JP2013113711A - バイオセンサおよび被験液の測定方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】中心点Cから周辺に至る線分L1〜L4で区分された測定エリアA1〜A4を設け、各測定エリアにおける、標識リガンドと測定対象成分との反応性、および固定リガンドと測定対象成分との反応性の少なくとも一方は、他の1上の測定エリアにおける各反応性と異なるように調整する。
【選択図】図1
Description
免疫クロマトセンサで被験液中の測定対象成分(例えば抗原)を検出する方法としては、測定対象成分に対し特異的結合部位が異なる2種類の特異的結合物質(リガンド、例えば抗体)で分析対象成分を挟んで複合体を形成させるサンドイッチ法が一般的である。
この免疫クロマトセンサによれば、まず、被験液中の抗原と標識抗体が結合した複合体(抗原-標識抗体)が生成するが、この複合体は、被験液の展開とともに検出ラインに至り、サンドイッチ複合体(固定化抗体−抗原-標識抗体)として検出ラインに捕捉される。捕捉されるサンドイッチ複合体の量は、被験液中の抗原濃度に対応するので、該複合体の標識を目視、その他で検知することにより、被験液中の抗原濃度を求めることができる。
さらに、被験液中の測定対象成分濃度が検出濃度範囲を大きく超えると、プロゾーン現象(測定対象成分過多による擬陰性)を生じ、実際の被験液中の測定対象成分が高濃度であるにも関わらず、見かけ上低濃度に値する結果が得られることがある。
また、測定対象成分のおよその濃度が不明であると、適切な希釈倍率を決めることも困難であり、検出濃度範囲に入る適切な濃度とするために、何度も試行錯誤を行わなければならないという問題もあった。
具体的には、一端が被験液を添加する被験液添加部とされた短冊状の展開層に、標識抗体を、被験液の展開に伴って溶出可能な状態で保持させると共に、その下流側に第1および第2の検出ラインを順次設け、それらの検出ラインに、測定対象である抗原に対する親和力が互いに異なる固定化抗体を各々固定したバイオセンサが提案されている。
このバイオセンサによれば、上流側に配置された第1の検出ラインにおける検出においてプロゾーン現象が生じた場合、その下流側に配置した第2の検出ラインで、そのことを検知できるとされている。
また、各々の検出ラインの固定化抗体の抗原との親和性を互いに異なるものとしたことにより、各々の検出ラインは、異なる検出濃度範囲を持つことになり、結果として、各検出ラインの検出濃度範囲を合わせた、広い範囲の濃度範囲に対応可能になるとされている。
本発明は、上記事情に鑑みてなされたものであって、広い検出濃度範囲にわたって、正確な濃度測定を簡便に行うことが可能なバイオセンサおよび被験液の測定方法を提供することを課題とする。
[1]任意の点から周辺に至る2以上の線分で区分された複数の測定エリアを有するシート状の吸水体を備え、吸水体の一方の面における前記任意の点およびその近傍が被験液添加部とされ、複数の測定エリアには、各々被験液添加部から離れる方向に向かって標識部および結果表示部が順に配置されて、被験液添加部に添加された被験液が吸水体を展開して標識部と結果表示部を順次湿潤するように構成され、各標識部には、被験液中の測定対象成分と特異的に結合する標識リガンドが、被験液の湿潤により溶出可能な状態で吸水体に担持され、各結果表示部には、被験液中の測定対象成分と特異的に結合する固定リガンドが、被験液の湿潤によっても溶出不能な状態で吸水体に固定され、各測定エリアにおける、標識リガンドと測定対象成分との反応性、および固定リガンドと測定対象成分との反応性の少なくとも一方は、他の1以上の測定エリアにおける各反応性と異なるように調整されていることを特徴とするバイオセンサ。
[2]吸水体の一方の面の被験液添加部以外の部分であって、少なくとも標識部から結果表示部に至る部分が、非透水性の透明シートで被覆されている[1]に記載のバイオセンサ。
[3]吸水体の他方の面が、非透水性の基材シートで被覆されている[1]または[2]に記載のバイオセンサ。
[4]複数の測定エリアには、各々さらにマーカー部が配置され、該マーカー部には、当該測定エリアによって測定可能な測定対象成分の検出濃度範囲を示す表示が付されている[1]〜[3]のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
[5]吸水体はn個(但し、nは3以上の整数)の頂点を有する正多角形であり、n個の測定エリアを有する[1]〜[4]のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
[6]n個の測定エリアを区分する2以上の線分は、各々吸水体の中心点から、隣接する2つの頂点の中点に至る線分である[5]に記載のバイオセンサ。
[7]請求項1〜6のいずれか一項に記載のバイオセンサを、複数の測定エリアを区分する前記線分に添って被験液添加部が先端の位置となるように折り畳み、該被験液添加部を、被験液に浸漬することを特徴とする被験液の測定方法。
しかも、測定対象成分のおよその濃度が不明であっても、複数の検出濃度範囲の何れかの範囲に入る可能性が高まるので、適切な濃度とするために、希釈倍率を変えて何度も試行錯誤を行う必要がなくなる。
バイオセンサ10は、その上面から見た中心点Cとその近傍が被験液添加部4とされている。この被験液添加部4において、透明シート3には円形の穴3aが設けられ、吸水体2が露出するようになっている。
基材シート1は、吸水体2を補強できるものであれば特に限定はないが、非透水性の材質を用いることが好ましい。非透水性であることにより、検査担当者が被験液に接触することを避けることができ、血液、唾液、尿など感染のおそれがある溶液を被験液とする場合にも適切に取り扱うことができる。また、吸水体2の意図しない汚染を回避できる。
また、基材シート1は、不透明であることが好ましい。不透明であれば、基材シート1の外側からの光を遮断し、吸水体2における標識リガンドの観察が容易となる。基材シート1としては、例えば、乳白ポリエステルシートなどの不透明な樹脂フィルム、少なくとも一層は不透明な二層以上の樹脂をラミネートしたラミネートフィルム、紙を樹脂フィルムでラミネートしたラミネート紙等が使用できる。
透明シート3は、透明なシートであれば特に限定はない。ここで透明とは、後述の標識リガンドの標識物質からの信号を、透明シート3の外側から目視乃至は機械的に検出可能なことを意味する。透明シート3は、基材シート1と同様の理由で非透水性の材質を用いることが好ましい。透明シート3としては、例えば、透明ポリエステルシート、透明ポリプロピレンフィルムなどの透明な樹脂フィルム、透明な二層以上の樹脂をラミネートしたラミネートフィルム等が使用できる。
線分L1〜L4には、実線や破線等の印刷を施してもよいし、筋押し、ミシン目等の加工を施してもよい。印刷や加工を施すことにより、各測定エリアの境界を検査担当者が認識しやすくなる。また、線分L1〜L4に添った折り曲げも容易となる。印刷を施す場合、吸水体2に直接印刷を施してもよいし、基材シート1の吸水体2側や、透明シート3に印刷を施してもよい。筋押し、ミシン目等の加工を施す場合は、基材シート1、吸水体2、および透明シート3の積層体全体に対して施すことが加工の便宜上好ましい。
なお、線分L1〜L4に対する印刷や加工を施すことは必須ではない。すなわち、線分L1〜L4は、測定エリアA1〜A4を区分するためにだけ想定される仮想線であってもよい。
また、各測定エリアA1〜A4には、標識部R1〜R4よりも各頂点T1〜T4側に、各々結果表示部D1〜D4が設けられている。結果表示部D1〜D4は各々円弧状であり、全体として中心点Cを中心とするリング状とされている。なお、各結果表示部D1〜D4は、互いに連続していてもよいし、離間していてもよい。
また、各測定エリアA1〜A4には、結果表示部D1〜D4よりも各頂点T1〜T4側に、各々マーカー部M1〜M4が設けられている。
一方、結果表示部D1〜D4には、被験液中の測定対象成分と特異的に結合する固定リガンドが、被験液の湿潤によっても溶出不能な状態で吸水体2に固定されている。
本発明におけるリガンドは、ある特定の構造を有する物質(本発明の場合、測定対象成分)に特異的に結合する物質であり、抗原、抗体、核酸配列断片、エフェクター分子、レセプター分子、酵素とそのインヒビター、アビジン、ビオチン、糖鎖化合物、レクチン、アプタマー等が挙げられる。
測定対象成分とリガンドとの結合には、物理的吸着及び化学結合におけるイオン結合、共有結合、配位結合などが含まれる。
標識物質としては、金コロイド、セレニウムコロイド等の金属コロイド、染料色素で着色した着色ラテックス粒子、蛍光色素で着色した蛍光ラテックス粒子、半導体ナノ粒子、その他、着色した脂質小胞(リポソーム)や小胞などが挙げられる。
一方、結果表示部D1〜D4に固定されている固定リガンドは、標識リガンドのリガンドとは異なる種類のリガンドであり、標識リガンドのリガンドとは、測定対象成分の異なる部分と結合するリガンドである。
リガンドと測定対象成分との反応性は、例えば、結合に関与する適切なエピトープを選択したり、リガンドに測定対象成分との結合の立体障害となる基を導入したりすることにより調整できる。
標識リガンドと測定対象成分との反応性については、標識物質1つあたりに対するリガンドの結合量の大小によっても調整可能である。
表示は、検出濃度範囲を把握できるものであれば特に限定はなく、例えば、図1に示すような検出濃度範囲に対応するマークを付す他、検出濃度範囲に対応する色を付してもよい。さらに、検出濃度範囲を直接示す数値を記載してもよい。
表示は、吸水体2に直接印刷により付してもよいし、基材シート1の吸水体2側や、透明シート3に印刷により付してもよい。また、表示を行う位置は、結果表示部D1〜D4からの信号の検知を妨げない限り特に限定はない。吸水体2全体、若しくは基材シート1全体の色を測定エリア毎に変更してもよい。
いずれの方法においても、被験液は、被験液添加部4から各頂点T1〜T4および周辺P1〜P4に向かって毛細管現象により湿潤(展開)していく。
バイオセンサ10の被験液添加部4に対して被験液を滴下、又は被験液に被験液添加部4を浸すと、被験液添加部4に吸収された被験液は瞬時に周辺に向かって浸潤し、各標識部R1〜R4に担持されている標識抗体Rを被験液中に溶解または分散させて移動を継続する。被験液の中に抗原Aが存在すれば標識抗体Rは移動する間にその抗原Aと結合し、複合体X(標識抗体R−抗原A)を形成する。
この複合体Xが各結果表示部D1〜D4に固定されている固定抗体Dに到達すると、複合体(標識抗体R−抗原A)の抗原Aが固定抗体Dと結合し、そこにサンドイッチ複合体Y(固定抗体D−標識抗体R−抗原A)が捕捉される。
この捕捉されたサンドイッチ複合体Yの量を、目視又は機械的に検出することにより、被験液中の抗原Aの濃度を求めることができる。
なお、サンドイッチ複合体Yとして捕捉されなかった標識抗体Rは、さらに移動を継続してバイオセンサ10の周辺近傍に至る。この周辺近傍に至った標識抗体Rを確認することにより、被験液の展開が正常に行われたことを確認できる。
測定エリアA1の結果表示部D1のみにサンドイッチ複合体Yが検出された場合は、結果表示部D1において検出されたサンドイッチ複合体Yの量に基づいて抗原Aの濃度を求める。
測定エリアA2の結果表示部D2においてサンドイッチ複合体Yが検出され、測定エリアA3の結果表示部D3と測定エリアA4の結果表示部D4では検出されなかった場合は、結果表示部D2において検出されたサンドイッチ複合体Yの量に基づいて抗原Aの濃度を求める。
測定エリアA3の結果表示部D3においてサンドイッチ複合体Yが検出され、測定エリアA4の結果表示部D4では検出されなかった場合は、結果表示部D3において検出されたサンドイッチ複合体Yの量に基づいて抗原Aの濃度を求める。
測定エリアA4の結果表示部D4においてサンドイッチ複合体Yが検出された場合は、結果表示部D4において検出されたサンドイッチ複合体Yの量に基づいて抗原Aの濃度を求めることも可能であるが、プロゾーン現象が生じている可能性があるので、被験液を希釈して、若しくは希釈倍率をさらに高くして、再度別のバイオセンサ10を用いて試験を行うことが好ましい。
なお、サンドイッチ複合体Yが、いずれの測定エリアの結果表示部においても検出されない場合も、プロゾーン現象が生じている可能性があるので、注意が必要である。
すなわち、いずれか1組の測定エリアにおいて、標識リガンドと測定対象成分との反応性、および固定リガンドと測定対象成分との反応性の少なくとも一方が、他の1以上の測定エリアにおける各反応性と異なるように調整されていればよい。
また、被験液における抗原Aの濃度が高すぎても、低い希釈倍率で被験液を希釈すれば測定できるので、高希釈倍率とした場合よりも高い希釈精度が得られ、結果として高い精度で測定ができる。
また、本実施形態では、各測定エリアを区分する線分を、中心点Cから隣接する2つの頂点の中点に至る線分としたため、各測定エリアにおいて、中心点Cから1つの頂点に至る展開距離をとることができる。そのため、全体の面積を徒に大きくすることなく、充分な展開距離を得ることができる。また、各測定エリアの面積を均等にすることができる。
また、本実施形態では、4個の頂点を有する正方形としたので、大判のシート材料等から、無駄なく材料を切り出して製造が可能である。そのため、製造コストを抑制しやすい。
また、外形をm個(但し、mは4以上の偶数)の頂点を有する正多角形とし、m/2個の測定エリアを設ける構成としてもよい。この場合は、中心点Cから1つの頂点(但し、1つ置き)に至るm/2本の線分で区分すると、各測定エリアにおいて、中心点Cから1つの頂点に至る展開距離をとることができるので好ましい。
吸収体の外形が正多角形の場合の頂点の数は偶数であることが好ましい。正多角形の中でも正方形、正六角形が材料を効率的に使用して製造できるので好ましく、製造が容易であることから、正方形が特に好ましい。
また、外形は必ずしも正多角形である必要は無く、例えば、円形とすることができる。
また、複数の測定エリアを区分する線分に添って被験液添加部が先端の位置となるように折り畳み、該被験液添加部を、被験液に浸漬して測定する場合は、折り曲げを容易にするため、測定エリアの数は偶数であることが好ましい。
測定エリアの数は、あまり大きく過ぎると各エリアの面積が小さくなりすぎ、実用的でないため、20以下であることが好ましく10以下であることがより好ましい。
また、本実施形態のバイオセンサ10では、透明シート3が被験液添加部以外の全面で吸水体2を被覆する構成としたが、少なくとも標識部から結果表示部に至る部分が被覆されていればよい。例えば、周辺近傍において、吸水体2が露出する構成としてもよい。
さらに、基材シート1と透明シート3は必ずしも必須ではなく、いずれか一方、又は両方が無くてもよい。
また、吸水体2は、1葉のシートである必要はなく、例えば円形シートに1以上のリング状シートを重ねたものであってもよい。
10…バイオセンサ、20…ビーカー、
T1〜T4…頂点、P1〜P4…辺、C…中心点、L1〜L4…線分、
A1〜A4…測定エリア、R1〜R4…標識部、D1〜D4…結果表示部、
M1〜M4…マーカー部、A…抗原、R…標識抗体、D…固定抗体、
X…複合体、Y…サンドイッチ複合体
Claims (7)
- 任意の点から周辺に至る2以上の線分で区分された複数の測定エリアを有するシート状の吸水体を備え、
吸水体の一方の面における前記任意の点およびその近傍が被験液添加部とされ、
複数の測定エリアには、各々被験液添加部から離れる方向に向かって標識部および結果表示部が順に配置されて、被験液添加部に添加された被験液が吸水体を展開して標識部と結果表示部を順次湿潤するように構成され、
各標識部には、被験液中の測定対象成分と特異的に結合する標識リガンドが、被験液の湿潤により溶出可能な状態で吸水体に担持され、
各結果表示部には、被験液中の測定対象成分と特異的に結合する固定リガンドが、被験液の湿潤によっても溶出不能な状態で吸水体に固定され、
各測定エリアにおける、標識リガンドと測定対象成分との反応性、および固定リガンドと測定対象成分との反応性の少なくとも一方は、他の1以上の測定エリアにおける各反応性と異なるように調整されていることを特徴とするバイオセンサ。 - 吸水体の一方の面の被験液添加部以外の部分であって、少なくとも標識部から結果表示部に至る部分が、非透水性の透明シートで被覆されている請求項1に記載のバイオセンサ。
- 吸水体の他方の面が、非透水性の基材シートで被覆されている請求項1または2に記載のバイオセンサ。
- 複数の測定エリアには、各々さらにマーカー部が配置され、該マーカー部には、当該測定エリアによって測定可能な測定対象成分の検出濃度範囲を示す表示が付されている請求項1〜3のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
- 吸水体はn個(但し、nは3以上の整数)の頂点を有する正多角形であり、n個の測定エリアを有する請求項1〜4のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
- n個の測定エリアを区分する2以上の線分は、各々吸水体の中心点から、隣接する2つの頂点の中点に至る線分である請求項5に記載のバイオセンサ。
- 請求項1〜6のいずれか一項に記載のバイオセンサを、複数の測定エリアを区分する前記線分に添って被験液添加部が先端の位置となるように折り畳み、該被験液添加部を、被験液に浸漬することを特徴とする被験液の測定方法。
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