JP2013199446A

JP2013199446A - 新規ミモシン誘導体

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Publication number: JP2013199446A
Application number: JP2012068783A
Authority: JP
Inventors: Shinkichi Tawada; 真吉多和田; Upadhyay Atul; ウパダヤアツール
Original assignee: BIO SYSTEM CONSULTING KK; University of the Ryukyus NUC
Current assignee: BIO SYSTEM CONSULTING KK; University of the Ryukyus NUC
Priority date: 2012-03-26
Filing date: 2012-03-26
Publication date: 2013-10-03
Anticipated expiration: 2032-03-26
Also published as: JP5950390B2

Abstract

【課題】優れたノイラミニダーゼ阻害活性および／またはチロシナーゼ阻害活性を有する新規物質を提供すること。
【解決手段】下記一般式（１）
【化１】

（式中、Ｘ^１〜Ｘ^３は独立して、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、フェ
ニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、バリン（Ｖａ
ｌ）およびヒスチジン（Ｈｉｓ）よりなる群から選ばれるアミノ酸残基を示す）
で表されるミモシン誘導体。
【選択図】図２

Description

本発明は、ミモシン誘導体に関し、更に詳細には、優れたインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害活性およびチロシナーゼ阻害活性を有するミモシンテトラペプチドに関する。

インフルエンザウイルスによる感染には、宿主細胞に対する接着と脱離が重要であるが、この過程には、ヘマグルチニンとノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）という２種類のタンパク質が関与している。特にノイラミニダーゼは、インフルエンザウイルスが感染した細胞から脱離する上で必須の酵素である。このため、ノイラミニダーゼの活性を有効に阻害することができれば、インフルエンザウイルスが、感染した細胞表面から遊離・拡散することを阻害することができる。従って、ノイラミニダーゼの阻害は、結果として、インフルエンザウイルスによる他の細胞への感染・増殖を抑制し、インフルエンザウイルス感染症の治療に応用することができる。

このようなノイラミニダーゼ阻害活性を有する化合物について、いくつか報告されており（特許文献１ないし４）、その作用を利用した医薬品も開発されている。例えば、シアリダーゼの阻害剤であるタミフル（商品名、ロシュ社）（一般名称：リン酸オセルタミビル）や、リレンザ（商品名、グラクソ・スミスクライン社）（一般名称：ザナミビル)が知られており、インフルエンザの特効薬として処方されている。
しかし、これら医薬品は、アナフィラキシー様症状等の副作用や耐性ウイルスの出現等の問題があり、特に、タミフルを服用した患者が異常行動を起こして死亡する事故も複数報告されており、タミフル服用による精神・神経症状（意識障害、異常行動、譫妄、幻覚、妄想、痙攣など）も問題となっている。
また、報告されている上記のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害活性を有する物質も、その多くが複雑な構造を有するものであって、その生産には煩雑な工程が要求され、副作用の問題も懸念されるものであった。

一方、銅含有酵素であるチロシナーゼは、モノフェノールのカテコールへのオルト−ヒドロキシル化を触媒し、次いで酸化によりオルトキノリンを生成する。哺乳類において、チロシナーゼは、髪および皮膚色素の褐変に関与しているだけでなく、低色素沈着あるいは色素沈着過剰などの皮膚異常を引き起こす。さらにチロシナーゼは、癌およびパーキンソン病のような神経変性疾患に関与している可能性も示唆されている。

チロシナーゼ活性阻害物質の代表的なものとして、コウジ酸やアルブチン、アスコルビン酸などがよく知られており、メラニンの生成および沈着を抑制する美白剤として利用されている（特許文献５〜７）。しかし、これらの中には活性が十分でないものもあり、天然物由来で強力かつ安全性の高いチロシナーゼ阻害剤がなお強く求められている。

ＷＯ２０１０／５７０００ＷＯ２００６／６４９１４特開２００８−１６３０３５特開２００７−２３８５９０特開昭５６−７７１０号公報特開昭６３−１７４９１０号公報特開昭５１−９５１４０号公報

従って、本発明の課題は、優れたノイラミニダーゼ阻害活性および／またはチロシナーゼ阻害活性を備えた安全性の高い新規物質を提供することである。

本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ギンネム（ギンゴウカン）やミモザなどの熱帯〜亜熱帯植物中に含まれるミモシンに、特定のトリペプチドを結合したミモシンテトラペプチドは、ミモシンよりも優れたノイラミニダーゼ阻害活性および／またはチロシナーゼ阻害活性を示すことを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、下記一般式（１）；

（式中、Ｘ^１〜Ｘ^３は独立して、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、バリン（Ｖａｌ）およびヒスチジン（Ｈｉｓ）よりなる群から選ばれるアミノ酸残基を示す）
で表されるミモシン誘導体である。

また本発明は、上記ミモシン誘導体を有効成分として含有するインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤またはチロシナーゼ阻害剤である。

本発明のミモシン誘導体は、優れたインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害作用および／またはチロシナーゼ阻害活性を有するものである。従って、これを有効成分として含有するインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤は、インフルエンザ治療用の医薬品またはその原料として利用できるものである。またこのミモシン誘導体を有効成分として含有するチロシナーゼ阻害剤は、医薬品のほか、美白用化粧料などとして利用することができる。

ミモシンテトラペプチドの反応スキームを示す図である。（Ａ）はＷａｎｇ樹脂とＦｍｏｃアミノ酸の結合、（Ｂ）はＦｍｏｃミモシンテトラペプチドを形成するためのアミノ酸鎖の伸長、（Ｃ）はミモシンテトラペプチドを得るためのＦｍｏｃ基の除去を示す。０〜２μＭのミモシンテトラペプチドの存在下におけるラインウェーバー・バークプロットである。Ｍ−ＦＷＹ（Ａ）、Ｍ−ＦＹＹ（Ｂ）、Ｍ−ＦＦＹ（Ｃ）、Ｍ−ＶＧＹ（Ｄ）、Ｍ−ＱＧＹ（Ｅ）、Ｍ−ＷＧＹ（Ｆ）、Ｍ−ＦＧＹ（Ｇ）およびＭ−ＨＧＹ（Ｈ）のそれぞれのノイラミダ―ゼ阻害活性を示したものである。

本発明のミモシン誘導体は、下記一般式（１）；

で表されるものである。

ミモシン（β−［Ｎ−（３−ヒドロキシ−４−ピリドン）］−α−アミノプロピオン酸）は、ピリジン環の窒素原子に結合したアラニン側鎖を有する非タンパク質アミノ酸であるが、上記一般式（１）のミモシン誘導体は、このミモシンにトリペプチドが結合したテトラペプチドである。

上記一般式（１）中、Ｘ^１〜Ｘ^３は、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）、トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｙ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、バリン（Ｖａｌ；Ｖ）およびヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）よりなる群から選ばれるアミノ酸残基であり、これらは互いに独立して、同一であっても異なっていてもよい。

基Ｘ^１〜Ｘ^３を構成するアミノ酸に光学異性体が存在する場合は、Ｄ体であってもＬ体であってもよいが、Ｌ体であることが好ましい。Ｘ^３はＮ末端側でミモシンとアミド結合している。

これらの中でも、基Ｘ^３−Ｘ^２−Ｘ^１が、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（ＦＦＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（ＦＹＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（ＦＷＹ）、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ＶＧＹ）、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ＱＧＹ）、Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ＷＧＹ）、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ＦＧＹ）およびＨｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ＨＧＹ）よりなる群から選ばれるトリペプチド残基は、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤および／またはチロシナーゼ阻害剤が優れるため好適である。

この中でも、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（ＦＦＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（ＦＹＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（ＦＷＹ）は、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤に優れるため好ましく、特にＰｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（ＦＦＹ）が好ましい。また、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（ＦＦＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（ＦＹＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（ＦＷＹ）、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ＶＧＹ）、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ＱＧＹ）、Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ＷＧＹ）、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（ＦＧＹ）は、チロシナーゼ阻害活性が高いため好ましく、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（ＦＦＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ（ＦＹＹ）、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ（ＦＷＹ）がより好ましく、特にＰｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ（ＦＦＹ）が好ましい。

また本発明のミモシン誘導体は下記一般式（２）

で表すこともできる。

上記一般式（２）中、Ｒ^１〜Ｒ^３は、４−ヒドロキシベンジル基、３−インドリルメチル基、ベンジル基、水素原子、２−カルバモイルエチル基、イソプロピル基、イミダゾリルメチル基よりなる群から選ばれる基を示し、これらは互いに独立して、同一であっても異なっていてもよい。

これらの中でもＲ^１は４−ヒドロキシベンジル基が好ましい。また、Ｒ^２は、４−ヒドロキシベンジル基、３−インドリルメチル基、ベンジル基および水素原子よりなる群から選ばれたものであることが好適である。Ｒ^３は、３−インドリルメチル基、ベンジル基、２−カルバモイルエチル基、イソプロピル基およびイミダゾリルメチル基よりなる群から選ばれたものであることが好適である。

中でも、Ｒ^１が４−ヒドロキシベンジル基、Ｒ^３がベンジル基であって、Ｒ^２がベンジル基、４−ヒドロキシベンジル基又は３−インドリルメチル基である組み合わせは、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害活性およびチロシナーゼ阻害活性が優れるため好ましく、特にＲ^１が４−ヒドロキシベンジル基で、Ｒ^２とＲ^３がともにベンジル基である組み合わせが好ましい。また、Ｒ^１が４−ヒドロキシベンジル基、Ｒ^２が水素原子であって、Ｒ^３がイソプロピル基、２−カルバモイルエチル基、３−インドリルメチル基又はベンジル基である組み合わせは、チロシナーゼ阻害活性に優れるために好適である。

また上記一般式（２）中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３が水素原子以外の場合には、これらが結合する炭素は不斉炭素となる。ｘ、ｙ、ｚは、不斉炭素となる場合のそれぞれの絶対配置（ＳまたはＲ）を示す符号を表わす。本発明のミモシン誘導体には、エナンチオマー、ジアステレオマーおよびラセミ体を含むこれらの混合物が包含されるが、ｘ、ｙ、ｚが全て（Ｓ）の立体配置であることが好ましい。

上記一般式（１）または（２）で示される本発明のミモシン誘導体は、例えば以下の方法によって製造することができる。

ミモシンはギンネムやミモザのような熱帯・亜熱帯植物に含まれる。このギンネムは、ネムノキ科ギンゴウカン属の常緑低木で、熱帯から亜熱帯アジアに分布し、日本では沖縄県から九州南部に分布する。

このギンネムの葉からミモシンを得るには、まず、ギンネムの葉、好ましくは新鮮な若葉を、好ましくは細切ないし細断して抽出原料とする。

次いで、上記のように準備した抽出原料に対し、適量の水を加熱し、得られた熱水で抽出する。この熱水抽出は、７０℃以上、好ましくは７５℃ないし沸騰状態の熱水で行うことができるが、ミモシン分解酵素を失活させ、純度の高いミモシンを得るためには、沸騰水（１００℃程度）の熱水を用いることが特に好ましい。また、抽出時間は、５ないし３０分程度であり、特に１０分間程度煮沸抽出を行うことが好ましい。抽出に用いる抽出溶媒としては、蒸留水が好ましく、また、抽出中、必要により連続あるいは間欠的に攪拌することが望ましい。

このギンネム葉抽出液中に、強陽イオン交換樹脂を加えて、ミモシンを含む被吸着成分を吸着させる。次いで、このイオン交換樹脂を、水や、水−エタノール混液で洗浄した後、アンモニア水中等に浸漬し、ミモシンをイオン交換樹脂から溶出させる。この溶出液を必要により活性炭処理した後、濃縮処理し、低温で放置することによりミモシン塩が析出してくるので、これを集めることでミモシンが得られる。得られたミモシンは必要に応じて再結晶等の手段により精製してもよい。

このようにして得られたミモシンに、ペプチド固相合成法などの公知のペプチド合成法を用いてアミノ酸を結合させることにより本発明のミモシン誘導体を得ることができる。

ミモシンおよびアミノ酸は、アミノ基を、９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基（Ｆｍｏｃ）やｔ−ブチルオキシカルボニル基（Ｂｏｃ）などの保護基で保護することが好ましい。

ペプチド結合を形成するための縮合剤としては、例えば、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）、Ｎ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）等が挙げられる。また、これらの縮合剤をＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）と混合して用いることもできる。

ペプチドまたはアミノ酸のアミノ末端アミノ基の保護基であるＢｏｃおよびＦｍｏｃは、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ピペリジンなどにより除去することができる。

また、ペプチド固相合成樹脂としては、Ｗａｎｇ樹脂などを用いることができる。ペプチドをペプチド固相合成樹脂より脱離させるにあたっては、例えば、ＴＦＡなどが用いられる。

本発明のミモシン誘導体を製造するためのＦｍｏｃ固相合成法による反応スキームを図１に示す。このスキームにおいては、Ｎ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ)コハク酸イミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）のＦｍｏｃ基をミモシンに結合してＦｍｏｃ−ミモシンを調製し、これとＦｍｏｃ−アミノ酸を用いて形成させたトリペプチドを結合させることによって、ミモシンテトラペプチドを形成させている。以下、より具体的に説明する。

（Ｆｍｏｃ−ミモシンの調製）
ミモシンおよび炭酸ナトリウムをジオキサンを含有する蒸留水に溶解し、この溶液にＦｍｏｃ−ＯＳｕを添加し、室温で一晩インキュベートする。次いで、炭酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した後、この溶液をろ過し、次いで酢酸エチルで洗浄して、未反応のＦｍｏｃ−ＯＳｕ、副産物である９−フルオレニルメタノールおよび９−メチレンフルオレンを除去する。氷浴中で、塩酸を用いて水画分のｐＨを４程度にまで下げることによって、Ｆｍｏｃ−ミモシンの結晶が析出する。

（ミモシンテトラペプチドの固相合成）
Ｆｍｏｃ−アミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｘ_１−ＯＨ）のジメチルアセトアミド溶液に、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）およびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）を添加し、攪拌する。この溶液にＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で膨張させたＷａｎｇ樹脂を添加し、攪拌する（図１Ａ参照）。この樹脂をろ過し、ジクロロメタン、イソプロピルアルコールおよびメタノールで洗浄し、真空条件下で乾燥する。ＤＭＦ中にて２５％ピぺリジン（試薬ａ）によりＦｍｏｃの脱保護を行った後、次のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｘ_２−ＯＨ）を、試薬ｂ（Ｆｍｏｃアミノ酸、ＨＯＢt、ＨＢＴＵおよびＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の混合物）に結合させ、さらに攪拌する（図１Ｂ参照）。このジペプチドに、同様にして、Ｆｍｏｃアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｘ_３−ＯＨ）を結合させてトリペプチドを形成する。さらに同様にして上記で調製したＦｍｏｃ−ミモシンを加えて結合させた後、９５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；試薬ｋ)で攪拌する（図１Ｃ参照）。この樹脂をろ過し、ＴＦＡで洗浄した後、得られたろ液から氷冷されたジエチルエーテルで沈殿を生じさせることによって、ミモシンテトラペプチドが得られる。

以上のようにして得られた本発明のミモシン誘導体は、そのまま、あるいは必要に応じ、液体高速クロマトグラフィーなど公知の方法によって精製した後、インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤またはチロシナーゼ阻害剤として利用することができる。

例えば、ミモシン誘導体を有効成分とするインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤の調製は、治療有効量のミモシン誘導体を、製薬上許容される任意成分、例えば、慣用の賦形剤、結合剤、滑沢剤、水性溶剤、油性溶剤、乳化剤、懸濁化剤、保存剤、安定剤等と組み合わせ、混合することにより行うことができる。

本発明のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤は、経口でも非経口でも投与することができる。経口投与による場合の本発明インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤は、通常の経口投与製剤、例えば、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤等の固形剤；水剤；油性懸濁剤；又はシロップ剤もしくはエリキシル剤等の液剤のいずれかの剤形としても用いることができる。非経口投与による場合には、本発明インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤は、水性又は油性懸濁注射剤、点鼻液として用いることができる。

本発明のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤の投与量は、投与方法、患者の年齢、体重、状態および疾患の種類によっても異なるが、通常、経口投与の場合、成人１日あたり約１０〜２００ｍｇであり、好ましくは、約１０〜２０ｍｇであり、これを必要に応じて数回に分け投与すれば良い。また、非経口投与の場合は、成人１日あたり約５〜１００ｍｇ、好ましくは、約５〜１０ｍｇを投与すれば良い。

なお、本発明のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤を抗インフルエンザ薬として用いる場合は、特に経口剤が好ましい。

一方、本発明のチロシナーゼ活性阻害剤も上記インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤と同様にして、色素沈着過剰、低色素沈着等の皮膚異常の治療用途のための経口あるいは非経口の医薬として製剤化することができる。また皮膚外用剤とすることもでき、例えば、精製水、アルコール類、水溶性高分子、油剤、界面活性剤、ゲル化剤、保湿剤、ビタミン類、抗菌剤、香料、塩類、ｐＨ調整剤等の成分を加えて調製することができる。

本発明のチロシナーゼ活性阻害剤の添加量は、添加対象物の種類、投与経路、剤形等の諸条件によって異なるが、例えば、医薬製剤（全重量）中に２質量％〜５質量％含有させることが好適である。

また本発明のチロシナーゼ活性阻害剤の投与量は、特に限定されるものではなく、患者の年齢、性別、体重、症状の程度、又は投与方法などに応じて適宜決定することができるが、例えば、経口投与の場合には、成人１日あたり約１０〜２００ｍｇであり、好ましくは、約１０〜２０ｍｇである。また非経口投与の場合は、成人１日あたり約５〜１００ｍｇ、好ましくは、約５〜１０ｍｇを投与すれば良い。

さらに、本発明のチロシナーゼ阻害剤は、メラニンの産生や沈着を抑制し、美白作用を有するため、化粧料に配合し美白化粧料とすることもできる。例えば、公知の化粧料基剤にチロシナーゼ阻害剤を、３〜５質量％程度配合し、常法に従って、溶液状、可溶化状、乳化状、粉末状、ペースト状、ムース状、ジェル状の形態とすることにより製造され、化粧水、乳液、クリーム、パック、軟膏等として提供される。

また、上記美白化粧料の製造にあたっては、必要に応じて本発明の効果を損なわない範囲で、通常、化粧料に使用される成分、すなわち、精製水、アルコール類、水溶性高分子、油剤、界面活性剤、ゲル化剤、保湿剤、ビタミン類、抗菌剤、香料、塩類、ｐＨ調整剤等を加えることができる。

次に実施例を挙げ、本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例に何ら制約されるものではない。

参考例１
ミモシンの調製：
ギンゴウカンの葉１ｋｇを、５Ｌの水で１０分間煮沸した。抽出液をろ過し、ろ液にカチオン交換樹脂（オルガノ株式会社、IR120BH）２ｋｇを添加した。この抽出液・樹脂混合物を、振とう機（アズワン社製、ＳｈａｋｉｎｇＢａｔｈｓＳＢ−２０）で室温にて一晩振とうした。ミモシン以外の不純物を取り除くために、このカチオン交換樹脂を、８０％のエタノール５Ｌで洗浄し、さらに、数回程度水で蒸留でした。この樹脂を４Ｎ水酸化アンモニウム６Ｌで溶出して粗ミモシンを得た。この溶出物を真空で濃縮し、さらに、粗ミモシンを水酸化ナトリウム水溶液に溶解した。この溶液のｐＨを６Ｎ塩酸で４．５〜５．０に調節し、冷凍庫に一晩置いて結晶化させた。得られた結晶をろ過し、さらに真空状態で乾燥することで、純度９５％以上のミモシンを５．３８７ｇ（０．５４％）得た。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ／ｚ［Ｍ−Ｈ］^＋;１９７．２;［Ｍ＋Ｈ］^＋；１９９．１

製造例１
ミモシン誘導体の調製（Ｍ−ＦＦＹ）：
Ｆｍｏｃ固相合成法により、ミモシン（Ｍ）にトリペプチドを結合してテトラペプチドの合成を行った。ハイペップ研究所から入手したＦｍｏｃ−アミノ酸を用いて、最初の結合は、チロシン（Ｙ）で行い、次にフェニルアラニン（Ｆ）を結合してジペプチドを形成し、さらに、フェニルアラニン（Ｆ）を結合してトリペプチドを形成した。形成されたジペプチドを別途調製したＦｍｏｃ−ミモシンと結合してミモシンテトラペプチドを得た。より具体的な製法を以下に示す。

（Ｆｍｏｃ−ミモシンの調製）
５ｇのミモシンおよび５．５ｇの炭酸ナトリウムを７５ｍＬのジオキサンを含有する蒸留水７５ｍＬに溶解した。この溶液に１２．５ｇのＮ−（９−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ)コハク酸イミド（Ｆｍｏｃ−ＯＳｕ）を添加し、この混合液を室温で一晩インキュベートした。次に、３００ｍＬの炭酸ナトリウム溶液（０．１Ｍ）を添加し、さらにマグネチックスターラー（３００ｒｐｍ）で５時間、２５℃で攪拌した。得られた溶液（４５０ｍＬ）をろ過し、酢酸エチル（１５０ｍＬ）で洗浄して未反応のＦｍｏｃ−ＯＳｕ、副産物である９−フルオレニルメタノールおよび９−メチレンフルオレンを除去した。氷浴中で、６Ｎ塩酸を用いて水画分のｐＨを４に下げ、Ｆｍｏｃ−ミモシンを結晶として得た。これをろ過し、真空条件下で乾燥した（収量７．１０８ｇ）。

（ミモシンテトラペプチドの固相合成）
Ｆｍｏｃ−Ｌ−チロシン１．６ｍｍｏｌのジメチルアセトアミド溶液５ｍＬに、１−ヒドロキシ−１Ｈ−ベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）１．６ｍｍｏｌおよびＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）１．６ｍｍｏｌを添加し、１０分間攪拌した。この溶液にＤＭＦ中で膨張させたＷａｎｇ樹脂１ｇを添加し、反応混合物を１７時間攪拌した（図１Ａ参照）。この樹脂をろ過し、ジクロロメタン、イソプロピルアルコールおよびメタノールで洗浄し、真空条件下で乾燥した。ＤＭＦ中にて３０分間、２５％ピぺリジン（試薬ａ）によりＦｍｏｃの脱保護を行った後、次のアミノ酸Ｆｍｏｃ−Ｌ−フェニルアラニンを、樹脂混合溶液（Ｆｍｏｃアミノ酸：ＨＯＢt：ＨＢＴＵ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）＝４：３：３．６：８；試薬ｂ）に結合させた。この反応混合物をさらに１時間攪拌した（図１Ｂ参照）。

結合の完全性を調べるために、ニンヒドリン試験を行った。ＨＯＢｔ：酢酸：ＤＩＥＡ：ＤＭＦ（０．８：１９：９：４００）混合液を樹脂１ｇあたり２０ｍＬ用いて、未結合のＦｍｏｃ−Ｌ−トリプトファンをアセチル基で保護した。
次に上記と同様にして、テトラペプチドを形成するために、Ｆｍｏｃ−Ｌ−フェニルアラニンをジペプチドに結合した。さらに上記で調製したＦｍｏｃ−ミモシンを加え、同様にして結合させた後、この樹脂を、１時間、９５％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ；試薬ｋ)でゆっくり攪拌した（図１Ｃ参照）。この樹脂をろ過した後、ＴＦＡで洗浄し、得られたろ過液から、氷冷されたジエチルエーテルで沈殿を生じさせた。得られた沈殿をろ過し、ジエチルエーテルで３回洗浄した後、真空条件下で乾燥して目的のミモシンテトラペプチドを得た（Ｍ−ＦＦＹ）。得られた粗ペプチドは白色固体であり、収量は８０．２ｍｇであった。この粗ペプチドをさらに下記条件の液体クロマトグラフィーによって精製した。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ/ｚ：６９３．２（［Ｍ−Ｈ］^＋）

（ＨＰＬＣ条件）
カラム：ＣａｄｅｎｚａＣＤ−Ｃ１８カラム（２０×１００ｍｍ；３μｍ）
移動相：０．１％トリフルオロ酢酸／ＣＨ_３ＣＮ（１．５／８．５）
流量：５ｍＬ／分

製造例２
ミモシン誘導体の調製（Ｍ−ＦＹＹ）：
２番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｌ−チロシン（Ｙ）、３番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）を用いた以外は製造例１と同様にしてミモチンテトラペプチド（Ｍ−ＦＹＹ）を得た（収量６５．７ｍｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ/ｚ：６７０．１（［Ｍ−Ｈ］^＋）

製造例３
ミモシン誘導体の調製（Ｍ−ＦＷＹ）：
２番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｌ−トリプトファン（Ｗ）、３番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）を用いた以外は製造例１と同様にしてミモチンテトラペプチド（Ｍ−ＦＷＹ）を得た（収量７１．５ｍｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ/ｚ：６５４．２（［Ｍ−Ｈ］^＋）

製造例４
ミモシン誘導体の調製（Ｍ−ＶＧＹ）：
２番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−グリシン（Ｇ）、３番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｌ−バリン（Ｖ）を用いた以外は製造例１と同様にしてミモチンテトラペプチド（Ｍ−ＶＧＹ）を得た（収量４２．５ｍｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ/ｚ：６０３．２（［Ｍ−Ｈ］^＋）

製造例６
ミモシン誘導体の調製（Ｍ−ＱＧＹ）：
２番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−グリシン（Ｇ）、３番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｌ−グルタミン（Ｑ）を用いた以外は製造例１と同様にしてミモチンテトラペプチド（Ｍ−ＱＧＹ）を得た（収量８５．６ｍｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ/ｚ：５６４．１（［Ｍ−Ｈ］^＋）

製造例７
ミモシン誘導体の調製（Ｍ−ＷＧＹ）：
２番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−グリシン（Ｇ）、３番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｌ−トリプトファン（Ｗ）を用いた以外は製造例１と同様にしてミモチンテトラペプチド（Ｍ−ＷＧＹ）を得た（収量６６．８ｍｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ/ｚ：５４５．１（［Ｍ−Ｈ］^＋）

製造例７
ミモシン誘導体の調製（Ｍ−ＦＧＹ）：
２番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−グリシン（Ｇ）、３番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｌ−フェニルアラニン（Ｆ）を用いた以外は製造例１と同様にしてミモチンテトラペプチド（Ｍ−ＦＧＹ）を得た（収量７８．４ｍｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ/ｚ：５５４．２（［Ｍ−Ｈ］^＋）

製造例８
ミモシン誘導体の調製（Ｍ−ＨＧＹ）：
２番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−グリシン（Ｇ）、３番目に結合させるＦｍｏｃアミノ酸としてＦｍｏｃ−Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）を用いた以外は製造例１と同様にしてミモチンテトラペプチド（Ｍ−ＨＧＹ）を得た（収量７８．４ｍｇ）。
ＬＣ−ＭＳ（ＥＳＩ−）ｍ/ｚ：５３１．１（［Ｍ−Ｈ］^＋）

実施例１
インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害作用：
ノイラミニダーゼ阻害アッセイは、まず、酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０）５０ｍＭに４−メチルウンベリフェリル−α−Ｄ−Ｎ−アセチルノイラミン酸ナトリウム水和物（Ｎｏ．Ｍ８６３９、シグマ社製）０．１ｍＭを加え、これを基質として用いた。次に、酢酸緩衝液（ｐＨ５．０）にウェルシュ菌（Clostridium perfringens）由来のノイラミニダ―ゼ（Ｓｉｇｍａ社）を加え、０．１Ｕ／ｍＬになるようにし、これを酵素試薬として用いた。

次に、製造例１〜８で得られたミモシンテトラペプチドをメタノールに溶解し、０．５、１、２μＭの濃度に希釈した。各サンプル２０μＬを酢酸緩衝液（ｐＨ６．８）８０μＬに加え、マイクロプレートのウェルに注入し、これに酵素試薬５０μＬを加えた。反応は、５０μＬの基質を加えることにより開始され、蛍光発光は、ＭＴＰ−８８０蛍光量計（コロナ電気株式会社製）を用いて測定した。励起および発光波長は、それぞれ３６０および４５０ｎｍに設定した。異なるサンプル濃度に対し、各基質濃度の範囲において記録された初期速度による時間駆動プロトコルを用いて反応速度試験を行った。結果を図２に示す。また、各ミモシンテトラペプチドの阻害様式およびＫｉ値を表１に示す。

また阻害率を、以下の式により計算しＩＣ_５０を求めた。結果を表１に示す。
阻害率（％）＝［１−（Ｓ−Ｓ_０）/（Ｃ−Ｃ_０）］ｘ１００
（式中、ＳおよびＣは反応後の試料および対照（メタノール）の相対蛍光単位（ＲＦＵ
）をそれぞれ表わし、Ｓ_０およびＣ_０は、０時間での相対蛍光単位を表わす。）
ミモシンについても同様にして試験を行った。結果を表１に併せて示す。また、ミモシンテトラペプチドを構成する各アミノ酸単独による３０μＭでのノイラミニダーゼ阻害率（％）も上記と同様にして求めた。結果を表２に示す。

なお、全ての実験は３連で行い、２回繰り返した。データは、６回の結果の平均値±標準偏差（ＳＤ）を表す。ＩＣ_５０は各サンプルが５０％の阻害活性を示すために必要とされる濃度としてグラフから求めた。反応速度試験における全ての計算は、マイクロソフトエクセルオフィス、２００７を用いて行った。有意性分析においては、データを一元配置分散分析ＡＮＯＶＡで分析し、ＴｕｋｅｙＨＳＤ法（Ｐ＝０．０１）を用いて平均値の有意差を算出した。

表１から明らかなように、合成されたミモシンテトラペプチドのうち、Ｍ−ＦＦＹ、Ｍ−ＦＹＹ、Ｍ−ＦＷＹ、Ｍ−ＶＧＹ、Ｍ−ＱＧＹはいずれもミモシンより優れた阻害活性を示した。特にＭ−ＦＦＹは、ミモシンの５倍の阻害活性を有するものであった。Ｍ−ＦＦＹの低いＩＣ_５０値およびＫｉ値は、ノイラミダ―ゼ阻害剤として有力な化合物であることを示すものである。ミモシンは競合阻害型であるが、ミモシンテトラペプチドはいずれも非競合阻害を示した（図２Ｈ参照）。個々のアミノ酸（３０μＭ）によるノイラミダ―ゼ阻害活性は、非常に弱いものであった（表２参照）。ノイラミダ―ゼ阻害活性において、ミモシンテトラペプチドは個々のアミノ酸より優れた阻害作用を有することが確認された。

実施例２
チロシナーゼ阻害作用：
製造例１〜８で得られた各ミモシンテトラペプチドのチロシナーゼ阻害作用を確認した。ミモシンテトラペプチドをメタノールで溶解し、いくつかの異なる濃度（μＭ）のサンプルを調製した。９６ウェルプレートに、１２０μＬのリン酸緩衝液（２０ｍＭ，ｐＨ６．８）、２０μＬのサンプル、２０μＬのマッシュルームチロシナーゼ（２０ｍＭ緩衝液にて、５００ｕｎｉｔｓ/ｍＬ)の順で添加した。２５℃で１５分間インキュベートした後、２０μＬのＬ−チロシナーゼ溶液（０．８５ｍＭ）を各ウェルに添加して反応を開始した。マイクロリーダーを用いて４７０ｎｍでの吸光度を測定することにより酵素活性を確認した。チロシナーゼ阻害率を以下の式により計算しＩＣ_５０を求めた。結果を表３に示す。

チロシナーゼ阻害率（％）＝［（Ａ−Ｂ）−（Ｃ−Ｄ）］/（Ａ−Ｂ）× １００
（式中、ＡおよびＢは、それぞれ、酵素存在下での対照（メタノール）および酵素存在
下でのサンプルのチロシナーゼ活性を示し、ＣおよびＤは、それぞれ、酵素非存在下
での対照（メタノール）および酵素非存在下でのサンプルのチロシナーゼ活性を示す。）

実験は３連で行い、２回繰り返した。データは、６回の結果の平均値±標準偏差（ＳＤ）を表す。ＩＣ_５０は各サンプルが５０％の阻害活性を示すために必要とされる濃度としてグラフから求めた。有意性分析においては、データを一元配置分散分析ＡＮＯＶＡで分析し、ＴｕｋｅｙＨＳＤ法（Ｐ＝０．０１）を用いて平均値の有意差を算出した。

表３に示すとおり、ミモシンのチロシナーゼ阻害活性のＩＣ_５０値は４４．７±０．４μＭ）であるのに対し、合成されたミモシンテトラペプチドは、いずれもミモシンよりも優れたチロシナーゼ活性阻害を示した（５．６〜３６．７μＭ）。
特にＭ−ＦＦＹは、合成されたミモシンテトラペプチドの中で、最も優れた阻害活性を有し、ミモシンの約８倍の活性を示した。

本発明のミモシン誘導体は、優れたインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害活性を示すため、インフルエンザが関連する疾患に対し、治療効果が期待できるものである。

また、本発明のミモシン誘導体は、優れたチロシナーゼ阻害活性を有するため、皮膚障害を予防・治療するための医薬や美白化粧料等として利用できるものである。

Claims

下記一般式（１）；

（式中、Ｘ^１〜Ｘ^３は独立して、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、フェ
ニルアラニン（Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇｌｙ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、バリン（Ｖａ
ｌ）およびヒスチジン（Ｈｉｓ）よりなる群から選ばれるアミノ酸残基を示す）
で表されるミモシン誘導体。
一般式（１）中、基Ｘ^３−Ｘ^２−Ｘ^１が、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−Ｔｙｒ、Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｔｒｐ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ、Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−ＴｙｒおよびＨｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒよりなる群から選ばれるトリペプチド残基である請求項１記載のミモシン誘導体。
一般式（１）のミモシン誘導体が、下記一般式（２）；

（式中、Ｒ^１〜Ｒ^３は独立して、４−ヒドロキシベンジル基、３−インドリルメチル基、
ベンジル基、水素原子、２−カルバモイルエチル基、イソプロピル基、イミダゾリル
メチル基よりなる群から選ばれる基を示し、ｘ、ｙ、ｚは、Ｒ^１、Ｒ^２またはＲ^３が結
合する炭素原子が不斉炭素である場合、それぞれの絶対配置（ＳまたはＲ）を示す符
号を表わす）で表されるものである請求項１記載のミモシン誘導体。
Ｒ^１が４−ヒドロキシベンジル基であり、Ｒ^２が４−ヒドロキシベンジル基、３−インドリルメチル基、ベンジル基および水素原子よりなる群から選ばれた基であり、Ｒ^３が３−インドリルメチル基、ベンジル基、２−カルバモイルエチル基、イソプロピル基およびイミダゾリルメチル基よりなる群から選ばれた基である請求項３記載のミモシン誘導体。
Ｒ^１が４−ヒドロキシベンジル基であり、Ｒ^２およびＲ^３がベンジル基である請求項３記載のミモシン誘導体。
請求項１ないし５のいずれかの項記載のミモシン誘導体を有効成分とするインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤。
請求項１ないし５のいずれかの項記載のミモシン誘導体を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
請求項７記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する美白化粧料。