JP2013521782A - シアノベンゾチアゾール化合物を使用する生物発光アッセイ - Google Patents

Abstract

本発明は、例えば、生物発光反応において、２−シアノ−６−ヒドロキシまたは２−シアノ−６−アミノ−ベンゾチアゾールの誘導体を用いる方法を提供する。本発明は、分子および／もしくは酵素の存在、そのような分子の調節活性、ならびに／またはそのような酵素の活性を検出または決定するための方法をさらに提供する。本方法は、ハイスループット形式に適応できる。
【選択図】 なし

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１０年３月１１日に出願された米国特許出願第６１／３１２，８５８号の利益を主張し、当該出願は、参照することによって本明細書に組み込まれる。

ルシフェラーゼは、例えば、ルシフェリン等の酵素特異的基質の酸化を介して光を生成することができる。これは、試料中のルシフェリンの存在またはレベルを検出するために行われるアッセイの基盤を提供する。一構成では、検出されるルシフェリンは、プロルシフェリン基質をルシフェリン生成物に変換する、関心対象の非ルシフェラーゼ酵素によって生成される。ホタルルシフェラーゼおよびすべての他の甲虫ルシフェラーゼの場合、発光は、ルシフェリン、マグネシウムイオン、酸素、およびＡＴＰの存在下で発生する。ウミシイタケルシフェラーゼを含む花虫類ルシフェラーゼの場合、基質セレンテラジンとともに酸素のみが必要とされる。結果として得られる生物発光が、存在する場合は、次に、照度計または任意の適切な放射エネルギー測定デバイスを使用して測定される。

甲虫ルシフェラーゼ基質、例えば、ルシフェリンは、光の効率的な生成に必要なカルボン酸基を含有する。しかしながら、多様な酵素は、反応部位付近にカルボン酸基を有する基質（例えば、ＣＹＰ２Ｄ６）を利用しないため、カルボン酸基を含有する基質を使用するこれらの酵素のアッセイを非常に困難にする。インビトロアッセイ／反応の場合、この問題は、カルボン酸基をエステル化して、したがって、基質上でその電荷を中和することによって克服することができる。しかしながら、これは、基質の大きさを増大させるため、その関心対象の酵素の活性部位への侵入を妨げる場合があり、結果として関心対象の酵素にとって無効な基質である化合物がもたらされる。

基質のエステル化が、インビトロアッセイにおいて、関心対象の酵素によって効果的に使用され得る基質を生成するとしても、そのような基質は、細胞中に存在するエステラーゼが、エステルを急速に開裂し、それによって上述のように、関心対象の酵素の許容される形態の基質でないかもしれないカルボン酸形態の基質を放出するため、例えば、生細胞等の細胞に基づいたアッセイにおいて機能しない場合がある。

本発明では、関心対象の酵素、すなわち、非ルシフェラーゼ酵素の検出または測定のための細胞に基づいたアッセイにおいて使用するための、新しい形態の基質、すなわち、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体が開示される。本発明における基質は、既知のルシフェリン基質上で通常見出されるカルボン酸基を含有せず、代わりに、Ｄ−システインの添加によってルシフェリンに急速かつ定量的に変形することができる、ルシフェリン類似体の前駆体である。このようにして、本発明の基質は、対応するルシフェリン類似体の大きさよりも小さいが、既知のルシフェリンにおいて見出される負の電荷を持つ基を有しない。また本発明は、細胞に基づくアッセイにおいて本発明の基質を使用して、関心対象の非ルシフェラーゼ酵素を検出または測定する方法を提供する。

本発明は、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体を使用して、関心対象の酵素について細胞に基づくアッセイを行うための方法を提供する。一態様では、本発明は、細胞中の非ルシフェラーゼ酵素を検出する方法を提供し、本方法は、前記酵素のための基質であって、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体である基質を、前記酵素と前記基質との間の反応を可能にする条件下で、細胞と接触させることと、ルシフェラーゼ反応混合物を、接触させた細胞に添加することと、生物発光を測定することと、を含む。様々な酵素（例えば、シトクロムＰ４５０、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、プロテアーゼ）と基質との間の反応を可能にする条件は、当業者によく知られている標準方法に従って培養された細胞内に存在する。しかしながら、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールが適用される媒質または緩衝塩溶液は、システインを含まないことが理解される。システインを含まない適用溶液は、関心対象の酵素に曝露する前に、溶液中における誘導体のシステインとの環化を回避する必要がある。

別の態様では、本発明は、細胞中の非ルシフェラーゼ酵素を検出する方法を提供し、本方法は、非ルシフェラーゼ酵素のための基質であって、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体である基質を、前記酵素と前記基質との間の反応を可能にする条件下で、第１の反応槽内で細胞と接触させて、インキュベーション混合物を形成することと、インキュベーション混合物の少なくとも一部を第２の反応槽に移すことと、ルシフェラーゼ反応混合物を第２の反応槽に添加することと、生物発光を測定することと、を含む。

一態様では、本発明は、非ルシフェラーゼ酵素の調節因子についてスクリーニングする方法を提供し、本方法は、細胞を試験化合物と接触させることと、非ルシフェラーゼ酵素のための基質であって、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体である基質を、この基質と非ルシフェラーゼ酵素との間の反応を可能にする条件下で添加して、混合物を形成することと、ルシフェラーゼ反応混合物をその混合物に添加することと、生物発光を測定することと、を含む。

別の態様では、本発明は、細胞中の２つ以上の非ルシフェラーゼ酵素を検出する方法を提供し、本方法は、第１の反応槽内で、２つの生物発光性基質であって、そのうちの１つが２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体である基質を、前記酵素と前記基質との間の反応を可能にする条件下で、細胞と接触させることと、インキュベーション混合物の一部を第２および第３の反応槽に移すことと、Ｄ−システインを含むルシフェラーゼ反応混合物を反応槽のうちの１つに添加し、Ｄ−システインを含まないルシフェラーゼ反応混合物を他の反応槽に添加することと、両方の反応槽内で生物発光を測定することと、を含む。

細胞に基づくアッセイ、例えば、哺乳類生細胞における非ルシフェラーゼ酵素のアッセイのための、本発明に記載されるルシフェリン前駆体基質、または複合生体液の使用は、新しく新規である。細胞に基づくアッセイにおけるそのような基質または複合生体液の使用は、以下を含むいくつかの要因のいずれかに起因して失敗すると考えられていた。
１．細胞中に存在するＬ−システインによる、前駆体基質からルシフェリンへの変形によって、不活性形態の基質を生成する。
２．細胞中に存在するＬ−システインによる、相当量の酵素生成物からルシフェリンへの変形によって、基質をルシフェラーゼによって利用されない形態のルシフェリンに変形する。ルシフェリンを利用するルシフェラーゼは、Ｄ−システインを用いて生成された立体異性形態を必要とする。
３．細胞中に存在する化合物との直接相互作用、または細胞中に存在する多くの酵素の１つの活性のいずれかによって、適切なルシフェリンを、シアノ基の反応を通じていくつかの他の化学形態に変換させることができない新しい化学形態に前駆体基質を変化させる。
４．通常ルシフェリン上で見出されるカルボン酸基からの電荷の欠失に起因して、細胞の膜内で基質が捕捉される。
５．本発明のための基質上のシアノ基が、それが細胞上で引き起こし得るいくらかの毒性作用に起因して、急速な溶融を引き起こし得るという発見。

天然ホタルルシフェリン中の環原子の付番を示す。６員「ベンゾ」環（「Ａ環」）、５員チアゾール環（「Ｂ環」）、および５員チアゾリル環（「Ｃ環」）。 ２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの環原子の付番を示す。６員「ベンゾ」環（「Ａ環」）、およびベンゾ環に融合された５員チアゾール環（「Ｂ環」）。 本発明の態様による、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）活性の検出を示す概略図である。 本発明の態様による、化合物３１３８および３４７８の利用に関して、１２ＵＧＴアイソザイムについての活性データを示す。 本発明の態様による、化合物３１６５の利用に関して、１２ＵＧＴアイソザイムについての活性データを示す。 哺乳類ミクロソームによる、化合物３１３８の利用を示す。 哺乳類ミクロソームによる、化合物３１６５の利用を示す。 本明細書に記載の方法による、化合物３１３８を使用するリトナビルによる様々なＵＧＴアイソザイムの阻害を示す。 本明細書に記載の方法による、化合物３１６５を使用するリトナビルによる様々なＵＧＴアイソザイムの阻害を示す。 本発明の態様による、ＵＧＴ１Ａ１（上）およびＵＧＴ２Ｂ７（下）についてのジクロフェナク阻害曲線をそれぞれのＩＣ５０値と共に示す。 本発明の態様による、６０μＭのＩＣ₅₀でのジクロフェナクによる、化合物３１３８のＨＬＭ利用の阻害を示す。 本発明の態様による、アッセイの変動性を決定するためのＵＧＴ１Ａ１についてのデータを示す。 本発明の態様による、様々な化合物によるＨＬＭ内のＵＧＴ活性の阻害を示す。 本発明の態様による、ベンゾチアゾール誘導体化合物３０１６について、実施例９に記載される、光出力としてのＣＹＰ４５０酵素活性の選択的検出（Ｖｅｒｉｔａｓ（登録商標）照度計によって記録）を示す。Ｙ軸は、相対光単位（ＲＬＵ）を示す。 本発明の態様による、ベンゾチアゾール誘導体化合物３０１９について、実施例９に記載される、光出力としてのＣＹＰ４５０酵素活性の選択的検出（Ｖｅｒｉｔａｓ（登録商標）照度計によって記録）を示す。Ｙ軸は、相対光単位（ＲＬＵ）を示す。 本発明の態様による、ベンゾチアゾール誘導体化合物３０２６について、実施例９に記載される、光出力としてのＣＹＰ４５０酵素活性の選択的検出（Ｖｅｒｉｔａｓ（登録商標）照度計によって記録）を示す。Ｙ軸は、相対光単位（ＲＬＵ）を示す。 本発明の態様による、ベンゾチアゾール誘導体化合物３８０６について、実施例９に記載される、光出力としてのＣＹＰ４５０酵素活性の選択的検出（Ｖｅｒｉｔａｓ（登録商標）照度計によって記録）を示す。Ｙ軸は、相対光単位（ＲＬＵ）を示す。 本発明の態様による、ベンゾチアゾール誘導体化合物３８１４について、実施例９に記載される、光出力としてのＣＹＰ４５０酵素活性の選択的検出（Ｖｅｒｉｔａｓ（登録商標）照度計によって記録）を示す。Ｙ軸は、相対光単位（ＲＬＵ）を示す。 本発明の態様による、ベンゾチアゾール誘導体化合物３８２０について、実施例９に記載される、光出力としてのＣＹＰ４５０酵素活性の選択的検出（Ｖｅｒｉｔａｓ（登録商標）照度計によって記録）を示す。Ｙ軸は、相対光単位（ＲＬＵ）を示す。 本発明の態様による、ベンゾチアゾール誘導体化合物３８３３について、実施例９に記載される、光出力としてのＣＹＰ４５０酵素活性の選択的検出（Ｖｅｒｉｔａｓ（登録商標）照度計によって記録）を示す。Ｙ軸は、相対光単位（ＲＬＵ）を示す。 本発明の態様による、ベンゾチアゾール誘導体化合物３８２１について、実施例９に記載される、光出力としてのＣＹＰ４５０酵素活性の選択的検出（Ｖｅｒｉｔａｓ（登録商標）照度計によって記録）を示す。Ｙ軸は、相対光単位（ＲＬＵ）を示す。 本発明の態様による、ベンゾチアゾール誘導体化合物３８３５について、実施例９に記載される、光出力としてのＣＹＰ４５０酵素活性の選択的検出（Ｖｅｒｉｔａｓ（登録商標）照度計によって記録）を示す。Ｙ軸は、相対光単位（ＲＬＵ）を示す。 本発明の態様による、ベンゾチアゾール誘導体化合物３８６６について、実施例９に記載される、光出力としてのＣＹＰ４５０酵素活性の選択的検出（Ｖｅｒｉｔａｓ（登録商標）照度計によって記録）を示す。Ｙ軸は、相対光単位（ＲＬＵ）を示す。 本発明の態様による、ベンゾチアゾール誘導体化合物３８６８について、実施例９に記載される、光出力としてのＣＹＰ４５０酵素活性の選択的検出（Ｖｅｒｉｔａｓ（登録商標）照度計によって記録）を示す。Ｙ軸は、相対光単位（ＲＬＵ）を示す。 本発明の態様による、ベンゾチアゾール誘導体化合物３８８３について、実施例９に記載される、光出力としてのＣＹＰ４５０酵素活性の選択的検出（Ｖｅｒｉｔａｓ（登録商標）照度計によって記録）を示す。Ｙ軸は、相対光単位（ＲＬＵ）を示す。 α−ナフトフラボンおよびフルボキサミンによる、化合物３０１９ＣＹＰ１Ａ２活性の用量依存的な阻害を示す。 α−ナフトフラボンおよびフルボキサミンによる阻害に対する、化合物３０１９ヒト肝臓ミクロソーム反応の感度を示す。 化合物３０１９を用いたヒト肝細胞アッセイからの光出力を示す。 化合物３０１９を用いた非溶解ヒト肝細胞アッセイからの光出力を示す。 化合物３０１９を用いた非溶解ラット肝細胞アッセイからの光出力を示す。 化合物３１３８を用いたヒト肝細胞アッセイにおける基質利用を示す。 ＰＢＩ３０１９およびＰＢＩ３１３８の構造を示す。 様々な誘導体についてのデータを示す。 ２つの異なる非ルシフェラーゼ酵素、ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４が、単一試料から検出される、アッセイからのデータを示す。

定義
本明細書で使用する、以下の用語および表現は、示された意味を有する。当然のことながら、本発明の化合物は、非対称に置換された炭素原子を含有し、光学的に活性またはラセミ形態で単離されてもよい。例えば、ラセミ形態の分割または光学的に活性な出発物質からの合成によって、光学的に活性な形態を準備する方法が、当該技術分野においてよく知られている。すべてのキラル、ジアステレオマー、ラセミ形態、および構造のすべての幾何学的異性形態が、本発明の一部である。

ラジカル、置換基、および範囲について以下に列挙される特定の値は、単なる例示の目的であり、ラジカルおよび置換基について定義された範囲内の他の規定値または他の値を除外しない。

本明細書で使用する、「置換された」という用語は、「置換された」を使用する表現内に示された基上の１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、または５個、いくつかの態様では１、２、または３個、他の態様では１または２個）の水素が、示された基からの選択または当業者に知られている適切な基で置換されることを示すものであるが、但し、示された原子の正原子価を超過しないこと、および置換が安定した化合物をもたらすことを前提とする。適切な置換基は、例えば、重陽子、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクル、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、トリフルオロメチルチオ、ジフルオロメチル、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、ヘテロアリールスルフィニル、ヘテロアリールスルホニル、複素環スルフィニル、複素環スルホニル、リン酸塩、硫酸塩、ヒドロキシルアミン、ヒドロキシル（アルキル）アミン、およびシアノを含む。さらに、適切な置換基としては、例えば、−Ｘ、−Ｒ、−Ｏ^-、−ＯＲ、−ＳＲ、−Ｓ^-、−ＮＲ₂、−ＮＲ₃、＝ＮＲ、−ＣＸ₃、−ＣＮ、−ＯＣＮ、−ＳＣＮ、−Ｎ＝Ｃ＝Ｏ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ₂、＝Ｎ₂、−Ｎ₃、ＮＣ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲＲ−Ｓ（＝Ｏ）₂Ｏ^-、−Ｓ（＝Ｏ）₂ＯＨ、−Ｓ（＝Ｏ）₂Ｒ、−ＯＳ（＝Ｏ）₂ＯＲ、−Ｓ（＝Ｏ）₂ＮＲ、−Ｓ（＝Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（＝Ｏ）Ｏ₂ＲＲ、−Ｐ（＝Ｏ）Ｏ₂ＲＲ、−Ｐ（＝Ｏ）（Ｏ^-）₂、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）₂、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ^-、−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ、−Ｃ（Ｓ）ＮＲＲ、−Ｃ（ＮＲ）ＮＲＲを挙げることができ、各Ｘは、独立して、ハロゲン（「ハロ」）、すなわちＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、またはＩであり、各Ｒは、独立して、Ｈ、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、保護基、またはプロドラッグ部分である。当業者によって容易に理解されるように、置換基がケト（＝Ｏ）またはチオキソ（＝Ｓ）等であるとき、次に、置換された原子上の２つの水素原子が置換される。

本明細書で使用する、「低級」という用語は、４個以下の炭素原子を有する炭素鎖を指す。

「アルキル」という用語は、例えば、１〜３０個の炭素原子、および多くの場合、１〜１２個、または１〜約６個の炭素原子を有する、分岐、非分岐、または環状炭化水素を指す。例としては、これらに限定されないが、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、１−ブチル、２−メチル−１−プロピル、２−ブチル、２−メチル−２−プロピル（ｔ−ブチル）、１−ペンチル、２−ペンチル、３−ペンチル、２−メチル−２−ブチル、３−メチル−２−ブチル、３−メチル−１−ブチル、２−メチル−１−ブチル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、２−メチル−２−ペンチル、３−メチル−２−ペンチル、４−メチル−２−ペンチル、３−メチル−３−ペンチル、２−メチル−３−ペンチル、２，３−ジメチル−２−ブチル、３，３−ジメチル−２−ブチル、ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル等が挙げられる。アルキルは、非置換であるか、または置換することができる。またアルキルは、随意に部分的または完全に不飽和であることもできる。したがって、アルキル基の列挙は、アルケニルおよびアルキニル基の両方を含む。アルキルは、上で記載および例示される、一価炭化水素ラジカルであることができるか、または二価炭化水素ラジカル（すなわち、アルキレン）であることができる。

「アルケニル」という用語は、モノラジカル分岐または非分岐の部分的に不飽和である炭化水素鎖（すなわち、炭素−炭素、ｓｐ²二重結合）を指す。一態様では、アルケニル基は、２〜１０個の炭素原子、または２〜６個の炭素原子を有することができる。別の態様では、アルケニル基は、２〜４個の炭素原子を有する。例としては、これらに限定されないが、エチレンまたはビニル、アリル、シクロペンテニル、５−ヘキセニル等が挙げられる。アルケニルは、非置換または置換であることができる。

「アルキニル」という用語は、完全な不飽和点（すなわち、炭素−炭素、ｓｐ三重結合）を有する、モノラジカル分岐または非分岐炭化水素鎖を指す。一態様では、アルキニル基は、２〜１０個の炭素原子、または２〜６個の炭素原子を有することができる。別の態様では、アルキニル基は、２〜４個の炭素原子を有することができる。この用語は、エチニル、１−プロピニル、２−プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、３−ブチニル、１−ヘキシニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、１−オクチニル等の基によって例示される。アルキニルは、非置換または置換であることができる。

「シクロアルキル」という用語は、単一の環状環または複数の縮合環を有する、３〜１０個の炭素原子の環状アルキル基を指す。そのようなシクロアルキル基としては、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチル等の単一環状構造、またはアダマンタニル等の複数環状構造が挙げられる。シクロアルキルは、非置換または置換であることができる。シクロアルキル基は、一価または二価であることができ、アルキル基について上述のとおり、随意に置換することができる。シクロアルキル基は、１つまたは複数の不飽和部位を随意に含むことができ、例えば、シクロアルキル基としては、１つまたは複数の炭素−炭素二重結合含むことができ、例えば、シクロヘキセン、１，３−シクロヘキサジエン、１，４−シクロヘキサジエン等を挙げることができる。

「アルコキシ」という用語は、アルキル−Ｏ−基を指し、アルキルは、本明細書に定義されるとおりである。一態様では、アルコキシ基としては、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、１，２−ジメチルブトキシ等が挙げられる。アルコキシは、非置換または置換であることができる。

「アリール」という用語は、親芳香族環系の単一炭素原子から１つの水素原子を除去することによって得られる芳香族炭化水素基を指す。このラジカルは、親環系の飽和または不飽和炭素原子にあることができる。アリール基は、６〜３０個の炭素原子を有することができる。アリール基は、単一の環（例えば、フェニル）または複数の縮合（溶融）環を有することができ、少なくとも１つの環は、芳香族である（例えば、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニル、またはアントリル）。典型的なアリール基としては、これらに限定されないが、ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニル等に由来する。アリールは、非置換であるか、またはアルキル基について上述のとおり、随意に置換することができる。

「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。同様に、「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、およびヨウ素を指す。

「ハロアルキル」という用語は、本明細書に定義される１つまたは複数の同一または異なり得るハロ基で置換された、本明細書に定義されるアルキルを指す。一態様では、ハロアルキルは、１、２、３、４、または５個のハロ基で置換することができる。別の態様では、ハロアルキルは、１、２、または３個のハロ基で置換することができる。またハロアルキルという用語は、ペルフルオロ−アルキル基も含む。代表的なハロアルキル基としては、例えば、トリフルオロメチル、３−フルオロドデシル、１２，１２，１２−トリフルオロドデシル、２−ブロモオクチル、３−ブロモ−６−クロロヘプチル、１Ｈ，１Ｈ−ペルフルオロオクチル等が挙げられる。ハロアルキルは、アルキル基について上述のとおり、随意に置換することができる。

「ヘテロアリール」という用語は、本明細書において、１、２、または３個の芳香族環を含有し、かつ芳香族環に少なくとも１つの窒素、酸素、または硫黄原子を含有する、単環、二環、または三環系として定義され、例えば、非置換であるか、または「置換された」の定義において上述のとおり、１つもしくは複数、特に１〜３個の置換基で置換することができる。典型的なヘテロアリール基は、１つまたは複数のヘテロ原子に加えて、２〜２０個の炭素原子を含有する。ヘテロアリール基の例としては、これらに限定されないが、２Ｈ−ピロリル、３Ｈ−インドリル、４Ｈ−キノリジニル、アクリジニル、ベンゾ［ｂ］チエニル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シンノリニル、ジベンゾ［ｂ，ｄ］フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル、インダゾリル、インドリシニル、インドリル、イソベンゾフラニル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフチリジニル、オキサゾリル、ペルイミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、テトラゾリル、およびキサンテニルが挙げられる。一態様では、「ヘテロアリール」という用語は、炭素、ならびに非過酸化酸素、硫黄、およびＮ（Ｚ）から独立して選択された、１、２、３、または４個のヘテロ原子を含有する、５個または６個の環原子を含有する、単環芳香族環を示し、Ｚは、不在であるか、またはＨ、Ｏ、アルキル、アリール、または（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルアリールである。別の態様では、ヘテロアリールは、そこから派生した約８〜１０個の環原子のオルト溶融二環式複素環、特にベンズ誘導体またはプロピレン、トリメチレン、もしくはテトラメチレンジラジカルをそこに溶融することによって生じたものを示す。

「複素環」という用語は、酸素、窒素、および硫黄から成る群から選択される少なくとも１つのヘテロ原子を含有し、「置換された」という用語の下で、本明細書に定義される１つまたは複数の基で随意に置換された、飽和または部分的に不飽和である環系を指す。複素環は、１つまたは複数のヘテロ原子を含有する、単環、二環、または三環式基であることができる。また複素環基は、環に結合されたオキソ基（＝Ｏ）またはチオキソ基（＝Ｓ）を含有することもできる。複素環基の非限定例としては、１，３−ジヒドロベンゾフラン、１，３−ジオキソラン、１，４−ジオキサン、１，４−ジチアン、２Ｈ−ピラン、２−ピラゾリン、４Ｈ−ピラン、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソクロマニル、イソインドリニル、モルホリン、ピペラジニル、ピペリジン、ピペリジル、ピラゾリジン、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピロリジン、ピロリン、キヌクリジン、およびチオモルホリンが挙げられる。

「複素環」という用語は、限定ではなく例として、Ｐａｑｕｅｔｔｅ，Ｌｅｏ Ａ．；Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｍｏｄｅｒｎ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗ．Ａ．Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９６８）、特にＣｈａｐｔｅｒ １、３、４、６、７、および９、Ｔｈｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ，Ａ Ｓｅｒｉｅｓ ｏｆ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９５０〜現在）、特にＶｏｌｕｍｅ １３、１４、１６、１９、および２８、ならびにＪ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９６０，８２，５５６６に記載される複素環のモノラジカルを含むことができる。一態様では、「複素環」は、本明細書に定義される「炭素環」を含み、１つまたは複数（例えば、１、２、３、または４個）の炭素原子が、ヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、またはＳ）で置換されている。

ヘテロシクルの例としては、限定ではなく例として、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリジル（ピペリジル）、チアゾリル、テトラヒドロチオフェニル、硫黄酸化テトラヒドロチオフェニル、ピリミジニル、フラニル、チエニル、ピロリル、ピラゾリル、ピペリジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、２−ピロリドニル、ピロリニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、デカヒドロキノリニル、オクタヒドロイソキノリニル、アゾシニル、トリアジニル、６Ｈ−１，２，５−チアジアジニル、２Ｈ，６Ｈ−１，５，２−ジチアジニル、チエニル、チアントレニル、ピラニル、イソベンゾフラニル、クロメニル、キサンテニル、フェノキサチニル、２Ｈ−ピロリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ピラジニル、ピリダジニル、インドリジニル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、１Ｈ−インダゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、フタラジニル、ナフチリジニル、キノキサリニル、キナゾリニル、シンノリニル、プテリジニル、カルバゾリル、β−カルボリニル、フェナントリジニル、アクリジニル、ピリミジニル、フェナントロリニル、フェナジニル、フェノチアジニル、フラザニル、フェノキサジニル、イソクロマニル、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピペラジニル、インドリニル、イソインドリニル、キヌクリジニル、モルホリニル、オキサゾリジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンズイソキサゾリル、オキシインドリル、ベンゾキサゾリニル、イサチノイル、およびビス−テトラヒドロフラニルが挙げられるが、これらに限定されない。

限定ではなく例として、炭素結合複素環は、ピリジンの２、３、４、５、または６位において、ピリダジンの３、４、５、または６位において、ピリミジンの２、４、５、または６位において、ピラジンの２、３、５、または６位において、フラン、テトラヒドロフラン、チオフラン、チオフェン、ピロール、またはテトラヒドロピロールの２、３、４、または５位において、オキサゾール、イミダゾール、またはチアゾールの２、４、または５位において、イソキサゾール、ピラゾール、またはイソチアゾールの３、４、または５位において、アジリジンの２または３位において、アゼチジンの２、３、または４位において、キノリンの２、３、４、５、６、７、または８位において、またはイソキノリンの１、３、４、５、６、７、または８位において結合される。炭素結合複素環としては、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、５−ピリジル、６−ピリジル、３−ピリダジニル、４−ピリダジニル、５−ピリダジニル、６−ピリダジニル、２−ピリミジニル、４−ピリミジニル、５−ピリミジニル、６−ピリミジニル、２−ピラジニル、３−ピラジニル、５−ピラジニル、６−ピラジニル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル等が挙げられる。

限定ではなく例として、窒素結合複素環は、アジリジン、アゼジチン、ピロール、ピロリジン、２−ピロリン、３−ピロリン、イミダゾール、イミダゾリジン、２−イミダゾリン、３−イミダゾリン、ピラゾール、ピラゾリン、２−ピラゾリン、３−ピラゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドール、インドリン、１Ｈ−インダゾールの１位、イソインドールまたはイソインドリンの２位、モルホリンの４位、およびカルバゾールの９位、またはβ−カルボリンにおいて結合することができる。一態様では、窒素結合複素環としては、１−アジリジル、１−アゼテジル、１−ピロリル、１−イミダゾリル、１−ピラゾリル、および１−ピペリジニルが挙げられる。

「炭素環」という用語は、単環として３〜８個の炭素原子を有し、二環として７〜１２個の炭素原子を有し、多環として最大約３０個の炭素原子を有する、飽和、不飽和、または芳香族環を指す。単環式炭素環は、通常、３〜６個の環原子、さらにより典型的には、５または６個の環原子を有する。二環式炭素環は、例えば、二環［４，５］、［５，５］、［５，６］、もしくは［６，６］系として配置された７〜１２個の環原子、または二環［５，６］もしくは［６，６］系として配置された９もしくは１０個の環原子を有する。炭素環の例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、１−シクロペント−１−エニル、１−シクロペント−２−エニル、１−シクロペント−３−エニル、シクロヘキシル、１−シクロヘキシ−１−エニル、１−シクロヘキシ−２−エニル、１−シクロヘキシ−３−エニル、フェニル、スピリル、およびナフチルが挙げられる。炭素環は、アルキル基について上述のとおり、随意に置換することができる。

「アルカノイル」または「アルキルカルボニル」という用語は、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、Ｒは、上で定義されたアルキル基である。

「アシルオキシ」または「アルキルカルボキシ」という用語は、−Ｏ−Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、Ｒは、上で定義されたアルキル基である。アシルオキシ基の例としては、これらに限定されないが、アセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシ、およびペンタノイルオキシが挙げられる。任意の上で定義されたアルキル基を使用して、アシルオキシ基を形成することができる。

「アルコキシカルボニル」という用語は、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ（または「ＣＯＯＲ」）を指し、Ｒは、上で定義されたアルキル基である。

「アミノ」という用語は、−ＮＨ₂を指す。アミノ基は、「置換された」という用語について本明細書に定義されるように、随意に置換することができる。「アルキルアミノ」という用語は、−ＮＲ₂を指し、少なくとも１つのＲはアルキルであり、第２のＲはアルキルまたは水素である。「アシルアミノ」という用語は、Ｎ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）Ｒを指し、各Ｒは、独立して水素、アルキル、またはアリールである。

「アミノ酸」という用語は、ＤまたはＬ形態の天然アミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、およびＶａｌ）、ならびに非天然アミノ酸（ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸塩、馬尿酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１，２，３，４，−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、α−メチル−アラニン、パラ−ベンゾイルフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシン、およびｔｅｒｔ−ブチルグリシン）の残基を含む。またこの用語は、従来のアミノ保護基（例えば、アセチルまたはベンジルオキシカルボニル）を担持する、天然および非天然アミノ酸、ならびにカルボキシ末端において保護される、天然および非天然アミノ酸（例えば、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、フェニル、もしくはベンジルエステルあるいはアミドとして、またはα−メチルベンジルアミドとして）も含む。他の適切なアミノおよびカルボキシ保護基は、当業者に知られている（例えば、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．；Ｗｕｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２^nd ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９１）およびそこで引用される参考文献を参照）。

「ペプチド」という用語は、２〜３５個のアミノ酸（例えば、本明細書で上に定義される）またはペプチジル残基の配列を説明する。この配列は、線形または環状であってもよい。例えば、環状ペプチドは、配列内の２つのシステイン残基の間のジスルフィド端の形成から調製することができるか、生じ得る。好ましくは、ペプチドは、３〜２０個、または５〜１５個のアミノ酸、または２〜５個のアミノ酸を含む。ペプチド誘導体は、米国特許第４，６１２，３０２号、第４，８５３，３７１号、および第４，６８４，６２０号に開示されるように、または本明細書の以下の実施例に記載されるように、調製することができる。本明細書で特異的に列挙されるペプチド配列は、左側にアミノ末端、右側にカルボキシ末端で記載される。

「サッカリド」という用語は、糖または他の炭水化物、特に単糖を指す。サッカリドは、Ｃ₆−ポリヒドロキシ化合物、通常、Ｃ₆−ペンタヒドロキシ、および多くの場合、環状グリカルであることができる。この用語は、既知の単糖およびそれらの誘導体、ならびに２つ以上の単糖類残基を有する多糖類を含む。サッカリドは、アミノ酸の定義において上述のように、ヒドロキシル基上に保護基を含むことができる。サッカリドのヒドロキシル基は、１つまたは複数のハロまたはアミノ基で置換することができる。さらに、炭素原子の１つまたは複数を、例えば、ケトまたはカルボキシル基に酸化させることができる。

「中断された」という用語は、「中断された」という用語を使用する表現において言及される特定の炭素鎖の２つの隣接する炭素原子（およびそれらが結合する水素原子（例えば、メチル（ＣＨ₃）、メチレン（ＣＨ₂）、またはメチン（ＣＨ））の間に別の基が挿入されることを示し、各指示原子の正原子価を超えないこと、および中断が安定した化合物をもたらすことを前提とする。炭素鎖を中断することができる適切な基は、例えば、１つまたは複数の過酸化オキシ（−Ｏ−）、チオ（−Ｓ−）、イミノ（−Ｎ（Ｈ）−）、メチレンジオキシ（−ＯＣＨ₂Ｏ−）、カルボニル（−Ｃ（＝Ｏ）−）、カルボキシ（−Ｃ（＝Ｏ）Ｏ−）、カルボニルジオキシ（−ＯＣ（＝Ｏ）Ｏ−）、カルボキシラト（−ＯＣ（＝Ｏ）−）、イミン（Ｃ＝ＮＨ）、スルフィニル（ＳＯ）、およびスルホニル（ＳＯ₂）を有するものを含む。アルキル基は、前述の適切な基の１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、または約６個）によって中断することができる。また中断の部位は、アルキル基の炭素原子と、アルキル基が結合される炭素原子との間であってもよい。

１つまたは複数の置換基を含有する、上記基のいずれかに関して、当然のことながら、そのような基は、立体的に実用的でなく、および／または合成的に実行可能でない置換または置換パターンを含まないことが理解される。さらに、本発明の化合物は、これらの化合物の置換から発生するすべての立体化学的異性体を含む。

「ルシフェラーゼ」という用語は、他に指定のない限り、自然発生するか、または突然変異によるルシフェラーゼを指す。ルシフェラーゼは、自然発生する場合、当業者によって有機体から容易に得ることができる。基質としてルシフェリンを利用するルシフェラーゼ（ルシフェリン利用ルシフェラーゼ）が好ましい。ルシフェラーゼが自然発生したものであるか、またはルシフェラーゼ−ルシフェリン反応において活性を維持する、自然発生するルシフェラーゼの突然変異によるものである場合、ルシラフェラーゼをコードするｃＤＮＡを発現するように変換された細菌、酵母、哺乳類細胞、昆虫類細胞、植物細胞等の培養から、またはそれをコードする核酸からルシフェラーゼを作製するためのインビトロ無細胞系から容易に得ることができる。ルシフェラーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ウィスコンシン州マディソン）から入手できる。好適な例は、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ ｐｙｒａｌｉｓ、Ｐｈｏｔｕｒｉｓ ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉｃａ、およびそれらの安定化突然変異形態からのものを含む、ホタルルシフェラーゼである。

本明細書において使用する、「ＬＤＲ」という用語は、「ルシフェリン検出試薬」として知られる溶液を指す。ルシフェリン検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐａｒｔ ｎｏ．Ｖ８５９）［０．６％ Ｐｒｉｏｎｅｘ（登録商標）、０．１ｍｇ／ｍｌ 熱安定性ＵｌｔｒａＧｌｏ（登録商標）組み換えルシフェラーゼ、０．４ｍＭ ＡＴＰ、２Ｕ／ｍｌ無機プロホスファターゼ、０．２Ｍ ＰＩＰＥＳ ｐＨ６．７、１２ｍＭ ＭｇＳＯ４、１ｍＭ ＣＤＴＡ、１８ｕＭ ２−（４−アミノフェニル）−６−メチルベンゾチアゾール（ＡＰＭＢＴ）、２％ Ｔｅｒｇｉｔｏｌ、０．２％ ＤＴＡＢ、０．２％ Ｍａｚｕ、および２０Ｕ／ｍｌ ブタエステラーゼ］を、再構成緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ ｐａｒｔ ｎｏ．Ｖ８６５）とともに溶解することによって生成される。

「シアノ」基は、−ＣＮ、または

または

として表されてもよい。

発明の方法
本発明は、２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール、または２−シアノ−６−アミノベンゾチアゾールの誘導体（以下「２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール」の誘導体）を使用して、関心対象の酵素について細胞に基づくアッセイを行うための方法を提供する。一般に、細胞に基づくアッセイは、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール骨格（基質）に連結された、例えば、６′−ヒドロキシ部位または６′−アミノ部位に連結された、所望の非ルシフェラーゼ酵素のための特定の酵素認識部位を有する、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体を使用して行われる。その細胞を、その基質と接触させる。次に、得られた混合物を、ルシフェラーゼ反応混合物と接触させ、生物発光を測定する。一態様では、Ｄ−システインを基質と同時に添加する。別の態様では、Ｄ−システインを、ルシフェラーゼ反応混合物の前、または同時に混合物に添加する。あるいは、Ｄ−システインは、ルシフェラーゼ反応混合物中に存在してもよい。いくつかの実施形態では、Ｄ−システインは、複数回添加されてもよい。

２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールまたは２−シアノ−６−アミノベンゾチアゾールは、ルシフェラーゼと反応して光を生成しないが、両方の化合物は、Ｄ−システインと環化して、２−（６−ヒドロキシベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）−２，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸（Ｄ−ルシフェリン）または２−（６−アミノベンゾ［ｄ］チアゾール−２−イル）−２，５−ジヒドロチアゾール−４−カルボン酸（アミノルシフェリン）をそれぞれ形成し、ルシフェラーゼと反応すると、例えば、熱安定性ホタルルシフェラーゼにおいて光を生成する。アッセイは、ｐＨ４〜９で１〜１００μＭの誘導体を用いて行うことができる。多数の非ルシフェラーゼ酵素は、これらの誘導体を使用する生物発光アッセイにおいて検出され、および／またはそれらの活性が測定され得る。

ルシフェラーゼ反応混合物は、ルシフェラーゼ、Ｍｇ²⁺、およびＡＴＰを含む。またルシフェラーゼ反応混合物は、Ｄ−システイン、洗剤、エステラーゼ、塩等の他の成分を含んでもよい。ルシフェラーゼ反応混合物の例は、熱安定性ホタルルシフェラーゼ、ＭｇＳＯ₄、ＡＴＰ、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ ＮＰ−９、およびトリシンを含む。

生成された生物発光を、対照と比較することができる。適切な対照は、基質と非ルシフェラーゼ酵素との間の反応、またはルシフェラーゼ反応のいずれかに必須の成分または条件の１つまたは複数を欠失する。そのような成分または条件としては、これらに限定されないが、補因子、酵素、温度、および阻害因子が挙げられる。

非ルシフェラーゼ酵素媒介反応の調節因子を特定する方法も提供される。この方法は、細胞を、１つまたは複数の試験化合物、および非ルシフェラーゼ酵素のための基質であって、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体である基質と接触させることを含む。次に、得られた混合物は、ルシフェラーゼ反応混合物と接触させられる。一態様では、Ｄ−システインを基質と同時に添加する。別の態様では、Ｄ−システインを、ルシフェラーゼ反応混合物の前、または同時に混合物に添加する。あるいは、Ｄ−システインは、ルシフェラーゼ反応混合物中に存在してもよい。いくつかの実施形態では、Ｄ−システインは、複数回添加されてもよい。

さらに、本明細書で提供される方法を使用して、例えば、酵素、酵素調節因子、酵素基質、酵素活性因子、酵素反応の補因子（例えば、ＡＴＰ）、ＯＨラジカル等の少なくとも１つの分子、または例えば、酸化還元条件等の１つまたは複数の条件を検出してもよい。一態様では、本発明による方法は、単一試料中の１つまたは複数の分子を検出するための迅速な方法を提供する。

別の態様では、本方法は、生物発光アッセイにおける酵素、基質、または補因子等の分子の存在、量、または特異的活性を定量することを含む。生物発光信号の強度は、それぞれの分子の存在または量の関数である。一態様では、本方法は、少なくとも２つの異なる反応を用いる。例えば、第１の反応は、非ルシフェラーゼ酵素媒介反応であってもよく、第２の反応は、ルシフェラーゼ媒介の反応であってもよい。あるいは、第１の反応は、非酵素反応であり、第２の反応は、ルシフェラーゼ媒介反応である。

低い生物発光背景を有する誘導体を用いる、本明細書に記載の生物発光アッセイの場合、それらのアッセイは、より少量（または多量）の誘導体を使用することができ、それらの誘導体は、例えば、非ルシフェラーゼ酵素との、向上した反応性を有し得る。さらに、本明細書に記載の生物発光アッセイのいずれにおいても、ルシフェラーゼの不活性化を阻害または回避するか、またはそうでなければ生物発光信号を拡大または強化するものを含むが、これらに限定されない他の試薬を反応混合物に添加してもよい。

本発明の別の態様では、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体を使用することによって、酵素または非酵素反応の基質、補因子、調節因子（阻害因子または活性因子のいずれか）、または誘導体としてのそれらの活性について、試験化合物をスクリーニングおよび評価することができる。例えば、試験化合物は、試験化合物が存在しない場合、生物発光または生物発光生成物を産生する条件下で、反応混合物を誘導体および試験化合物と接触させることによって、反応の調節因子または基質となることが決定されてもよい。

本発明の一態様では、反応の基質と阻害因子とを区別する方法が提供される。例えば、試験化合物は、酵素の阻害因子または基質が存在しない場合、誘導体と酵素との間の相互作用に適した条件下で、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体を提供する前に、試験化合物の代謝を許可する条件下で、少なくとも１つの酵素でインキュベートされる。一態様では、その反応の生成物は、Ｄ−ルシフェリンまたはＤ−アミノルシフェリンに変換することができ、ルシフェラーゼが存在する場合、第２の発光反応を生じる。得られる発光反応を、酵素の阻害因子が存在しない場合、誘導体と酵素との間の相互作用に適した条件下で、酵素を化合物および誘導体と接触させることから得られるものと比較する。酵素による化合物の代謝は、アッセイ媒質中のその濃度を減少させ、それが酵素のための基質であったことを示す、化合物の代謝のない条件と比較して、阻害活性の明らかな喪失をもたらし得る。代謝されなかった阻害化合物は、基質の添加時間に関係なく、等しい能力を示すこととなる。

本発明の一態様では、試験化合物は、好ましくは最初に、第１の既定期間、例えば、２４〜４８時間、酵素と接触させられる。その後、混合物は、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体および生物発光酵素、例えば、ルシフェラーゼと同時または同時期に接触させられ、混合物は、第２の既定期間インキュベートさせる。

本発明の別の態様では、細胞に基づく方法が、試験化合物をスクリーニングして、細胞の酵素活性に対するその作用を決定するために提供される。試験化合物、例えば、非ルシフェラーゼ酵素の阻害因子、非ルシフェラーゼ酵素のための誘導因子、非ルシフェラーゼ酵素のための基質、および非ルシフェラーゼ酵素の活性因子が、自然に、または組み換え発現を介するかのいずれかでその酵素を発現する細胞、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体、および生物発光酵素と接触させられるか、またはその酵素を発現する細胞、発光酵素、および２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体と、既定の時間接触させられる。したがって、生物発光酵素、例えば、ルシフェラーゼ等の組み換え酵素を一時的に発現するか、または安定して発現するかのいずれかである細胞を用いてもよい。一時的または安定したトランスフェクト細胞を作成するための任意の従来の方法、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌに記載される方法を使用してもよい。一態様では、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体は、細胞と接触させられて細胞中に拡散し、適切な分子が存在する場合、ルシフェラーゼの基質である生成物を産生する。ルシフェラーゼが細胞中に存在する場合、生物発光を検出することができる。あるいは、ルシフェラーゼを欠失する細胞では、生成物が細胞を通過して媒質中に入ることができ、ルシフェラーゼ反応混合物を媒質に添加することができる。その後、細胞と化合物との相互作用から得られる活性を、対照（例えば、試験化合物を引いた）反応混合物に対して、反応混合物の生物発光を測定することによって決定することができる。

本発明の別の態様では、試験化合物は、好ましくは、最初に、既定の期間細胞と接触させられる。その後、細胞は、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体およびルシフェラーゼと同時または同時期のいずれかで接触させられ、混合物を、第２の既定期間インキュベートさせる。非ルシフェラーゼ酵素活性は、対照反応混合物（例えば、試験化合物を引いた）に対して、反応混合物から生成された生物発光の量を測定することによって決定することができる。本発明の別の態様では、試験化合物は、好ましくは、最初に、既定期間細胞と接触させられる。その後、曝露された細胞が、次に、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体と接触させられ、第２の既定期間インキュベートされる。次に、細胞をルシフェラーゼと接触させて、第３の混合物を形成し、第３の既定期間インキュベートさせる。その後、細胞と試験化合物との相互作用から得られる細胞の活性を、対照反応混合物（例えば、試験化合物を引いた）に対して、反応混合物の生物発光を測定することによって決定することができる。細胞媒質中に存在する分子、例えば、活性または不活性機構を介して細胞媒質中に存在する分子についての細胞に基づく生物発光検出アッセイは、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体との反応混合物を細胞媒質に添加すること、または細胞媒質を２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体との反応混合物に添加すること、および生物発光を検出することを含むことができる。

本発明の細胞に基づくアッセイのさらに別の態様では、ルシフェリン反応混合物を添加する前に、細胞が溶解されてもよい。動物細胞の場合、通常、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００またはＴｅｒｇｉｔｏｌ等の０．１〜１．０％非イオン性洗剤を含む緩衝液で十分である。細菌、植物、真菌、または酵母細胞は、通常、溶解がより困難である。洗剤、凍結／解凍周期、低張緩衝液、超音波処理、キャビテーション、またはこれらの方法の組み合わせを使用してもよい。ルシフェラーゼもしくは他の酵素活性、または他の分子もしくは条件の検出と互換性がある溶解物を生成する溶解の方法が好ましい。

非ルシフェラーゼ酵素の存在または活性は、細胞媒質中、または動物、例えば、生きている動物の細胞内で測定されてもよい。研究目的で、動物の細胞内で測定する場合、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体が動物に投与されてもよく、例えば、動物に注入されるか、または動物によって消費される水または食餌等の水溶液に添加されてもよい。ルシフェラーゼ基質である生成物への誘導体の変換は、動物の細胞内で発現されたルシフェラーゼによって媒介される生物発光、例えば、動物に投与された、例えば、動物に注入されたルシフェラーゼによるトランスジェニック動物（例えば、マウス、ラット、およびマーモセットモンキー）の全体動物画像化によって、または例えば、血液、血漿、尿等の生理液、もしくは組織試料を収集し、それらをルシフェラーゼ試薬と組み合わせることによって検出されてもよい。

２つの反応を用いるアッセイは、同時（１ステップ）または逐次（２ステップ）で行い、タンパク質（ペプチドまたはポリペプチド）、例えば、酵素反応のための酵素、基質、補因子、阻害因子、もしくは活性因子、または酸化還元条件等の条件を含む１つまたは複数の因子を検出してもよい。逐次反応は、同一槽、例えば、マルチウェルプレートのウェル、または異なる槽内で行ってもよい。２ステップアッセイの場合、第１の反応混合物は、非ルシフェラーゼ酵素媒介反応のための試薬のすべて、または一部を含有してもよく、試薬の１つが存在しない場合、例えば、細胞溶解物等の試料中で検出されるものである。

例えば、非ルシフェラーゼ酵素媒介反応は、非ルシフェラーゼのための基質である、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体を、Ｄ−ルシフェリンまたはＤ−アミノルシフェリンに変換することができる生成物に変換するために効果的な条件下で行われる。様々な酵素（例えば、サイトクロームＰ４５０、ＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ、グルタチオントランスフェラーゼ、プロテアーゼ）と基質との間の反応を許可する条件は、当業者によく知られている標準方法に従って培養された細胞内に存在する。しかしながら、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体が細胞に適用される媒質または緩衝塩溶液は、システインを含まないことを理解されたい。システインを含まない適用溶液は、関心対象の酵素に曝露する前に、システインを含む溶液中の誘導体の環化を回避する必要がある。

第１の反応は、ルシフェラーゼ反応混合物の添加時、または添加前に停止されてもよい。例えば、第１の反応の停止剤、例えば、洗剤が、ルシフェラーゼ反応混合物中に存在してもよい。ルシフェラーゼ反応混合物は、好ましくは、ルシフェラーゼのための基質を実質的に欠失し、例えば、ルシフェラーゼのための基質の源のみが、非ルシフェラーゼ酵素と誘導体との間の反応によって提供される。第１の反応のすべての試薬が、第１の反応混合物中に存在するとき、アッセイは、反応を変化させる部分、例えば、反応の阻害因子または増強因子を特定するために用いられてもよい。同時または連続のいずれかで、反応を行った後、１つもしくは複数の分子の存在もしくは量、または１つもしくは複数の反応の阻害因子または活性因子が検出され、どの程度でどのような能力を有するかが決定される。

１ステップアッセイの場合、反応混合物は、非ルシフェラーゼ酵素媒介反応およびルシフェラーゼ媒介反応のための試薬、または非酵素反応およびルシフェラーゼ媒介反応のための試薬等の２つの反応のための試薬、または単一反応のための反応混合物を含有してもよい。

２つの反応を用いるアッセイの場合、アッセイのための分子を添加する順序は異なってもよい。逐次開始および実行される場合（同一槽であるか否かにかかわらず）、反応条件、例えば、試薬濃度、温度、または追加試薬等の調整を行ってもよい。例えば、停止剤または増強剤を反応の間に添加してもよい（例えば、米国特許第５，７４４，３２０号（Ｓｈｅｒｆら）、および第６，５８６，１９６号（Ｂｒｏｎｓｔｅｉｎら）を参照、それらの開示は、参照することによって本明細書に特異的に組み込まれる）。一態様では、２つ以上の反応が、単一反応混合物中で同時に実行される。随意に、アッセイは均一なアッセイであり、例えば、混合物を試料に添加する前に、成分が混合される。結果は、試薬の追加移行なしに読み取られてもよい。

したがって、本発明のアッセイは、試料中の１つまたは複数の分子または条件の検出を可能にし、例えば、試料は、酵母、鳥類、植物、昆虫、もしくはヒト、サル、マウス、イヌ、ウシ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、またはブタ細胞等を含むが、これらに限定されない、ヒトもしくはラット肝細胞（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）等の哺乳類細胞等の真核性単離もしくは溶解細胞、または原核細胞、または２つ以上の異なる有機体からの細胞、または細胞溶解物もしくはその上澄み、または分子の精製形態、例えば、標準曲線を調製するために有用な生成非ルシフェラーゼ酵素を含む試料を含む。他の態様では、試料は、組織外植片、例えば、肝切片、脳切片、皮膚等であることができる。細胞は、組み換え技法を介して遺伝子的に修飾されていなくてもよいか（非組み換え細胞）、または組み換えＤＮＡで一時的にトランスフェクトされ、および／またはそのゲノムが組み換えＤＮＡで安定して相補されるか、またはそのゲノムが遺伝子を分断させる、例えば、プロモータ、イントロン、もしくはオープンリーディングフレームを分断させるか、または１つのＤＮＡフラグメントを別のものと置換するように修飾された、組み換え細胞であってもよい。組み換えＤＮＡまたは置換ＤＮＡフラグメントは、本発明の方法によって検出される分子、検出される分子のレベルもしくは活性を変化させる部分、および／または分子のレベルもしくは活性を変化させる分子もしくは部分に関連しない遺伝子生成物をコード化してもよい。

本方法は、酵素媒介反応、非酵素媒介反応または条件のための分子を検出するために用いることができる。例えば、この方法によって検出される分子または条件としては、これらに限定されないが、酵素、例えば、デメチラーゼ、オキシダーゼ（例えば、ＭＡＯ）、デアセチラーゼ、デホルミラーゼ、プロテアーゼ（プロテオソーム、カルパイン、β−セクレターゼ、カテプシン、カルパイン、トロンビン、グランザイムＢ）、ホスファターゼ、キナーゼ、ペルオキシダーゼ、トランスフェラーゼ、例えば、ＧＳＴまたはＵＧＴ、スルホターゼ、β−ラクタマーゼ、サイトクロームＰ４５０酵素、エステラーゼ、例えば、アセチルコリンステラーゼ、デヒドロゲナーゼ、酵素媒介反応の基質、阻害因子、補因子、活性因子、活性酸素種、還元条件および転写制御因子または遺伝子転写の調節因子が挙げられる。この方法で用いられる非ルシフェラーゼ酵素、検出される酵素または基質もしくは補因子の検出に有用な酵素のいずれかは、組み換え酵素および内因性（天然）酵素を含む、酵素の任意の組み換えから選択することができる。一態様では、検出される非ルシフェラーゼ酵素は、内因性酵素である。別の態様では、非ルシフェラーゼ酵素は、組み換え酵素である。当業者に明らかな別の組み合わせを、本明細書の教示に従って、本アッセイおよび方法で使用することができる。非ルシフェラーゼ酵素としては、限定されないが、プロテアーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、スルファターゼ、ペプチダーゼ、オキシダーゼ、デアルキラーゼ、デホルミラーゼ、トランスフェラーゼ、およびグリコシダーゼが挙げられる。非ルシフェラーゼ酵素は、加水分解酵素、酸化還元酵素、リアーゼ、トランスフェラーゼ、例えば、グルタチオンＳトランスフェラーゼまたはＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンターゼ、またはデアセチラーゼ、例えば、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）であってもよい。特定の関心対象は、生理学的意義を有する非ルシフェラーゼ酵素の群である。これらの酵素としては、タンパク質ペプチダーゼ、エステラーゼ、タンパク質ホスファターゼ、グリコシラーゼ、プロテアーゼ、デヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、オキシゲナーゼ、レダクターゼ、メチラーゼ、トランスフェラーゼ等が挙げられる。関心対象の非ルシフェラーゼ酵素としては、有機および無機のエステルを作製または加水分解すること、アミドをグリコシル化および加水分解することに関与するものが挙げられる。いずれの群においても、さらなる下位区分が存在し得る。

特に、本発明に有用な非ルシフェラーゼ酵素としては、酵素活性を呈する任意のタンパク質、例えば、リパーゼ、ホスホリパーゼ、スルファターゼ、ウレアーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、およびエステラーゼが挙げられ、酸ホスファターゼ、グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、ガラクトシダーゼ、およびカルボキシルエステラーゼを含む。一態様では、非ルシフェラーゼ酵素は、加水分解酵素である。加水分解酵素の例としては、アルカリおよび酸ホスファターゼ、エステラーゼ、デカルボキシラーゼ、ホスホリパーゼＤ、Ｐ−キシロシダーゼ、β−Ｄ−フコシダーゼ、チオグルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−ガラクトシダーゼ、α−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−グルクロニダーゼ、α−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−マンノシダーゼ、β−Ｄ−フラクトフラノシダーゼ、およびβ−Ｄ−グルコシデュロナーゼが挙げられる。

一態様では、このアッセイは、サイトクロームＰ４５０酵素（ＣＹＰ４５０）酵素またはモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）、Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ＮＡＴ）、フラビンモノアミンオキシダーゼ（ＦＭＯ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ホスファターゼ、例えば、アルカリンホスファターゼ（ＡＰ）、スルファターゼ、またはＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）を含む、非ルシフェラーゼ酵素を検出するのに有用である。例えば、アッセイは、レダクターゼのための基質、例えば、サイトクロームＰ４５０レダクターゼ、ＭＡＯ、ＦＭＯ、ＧＳＴ、デアルキラーゼ、デアセチラーゼ、デホルミラーゼ、ホスファターゼ、例えば、ＡＰ、スルファターゼ、β−ラクタマーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、プロテアーゼ、例えば、プロテオソーム、カテプシン、カルパイン、β−セクレターゼ、トロンビン、またはグランザイム、ルシフェラーゼを使用して行われてもよいか、またはアッセイを使用して、活性酸素種（ＲＯＳ）、ペルオキシダーゼ、例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、および／または酸化還元条件を検出してもよい。別の態様では、アッセイは、デアルキラーゼ、ＧＳＴ、またはルシフェラーゼ、酸化還元条件、またはＵＧＴ酵素、またはそれらの活性の調節（例えば、阻害もしくは活性）を検出するのに有用である、少なくともＢ環修飾を有する基質を使用して行われてもよい。

一態様では、アッセイは、試料中の複数の非ルシフェラーゼ酵素を検出するために有用である。例えば、アッセイを行って、１つの酵素群の２つの異なる酵素、例えば、単一試料中の２つのサイトクロームＰ４５０酵素、ＣＹＰ１Ａ２、およびＣＹＰ３Ａ４を検出してもよい。そのようなアッセイでは、２つの異なる生物発光基質を試料に添加し、生物発光基質の１つは、酵素の１つのための２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体、例えばＣＹＰ１Ａ２であるが、他の生物発光基質は、他の酵素のためのＤ−ルシフェリンまたはアミノルシフェリンの誘導体、例えばルシフェリンアセタール、例えばＣＹＰ３Ａ４であり得る。別の態様では、アッセイを行って、２つの異なる非ルシフェラーゼ酵素、例えば、ＣＹＰ４５０酵素およびＵＧＴ酵素を検出してもよい。このアッセイでは、２つの異なる生物発光基質が試料に添加され、生物発光基質の１つは、酵素の１つのための２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体、例えばＣＹＰ１Ａ２であるが、他の生物発光基質は、他の酵素のためのＤ−ルシフェリンまたはアミノルシフェリンの誘導体、例えばＵＧＴであり得る。これらの多重アッセイの場合、生物発光は、反応の一部を２つの異なる反応槽に移すことによって測定される。反応槽の１つに、Ｄ−システインを含有するルシフェラーゼ反応混合物を添加し、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体を使用して検出される非ルシフェラーゼ酵素の検出を可能にする。他の反応槽に、Ｄ−システインを含まないルシフェラーゼ反応混合物を添加し、他の生物発光基質を使用して検出される非ルシフェラーゼ酵素の検出を可能にする。さらに、試験化合物、例えば、薬物を試料に添加することができる。次に、本発明の細胞に基づく多重アッセイを使用して、複数の非ルシフェラーゼ酵素、例えば、酵素群中の２つの異なる酵素に対する試験化合物の作用を同時に決定することができる。

上述の方法に関して、いくつかの態様は、非ルシフェラーゼ酵素と誘導体との間の反応によって生成された生成物を含む、第１の混合物を提供し、生成物は、システインの存在下で、ルシフェラーゼのための生物発光基質である。また本発明は、逆の方法も提供し、そこでは第１の混合物は、非ルシフェラーゼ酵素と誘導体との間の反応によって生成された生成物を含み、この生成物は、システインの存在下で、ルシフェラーゼのための生物発光基質ではない。例えば、様々な態様では、非ルシフェラーゼ酵素は、ルシフェラーゼ基質を生成するよりも、ルシフェラーゼ前基質（例えば、誘導体）を消費することができる。試験反応を対照と比較することによって、この方法は、酵素活性を検出または決定するか、または酵素活性のための調節因子の活性を決定する能力を提供する。

サイトクロームＰ４５０アッセイ
一態様では、本発明は、サイトクロームＰ４５０（ＣＹＰ４５０）についての細胞に基づくアッセイを提供する。ＣＹＰ４５０反応を発光ホタルルシフェラーゼ反応と組み合わせる、生物発光検出方法が使用される。一態様では、第１の酵素反応において、ＣＹＰ４５０酵素が、シアノベンゾチアゾール誘導体を、ホタルルシフェラーゼの発光基質であるＤ−（−）−２−（６′−ヒドロキシ−２′−ベンゾチアゾリル）−２−チアゾリン−４−カルボン酸の前駆体（Ｄ−ルシフェリン）である２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールに酸化する。ＣＹＰ４５０反応生成物は、システインとの非酵素環化反応においてＤ−ルシフェリンに変換され、ホタルルシフェラーゼとの第２の酵素反応において検出される。誘導体化は、ＣＹＰ４５０酵素による先の酸化なしに、システイン反応が、ルシフェラーゼで光を生成できないルシフェリン誘導体を生成するものである。したがって、システムからの光出力は、シアノベンゾチアゾール誘導体のルシフェリン前駆体である２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールへのＣＹＰ４５０に依存した変換に依存および比例する。このアプローチに関する変型は、Ｄ−アミノルシフェリンに変換される、２−シアノ−６−アミノベンゾチアゾール誘導体で開始し、Ｄ−アミノルシフェリンもホタルルシフェラーゼの発光基質である。

ＵＤＰグルクロノシル転移酵素（ＵＧＴ）は、ＣＹＰ４５０反応の反応生成物を共役させることができ、それによってアッセイを干渉することができる。したがって、ＵＧＴの阻害因子は、細胞に基づくアッセイに含まれてもよい。適切な阻害因子は、サリチルアミドおよびジクロフェナクを含む。

ＣＹＰ４５０活性は、培養細胞、細胞画分（例えば、主にミクロソーム、Ｓ９細胞および、ミトコンドリア画分）、または天然もしくは組み換え源のいずれかからの半精製および精製調製物において測定されてもよい。ＣＹＰ４５０は、肝臓において特に豊富であるため、一般に、ＣＹＰ４５０活性について培養した肝細胞をアッセイし、肝ミクロソームおよび肝Ｓ９画分は、多くの場合、無細胞アッセイに使用される。また組み換え発現系を使用して、個別のＣＹＰ４５０酵素を生成してもよい。さらなる源としては、昆虫細胞／バキュロウイルス、大腸菌、および酵母発現系が挙げられる。肝臓は、その常在ＣＹＰ４５０集団が、薬物および他の生体異物の代謝および排除において中心的な役割を果たすため、特定の関心対象である。ＣＹＰ４５０の誘発および阻害は、それらが薬物の体内動態および薬物間の相互作用において果たす中心的役割に起因して、広く研究されている。ＣＹＰ依存性代謝は、阻害因子によって遅延され、誘発因子によって加速される。

ＣＹＰ４５０−１Ａ２、−２Ａ６、−２Ｂ６、−２Ｃ８、−２Ｃ９、−２Ｃ１９、−２Ｄ６、−２Ｅ１、および−３Ａ４／５を含む、ヒトＣＹＰ４５０のサブセットは、ヒトにおける大部分の薬物代謝に関与し、阻害プロファイルを評価するために、関心対象の化合物が、これらの一部またはすべてについての無細胞アッセイに適用される。組み換えまたは精製されたＣＹＰ４５０が使用される場合、基質の選択性は問題ではない。この場合、単一のＣＹＰ４５０酵素のみがアッセイに存在し、干渉する他の相互反応酵素は存在しない。しかしながら、肝ミクロソームまたは肝Ｓ９画分が使用されるとき、多くのＣＹＰ４５０が肝臓内で共発現するため、単一のＣＹＰ４５０酵素に焦点を当てた研究の場合、選択性が重要である。交差反応性基質を用いて、肝画分から認められた全活性は、試料中のすべての交差反応ＣＹＰ４５０の寄与を反映し、それによって、解釈が困難または不可能であり得る結果を生じる。この理由から、関心対象の個別のＣＹＰ４５０酵素について、選択性の高い基質を有することが望ましい。

細胞に基づく系は、主に転写レベルで開始されるため、ＣＹＰ４５０の誘発を測定するために有用であり、培養された肝細胞は、多くの場合、好ましいモデルとして使用される。すべてのＣＹＰ４５０遺伝子が、化学物質または他の環境入力によって誘発可能であるとは限らない。誘発可能なものとしては、ＣＹＰ１Ａ２、−２Ｃ９、−２Ｃ１９、−２Ｂ６、およびＣＹＰ３Ａ４が挙げられ、肝画分を用いた阻害研究の場合と同様に、ＣＹＰ４５０選択的基質は、ＣＹＰ４５０特異的誘発事象の明確な特徴付けに必要である。

ＵＧＴアッセイ
本発明は、細胞に基づくＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）アッセイも提供する。ＣＹＰ４５０酵素に加えて、あるシアノベンゾチアゾール誘導体は、ＵＧＴ酵素によるグルクロン酸への共役のための基質である。例えば、ホタルルシフェラーゼのための活性基質に対する前駆体である、シアノベンゾチアゾール誘導体（すなわち、前基質）が、ＵＧＴ基質として提供される。システインとの環化反応は、これらの化合物をそれらのルシフェラーゼ活性形態、例えば、Ｄ−ルシフェリンに変換する。ＵＧＴ酵素活性を欠失する反応では、共役が発生しないため、すべてのシアノベンゾチアゾール誘導体は、ルシフェラーゼのための活性形態に変換され、ルシフェラーゼ反応において最大光出力が認められる。しかし、活性ＵＧＴ酵素との反応では、シアノベンゾチアゾール誘導体の一部またはすべてが、グルクロン酸に共役され、生成物のシステイン環化形態は、ルシフェラーゼと不活性である。したがって、ＵＧＴ不活性対照と比較した光還元の程度を、ＵＧＴ活性と相関することができる。

多重アッセイ
本発明は、試料中の複数の非ルシフェラーゼ酵素を検出するためのアッセイも提供する。例えば、細胞を含有する試料が、第１の反応槽内で、酵素と基質との間の反応を許可する条件下で、２つの生物発光基質と接触させられ、基質の１つは２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体である。次に、インキュベーション混合物の一部を、第２および第３の反応槽に移す。反応槽の１つに、Ｄ−システインを含有するルシフェラーゼ反応混合物を添加する。他方の反応槽に、Ｄ−システインを含まないルシフェラーゼ反応混合物を添加する。両方の反応槽内で、生物発光を測定する。そのような多重アッセイを使用して、酵素群からの２つの酵素、例えば、ＣＹＰ４５０酵素ＣＹＰ１Ａ２およびＣＹＰ３Ａ４、または２つの異なる酵素、例えば、ＣＹＰ４５０酵素およびＵＧＴ酵素を検出することができる。

２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体
本発明において使用される誘導体の範囲内である２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの修飾は、環原子の１つもしくは複数の置換、環原子に結合された置換基（原子または基）の１つもしくは複数の置換、および／または環への１つもしくは複数の原子の添加、例えば、環の拡大もしくは追加、またはそれらの組み合わせを含む。２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールにおける環原子の一部についての付番が、図２に示される。２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールは、２つの縮合環、６位にＯＨ基を有する６員環（以下「Ａ環」）、および２位にシアノ基を有する、６員環に融合された５員環（以下「Ｂ環」）を有する。すべての立体異性体、例えば、エナンチオマーおよびジアステレオマーが、本明細書において特異的に検討される。１つのジアステレオマーは、別のものと比較して、優れた特性または活性を示し得る。必要に応じて、ラセミ材料の分離は、キラルカラムを使用するＨＰＬＣ、またはＴｈｏｍａｓ Ｊ．Ｔｕｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．１９９４，３７，２４３７−２４４４に記載される、カンフォン酸塩化物等の溶解剤を使用する溶解によって達成することができる。キラル化合物は、 例えば、Ｍａｒｋ Ａ．Ｈｕｆｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９５，６０，１５９０−１５９４に記載されるように、キラル触媒またはキラルリガンドを使用して、直接合成されてもよい。

本発明の誘導体は、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの環の１つまたは複数に対して１つまたは複数の修飾、および／または２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの環の１つまたは複数に結合される置換基を有してもよい。例としては、６−ＯＨを有する２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールが挙げられ、ルシフェラーゼまたは非ルシフェラーゼ酵素のための基質を提供するか、または６−Ｏもしくは６−Ｎ原子が、ルシフェラーゼもしくは非ルシフェラーゼ酵素のための基質である置換基を有する。２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールのさらなる例としては、本明細書に記載される式の化合物が挙げられる。他の態様では、４、５、または７位で置換された２−シアノ−ベンゾチアゾール誘導体が提供され、本発明の方法で使用することができる。

例えば、Ａ環修飾を有する２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール誘導体は、別の原子によるＡ環内に炭素原子の置換、環の追加、異なる原子または基による環原子に結合された置換基の置換、またはそれらの任意の組み合わせを有してもよい。Ｂ環修飾をによる２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾール誘導体は、５員環内に原子の追加または置換、例えば、それによって環を例えば６員環に拡大する、１つもしくは複数の原子の挿入、異なる原子、例えばＣもしくはＯを有する環内のＮもしくはＳの置換、環原子に結合された置換原子もしくは基の置換、またはそれらの任意の組み合わせを有してもよい。一態様では、本発明の誘導体は、複数の位置で修飾され、例えば、誘導体は、２つ（以上）のＡ環修飾、２つ（以上）のＢ環修飾、またはそれらの任意の組み合わせを有するものである。一態様では、修飾は、２−シアノ−６−ヒドロキシベンゾチアゾールの環の１つ上に置換基を追加することを含むことができ、置換基は、非ルシフェラーゼ酵素のための基質であるか、または非ルシフェラーゼ酵素のためのリンカーおよび基質である。

一態様では、本発明の誘導体は、Ｌ−Ｘ−Ｍの構造を有し、Ｌは、酵素のための基質であるか、または酵素と相互作用する別の分子であってもよく、Ｘは、Ｏ、ＮＲであってもよく、ここでＲは随意に置換されたアルキル基もしくは窒素保護基、ＮＨ、またはリンカー、例えば、ＬがＬ−Ｘ−Ｍから除去されると同時に開裂してＭを産生する、自己開裂リンカーであり、Ｍは、例えば本明細書に記載される１つまたは複数の置換基で随意に置換された２−シアノ−ベンゾチアゾールであってもよい。

一態様では、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体が、式Ｉの化合物であってもよく、
式中、
Ｒ¹は、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ^x、またはＮＲ^xＲ^yであり、
Ｒ²は、（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキル、トリフルオロメチル、アミノ、ニトロ、またはハロであり、
ｎは、０、１、２、または３であり、
Ｒ^xは、（ｉ）アリールが、以下のハロ、ヒドロキシ、アミノ基、ペプチド、もしくはエステルの１つまたは複数で随意に置換された、（Ｃ₁−Ｃ₁₀）アルキルアリール、または（ｉｉ）アルキルが、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、もしくはアミノで随意に置換された、（Ｃ₁−Ｃ₁₀）アルキルであり、
Ｒ^yは、水素または（Ｃ₁−Ｃ₁₀）アルキルである。

他の態様では、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体が、本明細書に記載される式ＩＡ〜ＸＶのいずれか１つの化合物であってもよい。一態様では、式Ｉの化合物が、
であってもよい。

他の態様では、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体が、本明細書に記載される式Ｉ〜ＸＶのいずれか１つの化合物であってもよい。一態様では、本発明は、式ＩＡの化合物を提供し、
式中、
Ｙは、Ｎ、Ｎ−酸化物、Ｎ−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、またはＣＨであり、
Ｘは、Ｓ、Ｏ、ＣＨ＝ＣＨ、Ｎ＝ＣＨ、またはＣＨ＝Ｎであり、
ＺおよびＺ′は、独立してＨ、ＯＲ、ＮＨＲ、またはＮＲＲであり、
Ｗ¹およびＺは、いずれも環Ａ上のケト基であり、環Ａ内の随意の二重結合を示す点線の少なくとも１つが不在であり、
Ｋ¹、Ｋ²、Ｋ³、およびＫ⁴のそれぞれは、独立してＣＨ、Ｎ、Ｎ−酸化物、またはＮ−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、Ｋ¹とＫ²、およびＫ³とＫ⁴との間の点線は、随意の二重結合を示し、
Ａ′およびＢ′は、環Ａに融合した随意の芳香族環であり、溶融三環系を形成するように、その一方のみが化合物内に存在して、
Ｂ′が存在するときはＺ基が存在し、
Ａ′が存在するときはＺ基が不在であり、
環Ｂ内の点線は、随意の二重結合であり、
各Ｒは、独立してＨ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルキニル、（Ｃ₃−Ｃ₂₀）シクロアルキル、（Ｃ₁−Ｃ₁₂）アルコキシ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルスルホキシ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールスルホキシ、ヘテロアリールスルホキシ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルスルホニル、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールスルホニル、ヘテロアリール−スルホニル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルスルフィニル、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルコキシカルボニル、アミノ、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル）₂、トリ（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アンモニウム（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、第四級窒素を有するヘテロアリール、第四級窒素を有するヘテロアリールカルボニル、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールチオ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルリン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルホスホン酸塩、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールリン酸塩、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールホスホン酸塩、リン酸塩、硫酸塩、サッカリド、グアニジノ、またはＭ⁺であって、Ｍはアルカリ金属であるか、
またはＺもしくはＺ′がＮＲ¹Ｒ¹であるとき、Ｒ¹Ｒ¹は、それらが結合するＮと一緒に、ヘテロアリールまたは複素環基を形成し、
任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、アリール、ヘテロアリール、または複素環基は、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルキニル、（Ｃ₃−Ｃ₂₀）シクロアルキル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルコキシル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルカルボニル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルカルボキシル、ハロ、ヒドロキシル、−ＣＯＯＲ^x、−ＳＯ₂Ｒ^x、−ＳＯ₃Ｒ^x、ニトロ、アミノ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−Ｓ（Ｏ）−、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−ＳＯ₂−、リン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルリン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルホスホン酸塩、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキニル、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル）₂、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキニル）₂、メルカプト、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルチオ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールチオ、トリフルオロメチル、＝Ｏ、ヘテロアリール、および複素環から選択された、１、２、３、４、または５個の置換基で随意に置換され、各置換基は、１〜３個のＲ基で随意に置換され、
Ｒ^xは、Ｈ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、または（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールであり、
ＺまたはＺ′が窒素部分を含むとき、ＺまたはＺ′窒素部分の一方または両方が（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルまたはＬ基で置換されてもよく、Ｌはアミノ酸ラジカル、最大２０個のアミノ酸部分を有するペプチドラジカル、または非ルシフェラーゼのための基質である任意の他の小分子であり、
Ｚがヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシルまたは窒素部分のＨは、（ＨＯ）₂Ｐ（Ｏ）−ＯＣＨ₂−、スルホ、−ＰＯ₃Ｈ₂、または１〜約１２個の炭素原子の炭素鎖を介してＺ基に結合したセファロスポラン酸で置換されてもよく、
ＺまたはＺ′がヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシルまたは窒素部分の１つのＨは、Ｌ′基リンカーで置換されてもよく、Ｌ′はリンカーを解放するための酵素によって除去可能な基であり、リンカーは、自己開裂することができる炭素鎖であって、１つまたは複数の窒素原子、酸素原子、カルボニル基、随意に置換された芳香族環、またはペプチド結合で随意に中断され、
リンカーは、そのリンカーの一端において、酸素原子またはＮＨ基を介してＬ′に結合され、そのリンカーの他端は、ＺもしくはＺ′とのエーテル、エステル、またはアミド結合を形成し、
ＺがＯＲのとき、式Ｉは、随意に、１〜４個のＯ原子、Ｎ原子、または随意に置換されたアリール、ヘテロアリール、もしくは複素環基によって随意に中断された（Ｃ₁−Ｃ₁₂）アルキルジラジカルを含むリンカーを介して、式Ｉの二量体の間に橋を形成するように、２つのＡ環において接続された二量体であり、式Ｉの二量体を接続する各Ｚ基のＲ基は橋で置換され、
Ａ^-は、第四級窒素が存在するときに存在するアニオンであるか、
またはその塩である。

別の態様では、本発明は、式ＩＡＡの化合物である式ＩＡの化合物を提供し、
式中、
Ｙは、Ｎ、Ｎ−酸化物、Ｎ−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、またはＣＨであり、
Ｘは、Ｓ、Ｏ、ＣＨ＝ＣＨ、Ｎ＝ＣＨ、またはＣＨ＝Ｎであり、
Ｚは、Ｈ、ＯＲ、ＮＨＲ、またはＮＲＲであり、
Ｗ¹は、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、（Ｃ_1-Ｃ₆）アルキル、または（Ｃ_1-Ｃ₆）アルコキシであり、
環Ｂ内の点線は、随意の二重結合であり、
各Ｒは、独立して、Ｈ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルキニル、（Ｃ₃−Ｃ₂₀）シクロアルキル、（Ｃ₁−Ｃ₁₂）アルコキシ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール、ヘテロアリール、複素環、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルスルホキシ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールスルホキシ、ヘテロアリールスルホキシ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルスルホニル、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールスルホニル、ヘテロアリール−スルホニル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルスルフィニル、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールスルフィニル、ヘテロアリール−スルフィニル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルコキシカルボニル、アミノ、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル）₂、トリ（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アンモニウム（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、第四級窒素を有するヘテロアリール、第四級窒素を有するヘテロアリールカルボニル、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールチオ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルリン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルホスホン酸塩、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールリン酸塩、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールホスホン酸塩、リン酸塩、硫酸塩、サッカリド、またはＭ⁺であって、Ｍはアルカリ金属であるか、
またはＺがＮＲ¹Ｒ¹のとき、Ｒ¹Ｒ¹は、それらが結合されるＮと一緒にヘテロアリールまたは複素環基を形成し、
任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、アリール、ヘテロアリール、または複素環基は、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルキニル、（Ｃ₃−Ｃ₂₀）シクロアルキル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルコキシル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルカルボニル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルカルボキシル、ハロ、ヒドロキシル、−ＣＯＯＲ^x、−ＳＯ₂Ｒ^x、−ＳＯ₃Ｒ^x、ニトロ、アミノ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−Ｓ（Ｏ）−、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−ＳＯ₂−、リン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルリン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルホスホン酸塩、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキニル、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル）₂、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキニル）₂、メルカプト、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルチオ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールチオ、トリフルオロメチル、＝Ｏ、ヘテロアリール、および複素環から選択された、１、２、３、４、または５個の置換基で随意に置換され、各置換基は、１〜３個のＲ基で随意に置換され、
Ｒ^xは、Ｈ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、または（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールであり、
Ａ^-は、第四級窒素が存在するときに存在するアニオンであるか、
またはその塩である。

別の態様では、本発明は、式ＩＩの化合物を提供し、
式中、
ＺおよびＺ′は、独立して、ＯＲ¹、ＮＨＲ¹、またはＮＲ¹Ｒ¹であり、
Ｗ¹は、Ｈ、ハロ、（Ｃ_1-Ｃ₆）アルキル、（Ｃ_2-Ｃ₂₀）アルケニル、ヒドロキシル、または（Ｃ_1-Ｃ₆）アルコキシであるか、または
Ｗ¹およびＺは、いずれも環Ａ上のケト基であり、環Ａ内の随意の二重結合を示す点線の少なくとも１つが不在であり、
Ｋ¹、Ｋ²、Ｋ³、およびＫ⁴のそれぞれは、独立して、ＣＨ、Ｎ、Ｎ−酸化物、またはＮ−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、Ｋ¹とＫ²、Ｋ³とＫ⁴との間の点線は、随意の二重結合を示し、
Ａ′およびＢ′は、環Ａに融合された随意の芳香族環であって、溶融三環系を形成するように、その一方のみが化合物中に存在し、
Ｂ′が存在するときは、Ｚ基が存在し、
Ａ′が存在するときは、Ｚ基が不在であり、
Ｒは、Ｈ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルキニル、（Ｃ₃−Ｃ₂₀）シクロアルキル、（Ｃ₁−Ｃ₁₂）アルコキシ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール、ヘテロアリール、複素環、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルスルホキシ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールスルホキシ、ヘテロアリール−スルホキシ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルコキシカルボニル、アミノ、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル）₂、トリ（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アンモニウム（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、第四級窒素を有するヘテロアリール、第四級窒素を有するヘテロアリールカルボニル、サッカリド、またはＭ⁺であって、Ｍはアルカリ金属であり、
Ｒ¹は、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール、ヘテロアリール、複素環、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルチオ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−Ｓ（Ｏ）−、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−ＳＯ₂、−ＳＯ₃（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、サッカリド、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルリン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルリン酸塩、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールチオ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール−Ｓ（Ｏ）−、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール−ＳＯ₂、−ＳＯ₃（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールリン酸塩、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールホスホン酸塩であるか、またはＲ¹は、Ｒ²で置換された（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルであり、
Ｒ²は、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルキニル、（Ｃ₃−Ｃ₂₀）シクロアルキル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルコキシル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルカルボニル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルカルボキシル、ヒドロキシル、−ＣＯＯＲ^x、−ＳＯ₃Ｒ^x、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルチオ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールチオ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−Ｓ（Ｏ）−、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−ＳＯ₂−、ニトロ、アミノ、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキニル、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル）₂、またはＮ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキニル）₂、メルカプト、サッカリド、またはトリフルオロメチルであるか、
またはＺもしくはＺ′がＮＲ¹Ｒ¹であるとき、Ｒ¹Ｒ¹は、それらが結合されるＮと一緒にヘテロアリールまたは複素環基を形成し、
任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、アリール、ヘテロアリール、または複素環基は、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルキニル、（Ｃ₃−Ｃ₂₀）シクロアルキル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルコキシル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルカルボニル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルカルボキシル、ハロ、ヒドロキシル、−ＣＯＯＲ^x、−ＳＯ₂Ｒ^x、−ＳＯ₃Ｒ^x、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−Ｓ（Ｏ）−、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−ＳＯ₂−、リン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルリン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルホスホン酸塩、ニトロ、アミノ、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキニル、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル）₂、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキニル）₂、メルカプト、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルチオ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールチオ、トリフルオロメチル、＝Ｏ、ヘテロアリール、および複素環から選択された、１、２、３、４、または５個の置換基で随意に置換され、各置換基は、１〜３個のＲ基で随意に置換され、
Ｒ^xは、Ｈまたは（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、
ＺまたはＺ′が窒素部分を含むとき、ＺまたはＺ′窒素部分の水素は、Ｌ基によって置換されてもよく、Ｌは、アミノ酸ラジカル、最大２０個のアミノ酸部分を有するペプチドラジカル、または非ルシフェラーゼのための基質である、任意の他の小分子であり、
Ｚがヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシルまたは窒素部分のＨは、（ＨＯ）₂Ｐ（Ｏ）−ＯＣＨ₂−、スルホ、−ＰＯ₃Ｈ₂で置換されるか、または１〜約１２個の炭素原子の炭素鎖を介して、Ｚ基に結合されるセファロスポラン酸で置換されてもよく、
ＺまたはＺ′がヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシルまたは窒素部分の１つのＨは、Ｌ′基リンカーで置換されてもよく、Ｌ′は、リンカーを解放するために酵素によって除去可能な基であり、リンカーは、自己開裂することができる炭素鎖であり、１つまたは複数の窒素原子、酸素原子、カルボニル基、随意に置換される芳香族環、またはペプチド結合によって随意に中断され、
リンカーは、リンカーの一端において、酸素原子またはＮＨ基を介してＬ′に結合され、リンカーの他端は、ＺまたはＺ′とのエーテル、エステル、またはアミド結合を形成し、
ＺがＯＲ¹であるとき、式ＩＩは、随意に、１〜４個のＯ原子、Ｎ原子、または随意に置換されたアリール、ヘテロアリール、または複素環基によって随意に中断されて、式ＩＩの二量体間に橋を形成するように、（Ｃ₁−Ｃ₁₂）アルキルジラジカルを含むリンカーを介して、２つのＡ環において接続された二量体であり、式ＩＩの二量体を接続する各Ｚ基のＲ¹基は、橋で置換され、
Ａ^-は、第四級窒素が存在するときに存在する、アニオンであるか、
またはその塩である。

さらに別の態様では、本発明は、式ＩＩＡの化合物である、式ＩＩの化合物を提供し、

式中、
Ｚは、ＯＲ¹、ＮＨＲ¹、またはＮＲ¹Ｒ¹であり、
Ｗ¹は、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、（Ｃ_1-Ｃ₆）アルキル、または（Ｃ_1-Ｃ₆）アルコキシであり、
Ｒ¹は、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール、ヘテロアリール、複素環、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルチオ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−Ｓ（Ｏ）−、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−ＳＯ₂、−ＳＯ₃（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、サッカリド、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルリン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルホスホン酸塩、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールチオ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール−Ｓ（Ｏ）−、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール−ＳＯ₂、−ＳＯ₃（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールリン酸塩、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールホスホン酸塩であるか、またはＲ¹は、Ｒ²によって置換された（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルであり、
Ｒ²は、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルキニル、（Ｃ₃−Ｃ₂₀）シクロアルキル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルコキシル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルアルキルカルボニル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルカルボキシル、ヒドロキシル、−ＣＯＯＲ^x、−ＳＯ₃Ｒ^x、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルチオ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールチオ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−Ｓ（Ｏ）−、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−ＳＯ₂−、ニトロ、アミノ、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキニル、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル）₂、またはＮ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキニル）₂、メルカプト、サッカリド、グアニジノ、またはトリフルオロメチルであるか、
またはＺがＮＲ¹Ｒ¹であるとき、Ｒ¹Ｒ¹は、それらが結合されるＮと一緒にヘテロアリールまたは複素環基を形成し、
任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、アリール、ヘテロアリール、または複素環基は、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルキニル、（Ｃ₃−Ｃ₂₀）シクロアルキル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルコキシル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルカルボニル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルカルボキシル、ハロ、ヒドロキシル、−ＣＯＯＲ^x、−ＳＯ₂Ｒ^x、−ＳＯ₃Ｒ^x、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−Ｓ（Ｏ）−、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−ＳＯ₂−、リン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルリン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルホスホン酸塩、ニトロ、アミノ、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキニル、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル）₂、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキニル）₂、メルカプト、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルチオ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールチオ、トリフルオロメチル、＝Ｏ、ヘテロアリール、および複素環から選択された、１、２、３、４、または５個の置換基で随意に置換され、各置換基は、１〜３個のＲ基で随意に置換され、
Ｒ^xは、Ｈまたは（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、
ＺがＯＲ¹であるとき、式ＩＩＡは、随意に、１〜４個のＯ原子、Ｎ原子、または随意に置換されたアリール、ヘテロアリール、または複素環基によって随意に中断されて、式ＩＩＡの二量体間に橋を形成するように、（Ｃ₁−Ｃ₁₂）アルキルジラジカルを含むリンカーを介して、２つのＡ環において接続された二量体であり、式ＩＩの二量体を接続する各Ｚ基のＲ¹基は、橋で置換され、
Ａ^-は、第四級窒素が存在するときに存在する、アニオンであるか、
またはその塩である。

一態様では、本発明は、式ＩＩＩの化合物を提供し、
式中、
Ｙは、Ｎ、Ｎ−酸化物、Ｎ−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、またはＣＨであり、
Ｘは、Ｓ、Ｏ、ＣＨ＝ＣＨ、Ｎ＝ＣＨ、またはＣＨ＝Ｎであり、
ＺおよびＺ′は、独立してＨ、ＯＲ、ＮＨＲ、またはＮＲＲであり、
Ｗ¹は、Ｈ、ハロ、（Ｃ_1-Ｃ₆）アルキル、（Ｃ_2-Ｃ₂₀）アルケニル、ヒドロキシル、または（Ｃ_1-Ｃ₆）アルコキシであるか、または
Ｗ¹およびＺは、いずれも環Ａ上のケト基であり、環Ａ内の随意の二重結合を示す点線の少なくとも１つが不在であり、
Ｋ¹、Ｋ²、Ｋ³、およびＫ⁴のそれぞれは、独立してＣＨ、Ｎ、Ｎ−酸化物、またはＮ−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルであり、Ｋ¹とＫ²、およびＫ³とＫ⁴との間の点線は、随意の二重結合を示し、
Ａ′およびＢ′は、環Ａに融合した随意の芳香族環であり、縮合三環系を形成するように、その一方のみが化合物内に存在して、
Ｂ′が存在するときはＺ基が存在し、
Ａ′が存在するときはＺ基が不在であり、
環Ｂ内の点線は、随意の二重結合であり、
各Ｒは、独立して、Ｈ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルキニル、（Ｃ₃−Ｃ₂₀）シクロアルキル、（Ｃ₁−Ｃ₁₂）アルコキシ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール、ヘテロアリール、複素環、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルスルホキシ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールスルホキシ、ヘテロアリール−スルホキシ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルスルホニル、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールスルホニル、ヘテロアリール−スルホニル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルスルフィニル、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルコキシカルボニル、アミノ、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル）₂、トリ（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アンモニウム（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、第四級窒素を有するヘテロアリール、第四級窒素を有するヘテロアリールカルボニル、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールチオ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルリン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルホスホン酸塩、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールリン酸塩、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールホスホン酸塩、リン酸塩、硫酸塩、サッカリド、またはＭ⁺であって、Ｍはアルカリ金属であるか、
またはＺもしくはＺ′がＮＲ¹Ｒ¹のとき、Ｒ¹Ｒ¹は、それらが結合されるＮと一緒にヘテロアリールまたは複素環基を形成し、
任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、アリール、ヘテロアリール、または複素環基は、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルキニル、（Ｃ₃−Ｃ₂₀）シクロアルキル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルコキシル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルカルボニル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルカルボキシル、ハロ、ヒドロキシル、−ＣＯＯＲ^x、−ＳＯ₂Ｒ^x、−ＳＯ₃Ｒ^x、ニトロ、アミノ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−Ｓ（Ｏ）−、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−ＳＯ₂−、リン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルリン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルホスホン酸塩、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキニル、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル）₂、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキニル）₂、メルカプト、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルチオ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールチオ、トリフルオロメチル、＝Ｏ、ヘテロアリール、および複素環から選択された、１、２、３、４、または５個の置換基で随意に置換され、各置換基は、１〜３個のＲ基で随意に置換され、
Ｒ^xは、Ｈ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、または（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールであり、
ＺまたはＺ′は窒素部分を含むとき、ＺまたはＺ′窒素部分の水素の一方または両方は、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルまたはＬ基で置換されてもよく、Ｌは、アミノ酸ラジカル、最大２０個のアミノ酸部分を有するペプチドラジカル、または非ルシフェラーゼのための基質である任意の他の小分子であり、
Ｚがヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシルまたは窒素部分のＨは、（ＨＯ）₂Ｐ（Ｏ）−ＯＣＨ₂−、スルホ、−ＰＯ₃Ｈ₂によって、または１〜約１２個の炭素原子の炭素鎖を介して、Ｚ基に結合されたセファロスポラン酸によって置換されてもよく、
ＺまたはＺ′がヒドロキシル基または窒素部分であるとき、ヒドロキシルまたは窒素部分の１つのＨは、Ｌ′基リンカーによって置換されてもよく、Ｌ′は、リンカーを解放するために酵素によって除去可能な基であり、リンカーは、自己開裂することができる炭素鎖であって、１つまたは複数の窒素原子、酸素原子、カルボニル基、随意に置換された芳香族環、またはペプチド結合で随意に中断され、
リンカーは、そのリンカーの一端において、酸素原子またはＮＨ基を介してＬ′に結合され、そのリンカーの他端は、ＺもしくはＺ′とのエーテル、エステル、またはアミド結合を形成し、
ＺがＯＲであるとき、式ＩＩＩは、随意に、１〜４個のＯ原子、Ｎ原子、または随意に置換されたアリール、ヘテロアリール、もしくは複素環基によって随意に中断され、式ＩＩＩの二量体間に橋を形成する、（Ｃ₁−Ｃ₁₂）アルキルジラジカルを含むリンカーを介して、２つのＡ環において接続された二量体であり、式ＩＩＩの二量体を接続する各Ｚ基のＲ基は、橋によって置換され、
Ａ^-は、第四級窒素が存在するときに存在するアニオンであるか、
またはその塩である。

一態様では、本発明は、式ＩＩＩＡの化合物である、式ＩＩＩの化合物を提供し、
式中、
Ｙは、Ｎ、Ｎ−酸化物、Ｎ−（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、またはＣＨであり、
Ｘは、Ｓ、Ｏ、ＣＨ＝ＣＨ、Ｎ＝ＣＨ、またはＣＨ＝Ｎであり、
Ｚは、Ｈ、ＯＲ、ＮＨＲ、またはＮＲＲであり、
Ｗ¹は、Ｈ、ハロ、ヒドロキシル、（Ｃ_1-Ｃ₆）アルキル、（Ｃ_2-Ｃ₁₀）アルケニル、または（Ｃ_1-Ｃ₆）アルコキシであり、
環Ｂ内の点線は、随意の二重結合であり、
各Ｒは、独立して、Ｈ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルキニル、（Ｃ₃−Ｃ₂₀）シクロアルキル、（Ｃ₁−Ｃ₁₂）アルコキシ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール、ヘテロアリール、複素環、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルスルホキシ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールスルホキシ、ヘテロアリール−スルホキシ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルスルホニル、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールスルホニル、ヘテロアリール−スルホニル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルスルフィニル、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールスルフィニル、ヘテロアリール−スルフィニル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルコキシカルボニル、アミノ、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル）₂、トリ（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アンモニウム（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、ヘテロアリール（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、第四級窒素を有するヘテロアリール、第四級窒素を有するヘテロアリールカルボニル、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールチオ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルリン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルホスホン酸塩、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールリン酸塩、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールホスホン酸塩、リン酸塩、硫酸塩、サッカリド、またはＭ⁺であって、Ｍはアルカリ金属であるか、
またはＺがＮＲ¹Ｒ¹のとき、Ｒ¹Ｒ¹は、それらが結合されるＮと一緒に、ヘテロアリールまたは複素環基を形成し、
任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、アリール、ヘテロアリール、または複素環基は、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルケニル、（Ｃ₂−Ｃ₂₀）アルキニル、（Ｃ₃−Ｃ₂₀）シクロアルキル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルコキシル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルカルボニル、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルカルボキシル、ハロ、ヒドロキシル、−ＣＯＯＲ^x、−ＳＯ₂Ｒ^x、−ＳＯ₃Ｒ^x、ニトロ、アミノ、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−Ｓ（Ｏ）−、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキル−ＳＯ₂−、リン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルリン酸塩、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルホスホン酸塩、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、ＮＨ（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキニル、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル）₂、Ｎ（（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキニル）₂、メルカプト、（Ｃ₁−Ｃ₂₀）アルキルチオ、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリール、（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールチオ、トリフルオロメチル、＝Ｏ、ヘテロアリール、および複素環から選択された、１、２、３、４、または５個の置換基で随意に置換され、各置換基は、１〜３個のＲ基で随意に置換され、
Ｒ^xは、Ｈ、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキル、または（Ｃ₆−Ｃ₃₀）アリールであり、
ＺがＯＲであるとき、式ＩＩＩは、随意に、１〜４個のＯ原子、Ｎ原子、または随意に置換されたアリール、ヘテロアリール、もしくは複素環基によって随意に中断され、式ＩＩＩの二量体間に橋を形成するように、（Ｃ₁−Ｃ₁₂）アルキルジラジカルを含むリンカーを介して、２つのＡ環において接続された二量体であり、式ＩＩＩの二量体を接続する各Ｚ基のＲ基は、橋によって置換され、
Ａ^-は、第四級窒素が存在するときに存在するアニオンであるか、
またはその塩である。

一態様では、本発明は、式Ｖの化合物を提供し、
式中、
Ｙは、Ｎ、Ｎ−酸化物、Ｎ−低級アルキル、またはＣＨであり、
Ｘは、Ｓ、ＣＨ＝ＣＨ、またはＮ＝Ｃであり、
ＺおよびＺ′は、Ｈ、ＯＲ、ＮＨＲ、またはＮＲＲであり、
Ｗは、Ｈ、ハロ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_2-20アルケニル、ヒドロキシル、またはＣ_1-6アルコキシであるか、または
環Ａ上のＷおよびＺは、いずれもケト基であり、
Ｋ¹、Ｋ²、Ｋ³、およびＫ⁴のそれぞれは、独立してＣＨ、Ｎ、Ｎ−酸化物、またはＮ−低級アルキルであり、
Ｒは、Ｈ、Ｃ_1-20アルキル、置換Ｃ_1-20アルキル、Ｃ_2-20アルケニル、置換Ｃ_2-20アルケニル、ハロゲン化Ｃ_2-20アルケニル、置換ハロゲン化Ｃ_2-20アルケニル、Ｃ_3-20アルキニル、置換Ｃ_3-20アルキニル、Ｃ_2-20アルケニルＣ_1-20アルキル、置換Ｃ_2-20アルケニルＣ_1-20アルキル、Ｃ_3-20アルキニルＣ_2-20アルケニル、置換Ｃ_3-20アルキニルＣ_2-20アルケニル、Ｃ_3-20シクロアルキル、置換Ｃ_3-20シクロアルキル、Ｃ_6-30アリール、ヘテロアリール、Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルキル、置換Ｃ_6-30アリール、置換ヘテロアリール、置換Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルキル、アルキルスルホキシＣ_1-20アルキル、Ｃ_1-20アルコキシカルボニル、Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルコキシカルボニル、Ｃ_6-30アリールチオＣ_1-20アルキル、ヒドロキシＣ_1-20アルキル、トリＣ_1-20アンモニウムＣ_1-20アルキル、ヘテロアリールＣ_1-20アルキル、置換ヘテロアリールＣ_1-20アルキル、第四級窒素を有するヘテロアリール、第四級窒素を有するヘテロアリールカルボニル、およびＮ−メチル−テトラヒドロピリジニルであって、Ｚ″が酸素であるときはＭ⁺であり、Ｍはアルカリ金属であって、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基は、もう１つのＣ_1-20アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アセチル、アミノ、低級アルキルアミノ、低級アルキニルアミノ、イミダゾリニルメチルアミノ、ジ−低級アルキルアミノ、ジ−低級アルキニルアミノ、ピペリジノ、ピロリジノ、アゼチジノ、アジリジノ、ジ−イミダゾリニルメチルアミノ、メルカプト、Ｃ_1-20アルキルチオ、Ｃ_6-30アリールチオ、またはトリフルオロメチル基、置換Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルキルカルボニルによって随意に置換されてもよく、各Ｒ基は、複数個存在する場合は独立して定義され、
およびここで、
Ｚがアミノであるとき、水素の一方または両方は、Ｃ_1-20アルキルまたはＬ基によって置換されてもよく、
Ｌは、アミノ酸ラジカル、最大２０個のアミノ酸部分を有するペプチドラジカルであるか、または非ルシフェラーゼのための基質である、任意の他の小分子であってもよく、
およびここで、
Ｚがヒドロキシルまたはアミノであるとき、Ｈは、（ＨＯ）₂Ｐ（Ｏ）−ＯＣＨ₂−、スルホ、もしくは−ＰＯ₃Ｈ₂によって、または１つもしくは複数の炭素原子の炭素鎖を介して、Ｚ基に結合されたセファロスポラン酸によって置換されてもよく、
Ｚがヒドロキシルまたはアミノであるとき、Ｈは、Ｌ′基リンカーによって置換されてもよく、Ｌ′は、リンカーを解放するために酵素によって除去可能な基であり、リンカーは、最適に自己開裂し得る炭素鎖であって、１つまたは複数の窒素原子、酸素原子、カルボニル基、（置換された）芳香族環、またはペプチド結合で随意に中断され、
リンカーは、そのリンカーの一端において、酸素原子またはＮＨ基を介してＬ′に結合され、そのリンカーの他端は、Ｚ基とのエーテル、エステル、またはアミド結合を形成し、
Ｚがヒドロキシルであるとき、式Ｖは、−ＯＣＨ₂Ｏ−橋を介して、２つのＡ環において接続された二量体を含み、
ここで、
Ａ′およびＢ′は、環Ａに融合された随意の芳香族環であり、溶融三環系を形成するように、その１つのみが一度に存在してもよく、
Ｂ′が存在するときはＺ基が存在し、
Ａ′が存在するときはＺ基が不在であり、
ここで、
環Ａの１つの炭素は、Ｎ−酸化物部分によって置換されてもよく、
環Ｂ内の点線は、随意の二重結合であり、
ＸがＮ＝Ｃである場合、環Ｃは、Ｎ＝Ｃ部分の炭素原子において結合され、
Ａ^-は、第四級窒素が存在するときに存在するアニオンであるか、またはその塩である。

本明細書におけるさらなる誘導体は、一般的な式ＶＩＩを有し、
式中、
Ｙは、Ｎ−酸化物、Ｎ−低級アルキル、またはＣＨであり、
Ｘは、ＳまたはＣＨ＝ＣＨであるか、または
Ｙは、Ｎであり、Ｘは、Ｎ＝ＣまたはＣＨ＝ＣＨであり、
ＺおよびＺ′は、Ｈ、ＯＲ、ＮＨＲ、またはＮＲＲであるか、または
Ｚは、ホウ素原子を介して、環Ａに結合される環状ジエーテル化ジヒドロキシボラン基であり、
Ｗは、Ｈ、ハロ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_2-20アルケニル、ヒドロキシル、またはＣ_1-6アルコキシであり、
Ｋ¹、Ｋ²、Ｋ³、およびＫ⁴のそれぞれは、独立してＣＨ、Ｎ、Ｎ−酸化物、またはＮ−低級アルキルであり、
Ｒは、Ｈ、Ｃ_1-20アルキル、置換Ｃ_1-20アルキル、Ｃ_2-20アルケニル、置換Ｃ_2-20アルケニル、ハロゲン化Ｃ_2-20アルケニル、置換ハロゲン化Ｃ_2-20アルケニル、Ｃ_2-20アルケニルＣ_1-20アルキル、置換Ｃ_2-20アルケニルＣ_1-20アルキル、Ｃ_3-20アルキニル、置換Ｃ_3-20アルキニル、Ｃ_3-20アルキニルＣ_2-20アルケニル、置換Ｃ_3-20アルキニルＣ_2-20アルケニル、Ｃ_3-20シクロアルキル、置換Ｃ_3-20シクロアルキル、Ｃ_6-30アリール、ヘテロアリール、Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルキル、置換Ｃ_6-30アリール、置換ヘテロアリール、置換Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルキル、Ｃ_1-20アルコキシカルボニル、Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルコキシカルボニル、Ｃ_6-30アリールチオＣ_1-20アルキル、ヒドロキシＣ_1-20アルキル、トリＣ_1-20アンモニウムＣ_1-20アルキル、ヘテロアリールＣ_1-20アルキル、置換ヘテロアリールＣ_1-20アルキル、第四級窒素を有するヘテロアリール、第四級窒素を有するヘテロアリールカルボニル、Ｎ−メチル−テトラヒドロピリジニル、ペンタフルオロフェニルスルホニル、およびＺ″が酸素であるときはＭ⁺であり、Ｍはアルカリ金属であって、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、および／またはアルキニル基は、もう１つのＣ_1-20アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アセチル、アミノ、低級アルキルアミノ、低級アルキニルアミノ、イミダゾリニルメチルアミノ、ジ−低級アルキルアミノ、ジ−低級アルキニルアミノ、ピペリジノ、ピロリジノ、アゼチジノ、アジリジノ、ジ−イミダゾリニルメチルアミノ、メルカプト、Ｃ_1-20アルキルチオ、Ｃ_6-30アリールチオ、またはトリフルオロメチル基によって随意に置換されてもよく、各Ｒ基は、複数個存在する場合は独立して定義され、
およびここで、
Ｚがアミノであるとき、水素の一方または両方は、Ｃ_1-20アルキルまたはＬ基によって置換されてもよく、
Ｌは、アミノ酸ラジカル、最大２０個のアミノ酸部分を有するペプチドラジカルであるか、または非ルシフェラーゼのための基質である、任意の他の小分子であってもよく、
およびここで、
Ｚがヒドロキシルまたはアミノであるとき、Ｈは、（ＨＯ）₂Ｐ（Ｏ）−ＯＣＨ₂−、スルホ、もしくは−ＰＯ₃Ｈ₂によって、または１つもしくは複数の炭素原子の炭素鎖を介して、Ｚ基に結合されたセファロスポラン酸によって置換されてもよく、
Ｚがヒドロキシルまたはアミノであるとき、Ｈは、Ｌ′基リンカーによって置換されてもよく、Ｌ′は、リンカーを解放するために酵素によって除去可能な基であり、リンカーは、最適に自己開裂し得る炭素鎖であって、１つまたは複数の窒素原子、酸素原子、カルボニル基、（置換された）芳香族環、またはペプチド結合で随意に中断され、
リンカーは、そのリンカーの一端において、酸素原子またはＮＨ基を介してＬ′に結合され、そのリンカーの他端は、Ｚ基とのエーテル、エステル、またはアミド結合を形成し、
Ｚがヒドロキシルであるとき、式ＶＩＩは、−ＯＣＨ₂Ｏ−橋を介して、２つのＡ環において接続された二量体を含み、
ここで、
Ａ′およびＢ′は、環Ａに融合された随意の芳香族環であり、溶融三環系を形成するように、その１つのみが一度に存在してもよく、
Ｂ′が存在するときはＺ基が存在し、
Ａ′が存在するときはＺ基が不在であり、
ここで、
環Ａの１つの炭素は、Ｎ−酸化物部分によって置換されてもよく、
環Ｂ内の点線は、随意の二重結合であり、
ＸがＮ＝Ｃである場合、環Ｃは、Ｎ＝Ｃ部分の炭素原子において結合され、
Ａ^-は、第四級窒素が存在するときに存在するアニオンであるか、またはその塩である。

他の誘導体は、式ＶＩＩＩの化合物を含み、
式中、
ｎ＝０または１であり、
ｎ＝０であるとき、Ｘ＝Ｓであり、−−−−は、単一結合であるか、または
ｎ＝１であるとき、Ｘ＝ＣＨであり、−−−−は、二重結合であり、
Ｒ₁は、Ｈ、Ｆ、またはＯＨであり、
Ｒ₃およびＲ₄は、独立して、Ｈ、メチル、エチル、プロピル、アリル、イミダゾリニルメチル、であるか、または
Ｒ₃およびＲ₄は、それらが結合される窒素原子と一緒に、ピペリジノ、ピロリジノ、アゼチジノ、またはアジリジノ環を形成し、
Ｒ₇は、Ｈまたはメチルであり、
Ｒ₈は、Ｈ、メチル、ヒドロキシル、またはアセチルであり、
Ｒ₉は、Ｈまたはメチルである。式ＶＩＩＩの化合物は、ＭＡＯ基質として有用であり得る。

さらに他の誘導体は、式ＩＸの化合物を含み、
式中、Ｒ¹は、Ｈ、ＯＲ、ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−ベンジル、またはＮＨ−Ｏ−イソ−ブチルであり、Ｒは、低級アルキル、ベンジル、２，４，６−トリメチルベンジル、フェニルピペラジノベンジル、ｏ−トリフルオロメチルベンジル、または３−ピコリニルである。そのような誘導体は、Ｐ４５０基質として有用であり得る。

式Ｘの化合物も提供され、
式中、
Ｙは、Ｎ、Ｎ−酸化物、Ｎ−低級アルキル、またはＣＨであり、
Ｘは、Ｓ、ＣＨ＝ＣＨ、またはＮ＝Ｃであり、
ＺおよびＺ′は、独立して、Ｈ、ＯＲ、ＮＨＲ、またはＮＲＲであり、
Ｗ¹は、Ｈ、ハロ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_2-20アルケニル、ヒドロキシル、またはＣ_1-6アルコキシであるか、または
Ｗ¹およびＺは、いずれも環Ａ上のケト基であり、環Ａ内の点線は不在であり、
Ｋ¹、Ｋ²、Ｋ³、およびＫ⁴のそれぞれは、独立してＣＨ、Ｎ、Ｎ−酸化物、またはＮ−低級アルキルであって、Ｋ¹とＫ²、およびＫ³とＫ⁴との間の点線は、随意の二重結合を示し、
Ｒは、Ｈ、アミノ、Ｃ_1-20アルキル、Ｃ_2-20アルケニル、ハロゲン化Ｃ_2-20アルケニル、Ｃ_3-20アルキニル、Ｃ_2-20アルケニルＣ_1-20アルキル、Ｃ_3-20アルキニルＣ_2-20アルケニル、Ｃ_3-20シクロアルキル、Ｃ_6-30アリール、ヘテロアリール、Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルキル、Ｃ_1-20アルキルスルホキシ、Ｃ_6-30アリールスルホキシ、Ｃ_6-30アリールスルホキシＣ_1-20アルキル、Ｃ_1-20アルコキシカルボニル、Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルコキシカルボニル、Ｃ_6-30アリールチオＣ_1-20アルキル、ヒドロキシＣ_1-20アルキル、トリＣ_1-20アンモニウムＣ_1-20アルキル、ヘテロアリール−スルホキシ、ヘテロアリールＣ_1-20アルキル、第四級窒素を有するヘテロアリール、第四級窒素を有するヘテロアリールカルボニル、Ｎ−メチル−テトラヒドロピリジニルであり、
Ｒの任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アリール、またはヘテロアリール基は、１つまたは複数、例えば、１、２、３、４、または５個のＣ_1-20アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アセチル、−ＣＯＯＲ¹、−ＳＯ₃Ｒ¹、アミノ、ニトロ、低級アルキルアミノ、低級アルキニルアミノ、イミダゾリニルメチルアミノ、ジ−低級アルキルアミノ、ジ−低級アルキニルアミノ、ピペリジノ、ピロリジノ、アゼチジノ、アジリジノ、ジ−イミダゾリニル−メチル−アミノ、メルカプト、Ｃ_1-20アルキルチオ、Ｃ_6-30アリールチオ、トリフルオロメチル、Ｃ_1-20アルキルカルボキシル、Ｃ_6-30アリール、置換Ｃ_6-30アリール、Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルコキシル、複素環Ｃ_1-20アルキル、置換Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルコキシル、Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルキルカルボニル、置換Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルキルカルボニル、または追加の非置換Ｒ基によって随意に置換することができ、各Ｒ基は、複数個存在する場合は、独立して定義され、
複素環Ｃ_1-20アルキルは、１つまたは複数、例えば、１、２、３、４、または５個のＲ基で随意に置換され、
Ｒ¹は、水素またはＣ_1-6アルキルであり、
およびここで、
Ｚがアミノであるとき、水素の一方または両方は、Ｃ_1-20アルキルまたはＬ基によって置換されてもよく、
Ｌは、アミノ酸ラジカル、最大２０個のアミノ酸部分を有するペプチドラジカル、または非ルシフェラーゼのための基質である、任意の他の小分子であり、
およびここで、
Ｚがヒドロキシルまたはアミノであるとき、ヒドロキシルまたはアミノのＨは、（ＨＯ）₂Ｐ（Ｏ）−ＯＣＨ₂−、スルホ、−ＰＯ₃Ｈ₂によって、または１つもしくは複数の炭素原子の炭素鎖を介して、Ｚ基に結合されたセファロスポラン酸によって置換されてもよく、
ＺまたはＺ′がヒドロキシルまたはアミノであるとき、ヒドロキシルまたはアミノの１つのＨは、Ｌ′基リンカーによって置換されてもよく、Ｌ′は、リンカーを解放するために酵素によって除去可能な基であり、リンカーは、最適に自己開裂し得る炭素鎖であって、１つまたは複数の窒素原子、酸素原子、カルボニル基、（置換された）芳香族環、またはペプチド結合で随意に中断され、
リンカーは、そのリンカーの一端において、酸素原子またはＮＨ基を介してＬ′に結合され、そのリンカーの他端は、Ｚ、Ｚ′、またはＺ″−Ｒ基とのエーテル、エステル、またはアミド結合を形成し、
ＺがＯＲであるとき、式Ｘは、随意にＣＨ₂またはＣＨ₂−Ｃ₆Ｈ₄−ＣＨ₂橋を介して２つのＡ環において接続された二量体であることができ、式Ｘの二量体を接続する各Ｚ基のＲ基は、橋によって置換され、
ここで、
Ａ′およびＢ′は、環Ａに融合された随意の芳香族環であり、縮合三環系を形成するように、その１つのみが一度に存在してもよく、
Ｂ′が存在するときはＺ基が存在し、
Ａ′が存在するときはＺ基が不在であり、
ここで、
環Ａの１つの炭素は、Ｎ−酸化物部分によって置換されてもよく、
環Ｂ内の点線は、随意の二重結合であり、
ＸがＮ＝Ｃである場合、環Ｃは、Ｎ＝Ｃ部分の炭素原子において随意に結合されることができ、Ａ^-は、第四級窒素が存在するときに存在するアニオンであるか、またはその塩である。

式ＸＩの化合物がさらに提供され、
式中、
Ｙは、Ｎ−酸化物、Ｎ−低級アルキル、またはＣＨであり、
Ｘは、Ｓ、もしくはＣＨ＝ＣＨであるか、または
ＹはＮであり、ＸはＮ＝ＣまたはＣＨ＝ＣＨであり、
ＺおよびＺ′は、Ｈ、ＯＲ、ＮＨＲ、もしくはＮＲＲであるか、または
Ｚは、ホウ素原子を介して環Ａに結合された環化ジエーテル化ジヒドロキシボラン基であり、
Ｗ¹は、Ｈ、ハロ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_2-20アルケニル、ヒドロキシル、またはＣ_1-6アルコキシであり、
Ｋ¹、Ｋ²、Ｋ³、およびＫ⁴のそれぞれは、独立してＣＨ、Ｎ、Ｎ−酸化物、またはＮ−低級アルキルであって、Ｋ¹とＫ²、およびＫ³とＫ⁴との間の点線は、随意の二重結合を示し、
Ｒは、Ｈ、Ｃ_1-20アルキル、Ｃ_2-20アルケニル、ハロゲン化Ｃ_2-20アルケニル、Ｃ_3-20アルキニル、Ｃ_2-20アルケニルＣ_1-20アルキル、Ｃ_3-20アルキニルＣ_2-20アルケニル、Ｃ_3-20シクロアルキル、Ｃ_6-30アリール、ヘテロアリール、Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルキル、Ｃ_1-20アルキルスルホキシ、Ｃ_6-30アリールスルホキシ、Ｃ_6-30アリールスルホキシＣ_1-20アルキル、Ｃ_1-20アルキルヒドロキシＣ_1-20アルキル、Ｃ_1-20アルコキシカルボニル、Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルコキシカルボニル、Ｃ_6-30アリールチオＣ_1-20アルキル、ヒドロキシＣ_1-20アルキル、トリＣ_1-20アンモニウムＣ_1-20アルキル、ヘテロアリール−スルホキシ、ヘテロアリールＣ_1-20アルキル、第四級窒素を有するヘテロアリール、第四級窒素を有するヘテロアリールカルボニル、Ｎ−メチル−テトラヒドロピリジニルであり、
Ｒのアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、およびヘテロアリール基は、１つまたは複数、例えば、１、２、３、４、または５個のＣ_1-20アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アセチル、−ＣＯＯＲ¹、−ＳＯ₃Ｒ¹、アミノ、ニトロ、低級アルキルアミノ、低級アルキニルアミノ、イミダゾリニルメチルアミノ、ジ−低級アルキルアミノ、ジ−低級アルキニルアミノ、ピペリジノ、ピロリジノ、アゼチジノ、アジリジノ、ジ−イミダゾリニル−メチル−アミノ、メルカプト、Ｃ_1-20アルキルチオ、Ｃ_6-30アリールチオ、トリフルオロメチル、置換Ｃ_6-30アリール、Ｃ_1-20アルキルカルボキシル、置換Ｃ_6-30アリール、置換Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルコキシル、置換Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルキルカルボニル、または追加の非置換Ｒ基によって随意に置換することができ、各Ｒ基は、複数個存在する場合は、独立して定義され、
Ｒ¹は、水素またはＣ_1-6アルキルであり、
およびここで、
Ｚがアミノであるとき、アミノ基の水素の一方または両方は、Ｃ_1-20アルキルまたはＬ基によって置換されてもよく、
Ｌは、アミノ酸ラジカル、最大２０個のアミノ酸部分を有するペプチドラジカルであり得るか、または非ルシフェラーゼのための基質である、任意の他の小分子であり、
およびここで、
ＺまたはＺ′がヒドロキシルまたはアミノであるとき、ヒドロキシルまたはアミノのＨは、（ＨＯ）₂Ｐ（Ｏ）−ＯＣＨ₂−、スルホ、−ＰＯ₃Ｈ₂によって、または１つもしくは複数の炭素原子の炭素鎖を介して、Ｚ基に結合されたセファロスポラン酸によって置換されてもよく、
Ｚがヒドロキシルまたはアミノであるとき、ヒドロキシルまたはアミノの１つのＨは、Ｌ′基リンカーによって置換されてもよく、Ｌ′は、リンカーを解放するための酵素によって除去可能な基であり、リンカーは、自己開裂し得る炭素鎖であって、１つまたは複数の窒素原子、酸素原子、カルボニル基、（置換された）芳香族環、またはペプチド結合で随意に中断され、
リンカーは、そのリンカーの一端において、酸素原子またはＮＨ基を介してＬ′に結合され、そのリンカーの他端は、Ｚ、またはＺ−Ｒ基とのエーテル、エステル、またはアミド結合を形成し、
Ｚがヒドロキシルであるとき、式ＸＩは、ＯＣＨ₂Ｏ橋を介して２つのＡ環において接続された二量体を含み、
ここで、
Ａ′およびＢ′は、環Ａに融合された随意の芳香族環であり、縮合三環系を形成するように、その１つのみが一度に存在してもよく、
Ｂ′が存在するときはＺ基が存在し、
Ａ′が存在するときはＺ基が不在であり、
ここで、
環Ｂ内の点線は、随意の二重結合であり、
ＸがＮ＝Ｃである場合、環Ｃは、Ｎ＝Ｃ部分の炭素原子において随意に結合されることができ、
Ａ^-は、第四級窒素が存在するときに存在するアニオンであるか、またはその塩である。

式ＸＩＩの化合物も提供され、
式中、
Ｙは、Ｎ、Ｎ−酸化物、Ｎ−低級アルキル、またはＣＨであり、
Ｘは、Ｓ、ＣＨ＝ＣＨ、またはＮ＝Ｃであり、
ＺおよびＺ′は、独立して、Ｈ、ＯＲ、ＮＨＲ、もしくはＮＲＲであり、
Ｗ¹は、Ｈ、ハロ、Ｃ_1-6アルキル、Ｃ_2-20アルケニル、ヒドロキシル、またはＣ_1-6アルコキシであるか、または
Ｗ¹およびＺは、いずれも環Ａ上のケト基であり、環Ａ内の点線は不在であり、
Ｋ¹、Ｋ²、Ｋ³、およびＫ⁴のそれぞれは、独立してＣＨ、Ｎ、Ｎ−酸化物、またはＮ−低級アルキルであって、Ｋ¹とＫ²、およびＫ³とＫ⁴との間の点線は、随意の二重結合を示し、
Ｒは、Ｈ、Ｃ_1-20アルキル、Ｃ_2-20アルケニル、ハロゲン化Ｃ_2-20アルケニル、Ｃ_3-20アルキニル、Ｃ_2-20アルケニルＣ_1-20アルキル、Ｃ_3-20アルキニルＣ_2-20アルケニル、Ｃ_3-20シクロアルキル、Ｃ_6-30アリール、ヘテロアリール、複素環、置換複素環、Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルキル、Ｃ_1-20アルキルスルホキシ、Ｃ_6-30アリールスルホキシ、Ｃ_6-30アリールスルホキシＣ_1-20アルキル、Ｃ_1-20アルキルスルホキシＣ_1-20アルキル、Ｃ_1-20アルコキシカルボニル、Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルコキシカルボニル、Ｃ_6-30アリールチオＣ_1-20アルキル、ヒドロキシＣ_1-20アルキル、トリＣ_1-20アンモニウムＣ_1-20アルキル、ヘテロアリール−スルホキシ、ヘテロアリールＣ_1-20アルキル、第四級窒素を有するヘテロアリール、第四級窒素を有するヘテロアリールカルボニル、Ｎ−メチル−テトラヒドロピリジニルであり、
Ｒのアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アリール、およびヘテロアリール基は、１つまたは複数、例えば、１、２、３、４、または５個のＣ_1-20アルキル、ハロ、ヒドロキシル、アセチル、−ＣＯＯＲ¹、−ＳＯ₃Ｒ¹、アミノ、ニトロ、低級アルキルアミノ、低級アルキニルアミノ、イミダゾリニルメチルアミノ、ジ−低級アルキルアミノ、ジ−低級アルキニルアミノ、ピペリジノ、ピロリジノ、アゼチジノ、アジリジノ、ジ−イミダゾリニル−メチル−アミノ、メルカプト、Ｃ_1-20アルキルチオ、Ｃ_6-30アリールチオ、トリフルオロメチル、Ｃ_1-20アルキルカルボキシル、Ｃ_6-30アリール、置換Ｃ_6-30アリール、Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルコキシル、置換Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルコキシル、Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルキルカルボニル、置換Ｃ_6-30アリールＣ_1-20アルキルカルボニル、または追加の非置換Ｒ基によって随意に置換することができ、各Ｒ基は、複数個存在する場合は、独立して定義され、
置換アリール基は、１つで置換されるか、またはＲのアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、複素環、置換複素環、およびヘテロアリール基は、１つまたは複数のＣ_1-20アルキル、Ｃ_6-30アリール、ハロ、ヒドロキシル、アセチル、−ＣＯＯＲ¹、アミノ、ニトロ、低級アルキルアミノ、低級アルキニルアミノ、イミダゾリニルメチルアミノ、ジ−低級アルキルアミノ、ジ−低級アルキニルアミノ、ピペリジノ、ピロリジノ、アゼチジノ、アジリジノ、ジ−イミダゾリニル−メチル−アミノ、メルカプト、Ｃ_1-20アルキルチオ、Ｃ_6-30アリールチオ、またはトリフルオロメチル基で随意に置換することができ、
Ｒ¹は、水素またはＣ_1-6アルキルであり、
およびここで、
Ｚがアミノであるとき、アミノ基の一方または両方の水素は、Ｃ_1-20アルキル、またはＬ基によって置換されてもよく、
Ｌは、アミノ酸ラジカル、最大２０個のアミノ酸部分を有するペプチドラジカル、または非ルシフェラーゼのための基質である、任意の他の小分子であり、
およびここで、
Ｚがヒドロキシルまたはアミノであるとき、Ｈは、（ＨＯ）₂Ｐ（Ｏ）−ＯＣＨ₂−、スルホ、もしくは−ＰＯ₃Ｈ₂によって、または１つもしくは複数の炭素原子の炭素鎖を介して、Ｚ基に結合されたセファロスポラン酸によって置換されてもよく、環Ｂがチアゾール環であるとき、スルホまたは−ＰＯ₃Ｈ₂基は、低級アルキレン鎖を介してヒドロキシル酸素に結合されることを前提とし、
ＺまたはＺ′がヒドロキシルまたはアミノであるとき、１つのＨは、Ｌ′基リンカーによって置換されてもよく、Ｌ′は、リンカーを解放するために酵素によって除去可能な基であり、リンカーは、最適に自己開裂し得る炭素鎖であって、１つまたは複数の窒素原子、酸素原子、カルボニル基、（置換された）芳香族環、またはペプチド結合で随意に中断され、
リンカーは、そのリンカーの一端において、酸素原子またはＮＨ基を介してＬ′に結合され、そのリンカーの他端は、Ｚ、またはＺ′−Ｒ基とのエーテル、エステル、またはアミド結合を形成し、
Ｚがヒドロキシルであるとき、式ＸＩＩは、−ＯＣＨ₂Ｏ−橋を介して２つのＡ環において接続された二量体を含み、
ここで、
Ａ′およびＢ′は、環Ａに融合された随意の芳香族環であり、縮合三環系を形成するように、その１つのみが一度に存在してもよく、
Ｂ′が存在するときはＺ基が存在し、
Ａ′が存在するときはＺ基が不在であり、
ここで、環Ｂ内の点線は、随意の二重結合であり、
ＸがＮ＝Ｃである場合、環Ｃは、Ｎ＝Ｃ部分の炭素原子において随意に結合されることができ、Ａ^-は、第四級窒素が存在するときに存在するアニオンであるか、またはその塩である。

式ＸＶの化合物も提供され、
式中、
Ｚは、水素または保護基であり、
Ｌは、本明細書で以下に記載されるリンカー、例えば、アミノ酸または２〜１０個のアミノ酸の鎖であり、
Ｔは、ＯまたはＮＨであり、
Ｘは、水素またはフッ素であるが、Ｘ＝Ｈであるとき、アミノ酸の少なくとも１つがＲ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、またはＹであることを前提とする。

様々な態様では、Ｚは、ヘテロ原子のための保護基、例えば、窒素または酸素保護基であることができる。保護基の例は上で考察される。ある特定の態様では、保護基は、Ｃｂｚ、Ｂｏｃ、アセチル、またはスクシニル基であることができる。

ある態様では、式ＸＶの化合物は、以下の化合物であり得る：
。

上記式の化合物の他の例としては、以下の構造が挙げられる。
これらの化合物のアルキルまたはアリール基は、上述のとおり、および／または、例えば、「置換された」という用語の定義において記載されるように、１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、または６個）の置換基で追加または代替として置換することができる。

ＣＹＰ４５０の場合、有用な基質としては、これらに限定されないが、３０１９、３０１６、３０２６、３８１４、および３８２０が挙げられる。ＵＧＴの場合、有用な基質としては、これらに限定されないが、３１３８（市販）および３１６５が挙げられる。

リンカー
Ａ環修飾２−アミノ−６−ヒドロキシ−ベンゾチアゾールにリンカー戦略を用いて、デアセチラーゼ、デホルミラーゼ、デメチラーゼ等の関心対象の酵素、またはリンカーを解放するために式ＩのＬ基（その酵素のための基質）を除去することができる他の酵素のための基質を誘発して、残りのリンカーが非酵素反応によって随意に除去されてもよい、ルシフェラーゼのＤ−システイン基質の存在下で、生成物を産生する。

リンカーは、（Ｃ₁−Ｃ₆）アルキルまたは（Ｃ₁−Ｃ₆）アルコキシ基等のアルキルまたはアルコキシ鎖であることができる。鎖は、アルデヒド、アセチル、スルホキシド、スルホン、ニトロ、シアノ基、またはそれらの組み合わせ等の１つまたは複数の電子求引基置換基Ｒを有することができる。他のリンカーは、トリメチルロック、キニーネメチド、およびジケトピペラジンリンカー、およびそれらの誘導体を含む。トリメチルロックリンカーは、以下のように図示することができ、
式中、Ｒは、本明細書に記載されるローマ数字式、例えば、式Ｉ〜ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ〜ＩＸ、ＸＩ〜ＩＸ、ＸＩ〜ＸＩＩ、およびＸＶのいずれか１つについて定義されるとおりであり、アッセイされる酵素等の酵素によって除去可能な基であり、トリメチルロックリンカーは、Ｚ基またはＺ′−Ｒ基の１つの水素原子を置換し、「脱離基」は、式Ｉ〜ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ〜ＩＸ、ＸＩ〜ＸＩＩ、およびＸＶの構造の残りである。トリメチルロックリンカーの使用については、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，６２：１３６３（１９９７）およびＣｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２７：１６５２（２００５）を参照されたい。

キニーネメチドリンカーは、以下のように図示することができ、
式中、Ｒは、式Ｉ〜ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ〜ＩＸ、ＸＩ〜ＸＩＩ、およびＸＶのいずれか１つについて定義されるとおりであり、アッセイされている酵素等の酵素によって除去可能な基であり、キニーネメチドリンカーは、Ｚ基またはＺ′−Ｒ基の１つの水素原子を置換し、「脱離基」は、式Ｉ〜ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ〜ＩＸ、ＸＩ〜ＸＩＩ、およびＸＶの構造の残りである。キニーネメチドリンカーの使用については、Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，４２：３６５７（１９９９）およびＧｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．，１４：３９５（２００３）を参照されたい。

ジケトピペラジンリンカーは、以下のように図示することができ、
式中、Ｒは、式Ｉ〜ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ〜ＩＸ、ＸＩ〜ＸＩＩ、およびＸＶのいずれか１つについて定義されるとおりであり、アッセイされている酵素等の酵素によって除去可能な基であり、ジケトピペラジンリンカーの各Ｒ′は、独立して、Ｈ、またはＯ、Ｓ、もしくはＮＨによって随意に中断されたアルキル鎖、好ましくはメチル基であり、ジケトピペラジンリンカーは、Ｚ基またはＺ′−Ｒ基の１つの水素原子を置換し、「脱離基」は、式Ｉ〜ＩＩＩ、Ｖ、ＶＩＩ〜ＩＸ、ＸＩ〜ＸＩＩ、およびＸＶの構造の残りである。ジケトピペラジンリンカーの使用については、Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１０：１０７３（２０００）を参照されたい。

誘導体を含有する他のリンカーとしては、以下が挙げられる。

一般的な合成方法
式Ｉ〜ＸＶの化合物の調製物は、対応する２−ハロベンゾチアゾールから調製することができるか、有機合成の分野において既知の技術に従って調製されてもよい。多くの２，６−二置換ベンゾチアゾールは、商業的に入手可能であり、および／または当該技術分野において記載のとおり調製することができる。本明細書に記載の化合物を調製するために使用してもよい一般的な合成方法に関する情報は、Ｇｒｅｇ Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９６）、Ｍａｒｃｈ′ｓ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，５ｔｈ Ｅｄ．ｂｙ Ｍｉｃｈａｅｌ Ｂ．Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｅｒｒｙ Ｍａｒｃｈ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、およびＷｕｔｓ ｅｔ ａｌ．（１９９９），Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｇｒｏｕｐｓ ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓにおいて見出すことができる。合成は、Ｗｈｉｔｅ ｅｔ ａｌ．１９６３．Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃｉｅｔｙ ８５：３３７−４３およびＢｅｎｅｔｅａｕ ｅｔ ａｌ．１９９７．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ ２７（１３）：２２７５−２２８０に記載されるとおり行われてもよく、いずれも参照することによって本明細書に組み込まれる。

本発明の化合物を調製する方法は、ある例において、異性体を生成し得る。本発明の方法は、常にこれらの異性体の分離を必要とするわけではないが、そのような分離は、必要に応じて、当該技術分野において知られる方法によって達成されてよい。例えば、調製高性能液体クロマトグラフ法を、例えば、キラルパックを有するカラムを使用することによって、異性体精製に使用することができる。

以下の実施例は、上記発明を説明することを意図し、その範囲を狭めるものとして解釈されてはならない。当業者であれば、実施例が、本発明を実践することができる多くの他の方法を提案していることを容易に認識するであろう。本発明の範囲内で維持しながら、多くの変型および修正を行ってもよいことを理解されたい。

実施例
実施例１〜７の概略紹介
本発明は、ウリジン５′−ジホスホ−グルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼまたはＵＧＴ）族酵素のインビトロでの活性を決定する方法を含む。つまり、過剰発現した昆虫ミクロソーム（Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（登録商標）、ＢＤ Ｇｅｎｔｅｓｔ（登録商標）または動物組織ミクロソーム（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ、ＢＤ Ｇｅｎｔｅｓｔ（登録商標）からのＵＧＴ酵素を、本発明のシアノベンゾチアゾール基質および補因子ＵＤＰ−グルクロン酸（ＵＤＰＧＡ）とともに、ＭｇＣｌ₂およびアラメチシン（通常、５０ｍＭ ＴＥＳ、ｐＨ７．５、８ｍＭ ＭｇＣｌ₂、４ｍＭ ＵＤＰＧＡ（Ｓｉｇｍａ）、および２５μｇ／Ｌアラメチシン（Ｓｉｇｍａ））を含有する生理学的ｐＨの緩衝液中、３７℃でインキュベートした。ＵＧＴ酵素反応に続いて、１５〜３０ｍＭ Ｄ−システイン−ＨＣｌ Ｈ₂Ｏ（Ｓｉｇｍａ）を含有する等量のＰ４５０−Ｇｌｏルシフェリン検出試薬（ＬＤＲ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、プレートを混合して、室温で、典型的には２０〜３０分インキュベートした。Ｐ４５０−Ｇｌｏルシフェリン検出試薬は、組み換えホタルルシフェラーゼ、ＡＴＰ、およびＭｇ²⁺を含む、ルシフェラーゼ反応混合物を含有する。これは、Ｐｒｏｍｅｇａルシフェリン検出試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐａｒｔ＃Ｖ８５９Ｂ）のバイアルを、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐ４５０−Ｇｌｏ緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐａｒｔ＃Ｖ８６５Ｂ）のバイアルとともに溶解することによって、調製することができる。

このインキュベーション中に、システインは、シアノベンゾチアゾール基質と反応して、Ｄ−ルシフェリン誘導体を産生する。未修飾基質から形成されたルシフェリン誘導体の存在は、Ｐ４５０−Ｇｌｏ ＬＤＲの存在下で光出力をもたらすが、ＵＧＴによってグルクロン酸化された任意の基質は、光出力を開始しない。したがって、ＵＧＴ酵素の活性は、ＵＤＰＧＡ補因子を添加しない同一条件下で実行された試料と比較して、グルクロン酸化が発生した試料の相対光単位（ＲＬＵ）の差（より低いか、または出力がない）を分析することによって測定することができる。

実施例１．化合物３１３８、３４７８、および３１６５によるＵＤＰグルクロノシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）活性の検出
この例では、昆虫ミクロソーム（Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（登録商標）、ＢＤ Ｇｅｎｔｅｓｔ（登録商標））中で発現した一連の１２組み換えＵＧＴ、ならびにＵＧＴ酵素を発現しない対照ミクロソームを、ＵＤＰＧＡ補因子とともに、またはそれを含まずに、化合物３１３８、化合物３４７８、または化合物３１６５を基質として用いてインキュベートした。
Ｄ−システインを含有するルシフェリン検出試薬（ＬＤＲ）の添加後、基質および生成物の両方をＤ−ルシフェリンに変換した（化合物３４７８は、ＬＤＲの添加前に既にルシフェリン誘導体である）。図３に示されるように、例として化合物３１３８を使用する、非グルクロン酸化基質のみが光を生成し、酵素によってグルクロン酸化された任意の基質は、光を生成せず、その結果、その試料のための相対光単位（ＲＬＵ）の低下をもたらす。

反応液は、白色９６ウェルプレート中で組み立てた。各ウェルは、１００ｍＭ ＴＥＳ、ｐＨ７．５、１６ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０μｇ／ｍＬアラメチシン（Ｓｉｇｍａ）、６０μＭ化合物３１３８または化合物３４７８、および０．４ｍｇ／ｍＬの対照または組み換えＵＧＴ膜で構成された２０μＬの反応混合液を含有した。２０μＬの水または８ｍＭトリアンモニウムＵＤＰＧＡ（Ｓｉｇｍａ）を各ウェルに添加することによって反応を開始した。プレートを混合し、密閉して、３７℃の水浴中で２時間インキュベートした。インキュベーション後、４０μＬ Ｐ４５０−ＧｌｏＬＤＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、２０ｍＭ Ｄ−システイン−ＨＣｌ Ｈ₂Ｏ（Ｓｉｇｍａ）とともに各ウェルに添加し、プレートを混合して、室温で２０分間インキュベートさせた。インキュベーションが完了した後、プレートをＶｅｒｉｔａｓ（登録商標）照度計（Ｔｕｒｎｅｒ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サニーベール）上で読み取った。

各アイソザイムについて、ＵＤＰＧＡを含有する複製からの生物発光を、ＵＤＰＧＡを含まない複製の平均生物発光から減じた。平均ΔＲＬＵ値が得られ、次に複製の標準偏差を、ＵＤＰＧＡを含まない試料の平均生物発光で割ることによって、各アイソザイムについて利用率％を得た。次に、対照ミクロソームから得られた利用率％を、各アイソザイムから減じて、それらのアイソザイムについての背景訂正利用データを得た。

これらの１２個のアイソザイムに関する活性データが、図４および５に示される。主要なＵＧＴアイソザイム１Ａ１、１Ａ８、１Ａ９、１Ａ１０、および２Ｂ７は、すべて２時間のインキュベーション中に化合物３１３８の５０％超を利用した。これらの同一のアイソザイムは、化合物３４７８、化合物３１３８のルシフェリン類似体の１５％以下を利用し、これらの酵素を測定するために、前ルシフェリンを使用する必要性を示す。ＵＧＴ１Ａ３、１Ａ６、１Ａ７、２Ｂ１５、および２Ｂ１７の場合、化合物３１３８の利用は少ないが、依然として、背景を超える検出可能なレベルの利用が存在した。これらの酵素による化合物３１３８の利用は、反応時間、ミクロソーム酵素の濃度、および／または化合物３１３８の濃度を調節することによってさらに最適化することができる。アイソザイムおよびＰＢＩ３４３８を有するこの第２のセットの場合、ＵＧＴ１Ａ６のみが、任意の適切な程度で化合物３４７８を利用することができる。ＵＧＴ１Ａ４および２Ｂ４は、基質として、適切な程度で化合物３１３８または３４７８を利用しなかった。化合物３１６５は、ＵＧＴ１Ａ４によってのみ利用され、より少ない程度にＵＧＴ１Ａ９によって利用された（図５）。

実施例２．哺乳類ミクロソームによる化合物３１３８および３１６５の利用
内因性に発現されたＵＧＴアイソザイムが化合物３１３８および３１６５を基質として利用する能力を、組み換えミクロソームを用いるアッセイ（実施例１）と同様の方法で決定した。化合物３１３８と共に、５０ｍＭ ＴＥＳ、ｐＨ７．５、８ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２５μｇ／ｍＬアラメチシン、０．１ｍｇ／ｍＬ哺乳類ミクロソーム、または０．２ｍｇ／ｍＬ組み換えＳｕｐｅｒｓｏｍｅｓ、および５０μＭ化合物３１３８中、おびよ４ｍＭ ＵＤＰＧＡを含むか含まずに、３７℃で１５分間、反応液をインキュベートした（それぞれ試験反応液および対照）。化合物３１６５と共に、５０ｍＭ ＴＥＳ、ｐＨ７．５、８ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２５μｇ／ｍＬアラメチシン、０．２ｍｇ／ｍＬ哺乳類ミクロソーム、または組み換えＳｕｐｅｒｓｏｍｅｓ、および５０μＭ化合物３１６５中、おびよ４ｍＭ ＵＤＰＧＡを含むか含まずに、３７℃で２時間、反応液をインキュベートした（それぞれ試験反応液および対照）。組織ミクロソームは、Ｘｅｎｏｔｅｃｈ ＬＬＣまたはＢＤ Ｇｅｎｔｅｓｔから得られた。Ｐ４５０−Ｇｌｏ ＬＤＲ＋システインの添加およびデータ分析は、組み換えＳｕｐｅｒｓｏｍｅｓパネルスクリーンの場合と同一の方法で行った（上記実施例１）。

化合物３１３８の利用は、異なる組織ミクロソームと動物ミクロソームとの間の差異を見るために、反応を１５分に短縮する必要があるほど急速であった。試験したすべての組織ミクロソームは、対照１Ａ１ Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓよりもはるかに多くの化合物３１３８を利用した（図６）。結果は予想外ではなかった。なぜなら、Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ中のＵＧＴ１Ａ１の濃度は、そのタンパク質を過剰発現する細胞から生じたものであるが、組織ミクロソーム試料中の化合物３１３８を利用することができる、すべてのアイソザイムの相加濃度よりも高い可能性は低いからである。さらに、最近の報告は、ＵＧＴアイソザイムは、単一膜内で一緒に発現した場合、相加活性以上を有し得ることを示す。

化合物３１６５の利用は、はるかに遅く、主に１つのアイソザイムによるその使用と一致する（ＵＧＴ １Ａ４、またはラットもしくはマウスからの同様の活性）（図７）。したがって、反応液を２時間インキュベートした。活性は、ヒト腎臓またはヒト腸ミクロソームのいずれよりもヒト肝ミクロソームの場合にはるかに高く、ＵＧＴ １Ａ４の発現が、超過肝組織中よりも肝臓において高いという報告と一致する。また活性は、ラットおよびマウス肝ミクロソームの両方について見られた。

実施例３．化合物３１３８および３１６５を用いるリトナビルによる組み換えＵＧＴアイソザイムの阻害の測定
ＨＩＶプロテアーゼ阻害因子であるリトナビルが、ＵＧＴ１Ａ１および１Ａ４を阻害するが、ＵＧＴ２Ｂ７に対してほとんど影響しないことは、文献で報告されている。現在のシステムにおいてこの観察を試験するために、化合物３１３８を使用して、ＵＧＴ１Ａ１および２Ｂ７ Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ中のＵＧＴ１Ａ１および２Ｂ７を検出し、化合物３１６５を使用して、ＵＧＴ１Ａ４ Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅ中のＵＧＴ１Ａ４を検出した。化合物３１３８との反応は、５０ｍＭ ＴＥＳ、ｐＨ７．５、８ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２５μｇ／ｍＬアラメチシン、０．２ｍｇ／ｍＬ Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ、５０μＭ化合物３１３８、および０〜１６２μＭリトナビル（ＡＫ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、おびよ５ｍＭ ＵＤＰＧＡを含むか含まずに行った。３７℃で２時間後、２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０中に希釈された１０μＬの５０ｍＭ Ｄ−システイン−ＨＣｌ・Ｈ₂Ｏを、各４０μＬ ＵＧＴ反応に添加した。１０分のインキュベーション後、５０μＬ Ｐ４５０−Ｇｌｏ ＬＤＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し、生物発光を測定した。化合物３１６５との反応は、約４０μＭのリトナビル濃度で、７０分間、３７℃でのみインキュベートされたことを除いて、反応液は、２５μＭ３１６５を使用して、同様の方法でインキュベートした。

化合物３１３８および３１６５による結果は、それぞれ図８および９に示される。リトナビルは、ＵＧＴ１Ａ１およびＵＧＴ１Ａ４を阻害するが、ＵＧＴ２Ｂ７は阻害せず、これは文献と一致する。測定値は、ＵＧＴ１Ａ１の場合、６０μＭ、およびＵＧＴ１Ａ４の場合、４μＭのＩＣ₅₀値を示した。この結果は、アッセイシステムが、組み換えＳｕｐｅｒｓｏｍｅｓを使用する、特定ＵＧＴアイソザイムの阻害因子を識別する能力を示す。

実施例４．ジクロフェナクを用いるヒト肝ミクロソームにおける組み換えＵＧＴアイソザイムおよびＵＧＴ活性の阻害
ジクロフェナクは、ＵＧＴ酵素の多くのための既知の基質である、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）であり、ＵＧＴ１Ａ１、１Ａ３、１Ａ６、１Ａ７、１Ａ８、１Ａ９、１Ａ１０、２Ｂ７、２Ｂ１５、および２Ｂ１７を阻害することも報告されている。大部分のＵＧＴアイソザイムに対するその広範な阻害活性は、組み換えＵＧＴ調製物およびヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）の両方において、ＵＧＴ活性の阻害を調査するための理想的な候補にする。

ジクロフェナクが組み換えＵＧＴを阻害する能力を評価するために、ＵＧＴ１Ａ１および２Ｂ７ Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓを使用して反応液を設定した。これらの反応液は、５０ｍＭ ＴＥＳ、ｐＨ７．５、８ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２５μｇ／ｍＬアラメチシン、０．１ｍｇ／ｍＬ Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（登録商標）および２０μＭ化合物３１３８を含有し、４ｍＭ ＵＤＰＧＡを含むか含まなかった。０〜１０ｍＭジクロフェナクの濃度で滴定を行った。３７℃で９０分後、４０μＬのＰ４５０−Ｇｌｏ ＬＤＲ＋２０ｍＭ Ｄ−システインを、各４０μＬ反応液に添加し、混合した。室温で２０分後、生物発光を照度計上で測定した。

ジクロフェナクがＨＬＭ中のＵＧＴ活性を阻害する能力を評価するために、反応液を以下のように設定した。すべての反応液は、５０ｍＭ ＴＥＳ、ｐＨ７．５、８ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２５μｇ／ｍＬアラメチシン、０．１ｍｇ／ｍＬ ＨＬＭを含有し、４ｍＭ ＵＤＰＧＡを含むか含まなかった。０〜３．６ｍＭジクロフェナクの濃度で滴定を行った。３７℃で１５分後、４０μＬのＰ４５０−Ｇｌｏ ＬＤＲ＋２０ｍＭ Ｄ−システインを、各４０μＬ反応液に添加し、混合した。室温で２０分後、生物発光を照度計上で測定した。

滴定曲線を、図１０（組み換えＳｕｐｅｒｓｏｍｅｓ）および１１（ＨＬＭ）に示される。ジクロフェナクは、ＩＣ₅₀が２３２μＭでＵＧＴ１Ａ１活性を阻害し、ＩＣ₅₀が７４μＭでＵＧＴ２Ｂ７活性を阻害した。これは、４−メチル−ウンベリフェロンを基質として使用するとき、ＵＧＴ２Ｂ７が、ＵＧＴ１Ａ１よりもジクロフェナクによって潜在的に多く阻害されるという文献の報告と一致する（Ｕｃｈａｉｐｉｃｈａｔ ｅｔ ａｌ．Ｄｒｕｇ Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐ．（２００４）．３２：４，４１３−４２３を参照）。ジクロフェナクは、ＩＣ₅₀が６０μＭで化合物３１３８のＨＬＭ利用を阻害した。この例は、組み換えＵＧＴ Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅ調製物およびヒト肝ミクロソーム環境の両方を使用して、阻害についてスクリーニングするためのアッセイの有用性を示す。

実施例５．ヒト肝ミクロソームにおけるＵＧＴ活性の阻害
多くの化合物は、特定のＵＧＴアイソザイムの活性を調節することが知られている。本明細書に記載のアッセイシステムにおいて、これらのいくつかを試験し、化合物３１３８を使用して測定されるように、ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）中のＵＧＴ活性を阻害するそれらの能力を測定した。阻害因子の化合物、ならびに化合物によって調節されると、文献において現在報告されているアイソザイムの一覧を、以下の表に示す。

これらの化合物がＨＬＭ中のＵＧＴ活性を阻害する能力を評価するために、反応液を以下のように設定した。すべての反応液は、５０ｍＭ ＴＥＳ、ｐＨ７．５、８ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２５μｇ／ｍＬアラメチシン、０．０５ｍｇ／ｍＬ ＨＬＭ、および５０μＭ 化合物３１３８を含有し、４ｍＭ ＵＤＰＧＡを含むか含まなかった。リトナビルおよびロピナビルを、最終濃度０．２５ｍＭで使用した。スルフィンピラゾン、キニジン、およびアンドロステロンを、最終濃度０．５ｍＭで使用した。１−ナフトール、スコポレチン、ウンベリフェロン、および７−ヒドロキシ−４−トリフルオロメチルクマリンは、最終濃度１ｍＭで使用した。ジクロフェナクは、最終濃度５ｍＭで使用した。バルプロエートは、最終濃度１０ｍＭで使用した。すべての反応液を、水、ＤＭＳＯ、またはエタノールのいずれかを含有する、それらの対応する媒体対照試料と比較した。３７℃で１５分後、４０μＬのＰ４５０−Ｇｌｏ ＬＤＲ＋２０ｍＭ Ｄ−システインを、各４０μＬ反応液に添加し、混合した。室温で２０分後、生物発光を照度計上で測定した。

化合物は、ＨＬＭ中のＵＧＴ活性を様々な程度で阻害した（図１３）。この試料は、より自然なヒト肝ミクロソーム環境において、様々なＵＧＴ阻害因子についてスクリーニングするためのアッセイの効用を示す。

実施例６．ＵＧＴ１Ａ１および２Ｂ７を使用する、アッセイ変動性の決定
アッセイ変動性を、１２個の個別のｎｏＵＤＰＧＡおよびｐｌｕｓＵＤＰＧＡ試料の活性データおよび標準偏差を使用して決定した。すべての反応液は、５０ｍＭ ＴＥＳ、ｐＨ７．５、８ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２５μｇ／ｍＬアラメチシン、０．２ｍｇ／ｍＬ ＵＧＴ１Ａ１、または２Ｂ７Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（登録商標）、および３０μＭ 化合物３１３８を含有し、５ｍＭ ＵＤＰＧＡを含むか含まなかった。３７℃で１２０分後、４０μＬのＰ４５０−Ｇｌｏ ＬＤＲ＋２０ｍＭ Ｄ−システインを、各４０μＬ反応液に添加し、混合した。室温で２０分後、生物発光を照度計上で測定した。

ＵＧＴ１Ａ１に関するデータを、図１２に示す。Ｚ′値は、以下に概説される等式を使用して計算した。

ロバストなアッセイシステムは、通常、０．５以上のＺ′値を示す。ＵＧＴ１Ａ１に関して計算されたＺ′値は、０．８３であった。同一条件下で、ＵＧＴ２Ｂ７に関して計算されたＺ′値は、０．６７であった。

実施例７．ＧＳＴアイソザイムによるベンゾチアゾールの利用
化合物９３４〜３７をＤＭＳＯ中に溶解して、約１ｍｇ／ｍＬの溶液を生成した。この溶液を１：１００（ｖ／ｖ）で５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５に希釈して、基質溶液を生成した（約１０μｇ／ｍＬ）。２０μＬのこの溶液を、９６ウェルの白色照度計プレート（Ｐｒｏｍｅｇａ ｐａｒｔ Ｚ３２９１）の１０ウェルに入れ、２０μＬの基質の１：３．１希釈液（約３．２μｇ／ｍＬ）を、照度計プレートの別の１０ウェルに入れた。

Ｄ−システイン、４ｍｇ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｒｐ．、Ｃ８００５−１ｇ、０１７Ｋ１０３４）を、１ｍＬの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５中に溶解し、次に、４μＬを、基質溶液を含有するウェルの４つに添加し、希釈基質溶液をウェルの４つに添加して、化合物９３４〜３７を対応するルシフェリン誘導体に変換した。これらの化合物の構造を、以下に示す。
水中のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼアイソザイムＡ１−１（ＧＳＴ Ａ１−１）（１．２ｍｇ／ｍＬ）、および１００μＬの１００ｍＭグルタチオンの試料を、５ｍＬの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５中に希釈し、次に２５μＬを以下のようにプレートに添加した。未変換の濃縮化合物９３４−３７を２ウェル、濃縮および変換した化合物９３４−３７を２ウェル、未変換の希釈化合物９３４−３７を２ウェル、および変換された希釈化合物９３４−３７を２ウェルに添加した。

ＧＳＴ Ｍ１−１（１．２ｍｇ／ｍＬ）および１００μＬの１００ｍＭグルタチオンの試料を、５ｍＬの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．５中に希釈し、次に２５μＬを、未変換の濃縮化合物９３４−３７の２ウェル、濃縮および変換した化合物９３４−３７の２ウェル、未変換の希釈化合物９３４−３７の２ウェル、および変換された希釈化合物９３４−３７の２ウェルに添加した。

グルタチオン（１００μＬの１００ｍＭグルタチオン）を、５ｍＬの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液ｐＨ７．５に希釈し、次に２５μＬを、濃縮および希釈溶液中の変換および未変換化合物９３４−３７の残りのウェルに添加した。

室温で５５分後、４μＬの上記Ｄ−システイン溶液を、前にシステインを受容していないすべてのウェルに添加し、次に５０μＬのＰ４５０−Ｇｌｏ ＬＤＲを添加した。次にプレートを、ＧｌｏＭａｘ照度計（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）内に置き、１５分のインキュベーション後に生物発光を測定した。得られた値を平均化し、酵素を含まないウェルから生成された生物発光の平均値を、次に酵素を含むウェルにおいて生成された生物発光の平均から減じた。結果を、以下の表に示す。


これらのデータは、ＧＳＴ Ａ１−１が、その未変換状態で、はるかに速い速度で基質を利用し、Ｄ−システインの添加によって、ルシフェリン誘導体に変換されると、材料を変換する能力を本質的に喪失することを明らかに示す。しかしながら、ＧＳＴ Ｍ１−１は、その未変換状態で材料を利用する能力がはるかに低いが、変換形態の基質を良好に利用することを示す。変換および未変換形態の利用におけるこの差異を使用して、試料がこれらのアイソザイムの一方または両方を含有するか否かを決定することができる。

実施例８．Ｎ−ペプチジル−６−アミノ−２−シアノベンゾチアゾールの合成
保護Ｎ−ペプチジル−６−アミノ−２−シアノベンゾチアゾールを、米国特許第７，３８４，７５８号（Ｏ′Ｂｒｉｅｎ ｅｔ ａｌ．）に記載されるように調製することができる。脱保護された誘導体を、以下のように調製することができる。
トリフルオロ酢酸／ジクロロメタン／トリイソプロピルシラン（５０／５０／２）の無水溶液に、ｔ−ブチル保護されたＮ−ペプチジル−６−アミノ−２−シアノベンゾチアゾール（第ＵＳ７，３８４，７５８号）を添加する。２時間後、溶液を蒸発させてシロップにする。ジエチルエーテルで沈殿させる。固体をエチルエーテルで２回洗浄する。真空下で乾燥させる。逆相ＨＰＬＣ上で精製して、２０ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃを溶出する。適切な画分を合わせ、凍結乾燥させて、ｔＢｕ脱保護化合物を提供する。Ｃｂｚ基の除去は、水素化条件下で達成することができる（例えば、Ｐｄ／Ｃの存在下での水素ガス）。

実施例９．サイトクロームＰ４５０酵素パネル画面：サイトクロームＰ４５０酵素によるベンゾチアゾールの利用
いくつかのシアノベンゾチアゾール誘導体を合成し、昆虫細胞／バキュロウイルス発現系において発現された一団の組み換えＣＹＰ４５０酵素に対してスクリーニングした。すべてのＣＹＰ４５０は、必要な補因子Ｐ４５０レダクターゼで共発現させた。活性を強化するために、サイトクロームｂ５で共発現させたものもあった。ベンゾチアゾール化合物３０１６、３０１９、３０２６、３８０６、３８１４、３８２０、３８２１、３８３３、３８３５、３８６６、および３８６８、３８２３、３０２３、３８２８、３０１７、３０１８、３０２０、３０２１、３０２２、３０２４、３８１５、３８１７、３８２２、３８２４、３８２５、３８２６、３８２７、３８２９、３８３０、３８５１、３８５２、３８９１、３９０７のストック溶液を、ＤＭＳＯ中５０ｍＭで作製した。各ＣＹＰ４５０酵素の１ピコモル（反応液中２０ｎＭ最終濃度）（Ｓｕｐｅｒｓｏｍｅｓ（登録商標）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を、ＫＰＯ₄緩衝液ｐＨ７．４（ＣＹＰ４５０−２Ｃ９の場合２５ｍＭ ＫＰＯ₄、ＣＹＰ４５０−２Ｂ６、−２Ｃ８、−２Ｃ１９、−４Ｆ２、−４Ｆ３Ａ、および−４Ｆ３Ｂの場合５０ｍＭ ＫＰＯ₄、ＣＹＰ４５０−１Ａ１、−１Ａ２、−１Ｂ１、−２Ｄ６、−２Ｅ１、−３Ａ５、−３Ａ７、−２Ｊ２、−４Ｆ１２、−１９およびマイナスＰ４５０対照の場合１００ｍＭ ＫＰＯ₄、ＣＹＰ４５０−３Ａ４の場合２０ｍＭ ＫＰＯ₄）、または１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（ＣＹＰ４５０−２Ａ６、−２Ｃ１８、および−４Ａ１１の場合）において、５０μＬ反応液中、５０μｍの各化合物とインキュベートした。反応を、ＮＡＤＰＨ再生系を添加することによって開始した（最終濃度：１．３ｍＭ ＮＡＤＰ⁺、３．３ｍＭグルコース−６−リン酸塩、３．３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．４Ｕ／ｍＬグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、および０．０５ｍＭクエン酸ナトリウム）。反応液を、３０分間３７℃でインキュベートした。インキュベーション後、６．６ｍＭ Ｄ−システインを補充した５０μＬのＰ４５０−Ｇｌｏ（登録商標）ＬＤＲ（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐ．）を、各反応液に添加し、室温で２０分間インキュベートして、Ｖｅｒｉｔａｓ照度計上で生物発光を測定した。また低濃度の化合物を使用して、化合物の一部を再度スクリーニングした。低濃度のＣＹＰ４５０酵素は、化合物（例えば、化合物３０１９）のより厳密な相互反応性プロファイルに対する条件の特定を可能にする。図３３の表に示されるデータは、ベンゾチアゾール化合物を使用して、本発明において、生物発光としてＣＹＰ４５０酵素活性を検出できることを示す。各化合物は、１つまたは複数のＣＹＰ４５０で活性となり、ＣＹＰ４５０活性のプロファイルは、化合物構造に応じて、一団の酵素全体で異なった。指定のＣＹＰ４５０酵素に特異的な生物発光は、Ｐ４５０酵素によるベンゾチアゾール化合物の酸化で、６−ヒドロキシベンゾ［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリル（ベンゾチアゾール誘導体）を産生することに起因し得る。６−ヒドロキシベンゾ−［ｄ］チアゾール−２−カルボニトリルは、次にＤ−システインと反応して、Ｄ−ルシフェリン誘導体を形成することができ、次いで、ルシフェリン検出試薬中のルシフェラーゼと反応して、Ｄ−ルシフェリンの存在量に比例して光を生成する。

実施例１０．
ヒト組み換えＣＹＰ４５０ １Ａ２およびヒト肝ミクロソーム（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、１００ｍＭ ＫＰＯ₄ ｐＨ７．４を含む５０μＬの反応容量、およびα−ナフトフラボンおよびフルボキサミンの容量で、化合物３０１９と共に１０分間、３７℃でインキュベートした。組み換えＣＹＰ１Ａ２アッセイの場合、０．５ｐｍｏｌｅのＣＹＰ４５０ １Ａ２および６μＭの化合物３０１９を使用した。ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）アッセイの場合、１μｇのＨＬＭおよび３μＭの化合物３０１９を使用した。等量のＰ４５０−Ｇｌｏ ＬＤＲを、６．６ｍＭ Ｄ−システインとともに、ＣＹＰ４５０反応液中に添加した。室温で２０分間インキュベーションした後、生物発光を照度計上で測定した。既知のＣＹＰ４５０ １Ａ２阻害因子であるα−ナフトフラボンおよびフルボキサミンは、組み換えＣＹＰ４５０ １Ａ２活性の用量依存性阻害をもたらした（図２６）。ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）において、化合物３０１９との相当な活性があり、この活性は、α−ナフトフラボンおよびフルボキサミンによる阻害にも敏感であった（図２７）。初期ＣＹＰ４５０酵素パネル画面および組み換えＣＹＰ４５０ １Ａ２阻害アッセイは、化合物３０１９が実際に、ＣＹＰ１Ａ２阻害を検出するために使用することもできる、ＣＹＰ４５０ １Ａ２基質であることを示すが、ＣＹＰ４５０ １Ａ２選択的阻害因子がＨＬＭ活性に及ぼす影響は、化合物３０１９が、異なるＣＹＰ４５０酵素の複雑な混合物において、相当量のＣＹＰ４５０ １Ａ２選択性を示すことを確認する。

実施例１１．
ヒト凍結保存肝細胞（ＣｅｌｓｉｓロットＲＴＭ）を解凍し、コラーゲンコーティングした９６ウェル培養プレートのウェル内の肝細胞培養培地に、約８０，０００細胞／ウェルで播種し、５％ ＣＯ₂を含む標準細胞培養インキュベータ内で、３７℃で維持した。次に、細胞を４８時間、１００μＭオメプラゾール、２５μＭリファンピシン、１ｍＭフェノバルビタル、または肝細胞培養培地中に溶解された媒体対照（０．１％ジメチルスルホキシド）で処理した（図２８、各処理について、ｎ＝３、平均値および標準偏差が示される）。次に、細胞をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ（ＫＨ）緩衝液で２回すすぎ、１００μＬ ＫＨ緩衝液中、６μＭの化合物３０１９、３ｍＭのサリチルアミド、および０．３％ジメチルスルホキシドと共に１時間インキュベートした。次に、プレートをインキュベータから除去し、エステラーゼを有する１００μＬのＰ４５０−Ｇｌｏ ＬＤＲを、６．６ｍＭ Ｄ−システインとともに（左グラフ）またはＤ−システインなしに（右グラフ）、各ウェルに添加して、溶解物を生成した。１００μＬの溶解物を、培養プレートの各ウェルから、白色９６ウェル照度計プレート（Ｃｏｓｔａｒ）のウェルに移した。室温（約２１℃）で２０分後、プレート読み取り照度計（Ｖｅｒｉｔａｓ）上で生物発光を測定した。

細胞内に存在する天然システインの影響に関する洞察を得るために、Ｄ−システインを含まない試料を含めた。内因性システインは、細胞中にＬ−システインとして存在し、Ｌ−システインとの環化は、Ｌ−ルシフェリンを生成することとなり、これは一般に、ホタルルシフェラーゼのための有効な基質ではなく、阻害因子となると考えられている（Ｄ−ルシフェリンは、ホタルルシフェラーゼのための基質の主な活性形態である）。内因性Ｌ−システインの存在は、アッセイを干渉することが予想され得たが、アッセイ結果は、ロバスト基礎および誘導信号が認められたため、これが、アッセイを損なう程度で起こらなかったことを示す。

細胞を含み、この系においてＬ−システインの唯一の源である、Ｄ−システインを含まない試料からの結果は、無細胞背景対照と類似していた。これは、Ｌ−ルシフェリンからＤ−ルシフェリンへの変換が、プラスＤ−システイン試料において認められる全信号に有意に寄与しなかったことを示す（図２８）。

実施例１２．ヒト肝細胞による非溶解細胞に基づくアッセイ
ヒト凍結保存肝細胞（ＣｅｌｓｉｓロットＲＴＭ）を解凍し、コラーゲンコーティングした９６ウェル培養プレートのウェル内の肝細胞培養培地に、約７０，０００細胞／ウェルで播種し、５％ ＣＯ₂を含む標準細胞培養インキュベータ内で、３７℃で維持した。次に、細胞を４８時間、１００μＭオメプラゾール、または肝細胞培養培地中に溶解された媒体対照（０．１％ジメチルスルホキシド）で処理した（各処理の場合ｎ＝３、平均値および標準偏差が示される）。次に、細胞をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ（ＫＨ）緩衝液で２回すすぎ、１００μＬ ＫＨ緩衝液中、３μＭの化合物３０１９、３ｍＭのサリチルアミド、および０．３％ジメチルスルホキシドと共に１時間インキュベートした。次に、５０μＬのＫＨインキュベーション緩衝液を各ウェルから除去し、白色９６ウェル照度計プレート（Ｃｏｓｔａｒ）のウェルに移して、６．６ｍＭ Ｄ−システインを含有する５０μＬのＰ４５０−Ｇｌｏ ＬＤＲとも合わせた。室温（約２１℃）で２０分後、プレート読み取り照度計（Ｖｅｒｉｔａｓ）上で生物発光を測定した。

図２９に示される結果は、化合物３０１９が細胞に進入し、ＣＹＰ４５０反応生成物および未反応の化合物３０１９が細胞を出ることを示した。図２９に示されるように、基礎信号は、媒体のみの処理を受けた細胞から認められ、信号は、ＣＹＰ１Ａ２誘導因子オメプラゾールで処理された細胞から有意に増加した。

実施例１３．ラット肝細胞による非溶解アッセイ
実施例１３に記載される非溶解アプローチに従って、凍結保存ラット肝細胞（ＸｅｎｏｔｅｃｈロットＲ１０００）を解凍し、コラーゲンコーティングした９６ウェル培養プレートのウェル内の肝細胞培養培地に、約５０，０００細胞／ウェルで播種し、５％ ＣＯ₂を含む標準細胞培養インキュベータ内で、３７℃で維持した。次に、細胞を４８時間、１０ｎＭ ２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＴＣＤＤ）または肝細胞培養培地中に溶解された媒体対照（０．００６％ジメチルスルホキシド）で処理した（各処理のについて、ｎ＝３、平均値および標準偏差が示される）。次に、細胞をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ（ＫＨ）緩衝液で２回すすいだ後、１００μＬ ＫＨ緩衝液中、３μＭの化合物３０１９、３ｍＭのサリチルアミド、および０．３％ジメチルスルホキシドと共に１時間インキュベートした。次に、５０μＬのＫＨインキュベーション緩衝液を各ウェルから除去し、白色９６ウェル照度計プレート（Ｃｏｓｔａｒ）のウェルに移して、６．６ｍＭ Ｄ−システインを含有する５０μＬのルシフェラーゼ反応混合物（上述のとおり）とも合わせた。室温（約２１℃）で２０分後、プレート読み取り照度計（Ｖｅｒｉｔａｓ）上で生物発光を測定した。

ヒト肝細胞と同様に、図３０に示される結果は、ＣＹＰ４５０ １Ａ２誘導因子である２，３，７，８−テトラクロロジベンゾ−ｐ−ジオキシン（ＴＣＤＤ）によって著しく増加した重要な基礎信号が認められたことを示す。ＴＣＤＤは、アリール炭化水素核受容体へのその結合を伴う機構を通じて遺伝子を誘発する、ジオキシン誘導体である。ＣＹＰ４５０ １Ａ群の遺伝子は、この経路に反応性のある基の中に含まれ、化合物３０１９のＣＹＰ１Ａ２選択性を示す、本明細書に提示される他の証拠を考慮すると、ＴＣＤＤによってもたらされる信号の増加は、ラットＣＹＰ１Ａ２遺伝子誘発と一致する。

実施例１４．
凍結保存ヒト肝細胞（ＡＤＭＥＴ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓロット♯Ｈ２０６３−Ｐ１０）を解凍し、Ｋｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ（ＫＨ）緩衝液中で再懸濁して、白色９６ウェル照度計プレートに約６０，０００細胞／ウェル（５０μＬの懸濁液）で分注した。１００μＭの化合物３１３８（図３２に示される）を、単独で（対照）または８ｍＭのウリジン５′−ジホスホ−グルクロン酸（ＵＤＰＧＡ）、４ｍＭのジクロフェナクまたはＵＤＰＧＡおよびジクロフェナクと組み合わせて含有する、５０μＬの５０ｍＭ ＴＥＳ緩衝液を、次に添加して、１５〜２０分間３７℃でインキュベートさせた。次に、２０ｍＭのＤ−システインを含有する、１００μＬのＰ４５０−Ｇｌｏ ＬＤＲを添加した。室温（約２１℃）で２０分後、プレート読み取り照度計上で生物発光を測定した。結果を図３１に示し、「基質利用率％」は、無細胞対照と比較して認められた生物発光の減少を反映する（例えば、利用率２０％は、対応する無細胞対照と比較して、光出力が２０％減少することを示す）。値は、平均および標準偏差であって、対照、＋ＵＤＰＧＡ、および＋ジクロフェナクについて、ｎ＝３であり、＋ＵＤＰＧＡ＋ジクロフェナクについて、ｎ＝２である。

ＰＢＩ３１３８の変換は、正常な肝細胞のインキュベーション時に見られた。ＵＤＰＧＡの添加は、ＵＧＴアイソザイムによって触媒された変換について予測されたように、細胞透過剤であるアラメタシンの存在下で、この変換を増加させた。この変換は、ジクロフェナクの存在によって阻害された（上述のとおり）。この阻害は、アラメタシンの存在下で、追加のＵＤＰＧＡが添加された場合でも見られた。これらの結果は、ミクロソームで見られるように、ＰＢＩ３１３８をこれらの細胞に添加することが、修飾化合物へのＰＢＩ３１３８の変換をもたらしたことを示す。

実施例１５．
以下の実施例は、本発明の生物発光アッセイ、すなわち、関心対象の非ルシフェラーゼ酵素のための２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体を使用する生物発光アッセイを、別の生物発光アッセイ、例えば、関心対象の非ルシフェラーゼ酵素のためのＤ−ルシフェリンまたはアミノルシフェリンの誘導体を使用する生物発光アッセイとともに、多重化する能力を示す。この実施例では、２つの異なるＰ４５０酵素、ＣＹＰ１Ａ２、およびＣＹＰ３Ａ４が、単一試料において検出された。ＣＹＰ１Ａ２の検出のために、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾール誘導体化合物３０１９を、Ｄ−システインを含有するＬＤＲを使用して検出された生物発光とともに使用した。ＣＹＰ３Ａ４の検出のために、ルシフェリンアセタール誘導体、ルシフェリン−ＩＰＡ（Ｌｕｃ−ＩＰＡ）を、Ｄ−システインを含まないＬＤＲを使用して検出された生物発光とともに使用した。この多重アッセイは、細胞に基づくアッセイにおいて、２つの異なる生物発光基質を使用する単一インキュベーションから、ＣＹＰ１Ａ２および／またはＣＹＰ３Ａ４の識別を可能にする。
ヒト凍結保存肝細胞（Ｃｅｌｓｉｓ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を解凍し、コラーゲンコーティングした９６ウェル培養プレートのウェル内の肝細胞培養培地に、約５０，０００細胞／ウェルで播種し、５％ ＣＯ₂を含む標準細胞培養インキュベータ内で、３７℃で維持した。次に、細胞を４８時間、１００μＭオメプラゾール、２５μＭリファンピシン、または肝細胞培養培地中に溶解された媒体対照（０．１％ＤＭＳＯ）で処理した（各処理について、ｎ＝６、平均値および標準偏差が示される）。次に、細胞をＫｒｅｂｓ−Ｈｅｎｓｅｌｅｉｔ（ＫＨ）緩衝液で２回すすいだ後、ＫＨ緩衝液中、６μＭの化合物３０１９、３ｍＭのサリチルアミド、および計０．３％のＤＭＳＯ、またはＫＨ緩衝液中、６μＭの化合物３０１９、３ｍＭのＬｕｃ−ＩＰＡ、および計０．３％のＤＭＳＯと共に１時間インキュベートした。次に、プレートをインキュベータから除去した。各正常細胞上澄みからの５０μＬを、白色９６ウェル照度計プレート（Ｃｏｓｔａｒ）の２セットのウェルに移した。１セットのウェルに、５０μＬのＬＤＲを４ｍＭ Ｄ−システインとともに添加し、Ｄ−システインを含まない５０μＬのＬＤＲを他のセットに添加した。室温（約２１℃）で２０分後、プレート読み取り照度計（Ｖｅｒｉｔａｓ）上で生物発光を測定した。

図３４ａ〜ｄに見られるように、本発明の方法は、同時に２つの生物発光基質の存在下で行うことができ、基質の１つは、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体である。オメプラゾールは、ＣＹＰ１Ａを誘発し、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）アゴニストである。リファンピシンは、ＣＹＰ３Ａ／２Ｃであり、ＰＸＲアゴニストである。「無細胞」対照は、基質のための背景を提供する。図３４Ａは、化合物３０１９を使用して検出されたオメプラゾールによる、ＣＹＰ１Ａ２活性の誘発を示す。図３４Ｂは、基質ルシフェリン−ＩＰＡを使用して検出されたリファンピシンによって、ＣＹＰ３Ａ４の誘発を示す。図３４Ｃは、ＣＹＰ３Ａ４基質、ルシフェリン−ＩＰＡの存在下、化合物３０１９を使用して検出されたオメプラゾールによるＣＹＰ１Ａ２活性の誘発を示す。図３４Ｄは、ＣＹＰ１Ａ２基質、化合物３０１９の存在下で、基質ルシフェリン−ＩＰＡを使用して検出されたリファンピシンによるＣＹＰ３Ａ４の誘発を示す。

すべての発行物、特許、および特許書類は、参照することによって個別に組み込まれるかのように、本明細書で参照することによって組み込まれる。本発明は、様々な特異的および好適な態様および技術を参照して説明された。しかしながら、本発明の精神および範囲内でありながら、多くの変型および修飾を行ってもよいことを理解されたい。

Claims (33)

1. 細胞内の非ルシフェラーゼ酵素を検出する方法であって、
   （ａ）前記非ルシフェラーゼ酵素のための基質であって、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体である基質を、前記酵素と前記基質との間の反応を可能にする条件下で、細胞と接触させることと、
   （ｂ）ルシフェラーゼ反応混合物を前記接触させた細胞に添加することと、
   （ｃ）生物発光を測定することと、
   を含む、方法。
2. 前記誘導体が、式（Ｉ）の化合物であり、
   式中、
   Ｒ¹が、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ^x、またはＮＲ^xＲ^yであり、
   Ｒ²が、（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキル、トリフルオロメチル、アミノ、ニトロ、またはハロであり、
   ｎが、０、１、２、または３であり、
   Ｒ^xが、（ｉ）アリールが、ハロ、ヒドロキシ、アミノ基、アミノ酸、ペプチド、およびエステルから成る群から選択される１〜５個の基で随意に置換された、（Ｃ₁−Ｃ₁₀）アルキルアリールであるか、または（ｉｉ）アルキルが、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、およびアミノから成る群から選択される１〜５個の基で随意に置換された、（Ｃ₁−Ｃ₁₀）アルキルであり、
   Ｒ^yが、水素または（Ｃ₁−Ｃ₁₀）アルキルである、
   請求項１に記載の方法。
3. 前記誘導体が、以下から成る群から選択される、請求項１に記載の方法：
   。
4. 前記非ルシフェラーゼ酵素が、ＵＧＴ、ＧＳＴ、ＣＹＰ４５０、ＦＭＯ、ＨＤＡＣ、またはプロテアーゼを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記ルシフェラーゼ反応混合物が、エステラーゼをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記ルシフェラーゼ反応混合物が、Ｄ−システインをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記細胞が肝細胞である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
8. 前記細胞が、試験化合物とさらに接触させられる、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. 前記試験化合物が、前記非ルシフェラーゼ酵素の阻害因子、前記非ルシフェラーゼ酵素の誘導因子、前記非ルシフェラーゼ酵素のための基質、および前記非ルシフェラーゼ酵素の活性化因子から成る群から選択される、請求項８に記載の方法。
10. 細胞内の非ルシフェラーゼ酵素を検出する方法であって、
    （ａ）第１の反応槽内で、前記非ルシフェラーゼ酵素のための基質であって、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体である基質を、前記酵素と前記基質との間の反応を可能にする条件下で、細胞と接触させて、インキュベーション混合物を形成することと、
    （ｂ）前記インキュベーション混合物の少なくとも一部を、第２の反応槽に移すことと、
    （ｃ）ルシフェラーゼ反応混合物を、前記第２の反応槽に添加することと、
    （ｄ）生物発光を測定することと、
    を含む、方法。
11. 前記誘導体が、式（Ｉ）の化合物であり、
    式中、
    Ｒ¹が、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ^x、またはＮＲ^xＲ^yであり、
    Ｒ²が、（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキル、トリフルオロメチル、アミノ、ニトロ、またはハロであり、
    ｎが、０、１、２、または３であり、
    Ｒ^xが、（ｉ）アリールが、ハロ、ヒドロキシ、アミノ基、アミノ酸、ペプチド、およびエステルから成る群から選択される１〜５個の基で随意に置換された、（Ｃ₁−Ｃ₁₀）アルキルアリールであるか、または（ｉｉ）アルキルが、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、およびアミノから成る群から選択される１〜５個の基で随意に置換された、（Ｃ₁−Ｃ₁₀）アルキルであり、
    Ｒ^yが、水素または（Ｃ₁−Ｃ₁₀）アルキルである、
    請求項１０に記載の方法。
12. 前記誘導体が、以下から成る群から選択される、請求項１０に記載の方法：
    。
13. 前記非ルシフェラーゼ酵素が、ＵＧＴ、ＧＳＴ、ＣＹＰ４５０、ＦＭＯ、ＨＤＡＣ、またはプロテアーゼを含む、請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法。
14. 前記ルシフェラーゼ反応混合物が、エステラーゼをさらに含む、請求項１０〜１３のいずれか１項に記載の方法。
15. 前記ルシフェラーゼ反応混合物が、Ｄ−システインをさらに含む、請求項１０〜１４のいずれか１項に記載の方法。
16. 前記細胞が肝細胞である、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
17. 前記細胞が、試験化合物とさらに接触させられる、請求項１０〜１６のいずれか１項に記載の方法。
18. 前記試験化合物が、前記非ルシフェラーゼ酵素の阻害因子、前記非ルシフェラーゼ酵素の誘導因子、前記非ルシフェラーゼ酵素のための基質、および前記非ルシフェラーゼ酵素の活性化因子から成る群から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 非ルシフェラーゼ酵素の調節因子をスクリーニングする方法であって、
    （ａ）細胞を試験化合物と接触させることと、
    （ｂ）前記非ルシフェラーゼ酵素のための基質であって、２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体である基質を、前記基質と前記非ルシフェラーゼ酵素との間の反応を可能にする条件下で添加して、混合物を形成することと、
    （ｃ）ルシフェラーゼ反応混合物を前記混合物に添加することと、
    （ｄ）生物発光を測定することと、
    を含む、方法。
20. 前記誘導体が、式（Ｉ）の化合物であり、
    式中、
    Ｒ¹が、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ^x、またはＮＲ^xＲ^yであり、
    Ｒ²が、（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキル、トリフルオロメチル、アミノ、ニトロ、またはハロであり、
    ｎが、０、１、２、または３であり、
    Ｒ^xが、（ｉ）アリールが、ハロ、ヒドロキシ、アミノ基、アミノ酸、ペプチド、およびエステルから成る群から選択される１〜５個の基で随意に置換された、（Ｃ₁−Ｃ₁₀）アルキルアリールであるか、または（ｉｉ）アルキルが、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、およびアミノから成る群から選択される１〜５個の基で随意に置換された、（Ｃ₁−Ｃ₁₀）アルキルであり、
    Ｒ^yが、水素または（Ｃ₁−Ｃ₁₀）アルキルである、
    請求項１９に記載の方法。
21. 前記誘導体が、から成る群から選択される、請求項１９に記載の方法：
    。
22. 前記非ルシフェラーゼ酵素が、ＵＧＴ、ＧＳＴ、ＣＹＰ４５０、ＦＭＯ、ＨＤＡＣ、またはプロテアーゼを含む、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
23. 前記ルシフェラーゼ反応混合物が、エステラーゼをさらに含む、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
24. 前記ルシフェラーゼ反応混合物が、Ｄ−システインをさらに含む、請求項１９〜２３のいずれか１項に記載の方法。
25. 前記細胞が肝細胞である、請求項１９〜２４のいずれか１項に記載の方法。
26. 細胞内の２つ以上の非ルシフェラーゼ酵素を検出する方法であって、
    ａ）第１の反応槽内で、２つ以上の生物発光性基質であって、そのうちの１つが２−シアノ−６−置換ベンゾチアゾールの誘導体である基質を、前記酵素と前記基質との間の反応を可能にする条件下で、細胞と接触させて、反応混合物を形成することと、
    ｂ）インキュベーション混合物の一部を第２および第３の反応槽に移すことと、
    ｃ）前記反応槽のうちの１つに、Ｄ−システインを含むルシフェラーゼ反応混合物を添加し、もう１つの反応槽に、Ｄ−システインを含まないルシフェラーゼ反応混合物を添加することと、
    ｄ）両方の反応槽内の生物発光を測定することと、
    を含む、方法。
27. 前記誘導体が、式（Ｉ）の化合物であり、
    式中、
    Ｒ¹が、Ｈ、ＯＨ、ＯＲ^x、またはＮＲ^xＲ^yであり、
    Ｒ²が、（Ｃ₁−Ｃ₃）アルキル、トリフルオロメチル、アミノ、ニトロ、またはハロであり、
    ｎが、０、１、２、または３であり、
    Ｒ^xが、（ｉ）アリールが、ハロ、ヒドロキシ、アミノ基、アミノ酸、ペプチド、およびエステルから成る群から選択される１〜５個の基で随意に置換された、（Ｃ₁−Ｃ₁₀）アルキルアリールであるか、または（ｉｉ）アルキルが、アルコキシ、ヒドロキシ、ハロ、およびアミノから成る群から選択される１〜５個の基で随意に置換された、（Ｃ₁−Ｃ₁₀）アルキルであり、
    Ｒ^yが、水素または（Ｃ₁−Ｃ₁₀）アルキルである、
    請求項２６に記載の方法。
28. 前記誘導体が、から成る群から選択される、請求項２６に記載の方法：
    。
29. 前記非ルシフェラーゼ酵素が、ＵＧＴ、ＧＳＴ、ＣＹＰ４５０、ＦＭＯ、ＨＤＡＣ、またはプロテアーゼを含む、請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法。
30. 前記ルシフェラーゼ反応混合物が、エステラーゼをさらに含む、請求項２６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
31. 前記細胞が肝細胞である、請求項２６〜３０のいずれか１項に記載の方法。
32. 前記細胞が、試験化合物とさらに接触させられる、請求項２６〜３１のいずれか１項に記載の方法。
33. 前記他方の生物発光性基質が、Ｄ−ルシフェリンまたはアミノルシフェリンの誘導体である、請求項２６〜３２のいずれか１項に記載の方法。