JP2013503198A - 人工多能性幹(iPS)細胞または組織特異的細胞を誘導するための新規タンパク質送達系 - Google Patents
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Abstract
人工多能性幹(iPS)細胞を誘導するための新規タンパク質送達系を記述する。この送達系は、体細胞内の受容体を認識する受容体結合領域、サイトゾル空間にインデューサーを移動させるトランスロケーショントランスロケーション領域、およびインデューサーが付着しインデューサーが細胞に移動するのを容易にする積荷ベアリング領域を持つコンストラクトを含む。
【選択図】図1B
【選択図】図1B
Description
本発明は、治療目的のためのタンパク質送達系に関する。より詳しくは、このタンパク質送達系は、再生医療または疾病処置のために体細胞を分化させて人工多能性幹(iPS)細胞または組織特異的細胞に誘導する再プログラム因子を送達するために利用できる。
過去には、多能性幹細胞は、核移植と細胞融合によって産生した(Shinya Yamanaka、Pluripotency and Nuclear Reprogramming、Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 363(1500):2079−2087 (June 27, 2008))。両方の方法は胚幹細胞を必要とし、それは研究と治療用途のために倫理的ジレンマを提起している。この問題は最近発見された人工多能性幹(iPS)細胞で克服され、それは胚性幹(ES)細胞の同様な魅惑的な生物学的性質を共有している(Yamanaka, A Fresh Look at iPS Cells. Cell 137: 13−17 (S. 2009))。
人工多能性幹細胞は、2006年にマウス繊維芽細胞(Takahashi, Y. and S. Yamanaka, Induction of Pluripotent Stem Cells from Mouse Embryonic and Adult Fibroblast Cultures by Defined Factors, Cell 126: 663−676 (2006))から、そして2007年には人間の繊維芽細胞(Yu Junying, et al., Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells, Science 318: 1917−1920 (2007), Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblasts by Defined Factors, Cell 131 : 861−872 (2007))、Takahashi, K., et al. Induction of Pluripotent Stem Cells From Adult Human Fibroblasts by Defined Factors, Cell 131 : 861−872 (2007))から明確な因子を強制的に発現させて初めて産生した。2セットの因子は、これらの研究において大人の体細胞を再プログラムさせてiPS細胞にすることを引き起こすのに用いられた。1つの因子は、Oct−3/4、Sox2、Klf4、およびc−Mycを含み(Takahashi, Cell 126: 663−676; Takahashi, Cell 131:861−872)、そして、もう一つの因子は、Oct4、Sox2、NanogおよびLin28を含む(Junying、Cell 318:1917−1920)。これらの明確な因子の再プログラム効率は、p53活性をノックダウンすることによって10倍増加できる。
2008年に、メルトンのグループは、3つの転写制御因子、Ngn3(別名Neurog3)、PdxlおよびMafaの特定の組合せを送達することによって、成熟したマウスの分化した膵臓外分泌細胞が、β細胞に密接に類似している細胞に再プログラムされたことを証明した(Zhou, Q. et al., In Vivo Reprogramming of Adult Pancreatic Exocrine Cells to β−cells, Nature 455: 627−633 (2008))。誘発されたβ細胞は、内因性島β細胞と形態学的に区別がつかない。これらは、β細胞機能に必須な遺伝子を発現し、局所維管束走向を改造して、インシュリンを分泌することによって、高血糖を改善することができる。この研究は、大人の体細胞が多能性幹細胞状態への復帰なしに転写制御因子の特定の組合せによって直接組織特異的細胞に再プログラムできることを示唆する。
iPS細胞の将来性は、莫大である。しかし、iPS細胞の臨床応用は、多くの障害に直面する(Yamanaka, Cell 137: 13−17; Miura, K. et al., Variation in the Safety of Induced Pluripotent Stem Cell Lines, Nature Biotechnology 27(8):743−745 (2009); Carpenter, M. et al., Developing Safe Therapies From Human Pluripotent Stem Cells, Nature Biotechnology 27: 606−613(2009))。1つの大きな困難は、再プログラミング因子の送達伝達手段に、直接関連している。最初に、再プログラミング因子遺伝子は、レトロなまたはレンチウイルスベクトルによって体性繊維芽細胞に導入された(Takahashi, Cell 126: 663−676; Junying, Cell 318: 1917−1920; Takahashi, Cell 131:861−8723−5)。レトロまたはレンチウイルスベクトルによる再プログラミングのプロセスの効率は僅か0.05%以下((Okita, K. et al., Generation of Mouse Induced Pluripotent Stem Cells Without Viral Vectors, Science 322: 949−953; Yamanaka, S. Elite and Stochastic Models for Induced Pluripotent Stem Cell Generation, Nature 460: 49−52 (2009))であった。
これらのベクトルはランダムに宿主のゲノムに統合されるので、オンコジーンの挿入活性化は、常にレトロまたはレンチウイルスベクトルを使用する際の大きな懸念である。導入遺伝子は主にiPS細胞で発現停止させられるが、c−Mycトランス遺伝子の再活性化が結果として腫瘍化に導くことがあった(Okita, K., et al., Generation of Germline−Competent Induced Pluripotent Stem Cells, Nature 448: 313−318 (2007))。これらの導入遺伝子の漏出発現は完全なiPS細胞分化と成熟も妨げるかもしれない。そして、結果としてテラトーマ構造のより大きな危険性に導かれる(Yamanaka, Cell 137: 13−17)。そのうえ、導入遺伝子はiPS細胞から再分化される細胞で再活性化し発現できるであろう。そして、結果としてiPS細胞または腫瘍形成の分化状態を再プログラムする危険に導かれるであろう。
アデノウイルスベクトルのような非組込ウイルスベクトルは、後にこれらの再プログラミング因子遺伝子を送達するのに用いられた(Zhou, Nature 455:627−633;Stadtfeld、M. et al.、Induced Pluripotent Stem Cells Generated Without Viral Integration、Science 322:945−949の(2008))。しかし、大量のアデノウイルスベクトル(それは細胞の上で細胞変性効果を引き起こす場合がある)は、アデノウイルス受容体CARが不足する細胞型に、効果的に形質導入するために必要とされる。そのうえ、「不活性ではない」アデノウイルスベクトルが伝達媒体に選択されるならば、いくつかのアデノウイルス遺伝子の低次発現は形質転換された細胞に影響を及ぼすかもしれない。
再プログラミングは、直接プラスミド形質移入を通して達成されることもある(Okita, Science 322: 949−953; Yu, J. et al. Human Induced Pluripotent Stem Cells Free of Vector and Transgene Sequences, Science 324: 797−801 (2009))、しかし、それはレトロウイルスベクトルのそれより100倍以上効率的でない(Okita, Science 322: 949−953)。アデノウイルスベクトル伝達とプラスミド形質移入は、安定した組込を除外しないかもしれない。アデノウイルスベクトルの組込周波数は、細胞につき10-3〜10-5までである(Harui, A. et al., Frequency and Stability of Chromosomal Integration of Adenovirus Vectors, J. Virology 73: 6141−6146 (1999))。
多能性幹細胞を産生する方法の比較は、表1に示される。
1998年に、フランケル(Frankel)とグリーン(Green)は、HIV−1 Tatタンパク質がレセプター非依存の様式で細胞に侵入できること別々に観察した(Frankel, A. and C. Pabo, Cellular Uptake of the Tat Protein from Human Immunodeficiency Virus, Cell 55: 1189−1193 (1988);Green, M. and P. Loewenstein, Autonomous Functional Domains of Chemically Synthesized Human Immunodeficiency Virus Tat Trans−Activator Protein, Cell 55: 1179−1188 (1988))。HIV−1 Tatの短い塩基アルギニンリッチな領域(aa48−57)を含むTatタンパク質伝達領域(PTD)は、in vitro及びin vivoでのペプチドを含む様々な分子を送達するために広く使われている(Schwarze, S. R. et al., In Vivo Protein Transduction: Delivery of a Biologically Active Protein Into Mouse, Science 285: 1569−1572 (1999);Lindsay, M. A. Peptide−Mediated Cell Delivery: Application in Protein Target Validation, Current Opinion in Pharmacology 2:587−594 (2002);Kwon, Y. D., et al., Cellular Manipulation of Human Embryonic Stem Cells by Tat−Pdxl Protein Transduction, Molecular Therapy 12: 28−32 (2005); Kim, D., Generation of Human Pluripotent Stem Cells by Direct Delivery of Reprogramming Proteins, Cell Stem Cell 4: 472−476 (2009); Wadia, J. S. et al., Transducible Tat−HA Fusogenic Peptide Enhances Escape of Tat−Fusion Protein After Lipid Raft Macropinocytosis, Nature Medicine 10:310−315 (2009); Zhou, H. et al., Generation of Induced Pluripotent Stem Cells Using Recombinant Proteins, Cell Stem Cell 4: 381−384.19−24 (2009))。
タンパク質ベースの媒体で分子を送達するこの方法は、タンパク質伝達と呼ばれている。イオン相互作用を通してTat−PTDを細胞表面に結びつけることは、脂質ラフト依存のマクロピノサイトーシス(Wadia, J. S., Nature Medicine 10:310−315)によって、結果としてTat−融合タンパクの内面化に導かれる。しかしながら、大部分のTat−融合タンパクは、マクロピノソームで捕捉されたままであり、これはマクロピノソームからのペプチドまたはタンパク質の逸脱は非効率なプロセスであることを示す(Wadia, J. S., Nature Medicine 10:310−315)。近年では、うまく4つの再プログラミング因子(Oct4、Sox2、Klf4、及びc−Myc)のC末端に融合されたポリアルギニン(11Rまたは9R)PTDが、マウス胚繊維芽細胞(Zhou, H. et al., Generation of Induced Pluripotent Stem Cells using Recombinant Proteins, Cell Stem Cell 4: 381−384 (2009))、また新生児の繊維芽細胞(Kim, D., Cell Stem Cell 4: 472−476)を非常に低い効率であるがiPS細胞に再プログラムすることに成功した。
本発明は、遺伝子発現ベクトルを使用することなくiPS細胞または組織特異的細胞を産生するために、大人の体細胞に再プログラム因子を送達する新規タンパク質ベースの系である。この系は、受容体結合領域、トランスロケーション領域、積荷保有領域及びインデューサーを持つコンストラクトを含む。受容体結合領域は、コンストラクトを体細胞に向かわせる。トランスロケーション領域は、積荷ベアリング領域とインデューサーを細胞に輸送するのを容易にする。積荷ベアリング領域は、インデューサーを細胞に送達する。本発明の1つの実施形態において、コンストラクトはコンストラクトの結合、トランスロケーションと積荷機能のために外毒素領域を利用する。そのような外毒素のいくつかは、クロストリジウム・ディフィシルTcdAとTcdB毒素(クロストリジウム・ボツリヌス菌BoNTA〜GおよびC2毒素)を含む。コンストラクトの様々な領域は、様々なサイズのインデューサーを収容し、インデューサーを特異的結合レセプターを持つ体細胞に向けさせるために交換されることを有する。
前記コンストラクトは、細胞がiPS細胞となるよう、多能性インデューサーを体細胞に送達するために用いることができる。本発明のもう一つの実施形態は、体細胞が1つまたは複数のインデューサーを支持するコンストラクトに接触するiPS細胞を産生する方法をさらに提供する。前記コンストラクトは、他のコンストラクト(例えばiPS細胞を産生するレンチウイルス、小タンパク質送達系、または小分子)と一緒に利用しても良い。
本発明の上記あるいは他の特徴、態様、および長所は、添付の図面に示されるこれらの実施形態の以下の説明に関して、更に詳細に考慮される。
上に要約された発明は以下の説明を参照することによってよりよく理解できる。そしてその説明の中で参照番号がその部分に対して使われていて、付随する請求項と図面とともに読むべきである。実施形態のこの説明は、発明の実施を構築して使用するのを可能にするために以下で述べられていて、本発明に制限することを意図するわけでなく、本発明の特定の例としての役割を果たす。当業者は、本発明の同じ目的を遂行する他の方法および系を修正または設計するための基礎として開示された概念と特定の実施形態を直ちに使用できるということ理解すべきである。当業者は、そのような等価のコンストラクトと株化細胞が、その最も広い形式において本発明の精神および範囲から逸脱しないことも理解しなければならない。
本明細書に使われる用語、「コンストラクト」とはインデューサー配列と積荷送達配列を含むアミノ酸配列を有する組み換え型ポリペプチドを指す。コンストラクトは、他の成分を持つことがある。たとえば、コンストラクトは受容体結合領域(RBD)、トランスロケーション領域(TD)、積荷ベアリング領域(CBD)と切断配列(CS)を含むことがある。以下に詳細に記述するように、RBDによって、コンストラクトがレセプターを有する細胞を認識してそれと結合できる。
TDによって、CBD(インデューサーを含むことがある)をサイトゾルに輸送できる。CBDは、毒素の不活化有機活性領域である場合がある。より詳しくは、当業者に既知の方法によってCBDが標的細胞に無毒になるものと理解されている。いくつかの実施形態において、CBDはTDに直接リンクしているインデューサーである場合がある。CSとは、例えば、多能性インデューサーを運ぶCBDを細胞内のコンストラクトから解放させる固有のシステインプロテアーゼ領域(CPD)または別のプロテアーゼ配列である場合がある。
「インデューサー」とは、他の特徴の内、体細胞に導入されると体細胞がiPS細胞に転換するのを補助できる転写制御因子である。以下のインデューサーが同定された:Oct3/4、Sox2、Klf4、c−Myc、Nanog、lin28、hTERT(ヒトテロメラーゼ)およびSV40大型T抗原。他のインデューサーは、MafA、Pdx−1、Ngn3、SV−40 T−ag、DPPA4、DPPA5、ZIC3、BCL−2、h−RAS、TPT1、SALL2、NAC1、DAX1、TERT、ZNF206、FOXD3、REX1、UTF1、p53 siRNAを含むことがある。上述の因子に加えて、インデューサーはp53阻害遺伝子(例えばp53、siRNAs、アンチセンスRNA/DNAとリボザイムを標的とする抗体と抗体フラグメント)も含むことがある。
当業者は、本明細書に記述される配列の「実質同一の」ホモログが本発明の例示的な実施形態を構成することを理解されたい。
以下のいずれかが成立するならば、2つのアミノ酸配列は「実質同一である」:(i)結果として生じるポリペプチドの畳み込み活性に重大な影響を及ぼさない保守的なアミノ酸置換のみを有する、(ii)2つの整列化した配列の最も短い方のアミノ酸残基について、挿入、削除、そして、代入によるギャップの数が、最大で10%、望ましくは5%でしかなく、または、(ii)最大でアミノ酸残基の30%、望ましくは20%、より望ましくは15%または10%しか、2つの配列の間で変化がない。米国特許出願番号US2003/0,161,809A1号の中にヒューストンらによって記述された他の方法を使って、2つの配列がかなり同一かどうか決定しても良い。
クロストリジウム外毒素はそのN末端酵素領域に効果的な細胞取り込みとサイトゾル送達のためのすべてのメカニズムを備えていて、再プログラミングタンパク質を大人の体細胞に送達するのに用いることができる。特に、クロストリジウム外毒素とは、毒素を効率的にそのN末端酵素領域と、そのN末端に付随した全てをサイトゾル転位させるモジュラー多領域を示す。例えば、クロストリジウム・ボツリヌス神経毒タイプD(BoNT−D)とクロストリジウム・ディフィシル毒素B型(TcdB)の両方は、毒素のN末端に付加された積荷をサイトゾルに送達する能力を示した(Bade, S. et al., Botulinum Neurotoxin Type D Enables Cytosolic Delivery of Enzymatically Active Cargo Proteins to Neurons Via Unfolded Translocation Intermediates, J. Neurochemistry 91: 1461−147225−26 (2004);
Pfeifer, G. et al., Cellular Uptake of C.difficile Toxin B, Translocation of the N−terminal Catalytic Domain Into the Cytosol ofEukaryotic Cells, J. of Boil. Chem. 278:44535−44541(2003))。
Pfeifer, G. et al., Cellular Uptake of C.difficile Toxin B, Translocation of the N−terminal Catalytic Domain Into the Cytosol ofEukaryotic Cells, J. of Boil. Chem. 278:44535−44541(2003))。
I. C.difficile TcdAoおよびTcdB多能性インデューサーiPS細胞コンストラクト。
本発明の1つの実施形態は、図1で示すような3つの機能領域を有するクロストリジウム・ディフィシル毒素A(TcdA)とB(TcdB)のコンストラクトを含む:(a)エンドサイトーシスのための標的細胞と結合するRBD;(b)毒素の酵素領域のサイトゾル送達を促進するTD;および、(c)インデューサーを運ぶCBD(GT酵素領域の不活発な部分である)。図1Aは、N末端グルコシル・トランスフェラーゼ領域(GT)、固有のシステインプロテアーゼ領域(CPD)、中心トランスロケーション領域(TD)(疎水性部分(HR)を含む)、C末端受容体結合領域(RBD)を有するクロストリジウムディフィシレ毒素の一次構造を示す。CBDは、エンジニアリング組換え型タンパク質のためのGT領域の中に位置する。
図1Bで示すように、TcdB変異体の様々な異なるコンストラクトは、GTタンパク質構造の先端を切り取ることによって無毒化される。野生型TcdB、無毒TcdB(aTcdB)、ならびに組換え型融合タンパクaTcdB−Ml、aTcdB−M2、およびaTcdB−M3、のタンパク質構造。aTcdB−Mlによって、インデューサーがaTcdBのN末端に付加できる。aTcdB−M2は、先端が切り取られたグルコシル基転移酵素(GT)領域に付属する積荷を持ち、aTcdB−M3は、全てのGT領域を置き換える積荷を持っている
最初のステップとして、TcdAのRBDとTcdB RBD(複数)が、Gal−α1、3−Gal−β1、4−GalNAcを含む細胞表面炭水化物と結合する。これらの細胞表面炭水化物は、大部分の体細胞で見出される。このように、TcdA RBDは、大部分の体細胞と結合する。
RBDがそのレセプターと結合した後、CBDは受容体媒介エンドサイトーシスによって内在化される。TDの疎水性部分(HR)は、CBDがそれを通ってサイトゾルに転位できる孔を作るために毒素の対応する部分がそれ自体をエンドソーム膜に挿入するのを可能にする。転位されたものは残りのコンストラクトから切り離されることができて、自己タンパク分解によってサイトゾルにリリースされることができる。そして、図1Bで示すようにTDのN末端部分で自己切断位に隣接している固有のシステインプロテアーゼ領域(CPD)によって触媒作用を及ぼされる。その結果、本明細書に記述されているように、TcdAおよびTcdBのRBDおよびTDを含むコンストラクトを使用して多能性インデューサーを体細胞に導入することができる。
CBDは、インデューサーを運ぶ不活化GT領域である。GT領域は、当業者に知られている様々な方法を使用して不活性化できる。GT領域は切り詰めできる。活性は、その道筋でアミノ酸置換によって破壊できる。本発明の1つの実施形態に、TcdAのGTはD285AとD287Aの削除に引き続いて不活性化し、そして、TcdBのGTはD286AとD288Aの削除に引き続いて不活性化する。本発明のいくつかの実施形態において、活性に対して責務を担う領域部分が削除される様々な長さのGT領域が利用できる。GT領域を不活化すると、TcdAまたはTcdBが無毒化しiPS細胞を産生するためのコンストラクト内での使用を実行可能にする。不活化GT領域は、インデューサーが付着できるCBDになる。図1Bは、本発明の1つの実施形態に従うコンストラクトの様々な可能な配置を示す。
本発明のいくつかの実施形態に従い、図2A〜図2Dは、TcdBとOct4とSox2の様々な領域を利用する様々なコンストラクトを例示する。図2Aの中で、Oct4−aTcdBコンストラクト(配列番号1)の配列は、以下の領域を備えている:ストレプトアビジン結合ペプチド(SBP)(aa1−55);Oct4配列(aa57−416);CBD(aa420−961);CPD(aa962−1185);疎水性領域(aa1374−1546)を含むTD(aa1186−2269);RBD(aa2270−2784);そして、ヒスチジンタグ(aa2785−2790)。図2Bの中で、Oct4−aTcdB(dGT)コンストラクト(配列番号2)の配列は、以下の領域を備えている:ストレプトアビジン結合ペプチド(SBP)(aa1−55);Oct4配列(aa57−416);CBD(aa419−488);CPD(aa489−712);疎水性領域(aa901−1073)を含むTD(aa713−1796);RBD(aa1797−2311);およびヒスチジンタグ(aa2312−2317)。SBPとヒスチジンタグが単にコンストラクトのためのタグであるものと理解される。それは他のタグを交換しても良いし、Oct4(インデューサー)をサイトゾル空間へのトランスロケーションさせるコンストラクト能力に影響を及ぼすことなく完全に除去しても良い。
図2Cの中で、Oct4−aTcdAコンストラクト(配列番号3)の配列は、以下の領域を備えている:ストレプトアビジン結合ペプチド(SBP)(aa1−55);Oct4配列(aa58−416);CBD(aa420−959);CPD(aa960−1187);疎水性領域(aa900−1376)を含むTD(aa1188−2267);RBD(aa2268−3128);およびヒスチジンタグ(aa3128−3134)。図2Dの中で、Oct4−aTcdA(dGT)コンストラクト(配列番号4)の配列は、以下の領域を備えている:ストレプトアビジン結合ペプチド(SBP)(aa1−55);Oct4配列(aa58−416);CBD(aa419−486);CPD(aa487−714);疎水性領域(aa903−1075)を含むTD(aa715−1794);RBD(aa1795−2655);およびヒスチジンタグ(aa2656−2661)。
同様に、図3A〜図3Dは、TcdA、TcdBとSox2を利用するコンストラクトを例示する。図3Aの中で、Sox2−aTcdBコンストラクト(配列番号5)の配列は、以下の領域を備えている:ストレプトアビジン結合ペプチド(SBP)(aa1−55);Sox2配列(aa58−373);CBD(aa377−918);CPD(aa919−1142);疎水性領域(aa1331−1503)を含むTD(aa1143−2226);RBD(aa2268−3128);およびヒスチジンタグ(aa2227−2741)。図3Bの中で、Sox2−aTcdB(dGT)コンストラクト(配列番号6)の配列は、以下の領域を備えている:ストレプトアビジン結合ペプチド(SBP)(aa1−55);Sox2配列(aa58−373);CBD(aa376−445);CPD(aa446−669);疎水性領域(aa858−1030)を含むTD(aa670−1753);RBD(aa1754−2268);およびヒスチジンタグ(aa2269−2274)。
図3Cの中で、Sox2−aTcdAコンストラクト(配列番号7)の配列は、以下の領域を備えている:ストレプトアビジン結合ペプチド(SBP)(aa1−55);Sox2配列(aa58−373);CBD(aa377−916);CPD(aa917−1144);疎水性領域(aa1333−1505)を含むTD(aa1145−2224);RBD(aa2225−3085);およびヒスチジンタグ(aa3086−3091)。図3Dの中で、Sox2−aTcdA(dGT)コンストラクト(配列番号8)の配列は、以下の領域を備えている:ストレプトアビジン結合ペプチド(SBP)(aa1−55);Sox2配列(aa58−373);CBD(aa376−443);CPD(aa444−671);疎水性領域(aa860−1032)を含むTD(aa672−1751);RBD(aa1752−2612);およびヒスチジンタグ(aa2613−2618)。
II. クロストリジウム・ボツリヌス菌神経毒多能性インデューサーiPS細胞コンストラクト
クロストリジウム・ボツリヌス菌神経毒(BoNT)は、多分化能インデューサー送達のために使うことができるクロストリジウム外毒素のもう1つの候補である。BoNTは、特定のニューロン・レセプターを認識するRBDから構成される。BoNT毒素のH鎖(He)は、コンストラクトのためのTDとして機能する。本発明の1つの実施形態のコンストラクトのCBDは、L鎖の膜への非パルミトイル化された係留防御を持つクロストリジウム・ボツリヌス菌神経毒L鎖または先端を切り取ったL鎖でありえる。L鎖は、BoNTのA型〜G型から選ばれてコンストラクトによって送達されるインデューサーの薬理効果の異なる寿命を提供する。
III. クロストリジウム属C2毒素コンストラクト
クロストリジウム属C2毒素は、C2II鎖が酵素により活性化したADPリボシル化鎖のC2Iの細胞レセプター結合、エンドサイトーシス、小孔形成、およびトランスロケーションに関与する二成分毒素構造を持つ。本発明の1つの実施形態に従うコンストラクトは、C2II鎖に多能性インデューサーを融合させて作ることができる。C2I鎖の一部の省略によって、コンストラクトをiPS細胞の産生のプロモーターとして使用するために無毒で安全にする。代わりに、C2I領域は、活性部位の修飾または削除によって不活性化させることができる。また、残基のいくつかは、下記の図で示すように変質させても良い。
図4A〜図4Eは、本発明の1つの実施形態に従って作れるコンストラクトのいくつかの代表例を表す。図4Aで、基本的なC2IIコンストラクトは、SBPとヒスチジンタグで提示される(配列番号9)。図4Bは、Oct4と不活化C2I領域(配列番号10)を有するコンストラクトを表す。C2I領域は、コンストラクトのaa600、602、804、805および807で点突然変異によって不活性化されることを有する。SBPとヒスチジンタグは、任意である。図4Cは、Oct4と先端を切ったC2I(配列番号11)を有するコンストラクトを表し、そしてその切断がそれを不活発にする。図4Dは、Sox2と不活化したC2I配列(配列番号12)を有するコンストラクトを表す。図4Eは、Sox2を有する先端を切ったC2Iを表す(配列番号13)。
IV. クロストリジウム毒素領域スワッピング
様々なクロストリジウム毒素は、異なる細胞型と結合する。クロストリジウム毒素のRBDは、交換/スワップできてインデューサーを体細胞に送達することができる様々な異なるコンストラクトの存在を証明する。C末端RBDの領域スワッピングによって、細胞型、組織、特異的送達のための異なるコンストラクトを作ることができる。1つの実施形態おいて、TcdAまたはTcdBのRBDは、標的神経細胞のためにBoNTから選択されるRBDと入れ替えることができる。もう1つの実施形態おいて、TcdAまたはTcdBのRBDは、細胞型または組織特異細胞表面レセプターと結合し、レセプター媒介内在化を誘発するリガンドと置換することができる。全体で、異なるユーティリティに対応する順序を変えたタンパク質ベースの送達媒介は、N末端領域スワッピングとC末端領域スワッピングとの組合せによって作成することができる。
送達媒介である以上に、BoNTのC末端RBDは、TcdAまたはTcdBのRBDに取って代わることができ、特に神経細胞を標的とするタンパク質送達媒介を作製するのに用いることができる。同様に、TcdAまたはTcdBのRBDは、BoNTのRBDに取って代わるのに用いることができ結果としてBoNTコンストラクトによってインデューサーの非細胞特異標的になる。さらにまた、BoNTL鎖は、TcdBまたはTcdAのN末端に取って代わるのに用いることができBoNTL鎖のN末端に融合する積荷タンパク質の望ましい生物学的機能を強化する。L鎖はBoNTのA型からG型まで、好ましくはクロストリジウム・ボツリヌス菌神経毒A型のL鎖までの間で選択される。従って、本明細書に示されているように、クロストリジウム外毒素間の領域交換を用いることによって、様々な多能性インデューサー送達媒介が合成できる。
図5A〜図5Dは、本発明の1つの実施形態に従って作ることができるコンストラクトのいくつかの代表例を表す。図5Aの中で、Oct4は、TDとTcdB RBD(配列番号14)のようにBoNT/Clに付着する。図4Aのコンストラクトにおいて、BoNT/ClのL鎖の活性は、示されている修飾によって破壊できる。図4Bは、BoNT/Cl TDとTcdB RBDを有するSox2を表す(配列番号15)。図5Cは、インデューサーとしてのOct4、TDとしてのC2IおよびRBDとしてのトランスフェリンを有するコンストラクトを表す。図5Dは図5Cと類似しているが、Oct4の代わりに、Sox2を利用する(配列番号16)。図5Eは、インデューサーがOct4であり、CBDとTDがBoNT/Clによって提供され、そしてRBDがILGFと一致する本発明の1つの実施形態に従うコンストラクトの更なる例を提供する(配列番号17)。図5Fは、インデューサーがSox2であり、CBDとTDがBoNT/Clによって提供され、そしてRBDがILGFと一致する本発明の1つの実施形態に従うコンストラクトの更なる例を提供する(配列番号18)。
当業者は、コンストラクトが標準的方法によって作製できることを理解するであろう。たとえば、コンストラクトは標準的方法によって大腸菌または藻類系で発現することができる。Humphreys, David P. et al. High−Level Periplasmic Expression in Escherichia coli Using a Eukaryotic Signal Peptide: Importance of Codon Usage at the 59 End of the Coding Sequence, Protein Expression and Purification 20, 252−264 (2000); Griswold, Karl E. et al., Effects of Codon Usage Versus Putative 50−mRNA Structure on the Expression of Fusarium solani cutinase in the Escherichia coli Cytoplasm, Protein Expression and Purification 27: 134−142 (2003); Mayfield, Stephen P et al., Chlamydomonas reinhardtii Chloroplasts as Protein Factories, Current Opinion in Biotechnology, 18: 126? 133 (2007)。
V. 例
TcdBコンストラクトの調製
TcdBコンストラクトの調製
我々は、バチルスメガテリウム発現系を使うクロストリジウム・ディフィシル毒素の強い組み換え型発現度を成功裏に示した。TcdAとTcdB遺伝子の両方を、PCRによってクロストリジウム・ディフィシル(VPI 10463)ゲノムDNAから増幅した。これらのPCR産物を、クローン化してバチルスメガテリウム発現ベクトルpHis1522を作った(MoBiTec、ドイツ)。我々も、グルコシル基転移酵素領域での基質結合のために重要なアミノ酸を変異させて無毒TcdB遺伝子を作った。これらのコンストラクトを使ってバチルスメガテリウムプロトプラスト(MoBiTec)を形質移入した。その上、我々も将来において組み換え型コンストラクトに役立つためにTcdBをコードする完全な合成遺伝子のコンストラクトを生み出した。GTを切り詰めた変異体も、自己切断部位(−ΔGT68)の僅か68個のアミノ酸上流で、Gal4−TF/aTcdBから作られた。陽性クローンは組み換え型タンパク質発現のために選ばれた、そして細菌性可溶化液から組み換え型ヒスチジンタグされた組換え型TcdB(rTcdB)の精製を、イオン交換分画の後でNi−アフィニティークロマトグラフィーによって実行した。これらのクローンで、我々は、図6で示すように小規模の時間経過発現研究を行って、両方の組み換え型タンパク質のピーク発現がキシロース誘導後の2〜3時間であると分かった。
我々は、1リットルの総菌液の可溶化液から平均5〜10mgの高度に精製された組み換え型タンパク質を得ることができた。精製したrTcdBを、細胞病理と細胞毒性の効果およびRac1のグルコシル化についてマウス腸の上皮CT26細胞内で機能的にテストした。長い期間の無毒TcdB(aTcdB)で可能な限りの最高線量への細胞の露顕は、変異体GTは酵素活性(〜5logs)が実質的に欠けていて、劇的に減少した細胞障害性(>5logs)を示した。図4は、細胞変性効果は、aTcdBで処置したこれらの細胞の上では観察されなかったことを示す。
組換え型TcdBがヒューズのついた積荷を細胞に送達することができることを確かめるために、我々はTcdBのアミノ末端に、小さな酵素(O6−アルキルグアニン−DNAアルキル基転移酵素、ニューイングランドバイオラボによってSNAP−タグと呼ばれている)を付加した。我々は、SNAP−タグのキメラ融合を活性化組換え型TcdBに効率的に発現させることができる。キメラタンパク質は野生型TcdBに粗等しい毒性を保持する。このことは図7で示すように積荷がサイトゾルに達した後のみに毒性を引き起こすTcdBのグルコシル基転移酵素領域に付加されるので、積荷が細胞サイトゾルにアクセスしたに違い無いことを示す。
SNAP−TcdB融合タンパクの作製、精製および生物学的機能の実証
図8Aで示すように、N修飾SNAP−TcdB融合のドメイン構造は、野生型が290kDであるのと比較して、270kDペプチドである。野生型TcdBコンストラクトには、ヘキサヒスチジンタグがあった。SNAP−TcdBコンストラクトは、親和性精製のためにヘキサヒスチジンとストレプトアビジンタグで標識された。図8Bは、ストレプトアビジン精製によって回収された全長のSNAP−TcdB産物を表す;溶出剤(E)と(FT)を通る流れは野生型(W)標本と比較され、予想通りに産物を産生しなかった。図8Cの中で、精製した標本をウエスタンブロット解析すると、抗SNAPタグ抗体を使う強い信号を示す。最後に、図8Dの中で、ベロー細胞は、1時間精製したSNAP−TcdBまたは野生型TcdBの異なる用量にさらし、そして細胞円形化の%を評価した。結果は、融合パートナーをTcdBに添加すると逆にその生物学的機能をすることなく、細胞に積荷を送達可能なままであることが確認された。
既存の細胞ベース系のリポーターコンストラクトの構築と機能テスト
上記の機能TcdBペプチドは、本発明の1つの実施形態に従うコンストラクトを開発するのに使用できる。コンストラクトは、多能性インデューサーの配列をaTcdBコンストラクトのN末端終わりに加えることによって構築できる。次に多能性インデューサー/TcdBコンストラクトを、2つの系の内の1つでテストできる。
Gal4 DNA結合領域/NFkB活性化領域ベースのキメラの転写制御因子(Gal4−TF)の存在を検出するのに用いる哺乳類のリポーター株化細胞は修飾できて、多能性インデューサーコンストラクトテストのためのリポーターとして使われる。HEK293株化細胞は、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子(GLuc)遺伝子が続くYFPVenus遺伝子を含む2つのシストロン性リポーター遺伝子を発現するGal4応答プロモーターから構成される合成リポーターコンストラクトを持つ。VenusとGLucは、2つのリポータータンパク質の独立した発現度を可能にさせる口蹄疫ウイルスの「自己切断」ペプチド2Aによって切り離される。両方のリポーター遺伝子の包含によって、GLuc生物発光の検出のみならずVenus蛍光のための細胞の顕微鏡での瞬間的な検査が可能になる。aTcdBへの積荷附属器としてのGal4ベースの転写制御因子を持って、この系を転写制御因子/多能性インデューサーの機能細胞送達をテストするのに用いることができる。HEK293Venus/Glueリポーター系のGal4 DNA結合配列プロモーターを、4回反復Oct4/Sox2成分と置換できる。他の多能性インデューサーを、HEK293Venus/Glueリポーター系のGal4 DNA結合配列プロモーターをそれぞれの配列で置換することによってテストすることもできる。
第2のOct4/Sox2ベースの株化細胞リポーターを、コンストラクトをテストするために利用することができる。この第2の系は、部位特異的プロモーター活性化のOct4とSox2のために必要とされるDNA結合領域から成る(Ambrosetti D−C et al., Modulation of the Activity of Multiple Transcriptional Activation Domains by the DNA Binding Domains Mediates the Synergistic Action of Sox2 and Oct−3 on the Fibroblast Growth Factor−4 Enhancer, J. Biological Chem. 275:23387−23397 (2000))。pCATS03と呼ばれるプロモーターリポーター遺伝子コンストラクトは、SV40プロモーターの上流に位置するFGF−4エンハンサーに存在するHMGとPOUのモチーフを6部含む。HMGのモチーフはSox2と結合し、そして、隣接したPOUのモチーフはOct4と結合する(Chakravarthy, H. et al., Identification of DPPA4 and Other Genes as Putative Sox2: Oct−3/4 Target Genes Using a Combination of in Silico Analysis and Transcription−Based Assays, J. Cellular Physiology, 216:651−662 (2008); Rizzino, A. Sox2 and Oct−3/4: A Versatile Pair of Master Regulators that Orchestrate the Self−Renewal and Pluripotency of Embryonic Stem Cells by Functioning as Molecular Rheostats, System Biology and Medicine, WIREs Syst Biol Med 1(2), (2009))。ヒーラー細胞、pCATS03は極めて低いレベルのリポーター遺伝子を発現する。このプロモーターリポーター遺伝子コンストラクトは、ベースラインでHeLa細胞内に発現しないSox2とOct4の存在に非常に敏感である。HeLa細胞がSox2とOct4の発現ベクトルとともにpCATS03を形質移入されると、リポーター遺伝子の強い刺激(〉40倍)がある。Sox2とOct4それぞれは、各々リポーター遺伝子〜3倍刺激する。Sox2とOct4への共働応答があれば、このアッセイは、Sox2−とOct4−aTcdB融合タンパクが協力して一緒に働く能力を測定する非常に感度が高いテストを提供できる。
Oct4/Sox2リポーター株化細胞へのaTcdBによる生理活性Oct4とSox2の送達の実証
細胞ベースの分化アッセイについて、我々は、スミスとRizzino研究所によってなされたOct4またはSox2のレベルの小さな増加(〜2倍)がマウスES細胞の分化を誘発することを示す発見を活用する(Niwa H, et al. Quantitative Expression of Oct−3/4 Defines Differentiation, Dedifferentiation or Self−Renewal of ES Cells, Nat Genet 24:372−376 (2000); Kopp, J. et al., Small Increases in the Levels of Sox2 Trigger the Differentiation of Embryonic Stem Cells, Stem Cells 26:903−911 (2008))。
Oct4が上がる場合には、ES細胞は48時間以内に胚体外内胚葉と栄養外胚葉のマーカーを発現する細胞に分化する(Niwa H, Nat Genet 24:372−376)。Sox2が上がる場合には、ES細胞は48時間以内に外胚葉、中胚葉、および栄養外胚葉で、しかし内胚葉ではないところにマーカーを発現する細胞に分化する(Kopp, J. Stem Cells 26:903−911)。これらの分化マーカーは、リアルタイムRT−PCRを使うRNA分析で直ちに測定される(Kopp, J. Stem Cells 26:903−911)。
このアッセイを使って、Oct4−aTcdB融合タンパクとSox2−aTcdB融合タンパクの各々の機能は、ES細胞の分化を特定の分化した細胞に駆動するそれらの能力を測定することによって評価できる。
細胞ベースの転写アッセイのために、我々はOct4−およびSox2−aTcdB融合タンパクがヒーラー細胞に安定して形質移入されたプロモーター/リポーター遺伝子コンストラクトを刺激する能力を検査するつもりである。以前に記述されたように、この細胞リポーター系が構築され、この種のアッセイにはよく機能する。Sox2−とOct4−aTcdB融合タンパクは、タンパク質濃度の範囲に亘り個々にまた組合せでテストされる。これらの研究のために、我々は、Sox2−とOct4−aTcdBの融合タンパクがプロモーターリポーター遺伝子コンストラクトを刺激する能力を、レンチウイルスベクトルで送達されたSox2とOct4がpCATS03を刺激す能力と比較する(Nowling, T. et al., Transactivation Domain of the Transcription Factor Sox−2 and its Associated Coactivator, J. Biol. Chem. 275:3810−3818 (2000))。
その上、密接にGal4−TF株化細胞に関係するOct4/Sox2リポーター細胞系を作成でき、直接のプラスミド形質移入でテストできる。S03プロモーターから発現したVenus/GLucを含む合成リポーターコンストラクトは、Sox2/Oct4と結合するHMGとPOUのモチーフ6部を含み、レンチウイルスベクトルにクローン化できる。sox2とoct4遺伝子の両方が合成でき、pcDNA哺乳類の発現プラスミドにクローン化できる。この系は、リポーターコンストラクトと両方のsox2とoct4発現プラスミドを持つHEK293細胞を同時形質導入させることによって確認できる。このリポーターの活性化は、GLucアッセイとVenus(YFP)生物発光によってモニターできる。細胞内のOct4/Sox2活性を確認した後に、Oct4とSox2は、インデューサーコンストラクトの産生のためのaTcdB送達プラスミドに別々にクローン化して良い。リポーターを、他の因子(即ち、Oct4)のタンパク質送達によって補われる胚性トランス活性化因子(即ち、Sox2)のうちの1つのプラスミド形質移入によって、かつ逆に個々に送達されたタンパク質に対するリポーター応答をアッセイするために、さらに確認できる。最後に、aTcdBインデューサーコンストラクトは、iPS細胞産生系の組み合わせ効果と効率をテストするために両方の因子を送達するのに用いることができる。比較のために、タンパク質送達ペプチド(例えば、Tat−Oct4)を、多能性インデューサーコンストラクトの増改善した効率を示すのに用いることができる。
aTcdB経由のSox2およびOct4の送達によるマウス胚性繊維芽細胞からiPS細胞への脱分化
融合タンパク質媒介再プログラムの効率をMEFが4つの適切に特徴がはっきりした再プログラム転写制御因子を発現するレンチウイルスに感染する時に認められた再プログラム効率と比較できる(Cox, J.L., and Rizzino, A. Induced Pluripotent Stem Cells: What Lies Beyond the Paradigm Shift, Experimental Biology and Medicine 235: 148−158 (2010))。MEFは、自己切断ペプチド(口蹄疫ウイルスからの2A)によってお互いから切り離されているOct4、Sox2、Klf4およびc−Mycをコードする多シストロン性コピーを発現するレンチウイルスベクトルを使用して再プログラムされてきた。各々の多能性インデューサーコンストラクトを、MEFをドキシサイクリンに応じてKlf4とc−Mycだけを発現する誘導性レンチウイルスベクトルに感染させることによってテストできる。そしてこれらの細胞を使用して、MEFの形成を促進させるためにドキシサイクリンとともに毎日培地に加えられるSox2−とOct4−aTcdB融合タンパクの能力をアッセイできる。
再プログラムの効率(再プログラムされた細胞のパーセンテージ)を測定することに加えて、産生するiPS細胞の品質は、以下を含む多能性幹細胞の広範な確立した特性を検査することによって評価されることができる:内因性の多能性転写制御因子(例えば、内因性のSox2、Oct4、Nanog、UTF1)の発現、内因性のOct4とNanogの遺伝子の脱メチル化、細胞表面マーカーSSEA−1の発現、および胚様体を使う胚性胚芽の各々からマーカーを発現する細胞に分化するiPS細胞の能力。(哺乳類の胚形成のための試験管内モデル系の転写調節(Rizzino, A. Transcriptional Regulation )in an In Vitro Model System for Mammalian Embryogenesis, “Hormones and Growth Factors in Development and Neoplasia”, eds. R.B. Dickson and D.S. Salomon, John Wiley & Sons, New York, pp. 115−129 (1998)内に記載)。
本発明は、好ましい実施形態を参照して記述された。特定の値、関係、物質とステップは発明の概念を記述する目的のために述べられていて、多数の変更および?または修正が広範囲に記述された発明の基本的概念と実施原則の精神と範囲を逸脱しない限り特定の実施形態で示されるように発明に加えて良いことを当業者は理解できるであろう。上記の教示に照らしてみれば、当業者が、本明細書に教示された本発明から逸脱しない範囲でこれらの明細を修正できることを理解されたい。ここで本発明の基礎をなしている概念の好ましい実施形態と特定の修正を明記したので、本明細書に示され記述された実施形態の特定の変更および修正のみならず様々な他の実施形態を、その根底にある概念に精通すれば、即座に明白に当業者は気づくであろう。添付の請求項またはその等価物の範囲内にある限りそのような修正、代替物、およびその他の実施形態を含むことを目的とする。したがって、本明細書に特に述べられているのでなければ、発明を実施できることを、よく理解すべきである。従って、本実施例は、あらゆる点において例示的であって制限的でないとみなされる。
Claims (22)
- 受容体結合領域、トランスロケーション領域、積荷ベアリング領域、およびインデューサーを含む人工多能性幹(iPS)細胞を産生する、コンストラクト。
- 前記受容体結合領域、前記トランスロケーション領域および前記積荷領域が外毒素領域である、請求項1に記載のコンストラクト。
- 前記外毒素がクロストリジウム毒素である、請求項2に記載のコンストラクト。
- 前記クロストリジウム毒素がクロストリジウム・ディフィシル毒素である、請求項3に記載のコンストラクト。
- 前記クロストリジウム・ディフィシル毒素がTcdAである、請求項4に記載のコンストラクト。
- 前記クロストリジウム・ディフィシル毒素がTcdBである、請求項4に記載のコンストラクト。
- 前記外毒素が無毒である、請求項2に記載のコンストラクト。
- 前記クロストリジウム毒素がクロストリジウム・ボツリヌス毒素である、請求項3に記載のコンストラクト。
- 前記クロストリジウム・ボツリヌス毒素がBoNTA、BoNTB、BoNTC、BoNTD、BoNTE、BoNTFおよびBoNTGから成る群から選択される、請求項7に記載のコンストラクト。
- 前記クロストリジウム・ボツリヌス毒素の受容体結合領域が非特異的受容体結合領域と入れ替えられる、請求項7に記載のコンストラクト。
- 前記クロストリジウム毒素がクロストリジウム属C2毒素である、請求項3に記載のコンストラクト。
- 前記インデューサーがOct3/4である、請求項1に記載のコンストラクト。
- 前記コンストラクトが配列番号1を含む配列を有する、請求項12に記載のコンストラクト。
- 前記コンストラクトが配列番号2を含む配列を有する、請求項12に記載のコンストラクト。
- 前記コンストラクトが配列番号1および配列番号2からなる群から選択される配列と実質同一である配列を有する、請求項12に記載のコンストラクト。
- 前記インデューサーがSox2である、請求項1に記載のコンストラクト。
- 前記コンストラクトが配列番号3を含む配列を有する、請求項16に記載のコンストラクト。
- 前記コンストラクトが配列番号4を含む配列を有する、請求項16に記載のコンストラクト。
- 前記コンストラクトが配列番号1および配列番号2からなる群から選択される配列と実質同一である配列を有する、請求項16に記載のコンストラクト。
- 前記インデューサーが、Klf4、c−Myc、Nanog、lin28、hTERT(ヒトテロメラーゼ)およびSV40大型T抗原からなる群から選択される、請求項1に記載のコンストラクト。
- 前記積荷ベアリング領域が不活性外毒素領域である、請求項1に記載のコンストラクト。
- 前記クロストリジウム毒素が受容体結合領域およびトランスロケーション領域を更に含む、無毒クロストリジウム毒素およびインデューサーを含む、人工多能性幹(iPS)細胞を産生する、コンストラクト。
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