JP2013522205A - 高分子薬物送達結合体ならびにその製造および使用方法 - Google Patents

Abstract

本明細書には、生物活性剤を被験者に効果的に送達するための生分解性薬物送達結合体が記載されている。薬物送達結合体は、第１の（主鎖）切断可能なリンカーによって互いに結合された複数の線状水溶性高分子セグメントを含む水溶性高分子量線状生分解性ポリマー骨格を含み、生物活性剤は、少なくとも１つの水溶性高分子セグメント、少なくとも１つの切断可能なリンカー、またはこれらの組み合わせに共有結合されている。本結合体は、従来技術の送達結合体を上回る多数の利点を有する。また本明細書には、本結合体を製造および使用するための方法も記載されている。
【選択図】なし

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１０年３月８日に出願された米国仮特許出願第６１／３１１，４５９号に対する優先権を主張する。本出願は、その教示の全てについて、参照によってその全体が本明細書に援用される。

配列表への相互参照
本明細書に記載されるペプチドは、配列番号（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ）によって参照される。配列番号は、数値的に、配列識別子＜４００＞１、＜４００＞２などに対応する。書面によるコンピューター可読フォーマット（ＣＦＲ）の配列表は、参照によってその全体が援用される。

承認
本発明につながる研究は、アメリカ国立衛生研究所（National Institutes of Health）（ＮＩＨ）認可番号ＧＭ０６９８４７、ＥＢ００５２８８、ＣＡ５１５７８、およびＣＡ１３２８３１によって一部資金提供を受けた。アメリカ政府は、本発明における特定の権利を有する。

背景
従来の合成ポリマー−薬物結合体（コンジュゲ―ト）は低分子量薬物を上回る多数の利益を提供するが、合成ポリマー薬物キャリア（例えば、ＨＰＭＡまたはＰＥＧ）の分子量は、腎閾値によって制限される。この結果、糸球体ろ過による結合体の急速な排除が起こり、循環時間が短くなり、そして血管透過性・滞留性亢進（ＥＰＲ）効果による腫瘍組織における蓄積が非効率的になる。

薬物キャリア結合体の分子量および分子量分布（ＭＷＤ）は、効果的な機能のために重要である。腎閾値は、結合体の流体力学的半径を４５Å未満に制限する。従って、高分子キャリアの分子量は３０〜４０ｋＤａ未満でなければならない（正確な値は、詳細な構造に依存する）。しかしながら、分子量の低下は循環系における結合体の滞留時間を短くすると同時に、薬学的な効率を低下させる。理想的な薬物キャリアは、糸球体ろ過による急速な損失を防止するために十分に高い分子量を有するべきである。高分子量（長時間循環する）ポリマー結合体は、ＥＰＲ効果のために腫瘍組織中に効率的に蓄積する。しかしながら、これらは、非分解性の骨格を有する場合には、種々の臓器に沈着および蓄積して、生体適合性を損ない得る。

概要
本明細書には、生物活性剤を被験者に効果的に送達するための生分解性薬物送達結合体が記載されている。薬物送達結合体は、第１の（すなわち、主鎖）切断可能なリンカーによって互いに結合された複数の線状水溶性高分子セグメントを含む水溶性高分子量線状生分解性ポリマー骨格を含み、生物活性剤は、少なくとも１つの水溶性高分子セグメント、少なくとも１つの切断可能なリンカー、またはこれらの組み合わせに共有結合されている。本結合体は、従来技術の送達結合体を上回る多数の利点を有する。また本明細書には、結合体を製造および使用するための方法も記載されている。以下に記載される利点は、特許請求の範囲において特に指摘される要素および組み合わせを用いて、実現および達成されるであろう。上記の一般的な説明および以下の詳細な説明がいずれも単に例示的および説明的なものに過ぎず、限定的なものではないことは理解されるべきである。

図面の簡単な説明
本明細書中に援用されて本明細書の一部を構成する添付図面は、以下に記載されるいくつかの態様を示す。

本明細書に記載される結合体を調製するための例示的な反応スキームを示す。 銅触媒によるアルキンおよびアジド１，３−双極性付加環化による、ヘテロテレケリック型（heterotelechelic）ポリＨＰＭＡ（Ｍｗ＝４１．８ｋＤａ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０５）のマルチブロックコポリマーへの鎖延長を示す。３７℃におけるクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中０．１４ｍｇ／ｍＬのパパインによる、マルチブロックコポリマー（選択画分、Ｍｗ＝２９１ｋＤａ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１１）のインキュベーションの結果、マルチブロックコポリマー骨格中のオリゴペプチド配列が完全に分解し、初期分子量（Ｍｗ＝４１．７ｋＤａ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０４）を有するポリマーが形成された。 初期テレケリック型α，ω−ジチオール−ポリＨＰＭＡ（Ｐ−Ｏｒｇ）、延長されたマルチブロックポリＨＰＭＡ画分（Ｐ−Ｅｘｔ）、ならびに（Ａ）カテプシンＢおよび（Ｂ）パパインによる異なる時間間隔でのインキュベーション後の分解生成物のＳＥＣプロファイルを示す。 メス胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウス中のｓ．ｃ．Ａ２７８０ＡＤ（耐性）ヒト卵巣癌異種移植片に対するＨＰＭＡコポリマー−ＤＯＸ結合体の増殖阻害を示す。従来のＤＯＸ結合体と比較して、高分子量マルチブロックＤＯＸ結合体は、より高い抗腫瘍活性（より高い腫瘍増殖の阻害）を実証した。 モデル酵素としてパパイン（２．０μＭ）を用いて、McIlvaine緩衝液（５０ｍＭのクエン酸／０．１Ｍのリン酸）中、ｐＨ６．０、３７℃で実施された、マルチブロックコポリマー画分（Ｍｎ３０６ｋＤａ、ＰＤＩ１．０９）の分解を示し、分解されたＨＰＭＡコポリマー（Ｍｎ４７ｋＤａ、ＰＤＩ１．０１）が得られる。パパイン（１０μＭ）中でパクリタキセル（５．４重量％）がコポリマー結合体から切断された。

詳細な説明
本発明の化合物、組成物、および／または方法を開示および説明する前に、以下に記載される態様が特定の化合物、合成方法、または使用に制限されず、従って、当然ながら変わり得ることは理解されるべきである。また、本明細書中で使用される用語が特定の態様だけを説明するためのものであり、限定することを意図しないことも理解されるべきである。

本明細書において、そしてそれに続く特許請求の範囲において、以下の意味を有するように定義されるべきいくつかの用語が言及されるであろう。

本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形の「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限りは複数の指示対象も含むことに注意しなければならない。従って、例えば、「単数形のモノマー」への言及は、このようなモノマーの２つ以上の混合物なども含む。

「任意的な（optional）」または「任意的に（optionally）」は、続いて記載される事象または状況が発生してもしなくてもよく、その記載が、その事象または状況が発生する場合および発生しない場合を含むことを意味する。例えば、「任意的に置換された低級アルキル」という語句は、低級アルキル基が置換されていても置換されていなくてもよく、その記載が、非置換の低級アルキルおよび置換のある低級アルキルを両方とも含むことを意味する。

組成物または物品中の特定の要素または成分の重量部に対する本明細書および最終の特許請求の範囲における言及は、その要素または成分と、組成物または物品中の他の任意の要素または成分との間の重量関係（このために、重量部が示される）を示す。従って、２重量部の成分Ｘおよび５重量部の成分Ｙを含有する化合物において、ＸおよびＹは２：５の重量比で存在し、付加的な成分が化合物中に含有されるかどうかに関係なくこのような比率で存在する。

成分の重量パーセントは、特に反することが記載されない限り、成分が含有されている製剤または組成物の全重量に基づく。

化学種の残基は、本明細書および最終の特許請求の範囲において使用される場合、特定の反応スキームにおいて得られる化学種の生成物またはその後の製剤または化学生成物である部分を指し、その部分が化学種から実際に得られたかどうかに関係ない。例えば、少なくとも１つの−ＮＨ_２基を含有するアミノ酸は式Ｈ−Ｙ−ＯＨで表すことができ、ここで、Ｙはアミノ酸分子の残りの部分（すなわち残基、−ＨＮ−ＣＨＲ−ＣＯ−）である。

「アルキル基」という用語は、本明細書で使用される場合、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシルなどの、１〜２４個の炭素原子を有する分枝状または非分枝状の飽和炭化水素基である。「低級アルキル」基は、１〜６個の炭素原子を含有するアルキル基である。

「アリール基」という用語は、本明細書で使用される場合、任意の炭素ベースの芳香族基であり、ベンゼン、ナフタレンなどを含むがこれらに限定されない。「芳香族」という用語は、芳香族基の環内に取り込まれた少なくとも１つのヘテロ原子を有する芳香族基であると定義される「ヘテロアリール基」も含む。へテロ原子の例としては、窒素、酸素、硫黄、およびリンが挙げられるが、これらに限定されない。アリール基は置換されていてもよいし、非置換であってもよい。アリール基は、アルキル、アルキニル、アルケニル、アリール、ハライド、ニトロ、アミノ、エステル、ケトン、アルデヒド、ヒドロキシ、カルボン酸、またはアルコキシを含むがこれらに限定されない１つまたは複数の基によって置換され得る。

「シクロアルキル基」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｃ_３〜Ｃ_８環状基である。シクロアルキルは完全不飽和であってもよいし、１以上の不飽和度を有することもできる。「シクロアルキル」という用語は、環内に取り込まれた少なくとも１つのヘテロ原子を有するシクロアルキル基も含む。へテロ原子の例としては、窒素、酸素、硫黄、およびリンが挙げられるが、これらに限定されない。シクロアルキル基は置換されていてもよいし、非置換であってもよい。

「親水基」という用語は、本明細書で使用される場合、結合体の水溶性を高める任意の基である。親水基は、結合体において水溶性単位を生じるために使用される１つまたは複数のモノマー上に存在し得る。このような基の例としては、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、ＳＯ_３Ｈ基、または双性イオン基が挙げられるが、これらに限定されない。

本出願を通して使用されるＡＡ_１、ＡＡ_２、Ｌ、Ｌ^１、Ｘ、Ｙ、およびＺなどの変数は、反することが記載されない限り、これまでに定義された変数と同じである。

本明細書には、生物活性剤の送達において有用な薬物送達結合体が記載されている。結合体は、第１の（すなわち、主鎖）切断可能なリンカーによって互いに結合された複数の線状水溶性高分子セグメントを含む水溶性高分子量線状生分解性ポリマー骨格を含み、生物活性剤は、少なくとも１つの水溶性高分子セグメント、少なくとも１つの切断可能なリンカー、またはこれらの組み合わせに共有結合されている。結合体の各成分は、以下に詳細に記載される。

結合体は、５０ｋＤａ〜７５０ｋＤａの分子量を有する線状ポリマーである。１つの態様では、結合体の分子量は、５０ｋＤａ、６０ｋＤａ、７０ｋＤａ、８０ｋＤａ、９０ｋＤａ、１００ｋＤａ、１２５ｋＤａ、１５０ｋＤａ、１７５ｋＤａ、２００ｋＤａ、２２５ｋＤａ、２５０ｋＤａ、２７５ｋＤａ、３００ｋＤａ、３２５ｋＤａ、３５０ｋＤａ、３７５ｋＤａ、４００ｋＤａ、４２５ｋＤａ、４５０ｋＤａ、４７５ｋＤａ、５００ｋＤａ、５５０ｋＤａ、６００ｋＤａ、６５０ｋＤａ、７００ｋＤａ、７５０ｋＤａ、またはこれらの値に基づいた任意の範囲である。結合体は線状ポリマーであって、分枝状ポリマーではない。言い換えると、結合体は、抗癌剤、標的部分（抗体、抗体断片、アプタマー、ペプチド、オリゴ糖など）の付着のためのアンカーの機能を果たす単一の線状高分子骨格を有する。

以下でより詳細に議論されるように、生物活性剤は、切断可能なリンカーを介して、結合体の高分子骨格から垂下していてもよい。しかしながら、垂下している生物活性剤はそれ自体は高分子基ではなく、従って「高分子分枝」ではない。結合体の各成分は、以下に詳細に議論される。

結合体の水溶性成分は、比較的低い分子量を有する高分子セグメントである。１つの態様では、水溶性高分子セグメントは、５ｋＤａ、１０ｋＤａ、１５ｋＤａ、２０ｋＤａ、２５ｋＤａ、３０ｋＤａ、３５ｋＤａ、または４０ｋＤａの分子量を有する。水溶性高分子セグメントは、水と相互作用をして、結果として得られる結合体を水に可溶性にする１つまたは複数の親水基を有する。このような基の例には、例えば、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、カルボキシル基、ＳＯ_３Ｈ基、双性イオン基などの、プロトンを容易に受取または供与する任意の有機基が含まれる。

１つの態様では、水溶性高分子セグメントは、１つまたは複数の不飽和水溶性モノマーの重合生成物を含む。式Ｉ

（式中、Ｒ^１は、水素またはメチルであり、
Ｘは、ＯまたはＮＲ^２であり、ここで、Ｒ^２は水素またはアルキル基であり、
Ｌは、アルキル基、アリール基、またはシクロアルキル基であり、そして
Ｙは、親水基である）
を有する水溶性モノマーを使用して、水溶性高分子セグメントを生成することができる。

１つの態様では、Ｒ^１はメチルであり、ＸはＮＨであり、そしてＬは、例えば、メチレン基、エチレン基、またはイソプロピレン基などのＣ_１〜Ｃ_５アルキル基である。別の態様では、水溶性モノマーは、Ｎ−置換メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−二置換アクリルアミド、メタクリル酸もしくはアクリル酸の親水性エステル、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、スルホエチルメタクリレート、アクリル酸、メタアクリル酸、またはこれらの任意の組み合わせを含む。別の態様では、水溶性モノマーは、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、Ｎ−［３−（Ｎ’−ジカルボキシメチル）アミノプロピル］メタクリルアミド（ＤＡＭＡ）、Ｎ−メタクリロイルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシン−アミノマロン酸（ＭＡ−ＧＦＬＧ−ｄｉＣＯＯＨ）、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、またはこれらの任意の組み合わせを含む。

水溶性高分子セグメントは、当該技術分野において既知の技術を用いて作ることができる。実施例では、本明細書に記載される結合体において有用な水溶性高分子セグメントを作るための例示的な合成プロトコールも提供される。

１つの態様では、結合体中に存在する第１の切断可能なリンカーは、１つまたは複数のアミノ酸残基から構成される。第１の切断可能なリンカーは、リンカーがポリマー骨格中に存在する場合には、本明細書では主鎖切断可能なリンカーとも呼ばれる。例えば、第１の切断可能なリンカーは、２〜１３個のアミノ酸残基を有するペプチドであり得る。アミノ酸またはアミノ酸の配列を変化させることによって、特定の条件下で切断されるように第１の切断可能なリンカーを設計することが可能である。第１の切断可能なリンカーは血流中でかなり安定であるが、酵素と接触すると分解することが望ましい。

第１の切断可能なリンカーは、酵素によって切断可能である。１つの態様では、リンカーは、リソソーム酵素によって切断される。リソソーム酵素には、ペプチド結合を加水分解する能力を有するいくつかのプロテイナーゼ（例えば、カテプシンＢ、Ｌ、ＤまたはＫ）が含まれる。切断可能なリンカーのリソソーム加水分解の速度は、リンカー中に存在するアミノ酸残基の数および性質の両方に依存する。これは、立体的因子および構造的因子の両方の反映である。１つの態様では、第１の切断可能なリンカーは、アミノ酸配列−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｎｌｅ−（配列番号１）、−Ｃｉｔ−Ｐｈｅ−（配列番号２）、−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−（配列番号３）、−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−（配列番号４）、−Ａｒｇ−Ａｒｇ−（配列番号５）、Ｖａｌ−Ｃｉｔ（配列番号６）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ（配列番号７）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ（配列番号８）、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号９）、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ（配列番号１０）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ（配列番号１１）、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｌａ、Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｌａ（配列番号１２）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１３）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ（配列番号１４）、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ（配列番号１５）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ（配列番号１６）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号１７）、Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ（配列番号１８）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ（配列番号１９）、Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号２０）、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（配列番号２１）、およびＧｌｎ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（配列番号２２）を有するペプチドである。

別の態様では、第１の切断可能なリンカーは、式ＩＩＩ
−（ＡＡ_１）−Ｋ−（ＡＡ_２）− （ＩＩＩ）
を有し、式中、
ＡＡ_１およびＡＡ_２は、６個までのアミノ酸を含む同一または異なるアミノ酸配列であり、そして
Ｋは、リジン、オルニチン、またはジアミン（例えば、エチレンジアミン、ヘキサメチレンジアミンなど）である。ＡＡ_１およびＡＡ_２は、上記の任意のアミノ酸配列であり得る。

他の態様では、第１の切断可能なリンカーは、加水分解的に切断することができる基である。例えば、リンカーは、ｐＨの変化（例えば、カルボキシアルキルマレイン酸リンカーまたはアスコルビン酸リンカー）、またはこれらの組み合わせによって切断され得る。

第１の切断可能なリンカーは、当該技術分野において既知の技術を用いて作ることができる。実施例では、切断可能なリンカーを作るための例示的な合成プロトコールが提供される。切断可能なリンカーを水溶性高分子セグメントに連結させるための方法は、以下で詳細に議論される。

様々な生物活性剤を本明細書において使用することができる。生物活性剤は、結合体中の少なくとも１つの水溶性高分子セグメント、少なくとも１つの切断可能なリンカー、またはこれらの組み合わせに供給結合され得る。生物活性剤を結合体に共有結合させるための方法は以下に詳細に記載されており、例示的な手順は実施例において記載される。１つの態様では、２つ以上の異なる生物活性剤が結合体に共有結合されている。１つの態様では、生物活性剤は、抗癌剤、抗菌剤、抗寄生虫薬、抗炎症剤、心臓血管薬、または神経系に作用する薬物である。別の態様では、生物活性剤は、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、白金酸塩（シスプラチン、カルボプラチン、ＤＡＣＨ−Ｐｔ）、ドキソルビシン、ゲルダナマイシン、または９−アミノカンプトテシンを含む。

１つの態様では、生物活性剤が水溶性高分子セグメントに共有結合される場合、水溶性高分子セグメントは、上記のような１つまたは複数の不飽和水溶性モノマーと、式ＩＩ

を含むモノマーとの重合生成物を含み、式中、
Ｒ^１は、水素またはメチルであり、
Ｘは、ＯまたはＮＲ^２であり、ここで、Ｒ^２は水素またはアルキル基であり、
Ｌ^１は、第２の（すなわち、側鎖）切断可能なリンカーであり、そして
Ｚは、生物活性剤である。

この態様では、生物活性剤は、第２のリンカーＬ^１を介して不飽和モノマーに連結される。第２の切断可能なリンカーは、本明細書では側鎖リンカーとも呼ばれ、リンカーは高分子骨格の一部ではないが、骨格から垂下する。第２の切断可能なリンカーは、結合体のポリマー骨格中の第１の切断可能なリンカーのペプチドと同じペプチドでも異なるペプチドでもよい。式ＩＩを有する化合物を作るための例示的な方法は実施例において提供される。

特定の態様では、結合体には、細胞に対する結合体の特異性を改善するために１つまたは複数の標的基が共有結合されている。例えば、標的基は、水溶性高分子セグメント、第１の切断可能なリンカー、またはこれらの組み合わせに共有結合され得る。標的基は、スペーサーを用いずにアミド結合またはエステル結合のいずれかによってポリマー骨格に直接連結されてもよいし、あるいはアミノ酸またはペプチドスペーサーを介して連結されてもよい。標的基は、標的細胞上の特異的受容体によって到達可能でなければならず、これは、高分子薬物分子の幾何学と大きく相関する。

１つの態様では、標的基は、メタクリルアミド、メタアクリル酸またはＮ−メタクリロイル化アミノ酸もしくはペプチドに結合される。例えば、上記の式ＩＩを参照して、Ｚは生物活性剤の代わりに標的基であることも可能であり、これは、式ＩＩを有し、生物活性剤を含有する他のモノマーと重合させることができる。

標的基として、細胞表面の抗原または受容体に相補的な構造を使用することができる。１つの態様では、標的基は、抗体、抗体断片、糖類、またはエピトープ結合ペプチド、またはアプタマーである。例えば、標的基は、アミド結合によって結合された単糖、二糖、オリゴ糖もしくはメタクリロイル化糖類単位、ＩｇＧ（ラット免疫グロブリン）などの抗体もしくは抗体断片、またはトランスフェリンもしくはメラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）などのタンパク質、またはペプチドであり得る。別の態様では、標的基は、ガラクトサミン、フコシルアミン、ラクトース、葉酸誘導体、ホルモン（例えば、ＭＳＨ、セクレチン）、オピエート、モノクローナルおよびポリクローナル抗体である。１つの態様では、標的基は、ＣＤ４７（卵巣癌細胞の大部分において発現される）に特異的なＯＶ−ＴＬ１６抗体からのＦａｂ’、または前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）に対する抗体である。

本明細書に記載される結合体は、医薬組成物を生成するために、生物系または生物体が耐容性であり得る任意の賦形剤中に配合することができる。このような賦形剤の例としては、水、ヒアルロン酸水溶液、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、ハンクス液、および他の生理学的にバランスのとれた塩水溶液が挙げられるが、これらに限定されない。固定油、植物油（オリーブ油およびゴマ油など）、トリグリセリド、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射可能な有機エステル（オレイン酸エチルなど）などの非水系媒体も使用することができる。その他の有用な製剤には、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、またはデキストランなどの粘度増強剤を含有する懸濁液が含まれる。賦形剤は、等張性および化学安定性を高める物質などの少量の添加剤も含有し得る。緩衝液の例としては、リン酸緩衝液、重炭酸緩衝液およびトリス緩衝液が挙げられ、防腐剤の例としては、チメロソール（thimerosol）、クレゾール、ホルマリンおよびベンジルアルコールが挙げられる。特定の態様では、ｐＨは投与モードに応じて変更され得る。例えば、組成物のｐＨは約６．５〜約７．５であり、これは、局所適用に適している。さらに、医薬組成物は、本明細書に記載される化合物の他に、キャリア、増粘剤、希釈剤、防腐剤、表面活性剤などを含むことができる。

医薬組成物は、本明細書に記載される結合体と組み合わせて使用される１つまたは複数の活性成分も含むことができる。得られる医薬組成物は、適用部位に隣接した組織または適用部位から離れた組織への、薬物および他の生物活性剤の持続した連続送達のためのシステムを提供することができる。生物活性剤は、それが適用される生物系において局所性または全身性の生物学的、生理学的または治療的な効果を提供することができる。例えば、生物活性剤は、その他の機能として、感染または炎症を調節およびまたは防止し、細胞増殖および組織再生を増強し、腫瘍増殖を調節し、鎮痛剤としての機能を果たし、抗細胞接着を促進し、歯槽骨および歯の脱落を低減し、軟骨および体重を支持する関節の変性を阻害し、そして骨成長を高めるように作用することができる。さらに、本明細書に記載される結合体はどれも、２つ以上の薬学的に許容可能な化合物の組み合わせを含有することができる。このような化合物の例としては、抗菌剤、他の抗炎症剤、他の抗癌剤または抗転移剤、鎮痛剤、麻酔剤などが挙げられるが、これらに限定されない。

医薬組成物は、当該技術分野において既知の技術を用いて調製することができる。１つの態様では、組成物は、本明細書に記載される結合体と、薬学的に許容可能な化合物および／またはキャリアとを混合することによって調製される。「混合」という用語は、化学反応または物理的相互作用が起こらないように２つの成分を一緒に混ぜ合わせることであると定義される。「混合」という用語は、化合物と、薬学的に許容可能な化合物との間の化学反応または物理的相互作用も含む。

特定の場合の結合体の実際の好ましい量は、使用されている特定の化合物、配合される特定の組成物、適用モード、ならびに処置される特定の位置および対象に従って変わり得ることが認識されるであろう。所与の宿主に対する投与量は、従来の考察を用いて、例えば、主題の化合物と既知の薬剤との異なる活性の習慣的な比較によって、例えば、適切な従来の薬理学的プロトコールによって決定することができる。医薬化合物の用量を決定する技術に精通した医師および配合者は、標準的な推奨（(Physicians Desk Reference, Barnhart Publishing (1999)）に従って用量を決定することに全く問題ないであろう。

結合体の調製方法も本明細書において記載されている。図１は、結合体を生成するための一般的な反応スキームを提供する。図１を参照すると、反応１および２は、クリック反応を用いてビス−アジド化合物をビス−アルキン化合物にカップリングさせ、結合体を生成することを含む。式１において、ビス−アジド化合物は水溶性ポリマー（ポリＨＰＭＡ）であり、生物活性剤（すなわち、薬物）がポリマーに共有結合されている。式１においてビス−アジドは、酵素切断可能なペプチド（すなわち、第１の（主鎖）切断可能なリンカー）から構成されるビス−アルキンとカップリングされて、結合体を生成する。式２には別のアプローチが示されており、ビス−アジド化合物は、ポリマーに共有結合された生物活性剤を有する酵素切断可能なペプチドである。式２において、Ｒは、アルキン基でキャップされたリンカーである。

式３における別のアプローチは、マルチセグメントコポリマー結合体を調製するための、生物活性剤（すなわち、薬物）および酵素切断可能なペプチドの結合体を含有するヘテロテレケリック型ＨＰＭＡコポリマーのクリックカップリングである。ヘテロテレケリック型ＨＰＭＡコポリマー結合体は、アジドまたはアルキン変性ペプチド含有連鎖移動剤を用いるＲＡＦＴ共重合によって合成することができる。

式４は、ビス−アルキン化合物が水溶性ポリマー（ポリＨＰＭＡ）であり、生物活性剤（すなわち、薬物）がポリマーに結合されているアプローチを示す。

図１の式５および６には、結合体を生成するためのチオール−エン（例えば、マレイミド−チオール）反応の一例が記載される。チオール末端ポリマーは、ＲＡＦＴ重合によって容易に調製することができる。高効率チオール−エン反応は金属触媒を必要とせず、水および酸素と適合性であり、溶媒の非存在下、光化学開始において実施することができる。

図１の式７は、ＨＰＭＡコポリマー鎖の延長のためのヘテロディールス−アルダー反応の一例を提供する。この反応は高効率であり、触媒を必要としない。

図１の式８は、加水分解的に切断可能な結合を結合体のポリマー骨格に導入するための合成戦略を提供する。１，３−ジオキセパンは重合および開環を受けて、エステル結合を有するポリマーを生成する。エステル結合は、エステル基を加水分解して結合体を切断するために、ｐＨの調整によって切断することができる。

図１の式９は、ジピリジルジスルフィド、ＤＭＳＯなどの酸化剤を用いることによって、ＨＰＭＡコポリマー結合体の延長の一例を提供する。

実施例は、本明細書に記載される結合体を製造するための多数の合成戦略および手順を提供する。

本明細書に記載される結合体は水溶性および生分解性である。結合体は循環中安定であり、長い滞留時間を有し、そしてより良い標的特性を有する。さらに、リンカーの切断（例えば、酵素的、加水分解的など）後に体内から除去することができる。本明細書に記載されるような結合体の合成は用途が広く、それぞれに適した特性（循環時間および分解の速度／部位など）を有する多様なポリマー構造の調製を可能にする。さらに、結合体は、（１）不安定な薬物の劣化からの保護、（２）結合された薬物の非特異的な毒性の低下、（３）標的指向化による標的部位における薬物の能動的な蓄積の増大および／またはＥＰＲ効果による腫瘍部位における薬物の受動的な蓄積の増大、ならびに（４）同一の標的部位に対して異なる（相補的な）特性を有する２つ以上の薬物を送達し、協同的および／または相乗的な効果により薬物効率を高める能力のような、付加的な利点を有する。これらは、生物活性剤を被験者へ送達する際に、本明細書に記載される結合体が効果的である理由のほんの一部である。

開示される組成物および方法の所与の特定の態様はどれも、実施例において議論される非多糖類ベースの試薬を含む、本明細書に開示される特定の実施例および実施形態と容易に比較され得ることが理解される。このような比較を行うことによって、それぞれの特定の実施形態の相対的な効力を容易に決定することができる。特に好ましい組成物および方法は、本明細書中、実施例において開示されており、これらの組成物および方法は、必ずしも限定することはないが、本明細書に開示される組成物および方法のいずれかを用いて実施され得ることが理解される。

実施例
以下の実施例は、本明細書において記載および請求される化合物、組成物、および方法がどのように製造および評価されるかについての完全な開示および説明を当業者に提供するように提示されており、単に例示であることが意図され、本発明者らが本発明であると考えるものの範囲を限定することは意図されない。数（例えば、量、温度など）に関する正確さを保証するための努力が成されているが、いくらかの誤差および偏差は説明されるべきである。他に示されない限り、部は重量部であり、温度は℃で示されるか周囲温度であり、圧力は大気圧またはその付近である。記載されるプロセスから得られる生成物の純度および収率を最適化するために使用され得る反応条件、例えば、成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力および他の反応範囲および条件には、多数のバリエーションおよび組み合わせがある。このようなプロセス条件を最適化するために、合理的で日常的な実験が必要とされるのみであろう。

略語。ＣＴＡ、連鎖移動剤；ＣＴＰ、４−シアノ−４−チオベンゾイルスルファニル−ペンタン酸；Ｄａ、ダルトン；ＤＣＣ、ジシクロヘキシルカルボジイミド；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＤＣＵ、ジシクロヘキシル尿素；Ｄｄｅ、１−（４，４−ジメチル−２，６−ジオキサシクロヘキシリデン）エチル；ＤＩＡＤ、アゾジカルボン酸ジイソプロピル；ＤＩＰＥＡ、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン；ＤＭＡＰ、４−ジメチルアミノピリジン；ＤＭＦ、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド；ＤＯＸ、ドキソルビシン；ＤＴＸ、ドセタキセル；ＥＤＣＩ、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド；ＥＰＲ、血管透過性・滞留性亢進；ＥｔＯＡｃ、酢酸エチル；Ｆｍｏｃ、フルオレニルメチルオキシカルボニル；ＨＢＴＵ、Ｏ−ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−ウロニウム−ヘキサフルオロ−ホスファート；ＨＯＢｔ、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール；ＨＰＭＡ、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド；ＭＡ、メタクリロイル；ＭＡＬ、マレイミド；ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間；ＭＡ−ＮＨ_２、３−アミノプロピルメタクリルアミド；Ｍｎ、数平均分子量；ＭＳ、質量分析；Ｍｗ、重量平均分子量；ＭＷＤ、分子量分布；ＮＭＰ、１−メチル−２−ピロリジノン；ＰＤＩ、多分散性＝Ｍｗ／Ｍｎ；ＰＥＧ、ポリ（エチレングリコール）；ＰＨＰＭＡ、ポリＨＰＭＡ；ＰＳＭＡ、前立腺特異的膜抗原；ＲＡＦＴ、可逆的付加開裂連鎖移動；ＲＰ−ＨＰＬＣ、逆相高速液体クロマトグラフィ；ＳＥＣ、サイズ排除クロマトグラフィ；ＳＰＰＳ、固相ペプチド合成；ＴＣＥＰ．ＨＣｌ、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩；ＴＦＡ、トリフルオロ酢酸；ＴＬＣ、薄層クロマトグラフィ；ＴＴ、チアゾリジン−２−チオン；ＴＴＣ、トリチオカルボネート。

官能基の導入のための重合性薬物誘導体およびコモノマーの合成実施例
実施例１． ＭＡ−ＧＦＬＧ−ゲムシタビンの合成
Ｎ−メタクリロイルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシル−チアゾリジン−２−チオン（ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＴＴ）の合成

ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＴＴの合成は、わずかな変更を加えて、公開された手順［V. Subr et al., Reactive & Functional Polymers 66 1525-1538 (2006)］に従った。窒素雰囲気下、Ｎ−メタクリロイルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシン（ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＯＨ、３２０ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）、２−メルカプトチアゾリン（８３．５ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（８５．５ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）をジクロロメタン（ＤＣＭ）（２０ｍＬ）中に溶解させた。溶液を−１０℃で５分間攪拌し、ＥＤＣＩ（１３４．２ｍｇ、０．７ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を−１０℃で３時間、そして室温でさらに１２時間攪拌した。反応の後、５０ｍＬのＤＣＭを添加し、溶液をＮａＨＣＯ_３水（０．１Ｍ）、ＨＣｌ（０．１Ｍ）、そして次にＮａＣｌ水で洗浄した。有機層を乾燥（ＭｇＳＯ_４）させ、溶媒を回転蒸発により除去し、カラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０Å、２００〜４００メッシュ、ＥｔＯＡｃ：ＣＨ_３ＯＨ、１５：１）により粗生成物を精製し、次にＤＣＭから再結晶して、黄色の粉末を５１．９％の収率で得た。構造は、^１ＨＮＭＲおよび^１３ＣＮＭＲ分光法によって確認した。^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３、δ（ｐｐｍ））：０．８６（ｍ，６Ｈ，ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、１．５１（ｍ，２Ｈ，ＣＨＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、１．６６（ｍ，１Ｈ，ＣＨ（ＣＨ_３）_２）、１．９１（ｓ，３Ｈ，ＣＣＨ_３）、３．０３（ｍ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＨ_２）、３．３３（ｔ，２Ｈ，ＳＣＨ_２）、４．００（ｓ，２Ｈ，ＮＨＣＨ_２ＣＯ）、４．５４（ｔ，２Ｈ，ＮＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ）、４．６３（ｍ，１Ｈ，ＮＨＣＨＣＯ）、４．７３（ｍ，１Ｈ，ＮＨＣＨＣＯ）、４．８１（ｓ，２Ｈ，ＮＨＣＨ_２ＣＯ）、５．３９（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ_２）、５．７７（ｓ，１Ｈ，Ｃ＝ＣＨ_２）、６．９９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）、７．１８（ｍ，６Ｈ，ＮＨ、Ｐｈ−Ｈ）、７．５６−７．８０（ｍ，２Ｈ，ＮＨ）。^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３、δ（ｐｐｍ））：２０１．７８、１７２．６、１７０．９２、１７０．５７、１６９．３３、１６８．９９、１３９．０２、１３６．４６、１２９．７７、１２８．８０、１２７．２１、１２１．３１、５６．１１、５４．８９、５１．８３、４６．８５、４３．６１、４１．８１、３９．３７、２９．３７、２４．８８、２２．８６、１８．２１。

Ｎ−メタクリロイルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシル−ゲムシタビン（ＭＡ−ＧＦＬＧ−ゲムシタビン）の合成

ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＴＴ（９０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）およびゲムシタビン塩酸塩（４４．９５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下でピリジン（５ｍＬ）中に溶解させた。溶液を５０℃で１２時間攪拌してから、溶媒を回転蒸発により除去した。カラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０Å、２００〜４００メッシュ、ＤＣＭ：ＣＨ_３ＯＨ、６：１）により粗生成物を精製して、白色固体を６６．１％の収率で得た。構造は、^１ＨＮＭＲ分光法およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析によって確認した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ７０６．２２（ｍ＋Ｈ）^＋、７２８．２１（Ｍ＋Ｎａ）^＋、７４４．１９（Ｍ＋Ｋ）^＋。

同一のアプローチを用いて、ＭＡ−ＧＦＴＡ−ゲムシタビン、ＭＡ−ＧＦＡ−ゲムシタビン、ＭＡ−ＧＬＡ−ゲムシタビン、ＭＡ−ＧＩＡ−ゲムシタビン、ＭＡ−Ａｃａｐ−Ｖ−Ｃｉｔ−ゲムシタビン（ＡｃａｐはＮ^ε−アミノカプロン酸であり、Ｃｉｔはシトルリン（citruline）である）などの、酵素分解可能なオリゴペプチド配列を含有する重合性ゲムシタビン誘導体を合成することができる。

実施例２． Ｎ−メタクリロイルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシル−アミノマロン酸（ＭＡ−ＧＦＬＧ−マロン酸）の合成

窒素雰囲気下、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＯＨ（４００ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）、アミノマロン酸ジエチル塩酸塩（１８４ｍｇ、０．８７ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（１２１．６ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解させた。溶液を氷浴中で５分間攪拌し、ＤＩＰＥＡ（３１０ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を添加してから、ＨＢＴＵ（３４１．３ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を氷浴中で３０分間、そして室温で一晩攪拌した。反応の後、酢酸エチル（ＥｔＯＡｃ）（５０ｍＬ）を添加し、有機溶液をＮａＨＣＯ_３水（飽和）およびＨＣｌ（１Ｍ）、次にＮａＣｌ水で洗浄した。溶液を乾燥（ＭｇＳＯ_４）させ、回転蒸発により体積を１５ｍＬまで減少させた。ＥｔＯＡｃおよびエーテルからの再結晶によって８５％の収率で生成物（ＭＡ−ＧＦＬＧ−ｄｉＣＯＯＥｔ）を得て、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により構造を特徴付けた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ６４０．１０［（Ｍ＋Ｎａ）^＋、Ｃ_３０Ｈ_４３Ｎ_５Ｏ_９Ｎａ］。ＭＡ−ＧＦＬＧ−ｄｉＣＯＯＥｔ（３００ｍｇ、０．４９ｍｍｏｌ）をＣＨ_３ＯＨ（１０ｍＬ）中に溶解させた。溶液を氷浴中で５分間攪拌してから、ＣＨ_３ＯＨ（５ｍＬ）中のＮａＯＨ（１Ｍ、０．４９ｍｍｏｌ）を液滴で添加した。溶液を氷浴中でさらに２時間、そして室温でさらに１時間攪拌した。反応の後、ＭｅＯＨを除去し、溶液をＨＣｌ（１Ｍ）によりｐＨ＝２〜３まで酸性化し、分離し、ＥｔＯＡｃ（２５×３）により水を抽出した。有機溶液を乾燥（ＭｇＳＯ_４）させ、溶媒を回転蒸発により除去した。ＥｔＯＡｃからの再結晶により最終生成物（ＭＡ−ＧＦＬＧ−ｄｉＣＯＯＨ）を７６％の収率で得た。

実施例３． ２’−Ｏ−メタクリロイルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシル−ドセタキセル（ＭＡ−ＧＦＬＧ−ドセタキセル）の合成

ＭＡ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ（８４ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）、ドセタキセル（１４７ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２１ｍｇ、０．１７ｍｍｏｌ）を０．７５ｍＬのＤＭＦ中に溶解させ、０℃まで冷却し、０．１５ｍＬのＤＭＦ中のジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、４５ｍｇ、０．２２ｍｍｏｌ）溶液を液滴で添加した。反応混合物を０℃で２時間、そして室温でさらに２４時間攪拌した。ジシクロヘキシル尿素（ＤＣＵ）をろ過により除去した後、ＤＭＦを真空中で除去し、残渣を酢酸エチルで希釈した。少量のＤＣＵを再度ろ過により除去し、ろ液をＫＨＳＯ_４水、ＮａＨＣＯ_３水、ＮａＣｌ水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させた。乾燥した溶液をほぼ蒸発乾固させ、残渣をエーテルにより粉状にし、１２０ｍｇの白色粉末を得た。

１５分間で７５％から８５％までのＢの勾配の後、２０分間で８５％から８８％までの勾配を用いて、分取用ＲＰ−ＨＰＬＣカラム（VYDAC^ＴＭC18、２２×２５０、１０μｍ、流速５ｍｌ／分）における精製によって、純粋なモノマーを得た。緩衝液Ａは水中０．１％のＴＦＡであり、緩衝液Ｂは９０％のＭｅＯＨ中０．１％のＴＦＡであった。生成物は３２分間で溶出された。モノマーの純度は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって評価し（計算値Ｍ^＋：１２４９．４、実測値：１２７２．６４ Ｍ＋Ｎａ）、２’−Ｏ−エステルの形成は、^１ＨＮＭＲ分光法によって検証した。

実施例４． ２’−Ｏ−メタクリロイルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシル−パクリタキセル（ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＰＴＸ）の合成（スキーム１）
窒素雰囲気下、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＯＨ（１２９ｍｇ、０．２８ｍｍｏｌ）、パクリタキセル（２００ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（５０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中に溶解させた。溶液を０℃で１５分間攪拌し、ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中のＤＣＣ（２００ｍｇ、０．９７ｍｍｏｌ）を液滴で添加し、溶液を４℃で２４時間攪拌した。反応溶媒を減圧下で回転蒸発により除去した。ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）を添加し、ＤＣＵをろ過により除去し、溶液をＫＨＳＯ_４水（０．１Ｍ）、ＮａＨＣＯ_３（１Ｍ）、そして次にＮａＣｌ水で洗浄し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させた。溶液を回転蒸発により除去した。カラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０Å、２００〜４００メッシュ、ＥｔＯＡｃ：ＣＨ_３ＯＨ、１５：１）により粗生成物を精製して、白色固体を６８％の収率で得た（２０６ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ）。構造は、^１ＨＮＭＲ分光法およびマトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分析によって確認した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ１３１８．６８（［Ｍ＋Ｎａ］^＋）。

同一のアプローチを用いて、ＭＡ−ＧＬＬＧ−ＰＴＸ、ＭＡ−ＡＧＶＦ−ＰＴＸ、ＭＡ−Ａｃａｐ−Ｃｉｔ−Ｆ−ＰＴＸ（ＡｃａｐはＮ^ε−アミノカプロン酸であり、Ｃｉｔはシトルリンである）、ＭＡ−ＧＦＡ−ＰＴＸ、ＭＡ−ＧＦＧＦ−ＰＴＸなどの、異なるオリゴペプチドスペーサーを含有するパクリタキセル（および他の抗癌剤、ドセタキセル、ゲムシタビン、エピルビシンなど）の重合性誘導体が合成されるであろう。これらの（コ）モノマーは、標的のマルチブロック生分解性ＨＰＭＡコポリマー−抗癌剤結合体の合成において使用されるであろう。

開始系のコモノマーの合成実施例
実施例５． 鎖末端修飾のための４，４’−アゾビス（Ｎ，Ｎ’−プロパルギル−４−シアノペンタンアミド）（ジアルキン−Ｖ−５０１）の合成（スキーム２）
窒素雰囲気下、４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）（ＣＴＰ、５００ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）、プロパルギルアミン（２０１．０４ｍｇ、３．６５ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（４９９．９ｍｇ、３．７ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）中に溶解させた。溶液を氷浴中で５分間攪拌し、ＤＩＰＥＡ（６４６ｍｇ、５．０ｍｍｏｌ）を添加してから、ＨＢＴＵ（１．４ｇ、３．７ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を氷浴中で３０分間、そして室温で一晩攪拌した。反応の後、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ）を添加し、有機溶液をＮａＨＣＯ_３水（飽和）およびＨＣｌ（１Ｍ）、次にＮａＣｌ水で洗浄した。溶液を乾燥（ＭｇＳＯ_４）させ、回転蒸発により１５ｍＬまで濃縮した。ＥｔＯＡｃおよびエーテルによる再結晶によって７５％の収率で最終生成物を得た。^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３、δ（ｐｐｍ））：１．４４（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_３）、１．７２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_３）、２．２１（ｍ，２Ｈ，ＣＨ）、２．２３−２．４４（ｍ，８Ｈ，ＣＮＣＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ）、４．０４（ｍ，４，ＮＨＣＨ_２Ｃ）、６．１４（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）、６．１９（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）。^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３、δ（ｐｐｍ））：２０７．３３、２０７．２８、１５５．８１、１５５．６６、１１８．４６、１１０．６１、１０９．４７、１０９．４０、７０．４１、６７．３１、６７．２０、６５．４５、６０．７６、６０．４５。

実施例６． 鎖末端修飾のための４，４’−アゾビス（アジドプロピル４−シアノペンタノエート）（ジアジド−Ｖ−５０１）の合成（スキーム３）
４，４’−アゾビス（４−シアノ吉草酸）（Ｖ−５０１、１ｇ、３．６ｍｍｏｌ）、３−アジドプロパノール（１．０８ｇ、１０．７ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．３５ｇ、２．９ｍｍｏｌ）をＤＣＭ／ＴＨＦ（１０／１０ｍＬ）中に溶解させ、４℃まで冷却した。１０ｍＬのＤＣＭ中のＤＣＣ（１．６２ｇ、７．９ｍｍｏｌ）を液滴で添加した。添加の後、反応混合物を４℃で一晩、次に室温で１時間攪拌した。反応の完了後、２滴の酢酸を反応混合物に添加し、攪拌を３０分間続けた。ＤＣＵをろ過により除去し、溶媒を回転蒸発により除去した。シリカゲルクロマトグラフィ（シリカゲル６０Å、２００〜４００メッシュ、酢酸エチル／ヘキサン１／１）によって残渣を精製した。収量１．５ｇ。構造は、^１Ｈ−ＮＭＲおよび^１３Ｃ−ＮＭＲ分光法によって確認した。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、δ、ｐｐｍ）：４．１７（ｍ，４Ｈ，−ＣＯＯＣＨ_２）、３．３７（ｍ，４Ｈ，Ｎ_３ＣＨ_２）、２．６０−２．３０（ｍ，８Ｈ，ＣＯ−ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｃ）、１．８９（ｍ，４Ｈ，Ｃ−ＣＨ_２−Ｃ）、１．６８（ｄ，６Ｈ，ＣＨ_３）。^１３Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３、δ、ｐｐｍ）：１７１．１６、１１７．４２、７１．７６、６２．０１、４８．０７、３３．０５、２９．０１、２７．９７、２３．８６。

実施例７． α，ω−ジアルキン連鎖移動剤２−シアノ−５−オキソ−５−（プロパ−２−イニルアミノ）ペンタン−２−イル２−ヘキサ−５−インアミドエチルトリチオカルボネート（ＣＴＡ１、アルキン−ＴＴＣ）の合成（スキーム４）
窒素雰囲気下、５−ヘキシン酸（１．０ｇ、８．９ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（３．４１ｇ、９．０ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（１．２２ｇ、９．０ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中に溶解させた。溶液を氷浴中で５分間攪拌し、ＤＩＰＥＡ（１．９４ｇ、１５ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を氷浴中で５分間攪拌してから、システアミン（６９４．３５ｍｇ、９．０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温で一晩５時間攪拌した。次に、ＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）を添加し、有機溶液をＮａＨＣＯ_３水（飽和）およびＨＣｌ（１Ｍ）、次にＮａＣｌ水で洗浄した。溶液を乾燥（ＭｇＳＯ_４）させ、回転蒸発により１５ｍＬまで除去した。ＥｔＯＡｃからの再結晶によって７８．５％の収率で化合物１を得た。^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３、δ（ｐｐｍ））：１．８４（ｍ，２Ｈ，ＣＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ）、１．９５（ｓ，２，ＣＨ）、２．２２（ｍ，２Ｈ，ＣＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ）、２．３４（ｍ，２Ｈ，ＣＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ）、２．８２（ｍ，２Ｈ，ＳＨＣＨ_２ＣＨ_２）、３．５５（ｍ，２Ｈ，ＳＨＣＨ_２ＣＨ_２）、６．４６（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）。^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３、δ（ｐｐｍ））：１７２．８４、８３．４８、６９．１７、３８．４０、３７．７２、３４．８８、２４．１３、１７．８７。

化合物１（５１３．８ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）を水／アセトン（３／１、１５ｍＬ）中に溶解させ、氷浴中で保持し、５分間攪拌した。ＫＯＨ溶液（５０％、２０２ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）を１０分間にわたって攪拌溶液に液滴で添加してから、二硫化炭素（２２８．４ｍｇ、３．０ｍｍｏｌ）を１回で添加し、系を室温で３０分間攪拌し、氷／アセトン浴により−５℃まで冷却した。塩化ｐ−トルエンスルホニル（３０５ｍｇ、１．６ｍｍｏｌ）を１０分間にわたって数回に分けて添加し、攪拌を２４℃でさらに１時間続けた。次に、混合物を４５℃で１０分間攪拌してから、ＤＣＭ（１００ｍＬ）中に溶解させた。ＮａＣｌ水で２回（２×５０ｍＬ）洗浄した後、有機層を分離し、ＭｇＳＯ_４上で乾燥させた。乾燥剤をろ過により除去し、蒸発により溶媒を除去した。ＤＣＭおよびエーテルからの再結晶により６３．１％の収率で化合物２を得た。^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３、δ（ｐｐｍ））：１．６２（ｔ，２Ｈ，ＣＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ）、２．１２（ｍ，４、ＣＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ）、２．７６（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）、３．３５（ｍ，２Ｈ，ＳＣＨ_２ＣＨ_２）、３．４４（ｍ，２Ｈ，ＳＣＨ_２ＣＨ_２）、８．１２（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）。^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３、δ（ｐｐｍ））：２２１．２５、１７１．７８、８４．０１、７７．５１、３８．８８、３７．８５、３６．１１、３４．０４、２４．１５、１７．３６。

窒素雰囲気下、化合物２（２００ｍｇ、０．４３５ｍｍｏｌ）およびジ−アルキンＶ５０１（実施例４、２３１．２８ｍｇ、０．６５３ｍｍｏｌ）に蒸留酢酸エチル（１５ｍＬ）を添加した。溶液を２０時間還流させた。次に、酢酸エチルを減圧下で除去した。溶離液として酢酸エチル：ヘキサン（５０：５０）を用いるカラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０Å、６０−２００メッシュ）によって粗生成物を単離した。標的化合物を黄色の油として得た。収率：５１％。^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３、δ（ｐｐｍ））：１．７８（ｍ，２Ｈ，ＣＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ）、１．８２（ｓ，３Ｈ，ＣＨ_３）、１．９６（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）、２．１２（ｓ，１Ｈ，ＣＨ）、２．１９（ｍ，４，ＣＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＯ）、２．２９（ｍ，２Ｈ，ＣＮＣＣＨ_２ＣＨ_２）、２．４４（ｍ，２Ｈ，ＣＮＣＣＨ_２ＣＨ_２）、３．４８（ｍ，４Ｈ，ＳＣＨ_２ＣＨ_２）、６．６３（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）、７．１８（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）。^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３、δ（ｐｐｍ））：２１７．２７、１７３．３２、１７０．６９、１１９．３５、８３．７２、７９．６７、７１．８１、６９．６６、４７．１６、３７．８２、３６．３４、３５．１５、３４．３１、３１．４０、２９．４３、２５．０４、２４．４０、１８．１３。質量スペクトル（ＥＳＩ）計算値：４１０．１ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ^＋）、実測値：４１０．２ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ^＋）。質量スペクトル（ＭＡＬＤＩ）計算値：４１０．１０ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ^＋）、実測値：４１０．０５ ｍ／ｚ（Ｍ＋Ｈ^＋）。

実施例８． アルキン官能化酵素感受性ＣＴＡ、Ｎ^α−（５−ペンタノイル）−Ｎ^ε−（４−シアノ−４−（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタノイル−グリシルフェニルアラニルロイシルグリシル）−リジン（ＣＴＰ−ＧＦＬＧ−アルキン、ＣＴＡ２）の合成（スキーム５）
ＣＴＰ−ＧＦＬＧ−アルキンは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）方法論を用いて合成した。Ｄｄｅ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（３５１ｍｇ、０．６４ｍｍｏｌ）を、２８２μＬのＤＩＰＥＡを含む５ｍＬのＤＣＭ中に溶解させてから、１ｇの塩化２−クロロトリチル樹脂（１．２９ｍｍｏｌ／ｇ）を含有するバイアルに添加した。バイアルを緩やかに１．５時間振とうさせ続けた。樹脂をポリプロピレン管に移し、ＤＣＭ：ＭｅＯＨ：ＤＩＰＥＡ（１７：２：１）の混合物で洗った（２０ｍＬ×４）。次に、樹脂をＤＣＭおよびＤＭＦによりそれぞれ３回洗浄した。ＤＭＦ中２０％のピペリジン１０ｍＬによりＦｍｏｃ基を除去した（５分×３）。ＨＢＴＵ（２．４×、５８６ｍｇ）およびＤＩＰＥＡ（５×、３．２ｍｍｏｌ、５７０μＬ）の存在下でヘキシン酸（２．５×、１．６ｍｍｏｌ）をカップリングさせ、アルキン基を導入した。ＤＭＦ中３％のヒドラジン１０ｍＬ（５分×３）によりＤｄｅ基を除去した後、ＨＢＴＵ／ＤＩＰＥＡ手順を用いて、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨと順次カップリングさせることによって、テトラペプチドＧＦＬＧによる延長を達成した。ニンヒドリン試験（Kaiser試験としても知られている）を用いて、各カップリングおよび脱保護ステップの完了を確認した。ペプチドのＮ末端を、ＤＩＣ／ＨＯＢｔの存在下、４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエート（１．６ｍｍｏｌ、０．４５ｇ）でキャップした。ビーズをＴＦＥ／ＤＣＭ混合物（３：７）で２時間処理した。樹脂をろ過により除去した。ろ液を減圧下で濃縮し、メタノール溶液をエーテル中に沈殿させることによって精製した。ピンク色の粉末が得られた。構造は、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ−質量スペクトルによって検証した（［Ｍ＋Ｈ^＋］８７６．４１）。純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣにより決定した。

同じ原理に従って、最初のアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｏｒｎ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨを用いて、異なる配列を有する酵素感受性ＣＴＡ（ＣＴＡ２ａおよびＣＴＡ２ｂ）を合成することができる。

実施例９． ３−アジドプロピル４−シアノ−４−チオベンゾイルスルファニル−ペンタノエート（ＣＴＰ−Ｎ_３、ＣＴＡ３）の合成

４−シアノ−４−チオベンゾイルスルファニル−ペンタン酸（ＣＴＰ、１．０ｇ、３．６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（４３９．８ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）を無水ＤＣＭ（５０ｍＬ）中に溶解させた。溶液を氷浴中で５分間攪拌し、ＥＤＣＩ（６９０．１ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）を添加し、３０分間攪拌した。３−アジドプロパノール（３６４ｍｇ、３．６ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を氷浴中で３０分間、そして室温でさらに８時間攪拌した。反応の後、溶液をＮａＨＣＯ_３水（飽和）、そして次にＨ_２Ｏで洗浄した。有機層を乾燥（Ｎａ_２ＳＯ_４）させ、溶媒を回転蒸発により除去し、カラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０Å、２００〜４００メッシュ、酢酸エチル：ヘキサン、１：４）により粗生成物を精製して、ローズレッドの油を８４．６％の収率で得た。この化合物の構造は、^１ＨＮＭＲおよび^１３ＣＮＭＲ分光法により確認した。^１ＨＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３、δ（ｐｐｍ））：１．９０−１．９３（ｍ，５Ｈ，−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｎ_３、−ＣＨ_３）、２．４５−２．６０（ｍ，２Ｈ，Ｃ（ＣＮ）ＣＨ_２−）、２．６８（ｍ，２Ｈ，Ｃ（ＣＮ）ＣＨ_２ＣＨ_２−）、３．４０（ｔ，２Ｈ，−ＣＨ_２Ｎ_３）、４．２１（ｔ，４Ｈ，−ＯＣＨ_２ＣＨ_２−）、７．３９（ｍ，２Ｈ，ＰＨ−２Ｈ）、７．５７（ｍ，１Ｈ，ＰＨ−４Ｈ）、７．８９（ｍ，２Ｈ，ＰＨ−３Ｈ）。^１３ＣＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ_３、δ（ｐｐｍ））：２２２．４０、１７１．４３、１４４．７４、１３３．２９、１２８．８２、１２６．９１、１１８．６８、６２．２２、４８．３４、４５．９３、３３．６０、２９．９８、２８．２７、２４．４１。

実施例１０． 酵素感受性ＣＴＡ、Ｎ^α−（アジドフェニル）−Ｎ^ε−（４−シアノ−４−（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタノイル−グリシルフェニルアラニルロイシルグリシル）−リジン（ＣＴＰ−ＧＦＬＧＫ−Ｎ_３、ＣＴＡ４）の合成（スキーム６）
酵素感受性ペプチドを含有するテレケリック型連鎖移動剤は、塩化２−クロロトリチル樹脂においてＳＰＰＳ方法論および手動Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ戦略によって合成した。Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨを第１のアミノ酸としてビーズに負荷した（０．５ｇ、０．１９ｍｍｏｌ負荷）。ＤＭＦ中２０％のペプリジン（pepridine）によりＦｍｏｃ基を除去した後、アジド安息香酸をリジンのα−ＮＨ_２にカップリングさせた。次に、ＤＭＦ中３％のヒドラジンによってε−Ｄｄｅ基を除去した。カップリング剤としてＨＢＴＵ、そして脱保護剤としてＤＭＦ中２０％のペプリジン（pepridine）を用いることにより、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを連続的にビーズにカップリングさせた。脱保護の後、カップリング剤としてＤＩＣを用いて、連鎖移動剤４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエートをグリシンのアミノ基にカップリングさせた。ＤＣＭ中３０％のＴＦＥにより２−Ｃｌ−トリチル樹脂から２時間切断した後、ペプチドを単離した。収量８５ｍｇの生成物。^１Ｈ−ＮＭＲ分光法によってペプチドを特徴付けた。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、δ、ｐｐｍ）：１２．６２（ｓ，１Ｈ，−ＣＯＯＨ）、８．４５（ｔ，１Ｈ，Ｐｈ−ＣＯＮＨ）、８．２８（ｑ，１Ｈ，ＣＯＮＨ）、８．１０（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨ）、８．０２（ｍ，１Ｈ，ＣＯＮＨ）、７．９７（ｄ，１Ｈ，ＣＯＮＨ）、７．８８（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ−Ｈ）、７．６８（ｔ，１Ｈ，Ｐｈ−Ｈ）、７．５０（ｔ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ）、７．２１（ｍ，７Ｈ，Ｐｈ−Ｈ）、４．５１（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）、４．２５（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）、４．１７（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ）、３．７１−３．５６（ｍ，４Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ_２）、３．２１（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＮＨ−ＣＨ_２）、３．０３（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨＨ）、２．７６（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨＨ）、２．５０−２．３５（ｍ，４Ｈ，ＣＴＡ−ＣＨ_２ＣＨ_２）、１．８８（ｓ，３Ｈ，ＣＴＡ−ＣＨ_３）、１．７３−１．３０（ｍ，９Ｈ，Ｌｙｓ−Ｃ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｃ、Ｌｅｕ−ＣＨ_２ＣＨＭｅ_２）、０．８８−０．８１（ｄｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−Ｍｅ）。

実施例１１． ２アーム型ＣＴＡ、Ｎ^α，Ｎ^δ−（ビス（４−シアノ−４−（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタノイルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシル）リジン（（ＣＴＰ−ＧＦＬＧ）_２Ｋ、ＣＴＡ５）の合成（スキーム７）
酵素感受性ペプチドを含有するテレケリック型連鎖移動剤は、塩化２−クロロトリチル樹脂におけるＳＰＰＳ方法論および手動Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ戦略によって合成した。第１のアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｄｄｅ）−ＯＨをビーズに負荷した（０．５ｇ、０．１９ｍｍｏｌ負荷）。ＤＭＦ中２０％のピペリジンによりＦｍｏｃ基を除去した後、アジド安息香酸をリジンのα−ＮＨ_２にカップリングさせた。次に、ＤＭＦ中３％のヒドラジンによってε−Ｄｄｅ基を除去した。カップリング剤としてＨＢＴＵ、そして脱保護剤としてＤＭＦ中２０％のピペリジンを用いることにより、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを連続的にビーズにカップリングさせた。脱保護の後、カップリング剤としてＤＩＣを用いて、連鎖移動剤４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエートをグリシンのアミノ基にカップリングさせた。ＤＣＭ中３０％のＴＦＥにより２−Ｃｌ−トリチル樹脂から２時間切断した後、ペプチドを単離した。収量８５ｍｇの生成物。^１Ｈ−ＮＭＲ分光法によってペプチドを特徴付けた。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、δ、ｐｐｍ）：１２．６２（ｓ，１Ｈ，−ＣＯＯＨ）、８．４５（ｔ，１Ｈ，Ｐｈ−ＣＯＮＨ）、８．２８（ｑ，１Ｈ，ＣＯＮＨ）、８．１０（ｍ，２Ｈ，ＣＯＮＨ）、８．０２（ｍ，１Ｈ，ＣＯＮＨ）、７．９７（ｄ，１Ｈ，ＣＯＮＨ）、７．８８（ｍ，４Ｈ，Ｐｈ−Ｈ）、７．６８（ｔ，１Ｈ，Ｐｈ−Ｈ）、７．５０（ｔ，２Ｈ，Ｐｈ−Ｈ）、７．２１（ｍ，７Ｈ，Ｐｈ−Ｈ）、４．５１（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）、４．２５（ｍ，１Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）、４．１７（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ）、３．７１−３．５６（ｍ，４Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ_２）、３．２１（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ−ＮＨ−ＣＨ_２）、３．０３（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨＨ）、２．７６（ｍ，１Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨＨ）、２．５０−２．３５（ｍ，４Ｈ，ＣＴＡ−ＣＨ_２ＣＨ_２）、１．８８（ｓ，３Ｈ，ＣＴＡ−ＣＨ_３）、１．７３−１．３０（ｍ，９Ｈ，Ｌｙｓ−Ｃ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｃ、Ｌｅｕ−ＣＨ_２ＣＨＭｅ_２）、０．８８−０．８１（ｄｄ，６Ｈ，Ｌｅｕ−Ｍｅ）。

実施例１２． 鎖延長のためのジアルキン化合物の合成
ジアルキン修飾を有する酵素分解可能なペプチド、ＨＣ≡Ｃ−ＧＦＬＧ−Ｃ≡ＣＨ（ａ）およびＨＣ≡Ｃ−ＱＳＦＲＦＫ−Ｃ≡ＣＨ（ｂ）のＳＰＰＳ合成（スキーム８）
Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｉｖＤｄｅ）−ＯＨを第１のアミノ酸残基として用いて、２つの遊離アミン基を導入した。保護基（Ｆｍｏｃ−およびｉｖＤｄｅ−）を選択的に除去し、一方を使用してペプチドのＣ末端にアルキン基を導入し、他方はペプチド配列を構成する働きをした。Ｎ末端におけるアルキンの取込みは、標準的なカップリングプロトコールを用いて５−ヘキシン酸によるペプチドのアシル化によって達成した（ＤＭＦ中−ＣＯＯＨ／ＤＩＰＥＡ／ＨＡＴＵ）。次に、樹脂を３×ＤＭＦ、３×ＤＣＭおよび３×ＭｅＯＨで順次洗浄し、真空下で乾燥させた。得られた樹脂結合ペプチドを樹脂から切断し、ＴＦＡ：Ｈ_２Ｏ：ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）カクテルを用いて側鎖を保護した。３０分間で５０％から１００％までのＢの勾配（ここで、緩衝液Ａは水中０．１％のＴＦＡであり、緩衝液Ｂは９０：１０（ｖ／ｖ）メタノール／水中０．１％のＴＦＡである）を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Agilent Technologies 1100、セミ分取用Zorbax 300SB-C18カラム、２５０×９．４ｍｍ、細孔サイズ３００Å、粒径５μｍ、流速２．５ｍＬ／分）によって、粗製ペプチドを精製した。生成物の純度は、分析ＲＰ−ＨＰＬＣによって検証した。構造は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（Voyager-DE STR Biospectrometry Workstation, Perseptive Biosystems）によって確かめた。

上記のプロトコールに従って、ジアルキン修飾を有する２つの酵素分解可能なペプチド、ＨＣ≡Ｃ−ＧＦＬＧ−Ｃ≡ＣＨ（ａ）およびＨＣ≡Ｃ−ＱＳＦＲＦＫ−Ｃ≡ＣＨ（ｂ）を合成した。これらのペプチドの構造は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルによって確認した：ジアルキン−ＧＦＬＧについては、計算値７０８．３８（Ｍ^＋）、実測値７０９．４１（ｍ＋Ｈ）^＋、ジアルキン−ＱＳＦＲＦＫについては、計算値９９８．５３（Ｍ^＋）、実測値９９９．５５（Ｍ＋Ｈ）^＋。

ＨＣ≡Ｃ−ＧＦＬＧ−Ｃ≡ＣＨの液相有機合成
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ（５．０ｇ、１０．３ｍｍｏｌ）をＣＨ_３ＯＨ（５０ｍＬ）中に溶解させた。溶液を−１５℃で５分間攪拌してから、ＳＯＣｌ_２（１．４ｇ、１２ｍｍｏｌ）を液滴で添加した。溶液を０℃で３０分間、そして６０℃でさらに３時間攪拌した。後処理の後、２００ｍＬのエーテルを添加し、結晶化により９６．７％の収率で化合物２を得た。

窒素雰囲気下、Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＭｅ．ＨＣｌ（２．４ｇ、５．７ｍｍｏｌ）、５−ヘキシン酸（６１６．６ｍｇ、５．５ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（８１０．６ｍｇ、６ｍｍｏｌ）をＥｔＯＡｃ（５０ｍＬ）中に溶解させた。溶液を氷浴中で５分間攪拌してから、ＤＩＰＥＡ（１．９ｇ、１５ｍｍｏｌ）、そしてその後にＥＤＣＩ（１．１５ｇ、６ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を氷浴中で３０分間、そして室温で１６時間攪拌した。反応の後、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）を添加し、溶液をＮａＨＣＯ_３水（飽和）、ＨＣｌ（１Ｍ）、およびＮａＣｌ水で洗浄した。ＥｔＯＡｃ溶液を乾燥（ＭｇＳＯ_４）させ、回転蒸発によって溶媒を部分的に除去した（５０ｍＬになるまで）。再結晶によって８４％の収率で化合物３を得た（スキーム９）。

Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＯＨ（５．０ｇ、２２．５ｍｍｏｌ）をＣＨ_３ＯＨ（５０ｍＬ）中に溶解させた。溶液を−１５℃で５分間攪拌してから、ＳＯＣｌ_２（３．０ｇ、２５ｍｍｏｌ）を液滴で添加した。溶液を０℃で３０分間、そして６４℃でさらに３時間攪拌した。反応の後、２００ｍＬのエーテルを添加し、ＥｔＯＡｃ中での再結晶によって９４．１％の収率で化合物５を得た。

Ｇｌｙ−Ｐｈｅ−ＯＭｅ．ＨＣｌ（５．０ｇ、１８．３ｍｍｏｌ）、５−ヘキシン酸（２．０ｇ、１８ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（２．７ｇ、２０ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で無水ＤＭＦ（１００ｍＬ）中に溶解させた。溶液を氷浴中で５分間攪拌してから、ＤＩＰＥＡ（６．５ｇ、５０ｍｍｏｌ）、そしてその後にＨＢＴＵ（７．６ｇ、２０ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を氷浴中で３０分間、そして室温で一晩攪拌した。反応の後、ＥｔＯＡｃ（３００ｍＬ）を添加し、溶液をＮａＨＣＯ_３水（飽和）、ＨＣｌ（１Ｍ）およびＮａＣｌ水で洗浄した。溶液を乾燥（ＭｇＳＯ_４）させ、回転蒸発により体積を５０ｍＬまで減少させた。ＥｔＯＡｃおよびエーテルからの再結晶によって８６．３％の収率で化合物６を得た。

化合物６（４．５ｇ、１３．６ｍｍｏｌ）をＣＨ_３ＯＨ（１００ｍＬ）中に溶解させた。溶液を氷浴中で５分間攪拌し、ＣＨ_３ＯＨ（２５ｍＬ）中のＮａＯＨ（１Ｍ、１５ｍｍｏｌ）を３０分間にわたって液滴で添加した。溶液を氷浴中で１．５時間、そして室温でさらに１時間攪拌した。反応の後、ＭｅＯＨを除去し、ＥｔＯＡｃ（２００ｍＬ）を添加し、溶液をＨＣｌ（１Ｍ）によりｐＨ＝２〜３まで酸性化し、分離し、ＥｔＯＡｃ（５０×３）により水を抽出した。有機溶液を乾燥（ＭｇＳＯ_４）させ、回転蒸発により体積を５０ｍＬまで減少させた。ＥｔＯＡｃおよびエーテルからの再結晶により９０．６％の収率で化合物７を得た。

化合物７（３．５ｇ、１１．１ｍｍｏｌ）、Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＭｅ．ＨＣｌ（２．７４ｇ、１１．５ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（１．６２ｇ、１２ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（１００ｍＬ）中に溶解させた。溶液を氷浴中で５分間攪拌してから、ＤＩＰＥＡ（３．６ｇ、２８ｍｍｏｌ）、そしてその後にＨＢＴＵ（４．６ｇ、１２ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を氷浴中で３０分間、そして室温で一晩攪拌した。反応の後、ＥｔＯＡｃ（２５０ｍＬ）を添加し、有機溶液をＮａＨＣＯ_３水（飽和）およびＨＣｌ（１Ｍ）、次にＮａＣｌ水で洗浄した。溶液を乾燥（Ｎａ_２ＳＯ_４）させ、回転蒸発により５０ｍＬまで減少させた。ＥｔＯＡｃ中での再結晶により８５％の収率で化合物８を得た。

ＮａＯＨによる加水分解によって化合物８から化合物９を得た。収率＝８７．９％。

窒素雰囲気下、化合物３（１．４３ｇ、３．０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ中２０％のピペリジン中で攪拌し、溶媒を除去し、エーテルで処理して、油を得た。油、化合物９（１．４６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（４１８．８ｍｇ、３．１ｍｍｏｌ）を無水ＤＭＦ（５０ｍＬ）中に溶解させた。溶液を氷浴中で５分間攪拌し、ＤＩＰＥＡ（６４６ｍｇ、５ｍｍｏｌ）を添加してから、ＨＢＴＵ（１．１８ｇ、３．１ｍｍｏｌ）を添加した。溶液を氷浴中で３０分間、そして室温で一晩攪拌した。反応の後、ＥｔＯＡｃ（１５０ｍＬ）を添加し、有機溶液をＮａＨＣＯ_３水（飽和）およびＨＣｌ（１Ｍ）、次にＮａＣｌ水で洗浄した。溶液を乾燥（ＭｇＳＯ_４）させ、回転蒸発により５０ｍＬまで除去した。再結晶により８１％の収率で化合物１０を得た。

ＮａＯＨによる加水分解によって化合物１０から化合物１１を得た。収率８９％。構造は、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって特徴付けた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ：ｍ／ｚ７３１．３１［（Ｍ＋Ｎａ）^＋］。

実施例１３． 鎖延長のためのジアジド化合物、Ｎ^α，Ｎ^ε−（ビス（アジドベンゾイルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシルアラニル）リジン（Ｎ_３−ＧＦＬＧ−Ｎ_３）の合成（スキーム１０）
テレケリック型のアジド基官能化酵素感受性ペプチドは、塩化２−クロロトリチル樹脂におけるＳＰＰＳ方法論および手動Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ戦略によって合成した。カップリング剤としてＨＢＴＵ、そして脱保護剤としてＤＭＦ中２０％のピペリジンを用いることにより、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを連続的にビーズにカップリングさせた（０．４ｇ、０．１５ｍｍｏｌ負荷）。脱保護の後、カップリング剤としてＤＩＣを用いてアジド安息香酸をグリシル残基にカップリングさせた。ＤＣＭ中３０％のＴＦＥにより２−Ｃｌ−トリチル樹脂から２時間切断した後、ペプチドを単離した。収率１２８ｍｇ（６５％）。^１Ｈ−ＮＭＲ分光法によってペプチドを特徴付けた。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、δ、ｐｐｍ）：１２．５３（ｓ，１Ｈ，−ＣＯＯＨ）、８．７６（ｔ，２Ｈ，Ｐｈ−ＣＯＮＨ）、８．１７−７．８２（ｍ，１４Ｈ，ＣＯＮＨ、Ｐｈ−Ｈ）、７．１９（ｍ，１４Ｈ，Ｐｈ−Ｈ）、４．５３（ｍ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）、４．３４−４．１７（ｍ，４Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ，Ａｌａ−ＣＨ）、４．１６（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ）、３．９０−３．６２（ｍ，８Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ_２）、３．００（ｍ，４Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨＨ，Ｌｙｓ−ＮＨ−ＣＨ_２）、２．７９（ｍ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨＨ）、１．６８−１．２６（ｍ，１２Ｈ，Ｌｙｓ−Ｃ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｃ，Ｌｅｕ−ＣＨ_２ＣＨＭｅ_２）、１．６２（ｔ，６Ｈ，Ａｌａ−ＣＨ_３）、０．８７−０．８１（ｄｄ，１２Ｈ，Ｌｅｕ−Ｍｅ）。

実施例１４． Ｎ^α，Ｎ^ε−ビス（４−マレイミドメチル−シクロヘキサンカルボニル−グリシルフェニルアラニルロイシルグリシル（glycylphenylalanlylleucylglycyl））リジン（（ＭＡＬ−ＧＦＬＧ）_２Ｋ）の合成（スキーム１１）
テレケリック型のマレイミド基官能化酵素感受性ペプチドは、塩化２−クロロトリチル樹脂におけるＳＰＰＳ方法論および手動Ｆｍｏｃ／ｔＢｕ戦略によって合成した。カップリング剤としてＨＢＴＵ、そして脱保護剤としてＤＭＦ中２０％のピペリジンを用いて、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを連続的にビーズにカップリングさせた（０．１ｇ、０．０４ｍｍｏｌ負荷）。脱保護の後、ヘテロ二官能性薬剤のＳＭＣＣ（スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）をグリシル残基にカップリングさせた。ＤＣＭ中３０％のＴＦＥにより２−Ｃｌ−トリチル樹脂から２時間切断した後、生成物を単離した。収率３８ｍｇ（７６％）。^１Ｈ−ＮＭＲ分光法によってペプチドを特徴付けた。^１Ｈ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６、δ、ｐｐｍ）：１２．６２（ｓ，１Ｈ，−ＣＯＯＨ）、８．１４−７．１５（ｍ，２０Ｈ，ＣＯＮＨ，Ｐｈ−Ｈ）、７．００（ｓ，４Ｈ，−ＣＨ＝ＣＨ−）、４．４８（ｍ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨ）、４．２５（ｍ，２Ｈ，Ｌｅｕ−ＣＨ）、４．１６（ｍ，１Ｈ，Ｌｙｓ−ＣＨ）、３．７４−３．５０（ｍ，８Ｈ，Ｇｌｙ−ＣＨ_２）、３．２２（ｄ，４Ｈ，ＣＨ_２−シクロヘキサン）、３．０１（ｍ，４Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨＨ，Ｌｙｓ−ＮＨ−ＣＨ_２）、２．７７（ｍ，２Ｈ，Ｐｈｅ−ＣＨＨ）、２．０８（ｍ，４Ｈ，シクロヘキサン中の４ＣＨ）、１．６８−１．１５（ｍ，２８Ｈ，Ｌｙｓ−Ｃ−ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２−Ｃ、Ｌｅｕ−ＣＨ_２ＣＨＭｅ_２、シクロヘキサン中の８ＣＨ_２）、０．８７−０．８０（ｄｄ，１２Ｈ，Ｌｅｕ−Ｍｅ）。

アルキン−アジド反応を用いる、骨格分解可能なＨＰＭＡコポリマー−薬物結合体の合成実施例
実施例１５． ＨＰＭＡ ＲＡＦＴ重合によるアルキン−テレケリック型ポリＨＰＭＡ（ＨＣ≡Ｃ−ポリＨＰＭＡ−Ｃ≡ＣＨ）の合成（スキーム１２）
ＨＰＭＡと、ジアルキン官能化ＣＴＡ（ＣＴＡ１）とのＲＡＦＴ重合。ＨＰＭＡ（０．１ｇ、０．７ｍｍｏｌ）およびＣＴＡ１（２．８８ｍｇ、０．００７ｍｍｏｌ）を含有するアンプルをSchlenkラインにつないだ。３回の真空−窒素サイクルで酸素を除去した後、０．５ｍＬの脱気蒸留水を添加し、その後、蒸留水中の開始剤Ｖ−５０１溶液（０．１ｍＬ中０．４ｍｇ）をシリンジで添加した。アンプルを密封し、７０℃で１２時間重合を実施した。アセトン中への沈殿によってポリマーが得られ、メタノール中での再溶解−アセトン中での沈殿をさらに２回行うことにより精製した。テレケリック型ポリＨＰＭＡを真空下で乾燥させた。収量９５ｍｇ。移動相としてＰＢＳ（ｐＨ７）を有するSuperose6 HR/10/30カラムを用いて、miniDAWN TREOSおよびOptilabEX検出器（Wyatt Technology, Santa Barbara, CA）を備えたAKTA FPLCシステム（Pharmacia）におけるサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によってポリマーを分析した。ポリマーの平均分子量は、光散乱、ＵＶ、ＲＩにより決定し、ASTRAソフトウェアにより計算した（Ｍｗ１４ｋＤａ、ＰＤＩ１．０２）。

実施例１６． クリック反応による生分解性マルチブロックポリＨＰＭＡの合成（スキーム１３）
生分解性マルチブロックポリＨＰＭＡをクリック反応により合成した。アルキン−テレケリック型ポリＨＰＭＡ（５０ｍｇ、Ｍｗ１４ｋＤａ、Ｍｗ／Ｍｎ１．０３）およびアジド末端ペプチドをＤＭＦ中のＬ−アスコルビン酸（０．５×、０．６ｍｇ）の２００μＬの脱気溶液中に溶解させた。窒素雰囲気下、ＤＭＦ中のＣｕＢｒ（１×、１ｍｇ）の溶液５０μＬを添加した。反応混合物を室温で４８時間攪拌し続けた。ポリマーをアセトン中に沈殿させ、１０ｍＭのＥＤＴＡ溶液に対して、そして次に水中での透析によって精製して銅塩を除去し、そして凍結乾燥させた。収量４２ｍｇのクリック生成物。Ｓ６分取用カラムによる分画の後、Ｍｗ３５２ｋＤａ、Ｍｗ／Ｍｎ１．２を有するポリマーを得た。

実施例１７． ヘテロテレケリック型前駆体から調製されたマルチブロックポリＨＰＭＡの酵素触媒分解
ポリマー骨格中にＧＦＬＧ配列を含有するマルチブロックポリＨＰＭＡの分解は、モデル酵素としてパパインを用いて、McIlvaine緩衝液（５０ｍＭのクエン酸／０．１Ｍのリン酸）中、ｐＨ６．０、３７℃において実施した。０．０５ｍｇ／ｍＬの濃度（２８０ｎｍでＵＶにより決定）のパパインを、５ｍＭのグルタチオンで５分間還元した。酵素活性は、色素生産性基質としてＢｚ−ＰｈｅＶａｌＡｒｇ−ＮＡｐを用いて確認した。ポリマー（３〜１０ｍｇ）を酵素溶液中に溶解させ（３ｍｇ／ｍＬ）、３７℃で保持した。所定の時点で、移動相としてＰＢＳ（ｐＨ７）を有するSuperose6 HR/10/30カラムを用いて、miniDAWN TREOSおよびOptilabEX検出器（Wyatt Technology, Santa Barbara, CA）を備えたAKTA FPLCシステム（Pharmacia）におけるサイズ排除クロマトグラフィにより媒体を分析した。３７℃のクエン酸−リン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中０．１４ｍｇ／ｍＬのパパインによるマルチブロックコポリマー（選択画分、Ｍｗ＝２９１ｋＤａ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．１１）のインキュベーションの結果、マルチブロックコポリマー骨格中のオリゴペプチド配列が完全に分解し、初期分子量（Ｍｗ＝４１．７ｋＤａ、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．０４）を有するポリマーが形成された（図２）。

実施例１８． ヘテロテレケリック型ポリＨＰＭＡ（Ｎ_３−ポリＨＰＭＡ−Ｃ≡ＣＨ）の合成（スキーム１４）
ＨＰＭＡのＲＡＦＴ重合。ＨＰＭＡ（０．５ｇ、３．５ｍｍｏｌ）およびＣＴＰ−ＧＦＬＧＫ−アルキン（ＣＴＡ２、１７ｍｇ、０．０１９ｍｍｏｌ）を含有するアンプルをSchlenkラインにつないだ。３回の真空−窒素サイクルでアンプル中の酸素を除去した後、２．５ｍＬの脱気水を添加し、その後、メタノール中の開始剤ＡＩＢＮ溶液（０．１ｍＬ中１．７８ｍｇ）をシリンジで添加した。アンプルを密封し、６５℃で２０時間重合を実施した。アセトン中への沈殿によってポリマーが得られ、メタノール中での再溶解−アセトン中での沈殿をさらに２回行うことにより精製した。ポリマー（ポリＨＰＭＡ）を真空下で乾燥させ、ピンク色の粉末として単離した。収量０．４２ｇ。移動相としてＰＢＳ（ｐＨ７）を有するSuperose6 HR/10/30カラムを用いて、miniDAWN TREOSおよびOptilabEX検出器（Wyatt Technology, Santa Barbara, CA）を備えたAKTA FPLCシステム（Pharmacia）におけるサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によってポリマーを分析した。ポリマーの平均分子量は、光散乱、ＵＶ、ＲＩにより決定し、ASTRAソフトウェアにより計算した（Ｍｗ３３．１ｋＤａ、ＰＤＩ１．０４）。

末端基修飾。アルキンおよびジチオベンゾエート鎖末端を含有するヘテロテレケリック型ＨＰＭＡポリマー（Ｍｗ＝３３．１ｋＤａ、１００ｍｇ）を５００μＬの１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）中に溶解させた。ジチオベンゾエート基をアジド基に転換するために、ジアジド−Ｖ−５０１（２０×、０．０６ｍｍｏｌ）を添加し、溶液をＮ_２で３０分間バブリングし、密封し、７０℃で３時間攪拌し続けた。アセトン中への沈殿によってポリマーを精製し、減圧下で乾燥させた。収量９６ｍｇのα−アジド−ω−アルキン−ポリＨＰＭＡ（Ｎ_３−ポリＨＰＭＡ−Ｃ≡ＣＨ）。末端基修飾の完了は、検出可能なジチオベンゾエート基（δ＝７〜８．５ｐｐｍ）を全く示さない^１Ｈ−ＮＭＲ分光法と、２１００ｃｍ^−１における新しいピーク（アジド）を示すＦＴＩＲとによって確認した。

実施例１９． クリック反応による生分解性マルチブロックポリＨＰＭＡの合成（スキーム１５）
マイクロ波に支援されたクリック反応による鎖延長。ヘテロテレケリック型Ｎ_３−ポリＨＰＭＡ−Ｃ≡ＣＨ（２０ｍｇ）を１００μＬの脱気Ｌ−アスコルビン酸（０．２５×、０．０２６ｍｇ）のＤＭＦ溶液中に溶解させた。窒素雰囲気下、１００μＬのＣｕＢｒ（０．５×、０．０４４ｍｇ）のＤＭＦ溶液を添加した。反応混合物を３６Ｗのマイクロ波反応器（Biotage）に３０分間入れた。ポリマーをアセトン中に沈殿させ、１０ｍＭのＥＤＴＡ溶液に対する透析によって精製して銅塩を除去し、そして乾燥させた。収量１６ｍｇのクリック生成物。ポリマーをＳＥＣにより分析した。結果は、残存モノマー（３３．７ｋＤａ）に加えて、テトラマー（Ｍｗ１２１．１ｋＤａ）およびダイマー（Ｍｗ６９．６ｋＤａ）に関する３重のピークを示した。個々の量体（mer）は、クロマトグラフィカラムにおいて分離され、狭い分子量分布の画分をもたらすであろう。

実施例２０． ペンダントアミノ基（Ｐ−ＮＨ_２）を含有するテレケリック型ＨＰＭＡコポリマーの合成（スキーム１６）
ＨＰＭＡと、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド塩酸塩（ＡＰＭＡ）とを共重合させることによって、側鎖アミノ基を含有するＨＰＭＡコポリマー（Ｐ−ＮＨ_２）を生成した。ＨＰＭＡ（８８ｍｇ）、ＡＰＭＡ（１２ｍｇ、１０モル％）、ＣＴＰ−ＧＦＬＧＫ−アルキン（ＣＴＡ２、３．８ｍｇ）を含有するアンプルをSchlenkラインにつないだ。３回の真空−窒素サイクルで酸素を除去した後、０．５ｍＬの脱気Ｈ_２Ｏを添加し、その後、メタノール中の開始剤Ｖ−５０１溶液（５０μＬ中０．３６ｍｇ）をシリンジで添加した。アンプルを密封し、７０℃で２０時間共重合を実施した。アセトン中への沈殿によってポリマーが得られ、メタノール中での再溶解−アセトン中での沈殿をさらに２回行うことにより精製した。コポリマー（Ｐ−ＮＨ_２）を実施例１８に記載される手順に従って末端修飾した。移動相としてＰＢＳ（ｐＨ７）を有するSuperose6 HR/10/30カラムを用いて、miniDAWN TREOSおよびOptilabEX検出器（Wyatt Technology, Santa Barbara, CA）を備えたAKTA FPLCシステム（Pharmacia）において、ポリマーをＳＥＣにより分析した。ポリマーの平均分子量は、光散乱、ＵＶ、ＲＩにより決定し、ASTRAソフトウェアにより計算した。アミノ基の含量は、ニンヒドリンアッセイによって決定した。鎖延長は、実施例１９と同様の手順に従って行われるであろう。

実施例２１． 標的部分Ｆａｂ’を含有するテレケリック型ＨＰＭＡコポリマーの合成
ペンダントアミノ基を含有するテレケリック型ＨＰＭＡコポリマー（Ｐ−ＮＨ_２）をまず実施例２０に記載されるように合成した。トリエチルアミンの存在下ＤＭＦ中でＳＭＣＣとの反応によるＦａｂ’とのコンジュゲ―ションのために、アミノ基をマレイミド基に定量的に転換した。コポリマー中のマレイミドの量は、修正されたEllmanアッセイを用いて決定した。次に、Ｆａｂ’断片（ＯＶ−ＴＬ１６抗体由来）はキャリアに結合され得る。ポリマー前駆体を２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液ｐＨ６．５中に溶解させ、新たに調製されたＦａｂ’断片と４℃の暗所で一晩反応させる（ポリマー：Ｆａｂ’重量比＝１：２）ことによって、標的結合体が調製されるであろう。生成物は、０〜０．５ＭのＮａＣｌ濃度勾配で２０ｍＭのビス−トリス緩衝液ｐＨ６．５を用いて溶出されるDEAE Sepharose Fast Flowイオン交換カラム（Pharmacia）において精製されるであろう。結合体に相当する画分は、Superose 6（HR10/30）カラムを用いて、ＳＥＣによって単離されるであろう。Ｆａｂ’断片のポリマー前駆体へのコンジュゲ―ションの後、標的部分（Ｆａｂ’）を含有するヘテロテレケリック型ＨＰＭＡコポリマーを、抗癌剤を含有する同一の構成要素または別のヘテロテレケリック型ＨＰＭＡコポリマーと共に延長させ、標的生分解性マルチブロックＨＰＭＡコポリマーベースのポリマー治療薬を生成することができる。

実施例２２． チアゾリジン−２−チオン（ＴＴ）反応基を含有するテレケリック型ＨＰＭＡコポリマー（Ｐ−ＴＴ）の合成（スキーム１７）
ＨＰＭＡと、チアゾリジン−２−チオン（ＴＴ）の重合性誘導体との共重合によって、
側鎖反応基を含有するＨＰＭＡコポリマーを生成した。ＨＰＭＡ（０．３ｇ）、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＴＴ（６０ｍｇ、５モル％）、ＣＴＰ−ＧＦＬＧＫ−アルキン（ＣＴＡ２、１２．５ｍｇ）を含有するアンプルをSchlenkラインにつないだ。３回の真空−窒素サイクルで酸素を除去した後、２ｍＬの脱気ＭｅＯＨを添加し、その後、メタノール中の開始剤ＡＩＢＮ溶液（０．１ｍＬ中０．６ｍｇ）をシリンジで添加した。アンプルを密封し、６５℃で２４時間共重合を実施した。アセトン中への沈殿によってポリマーが得られ、メタノール中での再溶解−アセトン中での沈殿をさらに２回行うことにより精製した。コポリマー（Ｐ−ＴＴ）を実施例１８に記載される手順に従って末端修飾した。移動相としてＰＢＳ（ｐＨ７）を有するSuperose6 HR/10/30カラムを用いて、miniDAWN TREOSおよびOptilabEX検出器（Wyatt Technology, Santa Barbara, CA）を備えたAKTA FPLCシステム（Pharmacia）におけるＳＥＣによってポリマーを分析した。ポリマーの平均分子量は、光散乱、ＵＶ、ＲＩにより決定し、ASTRAソフトウェアにより計算した（Ｍｗ＝１６ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０２）。メタノール中でのＵＶ分光光度法によって決定されるコポリマー中のＴＴの含量は５．３％であった（ε_３０５＝１０，８００Ｌｍｏｌ^−１ｃｍ^−１）。

このポリマー前駆体は、抗癌剤、および標的部分を連続して結合させるために使用することができる。

結合体２２ａ：ポリマー前駆体をＤＭＳＯ中に溶解させた後、ドキソルビシンおよびガラクトサミンはアミド結合によってポリマーに結合され、生成物はＳＥＣにより精製され得る。実施例１９に記載されるような生成物の鎖延長は、アシアロ糖タンパク質受容体によるＮ−アシル化ガラクトサミンの生体認識によって肝細胞に対して標的可能なマルチブロック生分解性ＨＰＭＡコポリマー−ＤＯＸ結合体を提供するであろう。

結合体２２ｂ：ポリマー前駆体をＤＭＳＯ中に溶解させた後、エピルビシンおよび５’−アミノヘキシル−抗−ＰＳＭＡアプタマーＡ９（Bioconjugate Chemistry 19, 1309, 2008における構造を参照）はアミド結合によってポリマーに結合され、生成物はＳＥＣにより精製され得る。実施例１９に記載されるような生成物の鎖延長は、前立腺癌細胞に対して標的可能なマルチブロック生分解性ＨＰＭＡコポリマー−エピルビシン結合体を提供するであろう。

結合体２２ｃ：ポリマー前駆体をＤＭＳＯ中に溶解させた後、エピルビシンは、ＴＴ基で終結する側鎖の画分に結合され得る。ＨＰＭＡコポリマー−エピルビシン−（ＧＦＬＧ）−ＴＴ結合体はアセトン中への沈殿によって単離され、真空中で乾燥され得る。次に、８０ｍｇのポリマーの溶液は３００μＬのＤＭＳＯ中に溶解され、溶液は、４℃において４ｍＬのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．３中のＯＶ−ＴＬ１６抗体（１０ｍｇ／ｍＬ）に添加され得る。溶液が２時間保持されてから、ｐＨは３時間以内にｐＨ８．５まで徐々に上昇され得る。ＨＰＭＡコポリマー−エピルビシン−ＯＶ−ＴＬ１６結合体は、ＰＢＳ緩衝液において、まずSephadex G25カラムを用い、次に、サイズ排除Superose 6カラムを用いて精製されるであろう。

実施例２３． 白金の錯体化のためのマロン酸基を含有するテレケリック型ＨＰＭＡコポリマー前駆体（Ｐ−ｄｉＣＯＯＨ）の合成（スキーム１８）
抗癌剤白金酸塩を含有するＨＰＭＡコポリマー（Ｐ−Ｐｔ）を２段階プロセスで生成した。まず、ＨＰＭＡと、重合性マロン酸誘導体、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ｄｉＣＯＯＨとの共重合によってポリマー前駆体を得た。次に、白金剤をポリマー前駆体とキレート化して、薬物−ポリマー体を形成した。

ポリマー前駆体の合成。ＨＰＭＡ（１７０ｍｇ）、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ｄｉＣＯＯＨ（３０ｍｇ、５モル％）、ＣＴＰ−ＧＦＬＧ−アルキン（ＣＴＡ２、６．６８ｍｇ）を含有するアンプルをSchlenkラインにつないだ。３回の真空−窒素サイクルで酸素を除去した後、２．５ｍＬの脱気ＭｅＯＨを添加し、その後、メタノール中の開始剤ＡＩＢＮ溶液（０．１ｍＬ中０．７２ｍｇ）をシリンジで添加した。アンプルを密封し、６５℃で２０時間共重合を実施した。アセトン中への沈殿によってポリマーが得られ、メタノール中での再溶解−アセトン中での沈殿をさらに２回行うことにより精製し、ピンク色の粉末として単離した。第２のステップでは、コポリマー（Ｐ−ｄｉＣＯＯＨ）の末端修飾は、ｄｉＮ_３−Ｖ５０１（実施例６を参照）と一緒に、そのＮＭＰ中の溶液中で還流させることによって実施した。ヘテロテレケリック型コポリマーを真空下で乾燥させた。移動相としてＰＢＳ（ｐＨ７）を有するSuperose6 HR/10/30カラムを用いて、miniDAWN TREOSおよびOptilabEX検出器（Wyatt Technology, Santa Barbara, CA）を備えたAKTA FPLCシステム（Pharmacia）におけるＳＥＣを用いてポリマーを分析した。ポリマーの平均分子量は、光散乱、ＵＶ、ＲＩにより決定し、ASTRAソフトウェアにより計算した（Ｍｗ＝１６ｋＤａ、ＰＤＩ＝１．０２）。鎖延長は、実施例１９と同様の手順に従って行われるであろう。

白金剤のポリＨＰＭＡ骨格への連結（スキーム１９）
ジアミノシクロヘキシル（ＤＡＣＨ）ＰｔキレートＤＡＣＨＰｔ（ＯＨ_２）_２（P. Sood et al., Bioconjugate Chem. 2006, 17, 1270-1279）は、少量の５％のＨＮＯ_３を含有する水中（ｐＨ＜２）でのＨＰＭＡコポリマーと、ＤＡＣＨＰｔ（ＮＯ_３）_２との反応によって調製されるであろう。反応混合物は、７０℃で１時間攪拌され得る。ＨＰＭＡコポリマーＰ−ｄｉＣＯＯＨは、水中に溶解され得る。溶液のｐＨは２ＭのＮａＯＨによって１２．６に調整され、３０分間保持され得る。次に、５％のＨＮＯ_３をゆっくり添加することによって溶液はｐＨ７．４に調整され得る。白金化溶液は、激しく攪拌しながら添加され得る。ｐＨは２ＭのＮａＯＨを用いて５．２に調整されて維持され、２時間攪拌され得る。次に、ｐＨは２ＭのＮａＯＨを用いて７．４に調整され、３８℃で１７時間攪拌され得る。反応の後、生成物は精製され、凍結乾燥され得る。

実施例２４． 抗癌剤ゲムシタビンを含有するテレケリック型ＨＰＭＡコポリマー（Ｐ−ゲムシタビン）の合成（スキーム２０）
ＨＰＭＡと、薬物のＭＡ−ＧＦＬＧ−ゲムシタビンの重合性誘導体との共重合によって、抗癌剤ゲムシタビンを含有するＨＰＭＡコポリマー（Ｐ−ゲムシタビン）を生成した。ＨＰＭＡ（１６０ｍｇ）、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ゲムシタビン（４０ｍｇ、５モル％）、ＣＴＰ−ＧＦＬＧ−アルキン（ＣＴＡ２、６．６８ｍｇ）を含有するアンプルをSchlenkラインにつないだ。３回の真空−窒素サイクルで酸素を除去した後、２．５ｍＬの脱気ＭｅＯＨを添加し、その後、メタノール中の開始剤ＡＩＢＮ溶液（０．１ｍＬ中０．７２ｍｇ）をシリンジで添加した。アンプルを密封し、６０℃で２０時間共重合を実施した。アセトン中への沈殿によってポリマーが得られ、メタノール中での再溶解−アセトン中での沈殿をさらに２回行うことにより精製した。コポリマー（Ｐ−ゲムシタビン）を実施例１８に記載される手順に従って末端修飾した。移動相としてＰＢＳ（ｐＨ７）を有するSuperose6 HR/10/30カラムを用いて、miniDAWN TREOSおよびOptilabEX検出器（Wyatt Technology, Santa Barbara, CA）を備えたAKTA FPLCシステム（Pharmacia）におけるＳＥＣによって、ポリマーを分析した。ポリマーの平均分子量は、光散乱、ＵＶ、ＲＩにより決定し、ASTRAソフトウェアにより計算した。ゲムシタビンの含量をＵＶにより測定した。メタノール中でのＵＶ分光光度法によって決定されるコポリマー中のゲムシタビン（ｇｅｍ）の含量は５．４％であった（ε_３０５＝５７１０Ｌｍｏｌ^−１ｃｍ^−１）。鎖延長は、実施例１９と同様の手順に従って行われるであろう。

ＲＡＦＴ共重合のためにＣＴＡ２ａを用いて、抗癌剤ゲムシタビンを含有するＨＰＭＡコポリマー（Ｐ−ゲムシタビン）が生成される場合、スキーム２１に示されるように、主鎖は酵素分解可能な配列Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（ＦＫ）を含有し、側鎖はＧＦＬＧ配列を含有するであろう。

実施例２５． ゲムシタビンおよび標的部分Ｆａｂ’を含有するテレケリック型ＨＰＭＡコポリマーの合成（スキーム２２）
抗癌剤ゲムシタビンおよび標的Ｆａｂ’断片（抗ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）抗体に由来）を含有するＨＰＭＡコポリマーは、３段階で生成されるであろう。まず、実施例２０に記載されるように連鎖移動剤としてＣＴＰ−ＧＦＬＧ−アルキン（ＣＴＡ２）および開始剤としてＶ−５０１を用いて、ＨＰＭＡ（１２９ｍｇ、０．９ｍｍｏｌ）、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ゲムシタビン（４９ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）およびＡＰＭＡ（５．４ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）が７０℃においてＤＭＳＯ／Ｈ_２Ｏ中で重合され得る。ジアジド−Ｖ−５０１による末端修飾の後、ポリマーはＳＭＣＣと反応されて、側鎖マレイミド官能基が導入された後、実施例２１に記載されるようにチオール−マレイミド反応によって、Ｆａｂ’（１Ｆ５抗ＣＤ２０抗体に由来）とのコンジュゲ―ションが行われ得る。鎖延長は、実施例１９の手順に従って行われるであろう。

実施例２６． ゲムシタビンおよび白金前駆体を含有するテレケリック型組み合わせＨＰＭＡコポリマー−薬物結合体（Ｐ−ゲムシタビン−ｄｉＣＯＯＨ）の合成（スキーム２３）
実施例２２に記載されるように、ＨＰＭＡと、薬物の重合性誘導体と、白金による錯体化に適したマロン酸を含有するコモノマーとの共重合によって、抗癌剤ゲムシタビンおよび白金酸塩の前駆体を含有するＨＰＭＡコポリマー（Ｐ−ゲムシタビン−ｄｉＣＯＯＨ）を生成した。ＨＰＭＡ（１６０ｍｇ）、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ゲムシタビン（２２ｍｇ、２．５モル％）、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ｄｉＣＯＯＨ（１８ｍｇ、２．５モル％）、ＣＴＰ−ＧＦＬＧＫ−アルキン（ＣＴＡ２、６．６８ｍｇ）を含有するアンプルをSchlenkラインにつないだ。３回の真空−窒素サイクルで酸素を除去した後、２．５ｍＬの脱気ＭｅＯＨを添加し、その後、メタノール中の開始剤ＡＩＢＮ溶液（０．１ｍＬ中０．７２ｍｇ）をシリンジで添加した。アンプルを密封し、６５℃で２０時間共重合を実施した。アセトン中への沈殿によってポリマーが得られ、メタノール中での再溶解−アセトン中での沈殿をさらに２回行うことにより精製した。コポリマー（Ｐ−ゲムシタビン−ｄｉＣＯＯＨ）を実施例１８に記載される手順に従って末端修飾した。白金は、実施例２２に記載されるようなポリマーと錯体化されるであろう。移動相としてＰＢＳ（ｐＨ７）を有するSuperose6 HR/10/30カラムを用いて、miniDAWN TREOSおよびOptilabEX検出器（Wyatt Technology, Santa Barbara, CA）を備えたAKTA FPLCシステム（Pharmacia）において、ポリマーをＳＥＣにより分析した。ポリマーの平均分子量は、光散乱、ＵＶ、ＲＩにより決定し、ASTRAソフトウェアにより計算した。ゲムシタビンの含量はＵＶにより測定し、マロン酸の含量は滴定によって測定した。鎖延長は、実施例１８と同様の手順に従って行われるであろう。

実施例２７． 抗癌剤のための２つの異なる付着点、ＴＴ基およびマロン酸を含有するヘテロテレケリック型ＨＰＭＡコポリマー前駆体（Ｐ−ＴＴ−ｄｉＣＯＯＨ）の合成（スキーム２４）
側鎖中の反応性ＴＴ基と、Ｐｔの錯体化のための付着部位とを含有するＨＰＭＡコポリマーを、ＨＰＭＡと、２つのコモノマーとの共重合によって生成した。ＨＰＭＡ（１６６ｍｇ）、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ｄｉＣＯＯＨ（１７ｍｇ、２．５モル％）、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＴＴ（１７ｍｇ、２．５モル％）を含有するアンプルをSchlenkラインにつないだ。３回の真空−窒素サイクルで酸素を除去した後、２．５ｍＬの脱気メタノールを添加し、その後、メタノール中の開始剤ＡＩＢＮ溶液（０．１ｍＬ中０．７２ｍｇ）をシリンジで添加した。アンプルを密封し、６５℃で２０時間共重合を実施した。アセトン中への沈殿によってポリマーを単離し、メタノール中での再溶解−アセトン中での沈殿をさらに２回行うことにより精製した。真空下で乾燥させた後、コポリマーをオレンジ色の粉末として単離した。コポリマー（Ｐ−ＴＴ−ｄｉＣＯＯＨ）を実施例１８に記載される手順に従ってさらに末端修飾し、移動相としてＰＢＳ（ｐＨ７）を有するSuperose6 HR/10/30カラムを用いて、miniDAWN TREOSおよびOptilabEX検出器（Wyatt Technology, Santa Barbara, CA）を備えたAKTA FPLCシステム（Pharmacia）におけるＳＥＣによって分析した。ポリマーの平均分子量は、光散乱、ＵＶ、ＲＩにより決定し、ASTRAソフトウェアにより計算した。鎖延長は、実施例１９と同様の手順に従って行われるであろう。

実施例２８． アジド−テレケリック型ポリＨＰＭＡの合成（スキーム２５）
ＨＰＭＡとアジド官能化ＣＴＡ（ＣＴＡ３）とのＲＡＦＴ重合。ＨＰＭＡ（０．１ｇ、０．７ｍｍｏｌ）およびＣＴＡ３（３ｍｇ、０．００８ｍｍｏｌ）を含有するアンプルをSchlenkラインにつないだ。３回の真空−窒素サイクルで酸素を除去した後、０．５ｍＬの脱気メタノールを添加し、その後、メタノール中の開始剤ＡＩＢＮ溶液（０．１ｍＬ中０．５ｍｇ）をシリンジで添加した。アンプルを密封し、６０℃で２０時間重合を進行させた。アセトン中への沈殿によってポリマーを単離し、メタノール中での再溶解−アセトン中での沈殿をさらに２回行うことにより精製した。ポリＨＰＭＡを真空下で乾燥させ、ピンク色の粉末として単離した。収量６０ｍｇ。移動相としてＰＢＳ（ｐＨ７）を有するSuperose12 HR/10/30カラムを用いて、miniDAWN TREOSおよびOptilabEX検出器（Wyatt Technology, Santa Barbara, CA）を備えたAKTA FPLCシステム（Pharmacia）におけるサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）によってポリマーを分析した。ポリマーの平均分子量は、光散乱、ＵＶ、ＲＩにより決定し、ASTRAソフトウェアにより計算した（Ｍｗ２６ｋＤａ、ＰＤＩ１．０２）。

末端基修飾。このＨＰＭＡコポリマー（１０ｍｇ）を１００μＬの１−メチル−２−ピロリジノン（ＮＭＰ）中に溶解させた。ジアジド−Ｖ−５０１（ｄｉＮ_３−Ｖ５０１、２０×、２０μＬ）を添加し、溶液をＮ_２で３０分間バブリングし、密封し、７０℃で３時間攪拌し続けた。アセトン中への沈殿によってポリマーを精製し、減圧下で乾燥させた。収量９．６ｍｇの白色のアジド−テレケリック型ポリＨＰＭＡ（Ｎ_３−ポリＨＰＭＡ−Ｎ_３）。末端基修飾の完了は、検出可能なジチオベンゾエート基（δ＝７〜８．５ｐｐｍ）を全く示さない^１Ｈ−ＮＭＲ分光法と、２１００ｃｍ^−１における新しいピーク（アジド）を示すＦＴＩＲとによって確認した。

実施例２９． クリック反応による生分解性マルチブロックポリＨＰＭＡの合成（スキーム２６）
生分解性マルチブロックポリＨＰＭＡをクリック反応により合成した。アジド−テレケリック型ポリＨＰＭＡ（１５ｍｇ）およびアルキン末端ペプチドＧＦＬＧＫ（実施例１１）をＤＭＦ中のＬ−アスコルビン酸（０．２５×、０．０７ｍｇ）の１００μＬの脱気溶液中に溶解させた。窒素雰囲気下、ＤＭＦ中のＣｕＢｒ（０．５×、０．１ｍｇ）溶液５０μＬを添加した。反応混合物を８０℃で一晩攪拌し続けた。ポリマーをアセトン中に沈殿させ、１０ｍＭのＥＤＴＡ溶液に対して、そして次に対する透析によって精製して銅塩を除去し、そして乾燥させた。収量１２ｍｇのクリック生成物。ポリマーをＳＥＣにより分析した。結果は、テトラマー（Ｍｗ１１０．８ｋＤａ）が少量の中間体（Ｍｗ５３．４ｋＤａおよび２４．８ｋＤａ）と共に得られたことを示した。主要画分は、クロマトグラフィカラムにおいて分離されるであろう。

実施例３０． 生分解性マルチブロックポリＨＰＭＡコポリマー−パクリタキセル結合体の合成（スキーム２７）
ＲＡＦＴ重合。ＨＰＭＡ（８８６ｍｇ）、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＰＴＸ（２４５ｍｇ）、ＭＡ−Ｔｙｒ（１５ｍｇ）、（ＣＴＰ−ＧＦＬＧ）_２Ｋ（６．６ｍｇ）およびＡＩＢＮ（０．５ｍｇ）をメタノール（３．７ｍＬ）中に溶解させた。溶液をＮ_２で３０分間バブリングし、密封し、５５℃で３０時間重合させた。重合の後、メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によってコポリマーを精製し、次に、アセトンで洗浄し、減圧下で乾燥させた。収量４５４ｍｇのピンク色のテレケリック型ＨＰＭＡコポリマー−パクリタキセル（Ｍｎ１０３ｋＤａ、ＰＤＩ１．０５）。

末端基修飾。ＨＰＭＡコポリマー−パクリタキセル（４４０ｍｇ）を４．０ｍＬの脱酸素化メタノール中、７０℃で３時間、ジアルキン−Ｖ−５０１（６１ｍｇ、０．１７２ｍｍｏｌ）と反応させた。メタノール−アセトン中での２回の溶解−沈殿によってコポリマーを精製し、乾燥させ、α，ω−ジアルキンテレケリック型ＨＰＭＡコポリマー−パクリタキセルが８４％の収率（３７０ｍｇ）で得られた。

クリック反応。α，ω−ジアルキンテレケリック型ＨＰＭＡコポリマー−パクリタキセル（１０３ｋＤａ、３５０ｍｇ、３．４μｍｏｌ）、（アジド−ＧＦＬＧ）_２Ｋ（４．０ｍｇ、３．４μｍｏｌ）およびアスコルビン酸ナトリウム（８ｍｇ、４０μｍｏｌ）をバイアルに添加した。バイアルを真空にし、窒素を３回補充した後、１．１ｍＬの脱酸素化ＤＭＦを添加した。ＣｕＳＯ_４の脱酸素化溶液（水中、３．２ｍｇ、２０μｍｏｌ、２００μＬ）を添加した。バイアルを密封した。溶液を室温で２０時間攪拌した。コポリマーをアセトン中に沈殿させ、真空下で乾燥させ、ＰＤ−１０カラムによりさらに精製した。分取用Superose 6 HR 16/60カラムおよび溶離液として酢酸緩衝液（ｐＨ＝６．５）を用いてクリック生成物を分画した。流速は１ｍＬ／分であり、画分（Ｍｎ３０６ｋＤａ、ＰＤＩ１．０９）を捕集し、透析および凍結乾燥させ、白色の粉末が２７．７％の収率（９８ｍｇ）で得られた。

分解。モデル酵素としてパパイン（２．０μＭ）を用いて、McIlvaine緩衝液（５０ｍＭのクエン酸／０．１Ｍのリン酸）中、ｐＨ６．０、３７℃でマルチブロックコポリマー画分（Ｍｎ３０６ｋＤａ、ＰＤＩ１．０９）の分解を実施し、分解ＨＰＭＡコポリマー（Ｍｎ４７ｋＤａ、ＰＤＩ１．０１）が得られた。パクリタキセル（５．４重量％）をパパイン（１０μＭ）中でコポリマー結合体から切断した。結果は、図５に示される。

チオール−エン反応を用いる骨格分解可能なＨＰＭＡコポリマー−薬物結合体の合成実施例
実施例３１． ＣＴＡとして（ＣＴＰ−ＧＦＬＧ）_２Ｋを用いるチオール−テレケリック型ポリＨＰＭＡの合成およびポリマー鎖延長（スキーム２８）
ＨＰＭＡの重合。ＨＰＭＡ（３３０ｍｇ）、（ＣＴＰ−ＧＦＬＧ）_２Ｋ（１２ｍｇ）およびＡＩＢＮ（０．５ｍｇ）をメタノール（２．８ｍＬ）中に溶解させた。溶液をＮ_２で３０分間バブリングし、密封し、５０℃で４８時間重合させた。重合の後、メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によってポリマーを精製し、次に、アセトンで洗浄し、減圧下で乾燥させた。収量１５６ｍｇのピンク色のポリマー（Ｍｗ１９．４ｋＤａ、ＰＤＩ１．０５）。

アミノリシス。ＨＰＭＡポリマーＣＴＡ−ポリＨＰＭＡ−ＣＴＡ（１００ｍｇ）を８００μＬのメタノール中に溶解させ、ｎ−ＢｕＮＨ_２（５０μＬ）を添加し、混合物を１０分間振とうさせた。次に、メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によってポリマーを精製し、アセトンで洗浄し、減圧下で乾燥させた。収量７６ｍｇのチオールテレケリック型ポリＨＰＭＡ。

還元。ＨＰＭＡコポリマードセタキセル結合体ＣＴＡ−ポリＨＰＭＡ−ＣＴＡ（１０ｍｇ）、還元剤ＴＣＥＰ．ＨＣｌ（２０ｍｇ）を１００μＬメタノール中に添加し、室温で一晩攪拌した。還元の後、ポリマーをアセトン中に沈殿させ、エーテルまたはアセトンで３回洗浄し、室温において減圧下で乾燥させた。収量８ｍｇのチオールテレケリック型ポリＨＰＭＡ。

２，２’−ジピリジンジスルフィドによる鎖延長。チオールテレケリック型ポリＨＰＭＡ（６ｍｇ）および２，２’−ジピリジンジスルフィド（６ｍｇ）を１００μＬのメタノール中に溶解させた。反応混合物を室温で３時間振とうさせた。ポリマーをアセトン中に沈殿させ、溶解−沈殿法（未反応ＰｙＳＳＰｙの完全な除去）によって精製し、次に乾燥させた。収量６ｍｇのテレケリック型ＰｙＳＳ−ポリＨＰＭＡ。テレケリック型ＰｙＳＳ−ポリＨＰＭＡ（６ｍｇ）およびチオールテレケリック型ポリＨＰＭＡ（６ｍｇ）をそれぞれ４０μＬのメタノール中に溶解させ、次に、２つの溶液を混合し、４０℃で一晩振とうを続けた。メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によってポリマーを精製し、アセトンで洗浄し、減圧下で乾燥させた。収量１２ｍｇのポリ（ＰＨＰＭＡ−ＳＳ）。

界面鎖延長。チオールテレケリック型ポリＨＰＭＡ（１５ｍｇ）を２００μＬの水中に溶解させ、Ｎ_２で５分間バブリングした。ビス−ＭＡＬ−ｄＰＥＧ３（ＣＡＳ♯７５６５２５−８９−０）（０．３ｍｇ）を１００μＬのＤＣＭ中に溶解させた。２つの溶液を１ｍｌのアンプル内で混合し、炎で密封した。反応混合物を室温で２０時間激しく攪拌した。ポリマーをアセトン中に沈殿させ、アセトンで３回洗浄し、減圧下で乾燥させた。収量１５ｍｇの鎖延長されたポリマー。

ＤＭＳＯ酸化によるジスルフィド結合形成を用いる鎖延長。チオールテレケリック型ポリＨＰＭＡ（５ｍｇ）を２０μＬの水および１０μＬのＤＭＳＯの混合溶媒中に溶解させた。溶液を室温で１０時間攪拌した。ポリマーをアセトン中に沈殿させ、アセトンで３回洗浄し、減圧下で乾燥させた。収量５ｍｇのポリマー（Ｍｗ１６８．１ｋＤａ、ＰＤＩ１．４４）。

ビス−ＭＡＬ−ｄＰＥＧ３（ＣＡＳ♯７５６５２５−８９−０）による鎖延長。チオールテレケリック型ポリＨＰＭＡ（２６ｍｇ）およびビス−ＭＡＬ−ｄＰＥＧ３（１０．３ｍｇ）を６０μＬのＤＭＦ中に溶解させた。反応混合物を室温で８時間振とうさせた。ポリマーをアセトン中に沈殿させ、溶解−沈殿法（未反応ビス−ＭＡＬ−ｄＰＥＧ３の完全な除去）によって精製し、乾燥させた。収量２７ｍｇのテレケリック型ＭＡＬ−ポリＨＰＭＡ。テレケリック型ＭＡＬ−ポリＨＰＭＡ（２７ｍｇ）およびテレケリック型ＨＳ−ポリＨＰＭＡ（２５ｍｇ）をそれぞれ５０μＬのＤＭＦ中に溶解させた。２つの溶液を混合し、室温で一晩振とうを続けた。メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によってポリマーを精製し、アセトンで洗浄し、減圧下で乾燥させた。収量５０ｍｇのポリマー（Ｍｗ１００．４ｋＤａ、ＰＤＩ２．３１）。

実施例３２． マルチブロックポリＨＰＭＡの酵素触媒分解
チオール−エン反応から得られたマルチブロックポリＨＰＭＡの分解は、パパインまたはカテプシンＢを用いて、McIlvaine緩衝液（５０ｍＭのクエン酸／０．１Ｍのリン酸）中、ｐＨ５．０、３７℃において実施した。ポリマー切断研究においてカテプシンＢストック溶液（０．３５ｍｇ／ｍＬ）およびパパインストック溶液（０．４５ｍｇ／ｍＬ）を使用した。

パパイン（０．４５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＬ）（またはカテプシンＢ、０．３５ｍｇ／ｍＬ、０．１ｍＬ）を、５ｍＭのＧＳＨを含有する０．８ｍＬの緩衝液と混合し、混合物を３７℃で５分間プレインキュベートした。４ｍｇのポリマーを含有する０．１ｍＬの緩衝液中のマルチブロックマルチブロックＨＰＭＡコポリマー−ＤＯＸ結合体（２２７．７ｋＤａ画分）を添加し、３７℃でインキュベートした。指定の時間間隔で、０．１ｍＬのサンプルを抜き取り、０．０５ｍＬの１Ｍのヨード酢酸ナトリウムを含有する０．４ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．３）と混合した。サンプルは、移動相としてＰＢＳ（ｐＨ７．３）を有するSuperose6 HR/10/30カラムを用いるminiDAWN TREOSおよびOptilabEX検出器を備えたAeKTA FPLCシステムを用いて、ＳＥＣにより分析した。

分解生成物の平均分子量は、図３（左側パネル−カテプシンＢによる分解、右側パネル−パパインによる分解）に示されるように出発のポリＨＰＭＡに近い。主鎖の分解に加えて、ＤＯＸは同時にオリゴペプチド側鎖の分解によって遊離される。

実施例３３． 抗癌剤ドセタキセルを含有するチオール−テレケリック型ＨＰＭＡコポリマーの合成および鎖延長
共重合。ＨＰＭＡ（９８ｍｇ）、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ドセタキセル（１６ｍｇ、２モル％）、（ＣＴＰ−ＧＦＬＧ）_２Ｋ（４．１ｍｇ）およびＡＩＢＮ（０．２ｍｇ）をメタノール（１ｍＬ）中に溶解させた。溶液をＮ_２で３０分間バブリングし、密封し、５０℃で４８時間重合させた。メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によってポリマーを精製し、アセトンで洗浄し、減圧下で乾燥させた。収量３５ｍｇのピンク色のポリマーＰ−ＤＴＸ−ＣＴＡ２（Ｍｗ１１．６ｋＤａ、ＰＤＩ１．１２）。結合体は、１．５モル％のＤＴＸ（０．０９ｇ／ｇポリマー）を含有した。

アミノリシス。Ｐ−ＤＴＸ−ＣＴＡ２（２０ｍｇ）を１００μＬのメタノール中に溶解させ、ｎ−ＢｕＮＨ_２（１０μＬの）を添加し、混合物を５分間振とうさせた。次に、メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によってポリマーを精製し、アセトンで洗浄し、減圧下で乾燥させた。収量１５ｍｇのテレケリック型Ｐ−ＤＴＸ（ＨＳ−［ポリＨＰＭＡ−ＤＴＸ］−ＳＨ）。

鎖延長。チオールテレケリック型Ｐ−ＤＴＸ（７ｍｇ）およびビス−ＭＡＬ−ｄＰＥＧ３（５ｍｇ）を２０μＬのＤＭＦ中に溶解させた。反応混合物を室温で８時間振とうさせた。ポリマーをアセトン中に沈殿させ、溶解−沈殿法（未反応ビス−ＭＡＬ−ｄＰＥＧ３の完全な除去）により精製し、次に乾燥させた。収量８ｍｇのテレケリック型Ｐ−ＤＴＸ−ＭＡＬ２。テレケリック型Ｐ−ＤＴＸ−ＭＡＬ２（８ｍｇ）およびテレケリック型Ｐ−ＤＴＸ−ＳＨ２（６．５ｍｇ）をそれぞれ２０μＬのＤＭＦ中に溶解させた。２つの溶液を混合し、室温で一晩振とうを続けた。メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によってポリマーを精製し、アセトンで洗浄し、減圧下で乾燥させた。収量１２ｍｇのポリマー（Ｍｗ７９．４ｋＤａ、ＰＤＩ３．３３）。

実施例３４．チアゾリジン−２−チオン（ＴＴ）を含有するチオール−テレケリック型ＨＰＭＡコポリマーの合成、抗癌剤ドキソルビシンの付着および鎖延長
共重合。ＨＰＭＡ（２７０ｍｇ）、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＴＴ（６７ｍｇ、６モル％）、（ＣＴＰ−ＧＦＬＧ）_２Ｋ（１２ｍｇ）およびＡＩＢＮ（０．５ｍｇ）をメタノール（３ｍＬ）中に溶解させた。溶液をＮ_２で３０分間バブリングし、密封し、５０℃で４８時間重合させた。重合の後、メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によってポリマーを精製し、アセトンで洗浄し、減圧下で乾燥させた。収量１３９ｍｇのピンク色のポリマーＰ−ＴＴ−ＣＴＡ２（Ｍｗ１９．８ｋＤａ、ＰＤＩ１．０７）。

薬物結合およびアミノリシス。Ｐ−ＴＴ−ＣＴＡ２（７８ｍｇ）およびドキソルビシン（２０ｍｇ）を５００μＬのＤＭＳＯ中に溶解させた。ＤＩＰＥＡ（１２μＬ）を攪拌下で添加した。系を室温で一晩攪拌してから、メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によってポリマーを精製し、アセトンで洗浄し、減圧下で乾燥させた。収量３０ｍｇのテレケリック型ｐ−Ｄｏｘ−ＳＨ２。

鎖延長。テレケリック型Ｐ−ＤＯＸ−ＳＨ２（１０ｍｇ）およびビス−ＭＡＬ−ｄＰＥＧ３（７ｍｇ）を４０μＬのＤＭＦ中に溶解させた。反応混合物を室温で８時間振とうさせた。ポリマーをアセトン中に沈殿させ、溶解−沈殿（未反応ビス−ＭＡＬ−ｄＰＥＧ３の完全な除去）によって精製し、次に乾燥させた。収量１０．５ｍｇのテレケリック型Ｐ−ＤＯＸ−ＭＡＬ２。テレケリック型Ｐ−ＤＯＸ−ＭＡＬ２（１０．５ｍｇ）およびテレケリック型Ｐ−ＤＯＸ−ＳＨ２（１０ｍｇ）をそれぞれ２０μＬのＤＭＦ中に溶解させた。２つの溶液を混合し、室温で一晩振とうを続けた。メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によってポリマーを精製し、アセトンで洗浄し、減圧下で乾燥させた。収量２０ｍｇのポリマー（Ｍｗ９８．１ｋＤａ、ＰＤＩ２．３７）。薬物の含量は、ＵＶ−ｖｉｓにより測定した。結合体は２．４８モル％のＤＯＸ（０．０８ｇ／ｇポリマー）を含有した。

実施例３５． ドキソルビシンおよびドセタキセルを含有するチオールテレケリック型組み合わせＨＰＭＡコポリマー−薬物結合体の合成
ＨＰＭＡ（１４０ｍｇ）、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ドセタキセル（１２．５ｍｇ、１モル％）、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＤＯＸ（９．６ｍｇ、１モル％、（ＣＴＰ−ＧＦＬＧ）_２Ｋ（１１．５ｍｇ）およびＡＩＢＮ（０．４ｍｇ）をメタノール（１．４ｍＬ）中に溶解させた。溶液をＮ_２で３０分間バブリングし、密封し、５０℃で３０時間重合させた。重合の後、メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によってポリマーを精製し、アセトンで洗浄し、減圧下で乾燥させた。収量６５ｍｇ組み合わせコポリマー（Ｍｗ２９．９ｋＤａ、ＰＤＩ１．３６）。薬物の含量は、ＵＶ−ｖｉｓおよびパパイン切断によって測定した。結合体は、０．９６モル％のＤＯＸ（０．０３ｇ／ｇポリマー）および０．７５モル％のＤＴＸ（０．０４ｇ／ｇポリマー）を含有した。

実施例３６． ドキソルビシンおよびＦａｂ’標的部分を含有するチオール−テレケリック型組み合わせＨＰＭＡコポリマーの合成（スキーム２９）
ＨＰＭＡ（９０モル％）、ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｄｏｘ（５モル％）、ＭＡ−ＮＨ_２ＨＣｌ（５モル％）、（ＣＴＡ−ＧＦＬＧ）２Ｋ（連鎖移動剤として、１０ｋＤａのコポリマーの調製のために適切な量）およびＡＩＢＮ（ＣＴＡの１／５量）をメタノール中に溶解させた。溶液をＮ_２で３０分間バブリングし、密封し、５０℃で４８時間重合させた。重合の後、メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によってポリマーを精製し、次にアセトンで洗浄し、減圧下で乾燥させた。

コポリマーＣＴＡ−ポリ（ＨＰＭＡ−Ｄｏｘ−ＮＨ_２）−ＣＴＡはＤＭＦ中に溶解され、ＤＩＰＥＡ（コポリマー中のアミノ基の量に対して２当量）が添加され得る。ＤＭＦ中のＳＭＣＣ（３×）を０℃で添加した。反応混合物は室温下で１２時間攪拌され得る。反応の後、生成物は、メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によって精製され、次にアセトンで洗浄され、減圧下で乾燥されるであろう。

コポリマーＣＴＡ−ポリ（ＨＰＭＡ−Ｄｏｘ−ＭＡＬ）−ＣＴＡはＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中に溶解され得る。ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６．０）中のＦａｂ’が添加され得る。カップリング反応混合物は、室温下で１２時間穏やかに攪拌され得る。反応の後、２−メルカプトエタノールが溶液に添加され、１時間攪拌が継続され得る。溶液のｐＨは１ＮのＮａＯＨを用いて９に調整され、１０時間攪拌されて、末端ジチオエステル基を除去し得る。コポリマー結合体は、ＢＳ緩衝液（ｐＨ６）に対する透析（１００ｋＤａのＭＷＣＯ）によって精製され、限外ろ過によって濃縮されるであろう。

テレケリック型ＨＳ−ポリ（ＨＰＭＡ−Ｄｏｘ−Ｆａｂ’）−ＳＨおよびビス−ＭＡＬ−ｄＰＥＧ３（ＣＡＳ♯７５６５２５−８９−０、コポリマーと同等）は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６）中に溶解され得る、。反応混合物は、室温で２日間振とうされ得る。反応の後、延長されたコポリマー結合体は、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ６）に対する透析（１００ｋＤａのＭＷＣＯ）によって精製され、限外ろ過により濃縮され得る。結合体の最終精製はＳＥＣによって実施され得る。Ｆａｂ’の含量および分子量および多分散性は、ＵＶ−ｖｉｓおよびＦＰＬＣによって測定されるであろう。

他のアプローチを用いる骨格分解可能なＨＰＭＡコポリマー−薬物結合体の合成実施例
実施例３７． ＲＡＦＴ重合による加水分解的に切断可能なエステル結合のＨＰＭＡコポリマー主鎖への導入（スキーム３０）
ＨＰＭＡ、５，６−ベンゾ−２−メチレン−１，３−ジオキセパンまたは２−メチレン−１，３−ジオキセパン（モノマーの１重量％）、ＣＴＡ１（全モノマーの３重量％）およびＡＩＢＮ（ＣＴＡの２０重量％）は、メタノール（全モノマーの濃度は１５重量％であり得る）中に溶解され得る。溶液はＮ_２で３０分間バブリングされ、密封され、５０℃で２４時間重合され得る。重合の後、ポリマーは、メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によって精製され、次にアセトンで洗浄され、減圧下で乾燥されるであろう。

実施例３８． ヘテロディールス−アルダー反応によるマルチセグメントＨＰＭＡコポリマー結合体の合成（スキーム３１）
（１）ＨＤＡ−ＣＴＡ
４−シアノジチオ安息香酸。トルエン（２００ｍＬ）中の４−シアノ安息香酸（１０ｇ、６８ｍｍｏｌ）および五硫化リン（８ｇ、１８ｍｍｏｌ）の混合物を１２時間還流させた。赤色生成物４−シアノジチオ安息香酸を５％のＨＣｌ×３および塩水×３で洗浄した。次に、生成物を２００ｍＬの５％のＮａＯＨ中に抽出し、エーテルおよびベンゼンで洗浄した。

ビス（４−シアノチオベンゾイル）ジスルフィド。フェリシアン化カリウム（ＩＩＩ）（２５ｇ、７６ｍｍｏｌ）を脱イオン水（３００ｍＬ）中に溶解させ、激しく攪拌しながら、滴下漏斗によりナトリウム４−シアノジチオベンゾエートに１時間にわたって液滴で添加した。赤色沈殿物をろ過し、洗浄液が無色になるまで脱イオン水で洗浄した。固体を室温で一晩、真空中で乾燥させた。生成物ビス（４−シアノチオベンゾイル）ジスルフィドをエタノールから再結晶した。

４−シアノペンタン酸４−シアノジチオベンゾエートの合成。４，４’−アゾビス（４−シアノペンタン酸）（５．６ｇ、２０ｍｍｏｌ）およびビス（シアノチオベンゾイル）ジスルフィド（４ｇ、１１．２ｍｍｏｌ）を８０ｍＬの蒸留酢酸エチルを含有する２５０ｍＬの丸底フラスコに添加した。反応溶液を１８時間還流させた。酢酸エチルを真空中で除去した。溶離液として酢酸エチル：ヘキサン（２：３）を用いるカラムクロマトグラフィ（シリカゲル６０Å、７０〜２３０メッシュ）によって生成物を単離した。

他のベンゼン置換されたジチオエステルＣＴＡおよびピリジルジチオエステルＣＴＡは、同様の方法によって合成されるであろう。

ＨＡＤ−ＣＴＡ。テレケリック型ベンゼン置換ジチオエステルＣＴＡまたはピリジルジチオエステルＣＴＡを含有するＧＦＬＧペプチドは、実施例９に記載されるものと同一のＳＰＰＳ法によって合成されるであろう。

（２）α，ω−ジシクロペンタジエニル−ＰＥＧ
α，ω−ジブロモ−ＰＥＧはＴＨＦ中に溶解され、０℃に冷却され得る。この溶液に、３当量のシクロペンタジエニドナトリウム（ＴＨＦ中２．０Ｍ）がゆっくり添加され得る。混合物は０℃で３０分間、そして次に室温で１２時間攪拌され得る。得られる混合物は飽和ＮＨ_４Ｃｌ溶液中に注がれ、ＤＣＭで抽出され得る。有機相は冷蒸留水で洗浄され、ＭｇＳＯ_４上で乾燥され、濃縮され、冷ジエチルエーテル中で沈殿され得る。生成物は捕集され、減圧下で乾燥され得る。

（３）ヘテロ−ディールス−アルダー反応による延長
ＨＰＭＡ、コモノマー、ＨＤＡ−ＣＴＡおよびＡＩＢＮはメタノール中に溶解され、最終モノマー濃度は１３〜１５重量％になるであろう。溶液はＮ_２で３０分間バブリングされ、密封され、５０℃で４８時間重合され得る。重合の後、メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によってポリマーは精製され、次にアセトンで洗浄され、減圧下で乾燥され得る。α，ω−ジシクロペンタジエニル−ＰＥＧおよびジチオエステル終結ポリマー（末端官能基と同等）はＤＭＦ中に溶解され、室温で１日間攪拌され得る。ポリマーはメタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によって精製され、アセトンで洗浄され、減圧下で乾燥され得る。

実施例３９． Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシル−チアゾリジン−２−チオン（ＭＡ−ＧＧ−ＴＴ）の合成（スキーム３２）
ＭＡ−ＧＧ−ＴＴの合成は、実施例１におけるＭＡ−ＧＦＬＧ−ＴＴの合成と同様であった。Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシン（ＭＡ−ＧＧ−ＯＨ）を、触媒量のＤＭＡＰの存在下、ＥＤＣＩによる仲介で、ＤＣＭ中で２−メルカプトチアゾリンとカップリングさせた。反応の後、ＭｅＯＨ溶液からの再結晶によって生成物を精製した。

実施例４０． Ｎ−メタクリロイルグリシルグリシルバリニルシトルリン（ＭＡ−ＧｌｙＧｌｙＶａｌＣｉｔ−Ｇｅｍ）の合成（スキーム３３）
ＭＡ−ＧｌｙＧｌｙＶａｌＣｉｔ−ＯＨは、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）方法論によって合成されるであろう。カップリング剤としてＨＢＴＵ、そして脱保護剤としてＤＭＦ中２０％のピペリジンを用いることによって、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｆｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨ、そしてその後ＭＡ−ＧｌｙＧｌｙ−ＯＨが塩化２−Ｃｌ−トリチルビーズに連続的にカップリングされ得る。ペプチドは、ＴＦＡ：Ｈ_２Ｏ：ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）により２−Ｃｌ−トリチル樹脂から２時間切断した後に単離され、エーテル中で沈殿され、真空下で乾燥され得る。

ＭＡ−ＧｌｙＧｌｙＶａｌＣｉｔ−Ｇｅｍは、４℃においてＤＩＰＥＡおよびＤＣＣの存在下、ＤＭＦ中でのＭＡ−ＧｌｙＧｌｙＶａｌＣｉｔ−ＯＨと、ゲムシタビン塩酸塩との反応によって合成されるであろう。反応の後、溶媒は回転蒸発によって除去され得る。粗生成物はシリカゲルカラムクロマトグラフィによって精製され得る。

実施例４１． ２アーム型ＣＴＡ、Ｎ^α，Ｎ^δ−ビス（４−シアノ−４−（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタノイルバリニルシトルリニル）リジン（ＣＴＰ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ）_２Ｋ、ＣＴＡ５．１）およびＮ^α，Ｎ^δ−ビス（４−シアノ−４−（フェニルカルボノチオイルチオ）ペンタノイルフェニルアラニルリジル）リジン（ＣＴＰ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）_２Ｋ、ＣＴＡ５．２）の合成（スキーム３４）
２アーム型ＣＴＡ（ＣＴＰ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ）_２Ｋは、実施例１０に記載されるものと同一の方法によって合成されるであろう。簡単に言うと、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨは、塩化２−Ｃｌ−トリチルビーズに連続的にカップリングされ得る。脱保護の後、カップリング剤としてＤＩＣを用いて、連鎖移動剤４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエートはバリニル残基にカップリングされ得る。ペプチドは、ＤＣＭ中３０％のＴＦＥにより２−Ｃｌ−トリチル樹脂から２時間切断した後、単離され得る。

同一の方法を用いて、（ＣＴＰ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）_２Ｋが合成され得る。簡単に言うと、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨは、塩化２−Ｃｌ−トリチルビーズに連続的にカップリングされ得る。脱保護の後、カップリング剤としてＤＩＣを用いて、連鎖移動剤４−シアノペンタン酸ジチオベンゾエートはフェニルアラニル残基にカップリングされ得る。ペプチドは、ＤＣＭ中３０％のＴＦＥにより２−Ｃｌ−トリチル樹脂から２時間切断した後、単離され得る。

実施例４２． 鎖延長のためのジアジド化合物、Ｎ^α，Ｎ^δ−ビス（アジドベンゾイルバリニルシトルリニル）リジン（Ｎ_３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−Ｎ_３）およびＮ^α，Ｎ^δ−ビス（アジドベンゾイルフェニルアラニルリジル）リジン（Ｎ_３−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｎ_３）の合成（スキーム３５）
テレケリック型のアジド基官能化酵素感受性ペプチドＮ_３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−Ｎ_３は、実施例１２に記載されるものと同一の方法によって合成されるであろう。簡単に言うと、カップリング剤としてＨＢＴＵ、そして脱保護剤としてＤＭＦ中２０％のピペリジンを用いることにより、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｃｉｔ−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｖａｌ−ＯＨは、塩化２−Ｃｌ−トリチルビーズに連続的にカップリングされ得る。脱保護の後、アジド安息香酸は、カップリング剤としてＤＩＣを用いてグリシル残基にカップリングされ得る。ペプチドは、ＤＣＭ中３０％のＴＦＥにより２−Ｃｌ−トリチル樹脂から２時間切断した後、単離され得る。ペプチドは、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって特徴付けられるであろう。

同一の方法によって、Ｎ_３−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｎ_３が合成されるであろう。簡単に言うと、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨおよびＦｍｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨは、塩化２−Ｃｌ−トリチルビーズに連続的にカップリングされ得る。脱保護の後、アジド安息香酸は、カップリング剤としてＤＩＣを用いてグリシル残基にカップリングされ得る。ペプチドは、ＤＣＭ中３０％のＴＦＥにより２−Ｃｌ−トリチル樹脂から２時間切断した後、単離され得る。ペプチドは、^１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって特徴付けられるであろう。

実施例４３． ２つの薬物ＤＯＸおよびＧｅｍを含有するＨＰＭＡコポリマー結合体Ｐ−ＤＯＸ−Ｇｅｍの合成（スキーム３６）
ＨＰＭＡ（９０モル％）、ＭＡ−ＧＧ−ＴＴ（５モル％）、ＭＡ−ＧＦＬＧ−Ｇｅｍ（５モル％）、（ＣＴＰ−Ｖａｌ−Ｃｉｔ）_２Ｋまたは（ＣＴＰ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ）_２ＫおよびＡＩＢＮはメタノール中に溶解され得る。モノマーの濃度は約１５重量％になり得る。溶液は、Ｎ_２で３０分間バブリングされ、密封され、５０℃で２４時間重合され得る。重合の後、ポリマーはメタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によって精製され、アセトンで洗浄され、減圧下で乾燥され得る。

コポリマーＣＴＡ−Ｐ（ＨＰＭＡ−ＴＴ−Ｇｅｍ）−ＣＴＡ（１００ｍｇ）は８００μＬのＤＭＦ中に溶解され、８００μＬのＤＭＦ中のＮＨ_２ＮＨ_２（１００μＬ）に添加され、混合物は室温で３０分間振とうされ得る。次に、ポリマーは、メタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によって精製され、アセトンで洗浄され、減圧下で乾燥され得る。

コポリマーＨＳ−Ｐ（ＨＰＭＡ−ＣＯＮＨＮＨ_２−Ｇｅｍ）−ＳＨ（１００ｍｇ）は１ｍＬのＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（１／１）中に溶解され得る。０．５ｍＬのＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ（１／１）中のＤＯＸ（２０ｍｇ）が添加され得る。反応混合物は室温で攪拌され得る。次に、ポリマーはメタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によって精製され、アセトンで洗浄され、減圧下で乾燥され得る。

テレケリック型コポリマー結合体ＨＳ−Ｐ（ＨＰＭＡ−ＣＯＮＨＮＨ_２ＤＯＸ−Ｇｅｍ）−ＳＨおよびビス−ＭＡＬ−ｄＰＥＧ３（同等）はＤＭＦ中に溶解され得る。反応混合物は、室温で２４時間振とうされ得る。ポリマーはアセトン中に沈殿され、溶解−沈殿法によって精製され得る。

実施例４４． ２つの薬物、ＤＴＸおよびＧｅｍを含有するＨＰＭＡコポリマー結合体Ｐ−ＤＴＸ−Ｇｅｍの合成（スキーム３７）
ＨＰＭＡ（９０モル％）、ＭＡ−ＧＦＬＧ−ＤＴＸ（５モル％）、ＭＡ−ＧｌｙＧｌｙＶａｌＣｉｔ−Ｇｅｍ（５モル％）、ＣＴＡ１（実施例６）およびＡＩＢＮはメタノール中に溶解され得る。モノマーの濃度は、約１５重量％になり得る。溶液はＮ_２で３０分間バブリングされ、密封され、５０℃で２４時間重合され得る。重合の後、ポリマーはメタノール−アセトン中での３回の溶解−沈殿によって精製され、アセトンで洗浄され、減圧下で乾燥され得る。

コポリマーのアルキン−Ｐ（ＨＰＭＡ−ＤＴＸ−Ｇｅｍ）−アルキンおよびＮ_３−Ｖａｌ−Ｃｉｔ−Ｎ_３またはＮ_３−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｎ_３は、ＤＭＦ中のＬ−アスコルビン酸（０．５×）の脱気溶液中に溶解され得る。窒素雰囲気下、ＤＭＦ中のＣｕＢｒ（０．５×）溶液が添加され得る。反応混合物は室温で４８時間、攪拌が継続され得る。ポリマーはアセトン中に沈殿され、１０ｍＭのＥＤＴＡ溶液に対して、そして次に水中での透析によって精製されて銅塩が除去され、次に凍結乾燥され得る。

実施例４５． マルチブロックＨＰＭＡコポリマー−ＤＯＸ結合体の効力のインビボ評価
多剤耐性ヒト卵巣癌Ａ２７８０／ＡＤ細胞（５×１０^６）をメス胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウスの（右側）側腹部に皮下移植した。腫瘍が約１ｃｍ^２の大きさに達したら、ＨＰＭＡコポリマー−ＤＯＸ結合体（２５ｍｇのＤＯＸと同等／ｋｇ）によりマウスを腹腔内で３回（１、４、および７日目）処置した。

メス胸腺欠損ｎｕ／ｎｕマウス中のｓ．ｃ．Ａ２７８０ＡＤ（耐性）ヒト卵巣癌異種移植片に対するＨＰＭＡコポリマー−ＤＯＸ結合体の増殖阻害は図４に示される。従来のＤＯＸ結合体と比較して、高分子量マルチブロックＤＯＸ結合体は、より高い抗腫瘍活性（より高い腫瘍増殖の阻害）を実証した。

本出願を通して、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、本明細書に記載される化合物、組成物および方法をより完全に説明するために本出願内へ参照されることによってその全体が本明細書に援用される。

本明細書に記載される化合物、組成物および方法には種々の修正および変化が成され得る。本明細書に記載される化合物、組成物および方法の他の態様は、本明細書の考察および本明細書に開示される化合物、組成物および方法の実施から明らかになるであろう。本明細書および実施例は例として考えられることが意図される。

Claims (29)

1. 第１の切断可能なリンカーによって互いに結合された複数の線状水溶性高分子セグメントを含む水溶性高分子量線状生分解性ポリマー骨格を含み、生物活性剤が、少なくとも１つの水溶性高分子セグメント、少なくとも１つの切断可能なリンカー、またはこれらの組み合わせに共有結合された、薬物送達結合体またはその薬学的に許容可能な塩もしくはエステル。
2. 前記結合体が５０ｋＤａ〜７５０ｋＤａの分子量を有する、請求項１に記載の結合体。
3. 前記水溶性高分子セグメントが４０ｋＤａ未満の分子量を有する、請求項１に記載の結合体。
4. 前記水溶性高分子セグメントが１つまたは複数の不飽和水溶性モノマーの重合生成物を含む、請求項１に記載の結合体。
5. 前記不飽和水溶性モノマーが、式Ｉ
   

   

   （式中、Ｒ^１は水素またはメチルであり、
   ＸはＯまたはＮＲ^２であり、ここで、Ｒ^２は水素またはアルキル基であり、
   Ｌは、アルキル基、アリール基、またはシクロアルキル基であり、そして
   Ｙは親水基である）
   を含む、請求項４に記載の結合体。
6. Ｒ^１がメチルであり、ＸがＮＨであり、そしてＬがＣ_１〜Ｃ_５メチレン基である、請求項５に記載の結合体。
7. Ｌがメチレン基、エチレン基、またはイソプロピレン基である、請求項６に記載の結合体。
8. 前記親水基が、ヒドロキシル基、アミノ基、チオール基、ＳＯ_３Ｈ基、または双性イオン基である、請求項４に記載の結合体。
9. 前記水溶性モノマーが、Ｎ−置換メタクリルアミド、Ｎ，Ｎ−二置換アクリルアミド、メタクリル酸もしくはアクリル酸の親水性エステル、Ｎ−ビニルピロリドン、Ｎ−アクリロイルモルホリン、スルホエチルメタクリレート、アクリル酸、メタアクリル酸、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項４に記載の結合体。
10. 前記水溶性モノマーが、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、Ｎ−［３−（Ｎ’−ジカルボキシメチル）アミノプロピル］メタクリルアミド（ＤＡＭＡ）、Ｎ−メタクリロイルグリシルフェニルアラニルロイシルグリシン−アミノマロン酸（ＭＡ−ＧＦＬＧ−ｄｉＣＯＯＨ）、Ｎ−（３−アミノプロピル）メタクリルアミド、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項４に記載の結合体。
11. 前記生物活性剤が、第２の切断可能なリンカーを介して前記水溶性高分子セグメントに連結された、請求項１に記載の結合体。
12. 前記水溶性高分子セグメントが、請求項４〜１０のいずれか一項における１つまたは複数の不飽和水溶性モノマーと、式ＩＩ
    

    

    （式中、Ｒ^１は、水素またはメチルであり、
    ＸはＯまたはＮＲ^２であり、ここで、Ｒ^２は水素またはアルキル基であり、
    Ｌ^１は、第２の切断可能なリンカーであり、そして
    Ｚは、生物活性剤である）
    を含むモノマーとの重合生成物を含む、請求項１１に記載の結合体。
13. 前記第１および第２の切断可能なリンカーが、酵素、ｐＨの変化、またはこれらの組み合わせによって切断される、請求項１に記載の結合体。
14. 前記第１および第２の切断可能なリンカーが、２〜１３個のアミノ酸残基を有するペプチドを含む、請求項１に記載の結合体。
15. 前記第１および第２の切断可能なリンカーが、配列番号１〜２２のアミノ酸配列を有するペプチドである、請求項１に記載の結合体。
16. 前記第１のリンカーが、式ＩＩＩ
    −（ＡＡ_１）−Ｋ−（ＡＡ_２）− （ＩＩＩ）
    （式中、ＡＡ_１およびＡＡ_２は、６個までのアミノ酸を含む同一または異なるアミノ酸配列であり、そして
    Ｋは、リジン、オルニチン、またはジアミンである）
    を有する、請求項１に記載の結合体。
17. 前記第１および第２の切断可能なリンカーが、ｐＨ感受性リンカーを含む、請求項１に記載の結合体。
18. 前記ｐＨ感受性リンカーが、カルボキシアルキルマレイン酸リンカーまたはアスコルビン酸リンカーである、請求項１７に記載の結合体。
19. 前記生物活性剤が前記第１の切断可能なリンカーに共有結合され、前記生物活性剤がカップリング反応によって前記切断可能なリンカーに結合された、請求項１に記載の結合体。
20. 前記生物活性剤が抗癌剤を含む、請求項１に記載の結合体。
21. 前記生物活性剤が、パクリタキセル、ドセタキセル、ゲムシタビン、白金酸塩（シスプラチン、カルボプラチン、ＤＡＣＨ−Ｐｔ）、ドキソルビシン、ゲルダナマイシン、または９−アミノカンプトテシンを含む、請求項１に記載の結合体。
22. ２つ以上の異なる生物活性剤が前記結合体に共有結合された、請求項１に記載の結合体。
23. 前記水溶性高分子セグメント、前記第１の切断可能なリンカー、またはこれらの組み合わせに、標的基が共有結合された、請求項１に記載の結合体。
24. 前記標的基が、抗体、抗体断片、糖類、またはエピトープ結合ペプチド、またはアプタマーである、請求項２３に記載の結合体。
25. 請求項１〜２４のいずれか一項に記載の結合体と、薬学的に許容可能なキャリアとを含む医薬組成物。
26. 前記組成物が、薬学的に許容可能なキャリアとして無菌水性媒体を含む注射可能な組成物である、請求項２５に記載の医薬組成物。
27. 生物活性剤を被験者に送達するための方法であって、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の結合体を前記被験者に投与することを含む方法。
28. 請求項１〜２４のいずれか一項に記載の結合体の、生物活性剤のための送達デバイスとしての使用。
29. 前記水溶性高分子セグメントおよび前記第１の切断可能なリンカーが、アジド−アルキン反応、チオール−エン反応、酸化反応、またはディールス−アルダー反応によって互いにカップリングされる、請求項１に記載の結合体。

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