JP2013199446A - 新規ミモシン誘導体 - Google Patents
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Abstract
Description
しかし、これら医薬品は、アナフィラキシー様症状等の副作用や耐性ウイルスの出現等の問題があり、特に、タミフルを服用した患者が異常行動を起こして死亡する事故も複数報告されており、タミフル服用による精神・神経症状(意識障害、異常行動、譫妄、幻覚、妄想、痙攣など)も問題となっている。
また、報告されている上記のインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害活性を有する物質も、その多くが複雑な構造を有するものであって、その生産には煩雑な工程が要求され、副作用の問題も懸念されるものであった。
で表されるミモシン誘導体である。
ミモシンおよび炭酸ナトリウムをジオキサンを含有する蒸留水に溶解し、この溶液にFmoc−OSuを添加し、室温で一晩インキュベートする。次いで、炭酸ナトリウム溶液を添加し、攪拌した後、この溶液をろ過し、次いで酢酸エチルで洗浄して、未反応のFmoc−OSu、副産物である9−フルオレニルメタノールおよび9−メチレンフルオレンを除去する。氷浴中で、塩酸を用いて水画分のpHを4程度にまで下げることによって、Fmoc−ミモシンの結晶が析出する。
Fmoc−アミノ酸(Fmoc−X1−OH)のジメチルアセトアミド溶液に、1−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾール(HOBt)およびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)を添加し、攪拌する。この溶液にN,N−ジメチルホルムアミド(DMF)中で膨張させたWang樹脂を添加し、攪拌する(図1A参照)。この樹脂をろ過し、ジクロロメタン、イソプロピルアルコールおよびメタノールで洗浄し、真空条件下で乾燥する。DMF中にて25%ピぺリジン(試薬a)によりFmocの脱保護を行った後、次のアミノ酸(Fmoc−X2−OH)を、試薬b(Fmocアミノ酸、HOBt、HBTUおよびN,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)の混合物)に結合させ、さらに攪拌する(図1B参照)。このジペプチドに、同様にして、Fmocアミノ酸(Fmoc−X3−OH)を結合させてトリペプチドを形成する。さらに同様にして上記で調製したFmoc−ミモシンを加えて結合させた後、95%トリフルオロ酢酸(TFA;試薬k)で攪拌する(図1C参照)。この樹脂をろ過し、TFAで洗浄した後、得られたろ液から氷冷されたジエチルエーテルで沈殿を生じさせることによって、ミモシンテトラペプチドが得られる。
ミモシンの調製:
ギンゴウカンの葉1kgを、5Lの水で10分間煮沸した。抽出液をろ過し、ろ液にカチオン交換樹脂(オルガノ株式会社、IR120BH)2kgを添加した。この抽出液・樹脂混合物を、振とう機(アズワン社製、 Shaking Baths SB−20)で室温にて一晩振とうした。ミモシン以外の不純物を取り除くために、このカチオン交換樹脂を、80%のエタノール5Lで洗浄し、さらに、数回程度水で蒸留でした。この樹脂を4N 水酸化アンモニウム6Lで溶出して粗ミモシンを得た。この溶出物を真空で濃縮し、さらに、粗ミモシンを水酸化ナトリウム水溶液に溶解した。この溶液のpHを6N塩酸で4.5〜5.0に調節し、冷凍庫に一晩置いて結晶化させた。得られた結晶をろ過し、さらに真空状態で乾燥することで、純度95%以上のミモシンを5.387g(0.54%)得た。
LC−MS(ESI−)m/z[M−H]+;197.2;[M+H]+;199.1
ミモシン誘導体の調製(M−FFY):
Fmoc固相合成法により、ミモシン(M)にトリペプチドを結合してテトラペプチドの合成を行った。ハイペップ研究所から入手したFmoc−アミノ酸を用いて、最初の結合は、チロシン(Y)で行い、次にフェニルアラニン(F)を結合してジペプチドを形成し、さらに、フェニルアラニン(F)を結合してトリペプチドを形成した。形成されたジペプチドを別途調製したFmoc−ミモシンと結合してミモシンテトラペプチドを得た。より具体的な製法を以下に示す。
5gのミモシンおよび5.5gの炭酸ナトリウムを75mLのジオキサンを含有する蒸留水75mLに溶解した。この溶液に12.5gのN−(9−フルオレニルメトキシカルボニルオキシ)コハク酸イミド(Fmoc−OSu)を添加し、この混合液を室温で一晩インキュベートした。次に、300mLの炭酸ナトリウム溶液(0.1M)を添加し、さらにマグネチックスターラー(300rpm)で5時間、25℃で攪拌した。得られた溶液(450mL)をろ過し、酢酸エチル(150mL)で洗浄して未反応のFmoc−OSu、副産物である9−フルオレニルメタノールおよび9−メチレンフルオレンを除去した。氷浴中で、6N 塩酸を用いて水画分のpHを4に下げ、Fmoc−ミモシンを結晶として得た。これをろ過し、真空条件下で乾燥した(収量7.108g)。
Fmoc−L−チロシン1.6mmolのジメチルアセトアミド溶液5mLに、1−ヒドロキシ−1H−ベンゾトリアゾール(HOBt)1.6mmolおよびN,N’−ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)1.6mmolを添加し、10分間攪拌した。この溶液にDMF中で膨張させたWang樹脂1gを添加し、反応混合物を17時間攪拌した(図1A参照)。この樹脂をろ過し、ジクロロメタン、イソプロピルアルコールおよびメタノールで洗浄し、真空条件下で乾燥した。DMF中にて30分間、25%ピぺリジン(試薬a)によりFmocの脱保護を行った後、次のアミノ酸Fmoc−L−フェニルアラニンを、樹脂混合溶液(Fmocアミノ酸:HOBt:HBTU:N,N−ジイソプロピルエチルアミン(DIEA)=4:3:3.6:8;試薬b)に結合させた。この反応混合物をさらに1時間攪拌した(図1B参照)。
次に上記と同様にして、テトラペプチドを形成するために、Fmoc−L−フェニルアラニンをジペプチドに結合した。さらに上記で調製したFmoc−ミモシンを加え、同様にして結合させた後、この樹脂を、1時間、95%のトリフルオロ酢酸(TFA;試薬k)でゆっくり攪拌した(図1C参照)。この樹脂をろ過した後、TFAで洗浄し、得られたろ過液から、氷冷されたジエチルエーテルで沈殿を生じさせた。得られた沈殿をろ過し、ジエチルエーテルで3回洗浄した後、真空条件下で乾燥して目的のミモシンテトラペプチドを得た(M−FFY)。得られた粗ペプチドは白色固体であり、収量は80.2mgであった。この粗ペプチドをさらに下記条件の液体クロマトグラフィーによって精製した。
LC−MS(ESI−)m/z:693.2([M−H]+)
カラム:Cadenza CD−C18 カラム(20×100mm;3μm)
移動相:0.1%トリフルオロ酢酸/CH3CN(1.5/8.5)
流量:5mL/分
ミモシン誘導体の調製(M−FYY):
2番目に結合させるFmocアミノ酸としてFmoc−L−チロシン(Y)、3番目に結合させるFmocアミノ酸としてFmoc−L−フェニルアラニン(F)を用いた以外は製造例1と同様にしてミモチンテトラペプチド(M−FYY)を得た(収量65.7mg)。
LC−MS(ESI−)m/z:670.1([M−H]+)
ミモシン誘導体の調製(M−FWY):
2番目に結合させるFmocアミノ酸としてFmoc−L−トリプトファン(W)、3番目に結合させるFmocアミノ酸としてFmoc−L−フェニルアラニン(F)を用いた以外は製造例1と同様にしてミモチンテトラペプチド(M−FWY)を得た(収量71.5mg)。
LC−MS(ESI−)m/z:654.2([M−H]+)
ミモシン誘導体の調製(M−VGY):
2番目に結合させるFmocアミノ酸としてFmoc−グリシン(G)、3番目に結合させるFmocアミノ酸としてFmoc−L−バリン(V)を用いた以外は製造例1と同様にしてミモチンテトラペプチド(M−VGY)を得た(収量42.5mg)。
LC−MS(ESI−)m/z:603.2([M−H]+)
ミモシン誘導体の調製(M−QGY):
2番目に結合させるFmocアミノ酸としてFmoc−グリシン(G)、3番目に結合させるFmocアミノ酸としてFmoc−L−グルタミン(Q)を用いた以外は製造例1と同様にしてミモチンテトラペプチド(M−QGY)を得た(収量85.6mg)。
LC−MS(ESI−)m/z:564.1([M−H]+)
ミモシン誘導体の調製(M−WGY):
2番目に結合させるFmocアミノ酸としてFmoc−グリシン(G)、3番目に結合させるFmocアミノ酸としてFmoc−L−トリプトファン(W)を用いた以外は製造例1と同様にしてミモチンテトラペプチド(M−WGY)を得た(収量66.8mg)。
LC−MS(ESI−)m/z:545.1([M−H]+)
ミモシン誘導体の調製(M−FGY):
2番目に結合させるFmocアミノ酸としてFmoc−グリシン(G)、3番目に結合させるFmocアミノ酸としてFmoc−L−フェニルアラニン(F)を用いた以外は製造例1と同様にしてミモチンテトラペプチド(M−FGY)を得た(収量78.4mg)。
LC−MS(ESI−)m/z:554.2([M−H]+)
ミモシン誘導体の調製(M−HGY):
2番目に結合させるFmocアミノ酸としてFmoc−グリシン(G)、3番目に結合させるFmocアミノ酸としてFmoc−L−ヒスチジン(H)を用いた以外は製造例1と同様にしてミモチンテトラペプチド(M−HGY)を得た(収量78.4mg)。
LC−MS(ESI−)m/z:531.1([M−H]+)
インフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害作用:
ノイラミニダーゼ阻害アッセイは、まず、酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.0)50mMに4−メチルウンベリフェリル−α−D−N−アセチルノイラミン酸ナトリウム水和物(No.M8639、シグマ社製)0.1mMを加え、これを基質として用いた。次に、酢酸緩衝液(pH 5.0)にウェルシュ菌(Clostridium perfringens)由来のノイラミニダ―ゼ(Sigma社)を加え、0.1U/mLになるようにし、これを酵素試薬として用いた。
阻害率(%)=[1−(S−S0)/(C−C0)] x 100
(式中、SおよびCは反応後の試料および対照(メタノール)の相対蛍光単位(RFU
)をそれぞれ表わし、S0およびC0は、0時間での相対蛍光単位を表わす。)
ミモシンについても同様にして試験を行った。結果を表1に併せて示す。また、ミモシンテトラペプチドを構成する各アミノ酸単独による30μMでのノイラミニダーゼ阻害率(%)も上記と同様にして求めた。結果を表2に示す。
チロシナーゼ阻害作用:
製造例1〜8で得られた各ミモシンテトラペプチドのチロシナーゼ阻害作用を確認した。ミモシンテトラペプチドをメタノールで溶解し、いくつかの異なる濃度(μM)のサンプルを調製した。96ウェルプレートに、120μLのリン酸緩衝液(20mM,pH6.8)、20μLのサンプル、20μLのマッシュルームチロシナーゼ(20mM 緩衝液にて、500 units/mL)の順で添加した。25℃で15分間インキュベートした後、20μLのL−チロシナーゼ溶液(0.85mM)を各ウェルに添加して反応を開始した。マイクロリーダーを用いて470nmでの吸光度を測定することにより酵素活性を確認した。チロシナーゼ阻害率を以下の式により計算しIC50を求めた。結果を表3に示す。
(式中、AおよびBは、それぞれ、酵素存在下での対照(メタノール)および酵素存在
下でのサンプルのチロシナーゼ活性を示し、CおよびDは、それぞれ、酵素非存在下
での対照(メタノール)および酵素非存在下でのサンプルのチロシナーゼ活性を示す。)
特にM−FFYは、合成されたミモシンテトラペプチドの中で、最も優れた阻害活性を有し、ミモシンの約8倍の活性を示した。
Claims (8)
- 一般式(1)中、基X3−X2−X1が、Phe−Phe−Tyr、Phe−Tyr−Tyr、Phe−Trp−Tyr、Val−Gly−Tyr、Gln−Gly−Tyr、Trp−Gly−Tyr、Phe−Gly−TyrおよびHis−Gly−Tyrよりなる群から選ばれるトリペプチド残基である請求項1記載のミモシン誘導体。
- R1が4−ヒドロキシベンジル基であり、R2が4−ヒドロキシベンジル基、3−インドリルメチル基、ベンジル基および水素原子よりなる群から選ばれた基であり、R3が3−インドリルメチル基、ベンジル基、2−カルバモイルエチル基、イソプロピル基およびイミダゾリルメチル基よりなる群から選ばれた基である請求項3記載のミモシン誘導体。
- R1が4−ヒドロキシベンジル基であり、R2およびR3がベンジル基である請求項3記載のミモシン誘導体。
- 請求項1ないし5のいずれかの項記載のミモシン誘導体を有効成分とするインフルエンザウイルスノイラミニダーゼ阻害剤。
- 請求項1ないし5のいずれかの項記載のミモシン誘導体を有効成分とするチロシナーゼ阻害剤。
- 請求項7記載のチロシナーゼ阻害剤を含有する美白化粧料。
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