JP5374493B2 - 発光による生細胞及び死細胞のアッセイ - Google Patents
発光による生細胞及び死細胞のアッセイ Download PDFInfo
- Publication number
- JP5374493B2 JP5374493B2 JP2010503075A JP2010503075A JP5374493B2 JP 5374493 B2 JP5374493 B2 JP 5374493B2 JP 2010503075 A JP2010503075 A JP 2010503075A JP 2010503075 A JP2010503075 A JP 2010503075A JP 5374493 B2 JP5374493 B2 JP 5374493B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- substrate
- sample
- protease
- cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 238000010872 live dead assay kit Methods 0.000 title description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 194
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims description 91
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims description 91
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 90
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 claims description 75
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 claims description 60
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 57
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 claims description 48
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 46
- IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N D-Luciferin Chemical class OC(=O)[C@H]1CSC(C=2SC3=CC=C(O)C=C3N=2)=N1 IGXWBGJHJZYPQS-SSDOTTSWSA-N 0.000 claims description 45
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 15
- HKSJKXOOBAVPKR-SSDOTTSWSA-N (4s)-2-(6-amino-1,3-benzothiazol-2-yl)-4,5-dihydro-1,3-thiazole-4-carboxylic acid Chemical class S1C2=CC(N)=CC=C2N=C1C1=N[C@@H](C(O)=O)CS1 HKSJKXOOBAVPKR-SSDOTTSWSA-N 0.000 claims description 14
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 12
- 238000005415 bioluminescence Methods 0.000 claims description 7
- 230000029918 bioluminescence Effects 0.000 claims description 7
- 230000030833 cell death Effects 0.000 claims description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 102000018389 Exopeptidases Human genes 0.000 claims description 3
- 108010091443 Exopeptidases Proteins 0.000 claims description 3
- 101710118538 Protease Proteins 0.000 claims description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 claims description 3
- 102000007590 Calpain Human genes 0.000 claims description 2
- 108010032088 Calpain Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 claims description 2
- 241000254173 Coleoptera Species 0.000 claims description 2
- 102000003779 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000194 Dipeptidyl-peptidases and tripeptidyl-peptidases Proteins 0.000 claims description 2
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 claims description 2
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 claims 6
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 claims 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 claims 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 85
- -1 dihydroluciferin Chemical compound 0.000 description 71
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 53
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 51
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 40
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 36
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 36
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 32
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 125000000623 heterocyclic group Chemical group 0.000 description 24
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 23
- IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N (S)-colchicine Chemical compound C1([C@@H](NC(C)=O)CC2)=CC(=O)C(OC)=CC=C1C1=C2C=C(OC)C(OC)=C1OC IAKHMKGGTNLKSZ-INIZCTEOSA-N 0.000 description 22
- QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N Digitonin Natural products CC1CCC2(OC1)OC3C(O)C4C5CCC6CC(OC7OC(CO)C(OC8OC(CO)C(O)C(OC9OCC(O)C(O)C9OC%10OC(CO)C(O)C(OC%11OC(CO)C(O)C(O)C%11O)C%10O)C8O)C(O)C7O)C(O)CC6(C)C5CCC4(C)C3C2C QRLVDLBMBULFAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 21
- UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N digitonin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H]([C@]2(CC[C@@H]3[C@@]4(C)C[C@@H](O)[C@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO7)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O6)O[C@H]6[C@@H]([C@@H](O[C@H]7[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O7)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O6)O)[C@@H](CO)O5)O)C[C@@H]4CC[C@H]3[C@@H]2[C@@H]1O)C)[C@@H]1C)[C@]11CC[C@@H](C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-KUAJCENISA-N 0.000 description 21
- UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N digitonine Natural products CC1C(C2(CCC3C4(C)CC(O)C(OC5C(C(O)C(OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)CO7)O)C(O)C(CO)O6)OC6C(C(OC7C(C(O)C(O)C(CO)O7)O)C(O)C(CO)O6)O)C(CO)O5)O)CC4CCC3C2C2O)C)C2OC11CCC(C)CO1 UVYVLBIGDKGWPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 21
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 21
- 125000001072 heteroaryl group Chemical group 0.000 description 19
- CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N Dehydro-luciferin Natural products OC(=O)C1=CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 CYCGRDQQIOGCKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 18
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 18
- BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N Fivefly Luciferin Natural products OC(=O)C1CSC(C=2SC3=CC(O)=CC=C3N=2)=N1 BJGNCJDXODQBOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N Luciferin Natural products CCc1c(C)c(CC2NC(=O)C(=C2C=C)C)[nH]c1Cc3[nH]c4C(=C5/NC(CC(=O)O)C(C)C5CC(=O)O)CC(=O)c4c3C DDWFXDSYGUXRAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 18
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 18
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 18
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 18
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 18
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 17
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 description 14
- 125000000304 alkynyl group Chemical group 0.000 description 14
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 14
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 14
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 14
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 14
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 14
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 13
- 125000003342 alkenyl group Chemical group 0.000 description 12
- 125000005843 halogen group Chemical group 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 229930012538 Paclitaxel Natural products 0.000 description 11
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 11
- 229960001338 colchicine Drugs 0.000 description 11
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 11
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 229960001592 paclitaxel Drugs 0.000 description 11
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 11
- RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N taxol Chemical compound O([C@@H]1[C@@]2(C[C@@H](C(C)=C(C2(C)C)[C@H](C([C@]2(C)[C@@H](O)C[C@H]3OC[C@]3([C@H]21)OC(C)=O)=O)OC(=O)C)OC(=O)[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C=1C=CC=CC=1)C=1C=CC=CC=1)O)C(=O)C1=CC=CC=C1 RCINICONZNJXQF-MZXODVADSA-N 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 125000003282 alkyl amino group Chemical group 0.000 description 10
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 10
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 10
- 125000006413 ring segment Chemical group 0.000 description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 9
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 9
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 9
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 9
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 9
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 9
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 8
- 125000004169 (C1-C6) alkyl group Chemical group 0.000 description 7
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 7
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 7
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 7
- 108700002672 epoxomicin Proteins 0.000 description 7
- DOGIDQKFVLKMLQ-JTHVHQAWSA-N epoxomicin Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N(C)C(C)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)[C@@]1(C)CO1 DOGIDQKFVLKMLQ-JTHVHQAWSA-N 0.000 description 7
- 125000001188 haloalkyl group Chemical group 0.000 description 7
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 7
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000003358 C2-C20 alkenyl group Chemical group 0.000 description 6
- UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N Naphthalene Chemical compound C1=CC=CC2=CC=CC=C21 UFWIBTONFRDIAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N Nocodazole Chemical compound C1=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=CC=C1C(=O)C1=CC=CS1 KYRVNWMVYQXFEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N Pyrrolidine Chemical compound C1CCNC1 RWRDLPDLKQPQOW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N Thiazole Chemical group C1=CSC=N1 FZWLAAWBMGSTSO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N actinomycin D Natural products CC1OC(=O)C(C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)C2CCCN2C(=O)C(C(C)C)NC(=O)C1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)NC4C(=O)NC(C(N5CCCC5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)C(C(C)C)C(=O)OC4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 125000006323 alkenyl amino group Chemical group 0.000 description 6
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 description 6
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 6
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 6
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 6
- 229950006344 nocodazole Drugs 0.000 description 6
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 6
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 125000004423 acyloxy group Chemical group 0.000 description 5
- 125000006319 alkynyl amino group Chemical group 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 5
- 238000012054 celltiter-glo Methods 0.000 description 5
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 5
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 5
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 5
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 5
- 229910052731 fluorine Inorganic materials 0.000 description 5
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 5
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 125000006651 (C3-C20) cycloalkyl group Chemical group 0.000 description 4
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108090000331 Firefly luciferases Proteins 0.000 description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N Morpholine Chemical compound C1COCCN1 YNAVUWVOSKDBBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001204 N-oxides Chemical class 0.000 description 4
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Thiophene Chemical group C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 4
- 125000004414 alkyl thio group Chemical group 0.000 description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 125000005110 aryl thio group Chemical group 0.000 description 4
- 125000002619 bicyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 4
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 4
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 4
- 125000002950 monocyclic group Chemical group 0.000 description 4
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 4
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 125000000020 sulfo group Chemical group O=S(=O)([*])O[H] 0.000 description 4
- 125000001544 thienyl group Chemical group 0.000 description 4
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 4
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 4
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 4
- 125000002023 trifluoromethyl group Chemical group FC(F)(F)* 0.000 description 4
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 3
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N Furan Chemical group C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N Indole Chemical compound C1=CC=C2NC=CC2=C1 SIKJAQJRHWYJAI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 3
- 229940121849 Mitotic inhibitor Drugs 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N actinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=CC=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 RJURFGZVJUQBHK-IIXSONLDSA-N 0.000 description 3
- 125000004448 alkyl carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000005157 alkyl carboxy group Chemical group 0.000 description 3
- 125000005332 alkyl sulfoxy group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 125000005605 benzo group Chemical group 0.000 description 3
- 239000003710 calcium ionophore Substances 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 3
- HGCIXCUEYOPUTN-UHFFFAOYSA-N cyclohexene Chemical compound C1CCC=CC1 HGCIXCUEYOPUTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960000640 dactinomycin Drugs 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N ent-staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CJAONIOAQZUHPN-KKLWWLSJSA-N ethyl 12-[[2-[(2r,3r)-3-[2-[(12-ethoxy-12-oxododecyl)-methylamino]-2-oxoethoxy]butan-2-yl]oxyacetyl]-methylamino]dodecanoate Chemical compound CCOC(=O)CCCCCCCCCCCN(C)C(=O)CO[C@H](C)[C@@H](C)OCC(=O)N(C)CCCCCCCCCCCC(=O)OCC CJAONIOAQZUHPN-KKLWWLSJSA-N 0.000 description 3
- 125000002541 furyl group Chemical group 0.000 description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 150000002367 halogens Chemical group 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Chemical group C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000002632 imidazolidinyl group Chemical group 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 125000000842 isoxazolyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 3
- 125000001434 methanylylidene group Chemical group [H]C#[*] 0.000 description 3
- 125000004934 phenanthridinyl group Chemical group C1(=CC=CC2=NC=C3C=CC=CC3=C12)* 0.000 description 3
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 125000003373 pyrazinyl group Chemical group 0.000 description 3
- 125000002943 quinolinyl group Chemical group N1=C(C=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 3
- HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N staurosporine Chemical compound C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1[C@H]1C[C@@H](NC)[C@@H](OC)[C@]4(C)O1 HKSZLNNOFSGOKW-FYTWVXJKSA-N 0.000 description 3
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 125000003837 (C1-C20) alkyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004191 (C1-C6) alkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- LOZWAPSEEHRYPG-UHFFFAOYSA-N 1,4-dithiane Chemical compound C1CSCCS1 LOZWAPSEEHRYPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MCGBIXXDQFWVDW-UHFFFAOYSA-N 4,5-dihydro-1h-pyrazole Chemical compound C1CC=NN1 MCGBIXXDQFWVDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 9H-carbazole Chemical compound C1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 UJOBWOGCFQCDNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 2
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N Fluorine Chemical compound FF PXGOKWXKJXAPGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 2
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N N-benzoylglycine Chemical compound OC(=O)CNC(=O)C1=CC=CC=C1 QIAFMBKCNZACKA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000254064 Photinus pyralis Species 0.000 description 2
- GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N Piperazine Chemical compound C1CNCCN1 GLUUGHFHXGJENI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940079156 Proteasome inhibitor Drugs 0.000 description 2
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N Pyridine Chemical compound C1=CC=NC=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001427617 Pyrophorus Species 0.000 description 2
- KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N Pyrrole Chemical group C=1C=CNC=1 KAESVJOAVNADME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010052090 Renilla Luciferases Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical group C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000641 acridinyl group Chemical group C1(=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3C=C12)* 0.000 description 2
- 125000004442 acylamino group Chemical group 0.000 description 2
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000001340 alkali metals Chemical class 0.000 description 2
- 125000003302 alkenyloxy group Chemical group 0.000 description 2
- 150000004703 alkoxides Chemical class 0.000 description 2
- 125000005600 alkyl phosphonate group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004644 alkyl sulfinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004390 alkyl sulfonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002947 alkylene group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005133 alkynyloxy group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 2
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 2
- MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N anthracene Chemical compound C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3C=C21 MWPLVEDNUUSJAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000005135 aryl sulfinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004391 aryl sulfonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000000609 carbazolyl group Chemical group C1(=CC=CC=2C3=CC=CC=C3NC12)* 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000025084 cell cycle arrest Effects 0.000 description 2
- YGBFLZPYDUKSPT-MRVPVSSYSA-N cephalosporanic acid Chemical group S1CC(COC(=O)C)=C(C(O)=O)N2C(=O)C[C@H]21 YGBFLZPYDUKSPT-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000003016 chromanyl group Chemical group O1C(CCC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 2
- 125000004230 chromenyl group Chemical group O1C(C=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 2
- 125000000259 cinnolinyl group Chemical group N1=NC(=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 2
- 125000004093 cyano group Chemical group *C#N 0.000 description 2
- 125000000000 cycloalkoxy group Chemical group 0.000 description 2
- 125000001995 cyclobutyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 2
- MGNZXYYWBUKAII-UHFFFAOYSA-N cyclohexa-1,3-diene Chemical compound C1CC=CC=C1 MGNZXYYWBUKAII-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001511 cyclopentyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C1([H])[H] 0.000 description 2
- 125000001559 cyclopropyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C1([H])* 0.000 description 2
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000004663 dialkyl amino group Chemical group 0.000 description 2
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N diphenyl Chemical compound C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 2
- 239000011737 fluorine Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 125000003838 furazanyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005223 heteroarylcarbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000005143 heteroarylsulfonyl group Chemical group 0.000 description 2
- OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-N hydroperoxyl Chemical group O[O] OUUQCZGPVNCOIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003406 indolizinyl group Chemical group C=1(C=CN2C=CC=CC12)* 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000001977 isobenzofuranyl group Chemical group C=1(OC=C2C=CC=CC12)* 0.000 description 2
- 125000004594 isoindolinyl group Chemical group C1(NCC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 2
- 125000000904 isoindolyl group Chemical group C=1(NC=C2C=CC=CC12)* 0.000 description 2
- AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N isoquinoline Chemical group C1=NC=CC2=CC=CC=C21 AWJUIBRHMBBTKR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001786 isothiazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004593 naphthyridinyl group Chemical group N1=C(C=CC2=CC=CN=C12)* 0.000 description 2
- 125000000449 nitro group Chemical group [O-][N+](*)=O 0.000 description 2
- 125000002971 oxazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 125000001791 phenazinyl group Chemical group C1(=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C12)* 0.000 description 2
- 125000001484 phenothiazinyl group Chemical group C1(=CC=CC=2SC3=CC=CC=C3NC12)* 0.000 description 2
- 125000001644 phenoxazinyl group Chemical group C1(=CC=CC=2OC3=CC=CC=C3NC12)* 0.000 description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 125000004592 phthalazinyl group Chemical group C1(=NN=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 2
- 125000005936 piperidyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 239000003207 proteasome inhibitor Substances 0.000 description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 125000000561 purinyl group Chemical group N1=C(N=C2N=CNC2=C1)* 0.000 description 2
- 125000004309 pyranyl group Chemical group O1C(C=CC=C1)* 0.000 description 2
- 125000003226 pyrazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000002098 pyridazinyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000168 pyrrolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 125000002294 quinazolinyl group Chemical group N1=C(N=CC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 2
- 125000001567 quinoxalinyl group Chemical group N1=C(C=NC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N sarcosine Chemical compound C[NH2+]CC([O-])=O FSYKKLYZXJSNPZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 2
- CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N staurosporine Natural products C12=C3N4C5=CC=CC=C5C3=C3CNC(=O)C3=C2C2=CC=CC=C2N1C1CC(NC)C(OC)C4(OC)O1 CGPUWJWCVCFERF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003507 tetrahydrothiofenyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000335 thiazolyl group Chemical group 0.000 description 2
- 125000000464 thioxo group Chemical group S=* 0.000 description 2
- CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N trichlorofluoromethane Chemical compound FC(Cl)(Cl)Cl CYRMSUTZVYGINF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001834 xanthenyl group Chemical group C1=CC=CC=2OC3=CC=CC=C3C(C12)* 0.000 description 2
- AIFRHYZBTHREPW-UHFFFAOYSA-N β-carboline Chemical compound N1=CC=C2C3=CC=CC=C3NC2=C1 AIFRHYZBTHREPW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000004933 β-carbolinyl group Chemical group C1(=NC=CC=2C3=CC=CC=C3NC12)* 0.000 description 2
- LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N (2s,3s,4r,5r,6r)-5-amino-2-(aminomethyl)-6-[(2r,3s,4r,5s)-5-[(1r,2r,3s,5r,6s)-3,5-diamino-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-hydroxycyclohexyl]oxy-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl]oxyoxane-3,4-diol;sulfuric ac Chemical compound OS(O)(=O)=O.N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](N)C[C@@H](N)[C@@H]2O)O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)N)O[C@@H]1CO LJRDOKAZOAKLDU-UDXJMMFXSA-N 0.000 description 1
- 125000004642 (C1-C12) alkoxy group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004400 (C1-C12) alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003161 (C1-C6) alkylene group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006728 (C1-C6) alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006649 (C2-C20) alkynyl group Chemical group 0.000 description 1
- BWKMGYQJPOAASG-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4-tetrahydroisoquinoline-3-carboxylic acid Chemical compound C1=CC=C2CNC(C(=O)O)CC2=C1 BWKMGYQJPOAASG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNXJIVFYUVYPPR-UHFFFAOYSA-N 1,3-dioxolane Chemical compound C1COCO1 WNXJIVFYUVYPPR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004972 1-butynyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C#C* 0.000 description 1
- RQEUFEKYXDPUSK-UHFFFAOYSA-N 1-phenylethylamine Chemical class CC(N)C1=CC=CC=C1 RQEUFEKYXDPUSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000530 1-propynyl group Chemical group [H]C([H])([H])C#C* 0.000 description 1
- 125000001462 1-pyrrolyl group Chemical group [*]N1C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- BAXOFTOLAUCFNW-UHFFFAOYSA-N 1H-indazole Chemical compound C1=CC=C2C=NNC2=C1 BAXOFTOLAUCFNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005955 1H-indazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- KEQTWHPMSVAFDA-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydro-1h-pyrazole Chemical compound C1NNC=C1 KEQTWHPMSVAFDA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HBEDSQVIWPRPAY-UHFFFAOYSA-N 2,3-dihydrobenzofuran Chemical compound C1=CC=C2OCCC2=C1 HBEDSQVIWPRPAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FFMBYMANYCDCMK-UHFFFAOYSA-N 2,5-dihydro-1h-imidazole Chemical class C1NCN=C1 FFMBYMANYCDCMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TXHAHOVNFDVCCC-UHFFFAOYSA-N 2-(tert-butylazaniumyl)acetate Chemical compound CC(C)(C)NCC(O)=O TXHAHOVNFDVCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoisobutyric acid Chemical compound CC(C)(N)C(O)=O FUOOLUPWFVMBKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000069 2-butynyl group Chemical group [H]C([H])([H])C#CC([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004398 2-methyl-2-butyl group Chemical group CC(C)(CC)* 0.000 description 1
- 125000004918 2-methyl-2-pentyl group Chemical group CC(C)(CCC)* 0.000 description 1
- 125000004922 2-methyl-3-pentyl group Chemical group CC(C)C(CC)* 0.000 description 1
- 125000004493 2-methylbut-1-yl group Chemical group CC(C*)CC 0.000 description 1
- 125000003903 2-propenyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001494 2-propynyl group Chemical group [H]C#CC([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004105 2-pyridyl group Chemical group N1=C([*])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- RSEBUVRVKCANEP-UHFFFAOYSA-N 2-pyrroline Chemical compound C1CC=CN1 RSEBUVRVKCANEP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000004065 2-pyrrolines Chemical class 0.000 description 1
- VHMICKWLTGFITH-UHFFFAOYSA-N 2H-isoindole Chemical compound C1=CC=CC2=CNC=C21 VHMICKWLTGFITH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MGADZUXDNSDTHW-UHFFFAOYSA-N 2H-pyran Chemical compound C1OC=CC=C1 MGADZUXDNSDTHW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RMXVNDUWESWVKI-UHFFFAOYSA-N 3-(1-adamantyl)dioxetane Chemical compound C1OOC1C1(C2)CC(C3)CC2CC3C1 RMXVNDUWESWVKI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000474 3-butynyl group Chemical group [H]C#CC([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- BXRLWGXPSRYJDZ-UHFFFAOYSA-N 3-cyanoalanine Chemical compound OC(=O)C(N)CC#N BXRLWGXPSRYJDZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004917 3-methyl-2-butyl group Chemical group CC(C(C)*)C 0.000 description 1
- 125000004919 3-methyl-2-pentyl group Chemical group CC(C(C)*)CC 0.000 description 1
- 125000004921 3-methyl-3-pentyl group Chemical group CC(CC)(CC)* 0.000 description 1
- 125000003349 3-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 150000004066 3-pyrrolines Chemical class 0.000 description 1
- ZURRKVIQUKNLHF-UHFFFAOYSA-N 4,7,7-trimethylbicyclo[2.2.1]heptane-3-carboxylic acid Chemical compound C1CC2(C)C(C(O)=O)CC1C2(C)C ZURRKVIQUKNLHF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004920 4-methyl-2-pentyl group Chemical group CC(CC(C)*)C 0.000 description 1
- 125000005986 4-piperidonyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000339 4-pyridyl group Chemical group N1=C([H])C([H])=C([*])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- KDDQRKBRJSGMQE-UHFFFAOYSA-N 4-thiazolyl Chemical group [C]1=CSC=N1 KDDQRKBRJSGMQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MRUWJENAYHTDQG-UHFFFAOYSA-N 4H-pyran Chemical compound C1C=COC=C1 MRUWJENAYHTDQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006043 5-hexenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004938 5-pyridyl group Chemical group N1=CC=CC(=C1)* 0.000 description 1
- CWDWFSXUQODZGW-UHFFFAOYSA-N 5-thiazolyl Chemical group [C]1=CN=CS1 CWDWFSXUQODZGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004939 6-pyridyl group Chemical group N1=CC=CC=C1* 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 108010000239 Aequorin Proteins 0.000 description 1
- 241000059559 Agriotes sordidus Species 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical group [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004399 C1-C4 alkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 1
- 108090000567 Caspase 7 Proteins 0.000 description 1
- 102100029855 Caspase-3 Human genes 0.000 description 1
- 102100038902 Caspase-7 Human genes 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010069514 Cyclic Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000001189 Cyclic Peptides Human genes 0.000 description 1
- MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N Dioxygen Chemical compound O=O MYMOFIZGZYHOMD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 description 1
- SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N Dodecane Natural products CCCCCCCCCCCC SNRUBQQJIBEYMU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N Hydroxylamine Chemical compound ON AVXURJPOCDRRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 229930194542 Keto Natural products 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N L-citrulline Chemical compound NC(=O)NCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O RHGKLRLOHDJJDR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- DGYHPLMPMRKMPD-UHFFFAOYSA-N L-propargyl glycine Natural products OC(=O)C(N)CC#C DGYHPLMPMRKMPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N Ndelta-carbamoyl-DL-ornithine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=O RHGKLRLOHDJJDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N Phenazine Natural products C1=CC=CC2=NC3=CC=CC=C3N=C21 PCNDJXKNXGMECE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001148064 Photorhabdus luminescens Species 0.000 description 1
- 241000737257 Pteris <genus> Species 0.000 description 1
- KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N Pyrazine Natural products C1=CN=CC=N1 KYQCOXFCLRTKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N Pyrazole Chemical group C=1C=NNC=1 WTKZEGDFNFYCGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000242739 Renilla Species 0.000 description 1
- 241000242743 Renilla reniformis Species 0.000 description 1
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 1
- 108010077895 Sarcosine Proteins 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000607598 Vibrio Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000007825 activation reagent Substances 0.000 description 1
- HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N alpha-acetylene Natural products C#C HSFWRNGVRCDJHI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N anhydrous quinoline Natural products N1=CC=CC2=CC=CC=C21 SMWDFEZZVXVKRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000005428 anthryl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C2C([H])=C3C(*)=C([H])C([H])=C([H])C3=C([H])C2=C1[H] 0.000 description 1
- 229940034982 antineoplastic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003972 antineoplastic antibiotic Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 125000002029 aromatic hydrocarbon group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005361 aryl sulfoxide group Chemical group 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001539 azetidines Chemical class 0.000 description 1
- 125000002393 azetidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001541 aziridines Chemical class 0.000 description 1
- 125000004069 aziridinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004603 benzisoxazolyl group Chemical group O1N=C(C2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000001164 benzothiazolyl group Chemical group S1C(=NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000003354 benzotriazolyl group Chemical group N1N=NC2=C1C=CC=C2* 0.000 description 1
- 125000004541 benzoxazolyl group Chemical group O1C(=NC2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 108010075458 benzyloxycarbonyl-aspartyl-glutamyl-valyl-aspartyl-aminoluciferin Proteins 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- 238000007068 beta-elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 125000002618 bicyclic heterocycle group Chemical group 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 description 1
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001246 bromo group Chemical group Br* 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011203 carbon fibre reinforced carbon Substances 0.000 description 1
- 125000004181 carboxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 1
- 210000004671 cell-free system Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 125000001309 chloro group Chemical group Cl* 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 229960002173 citrulline Drugs 0.000 description 1
- 235000013477 citrulline Nutrition 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 230000001010 compromised effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 125000006165 cyclic alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000392 cycloalkenyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006310 cycloalkyl amino group Chemical group 0.000 description 1
- UVJHQYIOXKWHFD-UHFFFAOYSA-N cyclohexa-1,4-diene Chemical compound C1C=CCC=C1 UVJHQYIOXKWHFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000640 cyclooctyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000002433 cyclopentenyl group Chemical group C1(=CCCC1)* 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002784 cytotoxicity assay Methods 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 125000004856 decahydroquinolinyl group Chemical group N1(CCCC2CCCCC12)* 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 125000002704 decyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- UZVGSSNIUNSOFA-UHFFFAOYSA-N dibenzofuran-1-carboxylic acid Chemical compound O1C2=CC=CC=C2C2=C1C=CC=C2C(=O)O UZVGSSNIUNSOFA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004925 dihydropyridyl group Chemical group N1(CC=CC=C1)* 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003438 dodecyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 125000003983 fluorenyl group Chemical group C1(=CC=CC=2C3=CC=CC=C3CC12)* 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000003269 fluorescent indicator Substances 0.000 description 1
- 125000001153 fluoro group Chemical group F* 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 125000005150 heteroarylsulfinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004051 hexyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002768 hydroxyalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 150000002461 imidazolidines Chemical class 0.000 description 1
- MTNDZQHUAFNZQY-UHFFFAOYSA-N imidazoline Chemical class C1CN=CN1 MTNDZQHUAFNZQY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002636 imidazolinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002466 imines Chemical class 0.000 description 1
- 125000001841 imino group Chemical group [H]N=* 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 125000003453 indazolyl group Chemical group N1N=C(C2=C1C=CC=C2)* 0.000 description 1
- PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N indole Natural products CC1=CC=CC2=C1C=CN2 PZOUSPYUWWUPPK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N indolenine Natural products C1=CC=C2CC=NC2=C1 RKJUIXBNRJVNHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003387 indolinyl group Chemical group N1(CCC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 125000001041 indolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 125000002346 iodo group Chemical group I* 0.000 description 1
- 125000000959 isobutyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000003384 isochromanyl group Chemical group C1(OCCC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- GWVMLCQWXVFZCN-UHFFFAOYSA-N isoindoline Chemical compound C1=CC=C2CNCC2=C1 GWVMLCQWXVFZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005956 isoquinolyl group Chemical group 0.000 description 1
- ZLTPDFXIESTBQG-UHFFFAOYSA-N isothiazole Chemical group C=1C=NSC=1 ZLTPDFXIESTBQG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003125 jurkat cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000007422 luminescence assay Methods 0.000 description 1
- 238000000504 luminescence detection Methods 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 125000001570 methylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])[*:2] 0.000 description 1
- 125000001620 monocyclic carbocycle group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000001280 n-hexyl group Chemical group C(CCCCC)* 0.000 description 1
- 125000000740 n-pentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 125000004123 n-propyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 108010089433 obelin Proteins 0.000 description 1
- CQYBNXGHMBNGCG-RNJXMRFFSA-N octahydroindole-2-carboxylic acid Chemical compound C1CCC[C@H]2N[C@H](C(=O)O)C[C@@H]21 CQYBNXGHMBNGCG-RNJXMRFFSA-N 0.000 description 1
- 125000004930 octahydroisoquinolinyl group Chemical group C1(NCCC2CCCC=C12)* 0.000 description 1
- 125000002347 octyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 125000000160 oxazolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 125000004095 oxindolyl group Chemical group N1(C(CC2=CC=CC=C12)=O)* 0.000 description 1
- 125000004043 oxo group Chemical group O=* 0.000 description 1
- 229960001639 penicillamine Drugs 0.000 description 1
- 125000003538 pentan-3-yl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005010 perfluoroalkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000005327 perimidinyl group Chemical group N1C(=NC2=CC=CC3=CC=CC1=C23)* 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 125000004625 phenanthrolinyl group Chemical group N1=C(C=CC2=CC=C3C=CC=NC3=C12)* 0.000 description 1
- 125000005954 phenoxathiinyl group Chemical group 0.000 description 1
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N phosphothreonine Chemical compound OP(=O)(O)O[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O USRGIUJOYOXOQJ-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N phosphotyrosine Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CC=C(OP(O)(O)=O)C=C1 DCWXELXMIBXGTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 125000004193 piperazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000587 piperidin-1-yl group Chemical group [H]C1([H])N(*)C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- 125000003386 piperidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 125000003367 polycyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000004844 protein turnover Effects 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001042 pteridinyl group Chemical group N1=C(N=CC2=NC=CN=C12)* 0.000 description 1
- 125000004307 pyrazin-2-yl group Chemical group [H]C1=C([H])N=C(*)C([H])=N1 0.000 description 1
- 125000004944 pyrazin-3-yl group Chemical group [H]C1=C([H])N=C(*)C([H])=N1 0.000 description 1
- 150000003217 pyrazoles Chemical class 0.000 description 1
- USPWKWBDZOARPV-UHFFFAOYSA-N pyrazolidine Chemical compound C1CNNC1 USPWKWBDZOARPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003072 pyrazolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- DNXIASIHZYFFRO-UHFFFAOYSA-N pyrazoline Chemical compound C1CN=NC1 DNXIASIHZYFFRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002755 pyrazolinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000002206 pyridazin-3-yl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)N=N1 0.000 description 1
- 125000004940 pyridazin-4-yl group Chemical group N1=NC=C(C=C1)* 0.000 description 1
- 125000004941 pyridazin-5-yl group Chemical group N1=NC=CC(=C1)* 0.000 description 1
- 125000004942 pyridazin-6-yl group Chemical group N1=NC=CC=C1* 0.000 description 1
- PBMFSQRYOILNGV-UHFFFAOYSA-N pyridazine Chemical compound C1=CC=NN=C1 PBMFSQRYOILNGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N pyridine Natural products COC1=CC=CN=C1 UMJSCPRVCHMLSP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004076 pyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000246 pyrimidin-2-yl group Chemical group [H]C1=NC(*)=NC([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000004943 pyrimidin-6-yl group Chemical group N1=CN=CC=C1* 0.000 description 1
- 150000003233 pyrroles Chemical class 0.000 description 1
- 150000003235 pyrrolidines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000719 pyrrolidinyl group Chemical group 0.000 description 1
- ZVJHJDDKYZXRJI-UHFFFAOYSA-N pyrroline Natural products C1CC=NC1 ZVJHJDDKYZXRJI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001422 pyrrolinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 125000005493 quinolyl group Chemical group 0.000 description 1
- SBYHFKPVCBCYGV-UHFFFAOYSA-N quinuclidine Chemical compound C1CC2CCN1CC2 SBYHFKPVCBCYGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004621 quinuclidinyl group Chemical group N12C(CC(CC1)CC2)* 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000006049 ring expansion reaction Methods 0.000 description 1
- 229940043230 sarcosine Drugs 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 125000002914 sec-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000003530 single readout Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000446 sulfanediyl group Chemical group *S* 0.000 description 1
- 125000000475 sulfinyl group Chemical group [*:2]S([*:1])=O 0.000 description 1
- 125000000472 sulfonyl group Chemical group *S(*)(=O)=O 0.000 description 1
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 description 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000003718 tetrahydrofuranyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003039 tetrahydroisoquinolinyl group Chemical group C1(NCCC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 125000004853 tetrahydropyridinyl group Chemical group N1(CCCC=C1)* 0.000 description 1
- 125000005942 tetrahydropyridyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000000147 tetrahydroquinolinyl group Chemical group N1(CCCC2=CC=CC=C12)* 0.000 description 1
- 125000000383 tetramethylene group Chemical group [H]C([H])([*:1])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[*:2] 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001113 thiadiazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000004627 thianthrenyl group Chemical group C1(=CC=CC=2SC3=CC=CC=C3SC12)* 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical class [H]S* 0.000 description 1
- BRNULMACUQOKMR-UHFFFAOYSA-N thiomorpholine Chemical compound C1CSCCN1 BRNULMACUQOKMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930192474 thiophene Chemical group 0.000 description 1
- 230000036962 time dependent Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004306 triazinyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000001425 triazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 125000006168 tricyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 229930195735 unsaturated hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/66—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving luciferase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
本明細書において使用する場合、以下の用語及び表現は指示された意味を有する。本発明の化合物が非対称に置換炭素原子を含み、光学活性体又はラセミ体に単離され得ることは理解されるであろう。ラセミ体の分離による、又は光学活性出発物質からの合成によるような、光学活性体の調製法は当分野において周知である。構造のすべてのキラル型、ジアステレオマー型、ラセミ体及びすべての幾何異性体は本発明の一部である。
本発明の方法は、細胞膜の透過性及び完全性に関与するタンパク質分解活性に基づく。本方法の有利性は、アッセイの読み出しの感度、容易さ及び柔軟性を含む。生存率の測定は、生物発光プロテアーゼ基質、及び細胞膜の完全性が損なわれない限り細胞から放出されないが細胞外環境において活性である細胞内プロテアーゼ、例えば偏在する保存された細胞内プロテアーゼの相対的不透過性に基づく。この実施形態において有用な基質は、N−末端又はC−末端においてブロックされる基質を含む、エキソプロテアーゼ又はエンドプロテアーゼに対する基質を含む。実質的な細胞不透過性プロテアーゼ基質は、死細胞に関するアッセイにおいてエンドポイントを測定するために一般的に用いられる期間、例えば、プロテアーゼ基質を試料に加えた後、5、4、3、2又は1.5時間未満或いは5、15、30、60又は120分を超える時間において、生存細胞において検出不可能な基質である。一実施形態において、生物発光性の実質的な細胞不透過性基質は、アミノ酸或いはジペプチド又はトリペプチドの基質を含む。一実施形態において、生物発光性の細胞不透過性基質は、トリペプチジルペプチダーゼ、カルパイン又はキモトリプシンに対する基質並びにルシフェリンに対するプロ基質である。
表2
本発明の誘導体の範囲内にあるルシフェリンの修飾は、1つ又は複数の環原子の置換、1つ又は複数の、環原子に結合した置換基(原子又は基)の1つ又は複数の置換、及び/又は環に対する1つ又は複数の原子の付加、例えば、環の拡大又は付加或いはそれらの組合せが含まれ、これらの修飾の少なくとも1つはプロテアーゼ基質を含む。天然のホタルルシフェリンは、3つの連結した環、6位にOH基を有する6員の「ベンゾ」環(以下「環A」又は「A環」)、6員のベンゾ環に縮合した5員のチアゾール環(以下、「環B」又は「B環」)及び5位においてカルボキシル基で修飾された5員のチアゾール環(以下「環C」又は「C環」)を有する。
[式中、
Yは、N、N−オキシド、N−(C1〜C6)アルキル又はCHであり、
Xは、S、O、CH=CH、N=CH又はCH=Nであり、
Z及びZ’は、独立してH、R、OR、SR、NHR又はNRRであり、
Z”は、O、S、NH、NHR、N=Nであり、
Qは、カルボニル、CH2又は直接結合であり、
W1は、H、ハロ、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、ヒドロキシル、(C1〜C6)アルコキシ、又は
W1及びZは、双方とも環A上のケト基であり、環Aにおいて任意選択の二重結合を表す点線の少なくとも1つは存在せず、
W2は、それぞれ独立してH、ハロ、(C1〜C6)アルキル、(C2〜C4)アルケニル、ヒドロキシル、(C1〜C6)アルコキシであり、
K1、K2、K3及びK4は、それぞれ独立してCH、N、N−オキシド又はN−(C1〜C6)アルキルであり、
環A及び環Bの点線は、任意選択の二重結合を表し、
A’及びB’は、場合により存在する、環Aに縮合した芳香族環であり、これらの1つだけが、縮合三環系を形成するように化合物中に存在し、A’又はB’が存在する場合、基Z’は、場合により存在する、環A’又は環B’のどちらかの置換基であり、
Rは、それぞれ独立して、H、(C1〜C20)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、(C2〜C20)アルキニル、(C3〜C20)シクロアルキル、(C1〜C12)アルコキシ、(C6〜C30)アリール、ヘテロアリール、複素環、(C1〜C20)アルキルスルホキシ、(C6〜C30)アリールスルホキシ、ヘテロアリールスルホキシ、(C1〜C20)アルキルスルホニル、(C6〜C30)アリールスルホニル、ヘテロアリールスルホニル、(C1〜C20)アルキルスルフィニル、(C6〜C30)アリールスルフィニル、ヘテロアリールスルフィニル、(C1〜C20)アルコキシカルボニル、アミノ、NH(C1〜C6)アルキル、N((C1〜C6)アルキル)2、トリ(C1〜C20)アンモニウム(C1〜C20)アルキル、ヘテロアリール(C1〜C20)アルキル、四級窒素を有するヘテロアリール、四級窒素を有するヘテロアリールカルボニル、(C1〜C20)アシル、(C1〜C20)アシルオキシ、(C1〜C20)アルキルチオ、(C6〜C30)アリールチオ、(C1〜C20)アルキルホスフェート、(C1〜C20)アルキルホスホネート、(C6〜C30)アリールホスフェート、(C6〜C30)アリールホスホネート、ホスフェート、サルフェート、単糖類、1〜約10個のアミノ酸鎖であり、又は、場合によりZ”が酸素の場合、M+であり、Mはアルカリ金属であり、
或いはZ又はZ’がNRRであり、RRがNと一緒にヘテロアリール又は複素環基を形成する場合、
式中、任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アミノ、アリール、ヘテロアリール又は複素環基は、(C1〜C20)アルキル、(C2〜C20)アルケニル、(C2〜C20)アルキニル、(C3〜C20)シクロアルキル、(C1〜C20)アルコキシル、(C1〜C20)アルキルカルボニル,(C1〜C20)アルキルカルボキシル、ハロ、ヒドロキシル、−COORx、−SO2Rx、−SO3Rx、ニトロ、アミノ、(C1〜C20)アルキル−S(O)−、(C1〜C20)アルキル−SO2−、ホスフェート、(C1〜C20)アルキルホスフェート、(C1〜C20)アルキルホスホネート、NH(C1〜C6)アルキル、NH(C1〜C6)アルキニル,N((C1〜C6)アルキル)2、N((C1〜C6)アルキニル)2、メルカプト、(C1〜C20)アルキルチオ、(C6〜C30)アリール、(C6〜C30)アリールチオ、トリフルオロメチル、=O、ヘテロアリール又は複素環を含む、1、2、3、4又は5つの置換基で場合により置換されており、式中、置換基はそれぞれ1〜3つのR基で場合により置換されており、
Rxは、H、(C1〜C6)アルキル又は(C6〜C30)アリールであり、
式中、少なくとも1つのZ又はZ’、例えばZ又はZ’のR基は、1〜約10個のアミノ酸の基又は鎖である]
の化合物又はそれらの塩を提供する。
Z又はZ’が窒素部分を含む場合、Z又はZ’の窒素部分の1つ又は双方の水素は、(C1〜C20)アルキル又は基Lにより置き換えることができ、Lはアミノ酸ラジカル、20個までのアミノ酸部分を有するペプチドラジカル又はプロテアーゼに対する基質である任意の他の小型分子である。特定の実施形態において、Lがアミノ酸ラジカル又はペプチドラジカルである場合、少なくとも1つのW2はHではない。
(式中、
Yは、N、N−オキシド、N−低級アルキル又はCHであり、
Xは、S、CH=CH,又はN=Cであり、
Z及びZ’は、独立してH、OR、NHR、NRR又はボロン原子を介して環A又はA’に結合した環状ジオキサボロラン基であり、
Z”は、O、S、NH、NHR又はN=Nであり、
Wは、それぞれ独立してH、ハロ、C1〜6アルキル、C2〜20アルケニル、ヒドロキシル又はC1〜6アルコキシであり、或いは、
W及びZは、双方とも環A上のケト基であり、環Aの点線は存在せず、
K1、K2、K3及びK4は、それぞれ独立して、CH、N、N−オキシド又はN−低級アルキルであり、
環A及び環Bの点線は、任意選択の二重結合を表し、
Rは、それぞれ独立して、H、アミノ、C1〜20アルキル、C2〜20アルケニル、C3〜20アルキニル、C2〜20アルケニルC1〜20アルキル、C3〜20アルキニルC2〜20アルケニル、C3〜20シクロアルキル、C6〜30アリール、ヘテロアリール、C6〜30アリールC1〜20アルキル、C1〜12アルコキシ、C1〜12アルコキシカルボニル、C1〜20アルキルスルホキシ、C6〜30アリールスルホキシ、C6〜30アリールスルホキシC1〜20アルキル、C1〜20アルキルスルホキシC1〜20アルキル、C1〜20アルコキシカルボニル、C6〜30アリールC1〜20アルコキシカルボニル、C6〜30アリールチオC1〜20アルキル、トリC1〜20アンモニウムC1〜20アルキル、ヘテロアリールスルホキシ、ヘテロアリールC1〜20アルキル、4級窒素を有するヘテロアリール、4級窒素を有するヘテロアリールカルボニル、N−メチル−テトラヒドロピリジニル又はペンタフルオロフェニルスルホニルであり、
式中、任意のアルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、複素環、又はアミノ基は、1つ又は複数の、例えば1、2、3、4又は5つの、C1〜20アルキル、C2〜20アルケニル、C3〜20アルキニル、C3〜20シクロアルキル、ハロ、ヒドロキシル、アシル、アシルオキシ、−COOR1、−SO3R1、アミノ、ニトロ、低級アルキルアミノ、低級アルキニルアミノ、イミダゾリニル−メチルアミノ、ジ−低級アルキルアミノ、ジ−低級アルキニルアミノ、ピペリジノ、ピロリジノ、アゼチジノ、アジリジノ、ジ−イミダゾリニルメチルアミノ、メルカプト、C1〜20アルキルチオ、C6〜30アリールチオ、トリフルオロメチル、C1〜20アルキルカルボキシル、C6〜30アリール、C6〜30アリールC1〜20アルコキシル、ヘテロアリール、複素環、複素環C1〜20アルキル又はC6〜30アリールC1〜20アルキルカルボニルにより、場合により置換され得、基Rは、複数存在する場合、それぞれ独立して定義され、
R1は、水素、C1〜6アルキル又はC6〜30アリールであり、
Qは、C(=O)、CH2又は直接結合であり、
nは、0、1又は2であり、
式中、少なくとも1つのZ又はZ’は、例えばZ又はZ’のR基は、1〜約10個のアミノ酸鎖の基又は鎖であり、
A−は陰イオンであり、4級窒素が存在する場合に存在する)
の化合物又はそれらの塩を提供する。
(式中、
R1は、水素、ヒドロキシル、アミノ、C1〜20アルコキシ、置換C1〜20アルコキシ、C2〜20アルケニルオキシ、置換C2〜20アルケニルオキシ、ハロゲン化C2〜20アルコキシ、置換ハロゲン化C2〜20アルコキシ、C3〜20アルキニルオキシ、置換C3〜20アルキニルオキシ、C3〜20シクロアルコキシ、置換C3〜20シクロアルコキシ、C3〜20シクロアルキルアミノ、置換C3〜20シクロアルキルアミノ、C1〜20アルキルアミノ、置換C1〜20アルキルアミノ、ジC1〜20アルキルアミノ、置換ジC1〜20アルキルアミノ、C2〜20アルケニルアミノ、置換C2〜20アルケニルアミノ、ジC2〜20アルケニルアミノ、置換ジC2〜20アルケニルアミノ、C2〜20アルケニルC1〜20アルキルアミノ、置換C2〜20アルケニルC1〜20アルキルアミノ、C3〜20アルキニルアミノ、置換C3〜20アルキニルアミノ、ジC3〜20アルキニルアミノ、置換ジアルキルアミノ、C3〜20アルキニルC2〜20アルケニルアミノ、置換C3〜20アルキニルC2〜20アルケニルアミノ、又は1〜約10個のアミノ酸鎖であり、
R2及びR3は、独立してC又はNであり、
R4及びR5は、独立してS、O、NR8であり、
R6はCH2OH、COR11又は−OM+であり、式中、M+はアルカリ金属又は医薬として許容可能な塩であり、
R7は、H、C1〜6アルキル、C1〜20アルケニル、ハロゲン又はC1〜6アルコキシドであり、
R8は、水素、C1〜20アルキル、CR9R10であり、式中、R9及びR10は独立してH、C1〜20アルキル又はフッ素であり、
R11は、H、OH、C1〜20アルコキシド、C2〜20アルケニル又はNR12R13であり、式中、R12及びR13は独立してH又はC1〜20アルキルであり、
式中、1〜約10個のアミノ酸鎖の少なくとも1つは、式Vの化合物中に、この化合物がプロテアーゼ基質であるように存在する)
の化合物を提供する。
単一のプロテアーゼ基質を用いて、生細胞及び死細胞を検出できるかどうかを確定するために、Jurkat細胞を、RPMI 1640+10%FBS中で100,000細胞/mlに調整した。試料を、2つに分割した。1つを、穏やかに超音波処理に供し、細胞毒性を刺激した。他方は未処理のまま放置した。超音波処理(死滅した)分及び未処理(生きている)分を、様々な割合で組み合わせ、100、95、90、75、50、25、10、5及び0%の生存率で表した。各ブレンドを、100μlの複製量(10,000細胞/ウェルと同等)でマイクロタイターウェルに加えた。CytoTox−Glo試薬(2×試薬は、100μMのAAF−アミノルシフェリンの「AAF−Glo基質」、100mMのHepes、50mMのMgSO4 pH7.5を含み、凍結乾燥ルシフェラーゼ、結合剤及びATPを含むルシフェリン検出試薬の「ケーキ(cake)」を再水和するために使用した)を調製し、各ウェルに等量(100μL)/ウェルを加えた。プレートを、室温で15分間インキュベートし、死細胞のシグナルを、BMG PolarStarを使用して測定した。ジギトニン(DMSO中20mg/mL)を、CytoTox−Gloバッファー(100mMのHepes及び50mMのMgSO4)で300μg/mLに希釈し、各ウェルに20μL量を加え、完全な細胞溶解を容易にした。発光を、室温で15分間インキュベートした後で測定した。
Hela細胞を、10,000細胞/ウェルの濃度で、DMEM+10%FBS、50μL量中に播種し、5%CO2において、37℃で一晩接着させた。ノコダゾール(抗腫瘍薬)を、個々のプレートにおいて、DMEM+10%FBS中で2μMから2倍連続希釈し、50μL量を加えた(最も高い最終用量は1000nMである)。細胞を、化合物と共に24時間インキュベートした。CytoTox−Glo試薬を上記のように調製し、各ウェルに等量(100μL)/ウェルで加えた。15分間インキュベートした後で、死細胞のシグナルを回収した。ジギトニンを、AAF−Glo試薬を含むウェルに、30μg/mLになるように加えた。CellTiter−Gloを、ケーキと提供されたバッファーを再水和させることによって調製し、次いで、100μL量/ウェルを加えた。オービタルシェイカーを、700RPMで使用してプレートを振とうして、均一性を確保した。
図2Bは、パクリタキセル(有糸分裂阻害剤)に関するデータを示し、最も高い用量は500nMであった。この場合もやはり、CellTiter−Glo及びCytotox−Gloから誘導された値は、機構的に異なった毒性損傷と同様であった。
アクチノマイシンD(抗腫瘍抗生物質)を、マイクロタイタープレートにおいて、50μL量中2μMから、RPMI 1640+10%FBS中で2倍連続希釈した。RPMI 1640+10%FBSは、非誘導性の対照として使用した。Jurkat細胞を、10,000細胞/ウェルになるように、50μL量に加えた。オービタルシェイカーにより振とうすることによってプレートを混合し、次いで、37℃において、5%CO2中で24時間インキュベートした。GF−AFCを、50mMのMgSO4を含む100mMのHEPES pH7.5中で、200μMになるように希釈し、各ウェルに50μL量を加えた。37℃で30分間インキュベートした後で、生細胞の蛍光発光値を、BMG Polarstarを使用して回収した。CytoTox−Glo試薬を、2×試薬として調製し、100μL量を加えた。死細胞の値を、室温で15分間インキュベートした後で、BMG Polarstarを使用して回収した。ジギトニンを、30μg/mLになるように、20μL量を加え、オービタルシェイカーを使用してプレートを振とうした。ジギトニン処理した発光を、BMG Polarstarを使用して測定した。
イオノマイシン(カルシウムイオノフォア、これは、細胞膜を越えたカルシウム流出に作用し、したがって、高濃度ではモデルネクローシス誘導剤である)を、RPMI 1640+10%FBS、50μL量中で、100μMから2倍連続希釈した。Jurkat細胞を、10,000細胞/ウェルになるように、50μL量を加えた。オービタルシェイカーを使用してプレートを短時間振とうし、次いで、37℃において、6時間インキュベートした。CytoTox−Glo試薬を、上記のように調製し、各ウェルに等量(100μL)/ウェルを加えた。プレートを、室温で15分間インキュベートし、死細胞のシグナルを、BMG PolarStarを使用して測定した。ジギトニン(DMSO中20mg/mL)を、CytoTox−Gloバッファーで300μg/mLに希釈し、20μL量/ウェルを加え、完全な細胞溶解を容易にした。発光を、室温で15分間インキュベートした後で測定した。
HeLa細胞を、10,000細胞/ウェルの濃度で、DMEM+10%FBS、50μL量中に播種し、5%CO2において、37℃で一晩接着させた。コルヒチン(有糸分裂阻害剤)を、個々のプレートにおいて、DMEM+10%FBS中で1000nMから2倍連続希釈し、50μL量を加えた(最も高い最終用量は500nMである)。細胞を、化合物と共に24時間インキュベートした。CytoTox−Glo試薬を上記のように調製し、各ウェルに等量(100μL)/ウェルを加えた。15分間インキュベートした後で、死細胞のシグナルを回収した。ジギトニンを、AAF−Glo試薬を含むウェルに、30μg/mLになるように加えた。オービタルシェイカーを700RPMで使用してプレートを振とうして、均一性を確保した。得られた発光シグナルを、BMG Polarstarを使用して回収した。死細胞のシグナルを、ジギトニン処理したシグナルから差し引き、GraphPad Prismを使用して、死細胞のシグナルに対してプロットした(図6A)。実験を、パクリタキセルを使用して繰り返した(図6B)。
スタウロスポリン(多重機構のアポトーシス誘導因子)を、マイクロタイタープレートにおいて、50μL量で、RPMI 1640+10%FBS中で20μMから2倍連続希釈した。Jurkat細胞を、10,000細胞/ウェルになるように、50μL量を加えた。オービタルシェイカーを使用してプレートを短時間振とうし、次いで、37℃において、6時間インキュベートした。CytoTox−Glo試薬を、上記のように調製し、各ウェルに、等量(100μL)/ウェルを加えた。プレートを、室温で15分間インキュベートし、死細胞のシグナルを、BMG PolarStarを使用して測定した。ジギトニン(DMSO中20mg/mL)を、CytoTox−Gloバッファーで300μg/mLに希釈し、20μL量/ウェルを加え、完全な細胞溶解を容易にした。発光を、室温で15分間インキュベートした後で測定した。溶解後に得られた発光シグナルを、「生細胞」の寄与を反映させるために、初回の死細胞シグナルを差し引くことによって調整した(図7)。上記のデータを、死滅シグナル及び「生細胞」シグナル対イオノマイシンの濃度としてプロットした。生細胞及び死細胞は、同じ発光読み出しを使用すると逆相補的であった。このことはまた、別の毒素及び細胞死の機構形態を表す。
Jurkat細胞を、洗浄し、新鮮なRPMI 1640+10%FBS中で、50,000細胞/mLになるように調整した。プールを分割し、一方の分画は、穏やかな超音波処理により処理し、細胞毒性を引き起こし、他方の分画は、未処理で放置した。50μLの処理済み及び50μLの未処理を、同じ複製ウェル(最終100μL、5000細胞/ウェル 等量)に加え、50%生存細胞及び50%細胞毒性細胞である試料の集団を表した。対照ウェルには、50μLの未処理細胞及び50μLのRPMI 1640+10%FBS(最終100μL)を入れた。AAF−アミノルシフェリン基質を、50mMのMgSO4を含む100mMのHepesバッファー中で200μMに調製した。この基質/バッファー溶液の5.0mLを使用して、ルシフェリン検出試薬のケーキを再水和した。この試薬を、試料及び対照ウェルに、50μL/ウェルで加えた。発光を、BMG POLARstarで、動態モードにおいて25分間測定し、細胞毒性集団からのシグナルを回収した。プレートを取り外し、ジギトニンを試料及び対照ウェルの双方に、最終濃度が30μg/mLになるように、15μL量を加えた。700RPMで1分間、オービタルシェイカーで振とうすることによって混合した後で、プレートをPOLARstarに戻し、全細胞毒性による発光を、動態モードにおいて、さらに25分間測定した。
生存=全細胞毒性シグナル−初回細胞毒性シグナル
有効性試験期間の本アッセイの正確さ及び精密度を実証するために、Jurkat細胞を、3つの異なる反応条件に供した。
正確さを実証するために、イオノマイシンを、50μL量で、RPMI 1640+10%FBS中100μMから2倍連続希釈した。Jurkat細胞を、4ウェルで二重に、10,000細胞/ウェルで播種し、希釈したイオノマイシンと共に6時間インキュベートした。CytoTox−Glo試薬を上記のように調製し、各ウェルに等量(100μL)を加えた。細胞を、室温で15分間インキュベートし、死細胞のシグナルを、BMG Polarstarを使用して測定した。ジギトニン(DMSO中20mg/mL)を、CytoTox−Gloバッファーで300μg/mLに希釈し、20μL量/ウェルを加え、完全な細胞溶解を容易にした。発光を、室温で15分間インキュベートした後で測定した。
精密度を実証するために、異なる細胞数(5,000又は10,000)を使用したことを除いて、上記のような反応条件で二重試験を実施した。図9Bに見られるように、細胞数が異なるにもかかわらず、各二重試験に関するEC50値は同じであり、アッセイの精密度を実証している。
エポキソミシン
DU−145細胞を、5,000細胞/ウェルの濃度で、50μLのMEM+10%FBS中に播種し、一晩接着させた。エポキソミシン(プロテアソーム阻害剤)を、MEM+10%FBS中の5μMから連続希釈し、50μL量を加えた。細胞を、化合物と共に48時間インキュベートした。CytoTox−Glo試薬を上記のように調製し、各ウェルに等量(100μL)を加えた。15分間インキュベートした後で、死細胞のシグナルを測定した。ジギトニン(DMSO中20mg/mL)を、CytoTox−Gloバッファーで希釈し、20μL量を各ウェルに加え、完全な細胞溶解を容易にした。発光を、室温で15分間インキュベートした後で測定した。
本アッセイに由来する値が、他の細胞生存率測定に匹敵することを実証するために、このアッセイを、蛍光発光及び発光細胞生存率法と比較した。GF−AFCを、100mMのHEPES、pH7.5中で、200μMに希釈し、100μL量を、エポキソミシン処理DU−145細胞に加えた。37℃において30分間インキュベートした後で、蛍光発光を、BMG Polarstarを使用して測定した。発光細胞生存率測定のために、CellTiter−Glo(Promega)を、ケーキを、提供されたバッファーで再水和することによって調製し、100μL量を、エポキソミシン処理DU−145細胞を含む並行ウェルに加えた。オービタルシェイカーを使用してプレートを振とうし、均一性を確保した。室温で30分間インキュベートした後で、発光を、BMG Polarstarを使用して測定した。
本アッセイに由来する細胞毒性の値が、他の細胞毒性測定に匹敵することを実証するために、本アッセイを、蛍光発光細胞毒性法と比較した。CytoTox−ONE(商標)Homogenous Membrane Integrity Assay(これは、乳酸脱水素酵素(LDH)の放出を測定する)を、製造業者(Promega)のプロトコルに従って使用した。簡潔にいうと、CytoTox−ONE(商標)試薬を、基質混合物とアッセイ用バッファーとを混合することによって調製し、100μL量をエポキソミシン処理DU−145細胞に加えた。細胞を、室温で10分間インキュベートした。蛍光発光を、Labsystems Fluoroskan Ascentを使用して測定した。図10Cに見られるように、蛍光発光細胞毒性法に関して得られた値は、本アッセイから得られた値に匹敵した。
細胞生存率及び細胞毒性の二重測定が、誤った解釈を軽減することを実証するために、K562細胞を、5,000細胞/ウェルの濃度で、RPMI 1640+10%FBS、50μL量中に播種した。カンポテシン(Campothecin)を、RPMI 1640+10%FBS媒体中で、10μMから2倍連続希釈し、50μL量を加えた。細胞を、5%CO2において、37℃で24時間インキュベートした。CytoTox−Glo試薬を上記のように調製し、各ウェルに等量(100μL)を加えた。15分間インキュベートした後で、死細胞のシグナルを測定した。ジギトニン(DMSO中20mg/mL)を、CytoTox−Gloバッファーで希釈し、20μL量を各ウェルに加え、完全な細胞溶解を容易にした。発光を、室温で15分間インキュベートした後で測定した。
(参考文献)
Claims (17)
- 試料中の生細胞及び死細胞を検出する方法であって、
a)細胞を有する試料を、プロテアーゼに対する生物発光性の生存細胞不透過性基質及び生物発光アッセイ用の試薬と接触させ、その結果混合物を提供するステップであって、基質がルシフェリン誘導体であるステップと、
b)混合物中の発光を検出し、それによって試料中の死細胞の数又は存在を検出するステップと、
c)混合物中の細胞を溶解するステップと、
d)溶解混合物中の発光を検出し、それによって試料中の生細胞の数又は存在を検出するステップと、
を含む方法。 - 試料混合物中の生細胞及び死細胞を検出する方法であって、
a)細胞、プロテアーゼに対する生物発光性の生存細胞不透過性基質及び生物発光アッセイ用の試薬を含む試料混合物の発光を検出するステップであって、基質がルシフェリン誘導体であるステップと、
b)前記試料混合物中の細胞を溶解するステップと、
c)溶解細胞を含む試料混合物の発光を検出するステップと
を含む方法。 - 試料を、試薬より前に基質と接触させる、請求項1に記載の方法。
- 試料を、基質より前に試薬と接触させる、請求項1に記載の方法。
- 試料を、試薬及び基質と同時に接触させる、請求項1に記載の方法。
- 試料を、細胞死誘導剤を用いて処理する、請求項1から5までのいずれか一項に記載の方法。
- 生物発光性の生存細胞不透過性基質が、トリペプチジルペプチダーゼ、カルパイン又はキモトリプシンに対する基質である、請求項1から6までのいずれか一項に記載の方法。
- 試料が、哺乳動物細胞を含む、請求項1から7までのいずれか一項に記載の方法。
- 基質が、Ala−Ala−Phe−アミノルシフェリン又はZ−Leu−Leu−Val−Tyr−アミノルシフェリンである、請求項1から8までのいずれか一項に記載の方法。
- ルシフェリン誘導体がアミノルシフェリン誘導体である、請求項1から9までのいずれか一項に記載の方法。
- 基質が、甲虫ルシフェラーゼに対するプロ基質である、請求項1から10までのいずれか一項に記載の方法。
- プロテアーゼ以外の分子の存在又は量を検出するステップをさらに含む、請求項1から11までのいずれか一項に記載の方法。
- 細胞を、界面活性剤を用いて溶解する、請求項1から12までのいずれか一項に記載の方法。
- 試料が生理学的試料である、請求項1から13までのいずれか一項に記載の方法。
- プロテアーゼがエンドプロテアーゼである、請求項1から14までのいずれか一項に記載の方法。
- プロテアーゼがエキソプロテアーゼである、請求項1から14までのいずれか一項に記載の方法。
- プロテアーゼに対する基質が15残基以下のペプチドである、請求項1から8まで及び10から16までのいずれか一項に記載の方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US92337607P | 2007-04-13 | 2007-04-13 | |
US60/923,376 | 2007-04-13 | ||
PCT/US2008/004748 WO2008127677A2 (en) | 2007-04-13 | 2008-04-10 | Luminescent live and dead cell assay |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2010523149A JP2010523149A (ja) | 2010-07-15 |
JP2010523149A5 JP2010523149A5 (ja) | 2011-06-30 |
JP5374493B2 true JP5374493B2 (ja) | 2013-12-25 |
Family
ID=39798032
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2010503075A Active JP5374493B2 (ja) | 2007-04-13 | 2008-04-10 | 発光による生細胞及び死細胞のアッセイ |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8227205B2 (ja) |
EP (1) | EP2142665B1 (ja) |
JP (1) | JP5374493B2 (ja) |
AU (1) | AU2008239654A1 (ja) |
WO (1) | WO2008127677A2 (ja) |
Families Citing this family (10)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2003066611A1 (en) | 2002-02-01 | 2003-08-14 | Promega Corporation | Bioluminescent protease assay |
US7416854B2 (en) | 2004-01-22 | 2008-08-26 | Promega Corporation | Luminogenic and nonluminogenic multiplex assay |
US7553632B2 (en) * | 2004-01-22 | 2009-06-30 | Promega Corporation | Luminogenic and nonluminogenic multiplex assay |
AU2008239654A1 (en) | 2007-04-13 | 2008-10-23 | Promega Corporation | Luminescent live and dead cell assay |
US10324036B2 (en) | 2012-05-02 | 2019-06-18 | Charles River Laboratories, Inc. | Porous planar cell capture system |
AU2013256174B2 (en) | 2012-05-02 | 2017-03-02 | Charles River Laboratories, Inc. | Viability staining method |
JP6482459B2 (ja) | 2012-05-02 | 2019-03-13 | チャールズ リバー ラボラトリーズ, インコーポレイテッド | 細胞サンプル中の生存細胞を検出する方法 |
US10619182B2 (en) * | 2014-12-26 | 2020-04-14 | Hitachi, Ltd. | Method, device and system for testing drug sensitivity |
US10093960B2 (en) * | 2015-07-24 | 2018-10-09 | Molecular Devices, Llc | Luminescence measurement of biological samples utilizing dual reagents |
WO2021162123A1 (ja) | 2020-02-14 | 2021-08-19 | キッコーマン株式会社 | 試料中のatp、並びにamp及び/又はadpを測定するための液体組成物 |
Family Cites Families (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4640893A (en) | 1983-10-28 | 1987-02-03 | University Of Illinois | Novel rhodamine derivatives as fluorogenic substrates for proteinases |
US4557862A (en) | 1983-10-28 | 1985-12-10 | University Patents, Inc. | Rhodamine derivatives as fluorogenic substrates for proteinases |
DE3537877A1 (de) | 1985-10-24 | 1987-04-30 | Geiger Reinhard | Luciferin-derivate und immunoassays unter einsatz derartiger luciferin-derivate |
US4908309A (en) | 1986-03-11 | 1990-03-13 | Prototek, Inc. | Method of detecting cysteine proteases |
DE3700908A1 (de) | 1987-01-14 | 1988-07-28 | Geiger Reinhard | Aminoluciferine, verfahren zu deren herstellung und deren verwendung bei der bestimmung von enzymaktivitaeten |
US5314805A (en) | 1991-10-28 | 1994-05-24 | Molecular Probes, Inc. | Dual-fluorescence cell viability assay using ethidium homodimer and calcein AM |
WO1995027903A1 (en) | 1994-04-11 | 1995-10-19 | Nexins Research B.V. | A method for detecting and/or optionally quantifying and/or separating apoptotic cells in or from a sample |
US5976822A (en) | 1995-05-18 | 1999-11-02 | Coulter International Corp. | Method and reagent for monitoring apoptosis and distinguishing apoptosis from necrosis |
US5698411A (en) | 1995-05-18 | 1997-12-16 | Coulter Corporation | Method for determining activity of enzymes in metabolically active whole cells |
US5744320A (en) | 1995-06-07 | 1998-04-28 | Promega Corporation | Quenching reagents and assays for enzyme-mediated luminescence |
US6602657B1 (en) | 1995-12-28 | 2003-08-05 | Tropix, Inc. | Multiple reporter gene assay |
US6270980B1 (en) | 1997-06-05 | 2001-08-07 | Idun Pharmaceuticals, Inc. | Rapid methods for identifying modifiers of cellular apoptosis activity |
EP1026988A4 (en) | 1997-10-10 | 2005-03-30 | Cytovia Inc | FLUORESCENT DISPLAY MOLOCCULE AND APPLICATIONS, INCLUDING CASPASED DOSING |
US6342611B1 (en) | 1997-10-10 | 2002-01-29 | Cytovia, Inc. | Fluorogenic or fluorescent reporter molecules and their applications for whole-cell fluorescence screening assays for capsases and other enzymes and the use thereof |
DE19820328A1 (de) | 1998-05-07 | 1999-11-11 | Roche Diagnostics Gmbh | Verfahren und Reagenz zum Nachweis apoptotischer Zellen bzw. einer bei Apoptose aktivierten Protease |
BR9914648A (pt) | 1998-10-20 | 2001-11-27 | Millennium Pharm Inc | Processo para monitorar ação medicamentosa deinibidor de proteasoma |
AU781255B2 (en) | 1998-12-15 | 2005-05-12 | Applied Biosystems, Llc | Multiple enzyme assays |
ATE280836T1 (de) | 1999-02-25 | 2004-11-15 | Cyclacel Ltd | Test zur gleichzeitigen messung von verschiedenen enzymatischen aktivitäten |
US6391575B1 (en) | 1999-03-05 | 2002-05-21 | Idun Pharmaceuticals, Inc. | Methods for detecting membrane derived caspase activity and modulators thereof |
US20040214227A1 (en) | 1999-12-22 | 2004-10-28 | Erik Joly | Bioluminescence resonance energy transfer (bret) fusion molecule and method of use |
US7262005B1 (en) | 2000-02-04 | 2007-08-28 | Aurora Biosciences Corporation | Methods of protein destabilization and uses thereof |
US6448030B1 (en) | 2000-02-18 | 2002-09-10 | University Of Nevada-Las Vegas | Method for predicting the efficacy of anti-cancer drugs |
EP1174506A1 (en) | 2000-06-28 | 2002-01-23 | Stichting Dienst Landbouwkundig Onderzoek | C-terminal Erns peptide and analogues thereof |
US6890745B1 (en) | 2000-07-19 | 2005-05-10 | Chemicon International, Inc. | Protease specific cleavable luciferases and methods of use thereof |
CA2417355A1 (en) | 2000-08-08 | 2002-02-14 | Aclara Biosciences, Inc. | Multiplexed enzymatic assays |
US6811990B1 (en) | 2001-02-13 | 2004-11-02 | Michael J. Corey | Methods and compositions for coupled luminescent assays |
WO2003025192A2 (en) | 2001-09-19 | 2003-03-27 | Pe Corporation (Ny) | Membrane transportable fluorescent substrates |
WO2003066611A1 (en) | 2002-02-01 | 2003-08-14 | Promega Corporation | Bioluminescent protease assay |
DE10232902A1 (de) | 2002-07-19 | 2004-01-29 | Bayer Cropscience Ag | Verfahren zum Identifizieren von Inhibitoren des 20S und 26S Proteasoms |
CA2497560A1 (en) | 2002-09-20 | 2004-04-01 | Promega Corporation | Luminescence-based methods and probes for measuring cytochrome p450 activity |
US7553632B2 (en) | 2004-01-22 | 2009-06-30 | Promega Corporation | Luminogenic and nonluminogenic multiplex assay |
US7416854B2 (en) | 2004-01-22 | 2008-08-26 | Promega Corporation | Luminogenic and nonluminogenic multiplex assay |
WO2007027653A1 (en) | 2005-09-01 | 2007-03-08 | Promega Corporation | Cell-based luminogenic and nonluminogenic proteasome assays |
AU2008239654A1 (en) | 2007-04-13 | 2008-10-23 | Promega Corporation | Luminescent live and dead cell assay |
-
2008
- 2008-04-10 AU AU2008239654A patent/AU2008239654A1/en not_active Abandoned
- 2008-04-10 EP EP08742813.2A patent/EP2142665B1/en active Active
- 2008-04-10 US US12/100,889 patent/US8227205B2/en active Active
- 2008-04-10 WO PCT/US2008/004748 patent/WO2008127677A2/en active Application Filing
- 2008-04-10 JP JP2010503075A patent/JP5374493B2/ja active Active
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP2142665B1 (en) | 2013-11-27 |
WO2008127677A2 (en) | 2008-10-23 |
US8227205B2 (en) | 2012-07-24 |
WO2008127677A3 (en) | 2008-12-24 |
EP2142665A2 (en) | 2010-01-13 |
AU2008239654A1 (en) | 2008-10-23 |
US20120149045A1 (en) | 2012-06-14 |
JP2010523149A (ja) | 2010-07-15 |
WO2008127677A9 (en) | 2009-03-12 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP5374493B2 (ja) | 発光による生細胞及び死細胞のアッセイ | |
US9951372B2 (en) | Compounds and methods for assaying redox state of metabolically active cells and methods for measuring NAD(P)/NAD(P)H | |
JP5800711B2 (ja) | シアノベンゾチアゾール化合物を用いる生物発光アッセイ | |
US8288559B2 (en) | Luminogenic compounds and methods to detect cytochrome P450 3A enzymes | |
EP2545041B1 (en) | Bioluminescent assays using cyanobenzothiazole compounds | |
EP3181151B1 (en) | Detection of hydrogen peroxide | |
Li et al. | Discovery of bioluminogenic probes for aminopeptidase N imaging | |
JP6724119B2 (ja) | 赤方偏移ルシフェリン及びその使用方法 | |
Li et al. | Phenoxazine-based red-emitting fluorescence probe for specific detection and imaging of endogenous neutrophil elastase in vitro and in vivo | |
Ponomariov et al. | Universal Access to Protease Chemiluminescent Probes through Solid-Phase Synthesis | |
Baker et al. | An inducible reconstitution system for the real-time kinetic analysis of protease activity and inhibition inside the membrane |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20110511 |
|
RD03 | Notification of appointment of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7423 Effective date: 20110615 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120802 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20121025 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20121101 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20121203 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130821 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130920 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 5374493 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |