JP2013200260A - 電気化学測定用カーボン電極及びその製造方法 - Google Patents

Abstract

【課題】電極として十分な導電性と広い電位窓を有し、なおかつ核酸もしくはアミノ酸、又はそれらの代謝物もしくは酸代謝物中間体を構成成分として有する生体分子に対して優れた電極触媒活性を有する（電子移動速度が十分に速い）電気化学測定用カーボン電極を提供する。
【解決手段】本電気化学測定用カーボン電極は、測定対象溶液中で核酸もしくはアミノ酸、又はそれらの代謝物もしくは酸代謝物中間体を構成成分として有する生体分子を酸化又は還元反応により検出する電気化学測定用のカーボン電極であって、炭素間のsp²結合とsp³結合が混在するグラファイト置換型CN結合を含む微結晶ドメインより構成され、グラファイトカーボン電極よりも広い範囲の電位窓を有することを特徴とする。
【選択図】なし

Description

本発明は窒素含有カーボン電極及びその製造方法、詳しくは生体、医療、環境、食品などの分析に用いるために好適な電気化学分析用あるいは電気化学センサー用の電気化学測定用カーボン電極及びその製造方法に関するものである。

溶液中での電気化学反応を利用した電気化学測定法は、溶液中の微量重金属の同定や濃度計測、生体中の微量成分の検出に利用されている。この電気化学測定法は、電極を測定対象となる溶液に接触させ、この溶液に電位を印加して該溶液に含まれる測定対象分子に酸化、或いは、還元反応を生じさせ、その結果生じる電流変化を検出する方法であり、使用される電極は、広い電位範囲（電位窓）で電流変化を検出できることや、検出の際にノイズ成分となる充電電流や電気化学的に活性な電極表面に存在する置換基の電気化学反応によって生じる電流の影響を抑えて測定できることが重要である。この検出可能な電位窓は、電極の材質、溶媒、支持電解質などによって異なる。一方、電極のノイズ成分は、電極の材質と構造や表面積などにより変化する。電気化学測定に用いる電極材料としては、金、白金、パラジウムなどの貴金属材料、水銀などの金属材料の他、酸化インジウムなどの半導体材料、結晶性カーボン、カーボンファイバー、グラッシーカーボン、ボロン−ドープダイヤモンドなどの各種カーボン材料が使用される。中でもカーボン材料は、耐食性が高く、一般的に金属材料に比較し酸化還元側ともに比較的広い電位窓を有するために幅広い種類の分子の測定に利用できることから、高速液体クロマトグラフィーやキャピラリー電気泳動装置の様に多くの分析対象分子を同時に分離検出する装置の検出用電極として広く利用されている。本出願人らは、特許文献１において、広い電位窓を有し、ノイズの要因となる充電電流を低くすることができる電気化学測定用カーボン電極を、sp²結合とsp³結合が混在した微結晶ドメインから構成されることで実現することを提案した。

ところで、貴金属、金属電極は炭素材料電極に比べその電位窓は狭いものの、分析対象物質によっては、高い電極（触媒）活性を示す。例えば、グルコース、コレステロール、グルタミン酸など種々の生体物質は、それぞれ対応する酸化酵素により酸化分解され、過酸化水素を生成する。一般的に白金電極は過酸化水素に対する過電圧が小さいため、低い電位で過酸化水素を電気化学的に酸化もしくは還元し電気化学的に検出できる。一方、従来のカーボン系電極は上述の過酸化水素に対して電極活性が低い。このためカーボン系電極で過酸化水素のような電子移動の遅い物質を検出するには貴金属、金属電極よりも高い電圧を要するという問題点があった。

カーボン電極材料の活性を向上させる方法としては、カーボン材料中に他の元素成分を混在させる材料が古くから知られている。活性中心となる異元素はさまざま提案されており、例えば鉄やコバルト、窒素、ホウ素などを異元素として含む材料は、燃料電池のカソード反応である酸素還元反応（Oxygen Reduction Reaction (ORR)）に活性を示すことが報告されており、近年注目を集めている（特許文献２〜６、非特許文献１〜５）。これらの材料はカーボンアロイ触媒と呼ばれ、白金代替触媒材料としての実現が期待されている。中でも上述の窒素を含有するカーボン材料も高いORR活性を示すことが古くから知られ、金属フリーの白金代替材料としてその実現が期待されている（特許文献４〜７、非特許文献４〜５）。

窒素含有カーボンアロイの作製方法としては、いくつかの方法が知られており、下記に示すような方法が知られている。

１．窒素を含む高分子前駆体物質の炭素化
２．炭素材料に窒素を導入、炭素化
いずれの場合も窒素含有カーボンを作製する際、窒素による触媒効果を達成するために窒素含有カーボン前駆体の種類や量（もしくはカーボンと窒素含有物の組成比）や、焼成温度等によって触媒特性が大きく異なることが多く報告されていることから、これらの精密な選定、制御ならびに炭素化の高温焼結過程が必要である。また、窒素の導入によるORR活性向上に関する研究は精力的にされているものの、窒素成分導入によって電気化学分析や電気化学バイオセンサーで重要な関連物質に対する電極活性の向上に関する研究はほとんどない（非特許文献６）。

特開２００６−９０８７５号公報 特開２００７−２０７６６２号公報 ＷＯ２００８／１２７８２８ Ａ１ 特開２００４−３６２８０２号公報 特開２００４−３３０１８１号公報 特開２００６−３３１８４６号公報 特開２００９−２９１７０６号公報

Bashyamら、Nature 443, 63 (2006) Lefevreら、Science, 324, 713 (2009) 尾崎ら、Carbon, 44, 1324 (2006) 池田ら、J. Phys. Chem. C, 112, 14707 (2008) 尾嶋ら、J. Power Sources, 187, 93 (2009) Wangら、ACS Nano, 4, 1790 (2010)

上記のような背景から、本発明は、電極として十分な導電性と広い電位窓を有し、なおかつ核酸若しくはアミノ酸、又はそれらの代謝物もしくは酸代謝物中間体を構成成分として有する生体分子に対して優れた電極触媒活性を有する（電子移動速度が十分に速い）電気化学測定用カーボン電極、及び、その簡便な製造方法を提供することを課題とするものである。

本発明者らは、新しい導電性ECRカーボン電極の発明（特許文献１参照）を踏まえて鋭意研究したところ、電子サイクロトロン共鳴スパッタに代表されるスパッタ法によってカーボン薄膜の作成を行う際に、高温焼結手法を用いることなく、窒素ガスを導入しながらカーボンをスパッタすると、sp²結合とsp³結合のハイブリッド構造を有し、グラファイト置換側CN結合を含む導電性のECRスパッタカーボン薄膜が得られ、生体高分子に対しても電極触媒活性が大きく向上することを見出し、本発明を完成したものである。

すなわち、本発明は以下の１〜１０の構成を採用するものである。

１．測定対象溶液中で核酸もしくはアミノ酸、又はそれらの代謝物もしくは酸代謝物中間体を構成成分として有する生体分子を酸化又は還元反応により検出する電気化学測定用のカーボン電極であって、炭素間のsp²結合とsp³結合が混在するグラファイト置換型CN結合を含む微結晶ドメインより構成され、グラファイトカーボン電極よりも広い範囲の電位窓を有することを特徴とする電気化学測定用カーボン電極。

２．測定対象溶液中で生体分子からの直接電子移動反応に対して触媒活性を示すことを特徴とする上記１に記載の電気化学測定用カーボン電極。

３．炭素間のsp³結合のsp²結合に対するsp³結合の原子比が0.1〜0.4の範囲にあることを特徴とする上記１又は２に記載の電気化学測定用カーボン電極。

４．窒素元素の炭素原子に対する原子比が0.2以下（０は含まない）であることを特徴とする上記１から３のいずれかに記載の電気化学測定用カーボン電極。

５．CN結合のうちグラファイト置換型CN結合が最も多いことを特徴とする上記１から５のいずれかに記載の電気化学測定用カーボン電極。

６．上記１から５のいずれかの電気化学測定用のカーボン電極の製造方法であって、基板上にスパッタ法によりカーボン膜を形成すると同時に窒素成分ガスを導入することにより窒素含有カーボン膜からなるカーボン電極を形成することを特徴とする電気化学測定用カーボン電極の製造方法。

７．スパッタ法として、電子サイクロトロン共鳴スパッタ法、マグネトロンスパッタ法、RFスパッタ法、DCスパッタ法又はイオンビームスパッタ法を用いることを特徴とする上記５に記載の電気化学測定用カーボン電極の製造方法。

８．上記１から５のいずれかの電気化学測定用のカーボン電極を備えることを特徴とする電気化学測定用デバイス。

９．生体分子において電気化学反応に対する触媒の効果を示すことを特徴とする上記７に記載の電気化学測定用デバイス。

１０．上記１から５のいずれかの電気化学測定用カーボン電極を用い、測定対象溶液中で核酸もしくはアミノ酸、又はそれらの代謝物もしくは酸代謝物中間体を構成成分として有する生体分子を酸化又は還元反応により検出することを特徴とする電気化学測定方法。

本発明によれば、窒素含有高分子の前駆体、ならびにそれらの炭素化高温過程を経ることなく、CN結合のうちグラファイト置換型CN結合が優位な窒素含有カーボン電極を容易に作製でき、また得られた窒素含有カーボン電極は、従来のカーボン電極では高い電圧が必要であった物質をより低電位で安定に計測することが可能となった。また、従来電気化学反応の見られなかった分子、とりわけ電子移動が遅い生体分子などに対する高い電極活性を示すことから、より高感度な生体電気化学分析、ならびに酵素などの直接電子移動を利用した新しい生体電気化学分析が可能なカーボン電極を提供できる。

実施例２において、ECRスパッタカーボン薄膜における、X線光電子分光法を用いた、C1s、N1s由来のピークの波形分離を示す図、ならびに得られた薄膜電極の電位窓（実線）を従来のグラファイト電極の電位窓（点線）と比較した図である。 実施例３において、ECRスパッタカーボン薄膜電極（点線）と窒素含有ECRスパッタカーボン薄膜（実線）を作用電極として用いての、アデニンのサイクリックボルタモグラムを示す図である。 実施例３において、ECRスパッタカーボン薄膜電極（点線）と窒素含有ECRスパッタカーボン薄膜（実線）を作用電極として用いての、シトシンのサイクリックボルタモグラムを示す図である。 実施例３において、ECRスパッタカーボン薄膜電極（点線）と窒素含有ECRスパッタカーボン薄膜（実線）を作用電極として用いての、NADHのサイクリックボルタモグラムを示す図である。 実施例３において、ECRスパッタカーボン薄膜電極（点線）と窒素含有ECRスパッタカーボン薄膜（実線）を作用電極として用いての、シトクロムcのサイクリックボルタモグラムを示す図である。

以下、本発明を実施形態により詳細に説明する。

本発明の電気化学測定用カーボン電極は、測定対象溶液中で核酸又はアミノ酸、およびそれらの代謝物もしくは酸代謝物中間体を構成成分として有する生体分子を酸化又は還元反応により検出するものである。そして、炭素間のsp²結合とsp³結合が混在するグラファイト置換型CN結合を含む微結晶ドメインより構成され、グラファイトカーボン電極よりも広い範囲の電位窓を有することを特徴とする。

本発明におけるカーボン薄膜において、炭素間結合におけるsp³結合の量は、X線光電子分光法（XPS）を用いて評価可能であり、図1(a)に示す様にsp²結合＋sp³結合に対して10〜30％とすることが望ましい。炭素間結合がsp²結合とsp³結合からなり、sp³結合の量を10〜30％としたカーボン膜は、導電性のsp²結合に由来して、電極として使用するに十分な導電性を有するとともに、導電性は極めて低いが高い強度をもたらすsp³結合に由来して、電極として使用するに十分な強度を有する。sp²結合＋sp³結合に対するsp³結合の量は、後述するECRスパッタ法において例えば照射イオンの加速電圧を調整することにより制御可能である。

本発明の電気化学測定用カーボン電極は、その特有な製造方法により、グラファイト置換型CN結合を含む微結晶ドメインより構成される。この微結晶ドメイン中には、CN結合として、図１(b)に示すように、グラファイト置換型、ピリジン型、ピロール型等があるが、なかでもグラファイト置換型CN結合が最も多いことが好ましく、その割合は50%以上であることが、生体分子に対する高い電極活性を示す観点から好ましい。また、カーボン薄膜に含まれる窒素量も汎用的にX線光電子分光法（XPS）を用いて評価可能であり、窒素原子の炭素原子に対する原子比は０．２以下（０は含まない）が同様の観点から好ましい。カーボン薄膜は、特性にばらつきの少ないカーボン電極を作製する上で、製膜時の中心線平均粗さ（Ra）が1.5 nm以下であることが望ましい。カーボン薄膜の厚さは30nm〜200nm程度が、十分な導電性を確保し、所要の特性を得るために好ましい。

本発明におけるカーボン薄膜電極は、使用用途に応じて選択した基板にスパッタ法によりカーボン薄膜を堆積させることによって作製することができる。そのような形成法としては、好適には、電子サイクロトロン共鳴（ECR）スパッタ法が挙げられるが、マグネトロンスパッタ法、ＲＦスパッタ法、DCスパッタ法又はイオンビームスパッタ法を用いることができる。また、基板としては、例えば、導電性基板であれば、ドープしたシリコン単結晶ウエハが使用され、絶縁基板であればガラスやポリジメチルシロキサン（PDMS）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリスチレン、アクリル樹脂、エポキシ樹脂、オレフィン樹脂、等の各種高分子であって表面が平坦なものなどを使用することができる。

本発明の電気化学測定用カーボン電極によって測定される対象物質としては、バイオセンサーの分野で重要な酸素、過酸化水素、NADH、NADPHならびにグアニン、アデニン、チミン、シトシン、ウラシルなどの全ての核酸分子、核酸分子の誘導体、ならびにそれらにリボースやデオキシリボースが結合したヌクレオシド類、リボースもしくはデオキシリボースとリン酸基が結合したヌクレオチド類などの低分子が挙げられる。また、上述の核酸塩基から成るデオキシリボヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチド、DNA、cDNA、リボヌクレオチドからなるRNA、mRNA、sRNAなど、もしくはアミノ酸、アミノ酸代謝物やアミノ酸代謝中間物などが挙げられる。さらには、活性中心に金属イオンやフラビン、キノン系の酸化還元部位を有する酵素、たとえば、シトクロムｃ、シトクロムP450、フルクトースデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼなどの巨大分子の直接電子移動の評価が挙げられる。

以下、本発明について実施例及び比較例を用いて詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。また、電気化学的な測定法として下記ではサイクリックボルタンメトリーによる実施例を示すが、その他にも、スクウェアウェイブ（矩形波）ボルタンメトリー、デイファレンシャル（微分）パルスボルタンメトリー、ノーマルパルスボルタンメトリー、交流ボルタンメトリー、等の手法が適宜使用可能である。
＜実施例１＞ 窒素含有カーボン薄膜の作製
本発明の実施の形態に係わる窒素含有カーボン薄膜電極をECRスパッタ装置を用いてシリコンウエハー（サイズ：２インチ）上に形成する方法について説明する。ここでは、スパッタガスとしてアルゴン（Ar）と窒素（N₂）を、ターゲットとして焼結カーボン（C）を用い、スパッタガスのガス圧は、6×10^-3〜1×10^-1 Paとした。基板加熱は行わず室温とした。マイクロ波パワーは500W、ターゲット電圧は500Vとした。この際、スパッタガス中の窒素ガス流量を変えることによりカーボン膜中の窒素含有比を制御した。
＜実施例２＞ 窒素含有カーボン薄膜の表面特性評価
次に、sp²結合とsp³結合の比、ならびに窒素の成分比とその結合状態を、X線光電子分光法（XPS、島津製作所）を用いて観測した。図1に示した様に、作製したECRスパッタカーボン薄膜の炭素成分C1s（図1(a)）はsp²結合成分の強度が最も強く、次に強度が高い結合成分はsp³結合成分が検出・評価される。本実施例の図１より、炭素間のsp²結合とsp³結合との和に対するsp³結合の原子比の値は、0.2であった。また、窒素元素の炭素原子に対する原子比の値は、0.16であった。さらに、窒素成分N1s（図1(b)）はグラファイト置換型CN結合成分がピリジン型CN結合成分よりも強度が強い結果が得られる。以上の特徴を有する窒素含有スパッタ薄膜は、図１(c)に示したようにグラファイト電極よりも電位窓が広い結果を得た。
＜実施例３＞ 窒素含有カーボン薄膜の電極特性評価
作製された窒素含有カーボン薄膜上に直径1mmの穴を開けた絶縁テープを貼り付けて電極面積が既知のカーボン薄膜電極とした。窒素含有カーボン電極ならびに、窒素を含有しないスパッタナノカーボン電極を、それぞれpH7.0の0.05mol／Lリン酸緩衝液中に挿入し、ポテンシオスタット（CHIインスツルメンツ社製、ALS760）に参照電極（Ag/AgCl）、対極（Pt）とともに接続した。ここにアデニン（100 μmol／L）、シトシン（100 μmol／L）、NADH（100 μmol／L）、シトクロムc（100 μmol／L）となるように添加し、一定の走引速度50mV/秒と設定してサイクリックボルタンメトリー測定を行った場合の結果を図２〜５に示した。図２にはアデニンの結果、図３にはシトシンの結果、図４にはNADHの結果、図５にはシトクロムcの直接電子移動の結果をそれぞれ示す。

窒素成分を10〜13at.%含むカーボン膜は窒素を含まないカーボン電極よりもそれぞれの分子が酸化もしくは還元される際の過電圧が低くなる応答が得られた。このことはそれぞれの電気化学反応が窒素成分によって触媒されたことを示している。すなわちスパッタナノカーボンに窒素成分を導入することで上述の生体関連分子の電気化学反応に対するカーボン電極の活性が向上したことが明らかである。

Claims (10)

1. 測定対象溶液中で核酸もしくはアミノ酸、又はそれらの代謝物もしくは酸代謝物中間体を構成成分として有する生体分子を酸化又は還元反応により検出する電気化学測定用のカーボン電極であって、
   炭素間のsp²結合とsp³結合が混在するグラファイト置換型CN結合を含む微結晶ドメインより構成され、グラファイトカーボン電極よりも広い範囲の電位窓を有することを特徴とする電気化学測定用カーボン電極。
2. 測定対象溶液中で生体分子からの直接電子移動反応に対して触媒活性を示すことを特徴とする請求項１に記載の電気化学測定用カーボン電極。
3. 炭素間のsp²結合とsp³結合との和に対するsp³結合の原子比が0.1〜0.4の範囲にあることを特徴とする請求項１又は２に記載の電気化学測定用カーボン電極。
4. 窒素元素の炭素原子に対する原子比が0.2以下（０は含まない）であることを特徴とする請求項１から３のいずれか一項に記載の電気化学測定用カーボン電極。
5. CN結合のうちグラファイト置換型CN結合が最も多いことを特徴とする請求項１から４のいずれか一項に記載の電気化学測定用カーボン電極。
6. 請求項１から５のいずれかの電気化学測定用のカーボン電極の製造方法であって、
   基板上にスパッタ法によりカーボン薄膜を形成すると同時に窒素成分ガスを導入することにより窒素含有カーボン薄膜からなるカーボン電極を形成することを特徴とする電気化学測定用カーボン電極の製造方法。
7. スパッタ法として、電子サイクロトロン共鳴スパッタ法、マグネトロンスパッタ法、RFスパッタ法、DCスパッタ法又はイオンビームスパッタ法を用いることを特徴とする請求項６記載の電気化学測定用カーボン電極の製造方法。
8. 請求項１から５のいずれかの電気化学測定用のカーボン電極を備えることを特徴とする電気化学測定用デバイス。
9. 生体分子において電気化学反応に対する触媒の効果を示すことを特徴とする請求項８に記載の電気化学測定用デバイス。
10. 請求項１から５のいずれかの電気化学測定用カーボン電極を用い、測定対象溶液中で核酸もしくはアミノ酸、又はそれらの代謝物もしくは酸代謝物中間体を構成成分として有する生体分子を酸化又は還元反応により検出することを特徴とする電気化学測定方法。