JP2013113741A - 過酸化脂質の測定方法 - Google Patents
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Abstract
Description
が、従来の蛍光試薬Spy-LHPとは異なり、DMSOやエタノール等の極性溶媒に対して高い溶解性を有していることを見出し、細胞内の過酸化脂質をより高感度に測定することができることを確認した。
項1: 下記(a)及び(b)の工程を有する、過酸化脂質の測定方法:
(a)水性溶媒中で、下式(I)で示される化合物と過酸化脂質とを反応させる工程、
(A)下式(I)で示される化合物を水性溶媒に溶解させた状態で被験試料と接触させて、化合物(I)と被験試料中の過酸化脂質とを反応させる工程、及び
本発明が提供する過酸化脂質測定方法は、蛍光プローブとして下式(I)で示される化合物を使用することを特徴とする。
本発明の過酸化脂質の測定方法は、上記本発明の化合物(I)を過酸化脂質計測用試薬として用いて、過酸化脂質と反応して生じる蛍光性化合物(II)を指標として、過酸化脂質を蛍光検出することを特徴とする。
(a)本化合物(I)と過酸化脂質とを反応させる工程、及び
(b)上記(a)の反応で生じる蛍光性化合物(II)を、蛍光検出する工程。
また、(A)工程に引き続いて行われる(B)工程は、(b)の工程と同様に、(A)の工程で生じる蛍光性化合物(II)を蛍光検出する工程である。
下記の方法に従って、下式(I)で示される化合物(本発明の化合物(I))を特許文献1(特開2006-342135号公報)の実施例1に類似の方法で合成した。
4-ヨードアニリン(化合物2)4.38 gを原料とし、DMA、酢酸カリウム、酢酸パラジウム及びジフェニルホスフィン(化合物1)を加え、加熱還流したのち、得られた粗製物をシリカゲルカラムにより精製を行った。MSと1H-NMRにより生成物の確認を行った。
生成物の分析結果は以下のとおりであり、化合物3の生成を確認した。
収率 3.2305g(58.3 %)
性状 淡黄色油状
1H-NMR (TMS,CDCl3) δ(ppm)
3.6-4.0 (s, 2H, NH2), 6.6-6.7 (m, 2H, benzene), 7.1-7.2 (m, 2H, benzene),
7.25-7.35 (m, 10H, benzene)
MS m/z 277 (M+)。
3,4,9,10-ペリレンテトラカルボン酸二無水物(化合物4)1.41gを原料とし、3,6,9,12-オキサトリデシルアミン(化合物5)を反応させたのち、上記で製造した化合物3を精製することなく添加し、酢酸亜鉛及びイミダゾールを適宜加えて反応させた。得られた粗製物は、シリカゲルカラムにより精製を行った。MSと1H-NMRで生成物の確認を行った。
生成物の分析結果は以下のとおりであり、本発明の化合物(I)の生成が確認された。
収率 90mg(3.0 %)
性状 暗赤色粉末
1H-NMR (TMS,CDCl3) δ(ppm)
3.2-3.9 (m, 17H, methylene, methyl), 7.3-7.5 (m, 14H, benzene), 8.5-8.8 (m, 8H, perylene),
MS m/z 841 (M+)。
上記製造例で製造した本発明の化合物(I)の各種溶媒への溶解性を、下式(II)で示されるSpy-LHP(同仁化学研究所)と比較した。
製造例1で製造した本発明の化合物(I)と、本発明化合物(I)が過酸化物との反応により形成する酸化体である蛍光化合物の基礎的な蛍光特性を評価した。
本発明化合物(I)の過酸化脂質検出能を評価するため、エタノールに溶解した本発明化合物(I)に、脂溶性過酸化物であるリノール酸メチル過酸化物を添加し、蛍光測定を行った。測定の条件は次のとおりである。
本発明化合物(I)の濃度:1 μM
リノール酸メチル過酸化物の濃度:0〜200 nM
温度:室温(25±5℃)
測定に使用した励起波長(λex):524 nm
測定に使用した蛍光波長(λem):535 nm
バンド幅(励起/蛍光):2.5 nm/2.5 nm。
上記製造例で製造した本発明化合物(I)(以下、本化合物(I)ともいう)、及び比較化合物として上記式(II)で示されるSpy-LHP(同仁化学研究所)(以下、「比較化合物(II)」ともいう)を用いて、細胞中の過酸化脂質を蛍光顕微鏡にて測定した。
(1-1)DMSO溶解試薬
本化合物(I)を、1mM濃度になるように、室温でDMSOに溶解してDMSO溶解試薬とした。一方、比較化合物(II)は、上記本化合物(I)と同じ量を同量のDMSOに溶解して(室温)、溶解しきれなかった残渣を遠心分離することで除去した。比較化合物(II)の濃度は0.4〜0.6mM程度であった。
本化合物(I)および比較化合物(II)を、いずれも10mM濃度になるように、室温でクロロホルムに溶解してCHCl3溶解試薬とした。
脂質酸化開始剤として、2,2'-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]ジヒドロクロライド(AIPH)およびクメンヒドロペルオキシド(Cumene-OOH)を使用して、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞を処理して、細胞中の過酸化脂質のレベルを蛍光顕微鏡(Olympus IX-71落射蛍光顕微鏡)(励起波長:505 nm、蛍光波長:510-550 nm)で観察評価した。
本化合物(I)および比較化合物(II)の各CHCl3溶解試薬を使用して、細胞の過酸化脂質を測定した結果を図3(A:本化合物(I)、B:比較化合物(II))に示す。また、本化合物(I)および比較化合物(II)の各DMSO溶解試薬を使用して、細胞の過酸化脂質を測定した結果を図4(A:本化合物(I)、B:比較化合物(II))に示す。
本化合物(I)および比較化合物(II)について、実施例4と同様に調製したDMSO溶解試薬及びCHCl3溶解試薬をそれぞれ使用して、細胞中の過酸化脂質をフローサイトメーターを使用して測定した。
過酸化物として、実施例4と同様に、2,2'-アゾビス[2-(2-イミダゾリン-2-イル)プロパン]ジヒドロクロライド(AIPH)およびクメンヒドロペルオキシド(Cumene-OOH)を使用して、ヒト神経芽細胞腫SH-SY5Y細胞を処理して、細胞中の過酸化脂質のレベルを蛍光検出器を備えた下記条件のフローサイトメーター(Becton Dickinson FACSAria II)で測定した。
本化合物(I)および比較化合物(II)の各CHCl3溶解試薬及びDMSO溶解試薬を使用して処理した細胞について、フローサイトメーターで解析した結果を図5に示す。図中の無染色は本化合物(I)および比較化合物(II)を添加していない細胞を、Controlは本化合物(I)および比較化合物(II)のみで処理し、脂質酸化開始剤で処理していない細胞を表しており,AIPHおよびCumene-OOHはそれぞれ処理した脂質酸化開始剤を示している。
両化合物のCHCl3溶液を添加した場合は、両者とも細胞のダメージが強く検出操作に耐えられない状態であったと考えられる。
本化合物(I)を用いた細胞中の過酸化脂質検出法としては、下記の方法を奨励することができる。
1.本化合物(I) 50μgを含むチューブにDMSO 60μlを添加し、ピペッティングまたはボルテックスを使用して溶解する(濃度:1mmol/l [0.83mg/ml])。
2.上記で調製したプローブ溶液を、測定対象の細胞に添加する。例えば、細胞懸濁液(細胞数:1.0×105 cells/ml)1mlに対して適当量のプローブ溶液を添加する方法を挙げることができるが、このとき細胞懸濁液中のDMSO濃度が1%以下になるように、調整することが好ましい。
3.37℃で30分間インキュベートする。
4.蛍光顕微鏡、あるいはフローサイトメーター等で観察、分析する。
なお、観察及び分析に使用する測定条件は、実施例3に記載する条件に従うことができる。
Claims (4)
- 蛍光検出に用いる励起波長が480nm〜600nmであり、蛍光波長が500nm〜650nmである、請求項1または2に記載する測定方法。
- 被験試料中の脂質の過酸化度を測定する方法である、請求項2または3に記載する測定方法。
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