JP5374493B2 - 発光による生細胞及び死細胞のアッセイ - Google Patents
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Description
本明細書において使用する場合、以下の用語及び表現は指示された意味を有する。本発明の化合物が非対称に置換炭素原子を含み、光学活性体又はラセミ体に単離され得ることは理解されるであろう。ラセミ体の分離による、又は光学活性出発物質からの合成によるような、光学活性体の調製法は当分野において周知である。構造のすべてのキラル型、ジアステレオマー型、ラセミ体及びすべての幾何異性体は本発明の一部である。
本発明の方法は、細胞膜の透過性及び完全性に関与するタンパク質分解活性に基づく。本方法の有利性は、アッセイの読み出しの感度、容易さ及び柔軟性を含む。生存率の測定は、生物発光プロテアーゼ基質、及び細胞膜の完全性が損なわれない限り細胞から放出されないが細胞外環境において活性である細胞内プロテアーゼ、例えば偏在する保存された細胞内プロテアーゼの相対的不透過性に基づく。この実施形態において有用な基質は、N−末端又はC−末端においてブロックされる基質を含む、エキソプロテアーゼ又はエンドプロテアーゼに対する基質を含む。実質的な細胞不透過性プロテアーゼ基質は、死細胞に関するアッセイにおいてエンドポイントを測定するために一般的に用いられる期間、例えば、プロテアーゼ基質を試料に加えた後、5、4、3、2又は1.5時間未満或いは5、15、30、60又は120分を超える時間において、生存細胞において検出不可能な基質である。一実施形態において、生物発光性の実質的な細胞不透過性基質は、アミノ酸或いはジペプチド又はトリペプチドの基質を含む。一実施形態において、生物発光性の細胞不透過性基質は、トリペプチジルペプチダーゼ、カルパイン又はキモトリプシンに対する基質並びにルシフェリンに対するプロ基質である。
表2
本発明の誘導体の範囲内にあるルシフェリンの修飾は、1つ又は複数の環原子の置換、1つ又は複数の、環原子に結合した置換基(原子又は基)の1つ又は複数の置換、及び/又は環に対する1つ又は複数の原子の付加、例えば、環の拡大又は付加或いはそれらの組合せが含まれ、これらの修飾の少なくとも1つはプロテアーゼ基質を含む。天然のホタルルシフェリンは、3つの連結した環、6位にOH基を有する6員の「ベンゾ」環(以下「環A」又は「A環」)、6員のベンゾ環に縮合した5員のチアゾール環(以下、「環B」又は「B環」)及び5位においてカルボキシル基で修飾された5員のチアゾール環(以下「環C」又は「C環」)を有する。
[式中、
Yは、N、N−オキシド、N−(C1〜C6)アルキル又はCHであり、
Xは、S、O、CH=CH、N=CH又はCH=Nであり、
Z及びZ’は、独立してH、R、OR、SR、NHR又はNRRであり、
Z”は、O、S、NH、NHR、N=Nであり、
Qは、カルボニル、CH2又は直接結合であり、
W1は、H、ハロ、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、ヒドロキシル、(C1〜C6)アルコキシ、又は
W1及びZは、双方とも環A上のケト基であり、環Aにおいて任意選択の二重結合を表す点線の少なくとも1つは存在せず、
W2は、それぞれ独立してH、ハロ、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C4)アルケニル、ヒドロキシル、(C1〜C6)アルコキシであり、
K1、K2、K3及びK4は、それぞれ独立してCH、N、N−オキシド又はN−(C1〜C6)アルキルであり、
環A及び環Bの点線は、任意選択の二重結合を表し、
A’及びB’は、場合により存在する、環Aに縮合した芳香族環であり、これらの1つだけが、縮合三環系を形成するように化合物中に存在し、A’又はB’が存在する場合、基Z’は、場合により存在する、環A’又は環B’のどちらかの置換基であり、
Rは、それぞれ独立して、H、(C1〜C20)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、(C2〜C20)アルキニル、(C3〜C20)シクロアルキル、(C1〜C12)アルコキシ、(C6〜C30)アリール、ヘテロアリール、複素環、(C1〜C20)アルキルスルホキシ、(C6〜C30)アリールスルホキシ、ヘテロアリールスルホキシ、(C1〜C20)アルキルスルホニル、(C6〜C30)アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、(C1〜C20)アルキルスルフィニル、(C6〜C30)アリールスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニル、(C1〜C20)アルコキシカルボニル、アミノ、NH(C1〜C6)アルキル、N((C1〜C6)アルキル)2、トリ(C1〜C20)アンモニウム(C1〜C20)アルキル、ヘテロアリール(C1〜C20)アルキル、四級窒素を有するヘテロアリール、四級窒素を有するヘテロアリールカルボニル、(C1〜C20)アシル、(C1〜C20)アシルオキシ、(C1〜C20)アルキルチオ、(C6〜C30)アリールチオ、(C1〜C20)アルキルホスフェート、(C1〜C20)アルキルホスホネート、(C6〜C30)アリールホスフェート、(C6〜C30)アリールホスホネート、ホスフェート、サルフェート、単糖類、1〜約10個のアミノ酸鎖であり、又は、場合によりZ”が酸素の場合、M+であり、Mはアルカリ金属であり、
或いはZ又はZ’がNRRであり、RRがNと一緒にヘテロアリール又は複素環基を形成する場合、
式中、任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、アリール、ヘテロアリール又は複素環基は、(C1〜C20)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、(C2〜C20)アルキニル、(C3〜C20)シクロアルキル、(C1〜C20)アルコキシル、(C1〜C20)アルキルカルボニル,(C1〜C20)アルキルカルボキシル、ハロ、ヒドロキシル、−COORx、−SO2Rx、−SO3Rx、ニトロ、アミノ、(C1〜C20)アルキル−S(O)−、(C1〜C20)アルキル−SO2−、ホスフェート、(C1〜C20)アルキルホスフェート、(C1〜C20)アルキルホスホネート、NH(C1〜C6)アルキル、NH(C1〜C6)アルキニル,N((C1〜C6)アルキル)2、N((C1〜C6)アルキニル)2、メルカプト、(C1〜C20)アルキルチオ、(C6〜C30)アリール、(C6〜C30)アリールチオ、トリフルオロメチル、=O、ヘテロアリール又は複素環を含む、1、2、3、4又は5つの置換基で場合により置換されており、式中、置換基はそれぞれ1〜3つのR基で場合により置換されており、
Rxは、H、(C1〜C6)アルキル又は(C6〜C30)アリールであり、
式中、少なくとも1つのZ又はZ’、例えばZ又はZ’のR基は、1〜約10個のアミノ酸の基又は鎖である]
の化合物又はそれらの塩を提供する。
Z又はZ’が窒素部分を含む場合、Z又はZ’の窒素部分の1つ又は双方の水素は、(C1〜C20)アルキル又は基Lにより置き換えることができ、Lはアミノ酸ラジカル、20個までのアミノ酸部分を有するペプチドラジカル又はプロテアーゼに対する基質である任意の他の小型分子である。特定の実施形態において、Lがアミノ酸ラジカル又はペプチドラジカルである場合、少なくとも1つのW2はHではない。
(式中、
Yは、N、N−オキシド、N−低級アルキル又はCHであり、
Xは、S、CH=CH,又はN=Cであり、
Z及びZ’は、独立してH、OR、NHR、NRR又はボロン原子を介して環A又はA’に結合した環状ジオキサボロラン基であり、
Z”は、O、S、NH、NHR又はN=Nであり、
Wは、それぞれ独立してH、ハロ、C1〜6アルキル、C2〜20アルケニル、ヒドロキシル又はC1〜6アルコキシであり、或いは、
W及びZは、双方とも環A上のケト基であり、環Aの点線は存在せず、
K1、K2、K3及びK4は、それぞれ独立して、CH、N、N−オキシド又はN−低級アルキルであり、
環A及び環Bの点線は、任意選択の二重結合を表し、
Rは、それぞれ独立して、H、アミノ、C1〜20アルキル、C2〜20アルケニル、C3〜20アルキニル、C2〜20アルケニルC1〜20アルキル、C3〜20アルキニルC2〜20アルケニル、C3〜20シクロアルキル、C6〜30アリール、ヘテロアリール、C6〜30アリールC1〜20アルキル、C1〜12アルコキシ、C1〜12アルコキシカルボニル、C1〜20アルキルスルホキシ、C6〜30アリールスルホキシ、C6〜30アリールスルホキシC1〜20アルキル、C1〜20アルキルスルホキシC1〜20アルキル、C1〜20アルコキシカルボニル、C6〜30アリールC1〜20アルコキシカルボニル、C6〜30アリールチオC1〜20アルキル、トリC1〜20アンモニウムC1〜20アルキル、ヘテロアリールスルホキシ、ヘテロアリールC1〜20アルキル、4級窒素を有するヘテロアリール、4級窒素を有するヘテロアリールカルボニル、N−メチル−テトラヒドロピリジニル又はペンタフルオロフェニルスルホニルであり、
式中、任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、複素環、又はアミノ基は、1つ又は複数の、例えば1、2、3、4又は5つの、C1〜20アルキル、C2〜20アルケニル、C3〜20アルキニル、C3〜20シクロアルキル、ハロ、ヒドロキシル、アシル、アシルオキシ、−COOR1、−SO3R1、アミノ、ニトロ、低級アルキルアミノ、低級アルキニルアミノ、イミダゾリニル−メチルアミノ、ジ−低級アルキルアミノ、ジ−低級アルキニルアミノ、ピペリジノ、ピロリジノ、アゼチジノ、アジリジノ、ジ−イミダゾリニルメチルアミノ、メルカプト、C1〜20アルキルチオ、C6〜30アリールチオ、トリフルオロメチル、C1〜20アルキルカルボキシル、C6〜30アリール、C6〜30アリールC1〜20アルコキシル、ヘテロアリール、複素環、複素環C1〜20アルキル又はC6〜30アリールC1〜20アルキルカルボニルにより、場合により置換され得、基Rは、複数存在する場合、それぞれ独立して定義され、
R1は、水素、C1〜6アルキル又はC6〜30アリールであり、
Qは、C(=O)、CH2又は直接結合であり、
nは、0、1又は2であり、
式中、少なくとも1つのZ又はZ’は、例えばZ又はZ’のR基は、1〜約10個のアミノ酸鎖の基又は鎖であり、
A−は陰イオンであり、4級窒素が存在する場合に存在する)
の化合物又はそれらの塩を提供する。
(式中、
R1は、水素、ヒドロキシル、アミノ、C1〜20アルコキシ、置換C1〜20アルコキシ、C2〜20アルケニルオキシ、置換C2〜20アルケニルオキシ、ハロゲン化C2〜20アルコキシ、置換ハロゲン化C2〜20アルコキシ、C3〜20アルキニルオキシ、置換C3〜20アルキニルオキシ、C3〜20シクロアルコキシ、置換C3〜20シクロアルコキシ、C3〜20シクロアルキルアミノ、置換C3〜20シクロアルキルアミノ、C1〜20アルキルアミノ、置換C1〜20アルキルアミノ、ジC1〜20アルキルアミノ、置換ジC1〜20アルキルアミノ、C2〜20アルケニルアミノ、置換C2〜20アルケニルアミノ、ジC2〜20アルケニルアミノ、置換ジC2〜20アルケニルアミノ、C2〜20アルケニルC1〜20アルキルアミノ、置換C2〜20アルケニルC1〜20アルキルアミノ、C3〜20アルキニルアミノ、置換C3〜20アルキニルアミノ、ジC3〜20アルキニルアミノ、置換ジアルキルアミノ、C3〜20アルキニルC2〜20アルケニルアミノ、置換C3〜20アルキニルC2〜20アルケニルアミノ、又は1〜約10個のアミノ酸鎖であり、
R2及びR3は、独立してC又はNであり、
R4及びR5は、独立してS、O、NR8であり、
R6はCH2OH、COR11又は−OM+であり、式中、M+はアルカリ金属又は医薬として許容可能な塩であり、
R7は、H、C1〜6アルキル、C1〜20アルケニル、ハロゲン又はC1〜6アルコキシドであり、
R8は、水素、C1〜20アルキル、CR9R10であり、式中、R9及びR10は独立してH、C1〜20アルキル又はフッ素であり、
R11は、H、OH、C1〜20アルコキシド、C2〜20アルケニル又はNR12R13であり、式中、R12及びR13は独立してH又はC1〜20アルキルであり、
式中、1〜約10個のアミノ酸鎖の少なくとも1つは、式Vの化合物中に、この化合物がプロテアーゼ基質であるように存在する)
の化合物を提供する。
単一のプロテアーゼ基質を用いて、生細胞及び死細胞を検出できるかどうかを確定するために、Jurkat細胞を、RPMI 1640+10%FBS中で100,000細胞/mlに調整した。試料を、2つに分割した。1つを、穏やかに超音波処理に供し、細胞毒性を刺激した。他方は未処理のまま放置した。超音波処理(死滅した)分及び未処理(生きている)分を、様々な割合で組み合わせ、100、95、90、75、50、25、10、5及び0%の生存率で表した。各ブレンドを、100μlの複製量(10,000細胞/ウェルと同等)でマイクロタイターウェルに加えた。CytoTox−Glo試薬(2×試薬は、100μMのAAF−アミノルシフェリンの「AAF−Glo基質」、100mMのHepes、50mMのMgSO4 pH7.5を含み、凍結乾燥ルシフェラーゼ、結合剤及びATPを含むルシフェリン検出試薬の「ケーキ(cake)」を再水和するために使用した)を調製し、各ウェルに等量(100μL)/ウェルを加えた。プレートを、室温で15分間インキュベートし、死細胞のシグナルを、BMG PolarStarを使用して測定した。ジギトニン(DMSO中20mg/mL)を、CytoTox−Gloバッファー(100mMのHepes及び50mMのMgSO4)で300μg/mLに希釈し、各ウェルに20μL量を加え、完全な細胞溶解を容易にした。発光を、室温で15分間インキュベートした後で測定した。
Hela細胞を、10,000細胞/ウェルの濃度で、DMEM+10%FBS、50μL量中に播種し、5%CO2において、37℃で一晩接着させた。ノコダゾール(抗腫瘍薬)を、個々のプレートにおいて、DMEM+10%FBS中で2μMから2倍連続希釈し、50μL量を加えた(最も高い最終用量は1000nMである)。細胞を、化合物と共に24時間インキュベートした。CytoTox−Glo試薬を上記のように調製し、各ウェルに等量(100μL)/ウェルで加えた。15分間インキュベートした後で、死細胞のシグナルを回収した。ジギトニンを、AAF−Glo試薬を含むウェルに、30μg/mLになるように加えた。CellTiter−Gloを、ケーキと提供されたバッファーを再水和させることによって調製し、次いで、100μL量/ウェルを加えた。オービタルシェイカーを、700RPMで使用してプレートを振とうして、均一性を確保した。
図2Bは、パクリタキセル(有糸分裂阻害剤)に関するデータを示し、最も高い用量は500nMであった。この場合もやはり、CellTiter−Glo及びCytotox−Gloから誘導された値は、機構的に異なった毒性損傷と同様であった。
アクチノマイシンD(抗腫瘍抗生物質)を、マイクロタイタープレートにおいて、50μL量中2μMから、RPMI 1640+10%FBS中で2倍連続希釈した。RPMI 1640+10%FBSは、非誘導性の対照として使用した。Jurkat細胞を、10,000細胞/ウェルになるように、50μL量に加えた。オービタルシェイカーにより振とうすることによってプレートを混合し、次いで、37℃において、5%CO2中で24時間インキュベートした。GF−AFCを、50mMのMgSO4を含む100mMのHEPES pH7.5中で、200μMになるように希釈し、各ウェルに50μL量を加えた。37℃で30分間インキュベートした後で、生細胞の蛍光発光値を、BMG Polarstarを使用して回収した。CytoTox−Glo試薬を、2×試薬として調製し、100μL量を加えた。死細胞の値を、室温で15分間インキュベートした後で、BMG Polarstarを使用して回収した。ジギトニンを、30μg/mLになるように、20μL量を加え、オービタルシェイカーを使用してプレートを振とうした。ジギトニン処理した発光を、BMG Polarstarを使用して測定した。
イオノマイシン(カルシウムイオノフォア、これは、細胞膜を越えたカルシウム流出に作用し、したがって、高濃度ではモデルネクローシス誘導剤である)を、RPMI 1640+10%FBS、50μL量中で、100μMから2倍連続希釈した。Jurkat細胞を、10,000細胞/ウェルになるように、50μL量を加えた。オービタルシェイカーを使用してプレートを短時間振とうし、次いで、37℃において、6時間インキュベートした。CytoTox−Glo試薬を、上記のように調製し、各ウェルに等量(100μL)/ウェルを加えた。プレートを、室温で15分間インキュベートし、死細胞のシグナルを、BMG PolarStarを使用して測定した。ジギトニン(DMSO中20mg/mL)を、CytoTox−Gloバッファーで300μg/mLに希釈し、20μL量/ウェルを加え、完全な細胞溶解を容易にした。発光を、室温で15分間インキュベートした後で測定した。
HeLa細胞を、10,000細胞/ウェルの濃度で、DMEM+10%FBS、50μL量中に播種し、5%CO2において、37℃で一晩接着させた。コルヒチン(有糸分裂阻害剤)を、個々のプレートにおいて、DMEM+10%FBS中で1000nMから2倍連続希釈し、50μL量を加えた(最も高い最終用量は500nMである)。細胞を、化合物と共に24時間インキュベートした。CytoTox−Glo試薬を上記のように調製し、各ウェルに等量(100μL)/ウェルを加えた。15分間インキュベートした後で、死細胞のシグナルを回収した。ジギトニンを、AAF−Glo試薬を含むウェルに、30μg/mLになるように加えた。オービタルシェイカーを700RPMで使用してプレートを振とうして、均一性を確保した。得られた発光シグナルを、BMG Polarstarを使用して回収した。死細胞のシグナルを、ジギトニン処理したシグナルから差し引き、GraphPad Prismを使用して、死細胞のシグナルに対してプロットした(図6A)。実験を、パクリタキセルを使用して繰り返した(図6B)。
スタウロスポリン(多重機構のアポトーシス誘導因子)を、マイクロタイタープレートにおいて、50μL量で、RPMI 1640+10%FBS中で20μMから2倍連続希釈した。Jurkat細胞を、10,000細胞/ウェルになるように、50μL量を加えた。オービタルシェイカーを使用してプレートを短時間振とうし、次いで、37℃において、6時間インキュベートした。CytoTox−Glo試薬を、上記のように調製し、各ウェルに、等量(100μL)/ウェルを加えた。プレートを、室温で15分間インキュベートし、死細胞のシグナルを、BMG PolarStarを使用して測定した。ジギトニン(DMSO中20mg/mL)を、CytoTox−Gloバッファーで300μg/mLに希釈し、20μL量/ウェルを加え、完全な細胞溶解を容易にした。発光を、室温で15分間インキュベートした後で測定した。溶解後に得られた発光シグナルを、「生細胞」の寄与を反映させるために、初回の死細胞シグナルを差し引くことによって調整した(図7)。上記のデータを、死滅シグナル及び「生細胞」シグナル対イオノマイシンの濃度としてプロットした。生細胞及び死細胞は、同じ発光読み出しを使用すると逆相補的であった。このことはまた、別の毒素及び細胞死の機構形態を表す。
Jurkat細胞を、洗浄し、新鮮なRPMI 1640+10%FBS中で、50,000細胞/mLになるように調整した。プールを分割し、一方の分画は、穏やかな超音波処理により処理し、細胞毒性を引き起こし、他方の分画は、未処理で放置した。50μLの処理済み及び50μLの未処理を、同じ複製ウェル(最終100μL、5000細胞/ウェル 等量)に加え、50%生存細胞及び50%細胞毒性細胞である試料の集団を表した。対照ウェルには、50μLの未処理細胞及び50μLのRPMI 1640+10%FBS(最終100μL)を入れた。AAF−アミノルシフェリン基質を、50mMのMgSO4を含む100mMのHepesバッファー中で200μMに調製した。この基質/バッファー溶液の5.0mLを使用して、ルシフェリン検出試薬のケーキを再水和した。この試薬を、試料及び対照ウェルに、50μL/ウェルで加えた。発光を、BMG POLARstarで、動態モードにおいて25分間測定し、細胞毒性集団からのシグナルを回収した。プレートを取り外し、ジギトニンを試料及び対照ウェルの双方に、最終濃度が30μg/mLになるように、15μL量を加えた。700RPMで1分間、オービタルシェイカーで振とうすることによって混合した後で、プレートをPOLARstarに戻し、全細胞毒性による発光を、動態モードにおいて、さらに25分間測定した。
生存=全細胞毒性シグナル−初回細胞毒性シグナル
有効性試験期間の本アッセイの正確さ及び精密度を実証するために、Jurkat細胞を、3つの異なる反応条件に供した。
正確さを実証するために、イオノマイシンを、50μL量で、RPMI 1640+10%FBS中100μMから2倍連続希釈した。Jurkat細胞を、4ウェルで二重に、10,000細胞/ウェルで播種し、希釈したイオノマイシンと共に6時間インキュベートした。CytoTox−Glo試薬を上記のように調製し、各ウェルに等量(100μL)を加えた。細胞を、室温で15分間インキュベートし、死細胞のシグナルを、BMG Polarstarを使用して測定した。ジギトニン(DMSO中20mg/mL)を、CytoTox−Gloバッファーで300μg/mLに希釈し、20μL量/ウェルを加え、完全な細胞溶解を容易にした。発光を、室温で15分間インキュベートした後で測定した。
精密度を実証するために、異なる細胞数(5,000又は10,000)を使用したことを除いて、上記のような反応条件で二重試験を実施した。図9Bに見られるように、細胞数が異なるにもかかわらず、各二重試験に関するEC50値は同じであり、アッセイの精密度を実証している。
エポキソミシン
DU−145細胞を、5,000細胞/ウェルの濃度で、50μLのMEM+10%FBS中に播種し、一晩接着させた。エポキソミシン(プロテアソーム阻害剤)を、MEM+10%FBS中の5μMから連続希釈し、50μL量を加えた。細胞を、化合物と共に48時間インキュベートした。CytoTox−Glo試薬を上記のように調製し、各ウェルに等量(100μL)を加えた。15分間インキュベートした後で、死細胞のシグナルを測定した。ジギトニン(DMSO中20mg/mL)を、CytoTox−Gloバッファーで希釈し、20μL量を各ウェルに加え、完全な細胞溶解を容易にした。発光を、室温で15分間インキュベートした後で測定した。
本アッセイに由来する値が、他の細胞生存率測定に匹敵することを実証するために、このアッセイを、蛍光発光及び発光細胞生存率法と比較した。GF−AFCを、100mMのHEPES、pH7.5中で、200μMに希釈し、100μL量を、エポキソミシン処理DU−145細胞に加えた。37℃において30分間インキュベートした後で、蛍光発光を、BMG Polarstarを使用して測定した。発光細胞生存率測定のために、CellTiter−Glo(Promega)を、ケーキを、提供されたバッファーで再水和することによって調製し、100μL量を、エポキソミシン処理DU−145細胞を含む並行ウェルに加えた。オービタルシェイカーを使用してプレートを振とうし、均一性を確保した。室温で30分間インキュベートした後で、発光を、BMG Polarstarを使用して測定した。
本アッセイに由来する細胞毒性の値が、他の細胞毒性測定に匹敵することを実証するために、本アッセイを、蛍光発光細胞毒性法と比較した。CytoTox−ONE(商標)Homogenous Membrane Integrity Assay(これは、乳酸脱水素酵素(LDH)の放出を測定する)を、製造業者(Promega)のプロトコルに従って使用した。簡潔にいうと、CytoTox−ONE(商標)試薬を、基質混合物とアッセイ用バッファーとを混合することによって調製し、100μL量をエポキソミシン処理DU−145細胞に加えた。細胞を、室温で10分間インキュベートした。蛍光発光を、Labsystems Fluoroskan Ascentを使用して測定した。図10Cに見られるように、蛍光発光細胞毒性法に関して得られた値は、本アッセイから得られた値に匹敵した。
細胞生存率及び細胞毒性の二重測定が、誤った解釈を軽減することを実証するために、K562細胞を、5,000細胞/ウェルの濃度で、RPMI 1640+10%FBS、50μL量中に播種した。カンポテシン(Campothecin)を、RPMI 1640+10%FBS媒体中で、10μMから2倍連続希釈し、50μL量を加えた。細胞を、5%CO2において、37℃で24時間インキュベートした。CytoTox−Glo試薬を上記のように調製し、各ウェルに等量(100μL)を加えた。15分間インキュベートした後で、死細胞のシグナルを測定した。ジギトニン(DMSO中20mg/mL)を、CytoTox−Gloバッファーで希釈し、20μL量を各ウェルに加え、完全な細胞溶解を容易にした。発光を、室温で15分間インキュベートした後で測定した。
(参考文献)
Claims (17)
- 試料中の生細胞及び死細胞を検出する方法であって、
a)細胞を有する試料を、プロテアーゼに対する生物発光性の生存細胞不透過性基質及び生物発光アッセイ用の試薬と接触させ、その結果混合物を提供するステップであって、基質がルシフェリン誘導体であるステップと、
b)混合物中の発光を検出し、それによって試料中の死細胞の数又は存在を検出するステップと、
c)混合物中の細胞を溶解するステップと、
d)溶解混合物中の発光を検出し、それによって試料中の生細胞の数又は存在を検出するステップと、
を含む方法。 - 試料混合物中の生細胞及び死細胞を検出する方法であって、
a)細胞、プロテアーゼに対する生物発光性の生存細胞不透過性基質及び生物発光アッセイ用の試薬を含む試料混合物の発光を検出するステップであって、基質がルシフェリン誘導体であるステップと、
b)前記試料混合物中の細胞を溶解するステップと、
c)溶解細胞を含む試料混合物の発光を検出するステップと
を含む方法。 - 試料を、試薬より前に基質と接触させる、請求項1に記載の方法。
- 試料を、基質より前に試薬と接触させる、請求項1に記載の方法。
- 試料を、試薬及び基質と同時に接触させる、請求項1に記載の方法。
- 試料を、細胞死誘導剤を用いて処理する、請求項1から5までのいずれか一項に記載の方法。
- 生物発光性の生存細胞不透過性基質が、トリペプチジルペプチダーゼ、カルパイン又はキモトリプシンに対する基質である、請求項1から6までのいずれか一項に記載の方法。
- 試料が、哺乳動物細胞を含む、請求項1から7までのいずれか一項に記載の方法。
- 基質が、Ala−Ala−Phe−アミノルシフェリン又はZ−Leu−Leu−Val−Tyr−アミノルシフェリンである、請求項1から8までのいずれか一項に記載の方法。
- ルシフェリン誘導体がアミノルシフェリン誘導体である、請求項1から9までのいずれか一項に記載の方法。
- 基質が、甲虫ルシフェラーゼに対するプロ基質である、請求項1から10までのいずれか一項に記載の方法。
- プロテアーゼ以外の分子の存在又は量を検出するステップをさらに含む、請求項1から11までのいずれか一項に記載の方法。
- 細胞を、界面活性剤を用いて溶解する、請求項1から12までのいずれか一項に記載の方法。
- 試料が生理学的試料である、請求項1から13までのいずれか一項に記載の方法。
- プロテアーゼがエンドプロテアーゼである、請求項1から14までのいずれか一項に記載の方法。
- プロテアーゼがエキソプロテアーゼである、請求項1から14までのいずれか一項に記載の方法。
- プロテアーゼに対する基質が15残基以下のペプチドである、請求項1から8まで及び10から16までのいずれか一項に記載の方法。
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