請求項5のバイオカバーが少なくとも1つ積層されたバイオカバー層と、
前記バイオカバー層を覆う通気層又は前記バイオカバー層の下部に積層される通気層とを含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解システム。 - 前記メタン又は悪臭誘発化合物の発生源は、廃棄物埋立地、ゴミ埋立地、廃水処理場、糞尿処理場、畜産廃水処理場、生ゴミ処理場、石油化学製品製造場、下水処理場、産業廃水処理場、家畜飼育場、食品加工工場、ペンキ製造工場、鋳物製造工場、石油精製施設、糞尿処理場、屠殺場、肥料製造工場、プラスチック製造焼却施設、塗装施設又はめっき工場である請求項11に記載のシステム。
- メタン又は悪臭誘発化合物の発生源にバイオ活性層を設置することにより、メタン又は悪臭誘発化合物を生物学的に分解するメタン又は悪臭誘発化合物の分解システムにおいて、
前記バイオ活性層は、
請求項7のバイオフィルターが少なくとも1つ積層されたバイオフィルター層と、
前記バイオフィルター層を覆う通気層又は前記バイオフィルター層の下部に積層される通気層とを含むメタン又は悪臭誘発化合物の分解システム。 - 前記メタン又は悪臭誘発化合物の発生源は、廃棄物埋立地、ゴミ埋立地、廃水処理場、糞尿処理場、畜産廃水処理場、生ゴミ処理場、石油化学製品製造場、下水処理場、産業廃水処理場、家畜飼育場、食品加工工場、ペンキ製造工場、鋳物製造工場、石油精製施設、糞尿処理場、屠殺場、肥料製造工場、プラスチック製造焼却施設、塗装施設又はめっき工場である請求項13に記載のシステム。
- メタン又は悪臭誘発化合物を分解するためのスフィンゴモナス属(Sphingomonas sp.)MD2菌株(KCTC 11845BP)の用途。
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