JP2013107854A - リパーゼ活性阻害剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 サラシア属植物の葉から単離された特異的ポリフェノールオリゴマーであり、構成ユニットに、エピアフゼレチンを含有するプロアントシアニジンオリゴマーであること、また、さらに、構成ユニットに、エピガロカテキン、エピカテキン及びエピアフゼレチンを構成ユニットとするプロアントシアニジンオリゴマーであって、リパーゼ活性阻害作用を有し、植物成分由来のリパーゼ阻害活性剤として、抗肥満剤、メタボリックシンドローム抑制剤、或いは、高脂血症の予防・改善剤に対する機能成分となる、安全性の高い、リパーゼ活性阻害剤である。
【選択図】 図1
Description
したがって、強い膵リパーゼ活性阻害、すなわち脂質の吸収阻害活性を有する天然由来成分の探索が精力的に行われている。
また、S. reticulataの葉の60%エタノール抽出物は幹よりも強いリパーゼ阻害活性のあることが明らかにされ、その抽出液を精製した活性画分が報告されている(特許文献13)。
そのためには、サラシア属植物の葉の膵リパーゼ阻害活性画分を手軽に取得し、その活性成分を明らかにすることができれば、より一層の利用機会が向上し、肥満、高脂血症、メタボリックシンドロームの軽減に寄与ができると考えられる。
その結果、サラシア属植物の葉の膵リパーゼ阻害活性画分から、活性成分として、特異的ポリフェノールオリゴマーを純度よく取得することに成功し、かかるポリフェノールオリゴマーが、構成ユニットに、エピアフゼレチンを含有するプロアントシアニジンオリゴマーであること、また、さらに、構成ユニットに、エピガロカテキン、エピカテキン及びエピアフゼレチンを構成ユニットとするプロアントシアニジンオリゴマーであることを確認し、本発明を完成させるに至った。
当該ポリフェノールオリゴマーは、エピアフゼレチン、或いは、エピガロカテキン、エピカテキン及びエピアフゼレチンを構成ユニットとするポリフェノールオリゴマー、特にプロアントシアニジンオリゴマー、或いはその配糖体であり、かかるポリフェノールオリゴマーの存在は、自然界では極めて特異的なものである、
なお、活性成分である活性ポリフェノール、すなわち、構成ユニットにエピアフゼレチンを含有するプロアントシアニジンオリゴマーは、自然界に存在するポリフェノールとして極めて特異的なものであるが、サラシア属植物に由来するものに限るものではない。
すなわち、サラシア・レティキュラータ(Salasia reticulata)葉を乾燥後、微粉砕する。
乾燥の程度は特に限定されないが、葉を室温〜80℃程度の温度条件下に、乾燥させるのがよい。
乾燥された葉を微粉砕するのであるが、抽出に適した微粉砕とすればよい。
残渣に5〜15倍、好ましくは10倍量程度のアルコール水溶液、例えば、60%エタノール水溶液を加えて、30〜100℃、好ましくは50〜80℃程度に加温し、1〜4時間、好ましくは2時間程度の振とう抽出を行い、60%エタノール抽出画分を得る。
得られた50%アセトン溶出画分を、ゲル濾過用のセファデックスLH20充填カラムにチャージした後、エタノール水溶液の10%〜99.8%までのグラジエント溶出画分を除き、さらにアセトン10〜20%溶出画分を除き、最後に40%アセトン溶液にて溶出し、40%アセトン溶出画分を得る。
なお、本発明の活性ポリフェノールの取得方法は、上記の手段に限定されず、用いる溶媒、その濃度等を種々変更できることはいうまでもない。
固形組成物としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤等の形態を採ることができ、固形組成物の調製時には、各種の添加剤を、本発明の効果を損なわない範囲で適宜配合することができる。
そのような添加剤としては、例えば、一般的な賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味矯臭剤、増量剤、被覆剤、酸味料、及び保存料などが挙げられる。
なお、本発明のリパーゼ活性阻害剤の摂取量としては、目的とする症状等の改善のレベルに応じて適宜選択することができる。
サラシア・レティキュラータ葉の乾燥粉砕物50gに、9倍量(450mL)の水を加えて50℃/2時間の振とう抽出を行った後、3000rpm/10分で遠心を行い、上澄み液を廃棄した。
得られた残渣に、60%エタノール水溶液450mLを加えて、50℃/2時間の振とう抽出を行った後、3000rpm/10分で遠心を行い、得られた上澄み液を、60%エタノール水溶液抽出液とした。当該60%エタノール水溶液抽出液中には、約400mgの不揮発成分が含まれていた。
得られた60%エタノール水溶液抽出液を、イオン交換樹脂HP20(三菱化学社製)に通液してチャージした後、水溶出、アセトン20%水溶液溶出画分を廃棄し、次いでアセトン50%水溶液溶出画分を取得した。このアセトン50%水溶液溶出画分には約100mgの不揮発成分が含まれていた。
得られた50%アセトン水溶液溶出画分を、セファデックスLH20で充填したゲル濾過カラムに通液してチャージした後、まずエタノール50%〜99.8%水溶液、次いで、アセトン20%〜40%水溶液を通液して、得られた画分を廃棄し、最後にアセトン60%水溶液を通液して、溶出画分を取得した。
このアセトン60%水溶液溶出画分には、活性成分として、約7〜10mgの不揮発成分が含まれていた。
上記の実施例1で得たアセトン60%水溶液溶出画分(精製画分)中のポリフェノール含量を、フォーリン・チオカルト法にて求めた。
すなわち、標準試料として種々の濃度(0〜40ppm)の試薬ガーリック酸溶液を調製した。次いで、この標準試料溶液0.5mとフォーリン・チオカルト、フェノール試薬5mLを加え、攪拌後、25℃で静置3分後に20%炭酸ナトリウム水溶液5mLを加え、25℃で1時間静置後の700nmの吸光度を測定し、検量線を作成した。
ついで、40ppmの不揮発成分を含む精製画分試料溶液0.5mLを前記と同様の操作を行って、吸光度を測定した結果、34ppmのガーリック酸(没食子酸:gallic acid)に相当する吸光度を示した。
したがって、精製画分には、ガーリック酸として85%相当のポリフェノールが含まれていることになる。
活性成分には糖が含まれている可能性があること、また、活性成分はポリフェノールのポリマーである可能性が高いことなどを考慮すると、取得した精製画分のほぼすべてがポリフェノール成分であると推測された。
活性ポリフェノール成分は、薄層クロマトグラフィー(TLC)分析では原点として検出されること、また、サラシア属植物ポリフェノールには、エピカテキン(EC)、エピガロカテキン(EGC)などを構成ユニットとするプロアントシアニジンが多く存在することから、分子量の比較的大きいプロアントシアニジンと推察された。
そこで、活性ポリフェノール成分の構成ユニットを明らかにする目的で、下記の方法でメルカプトエタノールによるチオール分解を行った。
すなわち、試料溶液(活性ポリフェノール溶液)100μLを1mLのバイアル瓶に移し、窒素ガスを吹き込み、アセトンを除き、水溶液とした。メルカプトエタノール試液(2−メルカプトエタノール50mL、0.05M塩酸80mL、エタノール550mL、水320mLを混合したもの)200μLを加え、密栓して75℃で7時間加熱し、反応液をHPLCで分析した。
カラム:Cosmosil 5C18-AR II(ナカライテスク)、4.6mm×250mm
移動相:アセトニトリル(50mMリン酸)溶液、4−30%(39分)、30−75%(15分)のグラジエント
流速:0.8mL/分
なお、これら同定された構成ユニットのうち、EGC、ECは高分子化合物の末端ユニットに由来し、チオエーテル化合物である、FAF−ME、EGC−ME、及びEC−MEは延長ユニットに由来する。したがって、チオエーテル分解される前の高分子化合物の構造、すなわち活性ポリフェノールであるプロアントシアニジンの構造は、上記の化学式に記載のものであり、例えば図1に示したようなチオール分解構造を有するものと推測された。
膵リパーゼは、ブタ由来膵リパーゼ(MP Biochemicals, Inc.,カリホルニア、米国)を用い、その活性測定はリパーゼキットS(大日本製薬製)を用いて、定法に従って行った。
リパーゼ活性は、反応液に酵素を入れた場合と入れない場合の反応に伴って発色する反応液の吸光度(412nm)の差で評価した。
試料の阻害活性は、反応液中に試料を添加した場合と、試料の代わりにバッファーを添加した場合のリパーゼ活性の比較を行うことによって求めた。
反応は30℃、30分で行った。
反応液中の活性ポリフェノール濃度と阻害率の関係を、下記表1に示した。
この結果から、活性ポリフェノール(エピアフレゼチン含有プロアントシアニジンオリゴマー)のIC50は、22ppmと評価された。
当該ポリフェノールオリゴマーは、エピアフゼレチン(EAF)、或いは、エピガロカテキン(EGC)、エピカテキン(EC)及びエピアフゼレチン(EAF)を構成ユニットとするポリフェノールオリゴマー、特にプロアントシアニジンオリゴマー、或いはその配糖体であり、サラシア属植物、特にサラシア属植物の葉に多く存在することから、植物成分由来のリパーゼ活性阻害剤として、安全なものである。
Claims (7)
- リパーゼ阻害活性成分が、構成ユニットにエピアフゼレチンを含有するプロアントシアニジンオリゴマーあるいはその配糖体であることを特徴とするリパーゼ阻害剤。
- リパーゼ阻害活性成分が、エピガロカテキン、エピカテキン及びエピアフゼレチンを構成ユニットとするプロアントシアニジンオリゴマーあるいはその配糖体であることを特徴とするリパーゼ阻害剤。
- リパーゼ阻害活性成分が、サラシア・レティキュラータ(Salacia reticulata)由来のものであることを特徴とする請求項1又は2に記載のリパーゼ阻害剤。
- リパーゼ阻害活性成分が、サラシア・レティキュラータ(Salacia reticulata)の葉由来のものであることを特徴とする請求項1又は2に記載のリパーゼ阻害剤。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のリパーゼ阻害剤を機能成分とする抗肥満剤。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のリパーゼ阻害剤を機能成分とするメタボリックシンドローム抑制剤。
- 請求項1〜4のいずれかに記載のリパーゼ阻害剤を機能成分とする高脂血症の予防・改善剤。
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