JP2013245174A - 母乳中ｉｌ−２７産生増強のためのフラクトオリゴ糖の使用 - Google Patents

Abstract

【課題】母乳中の抗アレルギー免疫活性物質を増加させることで、新生児のアレルギー発症を予防することを可能とする、安全性に優れ日常的に汎用できる方法の提供。
【解決手段】母乳中インターロイキン−２７産生増強におけるフラクトオリゴ糖の使用、並びにフラクトオリゴ糖を用いることを特徴とする母乳中インターロイキン−２７産生増強方法、ここで、フラクトオリゴ糖は好ましくは次式（Ｉ）で表されるオリゴ糖である：Ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）ｎβ（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ（Ｉ）（式中、ｎは、１〜３である）。
【選択図】なし

Description

本発明は、母乳中インターロイキン−２７（以下、ＩＬ−２７と略称することがある）産生増強におけるフラクトオリゴ糖の使用に関する。より詳しくは本発明は、母乳中ＩＬ−２７産生増強におけるフラクトオリゴ糖の使用であって、フラクトオリゴ糖が娠期間および授乳期間に経口摂取されることを特徴とするフラクトオリゴ糖の使用に関する。また本発明は、フラクトオリゴ糖を用いることを特徴とする母乳中ＩＬ−２７産生増強方法に関する。

母乳は児にとって貴重な栄養源であり、生育・発達において大きな役割を担っている。従来、母乳栄養が児のアレルギーを予防すると報告されていたが（非特許文献１）、近年の母乳成分に関する研究から、母乳中に含まれる様々な免疫活性物質が、児のアレルギー疾患の発症に対して正負の両方に働くことが示唆されている（非特許文献２−５）。

妊婦のプロバイオティクス摂取や魚油摂取により母乳中の可溶性ＣＤ１４、イムノグロブリンＡ（以下、ＩｇＡと略称する）、トランスフォーミング増殖因子（以下、ＴＧＦ−βと略称する）などの抗アレルギー免疫活性物質の濃度が増加することが報告されている（非特許文献６−７）。しかし、母乳中の免疫活性物質に対する食品の効果に関する研究は非常に少ない。

プロバイオティクスとは、「経口摂取され、消化管内のフローラ（細菌叢）のバランスを改善することにより、宿主の健康に有益な作用を与える生きた微生物菌体、並びに該微生物菌体を含む医薬品、健康食品、および動物用混合飼料などの製品」をいう。このような微生物菌体として、腸管内にも存在している乳酸菌、糖化菌、および酪酸菌などが知られており、その摂取により消化管内、すなわち口腔内や腸内の細菌叢のバランスの健常化が図られ、疾病の予防や改善がなされると考えられている。

一方、プロバイオティクスと同様に腸内細菌叢に影響を与えるものとしてプレバイオティクスが知られている。プレバイオティクスは、「腸管内に常在している有益に働く細菌の選択的な栄養源となり、それらの増殖を促すか、あるいは有害な細菌の増殖を抑制することで、宿主に有益な効果をもたらす難消化性の食品成分」と定義され、それらには食物繊維類や抵抗性デンプン、オリゴ糖類などが含まれる（非特許文献８）。プレバイオティクスは腸内細菌叢の改善などを目的として日常生活でも使用されており、妊婦を含めて安全性が担保されている。

代表的なプレバイオティクスとして、フラクトオリゴ糖（Ｆｒｕｃｔｏ−Ｏｌｉｇｏｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：以下、ＦＯＳと略称することがある）などの難消化性オリゴ糖類があり、ビフィズス菌などの有益な菌の増殖を促すことが報告されている（非特許文献９−１０）。さらには腸の機能性、病原菌の定着に対する抵抗性、免疫機能、および代謝機能などに影響を及ぼすことによって、ヒトの健康を促進すると考えられている。近年では、アトピー性皮膚炎を発症するモデルマウスであるＮＣ／Ｎｇａマウスの母体にＦＯＳを摂取させると仔マウスのアトピー性皮膚炎発症が抑制されることが報告されている（非特許文献１１）。また、ＦＯＳの摂取によりマウス母乳中の総ＩｇＡ濃度および抗原特異的ＩｇＡ抗体価が増加することが報告されている（特許文献１）。

ＩＬ−２７は、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−３５などと共にＩＬ−１２サイトカインファミリーに属し、Ｔ細胞の分化に関連することが報告されている（非特許文献１２−１３）。ＩＬ−２７はヘルパーＴ１細胞（以下、Ｔｈ１細胞と略称する）の分化を誘導するのみでなく、ヘルパーＴ１７細胞（以下、Ｔｈ１７細胞と略称する）の誘導を抑制し、ＩＬ−１０産生を亢進させて（非特許文献１４−１５）、制御性Ｔ細胞であるＴｒ１細胞を誘導する（非特許文献１６−１７）。ＩＬ−２７非存在下ではヘルパーＴ２細胞（以下、Ｔｈ２細胞と略称する）反応が亢進し、ＩＬ−２７投与によりＴｈ１７細胞およびＴｈ２細胞による免疫反応が抑制されることから、ＩＬ−２７はアレルギーや炎症の抑制に深く関与すると考えられる。近年、ＩＬ−２７の誘導によりアレルギー反応が抑制されたことが報告されている（非特許文献１８−２１）。ＩＬ−２７は活性化樹状細胞やマクロファージから産生される（非特許文献２２）。

特開２００８−１１５１６９号公報。

「ジャーナル オブ ザ アメリカン アカデミー オブ ダーマトロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ）」、２００１年、第４５巻、ｐ．５２０−５２７。 「クリニカル アンド エクスペリメンタル アレルギー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｙ）」、２００６年、第３６巻、第１２号、ｐ．１６０９−１６１５。 「ネイチャー メディシン（Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）」、２００８年、第１４巻、ｐ．１７０−１７５。 「エンルズ オブ アレルギー，アズマ アンド イムノロジー（Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ， Ａｓｔｈｍａ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００９年、第１０３巻、第４号、ｐ．３３２−３３６。 「インターナショナル イムノロジー（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２０１１年、第２３巻、第１２号、ｐ．７４１−７４９。 「クリニカル アンド エクスペリメンタル アレルギー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｙ）」、２００４年、第３４巻、ｐ．１２３７−１２４２。 「クリニカル アンド エクスペリメンタル アレルギー（Ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ａｌｌｅｒｇｙ）」、２００８年、第３８巻、ｐ．１６０６−１６１４。 「ニュートリション リサーチ レビューズ（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｒｅｖｉｅｗｓ）」、２００４年、第１７巻、第２号、ｐ．２５９−２７５。 「ニュートリション アンド キャンサー（Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ）」、１９９６年、第２６巻、第１号、ｐ．２１−２９。 「ジャーナル オブ ペディアトリック ガストロエンテロロジー アンド ニュートリション（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）」、１９９５年、第２１巻、第３号、ｐ．２９７−３０３。 「ブリティッシュ ジャーナル オブ ニュートリション（Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ）」、２０１０年、第１０３巻、第４号、ｐ．５３０−５３８。 「ジャーナル オブ ロイコサイト バイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、２００９年、第８６巻、第６号、ｐ．１２９５−１３０３。 「イムノロジー レターズ（Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ）」、２００８年、第１１７巻、第２号、ｐ．１２３−１３０。 「ネイチャー イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００７年、第８巻、第１２号、ｐ．１３６３−１３７１。 「ネイチャー イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００７年、第８巻、第１２号、ｐ．１３７２−１３７９。 「ネイチャー イムノロジー（Ｎａｔｕｒｅ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００７年、第８巻、第１２号、ｐ．１２８１−１２８３。 「ジャーナル オブ インターフェロン アンド サイトカイン リサーチ（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａｎｄ Ｃｙｔｏｋｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）」、２０１０年、第３０巻、第６号、ｐ．３８１−３８８。 「アレルギー（Ａｌｌｅｒｇｙ）」、２０１１年、第６６巻、第４号、ｐ．４９９−５０８。 「ジャーナル オブ イムノロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００９年、第１８３巻、第１号、ｐ．２５４−２６０。 「エンルズ オブ アレルギー，アズマ アンド イムノロジー（Ａｎｎａｌｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ， Ａｓｔｈｍａ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）」、２００９年、第１０２巻、第３号、ｐ．２２３−２３２。 「バイオケミカル アンド バイオフィジカル リサーチ コミュニケーションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ）」、２００８年、第３７３巻、第３号、ｐ．３９７−４０２。 「アルキブ イムノロジエ エト テラピエ エクスペリメンタリス（Ａｒｃｈｉｖｕｍ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉａｅ ｅｔ ｔｈｅｒａｐｉａｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｉｓ）」、２００８年、第３７３巻、第３号、ｐ．３９７−４０２。

本発明は、母乳中の抗アレルギー免疫活性物質を増加させることで、新生児のアレルギー発症を予防することを可能とする、安全性に優れ日常的に汎用できる方法を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意研究を行い、妊娠中および授乳中にＦＯＳを摂取することにより、免疫関連遺伝子であるＩＬ−２７遺伝子の発現が母乳中細胞で増加すること、並びに妊娠中および授乳中のＦＯＳ摂取により、母乳乳清中のＩＬ−２７濃度が増加することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は、母乳中ＩＬ−２７産生増強におけるＦＯＳの使用に関する。

また本発明は、ＦＯＳを１日１ｇ〜３０ｇの摂取量で連日経口摂取されることを特徴とする、前記ＦＯＳの使用に関する。

さらに本発明は、ＦＯＳを妊娠期間および授乳期間に経口摂取されることを特徴とする、前記ＦＯＳの使用に関する。

さらにまた本発明は、母乳中ＩＬ−２７産生増強におけるＦＯＳの使用であって、ＦＯＳを、１回１ｇ以上の摂取量で１日１回以上を連日経口摂取により、妊娠第２６週から産後１ヶ月まで摂取されることを特徴とするＦＯＳの使用に関する。

また本発明は、母乳中ＩＬ−２７産生増強におけるＦＯＳの使用であって、ＦＯＳを、１回４ｇの摂取量で１日２回連日経口摂取により、妊娠第２６週から産後１ヶ月まで摂取されることを特徴とする、ＦＯＳの使用に関する。

さらに本発明は、ＦＯＳが食品中に含まれていることを特徴とする、前記ＦＯＳの使用に関する。

さらにまた本発明は、ＦＯＳを用いることを特徴とする母乳中ＩＬ−２７産生増強方法に関する。

また本発明は、ＦＯＳを１日１ｇ〜３０ｇの摂取量で連日経口摂取することを特徴とする請求項７に記載の母乳中ＩＬ−２７産生増強方法に関する。

さらに本発明は、ＦＯＳを妊娠期間および授乳期間に経口摂取することを特徴とする請求項７または８に記載の母乳中ＩＬ−２７産生増強方法に関する。

さらにまた本発明は、ＦＯＳを、１回１ｇ以上の摂取量で１日１回以上を連日経口摂取により、妊娠第２６週から産後１ヶ月まで摂取することを特徴とする母乳中ＩＬ−２７産生増強方法に関する。

また本発明は、ＦＯＳを、１回４ｇの摂取量で１日２回連日経口摂取により、妊娠第２６週から産後１ヶ月まで摂取することを特徴とする母乳中ＩＬ−２７産生増強方法に関する。

本発明によれば、母乳中ＩＬ−２７産生増強におけるＦＯＳの使用、並びにＦＯＳを用いることを特徴とする母乳中ＩＬ−２７産生増強方法を提供できる。本発明に係るＦＯＳの使用および母乳中ＩＬ−２７産生増強方法は、安全性に優れ日常的に汎用できる。

ＩＬ−２７はアレルギーや炎症の抑制に深く関与すると考えられており、ＩＬ−２７が誘導されるとアレルギーが抑制されることが報告されている（非特許文献１８−２１）。

したがって本発明により、母乳中ＩＬ−２７産生増強を達成することができ、その結果、新生児のアレルギー発症を予防することができる。

母乳中の免疫関連遺伝子発現および免疫活性物質へのＦＯＳ摂取の影響を検討するための試験プロトコルを説明する図である。図中、ＦＦＱは食事摂取頻度調査（Ｆｏｏｄ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）を意味する。（実施例１） 図１に示す試験の解析対象者の選定過程および選定結果を示す図である。（実施例１） 初乳の乳清中のＩＬ−２７濃度を、ＦＯＳ摂取群とプラセボ群とで比較検討した結果を示す図である。ＦＯＳ摂取群の初乳の乳清中ＩＬ−２７濃度はプラセボ群と比較して有意に高かった。（実施例１） 生後１ヶ月母乳の乳清中のＩＬ−２７濃度を、ＦＯＳ摂取群とプラセボ群とで比較検討した結果を示す図である。ＦＯＳ摂取群の生後１ヶ月母乳の乳清中ＩＬ−２７濃度はプラセボ群と比較して有意に高かった。（実施例１）

本発明の一つの実施形態について詳細に説明するとすれば、以下のとおりである。なお、本発明はこれに限られたものではない。

本発明は、母乳中ＩＬ−２７産生増強における、フラクトオリゴ糖の使用に関する。

フラクトオリゴ糖は、ショ糖に１〜３分子のフラクトースが結合したもので、難消化性のオリゴ糖である。本発明で用いるフラクトオリゴ糖は、フラクトースが１分子以上連結した構造をもつオリゴ糖であれば特に限定されないが、具体的には下記一般式（Ｉ）で表されるオリゴ糖を好ましく例示できる。

Ｇｌｕｃｏｓｙｌ（１→２）（ｆｒｕｃｔｏｓｙｌ）ｎβ（２→１）ｆｒｕｃｔｏｓｅ（Ｉ）（式中、ｎは、１〜３である）。

一般式（Ｉ）において、ｎ＝１のフラクトオリゴ糖として１−ケストース（以下、ＧＦ２と略称する）、ｎ＝２のフラクトオリゴ糖としてニストース（以下、ＧＦ３と略称する）、そしてｎ＝３のフラクトオリゴ糖として１Ｆ−β−フラクトフラノシルニストース（以下、ＧＦ４と略称する）を挙げることができる。本発明で用いるフラクトオリゴ糖は、ＧＦ２、ＧＦ３、およびＧＦ４から選択される少なくとも１種以上を含む混合物であることが好ましく、ＧＦ２を含むことがより好ましい。

本発明で用いるフラクトオリゴ糖が混合物である場合、その混合物の構成比（重量）は、特に限定されないが、グルコースおよびショ糖が０〜５％、ＧＦ２が２９〜４１％、ＧＦ３が４４〜５６％、ＧＦ４が６〜１４％であることが好ましい。

フラクトオリゴ糖は化学合成品でもよく、または、ショ糖を原料として転移酵素、例えばオウレオバシディウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｉｄｉｕｍ）やアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）などのカビのβ−フルクト−フラノシダーゼ（β−ｆｒｕｃｔｏ−ｆｕｒａｎｏｓｉｄａｓｅ）を用いて大量生産され、市販されているものを用いることができる。具体的には、メイオリゴ^{（登録商標）}（株式会社明治製）、ＡＣＩＬＩＧＨＴ^{（登録商標）}（Ｂｅｇｈｉｎ Ｍｅｉｊｉ製）、ＮＵＴＲＡＦＬＯＲＡ^{（登録商標）}（ＧＴＣ Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ Ｃｏｍｐａｎｙ製）などを例示できる。

フラクトオリゴ糖の摂取量は、妊産婦または授乳婦の年齢や身体状態などに依存して適宜変更可能であるが、腸内などの細菌叢改善が期待される濃度および健常人での一日摂取許容量（ＡＤＩ、Ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ Ｄａｉｌｙ Ｉｎｔａｋｅ）を考慮して、フラクトオリゴ糖として１日１ｇ以上、好ましくは１ｇ〜３０ｇ、より好ましくは２〜２０ｇ、さらに好ましくは４ｇ〜１５ｇ、さらにより好ましくは４〜１０ｇである。フラクトオリゴ糖は、少なくとも１日１回の摂取がよく、または１日２回〜数回に分けて摂取しても良い。好ましくは１日２回に分けて摂取する。例えば、１回４ｇの摂取量で１日２回摂取することがより好ましい。

フラクトオリゴ糖を摂取する期間は特に限定されず、日常的に摂取してもよく、あるいは妊産婦または授乳婦の場合、妊娠が判明した時点から授乳終了まで、好ましくは妊娠第２６週から授乳終了まで、さらに好ましくは妊娠第２６週から産後１ヶ月まで摂取することが好ましい。

本発明においてフラクトオリゴ糖は、単独で使用してもよいし、または、医薬組成物や食品組成物として調製して使用してもよい。食品組成物は、２種以上の食品原料や食品素材を組み合わせて調製される組成物をいい、健康食品や栄養組成物を含む意味で用いられる。また、組成物として調製したものを使用する場合、フラクトオリゴ糖に加えて、他の活性物質、あるいは他の薬理学的な活性物質を添加調製して使用してもよい。

フラクトオリゴ糖を医薬組成物として調製する場合、医薬組成物中に含まれるフラクトオリゴ糖の量は、広範囲から適宜選択されるが、通常約０．１〜９９．９重量％、好ましくは０．１〜９９重量％程度の範囲である。

フラクトオリゴ糖の摂取経路は特に限定されないが、経口摂取がより好ましい。フラクトオリゴ糖を経口摂取するときの形態は、例えば、錠剤、被覆錠、カプセル剤、顆粒剤、散剤、溶液、シロップ剤、乳液または分散性粉末による経口摂取を挙げることができる。これらの各種製剤は、常法に従ってフラクトオリゴ糖に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用し得る既知の補助剤を用いて製剤化することができる。

フラクトオリゴ糖を食品組成物として調製する場合、固形物重量に対して０．１〜７０重量％のフラクトオリゴ糖を含むように調製することが好ましい。

食品組成物として使用する場合、具体的には、妊産婦・授乳婦用栄養組成物、例えば妊産婦・授乳婦用粉乳や妊産婦・授乳婦用食品などにフラクトオリゴ糖を配合して調製したものを使用できる。

栄養組成物として使用する場合、具体的には、各種飲食品、例えば牛乳、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、クリーム、アイスクリームなどの乳製品、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、妊産婦・授乳婦用粉乳などの食品や栄養食品など）にフラクトオリゴ糖を添加し、これを摂取してもよい。フラクトオリゴ糖をそのまま使用したり、他の食品ないし食品成分と混合したりするなど、通常の栄養組成物における常法にしたがって使用できる。また、その性状についても、通常用いられる飲食品の状態、例えば、粉末や顆粒状などの固体状、ペースト状、液状ないし懸濁状のいずれでもよい。

フラクトオリゴ糖を配合した栄養組成物の成分は、特に限定されないが、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類などを主成分とすることができる。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、α―カゼイン、β―カゼイン、κ−カゼイン、β―ラクトグロブリン、α―ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質などの動植物性タンパク質、これら加水分解物；バター、乳性ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖などの各種乳由来成分などを挙げることができる。糖質としては、糖類、加工澱粉（テキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテルなど）、食物繊維などを挙げることができる。脂質としては、例えば、ラード、魚油など、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油などの動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油などの植物性油脂などを挙げることができる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンＡ、カロチン類、ビタミンＢ群、ビタミンＣ、ビタミンＤ群、ビタミンＥ、ビタミンＫ群、ビタミンＰ、ビタミンＱ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などを挙げることができ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどを挙げることができる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸などを挙げることができる。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用することができ、合成品及び／又はこれらを多く含む食品を用いてもよい。

以下、実施例を用いて本発明を詳細に説明するが、本発明に係る技術的範囲は以下の実施例に限定されるものではない。

＜対象と方法＞
１．試験対象およびサンプル
妊婦を対象として、プレバイオティクスであるフラクトオリゴ糖摂取群（以下、ＦＯＳ群と称する）とショ糖摂取群（以下、プラセボ群と称する）の２群を設定し、二重盲検ランダム化比較試験を施行した。妊婦のうち自由意思による参加同意が得られた健常妊婦を本試験の対象とした。試験デザインは平行群間比較とした。また、結果の統計解析はマン・ホイットニーのＵ検定（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ ｔｅｓｔ）またはピアソンのχ二乗検定（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ ｔｅｓｔ）により行った。

具体的には、試験対象者の８４名は二重盲検法に加え、ランダム化を行ったのち、ＦＯＳ群４１名、プラセボ４３名に振り分けた。試験薬の投与方法は、朝食後および夕食後それぞれ４ｇの、１日計８ｇを設定し、妊娠２６週から出産後１か月までの連日摂取とした（図１）。

対象者には試験薬の摂取確認および食物摂取頻度調査を行い、市販のオリゴ糖製品を週２日以上摂取している対象者および試験薬の摂取頻度が８０％以下の対象者に係る結果は結果解析から除外した（図２）。その結果、除外対象にならない数は、プラセボ群が２９名、ＦＯＳ群が３５名であった。これらの対象者について食事習慣および疾患既往歴などの対象者背景を比較した結果、２群間で大きな差はみられなかった（表１および表２）。

対象者からは初乳および生後１か月母乳を採取した。それらの母乳について、母乳中に含まれる細胞の遺伝子発現解析および乳清中のタンパク質測定を行った。母乳サンプルは採取して常温のまま保存し、２４時間以内に各処理を行った。母乳は、まず、２５℃にて２５００ｒｐｍで５分間の条件で遠心処理し、乳清成分と細胞成分とを分離した。分離した乳清成分は、４℃にて１００００ｒｐｍで１０分間の条件で再度遠心処理を行い、乳性脂肪成分が混合しないように分離し、−８０℃にて保存した。一方、遠心処理により分離した母乳中の細胞から、総ＲＮＡ（Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ）をＲＮイージー^{（登録商標）} ミニキット（ＲＮｅａｚｙ^（ＴＭ） Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて抽出した。また、総ＲＮＡ濃度が低いサンプルにおいてはＲＮイージー マイクロキット（ＲＮｅａｚｙ Ｍｉｃｒｏ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて総ＲＮＡの濃縮を行った。抽出した総ＲＮＡは測定に用いるまで−８０℃にて保存した。

２．母乳中細胞の網羅的遺伝子発現解析
母乳中細胞の網羅的遺伝子発現解析は、マイクロアレイを用いて実施した。まず、母乳中細胞から抽出した総ＲＮＡを材料として、遺伝子発現マイクロアレイ用ラベル化キット、Ｌｏｗ ｉｎｐｕｔ ＱｕｉｃｋＡｍｐ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ｋｉｔ（ｏｎｅ ｃｏｌｏｒ）^{（登録商標）}（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）にてメッセンジャーＲＮＡ（以下、ｍＲＮＡと略称する）の増幅およびラベル化を行った。得られたｍＲＮＡをサンプルとし、全ヒトゲノム（Ｗｈｏｌｅ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ）オリゴＤＮＡマイクロアレイキット（４×４４Ｋ）^{（登録商標）}（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いてマイクロアレイを施行した。

マイクロアレイによる測定結果の解析は、次のように行った。マイクロアレイチップ上の各スポットからはシグナル強度などが産出され、チップ間との補正後、最終的なシグナル強度として結果が出力される。遺伝子発現が検出されたものは７５％タイル ノーマリゼーション（Ｔｉｌｅ Ｎｏｒｍａｌｉｚａｔｉｏｎ）を用いてチップ間の補正を行った。このノーマライズ方法は、アジレントテクノロジーズ社が推奨している方法で、チップに搭載されている４１０００プローブのシグナル値（測定値）をランキングし、検出された全プローブの中の７５％にあたる遺伝子のシグナル値で、他のシグナル値を割った値を用いる。さらに解析に用いる場合は、ｌｏｇ２変換した値を用いた。測定結果の解析は統計解析ソフトＲを使用し、ＦＯＳ群とプラセボ群での群間比較を行った。検出された各遺伝子に関する情報はＤＡＶＩＤ（Ｔｈｅ Ｄａｔａｂａｓｅ ｆｏｒ Ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ， Ｂｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ｈｔｔｐ：／／ｄａｖｉｄ．ａｂｃｃ．ｎｃｉｆｃｒｆ．ｇｏｖ／））やＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／））などの統合データベースを参考にした。

３．乳清中のＩＬ−２７濃度測定
乳清中のＩＬ−２７濃度測定は、ヒトＩＬ−２７ デュオセット^{（登録商標）}（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）のＥＬＩＳＡキットを使用して行った。検出最小値は１５６．２５ｐｇ／ｍｌである。サンプルは試薬希釈液（Ｒｅａｇｅｎｔ Ｄｉｌｕｅｎｔ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）にて１００倍に希釈し、二重アッセイ（Ｄｕｐｌｉｃａｔｅ ａｓｓａｙ）にて測定した。測定濃度が低値を示したサンプルは希釈せず再測定を行った。なお、測定ではＲ＆Ｄ システムズ社製の洗浄バッファーおよび基質溶液、並びにコスター社製のコスターＥＩＡプレートを使用した。

データの統計解析には、エス・ピー・エス・エス株式会社のソフト、Ｄｒ．ＳＰＳＳを使用した。このソフトは、対象者背景、摂取食品の比較、および各測定結果についてのＦＯＳ群とプラセボ群での２群間比較統計解析に使用した。

＜結果＞
１．母乳中細胞の網羅的遺伝子発現解析の結果
初乳由来サンプルから、プラセボ群８例（ｎ＝８）およびＦＯＳ群８例（ｎ＝８）のサンプルを無作為に抽出し、マイクロアレイを行った。用いたサンプルの対象者背景に差は認められなかった。

マイクロアレイチップに搭載された全プローブ数４１０００のうち、上記計１６サンプルから検出されたプローブ数は１９５３４（４７．２％）であった。これらのプローブのうち、プラセボ群とＦＯＳ群を比較したときに統計学的有意な差があり、かつシグナル値に±１．５倍以上の差がみられたプローブ数は８８（０．４５％）であった。結果は、プラセボ群での平均シグナル値を１としたときの、ＦＯＳ群の平均シグナル値の倍率変化（Ｆｏｌｄ ｃｈａｎｇｅ、以下、Ｆｃ値と略称する）で比較した。

有意差の認められた８８プローブをもとにヒートマップを作成し、各サンプルの遺伝子発現タイプがどのように分類されているか階層クラスター分析を行った。すると縦軸の左側に６サンプル、右側に１０サンプルと大きく２群に分類され、プラセボ群とＲＯＳ群にクラスタリングされた。一部、プラセボ群の２サンプルが右側の群に含まれており、ＦＯＳ群に近い遺伝子発現がみられた。

初乳由来サンプルで２群間に有意差が検出された８８プローブのうち、ＦＯＳ群でシグナル値が高い遺伝子の上位５つを挙げると、最も発現量に差異がみられたものはＭＡＴＮ３（ｍａｔｒｉｌｉｎ ３）であり、プラセボ群に比べて２．４６倍高い値であった。以下は、ＺＮＦ４４（ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ４４）：Ｆｃ値２．４２、ＧＤＦ１０（ｇｒｏｗｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １０）：Ｆｃ値２．３６、ＨＥＰＨ（ｈｅｐｈａｅｓｔｉｎ）：Ｆｃ値２．３３、ＴＦＰＩ（ｔｉｓｓｕｅ ｆａｃｔｏｒ ｐａｔｈｗａｙ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（ｌｉｐｐｏｐｒｏｔｅｉｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ））：Ｆｃ値２．１４の順であった。

反対にＦＯＳ群でシグナル値が低い遺伝子の下位５つを挙げると、最も発現量に差異がみられたものはＣ１２ｏｒｆ７５（ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １２ ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ ７５）で、プラセボ群に比べて５．５９倍低い値を示した。続いてＧＳＴＭ５（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｍｕ ５）：Ｆｃ値３．８４、ＴＴＬＬ１２（ｔｕｂｌｉｎ ｔｙｒｏｓｉｎｅ ｌｉｇａｓｅ−ｌｉｋｅ ｆａｍｉｌｙ，ｍｅｍｂｅｒ１２）：Ｆｃ値２．７４、ＨＯＸＢ３（ｈｏｍｅｏｂｏｘ Ｂ３）：Ｆｃ値２．５６、ＡＢＣＣ４（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ，ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ Ｃ（ＣＦＴＲ／ＭＲＰ），ｍｅｍｂｅｒ ４）：Ｆｃ値２．３５の順であった。

１か月母乳由来サンプルからも、プラセボ群３例（ｎ＝３）およびＦＯＳ群３例（ｎ＝３）のサンプルを無作為に抽出し、マイクロアレイを行った。用いたサンプルの対象者背景に差は認められなかった。

マイクロアレイチップに搭載された全プローブ数４１０００のうち、上記計６サンプルから検出されたプローブ数は１９５３４（４７．２％）であった。これらのプローブのうち、プラセボ群とＦＯＳ群を比較したときに統計学的有意な差があり、かつシグナル値に±１．５倍以上の差がみられたプローブ数は１９１（０．５２％）であった。２群間の比較は、初乳由来サンプルの２群間比較に用いた方法と同じ方法で行った。

１か月母乳由来サンプルで２群間に差異が検出された１９１プローブをもとにヒートマップを作成し、各サンプルの遺伝子発現タイプがどのように分類されているか階層クラスター分析を行った。すると縦軸の左側に３サンプル、右側に３サンプルと大きく２群に分類され、プラセボ群とＦＯＳ群にクラスタリングされた。

１か月母乳由来サンプルで検出された１９１プローブのうち、ＦＯＳ群でシグナル値が高い遺伝子の上位５つを挙げると、ＡＢＣＡ１３（ＡＴＰ−ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｓｓｅｔｔｅ，ｓｕｂ−ｆａｍｉｌｙ Ａ（ＡＢＣ１），ｍｅｍｂｅｒ １３）が最も群間の差が大きく、プラセボ群と比較してＦＯＳ群で６．９８倍高値を示した。続いてＧＳＴＴ２（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ ｔｈｅｔａ ２）：Ｆｃ値６．７０、ＳＡＭＤ１０（ｓｔｅｒｉｌｅ ａｌｐｈａ ｍｏｔｉｆ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ １０）：Ｆｃ値４．６８、ＩＬ−２７：Ｆｃ値４．４５、ＤＥＮＮＤ２Ａ（ＤＥＮＮ／ＭＡＤＤ ｄｏｍａｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ２Ａ）：Ｆｃ値４．３８の順であった。

反対にＦＯＳ群でシグナル値が低い遺伝子の下位５つを挙げると、最も発現量に差異がみられたものはＣＴＡＧ２（ｃａｎｃｅｒ／ｔｅｓｔｉｓ ａｎｔｉｇｅｎ ２）でプラセボ群と比較して５．３７倍低い値だった。次いでＣＤＫＮ２Ａ（ｃｙｃｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｋｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ２Ａ）：Ｆｃ値３．７４、Ｃ１Ｒ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ １，ｒ ｓｕｂｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）：Ｆｃ値３．３７、ＧＰＸ７（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ７）：Ｆｃ値３．２８、ＲＡＢ３６（ＲＡＢ３６，ｍｅｍｂｅｒ ＲＡＳ ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ（ＲＡＢ３６））Ｆｃ値：２．９６の順であった。

２．乳清中ＩＬ−２７の濃度測定結果
マイクロアレイの結果より、ＦＯＳ群で遺伝子発現量が高値を示したサイトカインＩＬ−２７に注目し、母乳中の濃度測定を行った。ＩＬ−２７はアレルギーや炎症の抑制に深く関与すると考えられ、ＩＬ−２７誘導によりアレルギー反応が抑制されるという報告がある（非特許文献１８−２１）。

１か月母乳中のＩＬ−２７を２群間で比較すると、プラセボ群（ｎ＝２９）では分布範囲が０．１５６−２３．４ｎｇ／ｍｌおよび中央値が０ｎｇ／ｍｌであり、ＦＯＳ群（ｎ＝３５）では分布範囲が０．１５６−３２．６ｎｇ／ｍｌおよび中央値が１．７ｎｇ／ｍｌであった。このように、ＦＯＳ群が統計学的有意（ｐ＝０．０４０）に高値を示した（図３）。

また、初乳中のＩＬ−２７を２群間で比較すると、プラセボ群（ｎ＝２９）では分布範囲が０．１５６−９５．８ｎｇ／ｍｌおよび中央値が０．２ｎｇ／ｍｌであり、ＦＯＳ群（ｎ＝３５）では分布範囲が０．１５６−４４．６ｎｇ／ｍｌおよび中央値が２．４ｎｇ／ｍｌであった。このように、乳中のＩＬ−２７も、１か月母乳中のＩＬ−２７と同様に、ＦＯＳ群が統計学的有意（ｐ＝０．０２７）に高値を示した（図３）。

上記結果から、妊娠中および授乳中における母体のＦＯＳ摂取が母乳中細胞の遺伝子発現に影響を与えること、およびＦＯＳ摂取により母乳中細胞で顕著に発現が増加する遺伝子の中に、アレルギーと関連するＩＬ−２７の遺伝子が含まれていることが判明した。ＦＯＳ群の１ヶ月母乳中細胞でのＩＬ−２７遺伝子発現はプラセボ群と比較して有意に高かったが、一方、初乳中細胞でのＬ−２７遺伝子発現には差異が認められなかった。初乳には約１０^６／ｍｌの細胞が含まれているが、初乳の分泌には個人差が大きく、また含まれている細胞の種類や割合も個人によって大きく異なる。それに対して１か月母乳では母乳の産生量も安定し、細胞の割合の個人差も比較的少ないと思われる。このことから、初乳中細胞でのＩＬ−２７遺伝子発現に差異がみられなかった理由として、母乳細胞中に含まれるＩＬ−２７発現細胞、例えばマクロファージの割合の個人差などの影響を考えることができる。

さらに、ＦＯＳ摂取により乳清中ＩＬ−２７濃度がプラセボ群と比較して有意に増加することが、初乳および１ヶ月母乳のいずれにおいても明らかになった。一方、従来プロバイオティクス投与により増加するとの報告がある母乳中ＴＧＦ−β、総ＩｇＡ、可溶性ＣＤ１４の濃度にＦＯＳ群とプラセボ群との間で差異はなかった。したがって、プレバイオティクスであるＦＯＳ摂取による母乳中ＩＬ−２７増加のメカニズムは、プロバイオティクス摂取による遺伝子発現のメカニズムとは異なる可能性も考えられる。

本発明は、抗アレルギー免疫活性物質であるＩＬ−２７の母乳中の含有量を増加させることができるため、新生児のアレルギー発症の予防などに利用できる。

Claims (11)

1. 母乳中インターロイキン−２７産生増強におけるフラクトオリゴ糖の使用。
2. フラクトオリゴ糖を１日１ｇ〜３０ｇの摂取量で連日経口摂取されることを特徴とする請求項１に記載のフラクトオリゴ糖の使用。
3. フラクトオリゴ糖を妊娠期間および授乳期間に経口摂取されることを特徴とする請求項１または２に記載のフラクトオリゴ糖の使用。
4. 母乳中インターロイキン−２７産生増強におけるフラクトオリゴ糖の使用であって、フラクトオリゴ糖を、１回１ｇ以上の摂取量で１日１回以上を連日経口摂取により、妊娠第２６週から産後１ヶ月まで摂取されることを特徴とするフラクトオリゴ糖の使用。
5. 母乳中インターロイキン−２７産生増強におけるフラクトオリゴ糖の使用であって、フラクトオリゴ糖を、１回４ｇの摂取量で１日２回連日経口摂取により、妊娠第２６週から産後１ヶ月まで摂取されることを特徴とするフラクトオリゴ糖の使用。
6. フラクトオリゴ糖が食品中に含まれていることを特徴とする請求項１に記載のフラクトオリゴ糖の使用。
7. フラクトオリゴ糖を用いることを特徴とする母乳中インターロイキン−２７産生増強方法。
8. フラクトオリゴ糖を１日１ｇ〜３０ｇの摂取量で連日経口摂取することを特徴とする請求項７に記載の母乳中インターロイキン−２７産生増強方法。
9. フラクトオリゴ糖を妊娠期間および授乳期間に経口摂取することを特徴とする請求項７または８に記載の母乳中インターロイキン−２７産生増強方法。
10. フラクトオリゴ糖を、１回１ｇ以上の摂取量で１日１回以上を連日経口摂取により、妊娠第２６週から産後１ヶ月まで摂取することを特徴とする母乳中インターロイキン−２７産生増強方法。
11. フラクトオリゴ糖を、１回４ｇの摂取量で１日２回連日経口摂取により、妊娠第２６週から産後１ヶ月まで摂取することを特徴とする母乳中インターロイキン−２７産生増強方法。