JP2013509433A - ウイルス関連疾患を処置する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、その開示全体を引用することにより本明細書の一部をなすものとする、2009年10月30日に出願された米国特許仮出願番号第61/256,701号明細書、2010年4月22日に出願された米国特許仮出願番号第61/326,991号明細書、2010年4月22日に出願された米国特許仮出願番号第61/326,989号明細書、2010年4月22日に出願された米国特許仮出願番号第61/326,982号明細書、2010年4月22日に出願された米国特許仮出願番号第61/326,986号明細書、2010年4月23日に出願された米国特許仮出願番号第61/327,474号明細書、2010年4月26日に出願された米国特許仮出願番号第61/327,914号明細書、2010年4月27日に出願された米国特許仮出願番号第61/328,491号明細書、2010年5月3日に出願された米国特許仮出願番号第61/330,624号明細書、2010年5月5日に出願された米国特許仮出願番号第61/331,704号明細書、2010年6月16日に出願された米国特許仮出願番号第61/355,430号明細書、2010年10月20日に出願された米国特許仮出願番号第61/405,073号明細書、2010年10月20日に出願された米国特許仮出願番号第61/405,080号明細書、2010年10月20日に出願された米国特許仮出願番号第61/405,075号明細書及び2010年10月20日に出願された米国特許仮出願番号第61/405,084号明細書の米国特許法第119条(e)に基づく利益を主張する。
本明細書において、「アルキル」は、1〜30個の炭素原子を含有する直鎖又は分岐鎖炭化水素を意味する。一部の実施形態において、アルキル基は、1〜24、2〜25、2〜24、1〜10又は1〜8個の炭素原子を含有する。一実施形態において、アルキル基は、15、16、17、18又は19個〜20個の炭素原子を含有する。一部の実施形態において、アルキル基は、16又は17個〜20個の炭素原子を含有する。一部の実施形態において、アルキル基は、l5、16、17、18、19又は20個の炭素原子を含有する。更に他の実施形態において、アルキル基は1〜5個の炭素原子を含有し、更にまた他の実施形態において、アルキル基は1〜4又は1〜3個の炭素原子を含有する。アルキルの代表例として、メチル、エチル、n−プロピル、イソ−プロピル、n−ブチル、sec−ブチル、iso−ブチル、tert−ブチル、n−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、n−ヘキシル、3−メチルヘキシル、2,2−ジメチルペンチル、2,3−ジメチルペンチル、n−ヘプチル、n−オクチル、n−ノニル、n−デシル等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。追加的な例又は一般に適用できる置換基は、本明細書に記載されている特定の化合物によって説明される。
本発明の一部の態様において、多様な生物学的特性を有する化合物が提供される。本明細書に記載されている化合物は、少なくとも1種類のウイルスに関連する疾患の処置に関係する生物活性を有する。
Mは、
Qは、存在する場合、
R1、R1’、R2、R2’、Rx及びRyは、独立して、−H、ハロゲン、−ORi、−SRi、−NHRi又は−NRiRiiであり、
Ri及びRiiは、独立して、水素又は脂肪族部分であり、
mは、0〜6の整数であり、
Bは、水素、F、CF3、CHF2、−CH3、−CH2CH3、−CH2OH、−CH2CH2OH、−CH(OH)CH3、−CH2F、−CH=CH2及び−CH2N3からなる群から選択され、
Xは、セレン、イオウ又は酸素であり(一部の実施形態において、Xは酸素である)、
R3は、ヒドロキシ、−OR2a、C1−8アルキル、C2−8アルケニル、C2−8アルキニル、C1−8ヘテロアルキル、C2−8ヘテロアルケニル、C2−8ヘテロアルキニル又は−NR’R’’であり(一部の実施形態において、R3はヒドロキシルである)、
R2aは、C1−8アルキル、C2−8アルケニル、C2−8アルキニル、C1−8ヘテロアルキル、C2−8ヘテロアルケニル、C2−8ヘテロアルキニル、−P(=O)(OH)2又は−P(=O)(OH)OP(=O)(OH)2であり、
R’及びR’’は、独立して、H、C1−8アルキル、C2−8アルケニル、C2−8アルキニル、C1−8ヘテロアルキル、C2−8ヘテロアルキニル、C2−8ヘテロアルケニル及びC6−10アリールからなる群から選択され、又は、
NR’R’’は、置換又は非置換アミノ酸残基であり、
Zは、少なくとも1個のNを含むヘテロ環部分を含み(一部の実施形態において、ヘテロ環部分はプリン又はピリミジンである)、
記号*は、式A、A’、B又はB’におけるメチレン部分のZとの結合ポイントが、ヘテロ環部分の利用可能な窒素を介することを示す]
又はそれらの医薬的に許容可能な塩
の構造を有する。
aは2〜4であり(一実施形態において、aは2又は3である)、
tは11〜19であり(一実施形態において、tは15、16又は17である)、
Bは水素、−CH3又は−CH2OHである(一実施形態において、Bは−CH3である)]
又はその医薬的に許容可能な塩
の構造を有する。
から選択される。一部の実施形態において、Ri及びRiiは、独立して、−(C1−C24)アルキル、−(C2−C24)アルケニル、−(C2−C24)アルキニル又は−(C1−C24)アシルである。
Yは、N又はCXであり、
Xは、H、ハロ、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C2−6アルキニル、CN、CF3、N3、NO2、C6−10アリール、C6−10ヘテロアリール及びCORbからなる群から選択され、
Rbは、H、OH、SH、C1−6アルキル、C1−6アミノアルキル、C1−6アルコキシ及びC1−6チオアルキルからなる群から選択され、
R11は、H、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C2−6アルキニル、C6−10アリール、C3−10シクロアルキル及びC1−6アルキル、C2−6アルケニル、C2−6アルキニル又はC6−10アリールに置換されたカルボニルからなる群から選択される]
の部分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
Z’は、−NRaRb、−SRa又は−ORaであり、
L2は、共有結合である、或いは−N(−R15)−、N(−R15)C(=O)−、−O−、−S−、−S(=O)−又は−S(=O)2−であり、
R13は、H、C1−6アルキル、C1−6ヘテロアルキル、C2−6アルケニル、C6−10アリール、C7−16アリールアルキル、C3−10カルボシクリル、C6−10ヘテロシクリル又はC7−16ヘテロシクリルアルキルであり、
R14は、H、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、−O(CH2)xOC(=O)OR15若しくはOC(=O)OR15(式中、xは2又は3から10、15又は20である)又はΝRiRii(式中、Ri及びRiiの各出現は、独立して、水素、C1−6アルキル、C2−6アルケニル、C2−6アルキニル、C3−6シクロアルキル及びC3−8ヘテロシクリルからなる群から選択される)であり、
R15は、H、C1−6アルキル、C1−6ヘテロアルキル、C2−6アルケニル、C6−10アリール、C7−16アリールアルキル、C3−10シクロアルキル、C6−10ヘテロシクリル又はC7−16ヘテロシクロアルキルであり、
Ra、Rbは、独立して、水素、C1−6アルキル、C1−6アシル又はC3−6シクロアルキル及びC3−8ヘテロシクリル(C3−6シクロアルキル及びC3−8ヘテロシクリルは、1又は複数のC1−5アルキルに任意選択により置換されていてよい)からなる群から選択される]
の化合物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
の部分が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
R1、R1’、R2及びR2’は独立して、−H、ハロゲン、−ORi、−SRi、−NHRi、−NRiRiiであり、Ri及びRiiは独立して、水素又は脂肪族であり、
R3は、医薬的に有効なホスホネート、ビスホスホネート又は薬理学的に有効な化合物のホスホネート誘導体であり、
Xは、存在する場合、
の構造を有する。
を有するエタンジオールホスホネート種である。
を有するグリセロール種である。グリセロールは光学活性分子である。グリセロールの立体特異的ナンバリングの慣例を用いると、sn−3位は、グリセロールキナーゼによってリン酸化される位置である。グリセロール残基を有する本発明の化合物において、R3部分は、グリセロールのsn−3又はsn−1位のいずれかにおいて連結することができる。
R1、R1’、R2及びR2’は独立して、−H、オキソ、ハロゲン、−NH2、−OH若しくは−SH又は任意選択により置換された−XRiであり、Xは、O、S、−NH又は−NRiiであり、Ri及びRiiは独立して、−(C1−C24)アルキル、−(C1−C24)アルケニル、−(C1−C24)アルキニル又は−(C1−C24)アシルである]
の構造を有する。
R3は、必要に応じたリンカーLにおける官能基又はCαにおける利用可能な酸素原子と結合した医薬的に有効なホスホネート、ビスホスホネート又は薬理学的に有効な化合物のホスホネート誘導体であり、
Xは、存在する場合、
Lは、式、−J−(CR2)t−G−(式中、tは、1〜24の整数であり、J及びGは独立して、−O−、−S−、−C(O)O−又は−NH−であり、Rは、−H、置換若しくは非置換アルキル又はアルケニルである)の原子価結合又は二官能性結合分子であり、
mは、0〜6の整数であり、
nは、0又は1である。
を有する。
を有する。
エチドロン酸:1−ヒドロキシエチリデンビスホスホン酸(EDHP)、
クロドロン酸:ジクロロメチレンビスホスホン酸(Cl2MDP)、
チルドロン酸:クロロ−4−フェニルチオメチレンビスホスホン酸、
パミドロン酸:3−アミノ−1−ヒドロキシプロピリデンビスホスホン酸(ADP)、
アレンドロン酸:4−アミノ−1−ヒドロキシブチリデンビスホスホン酸、
オルパドロン酸:3ジメチルアミノ−1−ヒドロキシプロピリデンビスホスホン酸(ジメチル−APD)、
イバンドロン酸:3−メチルペンチルアミノ−1−ヒドロキシプロピリデンビスホスホン酸(BM21.0955)、
EB−1053:3−(1−ピロリジニル)−1−ヒドロキシプロピリデンビスホスホン酸、
リセドロン酸:2−(3−ピリジニル)−1−ヒドロキシ−エチリデンビスホスホン酸、
アミノ−オルパドロン酸:3−(N,N−ジメチルアミノ−1−アミノプロピリデン)ビスホスホネート(IG9402)等である。
の化合物を提供する。少なくとも1個の窒素を含有する例示的な陽イオンとして、種々のアンモニウム、モノ、ジ、トリ又はテトラ置換されたアミノ陽イオンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、少なくとも1個の窒素を含有する陽イオンは、式、[NR1R2R3R4]+によって表すことができ、R1、R2、R3及びR4は独立して、水素又は脂肪族部分である。一実施形態において、脂肪族部分は、C1−5アルキル(例えば、NH4 +、NH3CH3 +、NH3CH2CH3 +等)、C1−5アルケニル又はC1−5アルキニル等から選択される。一部の実施形態において、M+は、カリウム(K+)、ナトリウム(Na+)又はリチウム(Li+)である。一実施形態において、M+はK+である。式Iの化合物に関して、M+が複数の電荷を有する陽イオンである場合、陽イオン−陰イオンバランスを満たすよう複数の陰イオン等価物が提示される。例えば,陽イオンがCa2+又はMg2+である場合、陽イオン−陰イオンバランスの要件を満たすよう2個の陰イオン等価物が提示される。
本明細書に記載されている化合物の調製において利用されるプロセスは、所望の特定の化合物に依存する。特定の置換基の選択要因及び特定の置換基の様々な位置候補は全て、本発明の特定の化合物の調製経路の採用における役割を果たす。これらの要因は当業者によって容易に認識される。
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載されている化合物を含む医薬組成物である。別の実施形態において、医薬組成物は、医薬的に許容可能な担体を更に含む。本明細書における用語「医薬的に許容可能な担体」は、それ自体は治療薬ではなく、治療薬を対象へと送達するための溶剤として用いられる任意の物質を意味する。医薬的に許容可能な担体及び様々な組成物のための製造方法の例として、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第18版、Mack Publishing Co.(1990)(米国特許出願公開第2007/0072831号明細書も参照)における記載が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本発明の一態様は、本明細書に記載されている化合物を対象に治療上有効量投与するステップを含む、対象における少なくとも1種類のウイルスに関連する状態/疾患を処置する方法を提供する。
本明細書に記載されている化合物は、追加的な免疫抑制剤と組み合わせて(同時的又は逐次的に)用いて、免疫抑制薬を必要とする対象のウイルスに関連する疾患を処置することができる。いずれかの適切な免疫抑制剤は、本明細書に記載されている化合物と組み合わせて用いることができる。本明細書において、免疫抑制薬は、上述のE節に記載されており、免疫抑制効果をもたらすために有効な量が用いられる。
次の非限定的な実施例によって、本発明を更に詳細に説明する。
(1)環状シドホビルのヘキサデシルオキシプロピル、オクタデシルオキシプロピル、オクタデシルオキシエチル及びヘキサデシルエステルの合成
N,N−DMF(25mL)中のシドホビル(1.0g、3.17mmol)懸濁液に撹拌下、N,N−ジシクロヘキシル−4−モルホリンカルボキサミジン(DCMC、1.0g、3.5mmol)を添加した。混合液を一晩撹拌して、シドホビルを溶解した。次に、この清澄な溶液を付加漏斗(addition funnel)に充填し、高温の1,3−ジシクロヘキシルカルボジイミド(1.64g、7.9mmol)のピリジン溶液(25mL、60℃)に撹拌下、時間をかけて加えた(30分間)。この反応混合液をセ氏100度で16時間撹拌し、続いて室温へと冷却し、溶媒を減圧下で除去した。残渣をシリカゲルに吸着し、勾配溶出(CH2Cl2+MeOH)を用いたフラッシュカラムクロマトグラフィーにより精製した。最後に、5:5:1のCH2Cl2/MeOH/H2OによりUV活性生成物を溶出した。溶媒の蒸発により、860mgの白色の固体を得た。1H及び31P NMRスペクトルは、これが環状シドホビルのDCMC塩であることを示した(収率=44%)。
上述において得られたヘキサデシルオキシプロピル−環状CDVを0.5M NaOHに溶解し、室温で1.5時間撹拌した。次に、50%酢酸水を滴下し、pHを約9に調整した。沈殿したHDP−CDVを濾過により単離し、水でリンスし、乾燥し、次に再結晶化し(3:1のp−ジオキサン/水)、HDP−CDVを得た。
遊離酸型CMX157は、当業者にとって公知の方法により調製することができる(例えば、Painterら、Evaluation of hexadecyloxypropyl−9−R−[2−(Phosphonomethoxy)propyl]−adenine、CMX157, as a potential treatment for human immunodeficiency virus type 1 and hepatitis B virus infections:Antimicrob Agents Chemother 51:3505〜9(2007)及びPainterら、Design and development of oral drugs for the prophylaxis and treatment of smallpox infection. Trends Biotechnol 22:423〜7(2004)を参照)。
A.材料と方法
初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞(RPTEC)、BKV(Dunlop)及びあらゆる方法は、以前にBernhoffら(Bernhoffら、Cidofovir inhibits polyomavirus BK replication in human renal tubular cells downstream of viral early gene expression、Am J Transplant 8、1413〜1422(2008)を参照)によって記載された通りのものである。唯一の例外として、細胞内又は細胞外BKV DNA負荷量を定量化するための定量的PCR(qPCR)は、LTag遺伝子も標的とする異なるプライマー/プローブセットを用いて行った(Hirschら、J. Prospective study of polyomavirus type BK replication and nephropathy in renal−transplant recipients、N Engl J Med.、347、488〜496(2002)を参照)。各実験の前に、CMX001を1mg/mlとなるようメタノール/水/水酸化アンモニウム(50/50/2)に新しく溶解した。これをRPTEC成長培地で更に希釈した。
(1)阻害濃度IC90の決定
BKVの後代におけるCMX001の効果を調べるため、2hp.i.に濃度増加のCMX001を添加し、72hp.i.に上清を回収した。CMX001が、濃度依存的様式で細胞外BKV負荷量を低下させることが観察された(図1aを参照)。ウイルスのインプットを差し引くと、CMX001、0.31μMは、BKV負荷量を平均90%低下させ、これにより阻害濃度IC90を画定した。72hp.i.のBKV感染RPTECの免疫蛍光染色は、CMX001濃度が増加するにつれBKV感染細胞の数がより少なくなることを立証した(図1b)。CMX001、0.31uMにより、BKVアグノプロテイン発現細胞のおよそ60%の減少が観察された。LTagを発現する細胞数はあまり低下しなかったが、シグナル強度は無処置細胞よりも低かった。2.5uM CMX001では、ごく一部の細胞がアグノプロテイン及びLTag発現に関して陽性であったが、ウエル内の細胞全数は減少の様相を呈した。5uM CMX001では、弱くLTag染色された細胞がごく一部観察されたが、アグノプロテイン発現細胞は観察されず、総細胞数に対してより顕著な効果があった。10uM CMX001では、BKV感染細胞は観察されず、総細胞数は更に減少した。結論として、CMX001は、初期及び後期BKVタンパク質の発現並びに細胞外への後代の産生を低下させるが、より高濃度ではRPTECの増殖速度にも影響を及ぼすと思われる。
位相差顕微鏡によるRPTECの検査は、CMX001、0.31μMへの曝露3日間の間に生存率が損なわれたいかなる兆候も明らかにしなかった。より高感度のアッセイを用いるため、非感染RPTECにおけるBrdU取り込み及びWST−1アッセイを用いて宿主細胞DNA複製及び代謝活性を用いた。CMX001の添加は、非感染RPTECのDNA複製(図2a)及び代謝活性(図2b)の両方を濃度依存的様式で低下させた。無処置RPTECと比較すると、0.08〜10μMのCMX001は、それぞれDNA複製を15%〜93%、代謝活性を41%〜88%減少させた。BKV複製の90%阻害をもたらす0.31μM濃度において、BrdU取り込み及びWST−1活性のおよそ20%の低下が観察される。
BKVゲノム複製がCMX001の影響を受けるか否かを調べるため、24〜72hp.i.における細胞内BKV負荷量をqPCRにより測定した。記載されている通り(Bernhoffら、2008;Randhawaら、Quantitationation of DNA of polyomaviruses BK and JC in human kidneys.J Infect Dis.、192、504〜509(2005)を参照)、アスパルトアシラーゼ(ACY)遺伝子を用いて細胞内BKV負荷量を細胞数に対し正規化した。無処置RPTECと比較すると、CMX001、0.31μMは、細胞内BKV負荷量を48hで94%、72hp.i.で63%低下させた(図3)。このように、BKV生活環の第二のステップである細胞内BKVゲノム複製におけるCMX001の有意な阻害効果が同定できた。このステップは、2種の機序、1.後期遺伝子転写のためのDNA鋳型の増加及び2.後期プロモーターからの転写の活性化(Cole、C.N.、Polyomavirinae:The Viruses and Their Replication. In Fields Virology、Third edn、1997〜2043頁、B.N.Fields、D.M.Knipe&P.H.Howley編、New York:Lippincott−Raven(1996))によってウイルスの後期遺伝子発現も増加させる、LTag発現を必要とすることが公知である。
単細胞レベルのLTagの発現を調べるため、48及び72hp.iにおいて免疫蛍光染色を行った。48hp.i.において、BKV陽性細胞の数は、CMX001及び無処置ウエルでほぼ同じであった。72hp.i.において、CMX001処置細胞は、細胞当たりのLTag発現がより低いと思われる(図4a)。48及び72hp.iにおける後期タンパク質発現を免疫蛍光染色により検査すると、CMX001処置RPTECにおいてアグノプロテイン(図4a)及びVP1(データ図示せず)の有意な低下が観察された。ウエスタンブロッティングにより、VP1の減少が48及び72hp.i.においてそれぞれ86%及び63%であると判明し(図4b)、一方、LTag染色は、48及び72hp.i.においてそれぞれ33%及び30%減少したことが判明した。興味深いことに、免疫蛍光は、最大2.5μMのCMX001濃度であっても無処置細胞に匹敵するレベルでアグノプロテインを発現する、CMX001処置培養物における一部の不応性細胞も明らかにした。CMX001は、後期タンパク質発現を有意に低下させるが、感染後期の時点において初期タンパク質発現も阻害すると結論された。
BKV後代におけるCMX001の経時的な効果を検査するため、処置及び無処置細胞の上清を表示の時点で回収した。以前に記載した通り(Bernhoffら、2008)、無処置RPTECにおけるBKV(Dunlop)の第一の生活環の完了は、48〜72時間の間に起こる。無処置細胞48hp.i由来の上清においてBKV負荷量増加が観察されたが、CMX001処置細胞48hp.i.においてはインプットウイルスしか検出できなかった。72時間目に、無処置及びCMX001処置細胞の両方においてウイルス負荷量の増加が観察されたが、CMX001処置細胞由来の上清におけるBKV負荷量は、無処置細胞よりも84%低かった(1.13×108Geq/ml)(図5)。CMX001処置RPTECにおける後代の産生は遅延され得ると結論された。
ウイルス接種前の細胞の前処置がBKV感染を阻害し得るか否か調べるため、RPTECを4時間処置し、感染20時間前にCMX001を完全成長培地に交換した、或いは、感染24時間前に細胞を23時間処置し、感染1時間前にCMX001を完全成長培地に交換した。処置4時間、感染20時間前終了は、BKV負荷量72hp.i.においてほとんど何の効果もなかったが、感染1時間前まで処置23時間は、ウイルス負荷量を約50%低下させた(図6)。このように、CMX001前処置は、BKV複製を低下させはしたが、抑制はしなかった。
CMX001原液の安定性を検査するため、1mg/mlを4又は−20℃に1週間置き、続いて0.31uMになるよう希釈し、BKV感染RPTEC、3dp.iにおける細胞外BKV負荷量を測定することによってその抗ウイルス効果を試験した。4℃で保存した薬物は新たに調製した薬物と比較して60%未満の活性を有していたが、−20℃で保存した薬物はおよそ90%の活性を有していた(図7)。
BKV感染RPTECのCMX001による処置から得られた予備段階の結果を、図1〜7と共に図1〜7に関する上述の考察に示す。CMX001は、CDVよりも約400倍低い濃度で(CDV 40ug/ml=127uM対CMX001 0.31uM)、BKVゲノム複製のレベルでBKV感染を阻害する。0.31uM濃度のCMX001は、細胞外BKV負荷量をおよそ90%低下させ、これによりIC90を画定した。このCMX001濃度は、非感染細胞における細胞DNA複製を22%、代謝活性を20%減少させた。しかし、以前の一部の研究(Bernhoffら、2008)において、BKV感染が、細胞DNA複製を約40%、代謝活性を20%前後増加させることが示され、従って仮説として、CMX001、0.31uMを用いてBKV感染細胞を処置すると、DNA複製及び代謝活性の両方が非感染細胞レベルとなるであろう。
A.材料と方法
(1)細胞培養
COS−7細胞をDMEM−5%において増殖させる。前駆細胞に由来するアストロサイトを、ゲンタマイシンで補充したMEM−E−10%において維持した。TCID50が1ml当たり104.5の感染COS−7細胞由来のJCV Mad−4(ATCC VR−1583)上清を培養細胞の感染に用いた。
60〜70%コンフルエンスのCOS−7又はアストロサイト細胞を推定TCID50 0.2のJCV(Mad−4)に感染させた。2時間37℃のインキュベーションの後、上清を濃度増加のCMX001を含まない又は含む新しい培地に交換した。CMX001を1mg/mlになるようメタノール/水/水酸化アンモニウム(50/50/2)に新たに溶解し、続いて各成長培地で更に希釈した。
リポフェクタミン2000(Invitrogen)を用いてメーカーの説明書に従い、再連結したJCV Mad−4 DNAを50%〜70%コンフルエントのCOS−7細胞にDNA:脂質比、0.8:1でトランスフェクトした。
細胞をリン酸緩衝食塩水pH6.8(PBS)中の4%p−ホルムアルデヒド(PFA)で室温にて20分間固定し、PBS中の0.2%Triton X−100により室温で10分間透過処理した。室温にて5分間PBSで2回洗浄した後、PBS中の0.5M NH4Clで室温にて7分間処理することによりPFAを反応停止し、続いて室温にて5分間PBSで2回洗浄した。PBS中の3%ミルクにより非特異的結合部位のブロッキングを37℃で15分間行った。一次抗体(ウサギ抗VP1、3%ミルク/PBSで1:300)を37℃で45〜60分間インキュベートした。振盪機において室温で5分間、細胞をPBSで2回洗浄した。二次抗体(ニワトリ抗ウサギCy3、1:2000)及びDNAを染色する5μg/mlのヘキスト33342色素を細胞に添加し、続いて37℃で45〜60分間インキュベートした。細胞を先に述べた通りPBSで2回洗浄した。カバーガラスをN−没食子酸プロピル(NPropylgallat)中にマウントした。
100ulの細胞培養上清からDNAを抽出した後、Corbett X−tractor Gene及びCorbett VX試薬(Qiagen、スイス、ホンブレヒティコン)によりJCV負荷量を定量化した。JCV DNA試料の検出のためのリアルタイムPCRプロトコールはJCVラージTコード配列を標的とし、これについては他に記載されている(5)。
生細胞におけるミトコンドリアの脱水素酵素の比色WST−1アッセイ(Roche)により、代謝活性をモニターした。96ウエルプレートにCOS−7細胞を播種し、表示濃度のCMX001を添加した。450nm(試料)及び650nm(バックグラウンド)にてWST−1開裂産物を測定した。WST−1プラス培地単独をブランク値とした。
「細胞増殖ELISA、BrdU」キット(Roche)を用いた増殖細胞におけるDNAへのBrdU取り込みの比色測定によってDNA合成を定量化した。COS−7細胞を96ウエルプレートに播種し、表示濃度のCMX001を添加した。基質添加2時間後に450nm(試料)及び650nm(バックグラウンド)の吸光度を決定した。
(1)細胞培養におけるJCV Mad−4の複製
先ず、COS−7及びアストロサイト細胞培養物におけるJCV Mad−4複製の特徴を調べた。感染後7日目に(d.p.i.)JCV感染COS−7細胞を固定し、間接免疫蛍光法により染色した。図8に示す通り、JCV後期ウイルスカプシドタンパク質VP1を赤色シグナルとして検出でき、これは、JCVが、COS−7細胞においてウイルスの生活環を完了しつつあることを示唆する(図8、左パネル)。ヘキスト33342によるDNAの対比染色は、核を青色にマークした(図8、中央パネル)。両方の写真の重ね合わせ(図8、右パネル)は、JCV Mad−4 VP1が、感染COS−7細胞の核に存在することを示す。更に拡大すると、VP1シグナルが核小体を除く核内全体にわたって分散していた(図8、左パネル)。核に強いVP1シグナルを示す細胞は、同様に細胞質にも拡散した染色パターンを有していた。JCV感染細胞は、同一細胞培養物中に存在する非感染細胞(図8、右パネル)と比較して拡張した核(図8、中央パネル)を示した。データは、COS−7細胞がJCV Mad−4感染に対し感受性であること、また、細胞の約30%が7d.p.i.にJCV生活環後期に入ったことを立証する。
JCV後代におけるCMX001の効果を調べるため、2hp.i.に濃度増加のCMX001を添加し、5d.p.i.に上清を回収した。CMX001が、濃度依存的様式で細胞外JCV負荷量を低下させることが観察された(図12)。p.i.1日目から5日目の間に、ウイルス負荷量は、無処置細胞において約2.5log(1.24×107対5.09×109)増加した。それに対し、2.5μM CMX001で処置した細胞において、同じ期間内にほんの2と1/2倍の増加が観察された(9.69×106対2.44×107)。p.i.1日目のウイルス負荷量として定義されたウイルスインプットを差し引くと、0.15μMのCMX001はJCVウイルス負荷量を>50%低下させ、0.6μMはJCVを>90%低下させ、これにより、それぞれd.p.i.5日目の阻害濃度IC−50及びIC−90を画定した。
位相差顕微鏡によるCOS−7の検査は、CMX001、0.6μMに7日間曝露している間、生存率を損なういかなる兆候も明らかにしなかった。より高感度のアッセイを用いるため、非感染COS−7細胞におけるWST−1アッセイ及びBrdU取り込みを用いた細胞代謝活性における効果を調べた。CMX001の添加は、非感染COS−7細胞の代謝活性(図13)及びDNA複製(図14)を濃度依存的様式で低下させた。無処置COS−7細胞と比較すると、0.08から10μMへのCMX001濃度の増加は、それぞれ代謝活性を3%から52%へと、DNA複製を83%から10%へと減少させた。0.6μMにおいて、COS−7細胞は、代謝活性の17%の中程度の減少、およそ50%低下したBrdU取り込みを示した。総合すると、CMX001は、より高濃度で宿主細胞の代謝活性及びDNA複製を有意に低下させた。CMX001濃度0.08〜5μMにおけるアストロサイト細胞を用いて類似の実験も行った。非感染アストロサイトにおけるDNA複製は、最高CMX001濃度で25%〜92%減少した(データ図示せず)。両方の細胞型のDNA複製のCMX001関連阻害を比較すると、COS−7は僅かに感受性が低い(それぞれ83%対92%)と思われた。しかし、アストロサイト細胞に関して、アッセイの2時間の基質インキュベーション期間は、光学密度がCOS−7の読み取り値と比較して低かったため、最適ではないと思われる。これは、アストロサイト細胞の代謝が、COS−7細胞と比較して遅いという本出願人らの観察と一致する。
JCV後代レベルにおけるCMX001の経時的な効果を検査するため、処置及び無処置細胞の上清を表示時点で回収した。p.i.1日目における上清をインプットウイルスの測定値とした。無処置細胞において、細胞外JCV負荷量は、7日間の観察期間にわたって3logを超えて増加した(1.24×107対5.67×1010geq/ml)。5μM CMX001の存在下、JCV負荷量において1log未満の中程度の変化しか観察されない(1.34×107対8.85×107geq/ml)(図15)。7d.p.i.のCMX001、5uM処置細胞に関するJCウイルス負荷量を3d.p.i.の無処置細胞におけるウイルス後代と比較すると、CMX001処置細胞におけるウイルス負荷量は、僅か91%に達する(9.72×107対8.85×107geq/ml)。CMX001処置COS−7細胞における後代の産生が遅延し得ることが結論された。
後期遺伝子発現におけるCMX001の効果を調べるため、JCV VP1の免疫蛍光染色を行った。7d.p.i.において、比較として無処置COS−7細胞におけるJCV VP1を染色した(図16、上パネル)。1.25μMのCMX001の添加は、JCV VP1シグナルの有意な低下に関連した(図16、中央パネル)。5μMの最高CMX001濃度において、基本的にVP1陽性細胞は免疫蛍光によって観察できなかった(図16、下パネル)。CMX001は、JCV後期タンパク質発現を1.25μM〜5μMの間で有意に低下させたと結論された。
JCV後代レベルにおけるCMX001の効果を経時的に検査するため、処置及び無処置細胞の上清を表示時点で回収した。インプットウイルスを決定するため、試料を1d.p.i.にて採取した。無処置細胞の感染の過程において、細胞外JCV負荷量は、7日間の期間にわたっておよそ1log変化する(3.22×107対2.30×108geq/ml)。CMX001の存在下、1log未満のJCV負荷量が観察された(1.34×107対8.85×107geq/ml)(図17)。JCV複製は、アストロサイト細胞においてCOS−7よりも有意に遅かったと結論された。低濃度のCMX001が後代の産生を阻害する傾向にもかかわらず、7日間の観察期間ではCMX001の阻害効果を測定できなかった。
予備段階の結果は、CMX001が、COS−7細胞におけるJCV複製を阻害することを示唆する。0.6μMのCMX001濃度は、細胞外JCV負荷量をおよそ90%低下させた。この濃度は、CDV阻害において報告された濃度よりも2桁低いが、BKVに観察されたものと同じ範囲である。これにより、初代尿細管上皮細胞におけるBKV複製のCMX001 IC−90を0.31μMと決定した(34)。CMX001が、宿主細胞の代謝活性を17%、DNA複製を約50%減少させることが観察された。1から7d.p.i.に細胞外JCV負荷量を測定すると、最高濃度のCMX001(5μM)で処置した細胞からのJCV負荷量は、1d.p.i.のインプットウイルスよりも5d.p.i.において僅かに高かっただけであり、4日以内に放出されたウイルスは殆どない又は全くないことを示す。7d.p.iにおいて、この濃度におけるJCV負荷量がごく僅かに増加し、後代ウイルスのレベルが、無処置細胞の3d.p.i.に測定されたウイルス負荷量を下回った。アストロサイト細胞において、低濃度のCMX001が、後代ウイルスの蓄積を遅延し得る傾向がある。しかし、無処置アストロサイト細胞の7d.p.i.における非効率的な後代ウイルス産生は、JCV複製サイクルが有意により遅いことを立証する。
化合物:
Chimerix、Inc.によって提供された試験材料CMX021(シドホビル)を40mMで水に可溶化し、CMX001をDMSOに20mMで可溶化した。in vitro抗ウイルスアッセイのため、CMX−021に対し100μMの高試験濃度及びCMX001に対し500nMの高試験濃度を半log(half-log)増分で段階希釈し、これを用いて試験材料を評価した。CMX−021に関して、10μMに低めた高試験濃度を用いて第二のアッセイを行った。
[細胞調製]
抗ウイルスアッセイにおける使用前に、15μg/mLポリ−L−リジンでコーティングしたT−75フラスコ内のアストロサイト培地(ScienCellカタログ#1801;2%FBS、アストロサイト増殖サプリメント及びPen/Strepを補充した基本培地)において、ヒトアストロサイト(ScienCellカタログ#1800)を継代した。血球計数器及びトリパンブルー色素排除試験を用いて全細胞及び生存率の定量化を行った。アッセイに利用する細胞の細胞生存率は、95%より高かった。細胞を1ml当たり1×106細胞になるようポリ−L−リジンコーティングしたマイクロタイタープレートに100μLの容量でアストロサイト培地に再懸濁し、一晩37℃で接着させた。
アッセイに用いたウイルスは、ATCC(カタログ#VR−1583)から入手したJCVMAD−4であり、ストックウイルスプールの作製のためにCOS−7細胞においてこれを増殖させた。予め力価測定したウイルスアリコートをフリーザー(−80℃)から取り出し、生物学的安全キャビネット内で徐々に室温へと解凍した。ウイルスを組織培養培地に再懸濁し、100μL容量の各ウエルに添加したウイルスの量が感染7日後に定量的PCRによって最適化された量となるように希釈した。
各プレートは、実験ウエル(薬物と細胞とウイルス)に加えて、細胞対照ウエル(細胞のみ)、ウイルス対照ウエル(細胞とウイルス)、薬物毒性ウエル(細胞と薬物のみ)、薬物比色対照ウエル(薬物のみ)を含有する。化合物毎に5通りの半log希釈を用いて試料を3回反復して試験した。
5%CO2インキュベーターにおける37℃のインキュベーションの後、試験プレートをテトラゾリウム色素XTT(2,3−ビス(2−メトキシ−4−ニトロ−5−スルホフェニル)−5−[(フェニルアミノ)カルボニル]−2H−水酸化テトラゾリウム)で染色した。XTT−テトラゾリウムは、代謝的に活性な細胞のミトコンドリア酵素によって可溶性ホルマザン生成物に代謝される。RPMI1640中の1mg/mLストックとしてXTT溶液を毎日調製した。フェナジンメトサルフェート(PMS)溶液をPBS中に0.15mg/mLになるよう調製し、暗所で−20℃にて保存した。XTT溶液1ml当たり40μLのPMSを添加することによって、XTT/PMSストックを使用直前に調製した。50マイクロリットルのXTT/PMSをプレートの各ウエルに添加し、プレートを4時間37℃で再度インキュベートした。プレートを粘着プレートシーラーで封じ、穏やかに振盪又は数回反転して可溶性ホルマザン生成物を混合し、Molecular Devices Vmaxプレートリーダーを用いてプレートを450/650nmで分光光度的に読み取った。
ウイルスの力価測定の際に抽出したウイルスDNAのPCR増幅により、定量標準として用いるためのJCウイルスDNA産物を作製した。簡単に言うと、TaqPro Complete PCRミックス(Denville Scientific)並びにDNAオリゴヌクレオチドJCV3827F(5’−GGTTTCCAAGGCATACTGTGTAAC−3’)及びJT−2(5’−GAGAAGTGGGATGAAGACCTGTTT−3’)を用いて、7日目の力価測定標本100μlから得られた5μlのウイルスDNAを増幅した。その結果得られた532塩基対の産物を、QIAquick PCR精製カラム及び試薬(Qiagen)を用いて精製し、260nmの吸光度に基づいて定量化した。自動ジデオキシ配列決定及びNCBI非重複データベースに対するblast解析により、産物の配列をJCウイルスとして立証した。
Softmax Pro4.6ソフトウエアから生データを収集し、線形曲線適合計算による解析のためのMicrosoft Excel 2003表計算ソフトにインポートした。
抗JCポリオーマウイルスの評価:2実験において、ヒトアストロサイトにおけるJCVのMAD4株に対しCMX001及びCMX021(CDV)を評価した。2実験において、異なるロットの凍結アストロサイトを用いた。
2ロットのヒトアストロサイトを用いてImQuest BioSciences、Inc.によって標準化されたマイクロタイターin vitroアッセイシステムを用いて、JCポリオーマウイルス(JCV)に対する抗ウイルス活性に関して2種の試料を評価した。化合物CMX021−009は、HA細胞においてJCVMAD−4に対する抗ウイルス活性を立証し、これは独立したアッセイにおいて、類似のEC50値だが有意に異なるTC50値から得られた治療指数358.5及び3.2を得た。CMX−001−044は、異なるHA細胞ロットのJCV感染から一貫した抗ウイルス活性を立証し、これは治療指数16.4及び5.5を得た。
第一の患者は、EBV関連頭蓋内移植後リンパ球増殖性障害(PTLD)を発症した鎌状赤血球貧血症の病歴を有する11歳の患者である。血漿においてEBVが陽性であり(2010年12月7日及び12月14日)、脳生検はPTLDと一致した。12月初旬に、患者は、3日間の持続性の頭痛、嘔気、嘔吐及び下痢の病歴を呈した。患者は入院し、発作活動の可能性のある重篤な頭痛の急性発作を起こした。脳のCTは、右前頭葉にリング状に増強された腫瘤を示し、脳生検はEBV関連PTLDと一致した。患者はPICUに入れられた。高い頭蓋内圧、無呼吸に関連する反復性発作のため、挿管(intubtion)及びCMX001の緊急要請を行った。このEBV関連PTLD患者におけるCMX001の使用は、2009年12月26日から進行中である。患者は、CMX001に十分な耐容性を示し、4mg/kgを1週間に2回の投与を継続した。彼女(患者)は、疾患の兆候及び症状に臨床上の改善を得、頭蓋内腫瘤の減少がなければ安定化を得た。血漿中のEBVは、陰性を維持した。
薬物に起因し得る投与後の臨床上有意な消化管カプセル内視鏡検査による知見なし。
腎機能不全を示す値等、臨床検査値への薬物に関連する臨床上有意な変化なし。
重大な有害事象(SAE)なし、有意な有害事象(AE)(即ち、≧グレード2)なし、薬物に直接的に起因し得るAEなし。
アデノウイルス感染症は、免疫低下患者における重篤な罹患率及び死亡率の原因となる。現在、米国においてアデノウイルス感染症処置のためのFDAに認可された治療法は存在せず、様々な抗ウイルス剤又はIVIG若しくはドナーリンパ細胞注入等の免疫療法に関して逸話的な適応外使用しか記載されていない。これら薬剤の多くの使用は、毒性があり効力のエビデンスが殆どないことによって限定されている。本出願人らは、小児骨髄移植レシピエントにおける重篤な播種性アデノウイルス感染症の症例の処置における新規の抗ウイルス剤としてのCMX001の使用の成功を報告する。移植片対宿主疾患による重篤なGI機能不全の存在下における経口投与及び結腸のウイルス感染を立証した生検にもかかわらず、患者は、薬物吸収と、その後の処置に対する臨床及びウイルス学的(ウイルス負荷量の8log減少)反応を立証した。
重篤な再生不良性貧血の12歳女児は、アレムツズマブ/フルダラビン/メルファラン前処置の後、9/10HLA適合(Bがアレル不適合)同種骨髄移植を受けた。シクロスポリンA、メトトレキサート及び抗胸腺細胞グロブリンによる予防にもかかわらず、彼女は腸及び皮膚のグレード4移植片対宿主疾患(GvHD)を発症し、これは高用量ステロイド及びモノクローナル抗体に対し抵抗性であった。彼女はその後、救済使用実験プロトコールにより間葉系幹細胞の投与を受け、経腸栄養に耐容性を示すように徐々に改善した。彼女は、市販の検証されたアッセイ(Viracor)を用いた定量的血漿アデノウイルスDNA PCR解析値の上昇を伴いつつ反復性の下痢を発症した。結腸生検及び便培養によりアデノウイルス腸炎が確認され、肺標本も培養され疾患経過後期において陽性であった。免疫抑制(タクロリムス、ミコフェノール酸塩及びプレドニゾン)の漸減及びIVシドホビル1mg/kg、1週間に3回による処置にもかかわらず、血漿アデノウイルス血症は、6億8000万コピー/mlに増加した。シドホビルを5mg/kg、1週間に1回に増加し、静脈内免疫グロブリンを投与したにもかかわらず、彼女の臨床状態は、重篤な消化管(GI)出血、肝炎及び最終的な呼吸不全を発症して悪化した。
当初、患者は、重篤なGI出血のため持続的鼻腔胃(NG)吸引を必要とし、よって、耐容性を示す限り(一般に、1〜3時間)吸引を中断しつつNGチューブを介してCMX001を投与した。検証された分析手法(LC/MS/MS)を用いてCMX001及びシドホビル濃度を解析するため、患者の処置コースを通じて定期的な間隔で血漿試料を得た。興味深いことに、AdVウイルス血症は、処置の最初の5週間(約10回目の用量の間)に、CMX001の推定血漿曝露よりも低いにもかかわらず回復した(図20、挿入図)。吸収と最終的なCMX001への全身性曝露における患者GI出血及び鼻腔胃吸引の使用の潜在的な影響は不確実であるが、患者のGI出血が回復し、CMX001のより高い全身性曝露が観察されたため、曝露を減少させた可能性がある。先行するビスタイド(登録商標)投与から残存シドホビルを除去した後、CMX001に由来するシドホビルの最大血漿濃度は、80ng/mLを超えなかった。それに対し、ビスタイド(5mg/kg、プロベネシド含有)投与後のシドホビルのピーク血漿濃度は、19,600ng/mL(ビスタイド(登録商標)添付文書)の範囲である。
免疫低下患者におけるアデノウイルス(AdV)感染症の有病率は増加しており、現在同種BMTレシピエントの8.5%〜30%、特に、重篤な移植片対宿主疾患(GVHD)及び<300細胞/mm3のリンパ球絶対数(ALC)の患者で発生している。死亡率は、70%もの高さである。シドホビル(CDV)は、前向き又は対照治験からの支持的データなしでAdV疾患の処置に用いられる。CDVは、有意な腎毒性及び不定期の好中球減少症に関連する。AdV感染症のための確定的処置として確立された治療薬はない。シドホビルの脂質コンジュゲートであるCMX001は、細胞によって取り込まれ、細胞内で開裂されて遊離型CDVを生じ、これは、リン酸化されて活性抗ウイルス剤、シドホビル二リン酸塩(CDV−PP)を生成する。in vitroでは、CMX001は、ヒト末梢血単核細胞(PBMC)において、等モルのCDVよりも更に高い細胞内レベルのCDV−PPを生じる。このことは、下記の表6に示すアデノウイルスに対する効力の増加を説明する。静脈内に投与する必要のあるCDVとは異なり、CMX001は、経口投与される。また、CMX001は、おそらく腎有機アニオン輸送体がCMX001を認識できないため、腎毒性の可能性が低い。
AdV処置のためにCMX001の緊急用新薬治験承認を与えられた患者の記録を遡及的に解析した。CMX001で処置した16名のAdV疾患患者のうち、13名が、CMX001開始後≧4週間の利用できるデータを有していた。CMX001の用量は、およそ1mg/kgを1週間に1回から4mg/kgを1週間に2回までの範囲であった。VireCor(9症例)、Focus Diagnostics(2)及びワシントン大学分子ウイルス学研究室(Molecular Virology Laboratory)(2)においてアデノウイルスqPCRを行った。播種性AdV疾患は、血液等、2以上の部位からのウイルスの単離によって定義した。CMX001処置の最後に、ウイルス学的反応(VR)は、血漿VLにおけるベースラインからの≧99%下落又は検出不能な血漿ウイルスのいずれかとして定義した。ウィルコクソン符号順位検定を用いて、ベースラインから1、2、4、6及び8週目にVLが変化したか否か評価した。ロジスティック回帰分析モデルを用いて、共変数とVRの間の関連性の可能性を評価した。
[ベースライン]
群の年齢中央値は、12歳(範囲0.92〜66)であった。男性5名及び女性8名、小児患者8名及び成人5名であった。1名の患者は重篤な複合免疫不全症であり、1名は実質臓器移植レシピエントであり、11名は造血細胞移植レシピエント(そのうち10名はGVHD)であった。13名の患者全員が、≧1の追加的な部位からAdVが単離されたウイルス血症であった。GI 7(53.8%);GU 4(30.8%);肺3(23.1%);脳1(3.85%);及び骨髄1(3.85%)。移植後、中央値68(15〜720)日で疾患を診断した。診断におけるALC中央値は、300細胞/μL(範囲50〜1500)であった。全患者は、前CDV投与を受け、AdV感染症不応性又は腎毒性のため中央値21(範囲7〜90)日後にCMX001に切り替えた。患者を中央値68(範囲15〜208)日間CMX001で処置した。
ベースラインと比較した1、2、4、6及び8週目のALC及びVLの関係性を図21a〜21eに示す。VRは、年齢、性別、投与されたCMX001の合計mg数、CMX001のAUC又はCmaxに関連しなかった。CMX001のVLにおける薬力学的効果を表7に示す。VRは、13名の患者のうち8名(61.5%)で達成された。重大な有害事象、消化管、腎又は骨髄毒性は、報告されなかった。CMX001は、アデノウイルスに対して強力なin vitro活性を有しており、免疫低下患者におけるアデノウイルス疾患の処置に対し将来的なオプションとなり得る。この重篤疾患の集団においてCMX001で有意な安全性問題は生じなかった。
サイトメガロウイルス(CMV)感染症は、幹細胞移植設定における有意な罹患率及び死亡率に関連する。シドホビルの脂質コンジュゲートであるCMX001は、経口により投与され、血漿中を脂質コンジュゲートとして循環する。これは標的細胞により効率的に取り込まれ、細胞内で高濃度の活性抗ウイルスが達成される。CMX001の投与を受けた、CMVに感染した幹細胞移植患者における第一の臨床経験を説明する。患者は、AML(急性骨髄性白血病、3患者)、不応性リンパ腫、多発性骨髄腫、重篤な再生不良性貧血及び鎌状赤血球貧血の病歴を有した。7名の患者のうち6名は、幹細胞移植(SCT)を受け、残り1名はSCTを待っていた。CMX001による処置は、1名の患者において移植前に開始し、6名の患者においては21日間から2年間超(中央値61日間)であった。
CMX001は、in vitro及びin vivoの両方でヒトサイトメガロウイルス(HCMV)の複製を阻害することが以前に報告された。CMX001は、一リン酸塩アナログであるため、HCMV UL97キナーゼによる最初のリン酸化を必要としない。従って、これは、多くのガンシクロビル(GCV)耐性株に対し非常に活性が高く、耐性ウイルス感染症の処置に有用となる筈である。本出願人らは、GCVと組み合わせたCMX001のin vitroにおける抗ウイルス活性を調べて、この組み合わせの効力及び安全性を評価した。ヒト包皮線維芽細胞を感染多重度0.01PFU/細胞でHCMVに感染させ、非感染又は感染細胞のいずれかに段階濃度のCMX001及びGCV単独又は組み合わせを添加した。7日間のインキュベーション後に全DNAを回収し、リアルタイムPCRによりウイルスDNAのコピー数を決定した。予想通り、CMX001は、HCMVに対し非常に活性が高く、ウイルスDNAの量を1ナノモル濃度未満の濃度で10倍、10ナノモル濃度で1000倍低下させた。GCVの効力は、比較的中程度であり、10μMでウイルスDNAの蓄積を10倍未満低下させた。CMX001及びGCVの組み合わせは、3ピコモル濃度の低濃度のCMX001がGCVに添加された場合相乗的であった。試験したいずれの濃度に関しても細胞毒性における有意な変化は観察されず、これにより、この組み合わせに毒性がないことを確認した。これらのアッセイにおいて観察されたCMX001の例外的な効力は、全ウイルス転写産物のレベルを決定した定量的リアルタイムRT−PCRに基づくアレイにおいて確認された。ウイルス転写産物レベルの低下は、ゲノムコピー数の低下と一致し、GCVに対してin vitroにおけるウイルス複製の顕著な阻害を反映した。これらの結果は、最適以下の濃度のCMX001とGCVを用いた組み合わせが、in vitroにおいて相乗的であることを明らかに示す。
以前に記載した方法(Prichard and Shipman、1990)と同様の方法により、複合効力を評価するin vitroの抗ウイルスアッセイを用いてCMX001及びGCVの組み合わせを評価した。簡単に言うと、ヒト包皮線維芽細胞(HFF)細胞単層を含有する96ウエルプレート内に直接的にBioMek2000を用いて、薬物希釈液のチェッカーボードマトリックス(checkerboard matrix)を用意した。0.001PFU/細胞の感染多重度(MOI)にて4複製プレートを感染させ、7日間インキュベートし、リアルタイムPCRによってウイルス負荷量を定量化した。2複製プレートは非感染のままであり、7日目にCellTiter−Gloを用いて細胞毒性を評価した。
0.01PFU/細胞のMOIでHCMVのAD169株に感染させた96ウエルプレート内のHFF細胞単層において、ウイルスDNA合成の阻害を決定した。感染させた単層に化合物希釈液を添加し、これを7日間インキュベートした。96ウエルWizardキット(Promega)を用いてアッセイプレートからDNAを単離し、プライマー5’−AGGTCTTCAAGGAACTCAGCAAGA−3’及び5’−CGGCAATCGGTTTGTTGTAAA−3’並びにプローブ5’−(6FAM)CCGTCAGCCATTCTCTCGGCTAMRA−3’を用いたリアルタイムPCRにより定量化した。増幅断片と相同の配列を含有するプラスミドDNA(pMP217)の希釈による検量線を用いて、ウイルスコピー数の絶対量測定を行った。
HCMV遺伝子発現の網羅的解析を可能にするリアルタイムアレイを開発した。この技法は、リアルタイムPCRにより139種のウイルス遺伝子のmRNAレベルを定量化する。ウイルス遺伝子のプライマー並びに実験データの正規化及びΔΔCt法によるウイルス転写産物の定量化に用いられる2種の細胞ハウスキーピング遺伝子を含有する2種のアッセイプレートにおいて解析を行った。
本出願人らの研究室で行われた以前の試験は、ヘルペスウイルス及びオルソポックスウイルスに対するCMX001の効力を立証した。GCVに耐性のある分離株等、HCMVに対する特に優れた効力は、化合物が、耐性感染症の処置において有用となり得ることを示唆した。CMX001及びGCVの組み合わせを評価して、HCMVに対するそれらの複合効力を評価した。複合細胞毒性の評価を同時に行ったところ、相乗的な細胞毒性は観察されなかった(データ含まれず)。CMX001及びGCVの両方は、ウイルスDNA蓄積の低下に有効であった(図22)。リアルタイムPCRによって測定された通り、CMX001は、より強力なウイルス複製阻害剤である。10nMを超えるCMX001の濃度は、ウイルスDNAの増幅を基本的に除去し、これはインプットDNAレベルを維持、或いはそれを下回った。
この化合物で処置した培養物におけるウイルス遺伝子の転写プロファイルを検査することによって、CMX001による特に優れたウイルスDNA合成阻害を更に調べた(図25)。異なる作用機序による化合物への反応は、異なる転写プロファイルを生じる。
以前の試験は、CMX001又はアシクロビル(ACV)のいずれかが、単純ヘルペスウイルス(HSV)分離株に対してin vitroにおいて、また、HSV−1又は2に鼻腔内感染したマウスの死亡率抑制において有効であることを示した。組み合わせたこれら2種の薬剤の最適以下の用量を用いた効力の評価は、これまでに報告されていない。細胞培養において、HSV−1及びHSV−2の野生型及びACV耐性分離株の両方のパネルに対してCMX001を評価し、0.008〜0.03μMの範囲のEC50値で非常に有効であることが判明した。これらのウイルス分離株は、2.0から>100μMの範囲のACV濃度によっても阻害する。組織培養細胞における様々な濃度のCMX001及びACVの組み合わせの使用は、毒性を増加させず相乗的効力を生じた。この組み合わせが動物モデルにおいて増強された効力を生じるかを決定するため、HSV−2に鼻腔内感染したマウスにACVあり又はなしで、1日1回、1.25、0.42又は0.125mg/kgにてCMX001を投与した。1日2回、30、10又は3mg/kgにてACVを投与した。7日間の経口経管栄養によりウイルス感染72時間後に処置を開始した。このモデルにおいて5mg/kgがCMX001の最適用量であるとする以前の研究から予想された通り、単独療法としての1.25、0.42又は0.125mg/kgのCMX001は、生存又は死亡までの平均日数(mean day to death)(MDD)増加を有意に改善しなかった。ACVは、30mg/kg(p=0.06)で生存を単独で改善し、30又は10mg/kg(p<0.01)で死亡までの平均日数を有意に増加させたが、3mg/kgでは増加させなかった。CMX001及びACV両方の最適以下の用量は、死亡率からの保護を有意に増強、或いは組み合わせた9群のうち8群におけるいずれかの薬物単独と比較してMDDを増加させた。相加的な毒性は検出されなかった。これらの結果は、これら2種の薬剤の低用量の組み合わせが、相乗的にin vitro及びin vivoで作用し、ヒトのヘルペスウイルス感染症における使用を検討するべきであることを示した。
HFFにおけるプラーク減少アッセイを用いた確認によるヒト包皮線維芽細胞(HFF)細胞におけるCPEアッセイによるin vitroスクリーニング
動物:BALB/c、雌のマウス、3〜4週齢。
ウイルス接種:鼻腔内、1.1×105pfu/マウスを用いた0.04ml、ほぼLD90。
ウイルスストック:単純ヘルペスウイルス、1型、株E−377、F、HL−3、DM2.1、B−2006、PAAr5及びSC16−S1;又はHSV、2型、株MS、G、SR、AG−3、12247、11680又は11572。
抗ウイルス化合物:CMX001(ヘキサデシルオキシプロピル−CDV若しくはHDP−CDV)、シドホビル(CDV)又はアシクロビル(ACV)。
HSV−1又は−2の野生株に対するCMX001、CDV又はACVの単剤としてのin vitro効力を表8に示す。HSV−1又は−2のACV耐性株に対するCMX001及びACVの効力を表9に示す。EC50値は、CMX001が、in vitroでCDVよりも有効であることを示す。CMX001とACVとの組み合わせは、図27に示す通り、毒性を増すことなく相乗作用を生じた。
ポリオーマウイルス関連腎症又は出血性膀胱炎におけるポリオーマウイルスBK(BKV)複製を処置するための有効な抗ウイルス薬は、相当に臨床的な関心の高い対象である。シドホビルとは異なり、脂質コンジュゲート、1−O−ヘキサデシルオキシプロピル−シドホビル(CMX001)は、齧歯類モデル及びヒトの試験において経口利用でき、限定的な腎毒性を有する。初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞をBKV−Dunlopに感染させ、感染2時間後(hpi)にCMX001を添加した。細胞内及び細胞外BKV DNA負荷量を定量的PCRにより決定し、ウイルス初期及び後期遺伝子発現を逆転写PCR、ウエスタンブロッティング及び免疫蛍光顕微鏡観察により決定した。生存率、代謝活性、DNA複製及びリアルタイム増殖に関して宿主細胞も検査した。細胞外BKV負荷量を72hpiにおいて90%低下させる阻害濃度(IC−90)として、CMX001の力価0.31μMを同定した。本出願人らは、24hpiにおいてBKVラージT抗原mRNA及びタンパク質発現における効果はないが、細胞内負荷量によって測定されるその後のBKVゲノム複製が、48hpiにおいて90%低下したことを見出した。後期遺伝子発現は、48及び72hpiにおいて70〜90%低下した。96hpiのBKV負荷量において24、48、72及び96時間からの曝露を比較すると、CMX001 IC−90阻害は迅速であり、シドホビルIC−90よりも永続的であることが判明した。CMX001、0.31μMは、全体的な細胞代謝にはほとんど効果がなかったが、BrdU取り込み及び宿主細胞増殖を20〜30%低下させ、一方、BKV感染は、対数期及びほぼコンフルエントな培養物の両方で細胞増殖速度を増加させた。CMX001が、400×低レベルにてシドホビルよりも長く続く効果で、関連宿主細胞におけるin vitroの副作用が少なくBKV複製を阻害すると結論される。
[細胞及びウイルス]
初代ヒト腎近位尿細管上皮細胞(RPTEC)(Lonza、www.lonzabioscience.com)をメーカー記載の通りに増殖させた。全実験は、RPTEC継代4及びBKV−Dunlop上清又はVero細胞から勾配精製したウイルスを用いて行った。
各実験の前に、CMX001を1mg/mlとなるようメタノール/水/水酸化アンモニウム(50/50/2)に新たに溶解し、RPTEC成長培地で更に希釈した。約50%コンフルエントのRPTECをBKV(Dunlop)にMOI1で感染させた。37℃2時間のインキュベーションの後、他に記述がなければCMX001を含有する又は含有しない新鮮な培地にウイルスを交換した。
ミトコンドリア脱水素酵素によるテトラゾリウム塩、WST−1の低減を測定する比色WST−1アッセイ(Roche、スイス、ロートクロイツ)により、ミトコンドリアの代謝活性をモニターした。「細胞増殖ELISA、BrdU」キット(Roche)を用いたDNAへのBrdU取り込みの比色測定によって、DNA合成を定量化した。E−plate及びxCelligenceシステム(Roche)を用いて、細胞の付着及び増殖をインピーダンスとして測定した。RPTECがE−plateに付着し増殖するように、プレートを先ずフィブロネクチンでコーティングした。次に、プレートをシステムに接続して細胞培養インキュベーター内で固有の電気接点をチェックする前に、各ウエルに100μlの培地を添加することによってプレートのバックグラウンドインピーダンスをモニターした。その後、表示の細胞数を含有する100μlの細胞懸濁液を播種した。BKV感染及びCMX001処置の効果を決定するため、播種約24時間後、150μlの培地を、CMX001(最終濃度0.31μM)の存在下又は不在下で精製BKV−Dunlopを含有する又は含有しない新鮮な培地に交換した。細胞を96時間培養し、最初の6時間は15分間毎に、その後は30分間毎にインピーダンスを測定した。インピーダンスは、細胞指数(Cell Index)と称する任意の単位として表す。
24、48及び72hpiにおいて、mirVana PARISキット(Ambion)を用いて細胞を溶解し、全RNAを抽出した。アガロースゲル電気泳動によってRNA品質をチェックしてRNA濃度を決定する前に、RNA試料をDNase turbo(Ambion)で処置して残存DNAを除去した。High Capacity cDNAキット(Applied Biosystems)を用いて、試料当たり250ngのRNAからcDNAを作製した。
細胞外BKV負荷量をアッセイするため、24、48及び72hpiに細胞培養上清を回収し、ロボット(GenoM−48、Qiagen、www.qiagen.com)により自動抽出するまで−70℃で凍結した。細胞内BKV負荷量に関しては、細胞を洗浄し、トリプシン処置し、220gを10分間によりペレット化し、MagAttract DNA Mini M48キット(Qiagen)のG2バッファーに再懸濁し、同ロボットにより抽出するまで−70℃で凍結した。
細胞内又は細胞外BKV DNA負荷量を定量化するため、ラージT抗原(LT−ag)遺伝子を標的とするプライマー及びプローブによる定量的PCR(qPCR)を用いた。細胞内BKV DNAを正規化するため、細胞DNAを補正するためのアスパルトアシラーゼ(ACY)遺伝子のqPCRにより各試料を並行して解析した。
細胞を24、48及び72hpiにてCell Disruptionバッファー(mirVana PARISキット、Ambion)に溶解し、これをSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)で分離してPVDF(登録商標)メンブレン上にブロッティングするまで−70℃で保存した。Licor Odyssey Infrared検出システムによる検出に先立ち、LT−ag(1:2000)、VP1(1:10000)又はアグノ(1:10000)(1、27)に対して作製されたポリクローナルウサギ抗血清及びGAPDH(Ab8245;1:5000、Abcam、www.abcam.com)に対して作製されたモノクローナルマウス抗体、続いて両者共に1:5000の抗ウサギ及び抗マウス赤外色素標識二次抗体(IR Dye 800、Rockland、www.rockland−inc.com及びAlexa Fluor 680、Invitrogen、www.invitrogen.com)を用いてBKV及び細胞タンパク質の検出を行った。
細胞をPBSで洗浄し、メタノール固定し、PBS中の3%ヤギ血清で30分間ブロッキングし、続いてその後、一次(37℃)及び二次(r.t.)抗体により30分間のインキュベーションを行った。一次抗体は、モノクローナル抗SV40 LT−ag抗体(Ab−2 Pab416;1:100、Chemicon、www.chemicon.com)及びアグノ又はVP1(共に1:1000)に対して作製されたポリクローナルウサギ抗血清であった。二次抗体は、AlexaFluor568とコンジュゲートした抗マウス抗体及びAlexaFluor488とコンジュゲートした抗ウサギ抗体(1:500;Molecular Probes、www.invitrogen.com)であった。核は、DRAQ5(商標)(Biostatus、www.biostatus.com)で標識した。NIS Elements Basic Researchソフトウエア、バージョン2.2(Nikon Corporation)を備え、これにより処置を行うNikon TE2000顕微鏡を用いて画像を収集した。
[阻害濃度IC−90の決定]
BKV後代におけるCMX001の効果を調べるため、増加濃度のCMX001を2hpiに添加し、上清を72hpiに回収した。本出願人らは、CMX001が、細胞外BKV負荷量を濃度依存的様式で低下させることを観察した(図28a)。ウイルスインプットを差し引くと、CMX001、0.31μMは、BKV負荷量を平均して90%低下させ、これにより阻害濃度IC−90を画定した。この結果と一致して、72hpiのBKV感染RPTECの免疫蛍光染色は、ラージT抗原(LT−ag)及びアグノ発現細胞の数及び強度における濃度依存的減少を立証した(図28b)。10μMもの高CMX001濃度において、BKV感染細胞は観察されなかったが、総細胞数は有意に減少した(データ図示せず;後述も参照)。CMX001は、初期及び後期BKVタンパク質の発現及び細胞外後代の産生を低下させるが、RPTECの増殖にも濃度依存的効果を有すると思われると結論された。
BKV初期遺伝子発現におけるCMX001 IC−90の効果を試験するため、定量的逆転写PCR(qRT−PCR)により24、48及び72hpiの処置及び無処置RPTECにおけるLT−ag mRNAレベルを比較した。結果は、ハウスキーピング遺伝子huHPRTに対し正規化し、24hpiの無処置試料と比べた変化として提示した。24hpiの初期遺伝子発現において差異は見出されなかったが、48hpi及び72hpiにそれぞれ33%及び64%の低下が観察された(図29a)。ウエスタンブロッティングによるLT−ag発現の解析は、24hpiに殆ど差異を示さないが、より後期の時点にて20%〜30%低下を示す一致した結果を明らかにした(図29b)。CMX001は、ウイルス生活環初期においてBKV初期タンパク質発現を阻害しないが、より後期の48及び72hpiに阻害すると結論された。
BKVエピソーム複製は36hpi前後に起こることが公知であるため、BKVゲノム複製が、CMX001によって影響を受けるか否か調べた。24、48及び72hpiにおける細胞内BKV負荷量をqPCRによって測定し、細胞参照遺伝子としてアスパルトアシラーゼ(ACY)を用いて細胞数に対し正規化した。無処置RPTECと比較すると、0.31μMのCMX001は、48時間目に細胞内BKV負荷量を94%、72hpiに91%低下させた(図29c)。これにより、細胞内BKVゲノム複製におけるCMX001の有意な阻害効果を同定した。このステップは、2種の相乗的機序により、即ち、DNA鋳型を増加させ、これにより、後期遺伝子転写のための細胞当たりの遺伝子量(gene dosis)を増加させること、また、後期プロモーターからの転写を活性化させることにより、ウイルス後期遺伝子発現を増加させるLT−ag機能を必要とすることが公知である。
BKV後期遺伝子発現におけるCMX001の効果を試験するため、RT−qPCRにより24、48及び72hpiのCMX001処置及び無処置RPTECにおけるVP1及びアグノmRNAレベルを比較した。後期mRNAレベルは、ハウスキーピング遺伝子huHPRTに対し正規化し、24hpiの無処置試料と比べた変化として提示した。48及び72hpiにおいて、それぞれ93%及び82%の低下が見出された(図30a)。ウエスタンブロッティングにより、それぞれ85及び96%のVP1減少が見出され、一方、アグノは97及び96%低下した(図30b)。
BKV複製におけるCMX001阻害の動態を検査するため、RPTECを感染後に24時間、48時間、72時間又は96時間処置し、96hpiの上清におけるBKV負荷量を決定した。表示の時間において、上清を回収し、細胞を1回洗浄し、新しい完全培地を添加した。96hpiにおいて、上清におけるBKV負荷量を測定した。図示する通り、0.31μM、24時間のCMX001処置は、96hpiにBKV負荷量をおよそ90%低下させるのに十分であった(図31a)。より長い曝露時間は、限界効果しかなかった。これらの条件下において、細胞外BKV負荷量をこのレベルまで低下させるには、40μg/mLで少なくとも48時間のCDV処置が必要とされた。観察されたBKV負荷量の低下が、感染単位数の減少に対応するか否か調べるため、異なる時点で回収した上清を10倍希釈し、新しいRPTECに播種した。p.i.3日目に細胞を固定し、LT−ag及びアグノに対する抗体により免疫蛍光染色を行った。結果は、感染性ウイルスが、細胞をCMX001で僅か24時間処置した後にほとんど検出不能になったが、同様の結果を得るには72時間のCDV処置が必要であったことを立証した(図31b)。CMX001が、CDVよりも迅速且つ永続的な阻害効果を有することが結論された。
位相差顕微鏡は、0.31μMのCMX001への3日間の曝露の間、宿主細胞生存率低下のいかなる大まかな兆候も明らかにしなかった。より高感度のアッセイを用いるため、非感染及び感染RPTECにおけるBrdU取り込み及びWST−1アッセイを用いて宿主細胞DNA複製及び代謝活性を調べた。CMX001が、濃度依存的様式で感染RPTECのDNA複製及び代謝活性の両方を低下させることが判明した(図32a)。とりわけ、BKV複製のIC−90である0.31μMのCMX001は、BrdU取り込みの25%低下を誘導したが、代謝活性を有意に変化させなかった。
腎移植後のBKVの媒介するポリオーマウイルス関連腎症及び同種造血幹細胞移植後の出血性膀胱炎の現在の治療成績の改善には、より高い効力及び特異性を有する抗ウイルス薬が必要とされる。本試験において、ヒト初代近位尿細管上皮細胞におけるBKV複製に関与するその阻害活性に関してCMX001を特徴づけた。結果は、0.31μMのCMX001が、72hpiにおいて細胞外後代BKVの負荷量を90%低下するのに十分であることを立証する。BKV生活環の調査は、CMX001阻害が、BKVゲノム複製のレベルで24hpiにおける最初の初期遺伝子発現の後に起こることを示した。無処置対照と比較すると、細胞内BKVゲノム負荷量は、24から48hpiの間で増加していなかった。更に、その後の48及び72hpiにおける爆発的な後期遺伝子発現が有意に低下したが、無処置細胞においてこれはLT−agの媒介する活性化及びDNA鋳型のより多数の遺伝子コピー数の相乗作用によって生じる。CMX001は、同一試験システムにおけるCDVのIC−90よりも約400倍低濃度で活性であった(CDV IC−90 40ug/ml=127uM対、CMX001 IC−90 0.31uM)。CMX001の阻害活性は、96hpiにおけるBKV後代負荷量IC−90のCDVの48時間から72時間と比較すると、24時間の曝露時間を必要とするCDVと比較して、より速効性且つ永続的であった。阻害動態におけるこの差異は、希釈した上清を新しいRPTECに播種する場合の感染単位においても明らかであり、取り込みが改善され、細胞内濃度が高いリゾホスファチジル様修飾によってもたらされると考えられる。総合すると、データは、親化合物CDVを上回るリゾホスファチジル様誘導体CMX001の有意に増強されたBKV阻害効力を示す。
CDVと比較したCMX001のヒト胎児グリア細胞株SVGにおけるJCV複製における効果を調べた。SVG細胞におけるCMX001の限定的な細胞毒性が、0.01から0.1μMの間の濃度で観察された。CMX001は、初期感染においてJCV感染細胞の用量依存的減少を引き起こし、以前に確立した感染においてJCV感染細胞を実質的に除去したが、これはウイルスDNA複製レベルにおける欠損のためと思われる。ヒトグリア細胞に対して毒性のない濃度におけるJCV感染の抑制及びバイオアベイラビリティ増加は、CMX001をPML患者におけるJCV増殖の制限に利用できる可能性を示唆する。
[細胞及びウイルス]
ヒト胎児グリア培養物を複製開始起点欠損(origin-defective)SV40変異体でトランスフェクトし、その結果得られたSV40T抗原の安定的発現により不死化した細胞培養物を培養することによってSVG細胞を作出した。10%FBS、2mM L−グルタミン及びペニシリン/ストレプトマイシンで補充した最少基礎培地(MEM)中にSVG細胞を維持した。JCVのMad−4変種をヒト胎児脳前駆細胞由来のアストロサイトにおいて増殖させ、該細胞から精製した。ヒトO型赤血球の赤血球凝集(HA)によって、ウイルス濃度を決定した。
96ウエルプレートにおいてウエル当たり1×104〜2×104細胞、或いは6ウエルプレートにおいてウエル当たり3×105細胞の密度でSVG細胞を播種した。一晩37℃で細胞を培養した。次に、培養用培地を除去し、細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)で3回洗浄した。5×104細胞当たり10赤血球凝集素単位(HAU)の濃度のMad−4 JCVを含有する最小限の容量のPBSに細胞を90分間曝露した。培養プレートの呼び容積(nominal volume)まで各ウエルに培養用培地を添加した。非感染対照培養物は、ウイルスなしのPBSと90分間インキュベートした。JCVに一晩曝露した後、培養用培地を薬物含有培地と交換した。
5×104細胞当たり10赤血球凝集素単位(HAU)の濃度のMad−4 JCVにSVG細胞を90分間曝露することによって、感染SVG細胞の培養物を作製した。培養プレートの呼び容積まで培養用培地を添加し、細胞に新しい培地を与え、7〜11継代の間行った。7継代後、培養物は確立した感染であると考慮し、薬物処置実験に用いた。JCV DNA特異的プローブとのin situ DNAハイブリダイゼーションによって、細胞継代におけるJCV感染の維持を決定した。
本試験に用いた薬物の化学構造、生物学的特性及び作用機序を表11に列挙する。シトシンβ−D−アラビノフラノシド(Ara−C)をSigma−Aldrich(ミズーリ州セントルイス)から入手し、PBS1mL当たり5mgのストックとして−20℃で保存した。Ara−Cを1mL当たり5及び20μg濃度になるよう細胞培養用培地に直接希釈した。シドホビル(CDV)は、Gilead(カリフォルニア州フォスターシティ)から入手し、1.2M水溶液ストックとして室温で保存した。CDVを0.01、0.03、0.07、0.1及び1μM濃度になるよう細胞培地に直接希釈した。ヘキサデシルオキシプロピル−シドホビル、CMX001は、Chimerix Inc(ノースカロライナ州、ダラム)から入手し、メタノール/水/水酸化アンモニウム(50容量:50容量:2容量)中の1.8mMストックとして4℃で保存した。CMX001を0.01、0.03、0.07、0.1及び1μM濃度となるよう細胞培養用培地に直接希釈した。
Houff、S.A.、D.Katz、C.V.Kufta及びE.O.Major(1989)「A rapid method for in situ hybridization for viral DNA in brain biopsies from patients with AIDS」AIDS3:843〜5に以前に記載された通り、全長JCVビオチン化DNA BioProbe(Enzo Life Sciences、Inc.、ニューヨーク州ニューヨーク)を用いたin situ DNAハイブリダイゼーションにより、JCV感染SVG細胞におけるウイルスDNAの複製を検出した。JCVプローブの非特異的対照として、ウシ胸腺DNAを用いた。
MTS[3−(4,5−ジメチルチアゾール−2−イル)−5−(3−カルボキシメトキシフェニル)−2−(4−スルホフェニル)−2H−テトラゾリウム]アッセイを用いた細胞生存率の定量化は、無色テトラゾリウム塩を有色ホルマザンへと変換する、生細胞におけるミトコンドリア脱水素酵素の生物活性に基づく。メーカーの説明書(Promega、ウィスコンシン州マディソン)に従ってMTSアッセイを行った。簡単に言うと、細胞から培養用培地を除去し、50μLのPBSを96ウエルプレートの各ウエルに添加した。10μLのMTS試薬を細胞の入ったウエル及び細胞のないウエルに添加し、バックグラウンドを決定した。混合物を37℃で2時間インキュベートし、490nmで吸光度を測定した。同一培養物においてトリパンブルー染色を行い、MTS値を細胞生存率と相関させた。示されている最終値は、3回複製した結果である。無処置対照の値を100%と設定し、他の全数値を対照のパーセンテージとして表す。
メーカーの説明書(Invitrogen、メリーランド州ゲイサーズバーグ)に従って、アラマーブルー(AB)アッセイを用いた細胞生存率の定量化を行った。簡単に言うと、細胞を含有する又は細胞を含有しない96ウエルディッシュの各ウエルに10μlのAB試薬を添加して、バックグラウンドを決定した。混合物を37℃で6時間インキュベートし、吸光度を570nmで測定し、600nmを参照波長として用いた。無処置対照の値を100%と設定し、他の全数値を対照のパーセンテージとして表す。
in situ DNAハイブリダイゼーションに処置される培養物における細胞密度は、MTS又はABアッセイによって測定できなかったため、ヘマトキシリン染色強度の定量化によって処置される細胞培養物における細胞密度の近似値を求めた。in situ DNAハイブリダイゼーションのため、細胞を載せたカバーガラスを調製し、ヘマトキシリンで共染色した。その後、各カバーガラスを走査し、ImageJを用いてヘマトキシリン強度を定量化した。カバーガラス当たりの総細胞数を決定するため、10個のランダムな位置において100×拡大率で画像を取得した。各画像における細胞をくまなく計数し、各実験群につき10個の画像から得られた計数を平均することにより、スライド当たりの平均細胞数を導き出した。正確に900個の100×拡大率の画像が、18mm×18mmカバーガラスの表面に敷き詰められている。
DNeasy(登録商標)Blood&Tissueキットを用いてメーカーの説明書(Qiagen、カリフォルニア州バレンシア)に従って、非感染及びJCV感染SVG細胞培養物からDNAを回収した。ND−8000 NanoDrop(Thermo Scientific、デラウェア州ウィルミントン)を用いてDNAを定量化し、使用前に4℃で保存した。
Ryschkewitsch、C.、P.Jensen、J.Hou、G.Fahle、S.Fischer and E.O.Major(2004)「Comparison of PCR−southern hybridization and quantitative real−time PCR for the detection of JC and BK viral nucleotide sequences in urine and cerebrospinal fluid」J Virol Methods 121:217〜21に以前に記載された通り、一対のJCV Mad−1特異的プライマー及びウイルスT抗原N末端のヌクレオチド配列を標的とするプローブによる定量的リアルタイムPCRアッセイを用いて、JCV感染SVG培養物におけるJCVウイルスゲノムコピー数の定量化を行った。鋳型及びDNA溶出バッファーなしの二重陰性対照を加えて、精製プロセスの各ステップにおいて偽陽性を決定した。100pgから10ag(アトグラム)の範囲のJCV Mad−1プラスミド、pM1TCの段階希釈を用いて検量線を作成し、これを感染細胞培養物のウイルスゲノムコピー数の計算に用いた。
データは、平均値プラスマイナス標準偏差(SD)のパーセンテージとして表記した。ソフトウエアVASSARSTATSを用いて有意水準1%で一元配置又は二元配置ANOVA、続いてチューキーHSD試験により、データを統計学的に評価した。
[薬物のJCV感染における活性を測定するための組織培養モデルとしてのSVG細胞]
JCVは、中枢神経系(CNS)のグリア細胞において溶菌により複製するため、JCV複製における薬物処置の効果の試験にはSVG細胞が用いられてきた。SVG細胞は、SV40の複製開始起点欠損変異体による初代ヒト胎児脳培養物の不死化によって生じた異種培養物である。これは、SV40T抗原の安定的な発現によって不死化した。SVG細胞は形が不規則で、大型の核を含有する大型で扁平な細胞体を有するアストロサイトの形態を維持する(図33a及び33b)。MTSアッセイを用いて、SVG培養物の増殖動態及び細胞生存率を決定した。細胞を様々な密度で播種し、プレーティング24時間後にMTSアッセイ及びトリパンブルー染色によって細胞生存率を決定した。図33cに示す通り、MTS値(最適な密度)対、トリパンブルー染色によって決定した生細胞計数をプロットすることによって細胞生存率の検量線を作成した。予想通り、回帰解析(y=1×10−5x+0.0015、R2=0.9614)により観察される通り、MTS値と細胞生存率との間に直線関係が見られた。この検量線を用いて、MTS値に基づいてその次の図における細胞数を決定した。SVG培養物の経時的な生存率を決定するため、非感染又はJCV感染SVG細胞をウエル当たり2×103で96ウエルプレートに播種し、プレーティング後1、2、3、4及び7日目にMTS値をモニターした。各日数のMTS値(データ図示せず)を図33cにおいて導かれた等式を用いて細胞数に変換し、日数における対時間によりプロットし、0日目をプレーティング時とした。図33dは、1日目の細胞数が、ウエル当たり2×103の播種量と同様であることを立証し、これは、細胞プレーティング後の細胞増殖の1日間の遅滞期間を示す。細胞は、1日目から3日目の間に指数増殖した。4日目までに、非感染培養物は、JCV感染培養物よりも多くの細胞を含有したが、プレーティング後7日目までには、コンフルエントとなったため、どちらの培養物も細胞数は同様のものとなった。JCV複製は7〜14の間の日数を必要とするため、試験した時点において、非感染とJCV感染SVG細胞との間で増殖動態において大きな差異は観察されなかった。
CDVによるPMLの処置は、稀な症例における陽性予後に関連してきたが、BBBを通過できず、細胞毒性が高いため有効な処置であるとは考えられない。CMX001は、多くのウイルスの抑制に関してCDVよりも高レベルの効力を立証したシドホビルの修飾誘導体である。細胞生存率におけるCMX001の効果を決定するため、0.01〜1μM範囲の濃度のCMX001又はCDVで4日間SVG細胞を処置した。CDVは、0.1〜1μMの濃度範囲において、顕微鏡によって検出された細胞密度(図35a)、或いはアラマーブルー(AB)染色によって測定された生存率(図35b)に対しいかなる目に見える変化も誘発しなかった。MTSよりも高感度の解析であるため、AB染色により細胞生存率を定量化した。重要なことに、細胞毒性は、1mL当たり20〜50μg(63及び159μM)と、より高濃度のCDVに関連してきた。CMX001による処置は、0.1及び1μM濃度において細胞密度を目に見えて低下させ、ある程度の形態学的変化を起こした(図35a)。その上、図35bに示す通り、試験した全濃度のCMX001による処置は、0.01μMでは6%、0.1μMでは11%、1μMでは32%(p<0.01)等、細胞生存率を低下させた。これらの結果から、本出願人らは、細胞生存率における影響が限定的であるため、0.01〜0.1μMの間の濃度範囲が、JCVにおける効果に関してCMX001とCDVを比較するのに適切であると結論する。
6ウエルプレートにおいて、コンフルエントなSVG細胞培養物に5×104細胞当たり10赤血球凝集素単位(HAU)のMad−4 JCVを曝露した。一晩JCV曝露した後、0.01、0.03、0.07及び0.1μM濃度のCMX001若しくはCDV又は無処置対照として薬物希釈液で4日間細胞を処置した。in situ DNAハイブリダイゼーションにより、培養物におけるJCV DNA複製を測定した(図36a)。JCV陽性細胞を定量化し、JCV陽性細胞のパーセンテージを無処置対照のパーセンテージとして表記した(図36b)。CMX001は、0.03、0.07及び0.1μM濃度に対しそれぞれ46%、57%及び71%等、JCV DNA含有細胞のパーセンテージの用量依存的低下をもたらした。対照的に、同一濃度のCDVは、JCV DNA含有細胞におけるいかなる有意な低下も誘発しなかった。CMX001は、試験した濃度において細胞生存率に影響を及ぼすため、in situ DNAハイブリダイゼーションによる定量化に用いたカバーグラスから総細胞数を決定した。図36aに示す通り、細胞密度はCDV処置試料において変化しなかった。しかし、CMX001処置は、細胞密度の用量依存的低下を生じた(図36c)。CMX001処置によるJCV DNA陽性細胞のパーセンテージの低下が、細胞毒性の影響による総細胞数減少における間接効果ではなくJCVに対する薬物の阻害効果によるものであるか決定するため、JCV DNAを含有する細胞のパーセンテージをカバーガラス上の総細胞数に対して正規化した(図36d)。0.01μMのCMX001処置は総細胞数の有意な低下を生じなかったが、一方、0.03、0.07及び0.1μM濃度においては、総細胞数の14%、39%及び46%低下を生じた。AB染色によって測定した結果(図35b)と同様に、CDVは、試験したいかなる濃度においても細胞毒性を生じなかった。JCV DNA含有細胞のパーセンテージの総細胞数に対する正規化は、CMX001が、0.1μM濃度において52%の最大抑制で、JCV DNAを含有する細胞の量の用量依存的低下をもたらしたことを示した(図36d)。試験した無処置及びCMX001処置群間のJCV DNA含有細胞の低下は、有意であった(p<0.0001)。
CMX001は、ポリメラーゼ機能を阻害することによってDNAウイルスを破壊するCDVの誘導体である。従って、CMX001によるJCV増殖の抑制は、宿主DNAポリメラーゼによるウイルスDNA複製の妨害に起因する可能性がある。JCV DNA複製がCMX001の影響を受けるか決定するため、定量的リアルタイムPCR(qPCR)を用いて、CMX001処置したJCV感染SVG細胞に存在する全ウイルスDNAを測定した。コンフルエントなSVG細胞培養物を5×104細胞当たり10HAUのMad−4 JCVに曝露した。一晩JCV曝露した後、JCV感染細胞を異なる濃度のCMX001若しくはCDV又は無処置対照として薬物希釈液で4日間処置した。細胞培養物から全DNAを回収し、複製試料から得られた等量のDNAをJCV特異的qPCRアッセイにおいて用いた。無処置対照におけるJCVコピー数を100%の値とし、他の全数値を対照のパーセンテージとして報告する。CDV処置は、試験したいかなる濃度においても、SVG細胞に存在するJCVゲノムのコピー数に影響を及ぼさなかった。対照的に、CMX001処置は、感染細胞に存在するJCVゲノムコピー数を0.07及び0.1μM濃度でそれぞれ57%(p<0.01)及び60%(p<0.01)用量依存的に減少させた。この結果は、CMX001が、SVG細胞の初期感染においてある程度のレベルでJCV DNA複製に影響を及ぼすことを立証する。JCV感染におけるCMX001のEC50は、SVG細胞の感染においてJCVコピー数の50%低下を生じるCMX001の濃度によって決定した通り、0.045μMであった。
上述の結果は、CMX001が、SVG細胞の新規又は初期感染においてJCV増殖を抑制することを立証する。しかし、患者がPMLであると診断されるまでに、脳においてJCV増殖が相当な期間起きている。処置開始時には高レベルの後代ウイルスを産生するJCV感染細胞が存在するであろう。従って、CMX001が、進行中の感染に有効な処置となるか決定するため、本出願人らは、以前に確立した感染を用いてSVG細胞培養物におけるCMX001の効果を測定するよう努めた。細胞生存率におけるCMX001の効果を決定するため、非感染及びJCV感染SVG細胞を0.01〜1μM範囲の濃度のCMX001で4日間処置した。MTS解析により細胞生存率を測定した。無処置細胞の生存率を100%の値とし、他の全数値は対照を基準として示した。興味深いことに、CMX001は、0.01又は0.1μMの濃度では非感染又はJCV感染SVG細胞の細胞生存率を変化させなかった(図38)。しかし、1μM濃度のCMX001は、非感染細胞の生存率を15%低下させ(p>0.05)、JCV感染細胞の生存率を40%低下させた(p<0.01)。この傾向は、初期感染の生存率決定と一致する(図35)。
進行中又は確立された感染におけるJCV増殖に対するCMX001の効果を決定するため、非感染及び感染SVG細胞培養物を0.1μMのCMX001又は無処置対照として薬物希釈液で4日間処置した。図39aの位相差顕微鏡によって観察される通り、CMX001処置は、非感染又はJCV感染細胞における細胞密度又は形態に最小限の効果があり、この結果は、図38における細胞生存率の決定と一致する。CMX001処置培養物におけるJCV DNAの存在をin situ DNAハイブリダイゼーションにより決定し、細胞密度をヘマトキシリン染色強度により決定した。薬物処置なしの感染培養物においてJCV DNA含有細胞を観察した(図39b)。JCV DNA含有細胞のパーセンテージを定量化し、無処置対照を100%の値とし、0.1μM処置は対照のパーセンテージとして表記した。JCV DNA含有細胞は、CMX001処置培養物において殆ど存在しなかった(図39c)。CMX001は、図39dに示す細胞生存率において中程度の影響があった。JCV DNA含有細胞のパーセンテージを総細胞数に対し正規化し(図39e)、CMX001処置が、SVG細胞の確立された感染からJCV陽性細胞の94%除去をもたらしたことを立証した(p<0.05)。
本試験は、脂質と連結したシドホビル誘導体、ヘキサデシルオキシプロピル−シドホビル、CMX001が、ヒト胎児グリア細胞株SVGにおけるJCV増殖を抑制することを立証した。SVG細胞におけるCMX001の細胞毒性は、1μM以上の濃度でのみ観察された。CMX001は、初期感染においてJCV感染細胞の用量依存的減少をもたらし、確立された感染においてJCV感染細胞の有意な除去をもたらした。定量的PCR解析は、CMX001が、JCVのDNA複製能力を最大60%妨害することを明らかにした。ヒトグリア細胞に対し毒性を持たない濃度でのJCV感染の抑制及び患者における薬物のバイオアベイラビリティ増加は、CMX001をPML患者におけるJCV増殖の制限に利用できる可能性を示唆する。
CMX001は、活性抗ウイルス剤、シドホビル−二リン酸塩(CDV−PP)への細胞の曝露を増加させる。図40は、CMX001が、シドホビルよりも10倍少ない薬物で80倍多いCDV−PPを生じることを示す。PBMCにおけるCDV−PPをCMX001又はシドホビルと48時間インキュベートした。CDV−PPのt1/2は6.5日間であった。図41は、CMX001と48時間インキュベーションした後のヒトPBMCにおけるCDV−PPのin vitro細胞内レベルを示す。CDV−PPのt1/2は3.9日間であった。図42は、CMX001と1時間インキュベーションした後のヒトPBMCにおけるCDV−PPのin vitroレベルを示す。CDV−PPのt1/2は6.5日間であった。
図43は、4時間にわたるマウス腎臓からのシドホビル又はCMX001のクリアランスを示す。図44は、5mg/kgの[C2−14C]CMX001経口投与量4時間後のCMX001の臓器分布を示す。CMX001は、経口に用いることができ、広範囲に分布する。
健常な成人志願者におけるCMX001の無作為化二重盲検、プラセボ対照、単一用量、用量漸増試験を行った。
9群の単一用量コホート−CMX001:プラセボ(2:1)
各コホートにつき6名の対象;36名がCMX001投与;18名がプラセボ投与
最高用量は、2mg/kg(70kgのヒトに140mg)であった。
6群の複数回用量コホート−CMX001:プラセボ(2:1)(3週間にわたり3回の用量)
各コホートにつき5名の対象;20名がCMX001投与;10名がプラセボ投与
単一及び複数回用量は、十分に耐容性を示した;ワイヤレスカプセル内視鏡検査(WCE)により有害作用なし
CMX001錠剤対溶液製剤のバイオアベイラビリティ及びCMX001薬物動態における食品の効果を比較する健常な志願者におけるオープンラベル、3期(3-way)クロスオーバー試験を完了した。24名の健常な志願者は、40mg錠剤(摂食)、40mg錠剤(絶食)及び溶液として40mg(絶食)の投与を受けた。高脂肪食の経口摂取は、CMX001血漿Cmaxをおよそ40%低下させた。錠剤のTmaxは、絶食状態における液体製剤と比較してほぼ1時間遅延した。AUCによって示される曝露は変化しなかった。有害事象は概して軽度であり、重大な有害事象はなかった。
BKウイルスのウイルス尿症を発症したHSCT及び腎移植レシピエントにおけるCMX001の安全性及び耐容性を試験した。移植後集団におけるCMX001の安全性及び耐容性を調べ、尿及び血漿中の経時的なBKV DNAレベルをモニターする。
12名のHSCT及び12名の腎移植レシピエント、無作為に2:1(CMX001:プラセボ)
BKVウイルス尿症>104、ウイルス血症を発症した腎移植レシピエント<104
併用バルガンシクロビル/ガンシクロビル、HSCTレシピエントのみを除外
R+造血幹細胞移植(HSCT)レシピエントにおけるCMX001の安全性、耐容性及びサイトメガロウイルス(CMV)感染症を予防又は管理する能力の多施設、無作為化、二重盲検、プラセボ対照、用量漸増試験を計画した。試験集団は、生着した移植14〜30日後に登録したCMV R+HSCTレシピエントである。CMX001:プラセボは、2:1である。13名の対象をコホート1に登録した。
[CMX001の安全性及び耐容性の決定]
CMX001のR+HSCTレシピエントにおいてCMV感染症を予防又は管理する能力の決定
安全性エンドポイントは、臨床評価及び検査値、有害事象(及び重大な有害事象)、検査値のベースラインからの変化、バイタルサイン及び腎機能を含む。
効力不全エンドポイントは、処置期間のCMV疾患の処置又は診断の結論におけるCMV DNAemia>200コピー/mLである。
進行性ワクシニア患者の処置を試験した。軍隊入隊者、20歳、原因不明のAML、生ウイルス天然痘ワクチンの投与を受けた。化学療法後−重篤な進行性ワクシニア、多臓器不全及びシュードモナス敗血症。ワクシニア免疫グロブリン及び治験用抗ウイルス薬に対する反応が弱い−ワクチン接種部位周辺の病変及び抗ウイルス反応を欠く(ウイルス負荷量及び血清学によって示される)。CMX001(200mg初回量)により患者を処置し、他の治療法の増加用量を投与した。5日以内に、ワクチン接種部位におけるウイルス培養物はワクシニアウイルスに対し陰性となり、皮膚病変は治癒し始めた。患者は、合計6用量で6又は7日毎にCMX001の投与を受けた(MMWR 2009;58:1〜4)。
図45は、IVシドホビル又は経口CMX001後の血漿シドホビル濃度の比較を示す。特に、図45は、健常な対象における単一用量の2mg/kg CMX001と比較した、単一静脈内用量の5mg/kgシドホビルとプロベネシド(Cundy、1999)を投与された患者における推定シドホビル血漿濃度を示す。
評価可能な患者のうち1名を除き、CMX001の抗ウイルス活性が生じた。
5/6名のアデノウイルスを有する評価可能な患者は、アデノウイルスが>99%(2log10)低下した、或いは検出限界を下回った。シドホビル及びCMX001に対し前処置耐性を有する1名の患者は、CMX001によりウイルス血症がおよそ1.5log10低下し、CMX001中断後に3log反跳した。
3名がウイルス負荷量低下について評価でき、3/3名が応答した。CMV低下について評価できなかった患者のうち2名は、CMX001療法を通じて検出不能レベルであった。1用量のみのCMX001投与を受けた1名の患者はウイルス学的追跡調査を行わなかった。
1名は>1.5log10反応を有した。
脳脊髄液(CSF)及び尿における低レベルのJCVは、CMX001療法により検出不能となった。
ST−246及びワクシニア免疫グロブリン(VIG)処置中に検出可能で生存能力のあるワクシニアが病変部に存在。CMX001による処置後に除去。
移植患者(例えば、HSCT及び実質臓器移植(SOT))におけるアデノウイルス疾患に対する医学上の必要性は、現在未だに満たされていない。HSCT:リスク因子は、若年、T細胞除去療法、移植片対宿主病(GVHD)その他を含む。SOT:通常、末端器官疾患;経過の後期に起こり得る;疾患によるウイルス血症を呈さないこともある。アデノウイルスのウイルス血症に対し、≧1000コピー/mLが疾患の診断指標となる。これは、切迫した症状の発症を予測し、血漿中≧10,000コピー/mLで死亡率を伴う。ウイルス負荷の低下は、アデノウイルス関連の死亡率から保護する。
アデノウイルスのウイルス血症≧1000コピー/mLを有するHSCT及びSOT患者が含まれる。エンドポイントは、28日目における1log10の下落として測定されるウイルス血症の持続的な低下である。比較対照(comparator)は、第二の用量のCMX001(2mg/kg対4mg/kg)である。9月齢以上。追跡調査30日間。本試験は、切迫した死亡リスクのある患者(敗血症性ショック等)を除外する。本試験は、腎不全であれば参加できる。3週間の持続的な検出不能の後に投薬を中断することができる。本試験は、ウイルス負荷量はエンドポイントを満たすが検出不能ではない場合、或いはアデノウイルス疾患の反跳リスクがある場合、継続試験に参加できる。
上述の提案された試験を完了した患者の継続試験。CMX001は、以前の試験と同一用量となると思われる。参加は、上述の試験のエンドポイントを満たしたこと、アデノウイルス疾患の進行中のリスクがあることが必要とされる。最大60日間の処置が認められる。アデノウイルスアッセイが検出不能レベルを3週間持続した場合、処置は、より早く中断することができる。目的は、アデノウイルス疾患を管理することである。
[病歴]
不応性サイトメガロウイルス(CMV)を有し、D+/R−移植レシピエントである46歳女性は、反復性CMVウイルス血症(3ヶ月で4エピソード)の病歴があった。バルガンシクロビル療法は、重篤な好中球減少症を合併した(3回入院及びG−CSFによる進行中の処置)。患者は、高タクロリムスレベルに関連する腎機能不全の病歴があった(前CMX001処置糸球体濾過量は51mL/分であった)。
120mgのCMX001による処置を開始し、続いて毎週60mg、最終用量120mgを1週間に2回に用量を調整した。CMVは、CMX001処置により検出不能となり、処置期間において検出不能を維持した(その後2ヶ月)。WBCはより堅調となり、G−CSF処置を減少させた。
以前(27歳)に腎移植を行った50歳男性の不応性サイトメガロウイルス(CMV)を処置した。患者は、病因不明の糸球体腎炎のため1981年に腎移植を受けた。ベースラインクレアチニンは、2.3mg/dLであった。患者は、CMV DNAemiaに関連する原因不明熱(FUO)を前年に発症した(6週間のIV抗生物質により培養陰性心内膜炎を処置し、IVガンシクロビルによりCMVを処置した)。CMVウイルス血症は、周期的に再燃し、時に発熱を伴いつつ何ヶ月も持続した。ガンシクロビル/バルガンシクロビル療法によりクレアチニンは悪化した;レフルノミドを開始したが、CMVは持続した。腎機能障害のため、ホスカルネット又はシドホビルの使用を除外した。中等度低ガンマグロブリン血症;複数回用量のサイトメガロウイルス免疫グロブリン(CMVIg)は、ウイルス血症除去に有用ではなかった。浸潤性扁平上皮癌状態−指切断後。
CMX001は、180mgで開始し、続いて毎週80mgとした。第一のCMX001用量の後、CMV血漿DNAは、1年間近くで初めて検出不能となった。CMX001は、十分な耐容性を示した。反復性扁平上皮癌を放射線療法で処置した。2週間のCMX001用量省略の後、CMV DNAは、5,037コピー/mLへと上昇した。治療法を元に戻した。クレアチニンは、ほぼ3ヶ月のCMX001療法の間4.2〜4.7範囲で安定し続けた。癌の管理を試みるためミコフェノール酸塩を中断し、腎臓拒絶が後に起こった。INR/PT増加による致死的脳出血及び転移性癌が発生した。いずれのイベントもCMX001に関係するとは考えられない。
両肺移植を受けた腎不全の68歳男性の不応性サイトメガロウイルス(CMV)を処置した。CMVウイルス血症をIVガンシクロビルにより処置した。進行中のウイルス血症のため、治療法をホスカルネットに切り替えた。血漿がCMV検出不能となったら、予防のためバルガンシクロビルによる処置を継続した。敗血症エピソードにおいてCMVの再活性化が起こった(ガンシクロビルを開始し、ホスカルネットを2週間後に加えた)。腎不全進行のため透析が必要とされた。遺伝子型は、ガンシクロビルに対するA594V耐性変異を示した。UL54(シドホビル又はホスカルネット)変異は検出されなかった。血圧低下及びクレブシエラ(Klebsiella)吸引肺炎を伴う尿VRE感染症のための以前のICUケアは、患者の臨床状態を悪化させた。
CMX001による処置開始後、CMV DNAは検出不能となった。第一、第三及び第五の用量の後に薬物動態試料を収集し、腎不全に基づく用量調整は必要とされなかった。第一の用量後のCMX001ピーク血漿濃度は、264ng/mLであり、シドホビルの血漿濃度は、全観察時点で250ng/mL未満を維持した。患者は複数の進行中の医学的問題を抱えていたが、CMVは抑制され続けた。CMX001は、十分に耐容性を示した。患者は、大量吸引後に積極的なケアを行わないことを決定した。図48は、CMX001用量及びPCRプロットによる血漿CMVを示す。
シクロホスファミド免疫抑制ハムスターをアデノウイルス5に感染させた。ウイルス複製は、肝臓、副腎及び膵臓において行われた(Tothら、PNAS 2009)。動物は7日目までに瀕死となった。
図49は、CNSにおける単純ヘルペスウイルス−2(HSV−2)複製に対するCMX001の効果を示す(Quenelleら、JID、2010)。CMX001及びアシクロビルの結果が報告されている。
Claims (60)
- 式A若しくは式B
Mは、
Qは、存在する場合、
R1、R1’、R2、R2’、Rx及びRyは、独立して、H、ハロゲン、−ORi、−SRi、−NHRi又は−NRiRiiであり、Ri及びRiiは、独立して、水素又は脂肪族部分であり、
mは、0〜6の整数であり、
Bは、水素、−CH3、F、CF3、−CHF2、−CH2CH3、−CH2OH、−CH2CH2OH、−CH(OH)CH3、−CH2F、−CH=CH2及び−CH2N3からなる群から選択され、
Xは、セレン、イオウ又は酸素から選択され、
R3は、ヒドロキシ、−OR2a、C1−8アルキル、C2−8アルケニル、C2−8アルキニル、C1−8ヘテロアルキル、C2−8ヘテロアルケニル、C2−8ヘテロアルキニル又は−NR’R’’であり、
R2aは、C1−8アルキル、C2−8アルケニル、C2−8アルキニル、C1−8ヘテロアルキル、C2−8ヘテロアルケニル、C2−8ヘテロアルキニル、−P(=O)(OH)2又は−P(=O)(OH)OP(=O)(OH)2であり、
R’及びR’’は、独立して、H、C1−8アルキル、C2−8アルケニル、C2−8アルキニル、C1−8ヘテロアルキル、C2−8ヘテロアルキニル、C2−8ヘテロアルケニル及びC6−10アリールからなる群から選択され、又は、
NR’R’’は、置換又は非置換アミノ酸残基であり、
Zは、少なくとも1個のNを含むヘテロ環部分を含み、
記号*は、式(A)又は(B)におけるメチレンとZとの結合ポイントが、ヘテロ環部分の利用可能な窒素を介することを示す]
の化合物、それらの立体異性体、ジアステレオマー、エナンチオマー若しくはラセミ体又はそれらのいずれかの医薬的に許容可能な塩の治療上有効量を対象に投与するステップを含む、対象における少なくとも1種類のウイルスに関連する疾患を処置する方法。 - 前記対象が免疫低下している、請求項1に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類のウイルスに関連する疾患が、腎症、出血性膀胱炎及び進行性多巣性白質脳症(PML)からなる群から選択される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記疾患が、ポリオーマウイルス又はアデノウイルスである少なくとも1種類のウイルスに関連する、請求項1〜3に記載の方法。
- 疾患が、BK、John Cunninghamウイルス(JCV)、メルケル細胞ウイルス(MCV)、KIポリオーマウイルス(KIV)、WUポリオーマウイルス(WUV)、シミアンウイルス40(SV40)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1種類のウイルスに関連する、請求項1〜4に記載の方法。
- 前記疾患が、BKウイルス又はJCVである少なくとも1種類のウイルスに関連する、請求項1〜5に記載の方法。
- 前記対象が、少なくとも1種類のdsDNAウイルスに感染している、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- 前記少なくとも1種類のウイルスが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、インフルエンザ、単純ヘルペスウイルス1、単純ヘルペスウイルス2、ヒトヘルペスウイルス6(HHV−6)、ヒトヘルペスウイルス8(HHV−8)、サイトメガロウイルス(CMV)、B型及びC型肝炎ウイルス、エプスタイン・バーウイルス(EBV)、水痘帯状疱疹ウイルス、大痘瘡及び小痘瘡、ワクシニア、天然痘、牛痘、ラクダ痘、サル痘、エボラウイルス、パピローマウイルス、アデノウイルス又はJCウイルス、BKウイルス、SV40等のポリオーマウイルス並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記対象がHIVに感染している、請求項8に記載の方法。
- 前記化合物が、ウイルス感染細胞及び/又はウイルスの複製を特異的に標的として、ウイルスに関連する疾患を処置する、請求項1〜9のいずれかに記載の方法。
- 前記対象が、免疫抑制薬を投薬中の移植患者である、請求項1〜9のいずれかの方法。
- 移植患者が、腎臓、骨髄、肝臓、肺、胃、骨、精巣、心臓、膵臓、腸及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1個の移植臓器を有するレシピエントである、請求項11に記載の方法。
- 前記対象が、原発性又は後天性免疫不全症である、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記対象が、免疫抑制療法の結果免疫低下している、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- 前記対象が、化学療法の結果免疫低下している、請求項1〜10のいずれかに記載の方法。
- Xが酸素である、請求項1〜15のいずれかに記載の方法。
- R3がヒドロキシルである、請求項1〜16のいずれかに記載の方法。
- R1、R1’、R2、R2’、Rx及びRyが、独立して、−O(C1−C24)アルキル、−O(C2−C24)アルケニル、−O(C2−C24)アルキニル、−O(C1−C24)アシル、−S(C1−C24)アルキル、−S(C2−C24)アルケニル、−S(C2−C24)アルキニル、−S(C1−C24)アシル、−NH(C1−C24)アルキル、−NH(C2−C24)アルケニル、−NH(C2−C24)アルキニル、−NH(C1−C24)アシル、−N((C1−C24)アルキル)((C2−C24)アルキル)、−N((C1−C24)アルキル)((C2−C24)アルケニル)、−N((C1−C24)アルキル)((C2−C24)アシル)、−N((C1−C24)アルキル)((C2−C24)アルキニル)、−N((C1−C24)アルケニル)((C2−C24)アルキニル)、−N((C1−C24)アルケニル)((C2−C24)アルケニル)、−N((C1−C24)アルキニル)((C2−C24)アルキニル)、−N((C1−C24)アシル)((C2−C24)アルキニル)及び−N((C1−C24)アシル)((C2−C24)アルケニル)からなる群から選択される、請求項1〜17のいずれかに記載の方法。
- Mが、−O−(CH2)2−O−C1−24アルキル、−O−(CH2)3−O−C1−24アルキル、−O−CH2−CH(OH)−CH2−O−C1−24アルキル及び−O−CH2−CH(OH)−CH2−S−C1−24アルキルからなる群から選択される、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- Mが、−O−(CH2)a−O−(CH2)t−CH3(式中、aは2〜4、tは11〜19である)である、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- Mが、−O−(CH2)2−O−(CH2)15CH3又は−O−(CH2)2−O−(CH2)17CH3である、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- Mが、−O−(CH2)3−O−(CH2)15CH3又は−O−(CH2)3−O−(CH2)17CH3である、請求項1〜18のいずれかに記載の方法。
- Bが−CH3又は−CH2OHである、請求項1〜22のいずれかに記載の方法。
- aが2又は3である、請求項24に記載の化合物。
- tが15又は17である、請求項24又は25に記載の化合物。
- Bが−CH3又はCH2OHである、請求項24〜26のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記対象が免疫抑制剤を必要とする、請求項1〜29のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象に、1又は複数の免疫抑制剤を式A又はBの前記化合物と組み合わせて投与するステップを更に含む、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記免疫抑制剤が、対象に同時的又は逐次的に投与される、請求項31に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の免疫抑制剤が、ダクリズマブ、バシリキシマブ、タクロリムス、シロリムス、ミコフェノール酸塩(ミコフェノール酸ナトリウム又はミコフェノール酸モフェチルとして)、シクロスポリンA、グルココルチコイド、抗CD3モノクローナル抗体(OKT3)、抗胸腺細胞グロブリン(ATG)、抗CD52モノクローナル抗体(キャンパス1−H)、アザチオプリン、エベロリムス、ダクチノマイシン、シクロホスファミド、白金、ニトロソウレア、メトトレキサート、アザチオプリン、メルカプトプリン、ムロモナブ、IFNガンマ、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、タイサブリ(ナタリズマブ)、フィンゴリモド、シクロホスファミド、メトトレキサート、レフルノミド及びリツキシマブ並びにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記少なくとも1種類の免疫抑制剤が、タイサブリ(ナタリズマブ)である、請求項30〜32のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患がアデノウイルスに関連する、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記対象が、以前に少なくとも1種類の抗ウイルス剤により処置されたことがあり、この以前の処置は失敗に終わり、この以前に用いた抗ウイルス剤が、シドホビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、バラシクロビル及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患がヘルペスウイルスに関連し、対象は、以前に少なくとも1種類の抗ウイルス剤により処置されたことがあり、この以前の処置は失敗に終わり、この以前に用いた抗ウイルス剤が、シドホビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、バラシクロビル及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患がサイトメガロウイルスに関連し、対象は、以前に少なくとも1種類の抗ウイルス剤により処置されたことがあり、この以前の処置は失敗に終わり、この以前に用いた抗ウイルス剤が、シドホビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、バラシクロビル及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記疾患がアデノウイルスに関連し、対象は、以前に少なくとも1種類の抗ウイルス剤により処置されたことがあり、この以前の処置は失敗に終わり、この以前に用いた抗ウイルス剤が、シドホビル、ガンシクロビル、バルガンシクロビル、ホスカルネット、アシクロビル、バラシクロビル及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項1〜30のいずれか一項に記載の方法。
- 前記腎症又は出血性膀胱炎が、BKウイルス又はJCウイルスである少なくとも1種類のポリオーマウイルスに関連する、請求項44に記載の方法。
- 前記免疫低下した対象が、腎移植患者又は骨髄移植患者である、請求項44又は45に記載の方法。
- 前記薬物が、リツキサン、ラプティバ、タイサブリ(ナタリズマブ)、マイフォーティック、アボネックス、レミケード、エンブレル、ヒュミラ及びセルセプトからなる群から選択される、請求項47に記載の方法。
- 疾患が、腎症、出血性膀胱炎及び進行性多巣性白質脳症(PML)からなる群から選択される、少なくとも1種類のウイルスに関連する、請求項50に記載の方法。
- 前記疾患が、ポリオーマウイルス又はアデノウイルスである少なくとも1種類のウイルスに関連する、請求項50又は51に記載の方法。
- 前記疾患が、BK、John Cunninghamウイルス(JCV)、メルケル細胞ウイルス(MCV)、KIポリオーマウイルス(KIV)、WUポリオーマウイルス(WUV)、シミアンウイルス40(SV40)及びそれらの組み合わせからなる群から選択される少なくとも1種類のウイルスに関連する、請求項50又は51に記載の方法。
- 前記疾患が、BKウイルス又はJCVである少なくとも1種類のウイルスに関連する、請求項50に記載の方法。
- 他の薬物が、少なくとも1種類の医薬的に許容可能な担体中のリツキサン、ラプティバ、タイサブリ(ナタリズマブ)、マイフォーティック、アボネックス、レミケード、エンブレル、ヒュミラ及びセルセプトからなる群から選択される、請求項55に記載の組成物。
- 請求項1〜54のいずれかに記載の処置方法を行うための、請求項1〜54のいずれか一項に定義されている式A若しくはB又はそれらの組み合わせの化合物。
- 請求項1〜54のいずれか一項に記載の方法を行うための薬剤の調製のための、請求項1〜55のいずれか一項に定義されている式A若しくはB又はそれらの組み合わせの化合物の使用。
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Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017530118A (ja) * | 2014-09-15 | 2017-10-12 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | ヌクレオチド類似体 |
WO2020138067A1 (ja) * | 2018-12-25 | 2020-07-02 | 富士フイルム富山化学株式会社 | ピラジン誘導体と細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物とを組み合わせてなるrnaウイルス感染症治療剤 |
JP2022540273A (ja) * | 2019-03-29 | 2022-09-15 | エボニック オペレーションズ ゲーエムベーハー | アントシアニン組成物と抗ウイルス剤とを含む組み合わせ製剤 |
Families Citing this family (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008535862A (ja) | 2005-04-08 | 2008-09-04 | キメリクス,インコーポレイテッド | ポックスウイルス感染の治療のための化合物、組成物および方法 |
EP3085377A1 (en) | 2008-01-25 | 2016-10-26 | Chimerix, Inc. | Methods of treating viral infections |
WO2011011519A1 (en) | 2009-07-21 | 2011-01-27 | Chimerix, Inc. | Compounds, compositions and methods for treating ocular conditions |
WO2011100698A2 (en) | 2010-02-12 | 2011-08-18 | Chimerix, Inc. | Methods of treating viral infection |
WO2011139709A2 (en) * | 2010-04-26 | 2011-11-10 | Chimerix, Inc. | Methods of treating retroviral infections and related dosage regimes |
AU2011295937B2 (en) | 2010-08-31 | 2015-04-16 | Emergent Biodefence Operations Lansing Llc | Phosphonate ester derivatives and methods of synthesis thereof |
CA2853720A1 (en) * | 2011-10-26 | 2013-05-02 | Chimerix, Inc. | Hexadecyloxypropyl cidofovir for the treatment of double-stranded dna virus infection |
EP3578563B1 (en) | 2011-12-22 | 2021-04-14 | Geron Corporation | Guanine analogs as telomerase substrates and telomere length affectors |
WO2013163509A1 (en) * | 2012-04-27 | 2013-10-31 | Chimerix, Inc. | A method of mitigating virus associated end-organ damage |
CN107312039B (zh) | 2012-08-30 | 2019-06-25 | 江苏豪森药业集团有限公司 | 一种替诺福韦前药的制备方法 |
US9526729B2 (en) * | 2013-01-29 | 2016-12-27 | Hsiao Lily Yu | Medicament for treating peripheral neuropathies |
SG10201800188SA (en) | 2013-03-15 | 2018-02-27 | Univ California | Acyclic nucleoside phosphonate diesters |
JP6150949B2 (ja) | 2013-11-15 | 2017-06-21 | キメリックス インコーポレイテッド | ヘキサデシルオキシプロピル−ホスホン酸エステルの形態型 |
US10160778B2 (en) | 2014-10-27 | 2018-12-25 | Concert Pharmaceuticals, Inc. | Pyrimidine phosphonic acid esters |
EP3350191B9 (en) | 2015-09-15 | 2021-12-22 | The Regents of the University of California | Nucleotide analogs |
US20170326146A1 (en) * | 2016-05-12 | 2017-11-16 | Contravir Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating hepatitis b infections and related dosage regimes |
WO2018156879A1 (en) * | 2017-02-23 | 2018-08-30 | Chimerix, Inc. | Treatment of adenovirus with brincidofovir |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008535862A (ja) * | 2005-04-08 | 2008-09-04 | キメリクス,インコーポレイテッド | ポックスウイルス感染の治療のための化合物、組成物および方法 |
WO2008133966A1 (en) * | 2007-04-27 | 2008-11-06 | Chimerix, Inc. | Methods of reducing nephrotoxicity in subjects administered with nucleoside |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6605602B1 (en) * | 2001-09-28 | 2003-08-12 | University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education | Method of treating BK virus nephropathy |
KR100987815B1 (ko) * | 2002-04-26 | 2010-10-18 | 길리애드 사이언시즈, 인코포레이티드 | Hiv 프로테아제 억제제 화합물의 포스포네이트유사체의 세포 축적 |
US20050261237A1 (en) * | 2003-04-25 | 2005-11-24 | Boojamra Constantine G | Nucleoside phosphonate analogs |
EP2444071A1 (en) * | 2004-09-27 | 2012-04-25 | Sigmoid Pharma Limited | Minicapsule formulations |
EP2125024B1 (en) * | 2007-03-23 | 2013-02-13 | TO-BBB Holding B.V. | Targeted intracellular delivery of antiviral agents |
CA2770282A1 (en) * | 2009-08-03 | 2011-02-10 | Chimerix, Inc. | Composition and methods of treating viral infections and viral induced tumors |
US20110263536A1 (en) * | 2010-04-22 | 2011-10-27 | Chimerix, Inc. | Methods of Treating Orthopox Virus Infections and Associated Diseases |
-
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2014
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Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2008535862A (ja) * | 2005-04-08 | 2008-09-04 | キメリクス,インコーポレイテッド | ポックスウイルス感染の治療のための化合物、組成物および方法 |
WO2008133966A1 (en) * | 2007-04-27 | 2008-11-06 | Chimerix, Inc. | Methods of reducing nephrotoxicity in subjects administered with nucleoside |
Non-Patent Citations (4)
Title |
---|
JPN6014050607; Antiviral Research Vol.82, No.2, 200905, p.A84-A98 * |
JPN6014050609; Antimicrobial Agents and Chemotherapy Vol.51, No.11, 2007, p.4118-4124 * |
JPN6014050611; Antiviral Research Vol.71, 2006, p.154-163 * |
JPN7014003425; CMX001 in Post-transplant Patients With BK Virus Viruria , 20081117 * |
Cited By (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2017530118A (ja) * | 2014-09-15 | 2017-10-12 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | ヌクレオチド類似体 |
WO2020138067A1 (ja) * | 2018-12-25 | 2020-07-02 | 富士フイルム富山化学株式会社 | ピラジン誘導体と細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物とを組み合わせてなるrnaウイルス感染症治療剤 |
JPWO2020138067A1 (ja) * | 2018-12-25 | 2021-11-04 | 富士フイルム富山化学株式会社 | ピラジン誘導体と細胞内におけるピラジン誘導体リボース三リン酸体の量を増加させる化合物とを組み合わせてなるrnaウイルス感染症治療剤 |
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JP2022540273A (ja) * | 2019-03-29 | 2022-09-15 | エボニック オペレーションズ ゲーエムベーハー | アントシアニン組成物と抗ウイルス剤とを含む組み合わせ製剤 |
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