JP2013506709A5 - - Google Patents

Description

有効なコンジュゲートおよび親水性リンカー

本願は、２００８年４月３０日に提出された米国仮出願第６１／０４９，２８９号に対する優先権を主張する、２００９年４月３０日に提出された米国本出願第１２／４３３，６６８号の一部継続である。先願である出願第１２／４３３，６６８号および第６１／０４９，２８９号の全開示内容は、付随する継続出願の開示の部分と見なされ、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明は、薬物（例えば、細胞毒性剤）を細胞結合剤（例えば、抗体）に連結させて、薬物の活性の増大に寄与する新規のリンカーに関する。特に、本発明は、新規の親水性リンカーの使用であって、かかるリンカーが、細胞表面に少数の抗原を発現するものまたは処置に対して耐性である癌細胞を含めた種々の癌細胞タイプにおいて、細胞結合剤−薬物コンジュゲートの有効性または効能を数倍向上させる、使用に関する。本発明はまた、チオエーテル部位および反応性基を持つメイタンシノイドを調製するための方法であって、メイタンシノイドを細胞結合剤に連結させる、方法にも関する。

標的特異的治療剤として細胞毒性薬物の抗体コンジュゲートが開発されつつある。種々の癌細胞表面抗原に対する抗体は、種々の必須の細胞標的、例えば、微小管（メイタンシノイド、オーリスタチン、タキサン：米国特許第５，２０８，０２０号；同第５，４１６，０６４号；同第６．３３３，４１０号；同第６，４４１，１６３号；同第６，３４０，７０１号；同第６，３７２，７３８号；同第６，４３６，９３１号；同第６，５９６，７５７号；同第７，２７６．４９７号）、ＤＮＡ（カリケアマイシン、ドキソルビシン、ＣＣ−１０６５アナログ；米国特許第５，４７５，０９２号；同第５，５８５，４９９号；同第５，８４６，５４５号；同第６，５３４，６６０号；同第６，７５６，３９７号；同第６，６３０，５７９号）を阻害する種々の細胞毒性剤とコンジュゲートされている。これらの細胞毒性薬物のいくつかとの抗体コンジュゲートが、癌の治療のための臨床において盛んに研究されている（Ｒｉｃｈａｒｔ、Ａ．Ｄ．、およびＴｏｌｃｈｅｒ、Ａ．Ｗ．、２００７、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ、４、２４５−２５５）。

抗体−細胞毒性剤コンジュゲートは、通常、抗体上の反応性部位、例えば、リジンアミノ基、またはシステイン基（天然ジスルフィド結合の還元によって、または分子生物学的方法を用いた、抗体へのさらなる非天然システイン残基のエンジニアリングによって生成される）の初期修飾によって調製される。したがって、抗体は、ヘテロ二官能性リンカー試薬、例えば、ＳＰＤＢ、ＳＭＣＣおよびＳＩＡＢによって例示される、これまでに記載されているもの（米国特許第６，９１３，７５８号および米国特許出願公開第２００５０１６９９３３号）によって最初に修飾されて、反応性基、例えば、混合されたピリジルジスルフィド、マレイミドまたはハロアセトアミドを有するリンカーを組み込む。抗体に組み込まれた反応性リンカー基は、チオール基などの反応性部位を含有する細胞毒性剤によってその後コンジュゲートされる。別のコンジュゲーション経路は、チオール反応性基（例えば、ハロアセトアミド、またはマレイミド）を含有する細胞毒性剤誘導体と細胞結合剤上のチオール基との反応によるものである。チオール基は、天然ジスルフィド残基の還元によって（Ｒ．Ｓｉｎｇｈら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００２、３０４、１４７−１５６）、または組み込まれたジスルフィド部位の還元によって（ＳＰＤＰ、スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネートを介し、続いて、ジチオトレイトールによって還元、Ｄ．Ｇ．Ｇｉｌｌｉｌａｎｄら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１９８０、７７、４５３９−４５４３）、あるいはさらなる非天然システイン残基（Ｊ．Ｂ．Ｓｔｉｍｍｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２０００、２７５、３０４４５−３０４５０）の組み込み、または２−イミノチオラン（Ｒ．Ｊｕｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７８、１７、５３９９−５４０６）もしくはメチル３−メルカプトプロピオンイミデートエステル（Ｔ．Ｐ．Ｋｉｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、１９７８、１７、１４９９−１５０６）との反応によるチオール基の組み込みによって、細胞結合剤、例えば、抗体に組み込まれる。

ジスルフィドまたはチオエーテル連結部を有する抗体−細胞毒性剤コンジュゲートは、細胞内で、恐らくはリソソームにおいて開裂して、活性な細胞毒性剤を癌細胞内に送達する（Ｈ．Ｋ．Ｅｒｉｃｋｓｏｎら、２００６、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、６６、４６２６−４４３３）。還元性ジスルフィド連結部を有する抗体−細胞毒性剤コンジュゲートはまた、標的細胞の死滅に加えて、インビトロにおいておよび異種移植モデルにおいてインビボで抗原陰性細胞と抗原陽性細胞との混合集団中の近接する抗原陰性細胞も死滅させるが、これは、不均一な抗原発現を伴う腫瘍内の隣接する非抗原発現細胞に対する有効性を改善させる際の、標的−細胞で放出された細胞毒性剤の役割を示唆している（Ｙ．Ｖ．Ｋｏｖｔｕｎら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２００６、６６、３２１４−３２２１）。

抗体−細胞毒性薬物コンジュゲートは、インビトロにおいて細胞死滅活性、インビボにおいて抗腫瘍活性を示すが、これらの有効性は、多くの場合において、特に、標的癌細胞における抗原発現量が少ない場合、または標的細胞が処置に対して耐性である場合に減少する。これは、臨床的状況においてしばしば起こり、患者において低度から中程度の抗腫瘍活性をもたらす。耐性を回避するための可能性のあるアプローチは、親水性または疎油性官能基を持つ新規の薬物を合成することである（Ｇ．Ｓｚｏｋａｃｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、５；２１９−２３５、２００６を参照）。しかし、このプロセスは、煩雑であり、いくつかのアナログが合成されなければならず、薬物の構造の修飾が、生物学的活性の損失をしばしばもたらす。したがって、異なるアプローチが必要とされている。

非開裂性リンカーを介した細胞結合剤および薬物の細胞毒性コンジュゲートを調製するための、当該分野において記載されている方法では、２つの反応工程を必要とする（米国特許第５，２０８，０２０号および米国特許出願公開第２００５／０１６９９３３号）。まず、細胞結合剤、例えば、抗体は、細胞結合剤の反応性基、例えば、リジン残基上のアミン基またはシステイン残基上のスルフヒドリル基との反応を経て共有結合による化学結合を形成する二官能性架橋剤によって修飾される。細胞結合剤の修飾に続いて、生成物が精製されて、所望の修飾された細胞結合剤を未反応の架橋剤から分離する。コンジュゲーション工程として知られている第２工程において、反応性薬物誘導体、例えば、チオール含有メイタンシノイドが、修飾された細胞結合剤との反応のために、修飾された細胞結合剤に添加される。この反応に続いて、最終コンジュゲートから、いずれの未反応の薬物種および他の副生成物も除去するためのさらなる精製が必要とされる。これらの複数の反応および精製工程は、低収率の最終コンジュゲートをもたらし、これらの工程を大規模に実施することを考慮すると、高価かつ煩雑であり得る。これらの方法のさらなる欠点は、薬物が付着することなく未反応の架橋剤が細胞結合剤に連結したままであるときに生じる、コンジュゲートの不均一性である。未反応の架橋剤は、次いで、さらなる副反応、例えば、加水分解および分子内または分子間反応を経る可能性がある。したがって、基本的に１つの反応工程において細胞結合剤、例えば、抗体に非開裂性結合を介して共有結合的に連結され得る、官能化された反応性薬物誘導体、例えば、メイタンシノイドが必要とされている。

本発明は、薬物を細胞結合剤に連結させ、薬物の活性の増大に寄与する新規のリンカーを設計することによって耐性の問題に対処する。したがって、本発明は、当リンカー設計によって、特に抗原発現が低い広範な腫瘍、または薬物耐性腫瘍に対して活性であるコンジュゲートを得て、薬物が細胞結合剤に連結される様式を改善する。

本発明は、ポリエチレングリコール［ＰＥＧ_ｎ，（−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ）］スペーサーを組み込むことによって常套のリンカー（米国特許出願公開第２００５０１６９９３３号に記載されているＳＭＣＣ、ＳＩＡＢなど）が修飾されて親水性リンカーとされるとき、細胞結合剤−薬物コンジュゲートの有効性または効能が、細胞表面で少数の抗原を発現するものを含めた種々の癌細胞タイプにおいて、驚くべきことに数倍向上するという新規の所見に基づく。

また、予想外にも、これらのＰＥＧ含有コンジュゲートは、処置に対して耐性である細胞株に対して、これまで記載されているコンジュゲートよりも有効である。

さらに、抗体コンジュゲートの場合には、親水性リンカーの組み込みが、抗体１分子あたり最大で１５分子の薬物のコンジュゲーションを高収率で凝集も沈澱もなく可能にした。抗体１分子あたり最大で１５分子の薬物が連結した親水性リンカーを有するこれらのコンジュゲートは、（非修飾抗体の場合と同様に）高い親和性によって標的抗原に結合した。

本発明はまた、細胞結合剤を有するチオエーテル連結メイタンシノイドコンジュゲートが、細胞結合剤の従来の化学修飾によらず、基本的に１つの反応工程において調製され得るように、細胞結合剤のアミン基またはチオール基に対して反応性である新規のメイタンシノイドも開示する。

本発明は、チオエーテル部位および反応性基を持つ新規のメイタンシノイド誘導体の合成のためのプロセスを開示する。これらの新規のメイタンシノイドは、細胞結合剤を有するチオエーテル連結コンジュゲートの、基本的に１つの反応工程での調製において有用である。これらの新規の反応性メイタンシノイドを使用する細胞結合剤コンジュゲートの調製のためのプロセスも開示される。

したがって、本発明は、式（１）の化合物または式（１’）の特定の化合物：
Ｚ−Ｘ_ｌ−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−）_ｎ−Ｙ_ｐ−Ｄ （１）
Ｄ−Ｙ_ｐ−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−）_ｎ−Ｘ_ｌ−Ｚ （１’）
式中：
Ｚは、細胞結合剤とアミドまたはチオエーテル結合を形成することができる反応性官能基を表し；
Ｄは、薬物を表し；
Ｘは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し；
Ｙは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合を介して薬物に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し；
ｌは、０または１であり；
ｐは、０または１であり；
ｎは、１〜２０００の整数である；
を提供する。

本発明の別の態様は、式（２）の細胞結合剤薬物コンジュゲートまたは式（２’）の特定の化合物：
ＣＢ−［Ｘ_ｌ−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−）_ｎ−Ｙ_ｐ−Ｄ］_ｍ （２）
［Ｄ−Ｙ_ｐ−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−）_ｎ−Ｘ_ｌ］_ｍ−ＣＢ （２’）
式中、
ＣＢは、細胞結合剤を表し；
Ｄは、薬物を表し；
Ｘは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し；
Ｙは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合を介して薬物に付着した脂肪族、芳香族、または複素環式基を表し；
ｌは、０または１であり；
ｐは、０または１であり；
ｍは、２〜１５の整数であり；
ｎは、１〜２０００の整数である；
である。

本発明の別の態様は、式（３）の化合物または式（３’）の特定の化合物：
Ｚ−Ｘ_ｌ−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２Ｏ−）_ｎ−Ｙ−Ｄ （３）
Ｄ−Ｙ−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２Ｏ−）_ｎ−Ｘ_ｌ−Ｚ （３’）
式中：
Ｚは、細胞結合剤とアミドまたはチオエーテル結合を形成することができる反応性官能基を表し；
Ｄは、薬物を表し；
Ｘは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し；
Ｙは、ジスルフィド結合を介して薬物に付着した脂肪族、非芳香族複素環式または芳香族複素環式基を表し；
ｌは、０または１であり；
ｎは、１〜１４の整数である；
である。

本発明の別の態様は、式（４）の細胞結合剤薬物コンジュゲートまたは式（４’）の特定の化合物：
ＣＢ−（Ｘ_ｌ−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２Ｏ−）_ｎ−Ｙ−Ｄ）_ｍ （４）
［Ｄ−Ｙ−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２Ｏ−）_ｎ−Ｘ_ｌ］_ｍ−ＣＢ （４’）
式中、
ＣＢは、細胞結合剤を表し；
Ｄは、薬物を表し；
Ｘは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し；
Ｙは、ジスルフィド結合を介して薬物に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し；
ｌは、０または１であり；
ｍは、３〜８の整数であり；
ｎは、１〜１４の整数である；
である。

本発明のなおさらなる態様は、その方法による処置に対して感受性の癌を処置するための方法であって、式（２）または（４）のコンジュゲートを含む有効用量の組成物を、処置を必要とする患者に非経口投与することを含む方法である。

本発明のさらに別の態様において、反応性基を持ち、式（５）：
Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’（５）
式中：
Ｄ’は、スルフヒドリル保持メイタンシノイド、例えば、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）メイタンシン（ＤＭ４）を表し；
Ｙ’は、チオエーテル結合を表し、
Ｖは、１〜１０個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；
Ｑは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し；
Ｗは、１〜１０個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；
Ｚ’は、アミンまたはスルフヒドリル反応性基を表す；
によって表される、チオエーテル部位を有する新規のメイタンシノイドが提供される。

チオエーテル部位を持つ反応性メイタンシノイド誘導体は、スルフヒドリル保持メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１およびＤＭ４）およびヘテロ二官能性架橋剤から調製される。反応は、以下の化学方程式：
Ｄ’＋Ｙ”−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’→Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’
式中：
Ｄ’は、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）メイタンシン（ＤＭ４）などのスルフヒドリル保持メイタンシノイドを表し；
Ｖは、１〜１０個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；
Ｑは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し；
Ｗは、１〜１０個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；
Ｚ’は、アミンまたはスルフヒドリル反応性基であり；
Ｙ”は、スルフヒドリル反応性部位を表し；
Ｙ’は、スルフヒドリル保持メイタンシノイドと架橋剤との間のチオエーテル結合を表す；
によって表される。

本発明はまた、非開裂結合を介して連結された、メイタンシノイドおよび細胞結合剤の細胞毒性コンジュゲート（式１０）の調製のためのプロセスであって、細胞結合剤を式Ｚ’−Ｗ−Ｑ−Ｖ−Ｙ’−Ｄ’の化合物と反応させて、式ＣＢ−（Ｚ”−Ｗ−Ｑ−Ｖ−Ｙ’−Ｄ’）_ｍ
式中、
Ｚ’は、アミンまたはスルフヒドリル反応性基を表し；
Ｗは、１〜１０個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；
Ｑは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し；
Ｖは、１〜１０個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；
Ｙ’は、チオエーテル結合を表し；
Ｄ’は、スルフヒドリル保持メイタンシノイド、例えば、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１）またはＮ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メルカプト−４−メチル−ｌ−オキソペンチル）メイタンシン（ＤＭ４）を表し；
ＣＢは、細胞結合剤を表し；
Ｚ”は、アミド結合を表し；
ｍは、２〜８の整数である；
の細胞結合剤コンジュゲートを提供することを含むプロセスを開示する。

細胞結合剤メイタンシノイドコンジュゲートは、さらに精製されてよい。

本発明の代表的なＰＥＧ含有チオスクシンイミジル連結コンジュゲートの構造を示す（ｍＡｂ＝モノクローナル抗体）。 本発明の代表的なＰＥＧ含有チオアセトアミジル連結コンジュゲートの構造を示す。 本発明の代表的なＰＥＧ含有ジスルフィド連結化合物の構造を示す。 本発明のＰＥＧ含有チオスクシンイミジル連結コンジュゲートのための合成スキームを示す。 本発明のＰＥＧ含有チオアセトアミジル連結コンジュゲートのための合成スキームを示す。 本発明のＰＥＧ含有ジスルフィド連結化合物のための合成スキームを示す：ａ．）細胞結合剤への１工程コンジュゲーションのためのＰＥＧ含有ジスルフィド連結化合物の合成；およびｂ．）ヘテロ二官能性ＰＥＧ含有ジスルフィド連結架橋化合物の合成。 本発明のＰＥＧ含有チオスクシンイミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す（１工程コンジュゲーション）。 本発明のＰＥＧ含有チオスクシンイミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す（２工程コンジュゲーション）。 本発明のＰＥＧ含有チオエーテル連結（チオアセトアミジル連結）コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す（１工程コンジュゲーション）。 本発明のＰＥＧ含有チオエーテル連結（チオアセトアミジル連結）コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す（２工程コンジュゲーション） 本発明のＰＥＧ含有ジスルフィド連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す（１工程コンジュゲーション）。 本発明のＰＥＧ含有ジスルフィド連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す（２工程コンジュゲーション）。 本発明のＰＥＧ含有スルフヒドリル反応性チオスクシンイミジル連結化合物の合成スキームを示す。 本発明のＰＥＧ含有チオスクシンイミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す（１工程コンジュゲーション）。 本発明のＰＥＧ含有チオスクシンイミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す（２工程コンジュゲーション）。 本発明のＰＥＧ含有スルフヒドリル反応性チオアセトアミジル連結化合物のための合成スキームを示す；ａ．）１工程コンジュゲーションでのＰＥＧ含有スルフヒドリル反応性チオアセトアミド連結化合物の合成；およびｂ．）２工程コンジュゲーションでのヘテロ二官能性ＰＥＧ含有スルフヒドリル反応性架橋化合物の合成。 本発明のＰＥＧ含有チオアセトアミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す（１工程コンジュゲーション）。 本発明のＰＥＧ含有チオアセトアミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す（２工程コンジュゲーション）。 本発明のＰＥＧ含有スルフヒドリル反応性チオエーテル連結化合物のための合成スキームを示す：ａ．）１工程コンジュゲーションでのＰＥＧ含有スルフヒドリル反応性チオアセトアミジル連結化合物の合成；およびｂ．）２工程コンジュゲーションでのホモ二官能性ＰＥＧ含有スルフヒドリル反応性架橋化合物の合成。 本発明のＰＥＧ含有チオアセトアミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す（１工程コンジュゲーション）。 本発明のＰＥＧ含有チオアセトアミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す（２工程コンジュゲーション）。 脱グリコシル化ＨｕＡｂ−ＰＥＧ_４Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲート（１０．７ＤＭ１／Ａｂ、平均）の質量スペクトル（ＭＳ）を示す。 ＨｕＡｂ−ＰＥＧ_４Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲート（１０．７ＤＭ１／Ａｂ、平均）のサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）を示す。 ＨｕＡｂ−ＰＥＧ４Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲート（１０．７メイタンシノイド／抗体）のＦＡＣＳ結合が非修飾抗体の該結合に類似することを示す。 多剤耐性ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞に対する抗ＥｐＣＡＭ抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。 多剤耐性ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞に対する抗ＣａｎＡｇ抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。 Ｍｏｌｐ−８多発性骨髄腫細胞に対する抗ＣＤ５６抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。 ＨＣＴ１５細胞に対する抗ＥｐＣＡＭ抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。 ＣＯＬＯ２０５ｍｄｒ細胞に対する抗ＥｐＣＡＭ抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。 ＨＣＴ１５異種移植に対する抗ＥｐＣＡＭ抗体−メイタンシノイドコンジュゲートのインビボ抗腫瘍活性を示す。 ＣＯＬＯ２０５ｍｄｒ異種移植に対する抗ＥｐＣＡＭ抗体−メイタンシノイドコンジュゲートのインビボ抗腫瘍活性を示す。 ＣＯＬＯ２０５異種移植に対する抗ＥｐＣＡＭ抗体−メイタンシノイドコンジュゲートのインビボ抗腫瘍活性を示す。 ＣＯＬＯ２０５ｍｄｒ異種移植に対する抗ＣａｎＡｇ抗体−メイタンシノイドコンジュゲートのインビボ抗腫瘍活性を示す。 最大１７Ｄ／Ａを有する抗ＣａｎＡｇ抗体（ｈｕＣ２４２）−ＰＥＧ２４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートの結合を示す。 ＣＯＬＯ２０５細胞に対する、４〜１７Ｄ／Ａを有する抗ＣａｎＡｇ抗体（ｈｕＣ２４２）−ＰＥＧ２４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートのインビトロ有効性を示す。 多剤耐性（ｐｇｐ＋）ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞に対する、４〜１７Ｄ／Ａを有する抗ＣａｎＡｇ抗体（ｈｕＣ２４２）−ＰＥＧ２４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートのインビトロ有効性を示す。 ＵＯ−３１細胞に対する抗ＥＧＦＲ抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。 抗体−ＰＥＧ４−Ｍａｌ−ＤＭ１の血漿薬物動態を示す。 本発明のチオスクシンイミジル連結コンジュゲートの構造を示す（ｍＡｂ＝抗体、ｍ＝２〜８）。 本発明のチオアセトアミジル連結コンジュゲートの構造を示す（ｍＡｂ＝抗体、ｍ＝２〜８）。 本発明の化合物を用いて調製されるチオスクシンイミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す（ｍＡｂ＝抗体、ｍ＝２〜８）。 本発明の化合物を用いて調製されるチオアセトアミジル連結コンジュゲートのためのコンジュゲーション手順を示す（ｍＡｂ＝抗体、ｍ＝２〜８）。 本発明のアミン反応性チオスクシンイミジル連結化合物のための合成スキームを示す。 マレイミドとＮＨＳエステルとの間に直鎖炭化水素を含有するアミン反応性チオスクシンイミジル連結化合物の調製のための合成スキームを示す。 本発明の化合物を用いて調製される脱グリコシル化ｍＡｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲート（３．４２ＤＭ１／ｍＡｂ、平均）の質量スペクトル（ＭＳ）を示す。 マレイミドとＮＨＳエステルとの間にシクロアルキル基を含有するアミン反応性チオスクシンイミジル連結化合物の２工程調製のための合成スキームを示す。 マレイミドとＮＨＳエステルとの間にシクロアルキル基を含有するアミン−反応性非開裂性チオスクシンイミジル連結化合物の２工程調製のための合成スキームを示す。 本発明のチオアセトアミジル連結化合物の調製のための合成スキームを示す。 本発明のチオアセトアミジル連結化合物の２工程調製での合成スキームを示す。 本発明のチオスクシンイミジル連結コンジュゲート（ｍＡｂ＝抗体、ｍ＝２〜８）のための構造を示す。 本発明の化合物によって調製されるチオスクシンイミジル連結コンジュゲート（ｍＡｂ＝抗体、ｍ＝２〜８）のためのコンジュゲーション手順を示す。 本発明のスルフヒドリル反応性チオスクシンイミジル連結化合物の調製のための合成スキームである。 ３．８Ｄ／Ａを有する抗ＣａｎＡｇ（ｈｕＣ２４２）−Ｍａｌ−（ＣＨ_２）_６−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートが抗原陽性ＣＯＬ２０５細胞に結合することを示す。 ３．８Ｄ／Ａを有する抗ＣａｎＡｇ抗体（ｈｕＣ２４２）−Ｍａｌ−（ＣＨ_２）_６−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートが、抗原陽性ＣＯＬＯ２０５細胞に対して有効であるが、抗原陰性Ｎａｍａｌｗａ細胞に対してはあまり有効でないことを示す。

本発明は、ポリエチレングリコールまたはポリエチレンオキサイドリンカー（（−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ）によって薬物、例えば細胞毒性剤に連結した細胞結合剤、例えば抗体のコンジュゲートが、典型的な脂肪族リンカーおよび同様の薬物負荷を有する常套の細胞結合剤薬物コンジュゲートとの比較に基づいて予測したよりも数倍高い細胞毒性を標的癌細胞に対して示すという新規の所見を開示する。重要なことに、本発明において記載されているコンジュゲートは、多剤耐性（ｍｄｒ）であり、細胞毒性薬物による処置に対して低い感度を有する癌細胞に対してかなり有効または効果的である。癌の治療は、異なる化学治療剤による複数のラウンドの処置の後にしばしば遭遇する薬物耐性メカニズムを克服するという困難を有する。癌細胞において観察されるかかる１つのメカニズムは、多剤耐性と呼ばれ、ＡＴＰ結合カセット（ＡＢＣ）輸送体による薬物の輸送の向上によって引き起こされる（Ｃ．Ｄｒｕｍｏｎｄ、Ｂ．Ｉ．Ｓｉｋｉｃ、Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、１９９９，１７、１０６１−１０７０、Ｇ、Ｓｚｏｋａｃｓら、Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ、５；２１９−２３４、２００６）。これらの薬物耐性メカニズムを克服する治療、例えば、癌細胞によるかかる薬物流出を妨げるまたは克服することがかなり有用である。細胞結合剤および細胞毒性薬物のＰＥＧ連結コンジュゲートの細胞毒性が、多剤耐性癌細胞に対して評価されて、ＰＥＧリンカーが、これらの耐性細胞に対して何らかの利点を付与するか否かを試験した。ｍｄｒ細胞に対するかかるアッセイにおいて、細胞結合剤および細胞毒性薬物のＰＥＧ連結コンジュゲートは、従来のリンカーから誘導されるはるかに有効でないコンジュゲートと比較して予想外に有効なｍｄｒ細胞死滅を示した。加えて、本発明のコンジュゲートはまた、多剤耐性腫瘍細胞を用いて確立された動物モデルにおいて顕著に、より高い抗腫瘍活性を示す。

親水性ポリエチレングリコールまたはポリエチレンオキシドリンカー（ＰＥＧまたはＰＥＯ；（−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ）の使用はまた、治療用途に望まれる１ｍｇ／ｍｌを超える濃度において９０％を超える高いタンパク質モノマーレベルで、細胞結合剤分子あたり比較的多数の薬物の組み込みも可能にする。さらに、広範な細胞毒性薬物負荷（細胞結合剤あたり２という少数から例えば１５の多数の薬物が連結）を有する細胞結合剤のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）連結コンジュゲートは、標的癌細胞に対して、コンジュゲートの薬物負荷の増大に基づく薬物送達の化学量論的増大から予想されたものより著しく向上した細胞毒性を示した。ＰＥＧスペーサーを有する、細胞結合剤および薬物のコンジュゲートが、本発明において記載されており、これらは、標的癌細胞に対し、同様の薬物負荷を有する常套的に調製されたコンジュゲートと比較して２６０〜６５０倍もの有効性の向上という超化学量論的増大を細胞毒性において示した（例えば、図２９を参照）。

したがって、本発明の一態様において、ポリエチレングリコールスペーサー（−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎを有し、且つ細胞結合剤と反応することが可能である反応性基を有するリンカーを有する薬物が記載される。

この態様において特に考慮されるのは、式（１）の修飾化合物または式（１’）の特定の化合物：
Ｚ−Ｘ_ｌ−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−）_ｎ−Ｙ_ｐ−Ｄ （１）
Ｄ−Ｙ_ｐ−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−）_ｎ−Ｘ_ｌ−Ｚ （１’）
式中：
Ｚは、細胞結合剤とアミドまたはチオエーテル結合を形成することができる反応性官能基を表し；
Ｄは、薬物を表し；
Ｘは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し；
Ｙは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合を介して薬物に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し；
ｌは、０または１であり；
ｐは、０または１であり；
ｎは、１〜２０００の整数である；
である。

好ましくは、Ｙを薬物に付着させる共有結合は、チオエーテル結合またはアミド結合である。

好ましくは、ｎは、１〜１００の整数である。なおより好ましくは、ｎは、１〜１４の整数である。最も好ましい態様において、ｎは、１〜４の整数である。

本発明の第２態様において、ポリエチレングリコールリンカー（−ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎを有する、細胞結合剤および薬物の新規のコンジュゲートが記載される。これらのコンジュゲートは、常套のリンカーおよび等価の薬物負荷を有するコンジュゲートよりも癌細胞に対して有効である。

好ましい態様において特に考慮されるのは、式（２）の、細胞結合剤および薬物のコンジュゲート、または式（２’）の特定の化合物：
ＣＢ−［Ｘ_ｌ−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−）_ｎ−Ｙ_ｐ−Ｄ］_ｍ （２）
［Ｄ−Ｙ_ｐ−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−）_ｎ−Ｘ_ｌ］_ｍ−ＣＢ （２‘）
式中、
ＣＢは、細胞結合剤を表し；
Ｄは、薬物を表し；
Ｘは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し；
Ｙは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、エーテル結合、アミン結合、炭素−炭素結合およびヒドラゾン結合からなる群から選択される共有結合を介して薬物に付着した脂肪族、芳香族、または複素環式基を表し；
ｌは、０または１であり；
ｐは、０または１であり；
ｍは、２〜１５の整数であり；
ｎは、１〜２０００の整数である；
である。

好ましくは、共有結合は、チオエーテル結合またはアミド結合である。

好ましくは、ｍは、３〜８の整数である。

好ましくは、ｎは、１〜１００の整数である。なおより好ましくは、ｎは、１〜１４の整数である。最も好ましい態様において、ｎは、１〜４の整数である。

本発明は、抗体が細胞毒性薬物にジスルフィド結合を介して連結している抗体コンジュゲートの場合、イムノコンジュゲートの有効性または効能を向上させる際、連結される薬物の数とポリエチレングリコールスペーサーの長さとの間に重要な相関が存在するという新規の所見にも基づく。このリンカー設計のさらなる利益は、抗体−薬物コンジュゲートの望ましい高いモノマー比および最小限の凝集である。したがって、一態様において、本発明は、ジスルフィド連結コンジュゲートのためのポリエチレングリコールスペーサーが２〜８のエチレンオキシ基からなり、連結された薬物の数が３〜８の範囲であるとき、抗体−薬物コンジュゲートで最高の生物学的有効性または効能が得られ、また、望ましい高いモノマー含量が得られるという重要な所見に基づく。

好ましい態様において、短いポリエチレングリコールスペーサー（（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_{ｎ＝１〜１４}）を有するジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を介して、細胞結合剤と反応することが可能な官能基と連結された細胞毒性薬物が記載される。

この態様において特に考慮されるのは、式（３）の修飾細胞毒性化合物または式（３’）の特定の化合物：
Ｚ−Ｘ_ｌ−ＣＨ_２−ＣＨ_２Ｏ−）_ｎ−Ｙ−Ｄ （３）
Ｄ−Ｙ−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２Ｏ−）_ｎ−Ｘ_ｌ−Ｚ （３’）
式中：
Ｚは、細胞結合剤とアミドまたはチオエーテル結合を形成することができる反応性官能基を表し；
Ｄは、薬物を表し；
Ｘは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し；
Ｙは、ジスルフィド結合を介して薬物に付着した脂肪族、非芳香族複素環式または芳香族複素環式基を表し；
ｌは、０または１であり；
ｎは、１〜１４の整数である；
である。

好ましくは、ｎは、２〜８の整数である。

別の好ましい態様において、ポリエチレングリコールスペーサー（（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_{ｎ＝１〜１４}）を有するジスルフィド基（−Ｓ−Ｓ−）を介して３〜８の狭い範囲の薬物負荷によって連結された、細胞結合剤および薬物のコンジュゲートが記載され、これは、癌細胞に対して相対的に高い有効な生物学的活性を示し、また最小限のタンパク質凝集で望ましい生化学的特性：高いコンジュゲーション収率および高いモノマー比；を有する。

この態様において特に考慮されるのは、式（４）の細胞結合剤薬物コンジュゲートまたは式（４’）の特定の化合物：
ＣＢ−（Ｘ_ｌ−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２Ｏ−）_ｎ−Ｙ−Ｄ）_ｍ （４）
［Ｄ−Ｙ−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２Ｏ−）_ｎ−Ｘ_ｌ］_ｍ−ＣＢ（４’）
式中：
ＣＢは、細胞結合剤を表し；
Ｄは、薬物を表し；
Ｘは、チオエーテル結合、アミド結合、カルバメート結合、またはエーテル結合を介して細胞結合剤に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し；
Ｙは、ジスルフィド結合を介して薬物に付着した脂肪族、芳香族または複素環式基を表し；
ｌは、０または１であり；
ｍは、３〜８の整数であり；
ｎは、１〜１４の整数である；
である。

好ましくは、ｍは、３〜６の整数である。

また、好ましくは、ｎは、２〜８の整数である。

本発明において、薬物は親油性分子であり、これらは細胞結合剤、例えば、抗体にコンジュゲートされると、タンパク質の凝集または沈殿に起因してしばしば収率の損失が生じる。通常、細胞結合剤あたりの薬物の数を増大させることで、さらに悪いタンパク質の凝集または沈殿が生じ、これによりモノマー百分率が低くなり、収率が低下する。従来のリンカーによる典型的なコンジュゲート挙動と対照的に、ＰＥＧリンカーは、治療適用に有用である１ｍｇ／ｍｌ以上の高濃度で、細胞結合剤と薬物とのコンジュゲートのモノマー百分率（＞９０％のモノマー）および収率（＞７０％）において望ましい改善をもたらす。加えて、これらのコンジュゲートは、４℃での長期貯蔵に際して安定である。

本発明において、反応性基を持つチオエーテル部位を有する新規のメイタンシノイドが開示されるが、これらの化合物は、式（５）：
Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’（５）
式中：
Ｖは、好ましくは、１〜１０個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；より好ましくは、１〜５個の炭素原子を有する線状アルキルであり、さらにより好ましくは、Ｖは、１個の炭素のアルキル基（ＣＨ_２）であり；
Ｗは、１〜１０個の炭素原子を有する；より好ましくは、２〜８個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；さらにより好ましくは、Ｗは、シクロヘキシル基であり；
Ｄ’は、スルフヒドリル保持メイタンシノイドを表し、より好ましくは、ＤＭ１、ＤＭ３およびＤＭ４から選択され；
Ｙ’は、チオエーテル結合を表し；
Ｑは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し、好ましくは、Ｑは、存在せず；
Ｚ’は、限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、パラまたはオルトニトロフェニルエステル、ジニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステルおよびスルホテトラフルオロフェニルエステルから選択されるアミン反応性基またはチオール反応性基であり；マレイミドまたはハロアセトアミドであり、より好ましくは、Ｚは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルまたはマレイミドである；
によって表される。

別の実施形態において、チオエーテル部位を持つ反応性メイタンシノイド誘導体は、スルフヒドリル保持メイタンシノイド（例えば、ＤＭ１およびＤＭ４）およびヘテロ二官能性架橋剤から調製される。反応順序は、式（６）：
Ｄ’＋Ｙ”−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’→Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’ （６）
式中：
Ｖは、好ましくは１〜１０個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基；より好ましくは、１〜５個の炭素原子を有する線状アルキルであり、さらにより好ましくは、Ｖは１個の炭素のアルキル基（ＣＨ_２）であり；
Ｗは、１〜１０個の炭素原子を有する；より好ましくは、２〜８個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、さらにより好ましくは、Ｗは、シクロヘキシル基であり；
Ｙ”は、マレイミドまたはハロアセトアミドから選択されるチオール反応性基、好ましくはマレイミドを表し；
Ｄ’は、スルフヒドリル保持メイタンシノイドを表し、より好ましくは、ＤＭ１、ＤＭ３およびＤＭ４から選択され；
Ｙ’は、チオエーテル結合を表し
Ｑは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し、好ましくは、Ｑは存在せず
Ｚ’は、限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、パラまたはオルトニトロフェニルエステル、ジニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステルおよびスルホテトラフルオロフェニルエステルから選択されるアミン反応性基またはチオール反応性基を表し；マレイミドまたはハロアセトアミド、より好ましくは、Ｚは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルまたはマレイミドを表し
Ｙ’は、チオエーテル結合を表す；
によって表される。

本発明はまた、非開裂結合を介して連結された、メイタンシノイドおよび細胞結合剤の細胞毒性コンジュゲートの調製のためのプロセスであって、細胞結合剤を式Ｚ’−Ｗ−Ｑ−Ｖ−Ｙ’−Ｄ’の化合物と反応させて、式ＣＢ−（Ｚ”−Ｗ−Ｑ−Ｖ−Ｙ’−Ｄ’）_ｍ
式中、
Ｗは、１〜１０個の炭素原子を有する；より好ましくは、２〜８個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、さらにより好ましくは、Ｗは、シクロヘキシル基であり；
Ｑは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し、好ましくは、Ｑは存在せず；
Ｖは、好ましくは１〜１０個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；より好ましくは、１〜５個の炭素原子を有する線状アルキル基であり、さらにより好ましくは、Ｖは、１個の炭素のアルキル基（ＣＨ_２）であり；
Ｙ’は、チオエーテル結合を表し；
Ｄ’は、スルフヒドリル保持メイタンシノイドを表し、より好ましくは、ＤＭ１、ＤＭ３およびＤＭ４から選択され；
ＣＢは、抗体、単鎖抗体、抗体フラグメント、ペプチド、成長因子、ホルモン、ビタミン、またはアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ）から選択される細胞結合剤を表し、好ましくは、細胞結合剤は、抗体もしくは抗体フラグメントまたはＤａｒｐｉｎであり；
Ｚ’は、限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステル、パラまたはオルトニトロフェニルエステル、ジニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステルおよびスルホテトラフルオロフェニルエステルから選択されるアミン反応性基またはチオール反応性基であり；マレイミドまたはハロアセトアミドであり、より好ましくは、Ｚは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステルまたはマレイミドであり；
Ｚ”は、チオエーテル結合またはアミド結合を表す；
の細胞結合剤コンジュゲートを提供することを含むプロセスも提供する。

プロセスは、細胞結合剤、例えば抗体の、最大で２０％の有機溶媒を適宜含有する、水性緩衝液中の細胞結合剤の溶液と、有機溶媒または有機溶媒および水性緩衝液もしくは水の混合物中の式Ｚ’−Ｗ−Ｑ−Ｖ−Ｙ’−Ｄ’の化合物とを混合し、反応を５分〜７２時間の間進行させることによって行われ得る。コンジュゲートは、クロマトグラフィ、透析、クロスフロー濾過または前記方法の組み合わせによって精製されてよい。

全ての態様において、「脂肪族基」は、アルキル、アルケニルまたはアルキニル基として定義される。アルキル基は、鎖に好ましくは１〜２０個の炭素原子を有する直鎖または分枝状であってよい脂肪族炭化水素基、または好ましくは３〜１０個の炭素原子を有する環状である脂肪族炭化水素基である。より好ましいアルキル基は、鎖に１〜１２個の炭素原子を有する。「分枝状」は、１種以上の低級アルキル基、例えば、メチル、エチルまたはプロピルが、線状アルキル鎖に付着していることを意味する。例示的なアルキル基として、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｉ−プロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、３−ペンチル、オクチル、ノニル、デシル、シクロペンチルおよびシクロヘキシルが挙げられる。

アルケニル基は、炭素−炭素二重結合を含有し、好ましくは２〜１５個の炭素原子を鎖に有する、直鎖または分枝状であってよい脂肪族炭化水素基である。より好ましいアルケニル基は、鎖に２〜１２個の炭素原子；より好ましくは、鎖に約２〜４個の炭素原子を有する。例示的なアルケニル基として、エテニル、プロペニル、ｎ−ブテニル、ｉ−ブテニル、３−メチルブタ−２−エニル、ｎ−ペンテニル、ヘプテニル、オクテニル、ノネニル、デセニルが挙げられる。

アルキニル基は、炭素−炭素三重結合を含有し、好ましくは２〜１５個の炭素原子を鎖に有する、直鎖または分枝状であってよい脂肪族炭化水素基である。より好ましいアルキニル基は、鎖に２〜１２個の炭素原子；より好ましくは、鎖に２〜４個の炭素原子を有する。例示的なアルキニル基として、エチニル、プロピニル、ｎ−ブチニル、２−ブチニル、３−メチルブチニル、ｎ−ペンチニル、ヘプチニル、オクチニルおよびデシニルが挙げられる。

本明細書において用いられるとき、用語「芳香族基」は、６〜１４個の炭素原子、好ましくは６〜１０個の炭素原子の芳香族単環式または多環式炭化水素環系からなる置換または非置換のアリール基を意味する。例示的なアリール基として、フェニルおよびナフチルが挙げられる。置換基として、限定されないが、アルキル基、ハロゲン、ニトロ、アミノ、ヒドロキシルおよびアルコキシ基が挙げられる。

ハロゲンとして、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素原子が挙げられる。フッ素および塩素原子が好ましい。

用語「複素環式基」は、本明細書において用いられるとき、飽和、部分不飽和または不飽和の、非芳香族の安定な３〜１４、好ましくは５〜１０員の単、二または多環式環であって、環の少なくとも一員が、ヘテロ原子であるもの、あるいは、少なくとも１個のヘテロ原子を有する芳香族の好ましくは５〜１０員の単、二または多環式環を称する。通常、ヘテロ原子として、限定されないが、酸素、窒素、硫黄、セレニウム、およびリン原子が挙げられる。好ましいヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄である。

好ましい複素環式基として、限定されないが、ピロリジニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキシラニル、テトラヒドロフラニル、ジオキソラニル、テトラヒドロ−ピラニル、ジオキサニル、ジオキソラニル、ピペリジル、ピペラジニル、モルホリニル、ピラニル、イミダゾリニル、ピロリニル、ピラゾリニル、チアゾリジニル、テトラヒドロチオピラニル、ジチアニル、チオモルホリニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロピラニル、ジヒドロピラニル、テトラヒドロ−ピリジル、ジヒドロピリジル、テトラヒドロピリニジニル、ジヒドロチオピラニル、アゼパニル、ピロリル、ピリジル、ピラゾリル、チエニル、ピリミジニル、ピラジニル、テトラゾリル、インドリル、キノリニル、プリニル、イミダゾリル、チエニル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、フラニル、ベンゾフラニル、１，２，４−チアジアゾリル、イソチアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、イソキノリル、ベンゾチエニル、イソベンゾフリル、ピラゾリル、カルバゾリル、ベンズイミダゾリル、およびイソオキサゾリル、ピリジル−Ｎ−オキシド、ならびにフェニル基との縮合から得られる融合系が挙げられる。

ＸおよびＹによって表される脂肪族、芳香族および複素環式基は、荷電した置換基を保有することもできる。荷電した置換基は、限定されないがカルボキシレート、スルホネートおよびホスフェートから選択され、負に帯電していても、第三級または第四級アミノ基から選択され、正に帯電していてもよい。

表記「細胞結合剤に連結された」は、本明細書において用いられるとき、好適な連結基、またはその前駆体を介して、細胞結合剤に結合した少なくとも１個の薬物誘導体を含むコンジュゲート分子を称する。好ましい連結基は、チオールもしくはジスルフィド結合、またはその前駆体である。

本明細書において用いられるとき、所与の基の「前駆体」は、いずれかの脱保護、化学修飾、またはカップリング反応によって基を生じ得るいずれの基も称する。例えば、前駆体は、チオール前駆体としてのチオエステルまたはチオエーテルによって例示される適切に保護された官能基であり得る。

本明細書において用いられるとき、用語「反応性官能基」は、アミン反応性官能基、チオール反応性官能基またはヒドロキシル反応性官能基を称する。換言すると、反応性官能基は、細胞結合剤に存在するアミン、スルフヒドリル（チオール）、またはヒドロキシル基と反応し得る。例えば、アミン反応性官能基は、アミド結合をもたらす、反応性カルボン酸エステル（Ｎ−スクシンイミジル、Ｎ−スルホスクシンイミジル、Ｎ−フタルイミジル、Ｎ−スルホフタルイミジル、２−ニトロフェニル、４−ニトロフェニル、２，４−ジニトロフェニル、３−スルホ−４−ニトロフェニル、３−カルボキシ−４−ニトロフェニル、テトラフルオロフェニルエステルを含む）、反応性スルホン酸誘導体、または反応性チオエステルであり得て；チオール反応性官能基は、チオエーテル結合をもたらすマレイミド、ハロアセトアミド、またはビニルスルホンであり得て；ヒドロキシル反応性官能基は、エステル結合をもたらす反応性カルボン酸エステルであり得る。

Ａ．親水性リンカーを有する、修飾された薬物および修飾された細胞結合剤
リンカーは、薬物、例えばメイタンシノイドを細胞結合剤に安定な共有結合様式で連結させることが可能であるあらゆる化学部位である。リンカーは、薬物または細胞結合剤が活性を維持する条件で、酸誘発開裂、光誘発開裂、ペプチダーゼ誘発開裂、エステラーゼ誘発開裂、およびジスルフィド結合開裂に対して、感受性または実質的に耐性の可能性がある。図１、２および３は、本発明のコンジュゲートの構造を例示する。

薬物と細胞結合剤との間にリンカーを形成する親水性ＰＥＧ鎖を含む好適な架橋試薬は、当該分野で周知であるか、あるいは市販されている（例えば、Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎから、オハイオ州パウエル）。好適なＰＥＧ含有架橋剤は、市販のＰＥＧ自体から、当業者に公知の標準的な合成化学技術を用いて合成することもできる。本明細書に記載の方法により、薬物を二官能性ＰＥＧ含有架橋剤と反応させると、式（１）、Ｚ−Ｘ_ｌ−（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ−）_ｎ−Ｙ_ｐ−Ｄの化合物が得られる。例えば、チオール含有メイタンシノイド薬物をＰＥＧスペーサーを有するビスマレイミド架橋剤と反応させると、チオエーテル結合を介してＰＥＧスペーサーに結合されたメイタンシノイド薬物が得られる（例えば、図１３を参照）。ＰＥＧスペーサーおよび末端マレイミド基を有するこの修飾されたメイタンシノイドを、次いで例えば図１４に示される細胞結合剤と反応させると、本発明の式（２）の細胞結合剤−薬物コンジュゲートが得られる。

代替的には、アミン反応性基、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを持つ二官能性ＰＥＧ含有架橋剤の一方の端で細胞結合剤をまず反応させると、リンカーにアミド結合を通して共有結合的に結合した修飾された細胞結合剤が得られる（例えば、図１５を参照）。次の工程で、メイタンシノイドを、ＰＥＧスペーサーの他方の端のマレイミド置換基と反応させると、本発明の細胞結合剤−薬物コンジュゲートが得られる。

図１６および１７は、例えばＰＥＧ架橋剤の合成、およびチオアセトアミド連結を通してのそれとメイタンシノイドとの反応を示す。次いでマレイミド置換基は、ＰＥＧに組み込まれて、チオエーテル結合を介しての細胞結合剤との反応を可能にする。代替的には、例えば図１８に示されるように、細胞結合剤が、まずチオエーテル結合を通してＰＥＧ架橋剤に連結する。次いで、修飾された細胞結合剤をメイタンシノイド薬物と反応させると、コンジュゲートが得られる。ＰＥＧスペーサーの両端がヨードアセトアミド部分を含むホモ二官能性ＰＥＧ架橋剤であって、細胞毒性薬物と細胞結合剤の両方をチオエーテル結合を介して連結させて親水性ＰＥＧスペーサーを含むコンジュゲートをもたらすことができるホモ二官能性ＰＥＧ架橋剤の合成は、例えば図１９に示される。本発明のコンジュゲートを得るためのコンジュゲーション手順は、例えば図２０および２１に示される。

当業者であれば、種々の反応性基を持つ他のＰＥＧ含有架橋剤が、本明細書に記載されている方法により容易に合成され得ることを理解するであろう。例えば、ヒドロキシル基を持つ薬物、例えば１９−デメチルメイタンシノイド（米国特許第４，３６１，６５０号）を、塩基、例えば炭酸カリウムの存在下でヨード−アセチル−ＰＥＧリンカー（図５）と反応させると、エーテル結合を介してメイタンシノイドを連結させることができる。同様に、アミン含有メイタンシノイド（米国特許第７，３０１，０１９号に記載されているように合成）を、ヨードアセチルＰＥＧ（図５に示される）と、塩基、例えばピリジンまたはトリエチルアミンの存在下で反応させると、アミン連結を介してＰＥＧに連結されたメイタンシノイドが得られる。アミド結合を介した薬物とＰＥＧとの連結については、カルボキシ−ＰＥＧ（図５に示される）を、縮合剤、例えばジシクロヘキシルカルボジイミドの存在下でアミン含有メイタンシノイドと反応させると、アミド結合されたＰＥＧ−メイタンシノイドが得られる。薬物をＰＥＧスペーサーにカルバメート連結を介して連結させるためには、ＰＥＧをまずジホスゲンと反応させてＰＥＧクロロホルメートを得て、次いでこれをアミン含有メイタンシノイドと、塩基、例えばトリエチルアミンの存在下で反応させて、カルバメート連結されたＰＥＧ−メイタンシノイドを得ることができる。

好適なリンカーの例として、細胞結合剤との反応のためのＮ−スクシンイミジルエステル部位またはＮ−スルホスクシンイミジルエステル部位、および薬物との反応のためのマレイミドまたはハロアセチルをベースとする部位を有するリンカーが挙げられる。ＰＥＧスペーサーが、本明細書に記載されている方法によって当該分野において公知のいずれの架橋剤に組み込まれてもよい。マレイミド系部位を含む架橋試薬であってＰＥＧスペーサーが組み込まれ得る架橋試薬として、限定されないが、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、Ｎ−スクシンイミジル−４−（Ｎ’−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）：これはＳＭＣＣの「長鎖」アナログである（ＬＣ−ＳＭＣＣ）、κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）が挙げられる。ハロアセチルをベースとする部位を含む架橋試薬として、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）、およびＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）が挙げられる。

硫黄原子を含まない他の架橋試薬も本発明方法に用いられ得る。かかる架橋試薬は、ジカルボン酸をベースとする部位から誘導され得る。ジカルボン酸をベースとする好適な部位として、限定されないが、以下に示される一般式：
ＨＯＯＣ−Ａ’_ｐ−Ｅ’_ｑ−（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎＧ’_ｒ−ＣＯＯＨ
式中：Ａ’は２〜２０個の炭素原子を有する、適宜、直鎖または分枝鎖アルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、Ｅ’は３〜１０個の炭素原子を有する、適宜、シクロアルキルまたはシクロアルケニル基であり、Ｇ’は６〜１０個の炭素原子を有する、適宜、置換もしくは非置換芳香族基、またはヘテロ原子がＮ、ＯもしくはＳから選択される置換もしくは非置換複素環式基であり、ｐ、ｑおよびｒはそれぞれ０または１であり、ただし、ｐ、ｑおよびｒが同時にすべてゼロであることはなく、ｎは１から２０００までの整数である；のα，ω−ジカルボン酸が挙げられる。

本明細書に開示されているリンカーの多くは米国特許出願公開第２００５０１６９９３３号に詳細に記載されている。

本発明の別の態様において、細胞結合剤は、二官能性架橋試薬を細胞結合剤と反応させることにより修飾され、これにより細胞結合剤へのリンカー分子の共有結合が得られる。「二官能性架橋試薬」は、本明細書において用いられるとき、細胞結合剤を薬物、例えば本明細書に記載されている薬物に共有結合的に連結させるあらゆる化学部位である。本発明の好ましい態様において、連結部位の一部は薬物により与えられる。この点において、薬物は、細胞結合剤を薬物につなげるために用いられる、より大きいリンカー分子の一部である連結部位を含む。例えば、メイタンシノイドＤＭ１を形成するために、メイタンシンのＣ−３ヒドロキシル基における側鎖が、遊離スルフヒドリル基（ＳＨ）を有するように修飾される。このチオール化された形態のメイタンシンは、修飾された細胞結合剤と反応して、コンジュゲートを形成することができる。したがって、最終リンカーは２つの構成部分から組み立てられるが、その一方は架橋試薬によって付与され、他方はＤＭ１からの側鎖により付与される。

本発明の別の態様において、薬物は、ジスルフィド結合を通して細胞結合剤に連結される。リンカー分子は、細胞結合剤と反応し得る反応性化学基を含む。細胞結合剤との反応に好ましい反応性化学基は、Ｎ−スクシンイミジルエステルおよびＮ−スルホスクシンイミジルエステルである。さらにリンカー分子は、薬物と反応してジスルフィド結合を形成し得る反応性化学基、好ましくはジチオピリジル基を含む。特に好ましいリンカー分子として、例えば、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（例えば、Ｃａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，１７３：７２３−７３７（１９７８）を参照）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ブタノエート（ＳＰＤＢ）（例えば、米国特許第４，５６３，３０４号）、Ｎ−スクシンイミジル４−（２−ピリジルジチオ）ペンタノエート（ＳＰＰ）（例えば、ＣＡＳ登録番号３４１４９８−０８−６）、および他の反応性架橋剤、例えば、米国特許第６，９１３，７４８号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれる）に記載されているもの、が挙げられる。

代替的には、米国特許第６，４４１，１６３Ｂ１号に開示されるように、薬物がまず修飾されて、細胞結合剤と反応するのに好適な反応性エステルを導入することができる。活性化されたリンカー部位を含むこれらの薬物と細胞結合剤との反応は、細胞結合剤−薬物コンジュゲートを製造する別の方法を提供する。ｓｉＲＮＡの連結については、ｓｉＲＮＡが、オリゴヌクレオチドの修飾に一般に用いられる方法により、本発明の架橋剤に連結され得る（例えば、米国特許出願公開第２００５０１０７３２５号および同第２００７０２１３２９２号）。したがって、３’または５’−ホスホロアミダイト形態のｓｉＲＮＡが、ヒドロキシル官能基を持つ架橋剤の一方の端と反応して、ｓｉＲＮＡと架橋剤との間にエステル結合をもたらす。同様に、ｓｉＲＮＡホスホロアミダイトと末端アミノ基を持つ架橋剤との反応により、アミンを通して架橋剤とｓｉＲＮＡとが連結される。

Ｂ．細胞結合剤
本発明に用いられる細胞結合剤は、癌細胞上の標的抗原に特異的に結合するタンパク質（例えば免疫グロブリンおよび非免疫グロブリンタンパク質）である。これらの細胞結合剤として、以下：
−下記を含む抗体：
−表面再構成抗体（米国特許第５，６３９，６４１号）；
−ヒト化抗体または完全ヒト抗体（ヒト化抗体または完全ヒト抗体は、限定されないが、ｈｕＭｙ９−６、ｈｕＢ４、ｈｕＣ２４２、ｈｕＮ９０１、ＤＳ６、ＣＤ３８、ＩＧＦ−ＩＲ、ＣＮＴＯ９５、Ｂ−Ｂ４、トラスツズマブ、ビバツズマブ、シブロツズマブ、ペルツズマブおよびリツキシマブから選択される（例えば、米国特許第５，６３９，６４１号、同第５，６６５，３５７号、および同第７，３４２，１１０号；米国仮特許出願第６０／４２４，３３２号、国際特許出願ＷＯ０２／１６，４０１号、米国特許出願公開第２００６００４５８７７号、米国特許出願公開第２００６０１２７４０７号、米国特許出願公開第２００５０１１８１８３号、Ｐｅｄｅｒｓｅｎら（１９９４）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５，９５９−９７３，Ｒｏｇｕｓｋａら、（１９９４） Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｖｏｌ９１，９６９−９７３，Ｃｏｌｏｍｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｖｅｓｔ．，１９：４９−５６（２００１），Ｈｅｉｄｅｒら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３１Ａ：２３８５−２３９１（１９９５），Ｗｅｌｔら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１２：１１９３−１２０３（１９９４）、およびＭａｌｏｎｅｙら、Ｂｌｏｏｄ，９０：２１８８−２１９５（１９９７））；ならびに
−抗体のエピトープ結合フラグメント、例えば、ｓＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、およびＦ（ａｂ’）_２（Ｐａｒｈａｍ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２８９５−２９０２（１９８３）；Ｓｐｒｉｎｇら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：４７０〜４７８（１９７４）；Ｎｉｓｏｎｏｆｆら、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．８９：２３０〜２４４（１９６０））；
が挙げられる。

さらなる細胞結合剤として、限定されないが：
−アンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ；Ｚａｈｎｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２８１，４６，３５１６７−３５１７５，（２００６）；Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．＆ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２３，１２５７−１２６８）、または、例えば米国特許出願公開第２００７０２３８６６７号；米国特許第７，１０１，６７５号；ＷＯ／２００７／１４７２１３；およびＷＯ／２００７／０６２４６６に記載されているアンキリン様リピートタンパク質もしくは合成ペプチド）；
−インターフェロン（例えばα、β、γ）；
−リンホカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−６；
−ホルモン、例えば、インスリン、ＴＲＨ（チロトロピン放出ホルモン）、ＭＳＨ（メラノサイト刺激ホルモン）、ステロイドホルモン、例えばアンドロゲンおよびエストロゲン；ならびに
−成長因子およびコロニー刺激因子、例えばＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＩＧＦ−Ｉ、Ｇ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦおよびＧＭ−ＣＳＦ（Ｂｕｒｇｅｓｓ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｔｏｄａｙ ５：１５５−１５８（１９８４））；
によって例示される他の細胞結合性タンパク質およびポリペプチドが挙げられる。

細胞結合剤は、抗体である場合、ポリペプチドでありかつ膜貫通分子（例えば受容体）であり得る抗原、またはリガンド、例えば成長因子に結合する。抗原として、例えば、分子、例えば、レニン；ヒト成長ホルモンおよびウシ成長ホルモンを含む成長ホルモン；成長ホルモン放出因子；副甲状腺ホルモン；甲状腺刺激ホルモン；リポタンパク質；α−１−アンチトリプシン；インスリンＡ鎖；インスリンＢ鎖；プロインスリン；卵胞刺激ホルモン；カルシトニン；黄体形成ホルモン；グルカゴン；凝固因子、例えばｖｍｃ因子、ＩＸ因子、組織因子（ＴＦ）、およびフォンビルブラント因子；抗凝固因子、例えばプロテインＣ；心房性ナトリウム利尿因子；肺表面活性物質；プラスミノーゲン活性化因子、例えばウロキナーゼもしくはヒトの尿、または組織タイプのプラスミノーゲン活性化剤（ｔ−ＰＡ）；ボンベシン；トロンビン；造血性成長因子；腫瘍壊死因子−αおよび−β；エンケファリナーゼ；ＲＡＮＴＥＳ（ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｏｎ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｎｏｒｍａｌｌｙ Ｔ−ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｎｄ ｓｅｃｒｅｔｅｄ）；ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）；血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン；ミュラー管抑制物質；リラキシンＡ鎖；リラキシンＢ鎖；プロリラキシン；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；微生物タンパク質、例えばβラクタマーゼ；ＤＮアーゼ；ＩｇＥ；細胞毒性Ｔ−リンパ球関連抗原（ＣＴＬＡ）、例えばＣＴＬＡ−４；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；ホルモンまたは成長因子の受容体；プロテインＡまたはＤ；リウマチ因子；神経栄養因子、例えば骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ４、ＮＴ−５またはＮＴ−６）、または神経成長因子、例えばＮＧＦ−β；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）；線維芽細胞成長因子、例えばａＦＧＦおよびｂＦＧＦ；上皮成長因子（ＥＧＦ）；トランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、例えばＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β：ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含む；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）；デス（１−３）−ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｉ）、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＥｐＣＡＭ、ＧＤ３、ＦＬＴ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＳＴＥＡＰ、ＣＥＡ、ＴＥＮＢ２、ＥｐｈＡ受容体、ＥｐｈＢ受容体、葉酸受容体、ＦＯＬＲ１、メソテリン、クリプト、α_ｖβ_６、インテグリン、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ、トランスフェリン受容体、ＩＲＴＡ１、ＩＲＴＡ２、ＩＲＴＡ３、ＩＲＴＡ４、ＩＲＴＡ５；ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５９、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１５２；エリスロポエチン；骨誘導因子；イムノトキシン；骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β、および−γ；コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、例えばＭ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ−１〜ＩＬ−１０；スーパーオキシドジスムターゼ；Ｔ細胞受容体；表面膜タンパク質；崩壊促進因子；ウイルス抗原、例えばＨＩＶエンベロープの一部；輸送タンパク質；ホーミング受容体；アドレシン；調節タンパク質；インテグリン、例えばＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ、ＶＬＡ−４およびＶＣＡＭ；腫瘍関連抗原、例えばＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体；ならびに先に列挙したポリペプチドのいずれかのフラグメント、抗体模倣体アドネクチン（米国特許出願第２００７００８２３６５号）、または全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８０１７１０４０号または米国特許出願公開第２００８０３０５０４４号に開示されている１種以上の腫瘍関連抗原もしくは細胞表面受容体に結合する抗体、が挙げられる。

さらに、骨髄細胞に結合するＧＭ−ＣＳＦが、急性骨髄性白血病由来の罹患細胞に対する細胞結合剤として用いられ得る。活性Ｔ細胞に結合するＩＬ−２は、移植片拒絶の予防のために、移植片対宿主疾患の治療および予防のために、ならびに急性Ｔ細胞性白血病の処置のために用いられ得る。メラノサイトに結合するＭＳＨは、黒色腫の処置のために用いられ得る。葉酸が用いられて、卵巣および他の腫瘍に発現する葉酸受容体を標的化することができる。上皮成長因子が用いられて、扁平上皮癌、例えば肺癌および頭頚部癌を標的化することができる。ソマトスタチンが用いられて、神経芽細胞腫および他の腫瘍タイプを標的化することができる。

乳腺および精巣の癌は、それぞれ細胞結合剤としてのエストロゲン（またはエストロゲンアナログ）またはアンドロゲン（またはアンドロゲンアナログ）によって成功裏に標的化され得る。

本発明に包含される抗体に対する好ましい抗原として、ＣＤタンパク質、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１４、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５２、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ７９、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ１０３、ＣＤ１０５、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３８、およびＣＤ１５２；ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、例えば、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体；細胞接着分子、例えば、ＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、α４／β７インテグリン、およびα_ｖ／β_３インテグリン（そのαまたはβサブユニットを含む）（例えば、抗−ＣＤ１１ａ、抗−ＣＤ１８または抗−ＣＤ１１ｂ抗体）；成長因子、例えばＶＥＧＦ；組織因子（ＴＦ）；ＴＧＦ−β；αインターフェロン（α−ＩＦＮ）；インターロイキン、例えばＩＬ−８；ＩｇＥ；血液型抗原Ａｐｏ２、デス受容体；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣなどが挙げられる。本明細書において最も好ましい標的は、ＩＧＦ−ＩＲ、ＣａｎＡｇ、ＥｐｈＡ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＶＥＧＦ、ＴＦ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ１３８、ＣＡ６、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＥｐＣＡＭ、クリプト（大部分のヒト乳癌細胞において高レベルで産生されるタンパク質）、ダルピン、α_ｖ／β_３インテグリン、α_ｖ／β_５インテグリン、α_ｖ／β_６インテグリン、ＴＧＦ−β、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、Ａｐｏ２およびＣ２４２、または、全体が参照によって本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８０１７１０４０号もしくは米国特許出願公開第２００８０３０５０４４号に開示されている、１以上の腫瘍関連抗原もしくは細胞表面受容体に結合する抗体が挙げられる。

本発明に包含される抗体に対する好ましい抗原として、ＣＤタンパク質、例えばＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２７、ＣＤ３４、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４６、ＣＤ５６、ＣＤ７０およびＣＤ１３８；ＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバー、例えばＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４受容体；細胞接着タンパク質、例えばＬＦＡ−１、Ｍａｃ１、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ、ＥｐＣＡＭ、α４／β７インテグリン、およびαｖ／β３インテグリン（そのαまたはβサブユニットを含む）（例えば、抗−ＣＤ１１ａ、抗−ＣＤ１８または抗−ＣＤ１１ｂ抗体）；成長因子、例えばＶＥＧＦ；組織因子（ＴＦ）；ＴＧＦ−β；αインターフェロン（αＩＦＮ）；インターロイキン、例えばＩＬ−８；ＩｇＥ；血液型抗原Ａｐｏ２、デス受容体；ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体；肥満（ＯＢ）受容体；ｍｐｌ受容体；ＣＴＬＡ−４；プロテインＣなども挙げられる。本発明において最も好ましい標的は、ＩＧＦ−ＩＲ、ＣａｎＡｇ、ＥＧＦ−Ｒ、ＥＧＦ−ＲｖＩＩＩ、ＥｐｈＡ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＶＥＧＦ、ＴＦ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５６、ＣＤ７０、ＣＤ１３８、ＣＡ６、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、クリプト（大部分のヒト乳癌細胞において高レベルで産生されるタンパク質）、α_ｖ／β_３インテグリン、α_ｖ／β_５インテグリン、ＴＧＦ−β、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、Ａｐｏ２、ＥｐＣＡＭおよびＣ２４２である。

モノクローナル抗体技術により、モノクローナル抗体の形態の特異的細胞結合剤の製造が可能になる。当該分野において特に周知のものは、マウス、ラット、ハムスター、またはいずれかの他の哺乳動物を、目的とする抗原、例えば無傷の標的細胞、標的細胞から分離された抗原、全ウイルス、弱毒化した全ウイルス、およびウイルスタンパク質、例えばウイルスコートタンパク質で免疫化することにより産生されるモノクローナル抗体を作製するための技術である。感作されたヒト細胞も用いられ得る。モノクローナル抗体を作製する別の方法は、ｓＦｖ（一本鎖可変領域）、特にヒトｓＦｖのファージライブラリーの使用である（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、米国特許第５，８８５，７９３号；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、ＷＯ９２／０１０４７；Ｌｉｍｉｎｇら、ＷＯ９９／０６５８７）。

適切な細胞結合剤の選択は、標的化されるべき特定の細胞集団に依存する選択の問題であるが、適切なものが利用可能であるならば、一般にモノクローナル抗体およびそのエピトープ結合フラグメントが好ましい。

例えば、モノクローナル抗体Ｍｙ９は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞上に見出されるＣＤ３３抗原に対して特異的なネズミＩｇＧ_２ａ抗体であり（Ｒｏｙら、Ｂｌｏｏｄ ７７：２４０４−２４１２（１９９１））、ＡＭＬ患者を処置するのに用いられ得る。同様に、モノクローナル抗体、抗−Ｂ４は、Ｂ細胞上のＣＤ１９抗原に結合するネズミＩｇＧ_１であり（Ｎａｄｌｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３１：２４４−２５０（１９８３））、非ホジキンリンパ腫または慢性リンパ芽球性白血病の場合などの標的細胞がこの抗原を発現するＢ細胞または罹患細胞であるとき用いられ得る。抗体Ｎ９０１は、小細胞性肺癌腫細胞上および神経内分泌由来の他の腫瘍の細胞上に見出されるＣＤ５６に結合するネズミモノクローナルＩｇＧ_１抗体である（Ｒｏｙら、Ｊ．Ｎａｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８８：１１３６−１１４５（１９９６））；ｈｕＣ２４２はＣａｎＡｇ抗原に結合する抗体である；トラスツヅマブはＨＥＲ２／ｎｅｕに結合する抗体である；抗ＥＧＦ受容体抗体はＥＧＦ受容体に結合する。

Ｃ．薬物
本発明に用いられる薬物は、細胞結合剤に連結され得る細胞毒性薬物である。好適な薬物の例にとして、メイタンシノイド、ＤＮＡ結合性薬物、例えばＣＣ−１０６５およびそのアナログ、カリケアマイシン、ドキソルビシンおよびそのアナログ、ビンカアルカロイド）、クリプトフィシン、ドラスタチン、オーリスタチンおよびそのアナログ、ツブライシン、エポチロン、タキソイド、およびｓｉＲＮＡが挙げられる。

好ましいメイタンシノイドは、米国特許第５，２０８，０２０号；同第５，４１６，０６４号；同第６，３３３．４１０号；同第６，４４１，１６３号；同第６，７１６，８２１；ＲＥ３９，１５１および同第７，２７６，４９７号に記載されているものである。好ましいＣＣ−１０６５アナログは、米国特許第５，４７５，０９２号；同第５，５９５，４９９号；同第５，８４６，５４５号；同第６，５３４，６６０号；同第６，５８６，６１８号；同第６，７５６，３９７号および同第７，０４９，３１６に記載されているものである。好ましいドキソルビシンおよびそのアナログは、米国特許第６，６３０，５７９号に記載されているものである。好ましいタキソイドは、米国特許第６，３４０，７０１号；同第６，３７２，７３８号；同第６．４３６，９３１号；同第６，５９６，７５７号；同第６，７０６，７０８号；同第７，００８，９４２号；同第７，２１７，８１９号および同第７，２７６，４９９号に記載されているものである。カリケアマイシンは、米国特許第５，７１４，５８６号および同第５７３９，１１６号に記載されている。

ビンカアルカロイド化合物、ドラスタチン化合物、およびクリプトフィシン化合物は、ＷＯ０１／２４７６３に詳細に記載されている。オーリスタチンとして、オーリスタチンＥ、オーリスタチンＥＢ（ＡＥＢ）、オーリスタチンＥＦＰ（ＡＥＦＰ）、モノメチルオーリスタチンＥ（ＭＭＡＥ）が挙げられ、米国特許第５，６３５，４８３号、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１５：３６７−７２（１９９９）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｖｏｌ．３，Ｎｏ．８，ｐｐ．９２１−９３２（２００４）；米国特許出願第１１／１３４８２６号、米国特許出願公開第２００６００７４００８号、同第２００６０２２９２５号に記載されている。ツブライシン化合物は、米国特許出願公開第２００５０２４９７４０号に記載されている。クリプトフィシン化合物は、米国特許第６，６８０，３１１号および同第６，７４７，０２１号に記載されている。エポチロンは、米国特許第６，９５６，０３６号および同第６，９８９，４５０号に記載されている。

ｓｉＲＮＡは、米国特許出願公開第２００７０２７５４６５号、同第２００７０２１３２９２号、同第２００７０１８５０５０号、同第２００７０１６１５９５号、同第２００７００５４２７９号、同第２００６０２８７２６０号、同第２００６００３５２５４号、同第２００６０００８８２２号、同第２００５０２８８２４４号、同第２００５０１７６６６７号に詳細に記載されている。

アナログおよび誘導体
細胞毒性剤の当業者であれば、本明細書に記載されている細胞毒性剤のそれぞれが、得られる化合物が出発化合物の特異性および／または活性を依然として保持するように修飾され得ることを容易に理解するであろう。当業者であれば、これらの化合物の多くが本明細書に記載されている細胞毒性剤の代わりに用いられ得ることも理解するであろう。したがって、本発明の細胞毒性剤には、本明細書に記載されている化合物のアナログおよび誘導体が含まれる。

細胞結合剤は、これまでに記載されている方法（米国特許第６，０１３，７４８号；同第６，４４１，１６３１号、および同第６，７１６，８２１号；米国特許出願公開第２００５０１６９９３３号；ならびにＷＯ２００６／０３４４８８Ａ２）によって細胞毒性薬物にコンジュゲートされ得る。

Ｄ．治療的用途
本発明の細胞結合剤−薬物コンジュゲート（例えばイムノコンジュゲート）は、化学治療剤とも併用され得る。かかる化学治療剤は、米国特許第７，３０３，７４９号に記載されている。

本発明の細胞結合剤−薬物コンジュゲート（例えば、イムノコンジュゲート）は、インビトロ、インビボおよび／またはエクスビボで投与されて、患者を処置し、および／または選択された細胞集団の成長を調節することができ、これには、例えば以下が含まれる：肺、血液、血漿、乳腺、大腸、前立腺、腎臓、膵臓、脳、骨、卵巣、精巣、およびリンパ器官の癌；自己免疫疾患、例えば全身性狼瘡、関節リウマチ、および多発性硬化症；移植片拒絶、例えば腎移植拒絶、肝移植拒絶、肺移植拒絶、心臓移植拒絶、および骨髄移植拒絶；移植片対宿主疾患；ウイルス感染症、例えばＣＭＶ感染症、ＨＩＶ感染症、およびＡＩＤＳ；ならびに寄生虫感染症、例えばジアルジア症、アメーバ症、住血吸虫症など。好ましくは、本発明のイムノコンジュゲートおよび化学治療剤は、インビトロ、インビボおよび／またはエクスビボで投与されて、患者の癌を処置し、および／または癌細胞の成長を調節することができ、これには例えば血液、血漿、肺、乳腺、大腸、前立腺、腎臓、膵臓、脳、骨、卵巣、精巣、およびリンパ器官の癌；より好ましくは肺、大腸前立腺、血漿、血液または大腸の癌が含まれる。最も好ましい態様において、癌は多発性骨髄腫である。

「選択された細胞集団の成長を調節する」こととして、選択された細胞集団（例えば多発性骨髄腫の細胞集団、例えばＭＯＬＰ−８細胞、ＯＰＭ２細胞、Ｈ９２９細胞など）の分裂による増殖によりさらなる細胞を生ずることを阻害すること；例えば非処置細胞と比較して、細胞分裂が増加する速度を低下させること；選択された細胞集団を死滅させること；および／または選択された細胞集団（例えば癌細胞）が転移するのを防止することが含まれる。選択された細胞集団の成長は、インビトロ、インビボまたはエクスビボで調節され得る。

本発明の方法において、細胞結合剤−薬物コンジュゲート（例えばイムノコンジュゲート）が、インビトロ、インビボまたはエクスビボで投与され得る。細胞結合剤−薬物コンジュゲート（例えばイムノコンジュゲート）は、好適な、薬学的に許容される担体、希釈剤および／または賦形剤と共に用いられ得るが、これらは周知であり、臨床状況に応じて当業者によって決定され得る。適切な担体、希釈剤および／または賦形剤の例として：（１）約１ｍｇ／ｍｌ〜２５ｍｇ／ｍｌのヒト血清アルブミンを含有する、ダルベッコのリン酸緩衝化生理食塩水、ｐＨ約６．５、（２）０．９％生理食塩水（０．９％ ｗ／ｖ ＮａＣｌ）、および（３）５％（ｗ／ｖ）デキストロースが挙げられる。

本明細書に記載されている化合物および組成物は、適切な形態で、好ましくは非経口的に、より好ましくは静脈内に投与されてよい。非経口投与のために、化合物または組成物は、水性または非水性の無菌の液剤、懸濁液または乳剤であり得る。プロピレングリコール、植物油、および注射可能な有機エステル、例えば、オレイン酸エチルが、溶剤またはビヒクルとして用いられ得る。組成物は、助剤、乳化剤または分散剤を含有することもできる。

該組成物は、無菌水またはいずれかの他の注射可能な無菌媒体に溶解または分散され得る無菌固体組成物の形態であってもよい。

本明細書に記載されている細胞結合剤−薬物コンジュゲート（例えばイムノコンジュゲート）の「治療有効量」は、選択された細胞集団の成長を調節しおよび／または患者の疾患を処置するための投薬計画を称し、患者の年齢、体重、性別、食事および医学的状態、疾患の重症度、投与経路、ならびに薬理学的考慮事項、例えば、用いられる特定の化合物の活性、効能、薬物動態および毒性プロファイルを含めた種々の因子に従って選択される。「治療有効量」は、標準的な医療テキスト、例えばＰｈｙｓｉｃｉａｎｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ２００４を参照して決定することもできる。患者は、好ましくは動物、より好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトである。患者は雄または雌であってよく、乳児、小児または成人であってよい。

細胞結合剤−薬物コンジュゲート（例えばイムノコンジュゲート）投与の好適なプロトコルの例は、以下の通りである。コンジュゲートは、毎日の静脈内ボーラスとして約５日間、または約５日間の連続注入として、１日１回、約５日間与えられ得る。

代替的には、コンジュゲートは、週１回、６週間以上投与され得る。別の代替法として、コンジュゲートは、２または３週毎に１回投与され得る。ボーラス用量は、約５０〜約４００ｍｌの生理食塩水中で投与され、これに約５〜約１０ｍｌのヒト血清アルブミンが添加され得る。２４時間あたり約２５０〜約５００ｍｌの生理食塩水中で連続注入され、これに約２５〜約５０ｍｌのヒト血清アルブミンが添加され得る。投与量は、静脈内に一人あたり約１０ｐｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇ（約１００ｎｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲）であろう。

処置の約１〜約４週間後、患者は第２クールの処置を受けることができる。投与経路、賦形剤、希釈剤、投与量および時間に関する具体的な臨床プロトコルは、臨床状況に応じて当業者によって決定され得る。

組成物およびコンジュゲート（例えばイムノコンジュゲート）は、例えば異常な細胞増殖を特徴とする障害（例えば癌）の処置またはその重症度の軽減に有用な医薬の製造にも用いられ得る。

本発明は、１種以上のイムノコンジュゲートおよび１種以上の化学治療剤を含む本発明の医薬化合物および／または組成物の１種以上の成分を充填した１個以上の容器を含む医薬キットも提供する。かかるキットは、例えば他の化合物および／または組成物、それらの化合物および／または組成物を投与するため装置（複数可）、ならびに医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関により指定された形態の指示書を含むこともできる。

癌治療ならびにそれらの投与量、投与経路および推奨される用途は当該分野で公知であり、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）などの文献に記載されている。ＰＤＲには、種々の癌の処置に用いられている薬剤の投与量が開示されている。治療的に有効であるこれらの前記化学治療薬物の投与計画および投与量は、処置されている特定の癌、疾患の程度、および当該分野の医師によく知られている他の因子に依存し、医師によって決定され得る。例えば、２００６年版のＰｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅには、タキソテール（２９４７頁を参照）がチューブリン脱重合の阻害剤であること、ドキソルビシン（７８６頁を参照）、ドキシル（３３０２頁を参照）およびオキサリプラチン（２９０８頁を参照）がＤＮＡ相互作用剤であること、イリノテカン（２６０２頁を参照）がトポイソメラーゼＩ阻害剤であること、エルビタックス（９３７頁を参照）およびタルセバ（２４７０頁を参照）が上皮成長因子受容体と相互作用することが開示されている。ＰＤＲの内容は、全体が本明細書に明確に組み込まれる。当業者であれば、以下のパラメータのうち１個以上を用いてＰＤＲを検討して、本発明の教示に従って用いられ得る化学治療剤およびコンジュゲートの投与計画および投与量を決定することができる。これらのパラメータとして以下が挙げられる：
１．包括的インデックス
ａ）製造業者による
ｂ）製品（企業名または薬物の商標名による）
ｃ）カテゴリーインデックス（例えば「抗ヒスタミン」、「ＤＮＡアルキル化剤」、タキサンなど）
ｄ）一般／化学インデックス（商標でない一般の薬物名）
２．医薬の外観
３．ＦＤＡ標識と一致した製品情報
ａ）化学的情報
ｂ）機能／作用
ｃ）適応症および配合禁忌
ｄ）試験研究、副作用、警告。

上記の参考文献、特許出願、および特許のそれぞれの全内容は、限定されないが、明細書、特許請求の範囲および要約ならびにあらゆる図、表または図式を含めて全体が参照により本明細書に明確に組み込まれる。

Ｅ．反応性基を持つチオエーテル部位を有するメイタンシノイドの合成
反応性基を持つ非開裂性チオエーテル部位を有する新規のメイタンシノイドは、式（５）、Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’の化合物である。細胞結合剤との反応のための化学基Ｚ’として、限定されないが、Ｎ−スクシンイミジルエステル、Ｎ−スルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロスルホフェニル、およびニトロフェニルエステルが挙げられる。これらの化合物の調製方法は、本明細書に記載されている。スルフヒドリル保持メイタンシノイドは、反応性基を持つヘテロ二官能性架橋剤に、非開裂性チオエーテル結合を介して共有結合的に連結されており、細胞結合剤とのコンジュゲーションの前に単離される。

非開裂性リンカーは、安定な共有結合により細胞毒性薬物を細胞結合剤に連結することが可能であるあらゆる化学部位である。非開裂性リンカーは、酸誘発開裂、光誘発開裂、ペプチダーゼ誘発開裂、エステラーゼ誘発開裂、およびジスルフィド結合開裂に実質的に耐性である。非開裂性リンカーの例として、メイタンシノイドとの反応のためのＮ−スクシンイミジルエステル部位またはＮ−スルホスクシンイミジルエステル部位およびマレイミド系もしくはハロアセチル系部位を有するリンカーが挙げられる。マレイミド系部位を含む架橋試薬として、Ｎ−スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサンカルボキシレート（ＳＭＣＣ）、ＳＭＣＣの「長鎖」アナログ（ＬＣ−ＳＭＣＣ）であるＮ−スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）−シクロヘキサン−１−カルボキシ−（６−アミドカプロエート）；κ−マレイミドウンデカン酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＫＭＵＡ）、γ−マレイミド酪酸Ｎ−スクシンイミジルエステル（ＧＭＢＳ）、ε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＥＭＣＳ）、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭＢＳ）、Ｎ−（α−マレイミドアセトキシ）−スクシンイミドエステル（ＡＭＡＳ）、スクシンイミジル−６−（β−マレイミドプロピオンアミド）ヘキサノエート（ＳＭＰＨ）、Ｎ−スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレート（ＳＭＰＢ）、およびＮ−（ｐ−マレイミドフェニル）イソシアネート（ＰＭＰＩ）が挙げられる。ハロアセチル系部位を含む架橋試薬として、Ｎ−スクシンイミジル−４−（ヨードアセチル）−アミノベンゾエート（ＳＩＡＢ）、Ｎ−スクシンイミジルヨードアセテート（ＳＩＡ）、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ）、およびＮ−スクシンイミジル３−（ブロモアセトアミド）プロピオネート（ＳＢＡＰ）が挙げられる。

本発明において用いられて、細胞結合剤に共有結合的に連結され得る、チオエーテル部位を持つ反応性メイタンシノイド誘導体を生成することができるメイタンシノイドは、当該分野において周知であり、公知の方法に従って天然源から単離され得る、あるいは公知の方法に従って合成され得る。

反応性基を持つチオエーテル部位を有するメイタンシノイドの合成は、図１〜４を参照して記載され得るが、ここで、反応性基を持つチオエーテル保持メイタンシノイドが調製される。

本発明の代表的な化合物を、チオール含有メイタンシノイドから調製した：構造式（１）によって表される、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシンと呼ばれるＤＭ１：および構造式（２）によって表されるＮ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）メイタンシンと呼ばれるＤＭ４を以下に示す。

反応性基を持つチオエーテル部位を有する新規のメイタンシノイドは、以下の新たに記載されている方法によって調製される。

式（５）：Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’（５）の、反応性基を持つチオール部位を有する新規のメイタンシノイドの合成が記載され、以下の工程から構成される：
ａ．）式Ｙ”−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’のヘテロ二官能性リンカーを、チオール保持メイタンシノイドＤ’と共有結合的に連結させる工程；ここで、Ｙ”は、マレイミドまたはハロアセトアミドなどのチオール反応性基であり；Ｖは、好ましくは１〜１０個の炭素原子を有する、より好ましくは、１〜５個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり；Ｗは、好ましくは１〜１０個の炭素原子を有する、より好ましくは、１〜５個の原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、Ｑは、適宜、芳香族または複素環式部位を表し；Ｚ’は、アミン反応性基、例えば、限定されないがＮ−スクシンイミジルエステル、Ｎ−スルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロスルホフェニル、またはニトロフェニルエステルである。反応は、順序（６）から構成される：
Ｄ’＋Ｙ”−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’→Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’ （６）
ｂ．）チオール保持メイタンシノイド、Ｄ’、例えば、ＤＭ１およびＤＭ４に対して化学量論または過剰当量のヘテロ二官能性架橋剤Ｙ”−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’が用いられてよい。反応は、完了まで進行し、分析方法、例えば、ＨＰＬＣおよびＴＬＣによってモニタリングされ得る。反応は、ヘテロ二官能性リンカー、Ｙ”−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’に対して過剰のチオール保持メイタンシノイドＤ’によって実施されてもよい。
ｃ．）反応は、チオール保持メイタンシノイドＤ’およびヘテロ二官能性リンカーＹ”−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’が完全に可溶性であるように、好適な有機溶媒または水性緩衝液と有機溶媒との混合物において実施されてよい。好適な有機溶媒の例として、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，２−ジメトキシエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、メタノールおよびエタノールが挙げられる。有機溶媒と水性緩衝液との混合物中で反応を実施するとき、ｐＨは、アミン反応性基Ｚの加水分解の可能性を最小にしながらスルフヒドリル保持メイタンシノイドとマレイミドまたはハロアセトアミドＹ”との反応を促進するように制御されなければならない。この反応に好適なｐＨ範囲は、ｐＨ３〜１０であり、好ましくはｐＨ５〜９であり、最も好ましくはｐＨ６〜８である。
ｄ．）チオール保持メイタンシノイドＤ’とチオール反応性基Ｙ”との間のチオエーテル形成は、好適な有機塩基および純有機溶媒、例えば上記のものを用いて調製されてもよい。有機塩基、例えば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、トリエチルアミンおよび４−メチルモルホリンが用いられて、式（５）Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’の、反応性基を持つ所望のチオエーテル含有メイタンシノイドを形成してよい。
ｅ．）反応の完了後に、式（５）Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’の化合物が単離されてもよい。アミン反応性基Ｚ’を持つチオエーテル部位を有するメイタンシノイド（例えば、Ｎ−スクシンイミジルエステル）の精製に好適な技術として、シリカゲルクロマトグラフィ、順相または逆相分取高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、分取薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）および結晶化が挙げられる。
ｆ．）式（５）Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’の単離された生成物の純度および同定は、ＨＰＬＣ、質量分析（ＭＳ）、ＬＣ／ＭＳ、^１Ｈ ＮＭＲおよび^１３Ｃ ＮＭＲなどの分析方法によって確立され得る。

Ｆ．チオエーテル部位を有するメイタンシノイド誘導体の生成
反応性基を持つ非開裂性のチオエーテル部位を含有するメイタンシノイドの調製に有用である、チオエーテル部位を含有する新規のメイタンシノイド誘導体が本明細書に記載されている。ＤＭ１（１）およびＤＭ４（２）からのこれらの誘導体の調製が開示されており、式（１０）：
Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−ＣＯＯＨ（１０）
式中、
Ｖは、好ましくは１〜１０個の炭素原子を有する、より好ましくは、１〜５個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、
Ｗは、１〜１０個の炭素原子を有する、より好ましくは、１〜５個の炭素原子を有する、適宜、線状、分枝状または環式のアルキル、アルケニルまたはアルキニル基であり、
Ｄ’は、スルフヒドリル保持メイタンシノイドであるＤＭ１またはＤＭ４を表し；
Ｙ’は、チオエーテル結合を表し；
Ｑは、適宜、芳香族または複素環式部位を表す；
によって表される。

式（１０）の、カルボン酸を持つチオエーテル部位を有する新規のメイタンシノイド誘導体の合成が記載されており、以下の工程から構成される：
ａ．）式Ｙ”−Ｖ−Ｑ−Ｗ−ＣＯＯＨのカルボン酸リンカーをチオール保持メイタンシノイドＤ’に共有結合的に連結させる工程；ここで、Ｙ”は、マレイミドまたはハロアセトアミドなどのチオール反応性基であり；Ｑは、適宜、芳香族または複素環式部位を表す。反応順序は、式（１１）：
Ｄ’＋Ｙ”−Ｖ−Ｑ−Ｗ−ＣＯＯＨ→Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−ＣＯＯＨ （１１）
式中：
ＶおよびＷは、先に定義されている通りであり；
Ｄ’は、先に定義されている通りであり；
Ｙ”は、先に定義されている通りであり；
Ｙ’は、スルフヒドリル保持メイタンシノイドとカルボン酸ＣＯＯＨとの間のチオエーテル結合であり；
Ｑは、適宜、芳香族または複素環式部位を表す；
によって表される。
ｂ．）チオール保持メイタンシノイド、Ｄ’、例えば、ＤＭ１およびＤＭ４に対して化学量論または過剰当量の式Ｙ”−Ｖ−Ｑ−Ｗ−ＣＯＯＨのカルボン酸リンカーが用いられてよい。反応は、完了まで進行し、分析方法、例えば、ＨＰＬＣおよびＴＬＣによってモニタリングされ得る。反応は、式Ｙ”−Ｖ−Ｑ−Ｗ−ＣＯＯＨのカルボン酸リンカーに対して過剰のチオール保持メイタンシノイドＤ’によって実施されてもよい。
ｃ．）反応は、チオール保持メイタンシノイドＤ’および式Ｙ”−Ｖ−Ｑ−Ｗ−ＣＯＯＨのカルボン酸リンカーが完全に可溶性であるように、好適な有機溶媒または水性緩衝液と有機溶媒との混合物において実施されてよい。好適な有機溶媒の例として、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、１，２−ジメトキシエタン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、メタノールまたはエタノールが挙げられる。有機溶媒と水性緩衝液との混合物中で反応を実施するとき、ｐＨは、スルフヒドリルとマレイミドまたはハロアセトアミドＹ”との反応を促進するように制御されなければならない。この反応に好適なｐＨ範囲は、ｐＨ３〜１０、好ましくはｐＨ５〜９であり、最も好ましくはｐＨ６〜８である。
ｄ．）チオール保持メイタンシノイドＤ’とチオール反応性基Ｙ”との間のチオエーテル形成は、好適な有機塩基および純有機溶媒、例えば上記のものを用いるときにも起こる。有機塩基、例えば、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ）、トリエチルアミンおよび４−メチルモルホリンが用いられて、カルボン酸を持つ所望のチオエーテル含有メイタンシノイドを形成してよい。
ｅ．）反応の完了後に、式（１０）Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−ＣＯＯＨの化合物が単離されてもよい。カルボン酸を持つチオエーテル部位を有するメイタンシノイドの精製に好適な技術として、シリカゲルクロマトグラフィ、順相または逆相分取高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、分取薄層クロマトグラフィ（ＴＬＣ）または結晶化が挙げられる。
ｆ．）式（１０）Ｄ’−Ｙ’Ｖ−Ｑ−Ｗ−ＣＯＯＨの単離された生成物の純度および同定は、ＨＰＬＣ、質量分析（ＭＳ）、ＬＣ／ＭＳ、^１Ｈ ＮＭＲおよび^１３Ｃ ＮＭＲなどの分析方法によって確立され得る。

式（１１）Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−ＣＯＯＨの、末端カルボン酸を持つチオエーテル部位を含有する新規のメイタンシノイド誘導体は、式（５）Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’の化合物の調製において有用である。式（１１）Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−ＣＯＯＨのメイタンシノイド誘導体は、アミン反応性基Ｚを与えるようにさらに誘導体化されてよい。好ましいアミン反応性基Ｚ’は、活性エステル、例えば、限定されないが、Ｎ−スクシンイミジルエステル、Ｎ−スルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、テトラフルオロスルホフェニル、またはニトロフェニルエステルである。式（１１）の化合物からの式（５）の化合物の調製方法は、反応順序：
Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−ＣＯＯＨ＋Ｘ→Ｄ−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’
式中、Ｘは、活性化されたエステルＺ’を与えるＮ−ヒドロキシスクシンイミドである、すなわち、アミン反応性である；
に従う。

式（５）Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’のメイタンシノイドは、本明細書に記載されている公知の方法によって、式（１１）Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−ＣＯＯＨの新規のメイタンシノイド誘導体から調製されてよい。
ａ．）式（１１）Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−ＣＯＯＨのメイタンシノイドは、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチル−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ．ＨＣｌ）の存在下に、乾燥有機溶媒（例えば、塩化メチレン、ジメチルホルムアミド、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジエチルエーテル）中、僅かに過剰のＮ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｘ）と反応させてよい。ＥＤＣ．ＨＣｌ以外の縮合剤が反応に使用され得る。
ｂ．）反応の完了は、標準の化学技術、例えば、ＴＬＣまたはＨＰＬＣを用いてモニタリングさせてよい。
ｃ．）反応の完了後に、反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルを持つメイタンシノイド誘導体が、シリカゲルクロマトグラフィによって、またはＨＰＬＣによって、または結晶化によって精製されてよい。
ｄ．）式（５）Ｄ’−Ｙ’−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｚ’の単離された生成物の純度および同定は、ＨＰＬＣ、質量分析（ＭＳ）、ＬＣ／ＭＳ、^１Ｈ ＮＭＲおよび^１３Ｃ ＮＭＲなどの分析方法によって確立され得る。

Ｇ．反応性基を持つチオエーテル部位を有するメイタンシノイドとの抗体コンジュゲートの調製
式（８）ＣＢ−（Ｚ”−Ｗ−Ｑ−Ｖ−Ｙ’−Ｄ’）_ｍの、反応性基を持つチオエーテル部位を有する単離された反応性メイタンシノイド誘導体を用いた、細胞結合剤による非開裂性チオエーテル連結メイタンシノイドコンジュゲートの調製のためのプロセス（図３９および４０）が記載されており、以下の工程から構成される：
ａ．）細胞結合剤のリジン残基とチオエーテル結合を有するメイタンシノイドに連結したアミン反応性基との間で、共有結合によるアミド結合形成を介して、細胞結合剤ＣＢ（抗体）に、本発明の式（５）Ｄ’−Ｙ’−Ｗ−Ｑ−Ｖ−Ｚ’の、チオエーテル部位を持つ精製されたアミン反応性メイタンシノイドを共有結合的に連結させる工程。
ｂ．）コンジュゲーション反応は、抗体の性質に応じて０．５〜１０ｍｇ／ｍＬの抗体濃度で実施されてよい。
ｂ．）チオエーテル部位を持つアミン反応性非開裂性メイタンシノイドの原液は、抗体とのコンジュゲーションの前に純有機溶媒中で調製されてよい。原液の調製に好適な有機溶媒として、メタノール、エタノール、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）およびジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）が挙げられる。
ｃ．）メイタンシノイドの疎水性の性質に起因して、メイタンシノイドがコンジュゲーションの間に溶液中に残存することを確実にするには、水性緩衝液と有機溶媒との混合物中での抗体へのコンジュゲーションを行う必要があり得る。水性緩衝液中の好ましい有機溶媒量は、これらの条件下で試薬の溶解度および抗体の挙動に応じて０〜３０％（ｖ／ｖ）の範囲である。コンジュゲーションは、ｐＨ３〜１０で行われてよく、好ましくはｐＨ５〜９であり、最も好ましくはｐＨ６〜８である。コンジュゲーション反応に用いられる緩衝液は、このｐＨ範囲付近のｐＫａ値を有する緩衝液、例えば、リン酸緩衝液およびＨＥＰＥＳ緩衝液である。
ｃ．）抗体に対して５〜５０倍過剰の、チオエーテル部位を持つアミン反応性メイタンシノイドは、コンジュゲーション反応に用いられて、抗体１分子あたり所望の数の連結されたメイタンシノイド分子とのコンジュゲートを生じることができる。１抗体につき好ましくは２〜８個の連結されたメイタンシノイドが、最終コンジュゲートに望ましい。条件、例えば、抗体濃度、試薬の溶解度およびｐＨは、所要のメイタンシノイド試薬の過剰倍数ならびに最終コンジュゲートにおける抗体１モルあたりの連結されたメイタンシノイド分子の数に影響し得る。
ｄ．）クロスフロー濾過、透析、またはクロマトグラフィ（ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ）またはこれらの組み合わせによる、式（８）ＣＢ−（Ｚ”−Ｖ−Ｑ−Ｗ−Ｙ’−Ｄ’）_ｍの非開裂性コンジュゲートの精製。
実施例

いずれの特定の態様にも拘束されないが、細胞結合剤とのコンジュゲーションのための種々の反応性リンカーによるポリエチレングリコール（（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ）連結薬物の合成のための方法が記載される。これらのコンジュゲーション方法として、抗体と薬物、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）反応性基における反応によってポリエチレングリコール（（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ）リンカーを介して連結されたメイタンシノイドとの１工程コンジュゲーションが挙げられる。

また、抗体による、コンジュゲーションのための種々の反応性リンカーを有するジスルフィド基含有ポリエチレングリコール（（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ）連結薬物を合成する方法も記載される。これらのコンジュゲーション方法として、抗体と、薬物、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）反応性基における反応を介して、ポリエチレングリコール（（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｎ）リンカーを有するジスルフィド基と連結したメイタンシノイドとの１工程コンジュゲーションが挙げられる。

以下の実施例は、例示のみであって、本発明を限定することは意図されない。

実施例Ｉ
常套の脂肪族炭素スペーサーを含有するジスルフィドリンカーによる、抗体と、抗体分子あたり数個の連結されたメイタンシノイド分子とのコンジュゲーション：

抗体と数個のメイタンシノイドＤＭ４またはＤＭ１分子とをコンジュゲートする２工程プロセスにおいて、ヒト化抗体を、アミン反応性Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基（ＮＨＳ基）およびチオール反応性２−ピリジルジチオ基（−ＳＳＰｙ基）の両方を含有する市販のヘテロ二官能性リンカー（ＳＰＤＢ）によってまず修飾し、数個のリンカー分子を抗体分子に組み込んだ（Ｗ．Ｃ．Ｗｉｄｄｉｓｏｎら、Ｊ Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、２００６、４９、４３９２−４４０８に記載されている）。抗体分子への反応性リンカーの組み込みに続いて、第２反応工程において、反応性チオール基を有するメイタンシノイドＤＭ４またはＤＭ１をリンカー修飾抗体に添加して、ジスルフィド結合によってメイタンシノイドを抗体にコンジュゲートした。具体例では、５〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度のヒト化抗体を、１０〜１５倍モル過剰の、−（ＣＨ_２）−_ｎアルキル基を有する市販のヘテロ二官能性リンカー（例えば、ＳＰＤＢ、ＳＰＰ、ＳＰＤＰ）を用いて、水性緩衝液中ｐＨ６．５〜８で０．２５〜３時間、周囲温度で修飾し、次いで、ゲル濾過（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５クロマトグラフィを用いる）によって精製して、抗体１分子あたり平均８〜１２個のリンカー基によって修飾された抗体を高収率で得た（通常、８０〜９０％の収率）。連結された基の推定は、過剰の１，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）試薬を少量のアリコートのリンカー修飾抗体サンプルに添加する際に３４３ｎｍの吸光度（ε３４３ｎｍ＝８０８０Ｍ^−１ｃｍ^−１）に基づいて、２−チオピリドンの放出を測定することによって行なった。抗体に連結された反応性基を測定した後、２．５ｍｇ／ｍｌの濃度のリンカー修飾抗体を過剰のメイタンシノイドＤＭ４（反応性リンカーに対して１．７倍モル過剰のＤＭ４チオール）によってｐＨ６．５でコンジュゲートした。しかし、抗体−メイタンシノイドコンジュゲーション反応の間に沈澱が見られ、ゲル濾過による抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの精製の際には低い収率の抗体−メイタンシノイドコンジュゲート（約３８〜６０％の収率）を得た。抗体１分子あたりの連結メイタンシノイドの数を、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける吸光度の測定値から、メイタンシノイドおよび抗体について２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおける減衰係数を用いて求めた。抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの沈澱および約１〜１．５ｍｇ／ｍｌの低い収量に加えて、抗体１分子あたりの組み込まれたメイタンシノイドの数は、抗体１分子あたりの組み込まれた最初の反応性リンカー基のはるかに高い平均数（抗体１分子あたり約８〜１２個の反応性リンカー基）に基づいて予想したよりもはるかに少なかった（抗体１分子あたり平均で約５．２〜５．５個のメイタンシノイド分子）。これは、より多くのメイタンシノイド保持抗体コンジュゲートの沈澱を示唆している。別の例において、ヒト化抗体を、ＳＰＤＢヘテロ二官能性リンカーによってまず修飾し、抗体１分子あたり１１個のピリジルジチオ基を組み込んだが、１．７倍モル過剰のＤＭ４メイタンシノイドチオールによる第２反応の際、反応混合物中にかなりの沈澱が見られ、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの回収率は非常に低く、３０％未満であった。市販のヘテロ二官能性リンカー、例えば、脂肪族スペーサーを有するＳＰＤＢまたはＳＰＤＰを用いるとき、１ｍｇ／ｍｌ以上の抗体−メイタンシノイドコンジュゲート濃度を得るため、高いコンジュゲーションの収率で１抗体あたり４または５個を超えるメイタンシノイド分子を組み込むことは通常困難である。ここで観察されたＳＰＤＢ誘導リンカーまたはＳＰＤＰ誘導リンカーを有する抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの沈澱および低収率は、抗体の最初のＳＰＤＢリンカーまたはＳＰＤＰリンカー修飾の際（メイタンシノイドによるコンジュゲーションの前）には見られなかったが、これは、恐らく、抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの凝集および沈澱が疎水性分子の付着によって引き起こされたことを示唆している。

実施例ＩＩ
親水性ポリエチレンオキシドスペーサー（ＰＥＧ_ｎ、または（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_{ｎ＝１−１４}）を含有するジスルフィドリンカーによる、抗体と、抗体分子あたり数個の連結メイタンシノイド分子とのコンジュゲーション：
親水性スペーサー、例えばポリエチレンオキシド（ＰＥＧ_ｎ、または（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_{ｎ＝１−１４}）が、高い個数のメイタンシノイド分子（抗体分子当たり平均４分子を超える）を含む抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの凝集および沈殿を防止することができるかを調査するために、いくつかの新規のヘテロ二官能性および一官能性メイタンシノイド誘導体を調製し、これらを、直接修飾により、または抗体のリジン残基における最初の誘導体化およびその後のメイタンシノイドの反応による２工程反応により、抗体にコンジュゲートさせることができた（例えば、図３、６、１１および１２を参照）。

１５−（２−ピリジルジチオ）−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデカン酸の合成
アルドリチオール−２（１．１７ｇ，５．３１ｍｍｏｌ）の溶液を、１０ｍＬの丸底フラスコにおいて５．０ｍＬの１，２−ジメトキシエタン中で調製した。この反応フラスコに、１．０ｍＬの１，２−ジメトキシエタンに溶解した３−（２−チオテトラエチレングリコール）プロピオン酸（ＱｕａｎｔａＢｉｏｄｅｓｉｇｎ，４９０ｍｇ，１．７３ｍｍｏｌ）の溶液を添加した。撹拌しながら３．５時間、反応を進行させ、生成物をシリカクロマトグラフィにより、塩化メチレン中５％のメタノールで溶離して精製した。溶媒を真空中で除去して、４３２ｍｇ（６４％の収率）の所望の生成物を得た。

ＰｙＳＳ−ＰＥＧ_４−ＮＨＳ［１５−（２−ピリジルジチオ）−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデカン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル］の合成
１０ｍＬの丸底フラスコに、１５−（２−ピリジルジチオ）−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデカン酸（４３１ｍｇ，１．１０ｍｍｏｌ）、５．０ｍＬの塩化メチレンおよび撹拌棒を投入した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．６ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）および１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（６．８ｍｇ，０．０３６ｍｍｏｌ）を反応容器に添加し、室温で２時間、撹拌しながら反応を進行させた。生成物をシリカクロマトグラフィにより、塩化メチレン中７％の１，２−ジメトキシエタンで溶離して精製した。溶媒を真空中で除去して、２０６ｍｇ（３８％の収率）の所望の生成物を得た。ＭＳ：ｍ／ｚ：実測値：５１１．１（Ｍ＋Ｎａ）^＋，計算値：５１１．２。

１５−（ＤＭ４−ジチオ）−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデカン酸の合成
Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）メイタンシン（ＤＭ４，１８．６ｍｇ，０．０２３９ｍｍｏｌ）および１５−（２−ピリジルジチオ）−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデカン酸（１４．０ｍｇ，０．０３５８ｍｍｏｌ）の溶液を、０．７５ｍＬの１，２−ジメトキシエタン中で調製した。４−メチルモルホリン（６．０ｍｇ，０．０５９７ｍｍｏｌ）を反応容器に添加し、室温で２４時間、撹拌しながら反応を進行させた。反応が完了すると、粗反応混合物を真空中で乾燥させ、さらに精製せずに用いた（図６）。

１５−（ＤＭ４−ジチオ）−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデカン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＤＭ４−ＳＰＥＧ_４−ＮＨＳ）の合成
粗１５−（ＤＭ４−ジチオ）−４，７，１０，１３−テトラオキサペンタデカン酸を２．０ｍＬの塩化メチレンに溶解し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．６ｍｇ，０．３１ｍｍｏｌ）および１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（６．８ｍｇ，０．０３６ｍｍｏｌ）と合わせた。溶液を２．５時間撹拌し、生成物をシリカクロマトグラフィにより、塩化メチレン中４％のメタノールで溶離して精製した。溶媒を真空下で除去して、１５．０ｍｇ（５４％の収率）の所望の生成物を得た。ＭＳ：ｍ／ｚ：実測値：１１７９．３（Ｍ＋Ｎａ）^＋，計算値：１１７９．４（図６）。

抗体分子あたり高い個数のメイタンシノイド分子を連結するための、親水性ポリエチレンオキシドスペーサー（ＰＥＧ_ｎ、または（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_{ｎ＝１−１４}）を含むジスルフィドリンカーを用いる２工程の抗体コンジュゲーション：
親水性スペーサー、例えばポリエチレンオキシド（ＰＥＧ_ｎ、または（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_{ｎ＝１−１４}）を含む新規のヘテロ二官能性試薬を用いて抗体を修飾し、続いてＤＭ４チオールとコンジュゲートさせたときに、新規の観察が得られた。親水性ＰＥＧ_ｎスペーサーを有する抗体−メイタンシノイドコンジュゲートのコンジュゲーション混合物は、何ら沈殿を示さず、非常に高いモノマー画分（＞９０％）で高いコンジュゲート収率（＞７０％）を一貫して与えた。一例として、８ｍｇ／ｍｌの濃度のヒト化抗体を、抗体濃度に対して数倍モル過剰のＰｙＳＳ−ＰＥＧ_４−ＮＨＳ試薬で、ｐＨ８の緩衝液中において３０℃で１時間修飾し、次いでゲル濾過により精製した。抗体分子あたりの連結されたジチオピリジル基は、過剰のジチオトレイトールを用いてアリコートの２−チオピリドン放出アッセイにより約４〜１６個であると推定され、これに基づいて、１．４倍モル過剰のＤＭ４メイタンシノイドチオールをジチオピリジル−ＰＥＧ_ｎ−リンカー修飾した抗体の各溶液に添加し、ｐＨ６．５、２５℃で一晩のコンジュゲーション工程を実施し、次いでコンジュゲートをゲル濾過により精製した（図１２）。種々の初期リンカー組み込みを有する種々のコンジュゲーション混合物について抗体あたり組み込まれたメイタンシノイドの最終値は、抗体分子あたりメイタンシノイドが平均３〜９個であり、沈殿は観察されず、７０％超の収率および非常に高いモノマーであった（２０％イソプロパノールまたは０．４Ｍ過塩素酸ナトリウムを用いるサイズ排除ＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３０００ ＨＰＬＣに基づき、モノマーが９０％超）。最終コンジュゲート中のコンジュゲートされていない薬物は０．６％未満であることがＨｉＳｅｐ Ｍｉｘｅｄ−Ｍｏｄｅクロマトグラフィ（ＨｉＳｅｐカラム、Ｓｕｐｅｌｃｏ）により測定され、メイタンシノイドが抗体に共有結合的に連結したことを示した。別の例において、８ｍｇ／ｍｌの濃度のヒト化抗体を、抗体濃度に対して数倍モル過剰のＰｙＳＳ−ＰＥＧ_４−ＮＨＳ試薬で、ｐＨ６．５の緩衝液中において２５℃で１．５時間修飾し、次いでゲル濾過により精製した。抗体試料上のジチオピリジル−ＰＥＧ_ｎ保持リンカー基は抗体分子あたり６〜１８個と推定され、次いでこれを１．３〜１．７倍モル過剰のＤＭ４メイタンシノイドチオールとｐＨ６．５、２５℃で一晩反応させ、次いでゲル濾過により精製した。沈殿は観察されず、約１〜２ｍｇ／ｍｌで抗体−メイタンシノイドコンジュゲート最終試料は高いモノマー画分（＞９０％）を示したが、これは、凝集がなく、抗体あたり約３．１〜７．１個の高い個数のメイタンシノイド分子が共有結合的に付着しており、コンジュゲートされていないメイタンシノイドが非常に少なかったことを示している（ＨｉＳｅｐクロマトグラフィにより推定された、コンジュゲートされていないメイタンシノイドは１．７％未満）。抗体あたりの薬物負荷が高いこのコンジュゲートは、４℃での貯蔵に際し、分析した最長期間（１．５カ月間）まででも安定であった。

抗体分子あたり高い個数のメイタンシノイド分子を連結するための、親水性ポリエチレンオキシドスペーサー（ＰＥＧ_ｎ、または（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_{ｎ＝１−１４}）を含むジスルフィドリンカーを用いる１工程の抗体コンジュゲーション：
１工程コンジュゲーションのアプローチにおいて、親水性ポリエチレンオキシドスペーサー（ＰＥＧ_ｎ、または（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_{ｎ＝１−１４}）を含むジスルフィドリンカーを用いた抗体−メイタンシノイドコンジュゲートと、４ｍｇ／ｍｌの濃度のヒト化抗体と１０〜２０倍モル過剰のＤＭ４−ＳＰＥＧ_４−ＮＨＳ試薬とをｐＨ８の緩衝液中３０℃で２時間コンジュゲートさせた後にゲル濾過により精製することによって生成させ、抗体分子あたり６．６個のコンジュゲートされたメイタンシノイド（８２％のモノマー）を含む１．４ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを得た（図１１）。したがって、２工程および１工程のアプローチの両方により、親水性ポリエチレンオキシドスペーサー（ＰＥＧ_ｎ、または（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_{ｎ＝１−１４}）を含むジスルフィドリンカーを用いて、抗体分子あたり多数の連結されたメイタンシノイドが得られた。

実施例ＩＩＩ
親水性ポリエチレンオキシドスペーサー（ＰＥＧ_ｎ、または（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ）を含有するチオエーテルリンカーによる、抗体と、抗体分子あたり数個の連結されたメイタンシノイド分子とのコンジュゲーション：
抗体のリジン残基を直接修飾するために、従来の脂肪族リンカー、例えばＳＰＰから誘導されたアルキルリンカーを有するメイタンシノイドのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（Ｗ．Ｃ．Ｗｉｄｄｉｓｏｎら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００６，４９，４３９２−４４０８に記載されている）をまず用いて、抗体を１工程方法でコンジュゲートさせた。ヒト化抗体と、試験試薬としての８倍モル過剰の５ｍｇ／ｍｌのＤＭ１−ＳＰＰ−ＮＨＳ試薬とを、ｐＨ８の緩衝液中３０℃で２時間コンジュゲートさせる試み（続いてゲル濾過および透析を実施）は、かなりの沈殿および凝集を生じ、したがって最終コンジュゲートはわずか６１％のモノマーであり、抗体あたり連結したメイタンシノイドは約３．３個であった。対照的に、ＤＭ１−Ｍａｌ−ＰＥＧ_４−ＮＨＳ試薬を同様の条件下で用いると、１．１ｍｇ／ｍｌで抗体あたり５．４個のメイタンシノイド分子が連結したコンジュゲートが得られ、最終コンジュゲート中に沈殿はなかった（図７または９）。同様に、ＤＭ１−Ｍａｌ−ＰＥＧ_２−ＮＨＳ試薬を用いて、抗体分子あたり多数の連結されたメイタンシノイドがチオエーテル結合を介してコンジュゲートされたものを得た。別の例において、ネズミＩｇＧ_１抗体を４ｍｇ／ｍｌで１０および２０倍モル過剰のＤＭ１−Ｍａｌ−ＰＥＧ_４−ＮＨＳ試薬と、ｐＨ８の緩衝液中３０℃で２時間コンジュゲートさせ、続いてゲル濾過して、約１ｍｇ／ｍｌの濃度の抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを得て、抗体分子あたり４．１および７．８個のメイタンシノイド分子が共有結合的にコンジュゲートし（９８％のモノマー）、コンジュゲートされていない薬物は検出不可能なレベルであった（ＨｉＳｅｐ ＨＰＬＣアッセイ）。別の例において、ヒト化抗体を過剰のＤＭ１−Ｍａｌ−ＰＥＧ_４−ＮＨＳ試薬とコンジュゲートさせて、抗体あたり平均１０．７個の連結メイタンシノイド分子を得た（９９％モノマー；１．１ｍｇ／ｍｌの濃度）。図８および図１０に概説した２工程コンジュゲーション手順を用いて、抗体からＰＥＧ_４連結チオエーテルコンジュゲートも調製した。したがって、親水性リンカー、例えばＰＥＧ_ｎまたは（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎの使用により、抗体あたり多数のメイタンシノイド分子を導入することができる（例えば図１、２、４、５、７、８、９、１０、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０および２１を参照）。

ＤＭ１−Ｍａｌ−ＰＥＧ_２−ＮＨＳの合成
Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１，１３．４ｍｇ，０．０１８２ｍｍｏｌ）の溶液を０．７０ｍＬのＴＨＦ中で調製し、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−ジエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ_２−マレイミド，Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，１１．６ｍｇ，０．０２７３ｍｍｏｌ）を、水性リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ６）およびＴＨＦの１．５ｍＬの２：１（ｖ／ｖ）混合物中に添加した。室温で撹拌しながら１時間、反応を進行させ、ＴＬＣ分析は反応が完了したことを示した。粗反応混合物をシリカクロマトグラフィにより、塩化メチレン中８％のエタノールで溶離して精製した。溶媒を真空下で除去して、６．０ｍｇ（２８％の収率）の所望の生成物を得た。ＭＳ：ｍ／ｚ実測値：１１８５．３（Ｍ＋Ｎａ）^＋，計算値：１１８４．４（図４）。

ＤＭ１−Ｍａｌ−ＰＥＧ_４−ＮＨＳの合成
Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１，２８．１ｍｇ，０．０３８１ｍｍｏｌ）の溶液を０．５０ｍＬのＴＨＦ中で調製し、スクシンイミジル−［（Ｎ−マレイミドプロピオンアミド）−テトラエチレングリコール］エステル（ＮＨＳ−ＰＥＧ_４−マレイミド，Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ，３９．１ｍｇ，０．０７６２ｍｍｏｌ）を、水性リン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ，ｐＨ６）およびＴＨＦの１．５ｍＬの２：１（ｖ／ｖ）混合物中に添加した。室温で撹拌しながら１時間、反応を進行させ、ＴＬＣ分析は反応が完了したことを示した。粗反応混合物をシリカクロマトグラフィにより、塩化メチレン中６％のエタノールで溶離して精製した。溶媒を真空下で除去して、９．６ｍｇ（２０％の収率）の所望の生成物を得た。ＭＳ：ｍ／ｚ：実測値：１２７３．５（Ｍ＋Ｎａ）^＋，計算値：１２７３．５（図４）。

実施例ＩＶ
高メイタンシノイド保持抗体種の質量分析：
親水性ＰＥＧリンカーを有する高メイタンシノイド保持抗体種を分析するために、抗体あたり平均１０．７個のＤＭ１を含む非常に高いメイタンシノイド保持Ａｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートを選択した。該コンジュゲートを脱グリコシル化し、次いでＥＳＩ−ＴＯＦ ＭＳにより分析した（図２２）。質量スペクトルは、抗体あたり薬物４〜１５個の範囲の種々の数の連結されたメイタンシノイドで標識された種々の抗体種を示し、抗体あたり薬物８〜９個付近に最大値を有する。この分布は正規であり、高い薬物保持種について選択的な消失が見られなかったことを示唆し、これは最終コンジュゲートの高い溶解度と一致する。抗体あたり平均１０．７個のＤＭ１を含む高メイタンシノイド保持Ａｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートのサイズ排除クロマトグラフィＨＰＬＣは、驚くべきことに９９％超の高モノマー量を示した（図２３）。

実施例Ｖ
高メイタンシノイド保持抗体種のＦＡＣＳ結合は非修飾抗体の該結合に類似する：
ＥｐＣＡＭ、ＣａｎＡｇおよびＣＤ５６などの種々の標的に対する、いくつかの抗体の高メイタンシノイド保持コンジュゲートの結合を、フローサイトメトリーにより非修飾抗体と比較した。要約すると、抗原陽性細胞をコンジュゲートまたは非修飾抗体と共に４℃でインキュベートし、次いで二次抗体ＦＩＴＣコンジュゲートと共に４℃でインキュベートし、ホルムアルデヒド（ＰＢＳ中１％）で固定し、フローサイトメトリーにより分析した。評価したすべてのコンジュゲートについて、コンジュゲートの結合と非修飾抗体の結合との間に有意差は観察されなかった。一例を図２４に示すが、ここで、１０．７個のメイタンシノイド保持Ａｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートが非修飾抗体のものに類似する高い親和性によって抗原陽性細胞に結合した。

実施例ＶＩ
ポリエチレンオキシドスペーサー（ＰＥＧ_ｎ、または（−ＣＨ_２−ＣＨ_２−Ｏ）_ｎ）を含有するチオエーテルおよびジスルフィドリンカーを含む、抗体のメイタンシノイドコンジュゲートのインビトロ細胞毒性評価
ＰＥＧ_ｎスペーサーを含有するチオエーテルおよびジスルフィドリンカーを含む抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性効果を、ＷＳＴ−８細胞生存率アッセイを用いて、癌細胞とコンジュゲートとの４〜５日連続のインキュベーションの後に通常評価した。抗原発現癌細胞（約１０００〜５０００細胞／ウェル）を、９６ウェルプレートにおいて、ウシ胎仔血清を種々の濃度の抗体−メイタンシノイドコンジュゲートと共に含有する通常の成長培地において約５日間インキュベートした。次いでＷＳＴ−８試薬を添加し、約２〜５時間後に４５０ｎｍにおけるプレートの吸光度を測定した。生存画分をコンジュゲート濃度に対してプロットして、コンジュゲートのＩＣ_５０値（５０％の細胞が死滅する濃度）を求めた。

図２５は、抗ＥｐＣＡＭ Ａｂ−メイタンシノイドコンジュゲートの有効性が、ＰＥＧ_４連結チオエーテルコンジュゲート（Ａｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１）の薬物負荷の増加に伴い向上したことを示しているが、これは、抗体あたり約４個のメイタンシノイドの同様の薬物負荷におけるチオエーテル連結ＳＭＣＣ−ＤＭ１およびジスルフィド連結ＳＰＤＢ−ＤＭ４コンジュゲートよりも、ＥｐＣＡＭ抗原陽性ＣＯＬＯ２０５−多剤耐性細胞（ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞）に対する有効性が大きいことも示す。メイタンシノイド負荷が４．１および７．８のチオエーテル連結抗ＥｐＣＡＭ Ａｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートの有効性は新規であり、治療的適用にとって非常に有望な可能性を有する。

図２６は、ＣａｎＡｇ抗原陽性ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞に対する抗ＣａｎＡｇ Ａｂ−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。この場合も、チオエーテル連結Ａｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１およびＡｂ−ＰＥＧ_２−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートは、同様のメイタンシノイド負荷を有するチオエーテル連結Ａｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートと比較して、より高い有効性を示した。

図２７は、ＣＤ５６発現Ｍｏｌｐ−８多発性骨髄腫細胞に対する、ＰＥＧ含有チオエーテルおよびジスルフィドリンカーを有する抗ＣＤ５６抗体−メイタンシノイドコンジュゲートの細胞毒性を示す。抗体あたり７．７個の薬物を有するチオエーテル連結ＰＥＧ４コンジュゲート（Ａｂ−ＰＥＧ_４Ｍａｌ−ＤＭ１）は、３．８個の薬物を持つコンジュゲート（ＩＣ_５０＝１．９ｎＭ）と比較して、予想外にも細胞毒性能が１００倍増大したことを示した（ＩＣ_５０値０．０１９ｎＭ）。

図２８は、ＥｐＣＡＭ陽性多剤耐性ＨＣＴ１５細胞に対する、ＰＥＧ_４連結チオエーテルコンジュゲートを持つ抗ＥｐＣＡＭ Ａｂ−メイタンシノイドコンジュゲート（Ａｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１）の有効性が、抗体あたり約４個のメイタンシノイドの同様の薬物負荷の従来のチオエーテル連結ＳＭＣＣ−ＤＭ１より向上したことを示す。チオエーテル連結抗ＥｐＣＡＭ Ａｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートの高い有効性は新規の所見であり、治療的適用にとって非常に有望な可能性を有する。図２９は、ＥｐＣＡＭ陽性多剤耐性ＣＯＬＯ２０５細胞に対する、ＰＥＧ_４連結チオエーテルコンジュゲートを持つ抗ＥｐＣＡＭ Ａｂ−メイタンシノイドコンジュゲート（Ａｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１）の有効性が、抗体あたり約４個のメイタンシノイドの同様の薬物負荷の従来のチオエーテル連結ＳＭＣＣ−ＤＭ１より向上したことを示す。チオエーテル連結抗ＥｐＣＡＭ Ａｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートの向上した有効性は新規の所見であり、治療的適用にとって非常に有望な可能性を有する。図３７は、ＥＧＦＲ陽性ＵＯ−３１ヒト腎癌腫細胞に対する、親水性チオエーテル結合ＰＥＧ_４リンカーを有する抗ＥＧＦＲ Ａｂ−メイタンシノイドコンジュゲート（Ａｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１）の細胞毒性が、３．７個のメイタンシノイド／Ａｂを有する非親水性ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートと比較して著しく向上したことを示す。ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１の有効性は、常套のリンカーを有するＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのものより約１０倍高かった。

実施例ＶＩＩ
インビボ薬物動態：
親水性ＰＥＧ_４リンカーを含有し６．７Ｄ／Ａ（メイタンシノイド／抗体）を持つヒト化抗ＣＤ５６抗体（Ａｂ）−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートの血漿薬物動態を、常套の脂肪族炭素鎖リンカーを含有し４Ｄ／Ａを持つＡｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートのものと比較した（図３８Ａ）。ＣＤ１マウスに５ｍｇ／ｋｇのコンジュゲートを単回ボーラスにより静脈内注射した（抗体基準の用量；グループあたり３匹のマウス）。血漿サンプルを４週間までの数回の時点で収集した。血漿サンプルを抗体濃度およびコンジュゲート濃度についてＥＬＩＳＡを用いて分析した。抗体ＥＬＩＳＡについては、コーティングした固定化ヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を含有するマイクロタイタープレートに血漿サンプルを添加し、洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートしたヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃγ）抗体を用いて検出した。コンジュゲート濃度については、コーティングした固定化ヤギ−抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を含有するマイクロタイタープレートに血漿サンプルを添加し、洗浄し、ビオチニル化抗メイタンシン抗体およびアルカリホスファターゼコンジュゲートしたストレプトアビジンを用いて検出した。抗体濃度およびコンジュゲート濃度の両方のＥＬＩＳＡ結果は、親水性ＰＥＧ_４リンカーを有し６．７ＤＭ１／Ａｂの高い負荷を持つＡｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートが４週間の研究期間にわたって血漿中に良好に保持されることを証明した。

図３８Ａは、ＰＥＧ_４リンカーを用いた、高いメイタンシノイド負荷（６．７ＤＭ１／Ａｂ）を有する抗体−メイタンシノイドコンジュゲートのインビボ薬物動態を、４ＤＭ１／Ａｂを持つ標準的なリンカーコンジュゲートと比較して示す。高いメイタンシノイド負荷によってでも、６．７個のメイタンシノイド／Ａｂを有するＰＥＧ_４連結チオエーテルコンジュゲート（Ａｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１）は、標準的なコンジュゲートより長い半減期を有する。別の例において、^３Ｈ標識ＤＭ１を有するヒト化Ｃ２４２Ａｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−^３Ｈ−ＤＭ１コンジュゲート（３．３個のメイタンシノイド／Ａｂ）の血漿薬物動態を、コンジュゲートしていない抗体、および常套の脂肪族炭素鎖リンカーを含有する同様の４．２Ｄ／Ａの負荷を持つＡｂ−ＳＭＣＣ−^３Ｈ−ＤＭ１コンジュゲートと、ＣＤ−１マウスにおいて１０〜１２ｍｇ／ｋｇの静脈内用量で比較した（図３８Ｂ）。Ａｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−^３Ｈ−ＤＭ１コンジュゲートは、４週間にわたって、同様のメイタンシノイド負荷を持つ常套のＳＭＣＣリンカーコンジュゲートと比較してより高い血漿濃度を示したが、これは、抗体濃度（ＥＬＩＳＡ；図３８Ｂ）およびコンジュゲート濃度（^３Ｈ標識計数）の両方により測定された。ＰＥＧ_４−Ｍａｌ連結コンジュゲートの半減期は、ＳＭＣＣ連結コンジュゲートについての１２．６日と比較して１６日であり、したがって、ＳＭＣＣコンジュゲートよりもはるかに向上していた（図３８Ｂ）。重要なことに、ＣＤ−１マウスにおいて、３．３Ｄ／Ａを有するＡｂ−ＰＥＧ_４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートの、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量における曲線下面積（ＡＵＣ）（ＡＵＣ＝３８７９０ｈ．μｇ／ｍＬ）は、コンジュゲートしていない抗体の、同様の１２ｍｇ／ｋｇの静脈内用量におけるもの（ＡＵＣ＝３８７９８ｈ．μｇ／ｍＬ）と類似しており、４．２Ｄ／Ａを有するＡｂ−ＳＭＣＣ−ＤＭ１コンジュゲートの、１０ｍｇ／ｋｇの静脈内用量におけるもの（ＡＵＣ＝２５９１０ｈ．μｇ／ｍＬ）よりもはるかに良好であった（図３８Ｂ）。

実施例ＶＩＩＩ
耐性大腸癌（ＨＣＴ１５）異種移植に対する抗ＥｐＣＡＭ−メイタンシノイドコンジュゲート、ｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１およびｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートのインビボ抗腫瘍活性の比較
ｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１およびｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートの抗腫瘍効果を、Ｐ糖タンパク質を過剰発現して種々の薬物に対し耐性であることが示されているヒト大腸癌腫ＨＣＴ１５の異種移植モデルにおいて評価した。ＨＣＴ１５細胞をＳＣＩＤマウスの右肩下の領域に皮下注射した（１×１０^７細胞／動物）。腫瘍の体積が約１４０ｍｍ^３のサイズに達した時点で（腫瘍細胞接種後９日）、マウスを腫瘍体積によりランダム化して３グループに分け（５匹／グループ）、各グループをｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１（コンジュゲートタンパク質２０ｍｇ／ｋｇ）、ｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１（コンジュゲートタンパク質２０ｍｇ／ｋｇ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ビヒクル対照）のいずれかの静脈内単回ボーラスで処置した。腫瘍サイズを週２回測定することにより腫瘍の成長をモニタリングした。腫瘍サイズを式：長さ×幅×高さ×１／２により算出した。

腫瘍体積の平均変化を、例えば図３０に示す。ＰＢＳ対照群では、細胞接種後２０日目までに腫瘍が６００ｍｍ^３の腫瘍体積に達した。ｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１による処置は１５日の腫瘍成長遅延をもたらした。ｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１による処置は、さらなる抗腫瘍効果を示し、５匹中２匹の動物は完全な腫瘍退縮を有して４４日間持続し、３匹で３２日間の腫瘍成長遅延が見られた。

したがって、本発明のコンジュゲートｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１は、このヒト大腸癌異種移植モデルにおいてｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１より有意に有効である。

実施例ＩＸ
耐性大腸癌（ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ）の異種移植に対する抗ＥｐＣＡＭ−メイタンシノイドコンジュゲート（ｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１およびｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１）のインビボ抗腫瘍活性の比較
ｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１およびｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートの抗腫瘍効果を、Ｐ糖タンパク質を過剰発現するように工学的処理されたヒト大腸癌ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲの異種移植モデルにおいて評価した。ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞をＳＣＩＤマウスの右肩下の領域に皮下注射した（１×１０^７細胞／動物）。腫瘍の体積が約１７０ｍｍ^３のサイズに達した時点で（細胞接種後８日）、マウスをランダムに３グループに分け（６匹／グループ）、各グループをｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１（コンジュゲートタンパク質２０ｍｇ／ｋｇ）、ｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１（抗体投与量２０ｍｇ／ｋｇ）またはリン酸緩衝化生理食塩水（ビヒクル対照）のいずれかの静脈内単回ボーラスで処置した。腫瘍サイズを週２回測定することにより腫瘍の成長をモニタリングした。腫瘍サイズを式：長さ×幅×高さ×１／２により算出した。

腫瘍体積の平均変化を、例えば図３１に示す。ＰＢＳ対照群では、３８日で腫瘍が約１０００ｍｍ^３にまで成長した。ｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１による処置は、１４日の腫瘍成長遅延をもたらした。ｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１による処置は顕著な抗腫瘍効果を有し、６匹すべての動物において完全な腫瘍退縮をもたらした（図３１）。

同様な実験をＣＯＬＯ２０５異種移植に対しても行った。この場合も、Ｂ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１による処置は、より有効であり、完全な腫瘍退縮をもたらした一方で、標準的なＳＭＣＣコンジュゲートは中等度の腫瘍成長遅延を示すのみである（図３２）。

同様な結果がヒト化抗ＣａｎＡｇ抗体のコンジュゲートによって得られた（図３３）。

したがって、本発明のコンジュゲートｍｕＢ３８．１−ＰＥＧ４−ｍａｌ−ＤＭ１は、このヒト大腸癌異種移植モデルにおいて、これまでに記載されたリンカーを用いて調製されたコンジュゲートｍｕＢ３８．１−ＭＣＣ−ＤＭ１より有意に有効である。

実施例Ｘ
ＰＥＧの長さの評価：
ＰＥＧ_４、ＰＥＧ_８、ＰＥＧ_１２、ＰＥＧ_２４リンカーを用い、かつ抗体あたり種々の数のＤＭｘを組み込み、いくつかのＡｂ−ＰＥＧ_ｎ−Ｍａｌ−ＤＭｘコンジュゲートを調製した。図３４は、非常に高い１７．１Ｄ／Ａの負荷を有するＡｂ−ＰＥＧ_２４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートが、抗原発現癌細胞への非修飾抗体と同様の結合を示すことを明示している（フローサイトメトリーによる相対平均蛍光ＲＭＦ単位で測定された結合）。４〜８Ｄ／Ａを持つＡｂ−ＰＥＧ_８−Ｍａｌ−ＤＭ１およびＡｂ−ＰＥＧ_１２−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートも、細胞結合フローサイトメトリーによって非修飾抗体と同様の結合を示す。ＰＥＧ_４、ＰＥＧ_８、ＰＥＧ_１２、ＰＥＧ_２４リンカーを用いて調製したＡｂ−ＰＥＧ_ｎ−Ｍａｌ−ＤＭｘコンジュゲートは、抗原陽性細胞に対する細胞毒性において有効であった。図３５は、４〜１７Ｄ／Ａを有する抗ＣａｎＡｇ抗体（ｈｕＣ２４２）−ＰＥＧ_ｎ−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートが、ＣａｎＡｇ抗原陽性ＣＯＬＯ２０５細胞を５日間のインキュベーションに際し約０．１〜０．５ｎＭの有効なＩＣ_５０で死滅させたことを明示している。ｐｇｐ発現多剤耐性ＣＯＬＯ２０５−ＭＤＲ細胞は、４〜１７Ｄ／Ａを持つｈｕＣ２４２−ＰＥＧ_ｎ−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートによって、約０．０５〜０．５ｎＭのＩＣ_５０で有効に死滅した（図３６）。高い１７．１Ｄ／Ａを有するＰＥＧ_２４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートは、細胞毒性において、４Ｄ／Ａを有するＰＥＧ_２４−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートより有効であった（図３４、３６）。

実施例ＸＩ
アミン反応性基を含有する非開裂性チオスクシンイミジル部位を持つメイタンシノイドの、抗体に対するコンジュゲーション
非開裂性チオスクシンイミジル基を持つメイタンシノイドのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを用いて、１工程方法を用いて抗体をコンジュゲートした（図４１）。スルフヒドリル保持メイタンシノイドをヘテロ二官能性マレイミド保持架橋剤によって修飾し、単離し（図４３）、その後、抗体とのコンジュゲーションにより非開裂性チオスクシンイミジル連結抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを得た（図３９）。マレイミドとＮＨＳエステルとの間に炭化水素環を含有するＳＭＣＣ試薬によって反応を行い、同様の方法を用いて、スルフヒドリル保持メイタンシノイドをマレイミドとＮＨＳエステルとの間に直鎖炭化水素を含有するヘテロ二官能性リンカーと反応させることができた（図４４）。

ＤＭ１−ＳＭＣＣの合成
丸底フラスコに、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（３−メルカプト−１−オキソプロピル）−メイタンシン（ＤＭ１、６７．９ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、３２．１ｍｇ、０．０９６ｍｍｏｌ、１．０５当量）およびＴＨＦ（４ｍＬ）を投入した。試薬として撹拌された溶液を溶媒に溶解し、透明の無色溶液を生じさせた。次いで、ｐＨ６のリン酸緩衝液（４ｍＬ、１００ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ）を添加した。反応フラスコにセプタムおよび撹拌棒を装備し、激しく撹拌しながら室温で反応を進行させた。反応は、逆相ＨＰＬＣによって示されるように、３０分以内に完了したと見られた。反応の完了後、反応物体積を真空中で減少させ、白色固体／残渣を得た。生成物を塩化メチレン中３％のメタノールの混合物で溶離しながら、シリカゲルクロマトグラフィによって単離した。生成物含有画分を合わせ、真空中で乾固させて、６３ｍｇ（６３．９％の収率）のＤＭ１−ＳＭＣＣを白色固体として得た。単離した生成物の質量分析により、予測値ｍ＋Ｎａ^＋（ｍ／ｚ１０９４．４）およびｍ＋Ｃｌ⁻（ｍ／ｚ１１０６．２）の主な分子イオン（図４３）を確認した。

ＤＭ１−ＳＭＣＣによる抗体の１工程コンジュゲーション
ＤＭ１−ＳＭＣＣ試薬の１０ｍＭの原料（ｗ／ｖ）をＤＭＡ（１０．７ｍｇ／ｍＬ）中で調製した。原液をＥｔＯＨで希釈し、ＥｔＯＨおよびＤＭＡの試薬のブランクに対して吸光度を２８０ｎｍで測定した。原料であるＤＭ１−ＳＭＣＣ試薬の濃度を２８０ｎｍで５７００Ｍ^−１の減衰係数（この波長におけるＤＭ１の減衰係数である）を用いることによって算出した。ＤＭ１−ＳＭＣＣの実際の減衰係数を求めていないため、これが唯一の濃度推定値である。

抗体を、７倍モル過剰の試薬を用いて５ｍｇ／ｍＬでＤＭ１−ＳＭＣＣによってコンジュゲートした。数倍過剰のＤＭ１−ＳＭＣＣによる抗体の滴定を最初に実施して所望のＤＭ１：Ａｂ比を求めたが、通常、この範囲はヒト抗体では６〜１０倍モル過剰である。ＤＭＡ（５％ｖ／ｖ）を含むｐＨ７．５の緩衝液において室温で９０分間反応させた。次いで反応混合物を４℃で１２〜３６時間維持した。次いでコンジュゲートを、ｐＨ５．５のクエン酸緩衝液において平衡化したＮＡＰ−５（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５）カラム上で精製し、濾過し、ｐＨ５．５のクエン酸緩衝液に対して透析して、あらゆる未反応の遊離薬物を除去した。透析後、コンジュゲートは、抗体１モルあたり３．１個の連結したＤＭ１分子を有し、検出可能な遊離薬物はコンジュゲートにおいて存在しなかった（図３９、ｍ＝３．１）。最終コンジュゲートにおけるＡｂ抗体分子１個あたりのＤＭ１分子の数（平均）を、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるコンジュゲートの吸光度を決定し、これらの２波長におけるＤＭ１および抗体についての既知の減衰係数を用いることによって測定した。

ＳＥＣ ＨＰＬＣをコンジュゲートにおいて実施し、コンジュゲーション後に９６．８％がモノマー性であったことが明らかになった。

最終コンジュゲートもまた、サイズ排除ＬＣ／ＭＳによって分析した。本発明において記載されている方法によって作製したコンジュゲートは、脱グリコシル化されたコンジュゲートの、予測されたピーク分布のみを含有する所望のＭＳスペクトルを示す（図４５）。

ＤＭ４−ＳＭＣＣの合成
丸底フラスコに、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）メイタンシン（ＤＭ４、２２．０ｍｇ、０．０２８２ｍｍｏｌ）およびスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ、２４．２ｍｇ、０．０７２３ｍｍｏｌ、２．５０当量）およびガラス蒸留したＴＨＦ（１ｍＬ）を投入した。試薬として撹拌した溶液を溶媒に溶解し、透明な無色溶液を生じさせた。次いで、ｐＨ６のリン酸緩衝液（１ｍＬ、１００ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ）を添加した。反応フラスコにセプタムおよび撹拌棒を装備し、激しく撹拌しながら室温で反応を進行させた。反応は、逆相ＨＰＬＣによって示されるように、７時間後に完了したと見られた。反応の完了後、生成物を酢酸エチル中に抽出し（３×２５ｍＬ）、塩水（５ｍＬ）で洗浄し、真空中で乾燥させた。生成物を塩化メチレン中３％のエタノールの混合物で溶離しながら、シリカゲルクロマトグラフィによって単離した。生成物含有画分を合わせ、真空中で濃縮して、１９．７４ｍｇ（６２．８％の収率）のＤＭ４−ＳＭＣＣを得た。単離した生成物の質量分析により、予測値ｍ＋Ｎａ^＋（ｍ／ｚ１１３６．４）およびｍ＋Ｃｌ⁻（ｍ／ｚ１１４８．４）の主な分子イオンを確認した。

ＤＭ４−ＳＭＣＣによる、抗体の１工程コンジュゲーション
ヒト化抗体（２．５ｍｇ／ｍＬ）のｐＨ８．０の水性緩衝液（１００ｍＭのリン酸ナトリウム）中の溶液を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１０倍モル過剰のＤＭ４−ＳＭＣＣによってインキュベートして、２０％の最終ＤＭＳＯ濃度を得た。周囲温度で１時間、コンジュゲーションを進行させた。コンジュゲートをｐＨ５．５の緩衝液（１０ｍＭのヒスチジン、１３０ｍＭのグリシン、５％（ｗ／ｖ）のスクロース、ｐＨ５．５）中で平衡化させたＳｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５ゲル濾過カラム上の通過によって精製した。最終コンジュゲートにおける抗体１分子あたりの連結されたＤＭ４分子の数（平均）を、２５２ｎｍおよび２８０ｎｍにおけるコンジュゲートの吸光度を決定し、これらの２波長におけるＤＭ４および抗体についての既知の減衰係数を用いることによって測定した。

精製後、コンジュゲートは、抗体１分子あたり３．７個の連結されたＤＭ４分子を有した。ＳＥＣ分析を最終コンジュゲートにおいて実施して、９５％超がモノマー性であったことが明らかになったが、５％超の遊離薬物種が最終コンジュゲートにおいて存在した。コンジュゲートを透析すれば、望ましくない遊離薬物種の存在を減少させた可能性が考えられる。

実施例ＸＩＩ
アミン反応性基を含有する非開裂性チオアセトアミジル部位を持つメイタンシノイドの、抗体へのコンジュゲーション
メイタンシノイドＤＭ１を持つスルフヒドリルをブロモ酢酸と反応させ、チオアセトアミジル連結カルボン酸誘導体を得た。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドとのエステル化によって、アミン反応性非開裂性チオアセトアミジル連結メイタンシノイドを得た（図４８）。単離された化合物と抗体との１工程コンジュゲーション（図４２）により、非開裂性抗体メイタンシノイドコンジュゲートを得た（図４０）。

代替的には、スルフヒドリル保持メイタンシノイドＤＭ４をヘテロ二官能性のハロアセトアミド保持架橋剤によって修飾して、チオアセトアミジル部位を持つアミン反応性メイタンシノイドを得た（図４９）。単離された化合物と抗体との１工程コンジュゲーション（図４２）により、非開裂性チオアセトアミジル連結抗体−メイタンシノイドコンジュゲートを得た（図４０）。

ＤＭ１−ＳＢＡの合成
丸底フラスコに、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（３−メルカプト−１-オキソプロピル−メイタンシン（ＤＭ１、１８３．４ｍｇ、０．２４８ｍｍｏｌ）および無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、３ｍＬ）を投入した。ブロモ酢酸（３７．９ｍｇ、０．２７３ｍｍｏｌ、１．１当量）および１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ、７５．６ｍｇ、０．４９７ｍｍｏｌ）を順次添加しながら反応溶液を撹拌した。フラスコにセプタムおよび撹拌棒を装備し、１時間の間、激しく撹拌しながら室温で反応を進行させた。反応の完了後、反応物体積を真空中で減少させて粗油を得た。粗生成物を最小体積の塩化メチレンに溶解し、生成物を、５％のエタノール、０．５％の酢酸および９４．５％の塩化メチレンの混合物で溶離しながらシリカゲルクロマトグラフィによって単離した。生成物含有画分を合わせ、体積を真空中で減少させ、ＨＰＬＣによって、９４．６％の純度を有する、１５８．８ｍｇ（８０．４％の収率）のチオアセトアミジル連結ＤＭ１カルボン酸誘導体を得た。

丸底フラスコを、先の反応の生成物（１５８．８ｍｇ、０．１９９ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（１５ｍＬ）を投入した。次いで、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、２５．２ｍｇ、０．２１９ｍｍｏｌ、１．１当量）および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ、５７．２ｍｇ、０．２９８ｍｍｏｌ）を添加した。完了するまで室温にて撹拌しながら反応を進行させた。反応の完了後（約４５分）、反応混合物を酢酸エチルで希釈し（２０ｍＬ）、分離漏斗に移し、ｐＨ６のリン酸緩衝液（１５ｍＬ、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ）および塩水（７ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ_２ＳＯ_４上で乾燥させ、真空中で濃縮して、粗オフホワイト固体を得た。生成物を酢酸エチル中１０％の１，２−ジメトキシエタンの混合物で溶離しながらシリカゲルクロマトグラフィによって単離した。生成物含有画分を合わせ、真空中で濃縮して、逆相ＨＰＬＣによって９６．０％の純度を有する、３４．５ｍｇ（１９．４％の収率）のＤＭ１−ＳＢＡを得た。単離した生成物の質量分析により、予測値ｍ＋Ｎａ^＋（ｍ／ｚ９１５．２）およびｍ＋Ｃｌ⁻（ｍ／ｚ９２７．０）の主な分子イオンを確認した。

ＤＭ１−ＳＢＡによる、抗体の１工程コンジュゲーション
ＤＭ１−ＳＢＡ試薬の１０．８ｍＭの原料（ｗ／ｖ）をＤＭＡ中で調製した。抗体を、１０．２倍モル過剰の試薬を用いて２．５ｍｇ／ｍＬでＤＭ１−ＳＢＡによってコンジュゲートした。ＤＭＡ（１０％ｖ／ｖ）によって、ｐＨ７．５の緩衝液（１００ｍＭのリン酸カリウム）中で室温にて９０分間反応させた。次いでコンジュゲートをｐＨ６．５の緩衝液（１０ｍＭのリン酸カリウム、１４０ｍＭの塩化ナトリウム）で溶離しながらＳ３００ゲル濾過（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｓ３００）カラム上で精製した。精製後、コンジュゲートは、抗体１モルあたり３．７個の連結されたＤＭ１分子、および約０．１８％の遊離薬物を有した（図４０、ｍ＝３．７）。

コンジュゲートに対してＳＥＣ ＨＰＬＣを実施し、コンジュゲーション後に９９．６％がモノマー性であったことが明らかになった。

Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテートの合成（市販品も可）
１００ｍＬの丸底フラスコに、２−ブロモ酢酸（２．７９ｇ、２０．０８ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２．５４ｇ、２２．１２ｍｍｏｌ）および塩化メチレン（３０ｍＬ）を投入した。Ｎ−Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、４．４６ｇ、２２．１４ｍｍｏｌ）として氷浴中で撹拌した溶液を添加した。反応物を氷浴で１時間および室温でさらに１時間撹拌した。

反応混合物を焼結ガラス漏斗に通して濾過し、真空中で濃縮して粗白色固体を得た。固体を温塩化メチレン（３０ｍＬ）に溶解し、ヘキサン（２５ｍＬ）で再結晶した。固体を濾過によって収集し、ヘキサンで洗浄し、真空中で乾燥させて、３．９９ｇ（８４％の収率）のＮ−スクシンイミジルブロモアセテートを白色固体として得た。^１Ｈ ＮＭＲ（ＣＤＣｌ_３）δ２．８６４（ｓ、４Ｈ）および４．１００（ｓ、２Ｈ）ｐｐｍ．

ＤＭ４−ＳＢＡの合成
丸底フラスコに、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）メイタンシン（ＤＭ４、７１．９ｍｇ、０．０９２ｍｍｏｌ）および無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ、２．５ｍＬ）を投入した。反応をアルゴン雰囲気下に置き、Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテート（ＳＢＡ、２３．９ｍｇ、０．１０１ｍｍｏｌ、１．１当量）および１，８−ジアザビシクロ［５．４．０］ウンデカ−７−エン（ＤＢＵ、１４．７ｍｇ、０．０９７ｍｍｏｌ、１．０５当量）を順次添加した。フラスコにセプタムおよび撹拌棒を装備し、完了まで激しく撹拌しながら室温で反応を進行させた。生成物を、ヘキサン中１５〜６５％の酢酸エチルの勾配で３０分かけて、続いて１０分かけて６５〜９５％酢酸エチルの増大によって溶離しながら、分取シアノＨＰＬＣによって単回注入において単離した。これらの条件下で、ＤＭ４−ＳＢＡが２２〜２４分の間に溶離した。生成物を収集し、真空中で濃縮して、５０．１ｍｇ（５５．２％の収率）の所望のＤＭ４−ＳＢＡ（９５％純度）生成物を得た。単離した生成物の質量分析により、予測値ｍ＋Ｎａ^＋（ｍ／ｚ９５７．４）およびｍ＋Ｃｌ⁻（ｍ／ｚ９６９．２）の主な分子イオンを確認した。

実施例ＸＩＩＩ
カルボキシル部位を持つ非開裂性チオスクシンイミジル連結メイタンシノイド誘導体の調製
スルフヒドリル保持メイタンシノイド、例えば、ＤＭ１およびＤＭ４を修飾して、非開裂性チオスクシンイミジル保持カルボン酸誘導体を得ることができる（図４５、４６および４８）。これらの誘導体は、本明細書に記載されているアミン反応性の非開裂性チオスクシンイミジル連結メイタンシノイドの調製に有用であろう。図４５、４６および４８は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化エステルの形成を示すが、いくつかの他の活性化エステルが形成され得ることが当業者には明らかであり、これらとして、限定されないが、Ｎ−スルホスクシンイミジルエステル、ペンタフルオロフェノールエステル、テトラフルオロスルホフェノール、およびニトロフェノールエステルが挙げられる。スルフヒドリル保持メイタンシノイド、例えば、ＤＭ１およびＤＭ４をホモ二官能性マレイミド試薬によって修飾して、図５０に示すようなマレイミド基を持つメイタンシノイドを得ることができる。

ＤＭ１−ＭＣＣの調製
１０ｍＬの丸底フラスコに、ＤＭ１（４４．６ｍｇ、０．０５７１ｍｍｏｌ）、１，２−ジメトキシエタン（２．５ｍＬ）を投入し、撹拌棒を装備した。Ｎ−［４−（カルボキシシクロヘキシルメチル）］マレイミド（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｉｎｃ．、ＭＣＣ、２０．３ｍｇ、０．０８４３０ｍｍｏｌ）の１，２−ジメトキシエタン（０．５ｍＬ）中の溶液を反応フラスコに添加し、続いて、ｐＨ７．５の緩衝液（２．５ｍＬ、５０ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ）を添加した。数滴の飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を反応溶液に添加し、反応のｐＨを維持した。反応を室温で進行させ、２時間後に完了した。反応物体積を真空中で半分に減少させ、ｐＨ３に酸性化し、生成物を酢酸エチル中に抽出させた（３×１０ｍＬ）。抽出物を合わせ、塩水（５ｍＬ）で洗浄し、真空中で濃縮して、粗生成物を生じさせた。生成物を塩化メチレンおよびエタノールの９３：７混合物で溶離しながらシリカゲルクロマトグラフィによって単離した。生成物含有画分を合わせ、濃縮して、４６．５ｍｇ（８３．５％の収率）のＤＭ１−ＭＣＣ（９９．３％純度）を白色固体として得た。単離した生成物の質量分析により、予測値ｍ＋Ｎａ^＋（ｍ／ｚ９９７．３）の主な分子イオンを確認した。

ＤＭ４−ＳＭＣＣの調製
３ｍＬのガラスバイアルに、ＤＭ４（２４．３ｍｇ、０．０３１１ｍｍｏｌ）、Ｎ−［４−（カルボキシシクロヘキシルメチル）］マレイミド（ＭＣＣ、Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、８．１ｍｇ、０．０３４２ｍｍｏｌ）および１，２−ジメトキシエタン（１ｍＬ）を投入した。ｐＨ７．５の緩衝液（１ｍＬ、５０ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ）として撹拌した溶液を反応に添加した。室温で反応が進行し、２時間以内に完了した。反応物体積を真空中で半分に減少させ、ｐＨ３に酸性化し、生成物を酢酸エチル中で抽出させた（３×１０ｍＬ）。抽出物を合わせ、塩水（５ｍＬ）で洗浄し、真空中で濃縮して、粗生成物を生じさせた。生成物を塩化メチレンおよびエタノールの９：１の混合物で溶離しながらシリカゲルクロマトグラフィによって単離した。生成物含有画分を合わせ、濃縮して、１４．８ｍｇ（４６．９％の収率）のＤＭ４−ＭＣＣ（９６．７％純度）を白色固体として得た。単離した生成物の質量分析により、予測値ｍ＋Ｎａ^＋（ｍ／ｚ１０３９．５）の主な分子イオンを確認した。

実施例ＸｌＶ
チオール反応性部位を持つ非開裂性チオスクシンイミジル連結メイタンシノイド誘導体の調製
非開裂性チオスクシンイミジル基を含有するマレイミド保持メイタンシノイドをチオール含有抗体にコンジュゲートした（図５１）。非開裂性チオスクシンイミジル基を含有するマレイミド保持メイタンシノイドを、チオール含有メイタンシノイドの、ビスマレイミド架橋剤へのカップリングによって調製した（図５２）。ここで行った反応は、Ｍａｌ−（ＣＨ_２）_６−Ｍａｌ試薬によって行ったが、スルフヒドリル保持メイタンシノイドが、マレイミド部位間に異なるスペーサー単位を含有するビスマレイミド試薬に反応し得ることは当業者に明らかである。

ＤＭ１−Ｍａｌ−（ＣＨ_２）_６−Ｍａｌの調製
ビス（マレイミド）ヘキサノエート（１７．９ｍｇ、０．０６４８ｍｍｏｌ、３当量）のＴＨＦ（０．７５ｍＬ）溶液を反応バイアルにおいて調製した。ＤＭ１（１５．９ｍｇ、０．０２１６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（０．７５ｍＬ）中に添加しながら溶液を撹拌した。次いで、Ｎ， Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（３．３ｍｇ、０．０２５９ｍｍｏｌ、１，２当量）を添加し、室温で撹拌しながら反応を進行させた。反応の完了後、反応物体積を真空中で減少させ、粗油を得た。粗生成物を最小量のＣＨ_２Ｃｌ_２に再溶解し、ＣＨ_２Ｃｌ_２中７％メタノールで溶離しながら２０ｃｍ×２０ｃｍの１０００ミクロンのガラスプレートにて分取薄層クロマトグラフィによって精製した。生成物含有バンドをプレートから擦り取り、ＣＨ_２Ｃｌ_２中２０％メタノールで抽出し、焼結ガラス漏斗に通して濾過し、真空中で濃縮して、１０ｍｇ（４５．９％の収率）のＤＭ１−Ｍａｌ−（ＣＨ_２）_３−Ｍａｌ（９５．８％純度）を得た。単離した生成物の質量分析により、予測値ｍ＋Ｎａ^＋（ｍ／ｚ１０３６．４）およびｍ＋Ｃｌ⁻（ｍ／ｚ１０４８．３）の主な分子イオンを確認した。

ＤＭ４−Ｍａｌ−（ＣＨ_２）_６−Ｍａｌの調製
丸底フラスコに、ビス（マレイミド）ヘキサノエート（２５．０ｍｇ、０．０９０ｍｍｏｌ、３当量）およびＴＨＦ（１ｍＬ）を投入した。完全に溶解したら、Ｎ^２’−デアセチル−Ｎ^２’−（４−メルカプト−４−メチル−１−オキソペンチル）メイタンシン（ＤＭ４、２３．５ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１ｍＬ）溶液を反応フラスコに添加した。次いで、ｐＨ６のリン酸緩衝液（２ｍＬ、１００ｍＭのリン酸カリウム、２ｍＭのＥＤＴＡ）を反応フラスコに添加した。反応フラスコに撹拌棒およびセプタムを装備し、撹拌しながら室温で反応を進行させた。反応の完了後（約８時間）、反応物体積を真空中で減少させて乾燥させた。粗生成物を最小体積のアセトニトリルに再溶解し、生成物をセミ分取Ｃ１８ＨＰＬＣによって単離した。生成物含有画分を合わせ、真空中で濃縮して、１０．６ｍｇ（３３．３％の収率）のＤＭ４−Ｍａｌ−（ＣＨ_２）_６−Ｍａｌ（９９．９％純度）を得た。単離した生成物の質量分析により、予測値ｍ＋Ｎａ^＋（ｍ／ｚ１０７８．４）およびｍ＋Ｃｌ⁻（ｍ／ｚ１０９０．３）の主な分子イオンを確認した。

ｈｕＣ２４２−Ｍａｌ−（ＣＨ_２）_６−Ｍａｌ−ＤＭ１の調製
５％のジメチルアセトアミドを含有する１５０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）中のｈｕＣ２４２（８ｍｇ／ｍＬ）を９当量のＳＰＤＢで３０℃にて１時間修飾し、次いで５０ｍＭのリン酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌのｐＨ７．５の緩衝液を用いてＮＡＰ５サイジングカラムに通して溶離した。回収された修飾された抗体に２μＬの１Ｍのジチオトレイトールを３０℃で添加した。１０分後、５０ｍＭのリン酸塩、５０ｍＭのＮａＣｌのｐＨ６．５の緩衝液で溶離しながら反応物をＮＡＰ１０カラムにおいて精製した。ジメチルホルムアミド中のＤＭ１−ｍａｌ−（ＣＨ_２）_６−ｍａｌ（１．７モル当量）を所望の生成物を含有する画分に添加し、１０％ｖ／ｖのジメチルホルムアミド／緩衝液を得た。１時間後、粗コンジュゲートを、１０ｍＭのクエン酸塩、１３５ｍＭのＮａＣｌのｐＨ５．５の緩衝液で溶離しながらＮＡＰ２５カラムにおいて精製した。先に記載した結合アッセイを用いて、ｈｕＣ２４２−Ｍａｌ−（ＣＨ_２）_６−Ｍａｌ−ＤＭ１が、ネイキッドｈｕＣ２４２抗体と同程度に抗原陽性ＣＯＬＯ２０５細胞に結合することが示された（図５３）。ｈｕＣ２４２−Ｍａｌ−（ＣＨ_２）_６−Ｍａｌ−ＤＭ１コンジュゲートは、抗原陰性Ｎａｍａｌｗａ細胞よりも抗原陽性ＣＯＬＯ２０５細胞に対してはるかに細胞毒性であることが示された（図５４）。

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