JP2013521801A - タンパク質及びポリペプチドの産生 - Google Patents

Abstract

所望の非スピドロインタンパク質又はポリペプチドを生産する方法が、適切な宿主中で融合タンパク質を発現し、融合タンパク質を含む混合物得て、任意で融合タンパク質を単離することを含んでなる。融合タンパク質は、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）断片に由来する少なくとも一つの溶解性増強部分を含む。それは、所望の非スピドロインタンパク質又はポリペプチドである少なくとも一つの部分を更に含んでいる。各溶解性増強部分は、望まれるタンパク質又はポリペプチド部分へ直接又は間接的に結合している。

Description

発明の技術分野
本発明は、タンパク質及びポリペプチドの産生の分野に関連し、より具体的には、スパイダーシルクタンパク質（スピドロイン（ｓｐｉｄｒｏｉｎｓ））とその他、非スピドロインタンパク質及びポリペプチドの産生に関する。本発明は、スピドロインタンパク質／ポリペプチド又は非スピドロインタンパク質／ポリペプチドであり得る、望みのタンパク質を生産する方法を提供する。また、望みのタンパク質及びポリペプチドの産生のための新規融合タンパク質中間体、並びにこれらの中間体をコードするポリ核酸分子が提供される。

発明の背景
ＤＮＡからのタンパク質及びポリペプチドの産生は、様々な宿主で成しえることができるが、共通の問題は、不溶性のタンパク質／ポリペプチド凝集体の形成である。これは、機能性タンパク質／ポリペプチドの産生を大幅に妨げうるか又は阻み得る。この問題に対する一つの解決策は、必要な溶解性を提供するタンパク質またはポリペプチドとの融合タンパク質として、望みのタンパク質又はポリペプチドを発現させることである。本融合タンパク質は開裂され得、そして望みのタンパク質が単離され得る。

問題は、一般的に、低溶解性タンパク質又はポリペプチド、例えば膜に結合したタンパク質及びポリペプチドにより悪化される。例えば、肺サーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ：表６）は、肺胞ＩＩ型細胞により産生され、サーファクタント（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ）の構成物である膜貫通タンパク質であり、呼気終末で肺胞の崩壊を防ぐために必要である。新生児はしばしば不十分な量のサーファクタントに起因する呼吸困難に苦しむ。今日、この病気は、動物の肺から抽出されたサーファクタント製剤で治療される。ＳＰ−Ｃ−３３はＳＰーＣの変異体であって、膜貫通へリックスの残基（通常は主にバリン）がロイシンと置換される。ＳＰ−Ｃ−３３は、膜への適切な挿入を含む、天然のＳＰ−Ｃの機能を保持するが、凝集を起こしにくく、従って、合成のサーファクタント製剤の開発のために大量に生産するすることが可能である。ＳＰ−Ｃ−３３はこれまでに、ＤＮＡから生産することが可能ではなく、今日化学合成により製造されている。

組換えＤＮＡから発現される場合に困難をもたらすタンパク質とペプチドの他の例は、Ａβ−ペプチド、ＩＡＰＰ、ＰｒＰ、αシヌクレイン、カルシトニン、プロラクチン、シスタチン、ＡＴＦ及びアクチン；ＳＰ−Ｂ、αディフェンシン及びβディフェンシン、クラスＡＨアポリポタンパク質；ＬＬ−３７、ＳＰ−Ｃ、ＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ、Ｂｒｉｃｈｏｓ、ＧＦＰ、ニューロセルピン：ＥＰＯとＧＨを含むホルモン；及びＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩを含む成長因子；アビジン及びストレプトアビジン；及びプロテアーゼ３Ｃである。

本発明の目的は、タンパク質及びポリペプチド、特に、非スピドロインタンパク質及びポリペプチドの生産のための新しい手段と方法を提供することである。

本発明の目的はまた、水における溶解度が低い、タンパク質及びポリペプチド、特に、非スピドロインタンパク質及びポリペプチド、例えば、組換えＤＮＡから生産された場合凝集しやすいタンパク質及びポリペプチド、膜タンパク質及びポリペプチド、及びアミロイド形成タンパク質及びポリペプチドの生産のための新しい手段と方法を提供することである。

本発明の更なる目的は、タンパク質又はポリペプチド薬物及び薬物標的の生産について代替の手段と方法を提供することである。

本発明の目的は、ジスルフィドを含有するタンパク質及びポリペプチドの生産のための新しい手段と方法を提供することである。

本発明の目的はまた、アポリポタンパク質の生産のための新しい手段と方法を提供することである。

以下の明細書から明らかであろうこれら及び他の目的について、本発明は、第一の態様によれば、望みのタンパク質又はポリペプチドを生産する方法において有用である融合タンパク質を提供する。融合タンパク質はそのように有用であり得、又は開裂されて望みのタンパク質又はポリペプチドを単離形態で得ることができる。本発明の融合タンパク質は、（ｉ）スパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）の断片に由来する少なくとも一つの溶解性増強部分；及び（ｉｉ）望まれるタンパク質又はポリペプチドである少なくとも一つの部分を含み、各々の溶解性増強部分は、望まれるタンパク質又はポリペプチドに直接又は間接的に結合している。

融合タンパク質の所定の実施態様において、各溶解性増強部分は配列番号６に少なくとも８０％の同一性、又は配列番号８に少なくとも５０％の同一性を有する。融合タンパク質の特定の実施態様において、各溶解性増強部分は１００から１６０アミノ酸残基を含有する。

一実施態様において、融合タンパク質は、融合タンパク質が、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）断片から由来する単一の溶解性増強部分を含む場合、スパイダーシルクタンパク質又はポリペプチドは、非スピドロインタンパク質又はポリペプチドであるという条件に従う。

好ましい実施態様において、望まれるタンパク質又はポリペプチドは非スピドロインタンパク質又はポリペプチドである。幾つかの実施態様において、望まれるタンパク質又はポリペプチドは、配列番号６から１０の何れかに３０％未満の同一性を有する。

所定の実施態様において、融合タンパク質は、少なくとも二つの溶解性増強部分を含み、各々はスパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）断片に由来する。特定の実施態様において、融合タンパク質は、少なくとも二つの連続する溶解性増強部分を含み、各々はスパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）断片に由来する。

融合タンパク質の幾つかの実施態様において、少なくとも一つの溶解性増強部分が、少なくとも一つの望みのタンパク質又はポリペプチド部分のアミノ末端又はカルボキシ末端に直接的又は間接的に結合している。特定の実施態様において、少なくとも一つの溶解性増強部分は、融合タンパク質のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端を構成する。

一実施態様において、融合タンパク質は、（ｉｉｉ）少なくとも一つの望まれるタンパク質又はポリペプチド部分と少なくとも一つの溶解性増強部分との間に配置される少なくとも一つの開裂部位を含む。

融合タンパク質の所定の実施態様において、望まれるタンパク質又はポリペプチドは、海綿動物、有櫛動物、クラゲ、サンゴ、イソギンチャク、扁形動物、ワムシ、回虫、紐形動物、二枚貝、巻貝、タコ、条虫類、甲殻類、昆虫類、コケムシ、腕足類、箒虫動物、ヒトデ、ウニ、ホヤ、ナメクジウオ、ヒトを含む脊椎動物、植物、真菌、酵母、細菌、古細菌又はウイルスに由来するか、又は人工的なタンパク質又はポリペプチドである。特定の実施態様において、望まれるタンパク質又はポリペプチドは、軟体動物、昆虫、ヒトを含む脊椎動物、植物、真菌、酵母、細菌、古細菌又はウイルスに由来するか、又は人工タンパク質又はポリペプチドである。更なる特定の実施態様において、望まれるタンパク質又はポリペプチドは、ヒトを含む脊椎動物、植物、真菌、酵母、細菌、古細菌又はウイルスに由来するか、又は人工タンパク質又はポリペプチドである。

融合タンパク質の幾つかの実施態様において、望まれるタンパク質又はポリペプチドは、アミロイド形成タンパク質及びポリペプチド、ジスルフィド含有タンパク質及びポリペプチド、アポリポタンパク質、膜タンパク質及びポリペプチド、タンパク質及びポリペプチド医薬品及び薬物標的、凝集しやすいタンパク質及びポリペプチド、及びプロテアーゼからなる群から選択される。融合タンパク質の特定の実施態様において、望まれるタンパク質又はポリペプチドは、Ａβ−ペプチド、ＩＡＰＰ、ＰｒＰ、αシヌクレイン、カルシトニン、プロラクチン、シスタチン、ＡＴＦ及びアクチン；ＳＰ−Ｂ、αディフェンシン及びβディフェンシン、クラスＡＨアポリポタンパク質；ＬＬ−３７、ＳＰ−Ｃ、ＳＰ−Ｃ３３、ＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ、Ｂｒｉｃｈｏｓ、ＧＦＰ、ニューロセルピン：ＥＰＯとＧＨを含むホルモン；及びＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを含む成長因子；アビジン及びストレプトアビジン；及びプロテアーゼ３Ｃから成る群から選択される。

融合タンパク質の好ましい実施態様は、配列番号２６、２８、３０、３４、３７、３９、４２、及び４７、及びこれらのタンパク質の何れかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質からなる群から選択される。

特定の態様によれば、望まれるタンパク質又はポリペプチドはスピドロインタンパク質又はポリペプチドである。好ましい望まれるスピドロインタンパク質は、スパイダーシルクタンパク質の反復断片由来の７０から３００アミノ酸残基の反復断片；及び断片がスパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片に由来する７０から１２０アミノ酸残基のＣ末端断片、及び任意でスパイダーシルクタンパク質のＮ末端に由来する１００から１６０アミノ酸残基のＮ末端断片を包含している。

更に好ましい望まれるスピドロインタンパク質は、式ＲＥＰ−ＣＴ及び式ＮＴ−ＲＥＰ−ＣＴにより定められるタンパク質の群から選択され、ここでＮＴは１００から１６０アミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、その断片はスパイダーシルクタンパク質に由来するＮ末端断片であり；ＲＥＰは７０から３００アミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、ここで前記断片は、Ｌ（ＡＧ）_ｎＬ、Ｌ（ＡＧ）_ｎＡＬ、Ｌ（ＧＡ）_ｎＬ、Ｌ（ＧＡ）_ｎＧＬからなる群から選択され、ここでｎは２から１０の整数であり；各個々のＡセグメントは８から１８アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで０から３のアミノ酸残基はＡｌａではなく、残りのアミノ酸残基がＡｌａであり；各個々のＧセグメントは１２から３０アミノ酸残基のアミノ酸配列であり、ここで少なくとも４０％のアミノ酸残基がＧｌｙであり；かつ各個々のＬセグメントが０から２０アミノ酸残基のリンカーアミノ酸残基であり；かつＣＴが７０から１２０アミノ酸残基を有するタンパク質断片であり、その断片はスパイダーシルクタンパク質由来のＣ末端断片である。

その他の態様によれば、本発明は、本発明による融合タンパク質をコードする単離されたポリ核酸を提供する。単離されたポリ核酸の好ましい実施態様は、配列番号２６、２８、３０、３４、３７、３９、４２及び４７、及び、これらのタンパク質の何れかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質からなる群；及び配列番号２７、２９、３１、３８、４０、４３及び４８からなる核酸の群から選択される融合タンパク質をコードする核酸からなる群から選択される。

一態様によれば、本発明は、望まれるタンパク質又はポリペプチドの生産のための融合タンパク質中の溶解性増強部分として、スパイダーシルクタンパク質のN末端（NT）断片に由来する少なくとも一つの部分の新規な使用を提供する。好ましい実施態様において、望まれるタンパク質又はポリペプチドは非スピドロインタンパク質又はポリペプチドである。一実施態様において、融合タンパク質が、スパイダーシルクタンパク質のN末端（NT）断片から由来する単一の溶解性増強部分を含む場合、スパイダーシルクタンパク質又はポリペプチドは、非スピドロインタンパク質又はポリペプチドである、という条件に従う。特定の実施態様において、望まれるタンパク質又はポリペプチドはスピドロインタンパク質又はポリペプチドである。

その他の態様において、本発明は、以下の工程を含む融合タンパク質を生産する方法を提供する：ａ）本発明による融合タンパク質を適切な宿主で発現し；そしてｂ）融合タンパク質を含む混合物を得て、任意で融合タンパク質を単離する。

関連する態様によれば、本発明は、以下の工程を含む望みのタンパク質又はポリペプチドを生産する方法を提供する：ａ）本発明による融合タンパク質を適切な宿主で発現し；そしてｂ）融合タンパク質又はポリペプチドを含む混合物を得て、任意で融合タンパク質又はポリペプチドを単離する。所定の実施態様において、この方法は更に以下の工程を含む：ｃ）融合タンパク質を開裂し望みのタンパク質又はポリペプチドを与え；そしてｄ）望みのタンパク質又はポリペプチドを単離し；ここで前記融合タンパク質は、（ｉｉｉ）少なくとも一つの望みのタンパク質又はポリペプチド部分と少なくとも一つの溶解性増強部分との間に配置された少なくとも一つの開裂部位を含んでいる。

これらの方法の所定の実施態様において、工程ｂ）は、固定化ＮＴ部分を持つ親和性媒体上で、及び／又は陰イオン交換媒体上での融合タンパク質の精製を更に含む。特定の実施態様において、親和性媒体上での融合タンパク質の精製は、ｐＨ６．３以下で、固定化ＮＴ部分による親和性媒体への会合と、その後、望まれる解離媒体による親和性媒体からの解離により実施される。更なる特定の実施態様において、解離媒体はｐＨが６．４以上、ｐＨが４．１以下を有し、及び／又は高いイオン強度を有する。幾つかの実施態様において、陰イオン交換媒体上での融合タンパク質の精製は、ｐＨ６．４以上で陰イオン交換媒体への会合と、その後、高いイオン強度を有する解離媒体による陰イオン交換媒体からの解離により実施される。これらの方法の幾つかの実施態様において、工程ｂ）での融合タンパク質の精製は、カラムの中、官能面を持つ磁気ビーズ上、又は官能面を持つフィルター上で起きる。

図１は、スピドロインＮ末端ドメインの配列アラインメントを示す。 図２は、スピドロインＣ末端ドメインの配列アラインメントを示す。 図３は、融合タンパク質の電気泳動ゲルを示す。 図４は、融合タンパク質から得られたＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕタンパク質の電気泳動ゲルを示す。 図５は、融合タンパク質から得られた、ＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕを含むサーファクタント懸濁液のインビトロでの表面活性を示す。 図６は、ＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ融合タンパク質の電気泳動ゲルを示す。 図７は、Ｂｒｉｃｈｏｓ融合タンパク質の電気泳動ゲルを示す。 図８は、融合タンパク質から得られたＧＦＰ融合タンパク質及びＧＦＰの電気泳動ゲルを示す。 図９は、融合タンパク質から得られたニューロセルピン融合タンパク質及びニューロセルピンの電気泳動ゲルを示す。

発明の詳細な記述
本発明は、タンパク質及びポリペプチドの産生、特に非スピドロインタンパク質タンパク質及びポリペプチドに関する。この生産の目的に依存して、最終産物は異なり得る。例えば、脂質膜に挿入されたタンパク質又はポリペプチド、溶液状態でのタンパク質又はポリペプチド、又は他の生物分子と会合したタンパク質又はポリペプチドを得ることが望ましい場合がある。また、望みのタンパク質又はポリペプチドを、融合タンパク質の一部として得ることも非常に望まれ得ることも実現されるべきであり、それは精製、検出のために適したハンドルを与え、及び／又は望まれる特性、例えば、安定性及び溶解性を提供し得る。

本発明は、一般に、組換えＤＮＡから作られる融合タンパク質中の溶解性増強部分としてスパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）の断片の有用性の見識に基づいている。従って、本発明は、第一の態様に従い、（ｉ）スパイダーシルクタンパク質のＮＴ断片に由来する少なくとも一つの溶解性増強部分；（ｉｉ）望まれるタンパク質又はポリペプチドである少なくとも一つの部分を含む融合タンパク質を提供する。好ましい実施態様において、融合タンパク質は、（ｉ）スパイダーシルクタンパク質のＮＴ断片に由来する少なくとも一つの溶解性増強部分；及び（ｉｉ）望まれるタンパク質又はポリペプチドであり、任意で、本明細書に開示された他の好ましい特徴、例えば、溶解性増強部分と望まれるタンパク質又はポリペプチドとの間にリンカーペプチド及び／又は開裂部位を含む、少なくとも一つの部分から成る。実験においては、大腸菌において、異なる融合タンパク質の驚くほど高い収量が得られている。融合タンパク質は、単離された形態で、例えば、可溶形態において他では凝集したか又は溶解性が貧弱なタンパク質の研究、又はＸ線結晶学に関する結晶化などで有用であり得る。融合タンパク質はまた、望むタンパク質を遊離するために切断することができる。

用語「融合タンパク質」は、ここでは、組換え核酸、すなわち、通常は一緒に生じるであろう二つ以上の核酸を組み合わせることにより人工的に創られる、ＤＮＡ又はＲＮＡからの発現により作成されるタンパク質を意味する（遺伝子操作）。本発明による融合タンパク質は、組み合えタンパク質であり、従って、天然に生じるタンパク質に同一ではない。特に、野生型スピドロインは、上記に定めた組換え核酸から発現されないため、本発明による融合タンパク質ではない。結合された核酸配列は、特定の機能的特性を持つ異なるタンパク質、部分的なタンパク質又はポリペプチドをコードしている。得られる融合タンパク質、又は組換え融合タンパク質は、もとのタンパク質、部分的タンパク質又はポリペプチドの各々から由来した機能特性を持つ単一タンパク質である。

所定の実施態様において、本発明及び対応する遺伝子による融合タンパク質は、キメラであり、すなわち、タンパク質／遺伝子断片は、少なくとも２つの異なる種に由来する。溶解性増強部分は、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片から由来する。この態様によれば、望まれるタンパク質又はポリペプチドは非スピドロインタンパク質である。このことは、望まれるタンパク質又はポリペプチドは、スパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片、反復性断片、又はＮ末端断片からは由来しないことを意味する。

本発明による融合タンパク質はまた、一以上のリンカーペプチドを含む。リンカーペプチドは、溶解性増強部分と望まれるタンパク質又はポリペプチドとの間に配置され得るか、又は溶解性増強部分と望まれるタンパク質又はポリペプチドのどちらかの終端に配置され得る。融合タンパク質が２つ以上の溶解性増強部分を含有する場合、リンカーペプチドはまた２つの溶解性増強部分との間に配置され得る。リンカーは、融合タンパク質の機能単位の間にスペーサーを提供することができるが、融合タンパク質の同定及び精製のためのハンドル、例えばＨｉｓ及び／又はＴｒｘタグ、を構成し得る。融合タンパク質が、融合タンパク質の同定と精製のために２つ以上のリンカーペプチドを含む場合、それらはスペーサー配列、例えば、Ｈｉｓ_６−スペーサー−Ｈｉｓ_６−、などのスペーサー配列により隔てられているのが望まれる。リンカーはまた、シグナル認識粒子などのシグナルペプチドをも構成し得、それは融合タンパク質を膜へと導き、及び／又は宿主細胞から周囲の培地への融合タンパク質の分泌を引き起こす、融合タンパク質はまた、そのアミノ酸配列中に、リンカー及び／又は溶解性増強部分の切断及び除去を可能にする、開裂部位を含み得る。様々な開裂部位が、例えば、化学試薬、例えばＣＮＢｒによるＭｅｔ残基の後ろの開裂部位、及びヒドロキシルアミンによるＡｓｎ−Ｇｌｙ残基間の開裂部位、トロンビン又はプロテアーゼ３Ｃなどのプロテアーゼの開裂部位、及びインテイン自己スプライシング配列などの自己スプライシング配列が、当業者に知られている。

各溶解性増強部分は、望まれるタンパク質又はポリペプチド部分へ直接又は間接的に結合している。直接的結合は、リンカーなどの、介在配列無しで、２つの部分の間の直接共有結合を意味する。間接的な結合はまた、２つの部分が共有結合で結合されているが、リンカー及び／又は一以上の更なる溶解性増強部分などの介在配列があることを意味する。

少なくとも一つの溶解性増強部分は、望まれるタンパク質又はポリペプチドのどちらかの終端で配置され得、すなわち、Ｃ末端に配置されるか又はＮ末端に配置される。少なくとも一つの溶解性増強部分は、望まれるタンパク質又はポリペプチドのＮ末端に配置されることが好まれる。仮に融合タンパク質が、融合タンパク質の同定と精製のために一つ以上のリンカー、例えばＨｉｓ又はＴｒｘタグを含む場合、融合タンパク質のＮ末端に配置されることが好まれる。少なくとも一つの溶解性増強部分はまた、望まれるタンパク質又はポリペプチドの中に、例えば、望まれるタンパク質のドメイン又は部分の間に組込まれ得る。好ましい実施態様において、少なくとも一つの溶解性増強部分は、融合タンパク質のＮ末端及び／又はＣ末端を構成し、すなわち、溶解性増強部分の末端にはリンカーペプチド又は他の配列が存在しない。本発明による典型的な融合タンパク質は、１から６，例えば１から４，例えば１から２の溶解性増強部分を含み得る。

好ましい実施態様において、融合タンパク質は、少なくとも二つの溶解性増強部分を含み、各々はスパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）断片に由来する。溶解性増強部分、好ましくは２つの溶解性増強部分は、望まれるタンパク質又はポリペプチドのどちらかの終端に連続的に配置され得、すなわち、Ｃ末端に配置されるか又はＮ末端に配置される。連続的に配置された溶解性増強部分はまた、望まれるタンパク質又はポリペプチドの中に、例えば、望まれるタンパク質のドメイン又は部分の間に組込まれ得る。溶解性増強部分はまた、望まれるタンパク質又はポリペプチドの各終端のどちらかに、非連続的に配置され得、すなわち、Ｃ末端及びＮ末端に配置されるか、又は望まれるタンパク質又はポリペプチドの一つの終端に配置され、望まれるタンパク質又はポリペプチドの中に組込まれ得る。典型的な好ましい融合タンパク質は、２から６，例えば２から４の溶解性増強部分を含み得る。

好ましい実施態様において、融合タンパク質は、少なくとも一つの望まれるタンパク質又はポリペプチド部分と少なくとも一つの溶解性増強部分との間に配置される少なくとも一つの開裂部位を有する。このことは、融合タンパク質の開裂と望まれるタンパク質の精製を可能にする。しかしながら、望みのタンパク質又はポリペプチドを、融合タンパク質の一部として得ることも非常に望まれ得ることも実現されるべきであり、それは精製、検出のために適したハンドルを与え、及び／又は望まれる特性、例えば、安定性及び溶解性を提供し得ることが特記される。この場合、開裂部位は省くことができ得るか、又は開裂部位は包含され得るが開裂工程は省略され得る。

好ましい融合タンパク質は、Ｎ末端に溶解性増強部分が配置された形態を有し、１から３０アミノ酸残基、例えば１から１０アミノ酸残基のリンカーペプチドによって、Ｃ末端に配置された望まれるタンパク質又はポリペプチドへ結合している。リンカーペプチドは開裂部位を含み得る。任意で、融合タンパク質はＮ末端又はＣ末端に、Ｈｉｓタグ、及び開裂部位などの精製タグを含み得るリンカーペプチドを有する。

その他の好ましい融合タンパク質は、Ｃ末端に配置された望まれるタンパク質又はポリペプチドへ直接結合した溶解性増強部分をＮ末端に配置した形態を有する。任意で、融合タンパク質はＮ末端又はＣ末端に、Ｈｉｓタグ、及び開裂部位などの精製タグを含み得るリンカーペプチドを有する。

一つの好ましい融合タンパク質は、Ｎ末端に溶解性増強部分が２つ連続して配置された形態を有し、１から３０アミノ酸残基、例えば１から１０アミノ酸残基のリンカーペプチドによって、Ｃ末端に配置された望まれるタンパク質又はポリペプチドへ結合している。リンカーペプチドは開裂部位を含み得る。任意で、融合タンパク質はＮ末端又はＣ末端に、Ｈｉｓタグ、及び開裂部位などの精製タグを含み得るリンカーペプチドを有する。

その他の好ましい融合タンパク質は、Ｃ末端に配置された望まれるタンパク質又はポリペプチドへ直接結合した溶解性増強部分をＮ末端に２つ連続して配置した形態を有する。任意で、融合タンパク質はＮ末端又はＣ末端に、Ｈｉｓタグ、及び開裂部位などの精製タグを含み得るリンカーペプチドを有する。

溶解性増強部分は、スパイダーシルクタンパク質又はスピドロインのＮＴ断片から由来する。実施例は必然的に特定のＮＴ断片、ユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）由来の主要スピドロイン１（ＭａＳｐ１）に由来したタンパク質に関連するが、ここに開示された方法はいかなる類似タンパク質部分にも適用されると考えられる。用語「スピドロイン」及び「スパイダーシルクタンパク質」は、記述を通して同義に用いられ、全ての既知のスパイダーシルクタンパク質を包含し、典型的には「ＭａＳｐ」、ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の場合「ＡＤＦ」と略される主要アンプル型スパイダーシルクタンパク質を含む。これらの主要アンプル型スパイダーシルクタンパク質は一般に１と２の２つのタイプがある。これらの用語は更に、添付の特許請求の範囲と項目別の実施態様で定義されるように、本発明による新しいＮＴタンパク質断片、及び既知のスパイダーシルクＮＴタンパク質断片に高度な同一性及び／又は類似性を持つ他の非天然タンパク質を含む。

溶解性増強部分は、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）アミノ酸配列に高度な類似性を有する。図１に示されるように、このアミノ酸配列はＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２を含む、様々な種及びスパイダーシルクタンパク質のあいだで良く保存されている。図１において、以下のスピドロインＮＴ断片がアラインされ、必要に応じＧｅｎＢａｎｋの受託エントリーで表示されている。

Ｎ末端ドメインに対応する部分のみが、シグナルペプチドを除いて、各配列について示されている。ＮｃフラッグとＮｌｍフラッグが、Rising A. et al. Biomacromolecules 7, 3120-3124 (2006)に従って翻訳され編集された。

溶解性増強部分が完全には欠失していない限り、本発明による融合タンパク質において、どの溶解性増強部分が存在するかは重大ではない。従って、本発明による溶解性増強部分は、図１に示されたアミノ酸配列又は高度な類似性を持つ配列の何れかから選択することができる。様々な溶解性増強部分が、本発明による融合タンパク質に使用することができる。図１の相同配列に基づいて、以下の配列が、コンセンサス溶解性増強アミノ酸配列を構成する：ＱＡＮＴＰＷＳＳＰＮＬＡＤＡＦＩＮＳＦ（Ｍ／Ｌ）ＳＡ（Ａ／Ｉ）ＳＳＳＧＡＦＳＡＤＱＬＤＤＭＳＴＩＧ（Ｄ／Ｎ／Ｑ）ＴＬＭＳＡＭＤ（Ｎ／Ｓ／Ｋ）ＭＧＲＳＧ（Ｋ／Ｒ）ＳＴＫＳＫＬＱＡＬＮＭＡＦＡＳＳＭＡＥＩＡＡＡＥＳＧＧ（Ｇ／Ｑ）ＳＶＧＶＫＴＮＡＩＳＤＡＬＳＳＡＦＹＱＴＴＧＳＶＮＰＱＦＶ（Ｎ／Ｓ）ＥＩＲＳＬＩ（Ｇ／Ｎ）Ｍ（Ｆ／Ｌ）（Ａ／Ｓ）ＱＡＳＡＮＥＶ（配列番号８）。

本発明による溶解性増強部分の配列は、図１のアミノ酸配列に基づき、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８に対して少なくとも５０％同一性、好ましくは少なくとも６０％同一性を有する。好ましい実施態様において、本発明による溶解性増強部分の配列は、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８に対して、少なくとも６５％同一性、好ましくは少なくとも７０％同一性を有する。好ましい実施態様において、本発明による溶解性増強部分は、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８に対して、更に７０％、好ましくは８０％の類似性を有する。

本発明による代表的な溶解性増強部分は、ユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）配列の配列番号６である。本発明の好ましい実施態様によれば、溶解性増強部分は、配列番号６又は図１の個々の何れかのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％同一性を有する。本発明の好ましい実施態様にて、溶解性増強部分は、配列番号６又は図１の個々の何れかのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有する。本発明の好ましい実施態様において、溶解性増強部分は配列番号６又は図１の個々の何れかのアミノ酸配列に対して、特にＥａ ＭａＳｐ１に対して同一である。

用語「％同一性」は、本明細書と添付された特許請求の範囲の全体を通して使用されるように、以下のように計算される。クエリ配列は、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを使用して、標的配列にアラインされる(Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J., Nucleic Acids Research, 22: 4673-4680 (1994))。比較は、整列された配列の最短に対応するウィンドウを介して行われる。各位置でアミノ酸配列が比較され、標的配列において同一対応を有するクエリ配列における位置の割合いが、％同一性として報告される。

「％類似性」は、本明細書と添付された特許請求の範囲の全体を通して使用されるように、疎水性残基のＡｌａ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ及びＣｙｓは類似し；塩基残基のＬｙｓ、Ａｒｇ及びＨｉｓは類似し、；酸性残基のＧｌｕとＡｓｐは類似し；親水性残基、無電荷残基のＧｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒは類似していることを例外として、「％同一性」について説明されるように計算される。残りの天然アミノ酸のＧｌｙはこの文脈中の他の何れのアミノ酸に対して似ていない。

この説明全体を通して、本発明による他の代わりの実施態様は、明記された同一性の割合の代わりに、対応する類似の割合を実行する。別の代わりの実施態様は、明記された同一性の割合並びに、各配列について好ましい同一性の割合の群から選択された、その他のより高い割合の類似性を実行する。例えば、配列はその他の配列に７０％類似している可能性があり；又はそれはその他の配列に７０％同一であり得；又はそれはその他の配列に７０％同一で９０％類似であり得る。

溶解性増強部分は１００から１６０アミノ酸残基を含む。溶解性増強部分は、少なくとも１００，又は１１０を上回る、好ましくは１２０を上回るアミノ酸残基を含むことが望まれる。また、溶解性増強部分は、多くても１６０、又は１４０未満のアミノ酸残基を含むことが望まれる。典型的な溶解性増強部分は約１３０から１４０アミノ酸残基を含む。

本発明の所定の実施態様において、望まれるタンパク質又はポリペプチドはスピドロインタンパク質又はポリペプチドである。本発明の望まれるスピドロインタンパク質又はポリペプチドの配列は、ここで開示されたスピドロインアミノ酸配列の何れかに対して、少なくとも５０％の同一性、例えば少なくとも６０％同一性、好ましくは少なくとも７０％の同一性を有する。好ましい実施態様において、本発明の望まれるスピドロインタンパク質又はポリペプチドの配列は、ここで開示されたスピドロインアミノ酸配列の何れかに対して、少なくとも８０％同一性、好ましくは少なくとも９０％の同一性を有する。

好ましい実施態様において、望まれるスピドロインタンパク質は、スパイダーシルクタンパク質の反復断片由来の７０から３００アミノ酸残基の反復断片；及び断片がスパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片に由来する７０から１２０アミノ酸残基のＣ末端断片を包含している。任意で、望まれるスピドロインタンパク質は、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００から１６０アミノ酸残基のＮ末端断片を包含している。望まれるスピドロインタンパク質は、１７０から６００アミノ酸残基、好ましくは２８０から６００アミノ酸残基、例えば３００から４００アミノ酸残基、より好ましくは３４０から３８０アミノ酸残基からなる。長いスパイダーシルクタンパク質が、可溶化及び重合のための過酷な溶剤の使用を必要とする非晶質の凝集体を形成する傾向があるので、小さいサイズが有利である。タンパク質断片は、典型的んはペプチド結合により共有結合される。

特定の好ましい実施態様において、望まれるスピドロインタンパク質は、式ＮＴ_２−ＲＥＰ−ＣＴ（又はＮＴ−ＮＴ−ＲＥＰ−ＣＴ）、ＮＴ−ＲＥＰ−ＣＴ及びＲＥＰ−ＣＴで定義されるタンパク質の群から選択される。

ＮＴ断片は、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端アミノ酸配列に高度な類似性を有する。図１に示されるように、このアミノ酸配列はＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２を含む、様々な種及びスパイダーシルクタンパク質のあいだで良く保存されており、図１もまた参照。

本発明による望まれるスピドロインタンパク質において、どの特定のＮＴ断片が存在しているかは重大ではない。従って、本発明によるＮＴ断片は、図１に示されたアミノ酸配列又は高度な類似性を持つ配列の何れかから選択することができる。様々なＮ末端配列が、本発明による所望のスピドロインタンパク質に使用することができる。図１の相同配列に基づいて、以下の配列が、コンセンサスＮＴアミノ酸配列を構成する：ＱＡＮＴＰＷＳＳＰＮＬＡＤＡＦＩＮＳＦ（Ｍ／Ｌ）ＳＡ（Ａ／Ｉ）ＳＳＳＧＡＦＳＡＤＱＬＤＤＭＳＴＩＧ（Ｄ／Ｎ／Ｑ）ＴＬＭＳＡＭＤ（Ｎ／Ｓ／Ｋ）ＭＧＲＳＧ（Ｋ／Ｒ）ＳＴＫＳＫＬＱＡＬＮＭＡＦＡＳＳＭＡＥＩＡＡＡＥＳＧＧ（Ｇ／Ｑ）ＳＶＧＶＫＴＮＡＩＳＤＡＬＳＳＡＦＹＱＴＴＧＳＶＮＰＱＦＶ（Ｎ／Ｓ）ＥＩＲＳＬＩ（Ｇ／Ｎ）Ｍ（Ｆ／Ｌ）（Ａ／Ｓ）ＱＡＳＡＮＥＶ（配列番号８）。

好ましい実施態様において、本発明によるＮＴ断片の配列は、図１のアミノ酸配列に基づいて、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８に対して、少なくとも５０％同一性、好ましくは少なくとも６０％同一性を有する。好ましい実施態様において、本発明による溶解性増強部分の配列は、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８に対して、少なくとも６５％同一性、好ましくは少なくとも７０％同一性を有する。好ましい実施態様において、本発明によるＮＴ断片は、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号８に対して、更に７０％、好ましくは８０％の類似性を有する。

本発明による代表的なＮＴ断片は、ユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）配列の配列番号６である。本発明の好ましい実施態様によれば、ＮＴ断片は、配列番号６又は図１の個々の何れかのアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％の同一性を有する。本発明の好ましい実施態様において、ＮＴ断片は、配列番号６又は図１の個々の何れかのアミノ酸配列に対して、少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有する。本発明の好ましい実施態様において、ＮＴ断片は配列番号６又は図１の個々の何れかのアミノ酸配列に対して、特にＥａ ＭａＳｐ１に対して同一である。

ＮＴ断片は１００から１６０アミノ酸残基を含む。ＮＴ断片は、少なくとも１００，又は１１０を上回る、好ましくは１２０を上回るアミノ酸残基を含むことが望まれる。また、ＮＴ断片は、多くても１６０、又は１４０未満のアミノ酸残基を含むことが望まれる。典型的なＮＴ断片は約１３０から１４０アミノ酸残基を含む。

ＲＥＰ断片は、アラニンリッチストレッチとグリシンリッチストレッチを交互に反復特性を有する。ＲＥＰ断片は、一般に、７０を上回る、例えば１４０を上回り、かつ３００未満、好ましくは２４０未満、例えば２００のアミノ酸残基を含み、下記により詳細に説明されるように、それ自身を幾つかのＬ（リンカー）セグメント、Ａ（アラニンリッチ）セグメント及びＧ（グリシンリッチ）セグメントに分割することができる。典型的には、前記リンカーは任意であって、ＲＥＰ断片末端に位置しており、一方残りのセグメントは順にアラニンリッチ及びグリシンリッチである。従って、ＲＥＰ断片は一般的に以下の構造のどちらかを有することができ、ここでｎは整数である。
Ｌ（ＡＧ）_ｎＬ、例えばＬＡ_１Ｇ_１Ａ_２Ｇ_２Ａ_３Ｇ_３Ａ_４Ｇ_４Ａ_５Ｇ_５Ｌ；
Ｌ（ＡＧ）_ｎＡＬ、例えばＬＡ_１Ｇ_１Ａ_２Ｇ_２Ａ_３Ｇ_３Ａ_４Ｇ_４Ａ_５Ｇ_５Ａ_６Ｌ；
Ｌ（ＧＡ）_ｎＬ、例えばＬＧ_１Ａ_１Ｇ_２Ａ_２Ｇ_３Ａ_３Ｇ_４Ａ_４Ｇ_５Ａ_５Ｌ；又は
Ｌ（ＧＡ）_ｎＧＬ、例えばＬＧ_１Ａ_１Ｇ_２Ａ_２Ｇ_３Ａ_３Ｇ_４Ａ_４Ｇ_５Ａ_５Ｇ_６Ｌ.
当然、アラニンリッチセグメント又はグリシンリッチセグメントは、N-末端またはC-末端のリンカーセグメントに隣接しているかどうかは重要ではないということになる。ｎは２から１０の整数、好ましくは２から８、同様に好ましくは４から８、より好まれるのは４から６であり、すなわちｎ＝４、ｎ＝５、又はｎ＝６である。

好ましい実施態様では、本発明によるＲＥＰ断片のアラニン含有量は、２０％を超え、好ましくは２５％を超え、より好ましくは３０％を超え、かつ５０％未満、好ましくは４０％未満、より好ましくは３５％未満である。アラニンの高い含有量は、硬く、及び／又は強力な、及び／又はより少ない伸展性繊維を提供することが想定されるので、このことは有利である。

所定の実施態様において、ＲＥＰの断片はプロリン残基を欠いており、すなわち、ＲＥＰ断片にはＰｒｏ残基は無い。

次に、本発明によるＲＥＰ断片を構成するセグメントに目を向けると、各々のセグメントは個別であり、すなわち、特定のＲＥＰ断片の任意の２つのＡセグメント、任意の２つのＧセグメント、又は任意の２つのＬセグメントは同一であるか又は同一でない場合がある。従って、セグメントの各タイプが特定のＲＥＰ断片内で同一であることは、本発明の一般的特徴ではない。むしろ、以下の開示は、どのように個々のセグメントを設計し、それらを、本発明による機能性スパイダーシルクタンパク質の一部であるＲＥＰ断片に集めるかについて、当業者にガイドラインを提供している。

各個々のＡ断片は、８から１８アミノ酸残基を有するアミノ酸配列である。個々のＡセグメントは１３から１５アミノ酸残基を含有することが好ましい。また、Ａセグメントの大半、又は２つ以上が、１３から１５個のアミノ酸残基を含有し、そしてＡセグメントの少数、例えば１つ又は２つが、８から１８アミノ酸残基、例えば８から１２、又は１６から１８アミノ酸残基を含有することが可能である。これらのアミノ酸残基の大部分はアラニン残基である。より具体的には、アミノ酸残基の０から３はアラニン残基ではなく、残りのアミノ酸残基がアラニン残基である。従って、各個別のＡセグメントの全てのアミノ酸残基は、例外なく、又は１つ、２つ又は３つのアミノ酸残基が任意のアミノ酸であって良い例外を除き、アラニン残基である。アラニン置換アミノ酸は天然のアミノ酸であり、好ましくは、セリン、グルタミン酸、システイン、及びグリシン、より好ましくはセリンから個別に選択される。もちろん、一以上のＡセグメントが全てアラニンセグメントであり、一方、残りのＡセグメントが１から３の非アラニン残基、例えばセリン、グルタミン酸、システイン又はグリシンなどを含有することは可能である。

好ましい実施態様において、各Ａセグメントは、上に開示されたように１０から１５のアラニン残基、及び０から３の非アラニン残基を含む、１３から１５のアミノ酸残基を含む。より好ましい実施態様において、各Ａセグメントは、上に開示されたように１２から１５のアラニン残基、及び０から１の非アラニン残基を含む、１３から１５のアミノ酸残基を含む。

各個々のＡセグメントは、配列番号１０のアミノ酸残基７−１９、４３−５６、７１−８３、１０７−１２０、１３５−１４７、１７１−１８３、１９８−２１１、２３５−２４８、２６６−２７９、２９４−３０６、３３０−３４２、３５７−３７０、３９４−４０６、４２１−４３４、４５８−４７０、４８９−５０２、５１７−５２９、５５３−５６６、５８１−５９４、６１８−６３０、６４８−６６１、６７６−６８８、７１２−７２５、７４０−７５２、７７６−７８９、８０４−８１６、８４０−８５３、８６８−８８０、９０４−９１７、９３２−９４５、９６９−９８１、９９９−１０１３、１０２８−１０４２及び１０６０−１０７３の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。この群の各配列は、ユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）ＭａＳｐ１タンパク質の天然に生じる配列のセグメントに対応し、これは対応するｃＤＮＡのクローニングから推定される。国際公開第２００７／０７８２３９号を参照。あるいは、各個々のＡセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基１４３−１５２、１７４−１８６、２０４−２１８、２３３−２４７及び２６５−２７８の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。この群の各配列は、本発明による、発現された、非天然スパイダーシルクタンパク質のセグメントに対応し、そのタンパク質は適切な条件下でシルク繊維を形成する能力を有する。従って、本発明による所定の実施態様において、各個々のＡセグメントは、上述のアミノ酸セグメントから選択されたアミノ酸配列に対して同一である。いかなる特定の理論に束縛されることを望むことなく、本発明によるＡセグメントは、らせん構造又はβシートを形成することが想定される。

更に、実験データから、各個々のＧセグメントは１２から３０アミノ酸残基のアミノ酸配列であることが結論付けられている。個々のＧセグメントは１４から２３アミノ酸残基から成ることが好ましい。各Ｇセグメントの少なくとも４０％のアミノ酸残基はグリシン残基である。典型的には、各個々のＧセグメントのグリシン含量は、４０から６０％の範囲にある。

各個々のＧセグメントは、配列番号１０のアミノ酸残基２０−４２、５７−７０、８４１０６、１２１−１３４、１４８−１７０、１８４−１９７、２１２−２３４、２４９−２６５、２８０−２９３、３０７−３２９、３４３−３５６、３７１−３９３、４０７−４２０、４３５−４５７、４７１−４８８、５０３−５１６、５３０−５５２、５６７−５８０、５９５−６１７、６３１−６４７、６６２−６７５、６８９−７１１、７２６−７３９、７５３−７７５、７９０−８０３、８１７−８３９、８５４−８６７、８８１−９０３、９１８−９３１、９４６−９６８、９８２−９９８、１０１４−１０２７、１０４３−１０５９及び１０７４−１０９２の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。この群の各配列は、ユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）ＭａＳｐ１タンパク質の天然に生じる配列のセグメントに対応し、これは対応するｃＤＮＡのクローニングから推定される。国際公開第２００７／０７８２３９号を参照。あるいは、各個々のＧセグメントは、配列番号３のアミノ酸残基１５３−１７３、１８７−２０３、２１９−２３２、２４８−２６４及び２７９−２９６の群から選択されるアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％、最も好ましくは１００％の同一性を有する。この群の各配列は、本発明による、発現された、非天然スパイダーシルクタンパク質のセグメントに対応し、そのタンパク質は適切な条件下でシルク繊維を形成する能力を有する。従って、本発明による所定の実施態様において、各個々のＧセグメントは、上述のアミノ酸セグメントから選択されたアミノ酸配列に対して同一である。

所定の実施態様において、本発明による各Ｇセグメントのアミノ酸残基は、−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ではない。

本発明によれば、Ｇセグメント３つのサブタイプがある。この分類は、ユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）ＭａＳｐ１タンパク質配列（国際公開第２００７／０７８２３９号）の注意深い解析に基づいており、その情報は、新規な非天然スパイダーシルクタンパク質の構築において用いられ検証されている。

本発明によるＧセグメントの第一のサブタイプは、アミノ酸の一文字コンセンサス配列ＧＱＧ（Ｇ／Ｓ）ＱＧＧ（Ｑ／Ｙ）ＧＧ（Ｌ／Ｑ）ＧＱＧＧＹＧＱＧＡＧＳＳ（配列番号１１）により表わされる。この第一の、そして一般的に最長のＧセグメントサブタイプは、典型的には、２３アミノ酸残基を含むが、わずか１７アミノ酸残基しか含まない場合もあり、荷電残基を欠損するか又は一つの荷電残基を含む。従って、この第一のＧセグメントサブタイプは、１７から２３アミノ酸残基を含むことが望まれるが、わずか１２又は３０ものアミノ酸残基を含み得ることが意図されている。いかなる特定の理論に束縛されることを望むことなく、このサブタイプは、コイル構造又は３_１−ヘリックス構造を形成することが想定される。この第一のサブタイプの代表的なＧセグメントは、アミノ酸配列１０のアミノ酸残基２０−４２、８４−１０６、１４８−１７０、２１２−２３４、３０７−３２９、３７１−３９３、４３５−４５７、５３０−５５２、５９５−６１７、６８９−７１１、７５３−７７５、８１７−８３９、８８１−９０３、９４６−９６８、１０４３−１０５９及び１０７４−１０９２である。所定の実施態様において、本発明によるこの第一のサブタイプの各Ｇセグメントの最初の２つのアミノ酸残基は、−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−ではない。

本発明によるＧセグメントの第ニのサブタイプは、アミノ酸の一文字コンセンサス配列ＧＱＧＧＱＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）ＹＧＱＧ（Ａ／Ｓ）Ｇ（Ｓ／Ｇ）Ｓ（配列番号１２）により表わされる。この第二の、一般には中規模の、Ｇセグメントサブタイプは、典型的には１７アミノ酸残基を含み、荷電残基を欠損するか又は一つの荷電残基を含む。この第二のＧセグメントサブタイプは、１４から２０アミノ酸残基を含むことが望まれるが、わずか１２又は３０ものアミノ酸残基を含み得ることが意図されている。いかなる特定の理論に束縛されることを望むことなく、このサブタイプは、コイル構造を形成することが想定される。この第二のサブタイプはの代表的なＧセグメントは、配列番号１０のアミノ酸残基２４９−２６５、４７１−４８８、６３１−６４７及び９８２−９９８、及び配列番号３のアミノ酸残基１８７−２０３である。

本発明によるＧセグメントの第三のサブタイプは、アミノ酸の一文字コンセンサス配列Ｇ（Ｒ／Ｑ）ＧＱＧ（Ｇ／Ｒ）ＹＧＱＧ（Ａ／Ｓ／Ｖ）ＧＧＮ（配列番号１３）により表わされる。この第三のＧセグメントサブタイプは、典型的には１４アミノ酸残基を含み、一般的には本発明によるＧセグメントサブタイプの最短である。この第三のＧセグメントサブタイプは、１２から１７アミノ酸残基を含むことが望まれるが、２３ものアミノ酸残基を含み得ることが意図されている。いかなる特定の理論に束縛されることを望むことなく、このサブタイプは、ターン構造を形成することが想定される。この第三のサブタイプの代表的なＧセグメントは、アミノ酸配列１０のアミノ酸残基５７−７０、１２１−１３４、１８４−１９７、２８０−２９３、３４３−３５６、４０７−４２０、５０３−５１６、５６７−５８０、６６２−６７５、７２６−７３９、７９０−８０３、８５４−８６７、９１８−９３１、１０１４−１０２７；及び配列番号３のアミノ酸残基２１９−２３２である。

従って、好ましい実施態様において、各個々のＧセグメントは、配列番号１１、配列番号１２、及び配列番号１３から選択されたアミノ酸配列に対して、少なくとも８０％、好ましくは９０％、より好ましくは９５％の同一性を有する。

ＲＥＰ断片のＡセグメントとＧセグメントの交互配列の好ましい実施態様において、全ての第二のＧセグメントは第一のサブタイプであり、一方残りのＧセグメントは第三のサブタイプ、例えば、．．．Ａ_１Ｇ_短いＡ_２Ｇ_長いＡ_３Ｇ_短いＡ_４Ｇ_長いＡ_５Ｇ_短い．．．である。ＲＥＰ断片のその他の好ましい実施態様において、第二のサブタイプの一つのＧセグメントが、挿入、例えば．．．Ａ_１Ｇ_短いＡ_２Ｇ_長いＡ_３Ｇ_中間Ａ_４Ｇ_短いＡ_５Ｇ_長い．．．を介して規則的にＧセグメントを中断する。

各個々のＬセグメントは、任意のリンカーアミノ酸配列を表わし、０から２０アミノ酸残基、例えば０から１０アミノ酸残基を包含しうる。このセグメントは任意であって、スパイダーシルクタンパク質にとって機能的に重要ではないが、その存在は完全に機能的なスパイダーシルクタンパク質をさらに可能とし、本発明によるスパイダーシルク繊維を形成する。また、ユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）由来のＭａＳｐ１タンパク質の推定アミノ酸配列の反復部分（配列番号１０）に存在するリンカーアミノ酸配列もある。特に、リンカーセグメントのアミノ酸配列は、記載されたＡセグメント又はＧセグメントの何れかに似ている可能性があるが、一般的には、本明細書で定義されるような基準を満たすには十分でない。

国際公開第２００７／０７８２３９号に示されるように、ＲＥＰ断片のＣ末端部分に配置されたリンカーセグメントは、アミノ酸の１文字コンセンサス配列ＡＳＡＳＡＡＡＳＡＡ ＳＴＶＡＮＳＶＳ及びＡＳＡＡＳＡＡＡにより表わされ、それらはアラニンに富んでいる。実は、第二の配列は本発明によるＡセグメントであると考えることができ、一方、第一の配列は本発明によるＡセグメントに高度な類似性を有する。本発明によるリンカーセグメントのその他の例では、１文字アミノ酸配列ＧＳＡＭＧＱＧＳを有し、グリシンに富み、本発明によるＧセグメントに高度な類似性を有する。リンカーセグメントのその他の例はＳＡＳＡＧである。

代表的なＬセグメントは、配列番号１０のアミノ酸残基１−６及び１０９３−１１１０；配列番号３のアミノ酸残基１３８−１４２であるが、当業者は、これらのセグメントについて多くの適切な代替アミノ酸配列があることを容易に認識するであろう。本発明によるＲＥＰ断片の一実施態様において、Ｌセグメントの一つは０アミノ酸を含む、すなわちＬセグメントの一つを欠いている。本発明によるＲＥＰ断片のその他の実施態様において、両方のＬセグメントが０アミノ酸を含む、すなわち両方のＬセグメントの一つを欠いている。従って、本発明によるＲＥＰ断片のこれらの実施態様は、以下のように模式的に表わすことができる；（ＡＧ)_ｎＬ、(ＡＧ)_ｎＡＬ、(ＧＡ)_ｎＬ、(ＧＡ)_ｎＧＬ；Ｌ(ＡＧ)_ｎ、Ｌ(ＡＧ)_ｎＡ、Ｌ(ＧＡ)_ｎ、Ｌ(ＧＡ)_ｎＧ；及び(ＡＧ)_ｎ、(ＡＧ)_ｎＡ、(ＧＡ)_ｎ、(ＧＡ)_ｎＧ。任意のこれらのＲＥＰ断片は、以下に定められるように、任意のＣＴ断片との使用に適している。

望まれるスピドロインタンパク質のＣＴ断片は、スパイダーシルクタンパク質のＣ末端アミノ酸配列に高度な類似性を有する。国際公開第２００７／０７８２３９号に示されるように、このアミノ酸配列はＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２を含む、様々な種及びスパイダーシルクタンパク質のあいだで良く保存されている。ＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２のＣ末端領域のコンセンサス配列は、配列番号９として提供される。図2において、以下のＭａＳｐタンパク質がアラインされ、必要に応じＧｅｎＢａｎｋの受託エントリーで表示されている。

本発明によるスパイダーシルクタンパク質において、どの特定のＣＴ断片が、もしあれば、存在しているかは重大ではない。従って、本発明によるＣＴ断片は、図２及び表２に示されたアミノ酸配列又は高度な類似性を持つ配列の何れかから選択することができる。様々なＣ末端配列が、本発明によるスパイダーシルクタンパク質に使用することができる。

本発明によるＣＴ断片の配列は、図２のアミノ酸配列に基づいて、コンセンサスアミノ酸配列の配列番号９に対して、少なくとも５０％同一性、好ましくは少なくとも６０％同一性、より好ましくは少なくとも６５％の同一性、又は実に少なくとも７０％の同一性を有する。

本発明による代表的なＣＴ断片は、ユープロステノプス オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ ａｕｓｔｒａｌｉｓ）配列の配列番号ｙである。従って、本発明による好ましい態様によれば、ＣＴ断片は、配列番号７又は図２及び表２の個々の何れかのアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、例えば少なくとも９５％の同一性を有する。本発明の好ましい実施態様において、ＣＴ断片は配列番号７又は図２及び表２の個々の何れかのアミノ酸配列に対して同一である。

ＣＴ断片は７０から１２０アミノ酸残基からなる。ＣＴ断片は、少なくとも７０，又は８０を上回る、好ましくは９０を上回るアミノ酸残基を含むことが望まれる。また、ＣＴ断片は、多くても１２０、又は１１０未満のアミノ酸残基を含むことが望まれる。典型的なＣＴ断片は約１００アミノ酸残基を含む。

その他の態様によれば、本発明による望まれるタンパク質又はポリペプチドは、融合タンパク質が、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）断片に由来する、単一溶解性増強部分を含む場合、非スピドロインタンパク質又はポリペプチドである。好ましい実施態様において、望まれるタンパク質又はポリペプチドは非スピドロインタンパク質又はポリペプチドである。本発明による望まれる非スピドロインタンパク質又はポリペプチドの配列は、ここで開示されたスピドロインアミノ酸配列の何れか、特に配列番号６から１０の何れかに対して、３０％未満の同一性、例えば２０％未満の同一性、好ましくは１０％未満の同一性を有する。

好ましい実施態様において、望まれる非スピドロインタンパク質又はポリペプチドは、海綿動物、有櫛動物、クラゲ、サンゴ、イソギンチャク、扁形動物、ワムシ、回虫、紐形動物、二枚貝、巻貝、タコ、条虫類、甲殻類、昆虫類、コケムシ、腕足類、箒虫動物、ヒトデ、ウニ、ホヤ、ナメクジウオ、ヒトを含む脊椎動物、植物、真菌、酵母、細菌、古細菌又はウイルスに由来するか、又は人工的なタンパク質又はポリペプチドである。「由来する」により、本発明による望まれる非スピドロインタンパク質又はポリペプチドが、天然に生じ維持された機能を有する対応するタンパク質に対して、好ましくは少なくとも５０％の同一性、好ましくは少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％の同一性、又は実に少なくとも９０％の同一性、例えば９５ー１００％の同一性を有することを意味する。一つの好ましい実施態様において、望まれる非スピドロインタンパク質又はポリペプチドは、軟体動物、昆虫、ヒトを含む脊椎動物、植物、真菌、酵母、細菌、古細菌又はウイルスに由来するか、又は人工タンパク質又はポリペプチドである。好ましい実施態様において、望まれる非スピドロインタンパク質又はポリペプチドは、ヒトを含む脊椎動物、植物、真菌、酵母、細菌、古細菌又はウイルスに由来するか、又は人工タンパク質又はポリペプチドである。

好ましい実施態様において、望まれる非スピドロインタンパク質又はポリペプチドは、アミロイド形成タンパク質及びポリペプチド、ジスルフィド含有タンパク質及びポリペプチド、アポリポタンパク質、膜タンパク質及びポリペプチド、タンパク質及びポリペプチド医薬品及び薬物標的、凝集しやすいタンパク質及びポリペプチド、及びプロテアーゼからなる群から選択される。

本発明に係るアミロイド形成タンパク質及びポリペプチドは、疾患及び機能性アミロイドに関連付けられているタンパク質又はポリペプチドが含まれる。アミロイド形成タンパク質及びポリペプチドの例は、アミロイドベータペプチド（Ａβ−ペプチド）、膵島アミロイドポリペプチド（アミリン又はＩＡＰＰ）、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、α−シヌクレイン、カルシトニン、プロラクチン、シスタチン、心房性ナトリウム利尿因子（ＡＴＦ）及びアクチンを含む。本発明によるアミロイド形成タンパク質及びポリペプチドの例は、表３に一覧される。

ジスルフィド含有タンパク質及びポリペプチドの例としては、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）及びその変異体、例えばＭｉｎｉ−Ｂ、Ｍｉｎｉ−Ｂ２７、Ｍｉｎｉ−ＢＬｅｕ、α−ディフェンシン及びβディフェンシンを含む。特定の理論に限定されるものではないが、溶解性増強部分はディフェンシン及び他のジスルフィド含有タンパク質及びポリペプチドにおける鎖間ジスルフィド結合よりも鎖内ジスルフィド結合の所望の形成を促進することが熟考されている。本発明によるジスルフィド含有タンパク質及びポリペプチドの例は、表４に一覧される。

アポリポタンパク質の例はクラスＡ−Ｈアポリポタンパク質を含む。本発明によるアポリポタンパク質の例は、表５に一覧される。

膜タンパク質とポリペプチドの例は、膜結合受容体を含み、サイトカイン受容体、ＫＬ４、ＬＬ−３７、ＳＰ−Ｃ（Ｌｅｕ）、サーファクタントプロテインＣ（ＳＰ−Ｃ）及びこれらの変異体、例えば、ＳＰ−Ｃ（Ｌｅｕ）、ＳＰ−Ｃ３３、ＳＰ−Ｃ３０及びＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕなどを含む。他の特定の例は、Ｍｉｎｉ−Ｂ、Ｍｉｎｉ−ＢＬｅｕ、１ａ ＡＡ、１ｂ ＡＡ、０ ＡＡＡＡ、１ａ ＬＬ、１ｂ ＬＬ、０ ＬＬＬＬ又はＳＰ−Ｂタンパク質に、任意でＧｌｙ_ｎ、Ｌｅｕ_ｎ、Ｇｌｙ−Ａｌａ_ｎなどのリンカーを介して融合したＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕを含む。ＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕは、ＭｉｎｉＢ，Ｍｉｎｉ−ＢＬｅｕ、１ａ ＡＡ、１ｂ ＡＡ、０ ＡＡＡＡ、１ａ ＬＬ、１ｂ ＬＬ、０ ＬＬＬＬ又はＳＰ−Ｂタンパク質のＮ末端か、又は好ましくはＣ末端に配置され得る。本発明による膜タンパク質及びポリペプチドの例は、表６に一覧される。

タンパク質及びポリペプチド薬物及び薬物標的の例は、組換え生産されるホルモンを含み、ペプチド及びタンパク質ホルモン、例えば、エリスロポエチン（ＥＰＯ）及び成長ホルモン（ＧＨ）、サイトカイン、成長因子、例えばインスリン様増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ及びＩＧＦ−ＩＩ）、ＫＬ４、ＬＬ−３７、サーファクタントプロテインＣ（ＳＰーＣ）及びその変異体、例えばＳＰＣ（Ｌｅｕ）、ＳＰ−Ｃ３３、ＳＰ−Ｃ３０及びＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕを含む。他の特定の例は、Ｍｉｎｉ−Ｂ、Ｍｉｎｉ−ＢＬｅｕ、１ａ ＡＡ、１ｂ ＡＡ、０ ＡＡＡＡ、１ａ ＬＬ、１ｂ ＬＬ、０ ＬＬＬＬ又はＳＰ−Ｂタンパク質に、任意でＧｌｙ_ｎ、Ｌｅｕ_ｎ、Ｇｌｙ−Ａｌａ_ｎなどのリンカーを介して融合したＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕを含む。ＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕは、ＭｉｎｉＢ，Ｍｉｎｉ−ＢＬｅｕ、１ａ ＡＡ、１ｂ ＡＡ、０ ＡＡＡＡ、１ａ ＬＬ、１ｂ ＬＬ、０ ＬＬＬＬ又はＳＰ−Ｂタンパク質に対してＮ末端か、又は好ましくはＣ末端に配置され得る。本発明によるタンパク質及びポリペプチド薬物及び薬物標的の例は、表７に一覧される。

凝集しやすいタンパク質及びポリペプチドの例は、アビジン、ストレプトアビジンおよびサイトカイン受容体の細胞外リガンド結合部分を含む。本発明による凝集しやすいタンパク質及びポリペプチドの例は、表８に一覧される。

プロテアーゼの例は、コクサッキーウイルス又はヒトライノウイルス由来の３Ｃプロテアーゼを含む。本発明によるプロテアーゼの例は、表９に一覧される。

本発明の好ましい実施態様において、望まれる非スピドロインタンパク質は、サーファクタントタンパク質Ｂ（ＳＰ−Ｂ）及びその変異体、例えば、Ｍｉｎｉ−Ｂ、Ｍｉｎｉ−Ｂ２７、Ｍｉｎｉ−ＢＬｅｕ、ＫＬ４、ＬＬ−３７、及びサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）及びその変異体、例えば、ＳＰＣ（Ｌｅｕ）、ＳＰ−Ｃ３３、ＳＰ−Ｃ３０及びＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕから選択される。本発明による他の好ましい非スピドロインタンパク質は、ニューロセルピン、ＧＦＰ、及び１ａ ＡＡ、１ｂ ＡＡ、０ ＡＡＡＡ、１ａ ＬＬ、１ｂ ＬＬ及び０ ＬＬＬＬタンパク質である。

本発明の所定の好ましい実施態様において、融合タンパク質は、配列番号２６、２８、３０、３４、３７、３９、４２、及び４７、及びこれらのタンパク質の何れかに対して少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％の同一性を有するタンパク質からなる群から選択される。

その他の態様によれば、本発明は、本発明による融合タンパク質をコードする単離されたポリ核酸を提供する。好ましい実施態様では、単離されたポリ核酸は、配列番号２７、２９、３１、３８、４０、４３及び４８からなる群から選択される。その他の好ましい実施態様では、単離されたポリ核酸は、配列番号１４−１６、１８及び２４からなる群から選択される。

一態様によれば、本発明は、望まれるタンパク質又はポリペプチドの生産のための融合タンパク質中の溶解性増強部分として、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）断片に由来する少なくとも一つの部分の新規な使用を提供する。好ましい実施態様において、望まれるタンパク質又はポリペプチドはスピドロインタンパク質又はポリペプチドである。融合タンパク質が、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）断片に由来した単一の溶解性増強部分を含む場合、所望のタンパク質が非スピドロインタンパク質又はポリペプチドであることは好ましい選択肢である。好ましい一実施態様では、所望のタンパク質またはポリペプチドは、非スピドロインタンパク質又はポリペプチドである。

その他の態様によれば、本発明は、融合タンパク質の生産方法を提供する。第一の工程は、本発明に係る融合タンパク質を適切な宿主で発現することを含む。適切な宿主は、当業者に周知であり、例えば、細菌細胞及び真核細胞、例えば、酵母、昆虫細胞株及び哺乳動物細胞株などを含む。典型的には、この工程は、大腸菌で融合タンパク質をコードするポリ核酸分子の発現を含む。

第二の方法の工程では、融合タンパク質を含有する混合物を得ることを含む。混合物は、例えば、宿主細胞を溶解又は機械的に破壊することによって得ることができる。融合タンパク質が宿主細胞によって分泌される場合に、混合物はまた、細胞培養培地を収集することによって得ることができる。このようにして得られたタンパク質は、標準的な手順を用いて単離することができる。必要であれば、この混合物を遠心分離にかけて、適切な画分（沈殿物又は上清）を収集することができる。融合タンパク質を含有する混合物はまた、分離させるために、ゲルろ過クロマトグラフィー、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、透析法、相分離又は濾過に供することができる。任意で、リポ多糖及び他の発熱物質がこの段階で積極的に除去される。必要ならば、リンカーペプチドは、この工程で切断することによって除去することができる。

好ましい実施態様では、得られた混合物は、液体培地、典型的には、塩緩衝液又は細胞培養培地中に溶解させた融合タンパク質を含む。好ましい一実施態様では、混合物は６．３未満のｐＨ、好ましくは６未満のｐＨを有し、可溶性ＮＴドメインの会合を促進する。その他の好ましい実施態様では、混合物は６．４を上回るｐＨ、より好ましくは７を上回るｐＨを有し、可溶性ＮＴドメインの会合を促進する。６．４を上回るｐＨ、例えば７を上回るｐＨは、所望のタンパク質／ポリペプチドがスピドロインタンパク質に由来するか、又は所望のタンパク質／ポリペプチドがアミロイド形成又は凝集しやすいタンパク質／ポリペプチドである、本発明による融合タンパク質の溶解性を改善するために有用である。

関連する態様によれば、本発明は、所望のタンパク質又はポリペプチドを生産する方法を提供する。第一の工程は、本発明に係る融合タンパク質を適切な宿主で発現することを含む。適切な宿主は、当業者に周知であり、例えば、細菌細胞及び真核細胞、例えば、酵母、昆虫細胞株及び哺乳動物細胞株などを含む。典型的には、この工程は、大腸菌中で融合タンパク質をコードするポリ核酸分子の発現を含む。

第二の方法の工程では、融合タンパク質を含有する混合物を得ることを含む。混合物は、例えば、宿主細胞を溶解又は機械的に破壊すること、例えば超音波処理によって得ることができる。融合タンパク質が宿主細胞によって分泌される場合に、混合物はまた、細胞培養培地を収集することによって得ることができる。このようにして得られたタンパク質は、標準的な手順を用いて単離することができる。必要であれば、この混合物を遠心分離にかけて、適切な画分（沈殿物又は上清）を収集することができる。融合タンパク質を含有する混合物はまた、分離させるために、ゲルろ過クロマトグラフィー、例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、透析法、相分離又は濾過に供することができる。任意で、リポ多糖及び他の発熱物質がこの段階で積極的に除去される。必要ならば、リンカーペプチドは、この工程で切断することによって除去することができる。上記に示したように、これは、所望のタンパク質又はポリペプチドの最も適した形態、すなわち融合タンパク質の一部としてであってよい。精製及び検出のための適切なハンドルを与え、及び／又は所望の特性、例えば安定性及び特に溶解性を与え得る。

好ましい実施態様において、本方法はまた、所望のタンパク質またはポリペプチドを与えるために、融合タンパク質を開裂する工程をも含み得る。この実施態様において、融合タンパク質は、少なくとも一つの望まれるタンパク質又はポリペプチド部分と少なくとも一つの溶解性増強部分との間に配置される少なくとも一つの開裂部位を含む。典型的な融合タンパク質において、このことは、溶解性増強部分又は複数の部分、及び所望のタンパク質又はポリペプチドの間の単一の開裂部位が存在することを意味する。開裂は、標準的な手順を用いて、例えば、臭化シアン（ＣＮＢｒ）によるＭｅｔの後ろでの開裂、ヒドロキシルアミンによるＡｓｎとＧｌｙの残基間の開裂、−ＸＬＥＴＬＦＱＧＸ−部位でのＧｌｎとＧｌｙの残基間でのプロテアーゼ３Ｃによる開裂、及び当業者に良く知られた様々な他のプロテアーゼ部位での開裂によってなし遂げることができる。

このようにして得られた所望のタンパク質又はポリペプチドは、標準的な手順を用いて単離することができる。必要であれば、この混合物を遠心分離にかけて、適切な画分（沈殿物又は上清）を収集することができる。所望のタンパク質又はポリペプチドを含有する混合物はまた、分離させるために、ゲルろ過、クロマトグラフィー、透析法、相分離又は濾過に供することができる。任意で、リポ多糖及び他の発熱物質がこの段階で積極的に除去される。必要ならば、リンカーペプチドは、この工程で切断することによって除去することができる。

好ましい実施態様では、得られた混合物は、液体培地、典型的には、塩緩衝液又は細胞培養培地中に溶解させた融合タンパク質を含む。好ましい一実施態様では、混合物は６．３未満のｐＨ、好ましくは６未満のｐＨ、例えば４．２から６．３又は４．２から６の間隔を有し、可溶性ＮＴドメインの会合を促進する。その他の好ましい実施態様では、混合物は６．４を上回るｐＨ、より好ましくは７を上回るｐＨを有し、可溶性ＮＴドメインの会合を促進する。６．４を上回るｐＨ、例えば７を上回るｐＨは、所望のタンパク質／ポリペプチドがスピドロインタンパク質に由来するか、又は所望のタンパク質／ポリペプチドがアミロイド形成又は凝集しやすいタンパク質／ポリペプチドである、本発明による融合タンパク質の溶解性を改善するために有用である。

従って、融合タンパク質は、典型的には、液体培地中の溶液として得られる。用語「可溶性」及び「溶液中」とは、融合タンパク質が目視で凝集されず、６００００×ｇで溶媒から沈殿しないことを意味する。液体媒体は、任意の適切な媒体、例えば水性媒体、好ましくは生理学的媒体、典型的にはバッファリングされた水性媒体、例えば１０−５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ緩衝液又はリン酸緩衝液であり得る。液体媒体は好ましくはｐＨが６．４以上、例えば７以上を有し、及び／又は溶解性増強部分の重合を防ぐイオン組成物を有する。つまり、液体媒体は典型的にはｐＨが６．４以上、例えば７以上を有し、又は溶解性増強部分の重合を防ぐイオン組成物を有し、又は双方を有する。

溶解性増強部分の重合を防ぐイオン組成物は、当業者により容易に調製され得る。溶解性増強部分の重合を防止する好ましいイオン組成物は３００ｍＭを越えるのイオン強度を有する。溶解性増強部分の重合を防止するイオン組成物の具体的な例は、３００ｍＭを超えるＮａＣｌ、１００ｍＭのリン酸、及び溶解性増強部分の重合化において所望の防止効果を有するこれらのイオンの組合わせ、例えば１０ｍＭのリン酸及び３００ｍＭのＮａｃｌを包含する。

驚くべきことに、溶解性増強部分の存在が溶液の安定性を向上させ、これらの条件下でポリマー重合形成を防止することが見いだされている。このことは、即時重合が望まれ得ない場合、例えばタンパク質精製の間、大規模なバッチの調製において、又は別の条件が最適化される必要がある場合、有利であり得る融合タンパク質の高い安定性を達成するために、液体媒体のｐＨは６．７以上、例えば７．０以上に調整されることが望まれる。また、液体媒体のｐＨは、スパイダーシルクタンパク質の十分な溶解性を与えるが、６．３以下への続くｐＨ調整を容易にする６．４から６．８の範囲へ調整されることも有利であり得る。

本発明のその他の態様は、ｐＨが約（ｃａ）７から６に下げられるか、又はより具体的には６．４以上から６．３未満へ下げられる場合に、ＮＴドメインは大きな可溶性会合体を形成するであろうという見識に基づいている。この会合体は、４．２を超えるｐＨ、すなわち、４．２から６．３の範囲、例えば４．２から６の範囲で最も効率的に生じる。この特性は、例えば、ＮＴがカラム上に固定化されている場合、親和性精製について使用することができる。このアプローチは、会合体はｐＨが約６から７に上昇した場合に分離するため、生理学的に関連した間隔内でのｐＨの変化により結合タンパク質の遊離を可能にする。

本発明による方法の望まれる実施態様において、融合タンパク質を単離する工程は、親和性媒体、例えば固定化したＮＴ部分を持つアフィニティーカラム上、及び／又は陰イオン交換カラムなど陰イオン交換媒体上での融合タンパク質の精製を包含する。親和性媒体上での融合タンパク質の精製は、好ましくは、ｐＨが６．３以下、好ましくは４．２から６．３の範囲において、固定化ＮＴドメインを持つ親和性媒体への会合と、続く、例えば、６．４以上のｐＨ、４．１以下のｐＨを有し、及び／又は高いイオン強度を有する所望の解離媒体による親和性媒体からの解離により行うことができる。陰イオン交換媒体上での融合タンパク質の精製は、好ましくは、ｐＨ６．４以上での陰イオン交換媒体への会合と、その後、高いイオン強度を有する解離媒体による陰イオン交換媒体からの解離により実施される。必要に応じて、固定化ＮＴ部分を有するアフィニティーカラムなどの親和性媒体上での融合タンパク質の精製は、陰イオン交換カラムとなどの陰イオン交換媒体上での精製と組み合わせることができる。高いイオン強度を有する解離媒体は、典型的には、３００ｍＭを上回るイオン強度、例えば３００ｍＭのＮａＣｌなどを有する。

これらの２つの親和性に基づいた手順は、本発明による溶解性増強部分の固有の特性を利用する。とりわけ興味深いのは、スピドロインＮＴタンパク質断片の、ｐＨ６．３未満、特に４．２から６．３の範囲で会合する強い傾向である、このことは、強力な親和性精製ツールとして有利に利用することができ、複合体混合物から本発明による融合タンパク質を一工程で精製することを可能としている。クロマトグラフィーが好ましいが、クロマトグラフィー以外の親和性に基づく精製方法、例えば、機能化表面を持つ磁気ビーズ又は機能化表面を持つフィルター等を明らかに用いることができる。

また、ＮＴドメインは、ｐＨが約７から６に下げられ、又はより具体的には、６．４超から６．３未満に、好ましくは４．２から６．３の範囲、例えば４．２から６の範囲に下げられた場合に大きな可能性会合体を形成するであろうという見識も、巨視的なポリマー、例えば、本明細書に開示されるものなどのスパイダーシルクタンパク質の繊維、フィルム、発泡体、網又はメッシュなどを生産する方法において等、ＮＴ含有タンパク質の会合を促進することが望まれる場合に有用である。単離されたスパイダーシルクタンパク質のポリマーを生産する好ましい方法は、
（ｉ）１７０から６００アミノ酸残基からなり、
スパイダーシルクタンパク質のＮ末端断片由来の１００から１６０アミノ酸残基のＮ末端断片、及び
アピドロインタンパク質の反復断片由来の７０から３００アミノ酸残基の反復断片、及び任意で、
断片がスパイダーシルクタンパク質のＣ末端断片から由来する、７０から１２０アミノ酸残基のＣ末端断片
を包含するスパイダーシルクタンパク質を提供し、
（ｉｉ）ｐＨ６．４以上での液体媒体中に前記スパイダーシルクタンパク質の溶液、及び／又は、前記スパイダーシルクタンパク質の重合を防ぐイオン組成物を提供し、任意でリポ多糖及び他の発熱物質の除去を含み、
（ｉｉｉ）前記液体媒体の特性を、ｐＨ６．３以下、例えば４．２−６．３に、及び、前記スパイダーシルクタンパク質の前記重合を可能にするイオン組成物へ調整し、
（ｉｖ）液体媒体中でスパイダーシルクタンパク質に固体ポリマーを形成させ、前記液体媒体が、ｐＨ６．３以下、例えば４．２−６．３と、前記スパイダーシルクタンパク質の重合を可能にするイオン組成物を有し、及び
（ｖ）前記液体媒体から固体スパイダーシルクタンパク質を単離する
工程を含んでいる。

本発明は、以下の非限定的実施例により、以下に更に説明されるであろう。

実施例１ ＳＰーＣ３３Ｌｅｕ融合タンパク質の生産
Ｈｉｓ_６への融合体としてＮＴ−ＭｅｔＳＰ−３３Ｌｅｕをコードする遺伝子を含有する発現ベクターが構築された（配列番号２６−２７）。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が０．９から１まで増殖され、２５℃で３時間更にインキュベートされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられた。細胞は遠心分離によって回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁された。

リゾチームが添加され、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。Ｔｗｅｅｎを０．７％の最終濃度まで添加した。細胞は、超音波処理により、氷上で５分間、２秒間オン、２秒オフを交互に、破砕された。細胞溶解液を２００００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を、０．７％のＴｗｅｅｎを含有する２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８の緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡセファロースカラム上にロードした。カラムを、０．７％のＴｗｅｅｎを含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８の緩衝液で洗浄し、結合したタンパク質は、０．７％のＴｗｅｅｎを含有する２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、３００ｍＭイミダゾール緩衝液で溶出した。

溶出液を、還元条件下で１２％のトリス−グリシンゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。図３Ａ中で、融合タンパク質に対応する主要なバンドが矢印で示される収率は、ＯＤ_６００が１まで増殖された１リットル振盪フラスコ培養からのミリグラムの精製タンパク質よって決定した。収率は６４ｍｇ／ｌであった。単一のＮＴ部分を含む融合タンパク質は、細胞溶解液中の界面活性剤の存在において、驚くほど高収率をもたらすと結論される。

実施例２ ＳＰーＣ３３Ｌｅｕ融合タンパク質の生産
Ｈｉｓ_６への融合体としてＮＴ_２−ＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ（すなわち、ＮＴＮＴ−ＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ）をコードする遺伝子を含有する発現ベクターが構築された（配列番号２８−２９）。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が０．９から１まで増殖され、２５℃で３時間更にインキュベートされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられた。細胞は遠心分離によって回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁された。

リゾチームが添加され、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。Ｔｗｅｅｎは添加されないか、又は０．７％の最終濃度まで添加された。細胞は、超音波処理により、氷上で５分間、２秒間オン、２秒オフを交互に、破砕された。細胞溶解液を２００００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８の緩衝液±０．７％Ｔｗｅｅｎで平衡化したＮｉ−ＮＴＡセファロースカラム上にロードした。カラムを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８の緩衝液±０．７％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、結合したタンパク質は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、３００ｍＭイミダゾール緩衝液±０．７％Ｔｗｅｅｎで溶出した。

溶出液を、還元条件下で１２％のトリス−グリシンゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。図３Ｂ中で、融合タンパク質に対応する主要なバンドが矢印で示される収率は、ＯＤ_６００が１まで増殖された１リットル振盪フラスコ培養からのミリグラムの精製タンパク質よって決定した。収率はＴｗｅｅｎの非存在下で４０ｍｇ／ｌであり。０．７％のＴｗｅｅｎの存在下で６８ｍｇ／ｌであった。２つの連続したＮＴ部分を含有する融合タンパク質は、細胞溶解物中の界面活性剤の非存在下において驚くほど高収率をもたらし、細胞溶解物中の界面活性剤の存在下において、更に増加した収率をもたらすと結論される。

実施例３ ＳＰーＣ３３Ｌｅｕ融合タンパク質の生産
ＮＴ−ＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ、ＮＴ_２−ＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ及びＮＴ−ＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ−ＮＴをそれぞれコードする遺伝子を含有する発現ベクターがそれぞれ構築される。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が０．９から１まで増殖され、２５℃で３時間更にインキュベートされる大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられる。細胞は遠心分離によって回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁される。

リゾチームが添加され、細胞は氷上で３０分間インキュベートされる。Ｔｗｅｅｎは添加されないか、又は０．７％の最終濃度まで添加される。細胞は、超音波処理により、氷上で５分間、２秒間オン、２秒オフを交互に、破砕される。細胞溶解物は２００００×ｇで３０分間遠心分離される。

実施例４ ＮＴセファロースの調製
ＣｙｓＨｉｓ_６ＮＴコンストラクトが、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルク・バイオサイエンス）を形質転換するために用いられる。細胞は、カナマイシンを含むＬＢ培地中、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が０．８から１まで増殖され、室温で４時間更にインキュベートされる。その後、細胞は回収され、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０中に再懸濁され、リゾチームとＤＮａｓｅ Ｉが補充される。完全に溶解した後、１５０００ｇの上清がＮｉセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を充填したカラムにロードされる。カラムは広範に洗浄され、次いで結合タンパク質は１００ー３００ｍＭのイミダゾールで溶出される。標的タンパク質を含む画分はプールされ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して透析される。精製されたＣｙｓ−Ｈｉｓ_６−ＮＴタンパク質は、標準的プロトコール（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、活性化チオールセファロースへ結合される。

実施例５ ＮＴセファロースを用いる融合タンパク質の精製
実施例３からの細胞溶解物が、２０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６で予め平衡化したＮＴセファロースを充填したカラムにロードされる。カラムは２０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ６で広範に洗浄され、次いで結合タンパク質は２０ｍＭのＮａＰｉ、ｐＨ７で溶出される。標的タンパク質を含む画分がプールされる。タンパク質のサンプルはＳＤＳーＰＡＧＥ上で分離され、次いでクーマシーブリリアントブルーＲ-２５０で染色される。タンパク質の含有量は２８０ｎｍでの吸光度から決定される。

実施例６ 陰イオン交換体上での融合タンパク質の精製
実施例３からの細胞溶解物が、２０ｍＭのＮａＰ、ｐＨ６．５で予め平衡化したＨｉＴｒａｐ Ｑ ＦＦカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）上にロードされる。カラムは広範に洗浄され、次いで結合タンパク質はＮａＣｌが最大１Ｍまでの線形勾配で溶出される。標的タンパク質を含有する画分がプールされる。タンパク質のサンプルはＳＤＳーＰＡＧＥ上で分離され、次いでクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色される。タンパク質の含有量は２８０ｎｍでの吸光度から決定される。

実施例７ 所望のタンパク質の開裂及び単離
実施例３、５、及び６の融合タンパク質は、７０％ギ酸水溶液に溶解され、０．１ｇ／ｍｌのＣＮＢｒを補充され、室温で２４時間放置される。その後、混合物は乾燥され、クロロホルム／メタノール／水が体積で８：４：３の２相系中で分離される。ＳＰーＣ３３Ｌｅｕは有機相に見いだされ、その後任意で、Ｃ１８カラムを使用する逆相ＨＰＬＣで更に精製することができる。合成リン脂質を混合したＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕの活性は、例えば、 J. Johansson et al., J. Appl. Physiol. 95, 2055-2063 (2003)に記載されるように、インビトロ又はインビボで試験することができる。

実施例８ ＬＬ−３７融合タンパク質の生産
Ｈｉｓ_６への融合体としてＮＴ_２−ＬＬ３７（すなわち、ＮＴＮＴ−ＬＬ３７）をコードする遺伝子を含有する発現ベクターが構築された（配列番号３０−３１）。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が０．９から１まで増殖され、２５℃で３時間更にインキュベートされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられた。細胞は遠心分離によって回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁された。

リゾチームが添加され、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。細胞は、超音波処理により、氷上で５分間、２秒間オン、２秒オフを交互に、破砕された。細胞溶解液を２００００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、２５０ｍＭのＮａＣｌの緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡセファロースカラム上にロードした。カラムを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、２５０ｍＭのＮａＣｌの緩衝液で洗浄し、結合したタンパク質は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、３００ｍＭイミダゾール緩衝液で溶出した。

実施例９ ＮＴ−ＲＥＰ_４−ＣＴの生産
発現ベクターが、Ｈｉｓ_６へのＮ末端融合体としてＮＴ−ＲＥＰ_４−ＣＴを生産するために構築された（配列番号１７−１８）。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が〜１まで増殖され、室温で最大４時間更にインキュベートされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられた。その後、細胞は回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁され、リゾチームとＤＮａｓｅＩが補充された。

完全に溶解した後、１５０００ｇの上清がＮｉセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スエーデン）を充填したカラムにロードされた。カラムは広範に洗浄され、その後結合タンパク質は３００ｍＭのイミダゾールで溶出された。標的タンパク質を含む画分はプールされ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して透析された。
タンパク質のサンプルはＳＤＳ−ＰＡＧＥを経由して分離され、次いでクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色された。得られたＮＴ−ＲＥＰ_４−ＣＴタンパク質は、５ｋＤａの分子量カットオフセルロースフィルター（ミリポア）を使用する限外ろ過による濃縮された。

実施例１０ ＮＴ−ＲＥＰ_４−ＣＴの生産
発現ベクターが、ＺｂａｓｉｃへのＣ末端融合体としてＮＴ−ＲＥＰ_４−ＣＴを生産するために構築された（配列番号１９）。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が〜１まで増殖され、室温で最大２から４時間更にインキュベートされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられた。その後、細胞は回収され、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）に再懸濁され、リゾチームとＤＮａｓｅＩが補充された。

完全に溶解した後、１５０００ｇの上清が陽イオン交換体（ＨｉＴｒａｐ Ｓ，ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ウプサラ、スエーデン）上にロードされた。カラムは広範に洗浄され、その後結合タンパク質は５００ｍＭのＮａＣｌに対する勾配で溶出された。標的タンパク質を含む画分はプールされ、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）に対して透析された。ＮＴ−ＲＥＰ_４−ＣＴタンパク質（配列番号２０）が、プロテアーゼ３Ｃを用いるタンパク質切断によりＺｂａｓｉｃタグから遊離された：融合タンパク質の比率は１：５０（ｗ／ｗ）で４℃で一晩。遊離されたＺｂａｓｉｃタグを除去するために、切断混合物は第二の陽イオン交換体上でロードされ、素通り画分が回収された。

実施例１１ ＮＴ−ＲＥＰ_４−ＣＴの生産
発現ベクターが、ＨｉｓＴｒｘＨｉｓへのＣ末端融合体としてＮＴ−ＲＥＰ_４−ＣＴを生産するために構築された（配列番号２１）。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が〜１まで増殖され、室温で最大２から４時間更にインキュベートされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられた。その後、細胞は回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁され、リゾチームとＤＮａｓｅＩが補充された。

完全に溶解した後、１５０００ｇの上清がＮｉセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スエーデン）を充填したカラムにロードされた。カラムは広範に洗浄され、その後結合タンパク質は５００ｍＭのＮａＣｌに対する勾配で溶出された。標的タンパク質を含む画分はプールされ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して透析された。ＮＴ−ＲＥＰ_４−ＣＴタンパク質（配列番号２２）が、トロンビンを用いるタンパク質切断によりＨｉｓＴｒｘＨｉｓタグから遊離された：融合タンパク質の比率は１：１０００（ｗ／ｗ）で４℃で一晩。遊離したＨｉｓＴｒｘＨｉｓタグを除去するために、切断混合物は第二のＮｉセファロースカラム上にロードされ、素通り画分が回収された。

実施例１２ ＮＴ_２−ＲＥＰ_４−ＣＴの生産
Ｈｉｓ_６への融合体としてＮＴ_２−ＲＥＰ_４−ＣＴ（すなわちＮＴＮＴ−ＲＥＰ_４−ＣＴ） をコードする遺伝子を含有する発現ベクターが構築された（配列番号２３−２４）。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が０．９から１まで増殖され、２５℃で３時間更にインキュベートされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられた。細胞は遠心分離によって回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁された。

リゾチームとＤＮａｓｅが添加され、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。細胞溶解液を２００００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を、２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８の緩衝液で平衡化したＮｉ−ＮＴＡセファロースカラム上にロードした。カラムを、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８の緩衝液で洗浄し、結合したタンパク質は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、３００ｍＭイミダゾール緩衝液で溶出した。

溶出液を、還元条件下で１２％のトリス−グリシンゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。図３Ｃ中で、融合タンパク質に対応する主要なバンドが矢印で示される収率は、ＯＤ_６００が１まで増殖された１リットル振盪フラスコ培養からのミリグラムの精製タンパク質よって決定した。収率は３０ｍｇ／ｌであった。スピドロインミニチュアタンパク質は、２つのＮＴ部分を持つ融合体として有利に発現することができると結論される。

実施例１３ ＮＴ−ＲＥＰ_４−ＣＴ、ＮＴ_２−ＲＥＰ_４−ＣＴ及びＮＴ−ＲＥＰ_８−ＣＴの生産
ＮＴ−ＲＥＰ_４−ＣＴ（配列番号２０及び２２）、ＮＴ_２−ＲＥＰ_４−ＣＴ（配列番号２３）、及びＮＴ−ＲＥＰ_８−ＣＴ（配列番号２５）をコードする遺伝子を含む発現ベクターがそれぞれ構築される。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が０．９から１まで増殖され、２５℃で３時間更にインキュベートされる大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられる。細胞は遠心分離によって回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８に再懸濁される。

リゾチームが添加され、細胞は氷上で３０分間インキュベートされる。Ｔｗｅｅｎは添加されないか、又は０．７％の最終濃度まで添加される。細胞溶解物は３０分間２００００×ｇで遠心分離される。上清の一部が、実施例６に従い、陰イオン交換カラムにロードされる。

ＮＴ親和性媒体が実施例４に記載のように調製される。上清のその他の部分が実施例５に従って、親和性カラム上でロードされる。

陰イオン交換カラム及びＮＴ親和性カラムからの溶出物はゲル電気泳動に供される。

実施例１４ ＮＴＨｉｓ、ＮＴ_２−ＲＥＰ_８−ＣＴ及びＮＴ_２−Ｂｒｉｃｈｏｓの生産
Ａ）ＮＴＨｉｓ
発現ベクターが、Ｈｉｓ_６へのＮ末端融合体としてＮＴを生産するために構築された（配列番号３２）。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が〜１まで増殖され、室温で最大４時間更にインキュベートされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられた。その後、細胞は回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁され、リゾチームとＤＮａｓｅＩが補充された。

完全に溶解した後、１５０００ｇの上清がＮｉセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スエーデン）を充填したカラムにロードされた。カラムは広範に洗浄され、その後結合タンパク質は３００ｍＭのイミダゾールで溶出された。標的タンパク質を含む画分はプールされ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析された。タンパク質のサンプルはＳＤＳーＰＡＧＥを経由して分離され、次いでクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色された。得られたＮＴタンパク質（配列番号３２）は、５ｋＤａの分子量カットオフセルロースフィルター（ミリポア）を使用する限外ろ過による濃縮された。収率は振盪フラスコでＯＤ_６００が１まで増殖させ、１１２ｍｇ／リットルであった。

Ｂ）ＮＴ_２−ＲＥＰ_８−ＣＴ
発現ベクターが、Ｈｉｓ_６へのＮ末端融合体としてＮＴ_２−ＲＥＰ_８−ＣＴ（ＮＴＮＴ８ＲＥＰＣＴ）を生産するために構築された（配列番号３３）。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が〜１まで増殖され、室温で最大４時間更にインキュベートされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられた。その後、細胞は回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁され、リゾチームとＤＮａｓｅＩが補充された。タンパク質のサンプルはＳＤＳーＰＡＧＥを経由して分離され、次いでタンパク質の発現を確認するためにクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色された。

完全に溶解した後、１５０００ｇの上清がＮｉセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スエーデン）を充填したカラムにロードされた。カラムは広範に洗浄され、その後結合タンパク質は３００ｍＭのイミダゾールで溶出される。標的タンパク質を含む画分はプールされ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析される。タンパク質のサンプルはＳＤＳーＰＡＧＥを経由して分離され、次いでクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色された。

Ｃ）ＮＴ_２−Ｂｒｉｃｈｏｓ
発現ベクターが、Ｈｉｓ_６へのＮ末端融合体としてＮＴ_２−Ｂｒｉｃｈｏｓ（ＮＴ−ＮＴ−Ｂｒｉｃｈｏｓ）を生産するために構築された（配列番号３４）。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）により誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が〜１まで増殖され、室温で最大４時間更にインキュベートされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられた。その後、細胞は回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁され、リゾチームとＤＮａｓｅＩが補充された。細胞は、超音波処理により、氷上で５分間、２秒間オン、２秒オフで、破砕された。

完全に溶解した後、１５０００ｇの上清がＮｉセファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ウプサラ、スエーデン）を充填したカラムにロードされた。カラムは広範に洗浄され、その後結合タンパク質は３００ｍＭのイミダゾールで溶出された。標的タンパク質を含む画分はプールされ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析された。タンパク質のサンプルはＳＤＳーＰＡＧＥを経由して分離され、次いでクーマシーブリリアントブルーＲ−２５０で染色された。得られたＮＴ_２−Ｂｒｉｃｈｏｓタンパク質（配列番号３４）は、５ｋＤａの分子量カットオフセルロースフィルター（ミリポア）を使用する限外ろ過による濃縮された。収率は振盪フラスコでＯＤ_６００が１まで増殖させ、２０ｍｇ／リットルであった。

実施例１５ ｐＨ依存性、可逆的キャプチャーのためのＮＴ
目的：ＮＴ融合タンパク質を可逆的キャプチャーするための共有結合で固定化したＮＴ（及びＮＴＮＴ）の使用。

戦略：繊維（及びフィルム）に対するＮＴ（及びＮＴＮＴ）融合タンパク質の共有結合したＮＴ（及びＮＴＮＴ）によるｐＨ依存性会合体を調べる。ＮＴ無しの繊維とフィルムが対照として用いられる。

Ａ）繊維
ＮＴ−ＲＥＰ_４−ＣＴ（配列番号２０）、ＮＴ_２ＲＥＰ_４ＣＴ（配列番号２３）及びＲＥＰ_４ＣＴ（配列番号２、対照）の繊維（〜０．５ｃｍの長さ、〜５０μｇ）が、５ｍｇ／ｍｌの可溶性ＮＴＨｉｓ（配列番号３２）又はＮＴ_２−Ｂｒｉｃｈｏｓ（配列番号３４）の１００μｌ溶液に、ｐＨ８で１０分間浸された。ｐＨを４００μｌのリン酸ナトリウム緩衝液（ＮａＰ）の添加により６まで減少させ、繊維に対する水溶性ＮＴの会合を可能にするために１０分間インキュベートした。繊維をｐＨ６で５００μｌのＮａＰへ移し、二回洗浄した。最後に、繊維をｐＨ７で５００μｌのＮａＰへ移し、可溶性ＮＴを遊離させるために１０分間インキュベートした。同じことを、３００ｍＭのＮａＣｌの存在下、全てｐＨ６のＮａＰ緩衝液で行った。異なる溶液からのサンプルが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析された。

ＮＴ_２−ＲＥＰ_４−ＣＴ繊維及びＮＴ−ＲＥＰ_４−ＣＴ繊維を用いて、ＮＴＨｉｓとＮＴ_２Ｂｒｉｃｈｏｓの両方がｐＨ６で捕獲された。ｐＨをｐＨ７へ上昇させると、ＮＴＨｉｓ及びＮＴ_２−Ｂｒｉｃｈｏｓは両方とも再び遊離され、ＳＤＳーＰＡＧＥで検出することができた。３００ｍＭのＮａＣｌの添加は、ｐＨ６で捕獲を減少させた。

Ｂ）フィルム：
ＮＴ−ＲＥＰ_４−ＣＴ（配列番号２０）及びＲＥＰ_４−ＣＴ（配列番号２、対照）のフィルムが、３ｍｇ／ｍｌのタンパク質溶液を５０μｌをプラスチックウェルに流し込むことにより作成され、一晩放置して乾燥させた。翌日、５ｍｇ／ｍｌの可溶性ＮＴＨｉｓ（配列番号３２）の１００μｌがｐＨ８でフィルムを有するウェルに添加され、１０分間放置された。次いで、４００μｌのＮａＰの添加によりｐＨを６に減少させ、１０分間インキュベートし、フィルムへ可溶性ＮＴが会合できるようにした。フィルムは次いで５００μｌのＮａＰによりｐＨ８で２回洗浄された。可溶性ＮＴＨｉｓの遊離のために、５００μｌのＮａＰが添加され、１０分間インキュベートした。同じことを、３００ｍＭのＮａＣｌの存在下、全てｐＨ６のＮａＰ緩衝液で行った。異なる溶液からのサンプルが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析された。

ＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析は、ＮＴ−ＲＥＰ_４−ＣＴフィルムは、ＮＴＨｉｓをｐＨ６で捕獲し、ｐＨが７へ上昇すると、再び遊離されることを可能にすることを示していた。

実施例１６ 融合タンパク質のｐＨ依存性、可逆的会合のためのＮＴ
目的：タンパク質の部分間の相互作用の解析、例えば、ベータシート構造を持つ標的、例えばサーファクタントタンパク質Ｃ（ＳＰ−Ｃ）とＢｒｉｃｈｏｓの相互作用の解析を可能にする可逆的タグとしてＮＴを使用する。

ＮＴ_２−Ｂｒｉｃｈｏｓ（配列番号３４）は、ＮＴ_２−ＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ（配列番号２８）又はＮＴＨｉｓ（配列番号３２）のどちらかと、ｐＨ８で全容量が１００μｌに混合される。ＮａＰ緩衝液（４００μｌ）が添加されて最終ｐＨ６を与え、その混合物はＮＴ会合を可能にするために２０分間インキュベートされる。次に、ＮＴ会合の逆転を可能とするために、ｐＨは再びｐＨ７に上げられる。異なる溶液からのサンプルは、天然ゲル及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）上で分析される。

実施例１７ ＮＴ−ＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕの開裂及びＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕの単離
実施例１で得られた約５８ｍｇの凍結乾燥されたＨｉｓＮＴ−ＭｅｔＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ（配列番号２６）が、７０％のギ酸水溶液３ｍｌに、ボルテックスと超音波処理により溶解された。この溶液へ、アセトニトリル中の５ＭのＣＮＢｒの２００μｌが添加され、混合物は室温で２４時間インキュベートされた。その後、溶媒は、窒素気流下で蒸発させ、残渣は７０％水性ギ酸に可溶化することにより３回洗浄され、窒素下で乾燥させた。

次に、乾燥させた残渣に、クロロホルム／メタノール／水（体積で８：４：３）の４．５６ｍｌが添加され、その後その混合物はボルテックスされ遠心分離された。上相が除去され、クロロホルム／メタノール／水（体積で８：４：３）の１ｍｌが下相へ添加され、ボルテックス、遠心分離、及び上相の除去がくり返された。上相は合わせられ、真空下で乾燥させた。下相は窒素下で乾燥させた。

下相（左レーン）と上相（右レーン）の含有がＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された（図４）。これは、下相が、ＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕの推定分子量とよく一致する推定分子量を持つ一つの主要なバンドを含むことを示していた。ＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕの同一性は、ＥＳＩ質量分析及びアミノ酸配列決定によって確認され、これらは３５９４．６Ｄａのモノアイソトピック質量（３５９４．４Ｄａを算出）及び予想されるアミノ酸配列を示していた。

実施例１８ ＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ／リン脂質混合物の表面活性の分析
１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）／１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホグリセロール（ＰＯＰＧ）（６８：３１、ｗ／ｗ）が、クロロホルム：メタノール（１：１、ｖ／ｖ）に溶解され、同一溶媒中でＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ（実施例１７で得られた）と混合された。調製物のペプチド含量は、リン脂質重量に関して、２％であった。溶媒は窒素で蒸発させ、調製物は生理食塩水に、３７℃での低速回転により、１０ｍｇ／ｍｌの最終リン脂質濃度に再懸濁した。

表面張力はキャプティブバブルサーファクトメーター（ｃａｐｔｉｖｅ ｂｕｂｂｌｅ ｓｕｒｆａｃｔｏｍｅｔｅｒ）（ＣＢＳ）により、肺胞中で三通りに測定した(Schurch S et al., J. Appl. Physiol. 67: 2389-2396, 1989)。ＣＢＳにおいて、肺胞を表す界面活性剤と気泡は気密密閉容器中に存在している。動的な状況下で、表面活性を評価するために、チャンバーは圧縮され、表面張力は、気泡の形状と高さ／幅の比を調べることによって計算することができる。

実験では、ＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕの界面活性剤調製物（１０ｍｇ／ｍｌ）の２μｌが、スクロースを充填した試験チャンバー内に挿入された。挿入後に、気泡が作成され、表面張力が吸着の５分の間に測定された。続く準静的サイクリング実験では、気泡は最初の体積から５ｍＮ／ｍ未満の表面張力に到達するまで、５０％の最大面積の圧縮と続く拡張を５サイクルの間交互にし、段階的に圧縮された。

結果は図５に説明されており、３つの測定結果のうち、代表的な一例から第１及び第５サイクルが示されている。ＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ／ＤＰＰＣ／ＰＯＰＧ混合物の表面活性（図５）は、同じリン脂質混合物における合成ＳＰ−Ｃ３３のそれと非常ににており、例えば、J. Appl. Physiol, 95: 2055-2063 (2003)を参照。

実施例１９ ＳＰーＣ３３Ｌｅｕ融合タンパク質の生産
Ａ）ＮＴ無し（比較例）
発現ベクターが、２×Ｈｉｓ_６への融合体としてチオレドキシン（ＴＲＸ）−ＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕをコードする遺伝子を含有して構築された（配列番号３５−３６）。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、ＩＰＴＧにより誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が０．９から１まで増殖され、２５℃で３時間更にインキュベートされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられた。細胞は回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁された。

リゾチームが添加され、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。Ｔｗｅｅｎを０．７％の最終濃度まで添加した。細胞は、超音波処理により、氷上で５分間、２秒間オン、２秒オフを交互に、破砕された。細胞溶解液を２００００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を、２０ｍＭのＴｒｉｘ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋０．７％Ｔｗｅｅｎで平衡化したＮｉ−セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ウプサラ，スエーデン）を充填したカラム上にロードした。カラムは広範に洗浄され、その後結合タンパク質は３００ｍＭのイミダゾール＋０．７％Ｔｗｅｅｎで溶出された。

標的タンパク質は、３００ｍＭのイミダゾール＋０．７％Ｔｗｅｅｎで溶出し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析された（図６Ａ）。溶出は標的タンパク質の少量の不純な量を含んでいた。

Ｂ）ＮＴあり
発現ベクターが、２×Ｈｉｓ_６への融合体としてＴＲＸ−ＮＴ−ＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕをコードする遺伝子を含有して構築された（配列番号３７−３８）。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、ＩＰＴＧにより誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が０．９から１まで増殖され、２５℃で３時間更にインキュベートされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられた。細胞は回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁された。

リゾチームが添加され、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。Ｔｗｅｅｎを０．７％の最終濃度まで添加した。細胞は、超音波処理により、氷上で５分間、２秒間オン、２秒オフを交互に、破砕された。細胞溶解液を２００００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を、２０ｍＭのＴｒｉｘ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）＋０．７％Ｔｗｅｅｎで平衡化したＮｉ−セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ウプサラ、スエーデン）を充填したカラム上にロードした。カラムは広範に洗浄され、その後結合タンパク質は３００ｍＭのイミダゾール＋０．７％Ｔｗｅｅｎで溶出された。融合タンパク質を含む分画はプールされ、脱イオン水に対して透析した。

溶出液を、還元条件下で１２％のトリス−グリシンゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。図６Ｂ中で、タンパク質に対応する主要なバンドが矢印で示される収率は、ＯＤ_６００が１まで増殖された１リットル振盪フラスコ培養からのミリグラムの精製タンパク質よって決定した。収率は３０ｍｇ／ｌであった。

実施例２０ Ｂｒｉｃｈｏｓの生産
Ｈｉｓ_６ＬｉｎｋＨｉｓ_６への融合体としてＮＴ_２−Ｂｒｉｃｈｏｓ（すなわち、ＮＴＮＴ−Ｂｒｉｃｈｏｓ）をコードする遺伝子を含有する発現ベクターが構築された（配列番号３９−４０）。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、ＩＰＴＧにより誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が０．９から１まで増殖され、２５℃で３時間更にインキュベートされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられた。細胞は回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁された。

リゾチームが添加され、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。細胞は、超音波処理により、氷上で５分間、２秒間オン、２秒オフを交互に、破砕された。細胞溶解液を２００００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を、Ｎｉ−セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ウプサラ、スエーデン）を充填したカラム上にロードした。カラムは広範に洗浄され、その後結合タンパク質は３００ｍＭのイミダゾールで溶出された。融合タンパク質を含む画分はプールされ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析された。

溶出液を、還元条件下で１２％のトリス−グリシンゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。図７中で、融合タンパク質に対応する主要なバンドが矢印で示される収率は、ＯＤ_６００が１まで増殖された１リットル振盪フラスコ培養からのミリグラムの精製タンパク質よって決定した。収率は、融合タンパク質が２８ｍｇ／ｌであった。

Ｂｒｉｃｈｏｓタンパク質（配列番号４１）は、プロテアーゼ３Ｃを使用するタンパク質切断により２Ｈｉｓ_６ＮＴ_２タグから遊離される：融合タンパク質の比率は４℃で１：１００（ｗ／ｗ）。遊離した２Ｈｉｓ_６ＮＴ_２タグを除去するために、開裂混合物は第二のＮｉセファロース上へロードされ、素通り画分が回収される。

実施例２１ 緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の生産
この例で用いられるＧＦＰは、Ｓ１４７変異体であり、Kimata, Y et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 232: 69-73 (1997)を参照。

Ａ）ＮＴあり
Ｈｉｓ_６ＬｉｎｋＨｉｓ_６への融合体としてＮＴ_２−ＧＦＰ（すなわち、ＮＴＮＴ−ＧＦＰ）をコードする遺伝子を含有する発現ベクターが構築された（配列番号４２−４３）。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、ＩＰＴＧにより誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が０．９から１まで増殖され、２５℃で３時間更にインキュベートされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられた。細胞は回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁された。

リゾチームが添加され、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。細胞は、超音波処理により、氷上で５分間、２秒間オン、２秒オフを交互に、破砕された。細胞溶解液を２００００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を、Ｎｉ−セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ウプサラ、スエーデン）を充填したカラム上にロードした。カラムは広範に洗浄され、その後結合タンパク質は３００ｍＭのイミダゾールで溶出された。融合タンパク質を含む画分はプールされ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析された。ＧＦＰタンパク質（配列番号４４）は、プロテアーゼ３Ｃを使用するタンパク質切断により２Ｈｉｓ_６ＮＴ_２タグから遊離された：融合タンパク質の比率は４℃で１：１００（ｗ／ｗ）。遊離した２Ｈｉｓ_６ＮＴ_２タグを除去するために、開裂混合物は第二のＮｉセファロース上へロードされ、素通り画分が回収された。

溶出液を、還元条件下で１２％のトリス−グリシンゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（図８）。図８において、融合タンパク質に対応する主要バンド（第一の溶出、左のレーン）及び標的タンパク質（第二の溶出、右のレーン）が矢印により示されている。収率は、ＯＤ_６００が１まで増殖された１リットル振盪フラスコ培養からのミリグラムの精製タンパク質よって決定した。収率は融合タンパク質が４４ｍｇ／ｌ、標的タンパク質が１６ｍｇ／ｌであった。

精製されたＧＦＰは、強い蛍光を発し、発色団の自己触媒的形成に必須である、正しいフォールド（アルファヘリックスの連結を伴うベータバレル）を確証している。

Ｂ）他の精製タグあり：Ｚｂ及びＨｉｓ_６ＡＢＰ（比較例）
ベクター（ｐＴ７ＺｂＧＦＰ、ｐＴ７Ｈｉｓ６ＡＢＰＧＦＰ）を有するＢＬ２１（ＤＥ３）細胞は、カナマイシンを補充したトリプシン大豆ブロス培地中で３７℃で一晩増殖させた。翌朝、培養物は１リットル振とうフラスコ中の１００ｍｌの新鮮な培地に播種され、ＯＤ_６００が１に達するまで増殖させた。次にタンパク質の生産がＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭまで添加して誘導され、生産は１８時間続いた。細胞は回収され、５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に再懸濁された。細胞は、超音波処理により、氷上で３分間、１秒間オン、１秒オフを交互に、破砕された。細胞溶解物は１００００×ｇで２０分間遠心された。上清がカラムへロードされた。

ＺｂＧＦＰ（配列番号４５）融合タンパク質は、５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．５中で１ｍｌのＨｉＴｒａｐ Ｓ ＨＰカラムで精製され、１６０ｍＭのＮａＣｌを補充した同一緩衝液で溶出した。

Ｈｉｓ_６ＡＢＰＧＦＰ（配列番号４６）融合タンパク質は、５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ８中で１ｍｌのＴａｌｏｎカラムで精製され、３０ｍＭの酢酸と７０ｍＭの酢酸ナトリウムが補充されｐＨ５．０を与えた同一緩衝液で溶出した。

溶出液を、還元条件下で１０ー２０％の勾配ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。収率は、ＯＤ_６００が１まで増殖された１リットル振盪フラスコ培養あたりのミリグラムの精製タンパク質よって決定した。収率はＺｂＧＦＰについて１０ｍｇ／ｌで、Ｈｉｓ_６ＡＢＰＧＦＰについて７ｍｇ／ｌであった。

実施例２２ ニューロセルピンの生産
Ｈｉｓ_６ＬｉｎｋＨｉｓ_６への融合体としてＮＴ_２−ニューロセルピン（すなわち、ＮＴＮＴ−ニューロセルピン）をコードする遺伝子を含有する発現ベクターが構築された（配列番号４７−４８）。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、ＩＰＴＧにより誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が０．９から１まで増殖され、２５℃で３時間更にインキュベートされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられた。細胞は回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁された。

リゾチームが添加され、細胞を氷上で３０分間インキュベートした。細胞は、超音波処理により、氷上で５分間、２秒間オン、２秒オフを交互に、破砕された。細胞溶解液を２００００×ｇで３０分間遠心分離した。上清を、Ｎｉ−セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ウプサラ、スエーデン）を充填したカラム上にロードした。カラムは広範に洗浄され、その後結合タンパク質は３００ｍＭのイミダゾールで溶出された。融合タンパク質を含む画分はプールされ、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に対して透析された。

ニューロセルピンタンパク質（配列番号４９）は、プロテアーゼ３Ｃを使用するタンパク質切断により２Ｈｉｓ_６ＮＴ_２タグから遊離された：融合タンパク質の比率は４℃で１：１００（ｗ／ｗ）。遊離した２Ｈｉｓ_６ＮＴ_２タグを除去するために、開裂混合物は第二のＮｉセファロース上へロードされ、素通り画分が回収された。

溶出液を、還元条件下で１２％のトリス−グリシンゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した（図９）。図９において、融合タンパク質に対応する主要バンド（第一の溶出、左のレーン）及び標的タンパク質（第二の溶出、右のレーン）が矢印により示されている。収率は、ＯＤ_６００が１まで増殖された１リットル振盪フラスコ培養からのミリグラムの精製タンパク質よって決定した。収率は融合タンパク質が８ｍｇ／ｌ、標的タンパク質が４ｍｇ／ｌであった。比較として、Ｈｉｓ_６タグが付随するニューロセルピンの発現収率は、１．７ｍｇ／ｌであった (Belorgey et al. Eur J Biochem. 271(16):3360-3367 (2004)。

発現されたニューロセルピンによるｔＰＡ（組織プラスミノーゲンアクチベーター）の阻害率が決定され、以前公開されたのと同じであった (Belorgey et al. J. Biol. Chem. 277, 17367-17373 (2002)。

実施例２３ プロテアーゼ３Ｃ融合タンパク質の生産
Ｈｉｓ_６ＮＴ−３Ｃ及びＨｉｓ_６ＬｉｎｋＨｉｓ_６ＮＴＮＴ３Ｃをそれぞれコードする遺伝子を含む発現ベクターが構築された(Graslund T. et al., Protein Expr Purif 9(1): 125-132 (1997); Cordingley MG. et al., J. Virol. 63(12): 5037-5045 (1989))。そのベクターは、カナマイシンを含むＬＢ培地中、ＩＰＴＧにより誘導され、３０℃で、ＯＤ_６００が０．９から１まで増殖され、２５℃で３時間更にインキュベートされた大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（メルクバイオサイエンス（Ｍｅｒｃｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））を形質転換するために用いられる。細胞は回収され、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に再懸濁される。

リゾチームとＤＮａｓｅが添加され、細胞を氷上で３０分間インキュベートされる。細胞は、超音波処理により、氷上で３分間、１秒間オン、１秒オフを交互に、破砕される。細胞溶解液が１５０００×ｇで３０分間遠心分離される。上清が、２０ｍＭのＴｒｉｘ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で平衡化したＮｉ−セファロース（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，ウプサラ、スエーデン）を充填したカラム上にロードされる。カラムは広範に洗浄され、その後結合タンパク質は３００ｍＭのイミダゾールで溶出される。融合タンパク質を含む分画はプールされ、脱イオン水に対して透析される。溶出物は還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供される。収率は、ＯＤ_６００が１まで増殖された１リットル振盪フラスコ培養からのミリグラムの精製タンパク質よって決定される。

Claims (29)

1. （ｉ）スパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）断片に由来する少なくとも一つの溶解性増強部分；及び
   （ｉｉ）所望の非スピドロインタンパク質又はポリペプチドである少なくとも一つの部分
   を含み、
   各溶解性増強部分は、望まれるタンパク質又はポリペプチド部分へ直接又は間接的に結合している融合タンパク質。
2. 各溶解性増強部分が配列番号６に少なくとも８０％の同一性、又は配列番号８に少なくとも５０％の同一性を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
3. 各溶解性増強部分が、１００から１６０アミノ酸残基を含む、請求項１又は２の何れかに記載の融合タンパク質。
4. 融合タンパク質が、少なくとも二つの溶解性増強部分を含み、各々はスパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）断片に由来する、請求項１から３の何れかに記載の融合タンパク質。
5. 融合タンパク質が、少なくとも二つの溶解性増強部分を含み、各々はスパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）断片に由来する、請求項４に記載の融合タンパク質。
6. 少なくとも一つの溶解性増強部分が、少なくとも一つの所望のタンパク質又はポリペプチド部分のアミノ末端又はカルボキシ末端に直接的又は間接的に結合している、請求項１から５の何れかに記載の融合タンパク質。
7. 少なくとも一つの溶解性増強部分が、融合タンパク質のアミノ末端及び／又はカルボキシ末端を構成する、請求項６に記載の融合タンパク質。
8. （ｉｉｉ）少なくとも一つの所望のタンパク質又はポリペプチド部分と少なくとも一つの溶解性増強部分との間に配置される少なくとも一つの開裂部位
   を更に含む、請求項１から７の何れかに記載の融合タンパク質。
9. 所望のタンパク質又はポリペプチドが、配列番号６から１０の何れかに３０％未満の同一性を有する、請求項１から８の何れかに記載の融合タンパク質。
10. 所望のタンパク質又はポリペプチドが、海綿動物、有櫛動物、クラゲ、サンゴ、イソギンチャク、扁形動物、ワムシ、回虫、紐形動物、二枚貝、巻貝、タコ、条虫類、甲殻類、昆虫類、コケムシ、腕足類、箒虫動物、ヒトデ、ウニ、ホヤ、ナメクジウオ、ヒトを含む脊椎動物、植物、真菌、酵母、細菌、古細菌又はウイルスに由来するか、又は人工的なタンパク質又はポリペプチドである、請求項９に記載の融合タンパク質。
11. 所望のタンパク質又はポリペプチドが、軟体動物、昆虫、ヒトを含む脊椎動物、植物、真菌、酵母、細菌、古細菌又はウイルスに由来するか、又は人工タンパク質又はポリペプチドである、請求項１０に記載の融合タンパク質。
12. 所望のタンパク質又はポリペプチドが、ヒトを含む脊椎動物、植物、真菌、酵母、細菌、古細菌又はウイルスに由来するか、又は人工タンパク質又はポリペプチドである、請求項１１に記載の融合タンパク質。
13. 所望のタンパク質又はポリペプチドが、アミロイド形成タンパク質及びポリペプチド、ジスルフィド含有タンパク質及びポリペプチド、アポリポタンパク質、膜タンパク質及びポリペプチド、タンパク質及びポリペプチド医薬品及び薬物標的、凝集しやすいタンパク質及びポリペプチド、及びプロテアーゼからなる群から選択される、請求項９から１２の何れか一項に記載の融合タンパク質。
14. 所望のタンパク質又はポリペプチドが、Ａβ−ペプチド、ＩＡＰＰ、ＰｒＰ、αシヌクレイン、カルシトニン、プロラクチン、シスタチン、ＡＴＦ及びアクチン；ＳＰ−Ｂ、αディフェンシン及びβディフェンシン、クラスＡＨアポリポタンパク質；ＬＬ−３７、ＳＰ−Ｃ、ＳＰ−Ｃ３３、ＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕ、Ｂｒｉｃｈｏｓ、ＧＦＰ、ニューロセルピン：ＥＰＯとＧＨを含むホルモン；及びＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩを含む成長因子；アビジン及びストレプトアビジン；及びプロテアーゼ３Ｃからなる群から選択される、請求項１３に記載の融合タンパク質。
15. 所望のタンパク質又はポリペプチドが、ＳＰ−Ｂ及びその変異体、及びＳＰ−Ｃ及びその変異体から選択される、請求項１３に記載の融合タンパク質。
16. 所望のタンパク質又はポリペプチドが、ミニＢＬｅｕである、請求項１５に記載の融合タンパク質。
17. 所望のタンパク質又はポリペプチドが、ＳＰ−Ｃ３３Ｌｅｕである、請求項１５に記載の融合タンパク質。
18. 配列番号２６、２８、３０、３４、３７、３９、４２、及び４７、及びこれらのタンパク質の何れかに対して少なくとも８０％の同一性を有するタンパク質からなる群から選択される、請求項１から１４の何れかに記載の融合タンパク質。
19. 請求項１から１５の何れかに記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリ核酸。
20. 請求項１５に記載の融合タンパク質をコードする核酸からなる群及び配列番号２７、２９、３１、３８、４０、４３、及び４８からなる群から選択される、請求項１９に記載の単離されたポリ核酸。
21. 所望の非スピドロインタンパク質又はポリペプチドの生産のための融合タンパク質中の溶解性増強部分として、スパイダーシルクタンパク質のＮ末端（ＮＴ）断片に由来する少なくとも一つの部分の使用。
22. ａ）適切な宿主において、請求項１から１８の何れか一項に記載の融合タンパク質を発現し、及び
    ｂ）融合タンパク質を含む混合物を得て、任意で融合タンパク質を単離する
    工程を含む、融合タンパク質を生産する方法。
23. ａ）適切な宿主において、請求項１から１８の何れか一項に記載の融合タンパク質を発現し、及び
    ｂ）融合タンパク質又はポリペプチドを含む混合物を得て、任意で融合タンパク質又はポリペプチドを単離する
    工程を含む、所望のタンパク質又はポリペプチドを生産する方法。
24. ｃ）融合タンパク質を開裂し、所望のタンパク質又はポリペプチドを与え、及び
    ｄ）所望のタンパク質又はポリペプチドを単離する
    工程を更に含み、
    前記融合タンパク質が、
    （ｉｉｉ）少なくとも一つの所望のタンパク質又はポリペプチド部分と少なくとも一つの溶解性増強部分との間に配置される少なくとも一つの開裂部位
    を含む、請求項２３に記載の方法。
25. 工程ｂ）が、固定化ＮＴ部分を持つ親和性媒体上で、及び／又は陰イオン交換媒体上での融合タンパク質の精製を更に含む、請求項２２から２４の何れか一項に記載の方法。
26. 親和性媒体上での融合タンパク質の精製が、ｐＨ４．２から６．３での固定化ＮＴ部分による親和性媒体への会合と、その後の望まれる解離媒体による親和性媒体からの解離により実施される、請求項２５に記載の方法。
27. 解離媒体がｐＨが６．４以上、ｐＨが４．１以下を有し、及び／又は高イオン強度を有する、請求項２６に記載の方法。
28. 陰イオン交換媒体上での融合タンパク質の精製は、ｐＨ６．４以上で陰イオン交換媒体への会合と、その後、高いイオン強度を有する解離媒体による陰イオン交換媒体からの解離により実施される、請求項２５から２７の何れか一項に記載の方法。
29. 工程ｂ）での融合タンパク質の精製が、カラムの中、官能面を持つ磁気ビーズ上、又は官能面を持つフィルター上で起きる、請求項２５から２７の何れか一項に記載の方法。