JP2013091606A - 血清コレステロール量低下剤、及び血清コレステロール量を低下させる方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】ローヤルゼリーに含まれている胆汁酸結合能や高コレステロール血症改善能を備える特定の成分と１０−ヒドロキシ−２−デセン酸とを有効成分とする血清コレステロール量低下剤、及び当該血清コレステロール量低下剤を用いて血清コレステロール量を低下させる方法の提供。
【解決手段】ＭＲＪＰ１及び１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とすることを特徴とする、血清コレステロール量低下剤、並びに、ＭＲＪＰ１及び１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を経口摂取することを特徴とする、血清コレステロール量を低下させる方法。
【選択図】なし
【解決手段】ＭＲＪＰ１及び１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とすることを特徴とする、血清コレステロール量低下剤、並びに、ＭＲＪＰ１及び１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を経口摂取することを特徴とする、血清コレステロール量を低下させる方法。
【選択図】なし
Description
本発明は、ローヤルゼリー由来の特定のタンパク質及び脂肪酸を有効成分とする血清コレステロール量低下剤、並びに、当該タンパク質及び脂肪酸を用いた血清コレステロール量を低下させる方法に関する。
世界保健機関（ＷＨＯ）の統計では、世界の死因の第１位は、動脈硬化症等の心臓血管疾患である。血液中のＬＤＬ−コレステロール濃度が過剰に高いことが動脈硬化症の主因と考えられており、コレステロール代謝を改善するためのより効果的な医薬品や機能性食品の開発が強く求められている。
近年、ローヤルゼリー（以下、ＲＪ）の摂取により、高コレステロール血症が改善されるという報告がなされている（例えば、非特許文献１〜４参照。）。また、ＲＪには、一般成分として粗タンパク質が１２〜１５％含まれているほかに、特殊成分として１０−ヒドロキシ−２−デセン酸（以下、「デセン酸」と略記することがある。）とロイヤリシンが含まれているが、このデセン酸は、高脂血症ラットの血液中のトリグリセリド、総コレステロールを減少させるという報告がなされている（例えば、非特許文献５参照。）。
一方で、コール酸を結合させた担体を充填させたカラムを胆汁酸結合アフィニティーカラム（胆汁酸結合能を有する成分に対するアフィニティーカラム）として用い、血清アルブミンを単離する方法（例えば、非特許文献６参照。）や、胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いて、大豆タンパク質の中から胆汁酸結合能を有するタンパク質を単離・同定する方法（例えば、非特許文献７及び８参照。）等が開示されている。
ナカジン（Nakajin）、他４名、生薬学雑誌、１９８２年、第３６巻、第６５〜６９ページ。
ヴィテック（Vittek）、エクスペリエンチア（Experientia）、１９９５年、第５１巻、第９２７〜９３５ページ。
グオ（Guo）、他６名、ジャーナル・オブ・ニュートリショナル・サイエンス・アンド・ビタミノロジー（Journal of Nutritional Science and Vitaminology）、２００７年、第５３巻、第３４５〜３４８ページ。
カマクラ（Kamakura）、他２名、ジャーナル・オブ・ファーマシー・アンド・ファーマコロジー（Journal of pharmacy and pharmacology）、２００６年、第５８巻、第１６８３〜１６８９ページ。
ク（Xu）、他２名、ジョン・ヤオ・カイ（Zhong Yao Cai）（英文誌名：ジャーナル・オブ・チャイニーズ・メディシナル・マテリアルズ（Journal of chinese medicinal materials））、２００２年、第２５巻、第３４６〜３４７ページ。
パッチンソン（Pattinson）、他２名、ジャーナル・オブ・クロマトグラフィー（Journal of Chromatography）、１９８０年、第１８７巻、第４０９〜４１２ページ。
マキノ（Makino）、他４名、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry）、１９８８年、第５２巻、第８０３〜８０９ページ。
ミナミ（Minami）、他３名、アグリカルチュラル・アンド・バイオロジカル・ケミストリー（Agricultural and Biological Chemistry）、１９９０年、第５４巻、第５１１〜５１７ページ。
また、ＲＪは、働き蜂が下咽頭腺と大腮腺から分泌する乳白色ゼリー状の栄養物質である。ＲＪは女王蜂幼虫の唯一の食糧であり、様々なビタミン類、ミネラル、糖質、アミノ酸、タンパク質成分を含み、非常に栄養価が高い。また、科学的に立証されてはいないものの、昔から、疲労回復作用、抗アレルギー作用、抗癌作用、免疫増強作用等の多くの薬理作用を有すると考えられており、栄養補助食品や医薬品原料として広く用いられている。このため、ＲＪ由来の成分を有効成分とすることにより、安全な新しい高コレステロール血症予防・改善のための食品や医薬品を開発し得ることが期待される。
ＲＪ中には様々な成分が含まれているため、新規の医薬品や機能性食品を開発するためには、ＲＪ中の有効成分の特定が不可欠である。しかしながら、非特許文献１〜４では、ＲＪ自身には、高コレステロール血症改善効果があることは明らかにされているものの、その有効成分については全く解明されておらず、その作用機序も未解明である。
本発明は、ＲＪに含まれている胆汁酸結合能や高コレステロール血症改善能を備える特定の成分を有効成分とする胆汁酸結合剤、及び当該特定成分を用いて血清コレステロール量を低下させる方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いてＲＪから胆汁酸結合能を有する複数の成分を特定し、これらの成分の胆汁酸結合能や血清コレステロールに対する影響を調べ、血清コレステロール量低下作用を有する新たな成分を特定することにより、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は、以下の血清コレステロール量低下剤及び血清コレステロール量を低下させる方法を提供するものである。
（１） ＭＲＪＰ１及び１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とすることを特徴とする、血清コレステロール量低下剤。
（２） ＭＲＪＰ１及び１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を経口摂取することを特徴とする、血清コレステロール量を低下させる方法。
（１） ＭＲＪＰ１及び１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とすることを特徴とする、血清コレステロール量低下剤。
（２） ＭＲＪＰ１及び１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を経口摂取することを特徴とする、血清コレステロール量を低下させる方法。
本発明の血清コレステロール量低下剤や血清コレステロール量を低下させる方法においては、ＲＪ由来の血清コレステロール量低下作用を有する特定のタンパク質及び脂肪酸を併用して経口服用することにより、血清コレステロール量を安全に低下させることができる。したがって、本発明の血清コレステロール量低下剤等は、特に高コレステロール血症や動脈硬化症等の、血清中のコレステロール量の増大に起因する疾患に対する治療や予防効果が期待される。
本発明の血清コレステロール量低下剤の有効成分の１つであるＭＲＪＰ１（Ｍａｊｏｒ ｒｏｙａｌ ｊｅｌｌｙ ｐｒｏｔｅｉｎ １）は、後記参考例において示すように、ＭＲＪＰ２及びＭＲＪＰ３と共に、胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いて、ＲＪから初めて単離・同定された胆汁酸結合タンパク質である。胆汁酸結合アフィニティークロマトグラフィーを使用した胆汁酸結合タンパク質の単離・同定法は、本発明者らにより初めて、ＲＪに対して適用された。
ＭＲＪＰ１はＲＪに含まれているタンパク質全体の約３９．４％を占めるタンパク質であり、ＭＲＪＰ２はＲＪに含まれているタンパク質全体の約２１．５％を占めるタンパク質であり、ＭＲＪＰ３はＲＪに含まれているタンパク質全体の約２１．２％を占めるタンパク質である（泉宏樹、米倉政実著。「ローヤルゼリータンパク質のプロテオーム解析」、社団法人全国ローヤルゼリー公正取引協議会、平成２０年度報告書（２００８年）、第２１ページ。）。ＭＲＪＰ１は、４３２アミノ酸からなるタンパク質であり、一般的にはＳＤＳ−ＰＡＧＥでは約５５ｋＤａの分子量として知られている（J.Schmitozova et. al, Cell.Mol.Life Sci., vol.54, p1020-1030 (1998)）。また、ＭＲＪＰ１は、アメリカ合衆国のＮＣＢＩ（国立生物工学情報センター）の配列データベースに、アクセッション番号ＮＰ＿００１０１１５７９として登録されている。ＭＲＪＰ２は、４５２アミノ酸からなるタンパク質であり、一般的にはＳＤＳ−ＰＡＧＥでは約４９ｋＤａの分子量として知られている（J.Schmitozova et. al, Cell.Mol.Life Sci., vol.54, p1020-1030 (1998)）。また、ＭＲＪＰ２のＮＣＢＩのアクセッション番号はＮＰ＿００１０１１５８０である。ＭＲＪＰ３は、５４４アミノ酸からなるタンパク質であり、一般的にＳＤＳ−ＰＡＧＥでは６０〜７０ｋＤａの分子量である（J.Schmitozova et. al, Cell.Mol.Life Sci., vol.54, p1020-1030 (1998)）。また、ＭＲＪＰ３のＮＣＢＩのアクセッション番号はＮＰ＿００１０１１６０１である。
ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、及びＭＲＪＰ３は、胆汁酸結合能を有するため、胆汁酸結合剤の有効成分として用いることができる。例えば、ＭＲＪＰ１、ＭＲＪＰ２、及びＭＲＪＰ３からなる群より選択される１種以上を有効成分とする胆汁酸結合剤を、培養細胞等の生物個体外の細胞へ用いる場合には、培養液中のＭＲＪＰ１等の有効成分の含有量が１０ｍｇ〜１００mｇ／ｍＬとなるように、当該胆汁酸結合剤を培養液へ添加することができる。
ＭＲＪＰ１は、胆汁酸結合能に加えて、コレステロールミセルの溶解低下作用と、血清コレステロール量低下作用とを有する。すなわち、ＭＲＪＰ１は、コレステロールミセルの溶解抑制剤及び血清コレステロール量低下剤の有効成分として好適である。
すなわち、本発明の血清コレステロール量低下剤は、ＭＲＪＰ１及びデセン酸を有効成分とすることを特徴とする。デセン酸は、高脂血症ラットの血液中のトリグリセリド、総コレステロールを減少させる効果を有しており（非特許文献５参照。）、ＭＲＪＰ１と併用することにより、より顕著な血清コレステロール低下作用が奏される。
本発明の血清コレステロール量低下剤の有効成分として用いられるＭＲＪＰ１には、ＭＲＪＰ１中の１〜数個のアミノ酸を欠失、置換若しくは付加させたタンパク質であって、血清コレステロール量低下作用を有するタンパク質も含まれる。例えば、ＭＲＪＰ１のＮ末端やＣ末端にそれぞれ、１〜１０個、好ましくは１〜５個のアミノ酸を付加することができる。ＭＲＪＰ１のＮ末端やＣ末端に付加させるアミノ酸配列としては、例えば、Ｈｉｓタグ等の通常、リコンビナントタンパク質の生成に用いられるタグ配列等が挙げられる。
食事由来のコレステロールは、レシチン、脂肪酸、胆汁酸等とミセルを形成し、水溶性となり、非撹拌水層（ＵＷＬ）を通過し、小腸から吸収される。このような小腸におけるコレステロール吸収メカニズムから、ＭＲＪＰ１は、小腸内において、胆汁酸と結合することにより、コレステロールのミセル形成を抑制し、さらにコレステロールミセルの溶解性を低下させることによって、コレステロールの吸収を抑制すると推察される。
本発明の血清コレステロール量低下剤の有効成分として用いられるＭＲＪＰ１は、ＲＪから精製されたものであってもよく、遺伝子組換え技術を用いた公知の発現系により合成されたリコンビナントタンパク質であってもよく、ペプチド合成により得られた合成品であってもよい。例えば、ＲＪタンパク質溶液を胆汁酸結合アフィニティークロマトグラフィーによって分画し、ＭＲＪＰ１を含有する画分を回収する。この回収された画分を、本発明の血清コレステロール量低下剤の有効成分とすることができる。また、ＲＪタンパク質溶液をゲル濾過クロマトグラフィーによって分画し、ＭＲＪＰ１を含有する画分を回収する。この回収された画分を、本発明の血清コレステロール量低下剤の有効成分とすることもできる。
本発明の血清コレステロール量低下剤は、医薬品やサプリメント等の飲食品として単独で摂取されてもよく、他の飲食用組成物や医薬用組成物と同様に、飲食品や医薬品への添加剤として用いることもできる。
本発明の血清コレステロール量低下剤の剤型は、特に限定されるものではない。例えば、ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤、錠剤、顆粒剤、散剤、液剤、軟膏剤、クリーム剤、ゲル剤等であってもよい。培養細胞等へ用いられる場合には、乾燥粉末や、水や緩衝液等の適当な溶液に溶解させた液剤であることが好ましい。一方、生物個体へ用いられる場合には、経口投与に適した剤型であることが好ましく、腸溶剤であることがより好ましい。
本発明の血清コレステロール量低下剤に含まれるＭＲＪＰ１及びデセン酸の量は、ＭＲＪＰ１及びデセン酸の両者がそれぞれ血清コレステロール量低下能を発揮し得る量であれば、特に限定されるものではなく、ＭＲＪＰ１の精製方法や合成方法、剤型、一日の摂取量等を考慮して、適宜決定することができる。
本発明の血清コレステロール量低下剤は、ＭＲＪＰ１及びデセン酸のみからなるものであってもよく、その他の成分を含有するものであってもよい。その他の成分としては、ＭＲＪＰ１及びデセン酸の活性を損なわない限り、どのような成分であってもよく、例えば、ＭＲＪＰ１又はデセン酸以外のＲＪ由来の成分を含有していてもよく、胆汁酸結合能や血清コレステロール低下能を有する機能性ペプチドを含有していてもよい。その他にも、本発明の血清コレステロール量低下剤は、例えば、賦型剤、結合剤、界面活性剤、酸化防止剤、ｐＨ調整剤、崩壊剤、滑沢剤、防腐剤、殺菌剤、着色剤、矯味矯臭剤等の、医薬品や飲食品に添加される成分を含有することができる。
本発明の血清コレステロール量低下剤の製造方法は、含有されるＭＲＪＰ１及びデセン酸の活性を損なわない方法であれば特に限定されるものではなく、通常、機能性タンパク質及び脂肪酸を含有する飲食用組成物又は医薬用組成物を製造する場合に使用される方法を用いて製造することができる。
本発明の血清コレステロール量低下剤の投与量は、ＭＲＪＰ１及びデセン酸による血清コレステロール量低下作用が発揮され得る量であれば、特に限定されるものではなく、血清コレステロール量低下剤中のＭＲＪＰ１及びデセン酸の含有量、剤形、対象とする細胞の種類や状態、投与方法等を考慮して適宜決定することができる。
例えば、生物個体に摂取させる場合には、本発明の血清コレステロール量低下剤の摂取量は、ＭＲＪＰ１及びデセン酸による血清コレステロール量低下作用が発揮され得る量であれば、特に限定されるものではなく、摂取する人や動物の体重、年齢、性別、剤型等により適宜決定することができる。例えば、ＭＲＪＰ１及びデセン酸の一日当たりの摂取量がそれぞれ３００ｍｇ〜１ｇ／ｋｇとなるように、１度に又は数回に分けて摂取させることが好ましい。
本発明の血清コレステロール量低下剤は、経口摂取することにより、生体内において、胆汁酸と結合し、さらに、食事として摂取されたコレステロールのミセルの溶解性を低下させる結果、血清コレステロール量を低減させる。このため、本発明の血清コレステロール量低下剤は、高コレステロール血症や動脈硬化症等の、血清中のコレステロール量が過剰となることに起因する疾患の治療や予防に好適である。
本発明の血清コレステロール量を低下させる方法（以下、血清コレステロール量低下方法）は、ＭＲＪＰ１及びデセン酸を経口摂取することを特徴とする。ＭＲＪＰ１及びデセン酸を経口摂取させる生物は、小腸や胆管等の組織を有する動物であれば特に限定されるものではなく、ヒトであってもよく、マウス、ラット、イヌ、ネコ、サル、ウシ等のヒト以外の動物であってもよい。
本発明の血清コレステロール量低下方法においては、本発明の血清コレステロール量低下剤を経口摂取してもよく、ＭＲＪＰ１を含有する組成物とデセン酸を含有する組成物とを同時に経口摂取してもよい。また、ＭＲＪＰ１及びデセン酸が、生体内において実質的に同時に血清コレステロール量低下作用を発揮し得るように、両者を経口摂取すればよい。例えば、ＭＲＪＰ１及びデセン酸のいずれか一方を先に服用した後、例えば３０分間以内に、残る一方を服用してもよい。
次に実施例等を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［参考例１］
＜胆汁酸結合アフィニティーカラムの作製＞
胆汁酸結合アフィニティーカラムは、カルボジイミドをスペーサーとして、コール酸をカラム担体であるＥＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂに結合させることにより作製した。胆汁酸結合アフィニティーカラムの調製方法は、Ｐａｔｔｉｎｓｏｎらの方法（非特許文献６）に準じて行った。
具体的には、まず、ＥＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ担体５０ｍＬ容量に対し、６２５ｍＬの胆汁酸溶液（スペーサーとして３３．４ｍＭ １−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ＨＣｌと３．７ｍＭのコール酸を含む５０％エタノール溶液）をｐＨ６．４で１６時間反応させ、担体にコール酸を結合させた。その後、カラムに非吸着の過剰なコール酸溶液を０．５Ｍ ＮａＣｌを含む５０％エタノールで洗浄したものを充填することにより、胆汁酸結合アフィニティーカラム（カラムのベッド容量：５０ｍＬ）を作製した。なお、カラムは使用前に０．０２％ＮａＮ３溶液にて平衡化した。
＜胆汁酸結合アフィニティーカラムの作製＞
胆汁酸結合アフィニティーカラムは、カルボジイミドをスペーサーとして、コール酸をカラム担体であるＥＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂに結合させることにより作製した。胆汁酸結合アフィニティーカラムの調製方法は、Ｐａｔｔｉｎｓｏｎらの方法（非特許文献６）に準じて行った。
具体的には、まず、ＥＡＨ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ担体５０ｍＬ容量に対し、６２５ｍＬの胆汁酸溶液（スペーサーとして３３．４ｍＭ １−ｅｔｈｙｌ−３−（３−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｐｒｏｐｙｌ）ｃａｒｂｏｄｉｉｍｉｄｅ ＨＣｌと３．７ｍＭのコール酸を含む５０％エタノール溶液）をｐＨ６．４で１６時間反応させ、担体にコール酸を結合させた。その後、カラムに非吸着の過剰なコール酸溶液を０．５Ｍ ＮａＣｌを含む５０％エタノールで洗浄したものを充填することにより、胆汁酸結合アフィニティーカラム（カラムのベッド容量：５０ｍＬ）を作製した。なお、カラムは使用前に０．０２％ＮａＮ３溶液にて平衡化した。
＜胆汁酸結合アフィニティーカラムによる分画＞
次いで、作製されたカラムが、実際に胆汁酸結合能を有する化合物に対するアフィニティーを備えているかどうかを、ＢＳＡとＯｖａｌｂｕｍｉｎをアプライすることにより、確認した。カラムからの溶出条件は、マキノらの方法（非特許文献７）に準じて行った。
まず、作製された胆汁酸結合アフィニティーカラムに、１．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液又はＯｖａｌｂｕｍｉｎ溶液をアプライした。次に、当該カラムに第１次洗浄液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を通し、当該カラム中の担体に吸着していなかった物質を洗浄除去した。次いで、当該カラムに、溶出液（０．５％Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を通し、コール酸と結合したタンパク質、すなわち胆汁酸結合能を有するタンパク質を溶出した。最後に、当該カラムに、第２次洗浄液（８Ｍ ｕｒｅａ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を通し、当該カラムに非特異的に結合した物質を溶出した。
次いで、作製されたカラムが、実際に胆汁酸結合能を有する化合物に対するアフィニティーを備えているかどうかを、ＢＳＡとＯｖａｌｂｕｍｉｎをアプライすることにより、確認した。カラムからの溶出条件は、マキノらの方法（非特許文献７）に準じて行った。
まず、作製された胆汁酸結合アフィニティーカラムに、１．５ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ溶液又はＯｖａｌｂｕｍｉｎ溶液をアプライした。次に、当該カラムに第１次洗浄液（０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を通し、当該カラム中の担体に吸着していなかった物質を洗浄除去した。次いで、当該カラムに、溶出液（０．５％Ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔｅ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を通し、コール酸と結合したタンパク質、すなわち胆汁酸結合能を有するタンパク質を溶出した。最後に、当該カラムに、第２次洗浄液（８Ｍ ｕｒｅａ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）を通し、当該カラムに非特異的に結合した物質を溶出した。
各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を図１に示す。図１中、「（１）」が第１次洗浄液の画分であり、「（２）」が溶出液の画分であり、「（３）」が第２次洗浄液の画分である。この結果、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎは第１次洗浄液の画分に溶出されており、ＢＳＡは溶出液の画分に溶出されていた。これらの結果から、作製された胆汁酸結合アフィニティーカラムは、非特許文献７に記載されている胆汁酸結合アフィニティーカラム同様に、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎは吸着せず、ＢＳＡを吸着することが確認された。
［参考例２］
＜胆汁酸結合アフィニティーカラムによるＲＪタンパク質の分画＞
参考例１で作製された胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いて、ＲＪタンパク質の分画を行い、胆汁酸結合能を有するタンパク質を単離・精製した。この胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いたＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の単離精製は、これまで報告が無く、非常に効率的な精製法である。
まず、ＲＪタンパク質溶液を調製した。具体的には、ＲＪ（中国産）に純水を加えて懸濁したものを、孔径１０ｋＤａの透析膜を用いて、純水にて７２時間透析した。透析膜内液を回収し、凍結乾燥した後、再びＮａＮ３含有トリス緩衝液（０．２％ＮａＮ３、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に懸濁し、１１７ｍｇ／２５ｍＬのＲＪタンパク質溶液（１０ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ ＲＪ）を調製した。
＜胆汁酸結合アフィニティーカラムによるＲＪタンパク質の分画＞
参考例１で作製された胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いて、ＲＪタンパク質の分画を行い、胆汁酸結合能を有するタンパク質を単離・精製した。この胆汁酸結合アフィニティーカラムを用いたＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の単離精製は、これまで報告が無く、非常に効率的な精製法である。
まず、ＲＪタンパク質溶液を調製した。具体的には、ＲＪ（中国産）に純水を加えて懸濁したものを、孔径１０ｋＤａの透析膜を用いて、純水にて７２時間透析した。透析膜内液を回収し、凍結乾燥した後、再びＮａＮ３含有トリス緩衝液（０．２％ＮａＮ３、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０））に懸濁し、１１７ｍｇ／２５ｍＬのＲＪタンパク質溶液（１０ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ ＲＪ）を調製した。
次いで、参考例１で作製された胆汁酸結合アフィニティーカラムに、ＲＪタンパク質溶液をアプライした後、参考例１と同様にして、第１次洗浄液、溶出液、第２次洗浄液を順次当該カラムにアプライした。各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を図２に示す。図２中、「（１）」、「（２）」、及び「（３）」は図１と同じである。
さらに、溶出液により溶出された画分（図２中の「Ａ」、以下、「画分Ａ」）を回収した。
さらに、溶出液により溶出された画分（図２中の「Ａ」、以下、「画分Ａ」）を回収した。
＜胆汁酸結合アフィニティーカラムにより単離・精製されたＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の同定＞
胆汁酸結合アフィニティーカラムにより単離・精製されたＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の同定を行った。
まず、画分Ａを孔径１０ｋＤａの透析膜を用いて、純水にて４℃、７２時間透析・脱塩した。透析膜内液を回収し、凍結乾燥することにより、脱塩画分Ａを調製した。
次いで、脱塩画分Ａを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、含まれているタンパク質を分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３に示す。図３中、「ｓｔｄ」は分子量マーカーを、「Ａ」は脱塩画分Ａを意味し、これらをそれぞれアプライしたものである。この結果、「Ａ」レーンには約４９〜７５ｋＤａの範囲内に３本のバンド（図３中、（１）〜（３））が検出された。この結果から、脱塩画分Ａ溶液には、胆汁酸と結合する３種類のＲＪ由来タンパク質が含まれていたことが明らかである。
胆汁酸結合アフィニティーカラムにより単離・精製されたＲＪ由来胆汁酸結合タンパク質の同定を行った。
まず、画分Ａを孔径１０ｋＤａの透析膜を用いて、純水にて４℃、７２時間透析・脱塩した。透析膜内液を回収し、凍結乾燥することにより、脱塩画分Ａを調製した。
次いで、脱塩画分Ａを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、含まれているタンパク質を分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を図３に示す。図３中、「ｓｔｄ」は分子量マーカーを、「Ａ」は脱塩画分Ａを意味し、これらをそれぞれアプライしたものである。この結果、「Ａ」レーンには約４９〜７５ｋＤａの範囲内に３本のバンド（図３中、（１）〜（３））が検出された。この結果から、脱塩画分Ａ溶液には、胆汁酸と結合する３種類のＲＪ由来タンパク質が含まれていたことが明らかである。
各バンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルから切り出し、還元アルキル化した後、トリプシン処理によりＩｎ−ｇｅｌ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎを行った。その後、ゲルより抽出したペプチド断片を脱塩精製して、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにて質量分析を行った。この結果、図３中、バンド（１）はＭＲＪＰ３、バンド（２）はＭＲＪＰ１、バンド（３）はＭＲＪＰ２であると同定された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果、得られたＣＢＢ染色像を画像解析（Ｉｍａｇｅ Ｊ分析）したところ、これら３種のタンパク質の割合は、ＭＲＪＰ１が７６％、ＭＲＪＰ２が２２％、ＭＲＪＰ３が２％であった。
［参考例３］
ＲＪから単離精製されたＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ２の胆汁酸結合能を測定した。
ＲＪから単離精製されたＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ２の胆汁酸結合能を測定した。
＜ＲＪからのＭＲＪＰ１の単離精製＞
まず、ＲＪからゲル濾過クロマトグラフィーを用いてＭＲＪＰ１を精製した。具体的には、まず、参考例２と同様にして調製した２３．５ｍｇ／５ｍＬのＲＪタンパク質溶液（１０ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ ＲＪ）を５ｍＬ、ＨｉＬｏａｄ ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐ．ｇ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にアプライした。その後、溶出液（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を溶出速度１．５ｍＬ／ｍｉｎで当該カラムに通し、５ｍＬずつを１画分として回収した。各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を図４に示す。また、ＲＪタンパク質溶液と同時に、当該カラムに３６ｍｇ／ｍｌのＧｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ （ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）をアプライし、移動度（溶出開始からの総溶出量）と、当該画分に含まれる分子の大きさとの関係を調べ、検量線を作成した。作成された検量線を図５に示す。
本発明者らは、前記の胆汁酸結合アフィニティーカラムから溶出した複合体の、ゲル解析において量的に一番多かったＭＲＪＰ１画分に着目した。図４に示すゲル濾過クロマトグラフィーのうち、画分Ｂ（Frac.B：図４中、点線で囲まれた画分）は、図５に示すスタンダードの移動度と分子量から得た検量線から、分子量約２９０ｋＤａ付近であることがわかった。この画分を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、図６に示すように、約５５ｋＤａの位置に単一なバンドとして検出された。また、当該画分に含まれている分子に対してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにて質量分析を行ったところ、ＭＲＪＰ１を含む画分であると判明した。これらの結果から、ＭＲＪＰ１は約５５ｋＤａであり、ＲＪ中では、５〜６量体として存在していることが確認された。以下、当該画分をＭＲＪＰ１画分という。
なお、当該ＭＲＪＰ１画分には、非特許文献５において、高脂血症ラットの血液中のトリグリセリド、総コレステロールを減少させる作用が報告されているデセン酸は含まれていないことが、定量的に明らかにされた。
まず、ＲＪからゲル濾過クロマトグラフィーを用いてＭＲＪＰ１を精製した。具体的には、まず、参考例２と同様にして調製した２３．５ｍｇ／５ｍＬのＲＪタンパク質溶液（１０ｋＤａ ｃｕｔ ｏｆｆ ＲＪ）を５ｍＬ、ＨｉＬｏａｄ ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐ．ｇ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にアプライした。その後、溶出液（２０ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４・２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を溶出速度１．５ｍＬ／ｍｉｎで当該カラムに通し、５ｍＬずつを１画分として回収した。各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を図４に示す。また、ＲＪタンパク質溶液と同時に、当該カラムに３６ｍｇ／ｍｌのＧｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ （ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）をアプライし、移動度（溶出開始からの総溶出量）と、当該画分に含まれる分子の大きさとの関係を調べ、検量線を作成した。作成された検量線を図５に示す。
本発明者らは、前記の胆汁酸結合アフィニティーカラムから溶出した複合体の、ゲル解析において量的に一番多かったＭＲＪＰ１画分に着目した。図４に示すゲル濾過クロマトグラフィーのうち、画分Ｂ（Frac.B：図４中、点線で囲まれた画分）は、図５に示すスタンダードの移動度と分子量から得た検量線から、分子量約２９０ｋＤａ付近であることがわかった。この画分を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、図６に示すように、約５５ｋＤａの位置に単一なバンドとして検出された。また、当該画分に含まれている分子に対してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにて質量分析を行ったところ、ＭＲＪＰ１を含む画分であると判明した。これらの結果から、ＭＲＪＰ１は約５５ｋＤａであり、ＲＪ中では、５〜６量体として存在していることが確認された。以下、当該画分をＭＲＪＰ１画分という。
なお、当該ＭＲＪＰ１画分には、非特許文献５において、高脂血症ラットの血液中のトリグリセリド、総コレステロールを減少させる作用が報告されているデセン酸は含まれていないことが、定量的に明らかにされた。
＜ＲＪからのＭＲＪＰ２の単離精製＞
本発明者らはさらに、前記の胆汁酸結合アフィニティーカラムから溶出した複合体の、ゲル解析において量的に一番多かったＭＲＪＰ１画分に次いで多かったＭＲＪＰ２に着目した。図４に示すゲル濾過クロマトグラフィーのうち、画分Ｅ（Frac.E：図４中、一点鎖線で囲まれた画分）に含まれているタンパク質を調べた。当該画分Ｅは、図５に示すスタンダードの移動度と分子量から得た検量線から、分子量約５１ｋＤａ付近であることがわかった。この画分Ｅを１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、図７に示すように、４６〜６６ｋＤａの位置に２本のバンドとして検出された。
また、この画分Ｅを陰イオンクロマトグラフィーに供し、単一のタンパク質に精製した。具体的には、画分Ｅを結合用溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で１２５ｍｇ／５ｍＬに希釈した上で、５ｍＬをＨｉＰｒｅｐ Ｑ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にアプライした。その後、溶出液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて、移動相中の塩化ナトリウム濃度を図８中の点線で示すような０〜０．５Ｍにグラジエントをかけることにより、タンパク質を溶出させた。なお、移動相の移動速度は１．５ｍＬ／ｍｉｎとした。
各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を図８に示す。図８中に示す得られたピークのうちの１〜４を、それぞれ１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、図９に示すように、ピーク１から２までは単一なバンドとして検出された。そこで、ピーク１及び２を合わせて回収し、当該画分に含まれている分子に対してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにて質量分析を行ったところ、ＭＲＪＰ２を含む画分であると判明した。以下、当該画分をＭＲＪＰ２画分という。
本発明者らはさらに、前記の胆汁酸結合アフィニティーカラムから溶出した複合体の、ゲル解析において量的に一番多かったＭＲＪＰ１画分に次いで多かったＭＲＪＰ２に着目した。図４に示すゲル濾過クロマトグラフィーのうち、画分Ｅ（Frac.E：図４中、一点鎖線で囲まれた画分）に含まれているタンパク質を調べた。当該画分Ｅは、図５に示すスタンダードの移動度と分子量から得た検量線から、分子量約５１ｋＤａ付近であることがわかった。この画分Ｅを１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、図７に示すように、４６〜６６ｋＤａの位置に２本のバンドとして検出された。
また、この画分Ｅを陰イオンクロマトグラフィーに供し、単一のタンパク質に精製した。具体的には、画分Ｅを結合用溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０）で１２５ｍｇ／５ｍＬに希釈した上で、５ｍＬをＨｉＰｒｅｐ Ｑ ＦＦ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製）にアプライした。その後、溶出液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を用いて、移動相中の塩化ナトリウム濃度を図８中の点線で示すような０〜０．５Ｍにグラジエントをかけることにより、タンパク質を溶出させた。なお、移動相の移動速度は１．５ｍＬ／ｍｉｎとした。
各画分の移動度と２８０ｎｍの吸光度との関係を図８に示す。図８中に示す得られたピークのうちの１〜４を、それぞれ１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供したところ、図９に示すように、ピーク１から２までは単一なバンドとして検出された。そこで、ピーク１及び２を合わせて回収し、当該画分に含まれている分子に対してＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳにて質量分析を行ったところ、ＭＲＪＰ２を含む画分であると判明した。以下、当該画分をＭＲＪＰ２画分という。
＜透析法による胆汁酸結合試験＞
上記で精製されたＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ２の胆汁酸結合能の評価を、透析法により行った。ポジティブコントロールとして抗高コレステロール剤であるコレスチラミンを、ネガティブコントロールとしてカゼインをそれぞれ用いた。
具体的には、タウロコール酸含有リン酸緩衝液（５０ｍＭ タウロコール酸、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）中に、コレスチラミン、カゼイン、ＭＲＪＰ１画分、ＭＲＪＰ２画分、又は生ＲＪを凍結乾燥させたものを、それぞれ１００ｍｇ／ｍＬとなるように添加したものを反応溶液とした。これらの反応溶液を３７℃で２時間インキュベートした後、室温で７２時間透析した。透析膜外液に含まれている総胆汁酸量を測定することにより、透析膜内液に含まれている（すなわち、各分子と結合した）胆汁酸の割合を算出した。
算出された各分子と結合した胆汁酸の割合を図１０に示す。図１０中、「Ｉｎｔａｃｔ ＲＪ」は、生ＲＪを凍結乾燥させたものを添加した反応溶液の結果である。この結果、胆汁酸結合能はネガティブコントロール群のカゼイン（３３％）と比較し、ＭＲＪＰ１は４６％、ＭＲＪＰ２は３７％であった。すなわち、ＭＲＪＰ１のほうがＭＲＪＰ２よりも高い胆汁酸結合能を示した。
上記で精製されたＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ２の胆汁酸結合能の評価を、透析法により行った。ポジティブコントロールとして抗高コレステロール剤であるコレスチラミンを、ネガティブコントロールとしてカゼインをそれぞれ用いた。
具体的には、タウロコール酸含有リン酸緩衝液（５０ｍＭ タウロコール酸、１００ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．４）中に、コレスチラミン、カゼイン、ＭＲＪＰ１画分、ＭＲＪＰ２画分、又は生ＲＪを凍結乾燥させたものを、それぞれ１００ｍｇ／ｍＬとなるように添加したものを反応溶液とした。これらの反応溶液を３７℃で２時間インキュベートした後、室温で７２時間透析した。透析膜外液に含まれている総胆汁酸量を測定することにより、透析膜内液に含まれている（すなわち、各分子と結合した）胆汁酸の割合を算出した。
算出された各分子と結合した胆汁酸の割合を図１０に示す。図１０中、「Ｉｎｔａｃｔ ＲＪ」は、生ＲＪを凍結乾燥させたものを添加した反応溶液の結果である。この結果、胆汁酸結合能はネガティブコントロール群のカゼイン（３３％）と比較し、ＭＲＪＰ１は４６％、ＭＲＪＰ２は３７％であった。すなわち、ＭＲＪＰ１のほうがＭＲＪＰ２よりも高い胆汁酸結合能を示した。
［参考例４］
＜コレステロールミセル溶解性試験＞
ＲＪから単離精製されたＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ２のコレステロールミセル溶解抑制能を測定した。ＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ２は、参考例３において調製したＭＲＪＰ１画分及びＭＲＪＰ２画分をそれぞれ用いた。また、ネガティブコントロールとしてカゼインを用いた。
＜コレステロールミセル溶解性試験＞
ＲＪから単離精製されたＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ２のコレステロールミセル溶解抑制能を測定した。ＭＲＪＰ１及びＭＲＪＰ２は、参考例３において調製したＭＲＪＰ１画分及びＭＲＪＰ２画分をそれぞれ用いた。また、ネガティブコントロールとしてカゼインを用いた。
まず、最終濃度が３．７ｋＢｑ／ｍＬ（２．１Ｇｂｑ／ｍｍｏｌ，ＮＥＮ）となるように［４−１４Ｃ］コレステロール／クロロホルム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ社製）を、２μＭとなるようにコレステロール（片山化学工業社製）／クロロホルムを、２０μＭとなるようにＯｌｅｉｃ ａｃｉｄ（ＳＩＧＭＡ社製）／クロロホルムを、５μＭとなるようにＭｏｎｏ ｏｌｅｏｙｌ−ｒａｃ−Ｇｌｙｃｅｒｏｌ（ＳＩＧＭＡ社製）／クロロホルムを、０．６ｍＭとなるようにＬ−α−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ（ＳＩＧＭＡ社製）／クロロホルムを２０ｍＬ容量のガラスバイアルに分取し、よく混合した後、窒素ガスを吹き付け乾固させた。その後、得られた乾固物を、６．６ｍＭのＴａｕｒｏｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ（ＳＩＧＭＡ社製）及び１３２ｍＭ ＮａＣｌを含む１５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）に溶解させた。ボルテックミキサーで２分間攪拌した後、超音波処理（２５Ｗ、ｏｕｔｐｕｔ６、３分間）し、その後３７℃で２４時間振とうしながらインキュベートすることにより、［１４Ｃ］−コレステロールミセル溶液を調製した。
コレステロールミセル溶解性試験は、具体的には、［１４Ｃ］−コレステロールミセル溶液に、最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬとなるようにＣａｓｅｉｎ、ＭＲＪＰ１、又はＭＲＪＰ２を添加したものを反応溶液とした。各反応溶液をボルテックミキサーで２分間攪拌した後、超音波処理（２５Ｗ、ｏｕｔｐｕｔ ６、３分間）し、３７℃で１時間インキュベートした後、３８０μＬを３７℃、１００，０００×ｇで1時間遠心分離を行い、上清を回収した。回収された上清５０μＬに、乳化シンチレーターを１０ｍＬ加えて、液体シンチレーションカウンターにより、上清中の［１４Ｃ］−コレステロールを測定した。上清中には、水溶液中に安定して溶解しているコレステロールミセルが存在する。このため、反応溶液に予め添加した［１４Ｃ］−コレステロール量に対する上清中の［１４Ｃ］−コレステロール量の割合から、水溶液中に安定して溶解しているコレステロールミセルの割合が算出できる。
ミセルへのコレステロールの溶解割合を図１１に示す。各試験区は、Ｄｕｎｃａｎ’ｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｒａｎｇｅ ｔｅｓｔ（以下、ダンカン検定）によりｐ＜０．０５で統計学的な有意差検定処理した。その結果、ネガティブコントロール群のカゼイン（７９％）と比較し、ＭＲＪＰ１は４６％であり、有意に低下していた。これに対してＭＲＪＰ２は９３％であり、有意な上昇が見られた。すなわち、ＭＲＪＰ１はコレステロールミセル溶解抑制能を有することが明らかである。
［参考例５］
＜ラットへの経口投与試験＞
高コレステロール血症のモデルである１％コレステロール摂取ラットに、ＲＪから単離精製されたＭＲＪＰ１を経口投与し、血清コレステロールに与える影響を調べた。ＭＲＪＰ１は、参考例３において調製したＭＲＪＰ１画分を用いた。また、ネガティブコントロールとしてカゼインを用いた。
図１２に示すように、実験期間の３日間、コレステロールを含む食餌を与えたラットに、１日１回、ＭＲＪＰ１又はカゼインを経口投与した。３回目の投与から２４時間経過後、４時間絶食させた後、心臓採血によりラットを屠殺した。採取された血液を用いて、血清コレステロールを測定した。さらに解剖し、肝臓重量を測定した。その他の具体的な実験条件は以下の通りである。
＜ラットへの経口投与試験＞
高コレステロール血症のモデルである１％コレステロール摂取ラットに、ＲＪから単離精製されたＭＲＪＰ１を経口投与し、血清コレステロールに与える影響を調べた。ＭＲＪＰ１は、参考例３において調製したＭＲＪＰ１画分を用いた。また、ネガティブコントロールとしてカゼインを用いた。
図１２に示すように、実験期間の３日間、コレステロールを含む食餌を与えたラットに、１日１回、ＭＲＪＰ１又はカゼインを経口投与した。３回目の投与から２４時間経過後、４時間絶食させた後、心臓採血によりラットを屠殺した。採取された血液を用いて、血清コレステロールを測定した。さらに解剖し、肝臓重量を測定した。その他の具体的な実験条件は以下の通りである。
実験群：４週齢のＷｉｓｔａｒ系雄ラット（７０ｇ）
実験群数：ｎ＝９
投与開始時間：ＡＭ８：００
試験飼育期間：３日間（予備飼育３日間）
絶食時間：４時間
実験サンプル：カゼインナトリウム（ＣＳ）又はＭＲＪＰ１（ＭＲ）
サンプル投与量：３００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ、又は６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ
食餌組成：２０％カゼイン＋１％コレステロール
実験群数：ｎ＝９
投与開始時間：ＡＭ８：００
試験飼育期間：３日間（予備飼育３日間）
絶食時間：４時間
実験サンプル：カゼインナトリウム（ＣＳ）又はＭＲＪＰ１（ＭＲ）
サンプル投与量：３００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ、又は６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ
食餌組成：２０％カゼイン＋１％コレステロール
血清は、３０００ｒｐｍ、１５分間の遠心分離により調製した。血清コレステロールの定量は酵素法、具体的には市販のキット（コレステロールＥ−テストワコー；和光純薬工業社製））を用いて測定した。同様にして、ＨＤＬ−コレステロールはＨＤＬ−コレステロールＥ−テストワコー（和光純薬工業社製）を用いて測定した。ＬＤＬ＋ＶＬＤＬ−コレステロールは計算により求めた。
各種測定結果などを図１３〜１６に示す。なお、各数値は、１群９匹の平均±標準誤差とし、実験結果の統計的分析には、ダンカン検定とＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いた。
各実験群の体重の変化を図１３に、１日当たりの食餌摂取量を図１４に、肝臓重量を図１５に、それぞれ示す。この結果、各群のうち、カゼインナトリウム（ＣＳ）投与群とＭＲＪＰ１（ＭＲ）投与群とでは、いずれも特に差は観察されなかった。
一方、図１６のように、血清総コレステロール量は、３００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙの投与群と６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙの投与群のいずれにおいても、カゼインナトリウム（ＣＳ）投与群よりもＭＲＪＰ１（ＭＲ）投与群のほうが、血清総コレステロール量が低下する傾向が観察された。特に６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙの投与群では、カゼインナトリウム（ＣＳ）投与群よりもＭＲＪＰ１（ＭＲ）投与群のほうが、血清総コレステロール量が有意に（ダンカン検定とＳｔｕｄｅｕｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔの両方でｐ＜０．０５）低下していた。
これらの結果から、単離精製されたＭＲＪＰ１を経口投与することにより、血清総コレステロール量を低下させられることが明らかである。
各実験群の体重の変化を図１３に、１日当たりの食餌摂取量を図１４に、肝臓重量を図１５に、それぞれ示す。この結果、各群のうち、カゼインナトリウム（ＣＳ）投与群とＭＲＪＰ１（ＭＲ）投与群とでは、いずれも特に差は観察されなかった。
一方、図１６のように、血清総コレステロール量は、３００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙの投与群と６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙの投与群のいずれにおいても、カゼインナトリウム（ＣＳ）投与群よりもＭＲＪＰ１（ＭＲ）投与群のほうが、血清総コレステロール量が低下する傾向が観察された。特に６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙの投与群では、カゼインナトリウム（ＣＳ）投与群よりもＭＲＪＰ１（ＭＲ）投与群のほうが、血清総コレステロール量が有意に（ダンカン検定とＳｔｕｄｅｕｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔの両方でｐ＜０．０５）低下していた。
これらの結果から、単離精製されたＭＲＪＰ１を経口投与することにより、血清総コレステロール量を低下させられることが明らかである。
［参考例６］
＜ラットへの経口投与試験＞
実験群数を１０匹（ｎ＝１０）、試験飼育期間を７日間（予備飼育３日間）、サンプル投与量を６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙとした以外は、参考例５と同様にして、高コレステロール血症のモデルである１％コレステロール摂取ラットに、ＲＪから単離精製されたＭＲＪＰ１を７日間経口投与し、血清コレステロールに与える影響を調べた。
＜ラットへの経口投与試験＞
実験群数を１０匹（ｎ＝１０）、試験飼育期間を７日間（予備飼育３日間）、サンプル投与量を６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙとした以外は、参考例５と同様にして、高コレステロール血症のモデルである１％コレステロール摂取ラットに、ＲＪから単離精製されたＭＲＪＰ１を７日間経口投与し、血清コレステロールに与える影響を調べた。
各実験群の体重の変化を図１７に、１日当たりの食餌摂取量を図１８に、肝臓重量を図１９に、血清総コレステロール量を図２０に、それぞれ示す。なお、各数値は、１群１０匹の平均±標準誤差とし、実験結果の統計的分析には、Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔを用いた。
この結果、体重の変化、１日当たりの食餌摂取量、及び肝臓重量は、カゼインナトリウム（ＣＳ）投与群とＭＲＪＰ１（ＭＲ）投与群とでは、いずれも有意差は観察されなかった。
一方、血清総コレステロール量は、カゼインナトリウム（ＣＳ）投与群よりもＭＲＪＰ１（ＭＲ）投与群のほうが、血清総コレステロール量が有意に（約２６％）低下した（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔでｐ＜０．０５）。特に、血清ＬＤＬコレステロール及び血清ＶＬＤＬコレステロールの総量が有意に低下した。
これらの結果から、単離精製されたＭＲＪＰ１を７日間経口投与することにより、血清総コレステロール量を低下させられることが明らかである。
この結果、体重の変化、１日当たりの食餌摂取量、及び肝臓重量は、カゼインナトリウム（ＣＳ）投与群とＭＲＪＰ１（ＭＲ）投与群とでは、いずれも有意差は観察されなかった。
一方、血清総コレステロール量は、カゼインナトリウム（ＣＳ）投与群よりもＭＲＪＰ１（ＭＲ）投与群のほうが、血清総コレステロール量が有意に（約２６％）低下した（Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔ−ｔｅｓｔでｐ＜０．０５）。特に、血清ＬＤＬコレステロール及び血清ＶＬＤＬコレステロールの総量が有意に低下した。
これらの結果から、単離精製されたＭＲＪＰ１を７日間経口投与することにより、血清総コレステロール量を低下させられることが明らかである。
［実施例１］
＜ラットへの経口投与試験＞
ラットに、ＲＪから単離精製されたＭＲＪＰ１及び／又はデセン酸を経口投与し、血清コレステロールに与える影響を調べた。ＭＲＪＰ１は、参考例３において調製したＭＲＪＰ１画分を用いた。デセン酸は、デセン酸高濃度ローヤルゼリーをジエチルエーテルで抽出し、純度９９．７％になるまで精製を繰り返して得た。純度は日本薬局方ローヤルゼリーに記載の定量法（液体クロマトグラフィー）により測定した。また、ネガティブコントロールとしてカゼインを用いた。
＜ラットへの経口投与試験＞
ラットに、ＲＪから単離精製されたＭＲＪＰ１及び／又はデセン酸を経口投与し、血清コレステロールに与える影響を調べた。ＭＲＪＰ１は、参考例３において調製したＭＲＪＰ１画分を用いた。デセン酸は、デセン酸高濃度ローヤルゼリーをジエチルエーテルで抽出し、純度９９．７％になるまで精製を繰り返して得た。純度は日本薬局方ローヤルゼリーに記載の定量法（液体クロマトグラフィー）により測定した。また、ネガティブコントロールとしてカゼインを用いた。
具体的には、まず、実験開始までは水及び固形飼料を自由摂取させた４週齢のＷｉｓｔａｒ系雄ラット（初体重：７０ｇ）を、１実験群当たり１０匹ずつ、６実験群に分けた。この際、実験群ごとに体重に有意な差が生じないように群分けした。さらに、各実験群を、５匹ごとに前半グループと後半グループに分け、前半グループのラットに対しては予備飼育を３日間行い、後半グループのラットに対しては予備飼育を４日間行った。予備飼育後、参考例５と同様にして、実験期間の３日間、コレステロールを含む食餌を与え、さらに１日１回、各サンプルを経口投与した。投与前に各ラットの体重を測定して投与量を算出した。３回目の投与から０時間後〜２４時間後までの２４時間に摂取した食餌量を測定した。３回目の投与から２５時間経過後から４時間絶食させた後、心臓採血によりラットを屠殺した。採取された血液を用いて、参考例５と同様にして、血清コレステロールを測定した。さらに解剖し、肝臓重量を測定した。
各実験群に投与したサンプルは以下の通りである。
４５０ＣＳ群：カゼインナトリウム（４５０ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ）（タンパク質含有量：９１．９％）
６００ＣＳ群：カゼインナトリウム（６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ）（タンパク質含有量：９１．９％）
１０５０ＣＳ群：カゼインナトリウム（１０５０ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ）（タンパク質含有量：９１．９％）
４５０ＭＲＪＰ１：ＭＲＪＰ１（４５０ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ）（タンパク質含有量：８４．０５％）
６００ＨＤＡ：デセン酸（６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ）（デセン酸含有量：９９．６８％）
複合（４５０ＭＲＪＰ１＋６００ＨＤＡ)：ＭＲＪＰ１（４５０ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ）（タンパク質含有量：８４．０５％）＋デセン酸（６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ）（デセン酸含有量：９９．６８％）
４５０ＣＳ群：カゼインナトリウム（４５０ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ）（タンパク質含有量：９１．９％）
６００ＣＳ群：カゼインナトリウム（６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ）（タンパク質含有量：９１．９％）
１０５０ＣＳ群：カゼインナトリウム（１０５０ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ）（タンパク質含有量：９１．９％）
４５０ＭＲＪＰ１：ＭＲＪＰ１（４５０ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ）（タンパク質含有量：８４．０５％）
６００ＨＤＡ：デセン酸（６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ）（デセン酸含有量：９９．６８％）
複合（４５０ＭＲＪＰ１＋６００ＨＤＡ)：ＭＲＪＰ１（４５０ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ）（タンパク質含有量：８４．０５％）＋デセン酸（６００ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ）（デセン酸含有量：９９．６８％）
各サンプルは、全て、カルボキシメチルセルロース溶液（５ｍｇ／ｍＬ）で懸濁させたサンプル溶液とし、ゾンデを用いてラットに経口投与した。例えば、カゼインナトリウム（４５０ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ）を投与する場合、カゼインナトリウム濃度が２２．５ｍｇ／ｍＬとなるようにカルボキシメチルセルロース溶液に溶解させたものをサンプル溶液とし、投与に当たってはタンパク質含有量を考慮して、カゼインナトリウムとして４５０ｍｇ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙとなるように投与した。つまり、当該サンプル溶液を、ラット１匹当たり２０ｍＬ／ｋｇ（Ｂ．Ｗ．）／ｄａｙ投与した。また、デセン酸を投与する場合、投与前に、シャフトとしてＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ １１０３００２７ ＰＴＡ７（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ（キネマチカ）社製）を用いたポリトロンホモジナイザーＰＴ１０−３５（ＫＩＮＥＭＡＴＩＣＡ（キネマチカ）社製）によって、サンプル溶液中のデセン酸を均一にした（ホモジナイズ条件：Ｓｐｅｅｄ ３前後）。
また、その他の具体的な実験条件は以下の通りである。
投与開始時間：ＡＭ８：００
試験飼育期間：３日間（予備飼育３又は４日間）
絶食時間：４時間
食餌組成：２０％カゼイン＋１％コレステロール
投与開始時間：ＡＭ８：００
試験飼育期間：３日間（予備飼育３又は４日間）
絶食時間：４時間
食餌組成：２０％カゼイン＋１％コレステロール
各実験群の体重増加量（ｇ）を図２１に、１日当たりの食餌摂取量（ｇ／ｄａｙ）を図２２に、肝臓重量（ｇ／１００ｇ（Ｂ．Ｗ．））を図２３に、血清総コレステロール量（ｍｇ／ｄＬ）を図２４に、それぞれ示す。また、各測定値を表１に示す。なお、各数値は、１群１０匹の平均±標準誤差とし、実験結果の統計的分析には、ダンカン検定を用いた。図２１〜２４及び表１中、異なる文字は、ダンカン検定における有意差を示す（Ｐ＜０．０５）。
この結果、体重の変化（体重増加量）は、全ての実験群間で有意な差は無かった。また、食餌摂取量及び肝臓重量は、４５０ＣＳ群と比較して、他の実験群との間で有意な変化は観察されなかった。
一方で、血清総コレステロール量においては、４５０ＣＳ群と比較して、４５０ＭＲＪＰ１群で有意な血清総コレステロール量の低下が確認された。また、同様に血清総コレステロール量が低下することが期待された６００ＨＤＡ群では、血清総コレステロール量を低下させる傾向が確認された。さらに、ＭＲＪＰ１及びデセン酸を複合投与した複合（４５０ＭＲＪＰ１＋６００ＨＤＡ)群では、４５０ＣＳ群と比較して、有意かつ、全ての実験群の中で最も低い血清総コレステロール量を示した。
つまり、ＭＲＪＰ１とデセン酸を複合投与することにより、それぞれを単独で投与した場合と比較して、より強力な血清総コレステロール低下作用を発揮することが初めて明らかにされた。この低下効果のメカニズムはまだ明らかではないが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験の結果から、ＭＲＪＰ１が腸管においてコレステロール吸収阻害作用を有すると考えられることからも、この吸収阻害作用によって体外へのコレステロールの排出が促進されたためと考えられ、さらには、このメカニズム以外にも他のコレステロール代謝経路との複合的な効果による可能性も考えられる。
以上の結果より、ＭＲＪＰ１とデセン酸という血清総コレステロール量を低下するＲＪ成分を複合して経口摂取させることにより、相加的なコレステロール代謝改善作用が発揮されることが明らかである。
一方で、血清総コレステロール量においては、４５０ＣＳ群と比較して、４５０ＭＲＪＰ１群で有意な血清総コレステロール量の低下が確認された。また、同様に血清総コレステロール量が低下することが期待された６００ＨＤＡ群では、血清総コレステロール量を低下させる傾向が確認された。さらに、ＭＲＪＰ１及びデセン酸を複合投与した複合（４５０ＭＲＪＰ１＋６００ＨＤＡ)群では、４５０ＣＳ群と比較して、有意かつ、全ての実験群の中で最も低い血清総コレステロール量を示した。
つまり、ＭＲＪＰ１とデセン酸を複合投与することにより、それぞれを単独で投与した場合と比較して、より強力な血清総コレステロール低下作用を発揮することが初めて明らかにされた。この低下効果のメカニズムはまだ明らかではないが、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験の結果から、ＭＲＪＰ１が腸管においてコレステロール吸収阻害作用を有すると考えられることからも、この吸収阻害作用によって体外へのコレステロールの排出が促進されたためと考えられ、さらには、このメカニズム以外にも他のコレステロール代謝経路との複合的な効果による可能性も考えられる。
以上の結果より、ＭＲＪＰ１とデセン酸という血清総コレステロール量を低下するＲＪ成分を複合して経口摂取させることにより、相加的なコレステロール代謝改善作用が発揮されることが明らかである。
本発明の血清コレステロール量低下剤や血清コレステロール量低下方法は、特に高コレステロール血症や動脈硬化症の治療や予防のための医薬や機能性食品等の有効成分として利用が可能である。
Claims (2)
- ＭＲＪＰ１及び１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を有効成分とすることを特徴とする、血清コレステロール量低下剤。
- ＭＲＪＰ１及び１０−ヒドロキシ−２−デセン酸を経口摂取することを特徴とする、血清コレステロール量を低下させる方法。
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-
2011
- 2011-10-24 JP JP2011233333A patent/JP2013091606A/ja active Pending
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