JP2013054023A

JP2013054023A - Ｇｉｔ１遺伝子欠損マウス及びこれを用いた薬物スクリーニング方法

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Publication number: JP2013054023A
Application number: JP2011223127A
Authority: JP
Inventors: Eunjoon Kim; ウンジョンキム; Changwon Kang; チャンウォンカン; Won Mah; ウォンマ; Hyejung Won; ヒェジュンウォン; Eun-Kyoung Hahm; ウンキュンハム; Eunjin Kim; ウンジンキム
Original assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Current assignee: Korea Advanced Institute of Science and Technology KAIST
Priority date: 2011-09-02
Filing date: 2011-10-07
Publication date: 2013-03-21
Anticipated expiration: 2031-10-07
Also published as: US20130061338A1; KR101127756B1; US8552253B2; JP5436511B2

Abstract

【課題】脳の神経シナプスタンパク質であるＧＩＴ１（Ｇｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｋｉｎａｓｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１）の遺伝子が欠損された、人間を除く、特に、哺乳類を注意欠陥多動性障害モデルとして提供すること、及びＧＩＴ１遺伝子欠損マウスを使用してＡＤＨＤ候補物質である薬物を投与して回復を誘導することができる新たな薬物のスクリーニング方法を提供する。
【解決手段】ＧＩＴ１欠損マウスに対する分子生物学的、細胞生物学的、電気生物学的、動物行動学的分析に関し、候補物質である薬物投与により注意欠陥多動性障害である多動と前頭葉におけるシータ波の回復を観察し、注意欠陥多動性障害の回復を誘導することができる新たな薬物のスクリーニングを行う。
【選択図】図８

Description

本発明は、脳の神経シナプスタンパク質であるＧＩＴ１（Ｇｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｋｉｎａｓｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１）の遺伝子が欠損された、人間を除く、特に、哺乳類を注意欠陥多動性障害モデルとして使用する方法に関する。

また、本発明は、ＧＩＴ１欠損マウスに対する分子生物学的、細胞生物学的、電気生物学的、動物行動学的分析に関し、候補物質である薬物投与により注意欠陥多動性障害である多動と前頭葉におけるシータ波の回復を観察し、注意欠陥多動性障害の回復を誘導することができる新たな薬物のスクリーニング方法を提供する。

注意欠陥多動性障害（以下、ＡＤＨＤとする）は、注意欠陥、多動、衝動性を見せる公知された精神疾患の一種である。全世界の就学児童の５％程度がＡＤＨＤ関連症状を示すほど、有病率が非常に高い疾患である。また、Ｌｅｉｂｓｏｎなど（２００１，ＪＡＭＡ，２８５，６０−６６．）の研究によると、ＡＤＨＤ症状を示す児童がある家庭の場合、そうでない家庭に比べて２倍程度高い医療費がかかる。また、ＡＤＨＤ児童の親はストレスと罪悪感、さらにはうつ症状を示すなど、社会全般的にＡＤＨＤの治療に対する必要性が高まっている。このような高い有病率とこれによる社会的影響により、ＡＤＨＤの発症メカニズムを明かすために世界的に多くの研究が行われてきた。

ＡＤＨＤのメカニズムを説明するために多くの仮説が提示されており、このうちドーパミン仮説が最も多く注目されて来た。しかし、誘電体疫学研究（ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅｌｉｎｋａｇｅｏｒａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓｔｕｄｉｅｓ）により、ドーパミンと関係のない多くの遺伝子がＡＤＨＤに係わっていることが明らかになった。さらに、ＡＤＨＤの異質性と強い遺伝性は、様々なＡＤＨＤ関連遺伝子の存在を強く示唆している。

その一方で、Ｈ３受容体拮抗剤は、ＡＤＨＤ、肥満症、てんかん、精神分裂症、うつ病、痛症、薬物乱用／中毒など非常に様々な疾患に関する機能的効果を有している。さらに、ＡＤＨＤ、認知機能障害（アルツハイマー疾患）、睡眠障害または精神病を治療するための多数の新規の化合物が製造されている。

このようなＡＤＨＤの研究のために多くの種類の化合物の開発だけでなく、ＡＤＨＤの様々なモデル動物が提案された。Ｗｕｌｔｚなど（Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌａｎｄｎｅｕｒａｌｂｉｏｌｏｇｙ，１９９０，５３（１），８８−１０２．）は、既存の自然発生高血圧ラット（ＳｐｏｎｔａｎｅｏｕｓＨｙｐｅｒｔｅｎｓｉｖｅＲａｔ、以下、ＳＨＲとする）がＡＤＨＤモデル動物として活用されることができることを明かし、現在までも様々なＡＤＨＤ関連研究に使用されている。特に、ＳＨＲはドーパミンの分泌と代謝において問題があることが明らかになり（Ｒｕｓｓｅｌｌｅｔａｌ．，Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．，１９９８，１６３−１７１．）、これはＡＤＨＤにおけるドーパミンの重要性を意味する研究結果である。しかし、ＳＨＲのＡＤＨＤ関連症状に対する病理学的原因に関する明白な研究結果はなく、ドーパミンとＡＤＨＤの連関性は持続的に研究されているが、因果関係が明確になったと見るには無理がある状況である。

Ｇａｉｎｅｔｄｉｎｏｖなど（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８３（５４００），３９７−４０１．）は、ドーパミン輸送体を遺伝的に除去したマウス（ＤＡＴ−ＫＯｍｉｃｅ）を用いた実験により新たなＡＤＨＤモデル動物を提案した。これはドーパミン信号伝達に関するタンパク質がＡＤＨＤに係わるということを直接証明した論文であって、既存のドーパミン仮説を裏付けることができる発見である。しかし、ＤＡＴ−ＫＯｍｉｃｅの場合、ＡＤＨＤ症状を回復することにおいてドーパミンよりはセロトニンがさらに重要であることを示すなど、ドーパミン仮説とは相反する研究結果でもある。

Ｈｅｓｓなど（ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ．，１９９２，１２（７），２８６５−７４．）は、２番染色体の一部が除去された突然変異マウスであるコロボーマ（以下、Ｃｏｌｏｂｏｍａとする）マウスの多動に注目し、その後、誘電体関連研究などにより除去された２番染色体上に存在するＳＮＡＰ−２５というタンパク質がＡＤＨＤに係わっていることが明らかになった。しかし、その後、ＡＤＨＤの基底原因を明かすための試みが行われず、ＣｏｌｏｂｏｍａマウスにおけるＡＤＨＤメカニズムに対する研究は足踏み状態である。

上記のＡＤＨＤモデル動物のほかにも様々なモデルが提案されたが、ＡＤＨＤに係わっている遺伝子が明らかになっていなかったり、ほとんどが動物行動実験レベルの研究にとどまった。そのため、ＡＤＨＤの基底原因を究明するための分子生物学的、細胞生物学的、電気生理学的な接近方法の必要性が台頭された。このような方法により得られたＡＤＨＤに対する研究結果は、ＡＤＨＤの基底原因に対するさらに広い視野を提供するだけでなく、新たな治療剤の発見可能性を提案することができる。

既存のＡＤＨＤ治療剤としては、神経刺激剤に分類されるアンフェタミンとメチルフェニデートがある。Ｓｗａｎｓｏｎなど（Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌ．Ｒｅｖ．，２００７，１７，３９−５９．）の報告によると、１９９０年以降にＡＤＨＤの治療のための神経刺激剤の処方が持続的に増加している。

しかし、このような神経刺激剤の使用は幻覚と不安などの深刻な副作用を誘発する可能性がある。Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎなど（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，２００７，４７，６８１−６９８．）の研究は、神経刺激剤がドーパミン分泌神経細胞とセロトニン分泌神経細胞に損傷を与える可能性があるということを示唆しており、Ｋｏｌｂなど（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００３，１００，１０５２３−１０５２８．）の研究結果は、持続的なアンフェタミンの服用が神経細胞の構造可塑性（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ）に影響を与え、新たな経験による学習及び記憶作用を制限する可能性があるということを示唆している。このような神経刺激剤の副作用と神経細胞の毒性、そして記憶と学習能力に与える悪影響は、新たなＡＤＨＤ治療剤の必要性を強調する。

Ｇｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｋｉｎａｓｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１（以下、ＧＩＴ１とする）は、多機能アダプタータンパク質であって、ＡＲＦｓｍａｌｌＧＴＰａｓｅｓのためのＧＴＰａｓｅ−活性化ドメイン（ＡＲＦＧＡＰｄｏｍａｉｎ）を含むいくつかのドメインからなっている。ＧＩＴ１のＡＲＦＧＡＰドメインは、β２−アドレナリン受容体と他のＧ−タンパク質結合受容体の食菌作用による輸送に重要な機能を担当している。また、ＧＩＴ１、ＧＲＫ、ＰＩＸ、ＦＡＫ、ＰＬＣγ、ＭＥＫ１、Ｐｉｃｃｏｌｏ、ｌｉｐｒｉｎ−α、ｐａｘｉｌｌｉｎなどのような様々な信号伝達タンパク質とアダプタータンパク質と結合を行っており、これはＧＩＴ１が信号伝達アダプターとして機能できることを意味する。

脳におけるＧＩＴ１は、シナプスに存在し、神経突起の成長、樹状突起棘構造の形成、シナプス形成、シナプスＡＭＰＡ（２−ａｍｉｎｏ−３−（５−ｍｅｔｈｙｌ−３−ｏｘｏ−１、２−ｏｘａｚｏｌ−４−ｙｌ）ｐｒｏｐａｎｏｉｃａｃｉｄ）受容体の局在（ＡＭＰＡｒｅｃｅｐｔｏｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）などに関与する。ＧＩＴ１は、ハンチントン疾病に係わるハンチントンタンパク質に結合し、ハンチントン患者の脳でＧＩＴ１タンパク質が分裂された現象を観察した研究結果がある。また、ＧＩＴ１欠損マウスを用いた他の研究結果では、樹状突起の成長と樹状突起棘の密度減少、また学習及び記憶能力の損傷が報告されており（ＰｒａｓｈａｎｔｈｉＭｅｎｏｎｅｔａｌ.,ＢｒａｉｎＲｅｓ．２０１０；１３１７：２１８２２６）、これはＧＩＴ１が脳で重要な機能を行っていることを示唆する。

しかし、ＧＩＴ１に対する今までの研究は、分子生物学的、細胞生物学的な研究に限定されている。また、従来技術の行動実験の場合、実験結果を説明することができる正確なメカニズムを提示することができなかった。

本発明者は、ＧＩＴ１欠損マウスをＡＤＨＤモデル動物として使用し、既存の分子生物学的、細胞生物学的、動物行動学的な研究方法のほかにもシステムレベルにおける脳波図（Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒａｍ、以下、ＥＥＧとする）測定などの実験を行い、ＡＤＨＤの基底原因に対する遺伝的な原因を提供し、ＡＤＨＤ症状を示すＧＩＴ１欠損マウスを用いて新たなＡＤＨＤ治療剤をスクリーニングする方法を提供する。

韓国特許登録第１０−０８２７４７０号：ヒスタミンＨ３拮抗剤として有用な（１−４−ピペリジニル）ベンズイミダゾール誘導体、登録日：２００８年０４月２８日、出願人：シェリングコーポレーション

Ｌｅｉｂｓｏｎｅｔａｌ．，ＪＡＭＡ，２００１,２８５,６０−６６．Ｗｕｌｔｚｅｔａｌ．，Ｂｅｈａｖｉｏｒａｌａｎｄｎｅｕｒａｌｂｉｏｌｏｇｙ,１９９０,５３（１）,８８−１０２．Ｒｕｓｓｅｌｌｅｔａｌ．，Ｂｅｈａｖ．Ｂｒａｉｎ．Ｒｅｓ．１９９８,１６３−１７１．Ｇａｉｎｅｔｄｉｎｏｖｅｔａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ,１９９９,２８３（５４００）,３９７−４０１．Ｈｅｓｓｅｔａｌ．，ＪＮｅｕｒｏｓｃｉ．１９９２,１２（７）,２８６５−７４．Ｓｗａｎｓｏｎｅｔａｌ．，Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｌ．Ｒｅｖ．２００７,１７,３９−５９．Ｋｏｌｂｅｔａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ,２００３,１００,１０５２３−１０５２８．

本発明は、脳の神経シナプスタンパク質であるＧＩＴ１（Ｇｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｋｉｎａｓｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１）の遺伝子が欠損された、人間を除く、特に、哺乳類を注意欠陥多動性障害モデルとして提供することを目的とする。

本発明は、ＧＩＴ１遺伝子欠損マウスを使用してＡＤＨＤ候補物質である薬物を投与して回復を誘導することができる新たな薬物のスクリーニング方法を提供することを他の目的とする。

本発明は、脳疾患の一種である注意欠陥または多動障害を有している人間を含む哺乳類からこのような中枢神経系疾患及び精神疾患の薬物をスクリーニングすることができ、治療予防することができる方法であって、ＧＩＴ１遺伝子が欠損された、人間を除く哺乳類を使用する方法を提供する。

上記中枢神経系疾患及び精神疾患は、睡眠障害、覚醒障害、睡眠発作（ｎａｒｃｏｌｅｐｓｙ）、認知機能障害（ｃｏｇｎｉｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒ）、ＡＤＨＤ、肥満症（ｏｂｅｓｉｔｙ）、てんかん（ｅｐｉｌｅｐｓｙ）、精神分裂症（ｓｈｉｚｏｐｈｒｅｎｉａ）、うつ病、痛症及び薬物乱用／中毒からなる群から選択される何れか一つであることができる。

本発明における注意欠陥または多動の予防剤または治療剤候補物質としては、集中力強化剤であるメチルフェニデート（Ｍｅｔｈｙｌｐｈｅｎｉｄａｔｅ）、アンフェタミン（ｄ−Ａｍｐｈｅｔａｍｉｎｅ）及びペモリン（Ｐｅｍｏｌｉｎｅ）から選択される一つ以上を使用することができるが、抗精神薬物として中樞神経を刺激するメカニズムを有しているだけに多くの副作用を発生させるおそれがあり、特に、不眠、反跳現象（ｒｅｂｏｕｎｄｐｈｅｎｏｍｅｎａ）、食欲低下、不快感、眩暈、易刺激性や不安及び苛立ちなどの症状が現われる可能性がある。

さらに、上記候補物質は、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、醗酵生成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液または血漿などがあり、このような化合物は新規化合物であってもよく、公知の化合物であってもよい。このような候補物質は、塩を形成していても良い。候補物質の塩には生理学的に許容される酸（例えば、無機酸など）や塩基（例えば、有機酸など）などの塩があり、このうち生理学的に許容される酸添加塩が好ましい。このような塩としては、例えば、無機酸（例えば、塩酸、リン酸、臭化水素酸または硫酸など）の塩または有機酸（例えば、酢酸、ホルム酸、プロピオン酸、フマル酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、リンゴ酸、シュウ酸、安息香酸、メタンスルホン酸またはベンゼンスルホン酸など）の塩などが用いられる。

上記のような候補物質を投与する方法は、例えば、経口投与、静脈注射、皮下投与、皮内投与または腹腔内投与のうち対象動物の症状、候補物質の性質などに合わせて適当に選択されることができる。また、候補物質の投与量は、投与方法、候補物質の性質などに合わせて適当に選択されることができる。

本発明における候補物質の投与動物は、哺乳類、好ましくはマウス、ラット、豚及び猿から選択される一つ以上のものであってもよく、本発明者が発明したＧＩＴ１欠損マウスが最も好ましい。

前記ＧＩＴ１遺伝子は、脳のシナプスに存在し、神経突起の成長、樹状突起棘構造形成、シナプス形成、シナプスＡＭＰＡ受容体の局在（ＡＭＰＡｒｅｃｅｐｔｏｒｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）などに関与するものとして公知である。また、ＧＩＴ１はハンチントンタンパク質と結合し、ハンチントン患者の脳ではＧＩＴ１タンパク質が分裂される現象が観察され、ＧＩＴ１欠損マウスを用いた他の研究結果では樹状突起の成長と樹状突起棘の密度減少、そして学習及び記憶能力が損傷されることから、ＧＩＴ１が脳で重要な機能をしていることが分かる。

本発明における治療薬物または精神疾患をスクリーニングする方法は、神経細胞、特定遺伝子標的の細胞及び動物モデルを利用する方法であって、このうち選択される一つ以上を含むが、これに限定されない。

前記神経細胞は、例えば、ドーパミン性神経細胞としてＭＥＳ２３．５細胞、ＭＮ９Ｄ細胞、ＰＣ１２細胞、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞とＣＡＴＨ．ａ細胞等が含まれ、このようなドーパミン性神経細胞は、この細胞において変化されるバイオマーカーと神経保護ターゲットを見つけるために使用されている。特に、遺伝性パーキンソン病（ｆａｍｉｌｉａｌＰａｒｋｉｎｓｏ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）を起こす遺伝子突然変異であるＤＪ−１、ＰａｒｋｉｎまたはＰＩＮＫ１の遺伝子の機能が欠損された場合に現われる変化により神経保護のための治療剤及びバイオマーカーを発見しようとする研究が試みされているが、前記細胞モデルはドーパミン神経細胞だけの細胞内環境が維持されておらず、細胞の起源が全く異なかったりまたは融合された細胞の遺伝的特性をともに保有している短所がある。

また、特定遺伝子標的の細胞モデルによるスクリーニング方法も遺伝子欠損ではなくｓｉＲＮＡのような遺伝子部分欠損の細胞モデルにより完全な遺伝子機能欠損の場合に現われる可能性のある変化に対するターゲット発見には充分でない点がある。

本発明で前記細胞モデルとともに精神疾患の治療剤及び薬物をスクリーニングすることに使用される動物モデルとしては、ＳＨＲ、ドーパミン輸送体を遺伝的に除去したマウス（ＤＡＴ−ＫＯｍｉｃｅ）、パーキンソンＤＪ−１遺伝子欠損（ｋｎｏｃｋｏｕｔ）動物、ＳＮＡＰ−２５タンパク質が欠けたコロボーママウス及びＧＩＴ１遺伝子欠損マウスから選択される一つ以上を使用することが分かる。

前記動物モデルからは、特に、分子、生化学的研究の進行に十分な純粋ドーパミン性細胞を得るのが難しく、実際にパーキンソン病の患者からもサンプルを得るのが難しい状態であると公知されている。例えば、パーキンソン発病に対する病因遺伝子としてのＤＪ−１に関する詳細なメカニズムに対しては明らかになっておらず、ＤＪ−１遺伝子上の変異によりタンパク質が正常に生成されない場合にパーキンソン病が誘発されるという事実もまだ不明確である。

従って、特に、本発明では、ＧＩＴ１欠損マウスの注意欠陥、多動、散漫及び行動障害テストに、治療剤または薬物をスクリーニングする方法が使用されることが好ましいということが分かる。

本発明におけるＧＩＴ１欠損マウスを使用した具体的なスクリーニング方法としては、オープンフィールド試験（Ｏｐｅｎｆｉｅｌｄｔｅｓｔ）、ホームケージ活動性試験（Ｈｏｍｅｃａｇｅａｃｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔ）、モリス水迷路試験（Ｍｏｒｒｉｓｗａｔｅｒｍａｚｅｔｅｓｔ）、物体認識試験（Ｎｏｖｅｌｏｂｊｅｃｔｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｔｅｓｔ）及び脳波図（Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈｅａｌｏｇｒａｍ、以下、ＥＥＧとする）試験から選択される一つ以上を特徴とする方法を提供する。

前記オープンフィールド試験及びホームケージ活動性試験により、ＧＩＴ１欠損マウスに前記で提供される候補物質を投与する場合、正常マウスである対照群に比べて多動が驚くほどに改善される効果を示すことができ、モリス水迷路試験と物体認識試験のスクリーニング方法により、記憶、空間知覚及び学習能力が前記のように改善した効果を示す特徴があるため、前記候補物質の選別のための好ましい動物モデルとして使用されることができることが分かる。

特に、本発明におけるＧＩＴ１欠損マウスは、システムレベルでのＥＥＧによるスクリーニング方法により、前頭葉における非正常のシータ波領域の波形及び電力スペクトル密度を分析して、ＡＤＨＤを有した哺乳類の大脳機能を評価する基準と、基底原因に対する新たな評価方法として提供できることが分かる。

本発明は、ＧＩＴ１遺伝子欠損マウスを使用して注意欠陥または多動障害発病の原因となる神経化学的要因、遺伝的要因及び環境的要因を分析し、このような疾患及び各種不安障害の原因を解読して、予防剤または治療剤をスクリーニングするための効果的な動物モデルとして提供することができる。

ＧＩＴ１遺伝子の１番イントロンに遺伝子トラップ（ｇｅｎｅ−ｔｒａｐ）が挿入された状況の図解（エクソンの番号は各灰色のボックスに数字で示され、β−ｇｅｏはβ−ガラクトシダーゼとネオマイシンの結合体を意味し、矢印は遺伝子型検定のために使用されたプライマーセットを意味する）である。本発明に使用されたＧＩＴ１欠損マウスの遺伝子型を検定したＰＣＲ結果（ａ）と、タンパク質発現を確認したウエスタンブロット実験結果（ｂ）を示すものである。ＧＩＴ１欠損マウスから観察されるオープンフィールドにおける多動（ａ）とＡＤＨＤ治療薬物であるアンフェタミンとメチルフェニデート処理による多動の回復（ｂ、ｃ）を示すものである。正常マウスとＧＩＴ１欠損マウスの親しい空間での移動距離を２４時間測定したことを示すものである。ＧＩＴ１欠損マウスの空間知覚及び学習能力観察のためのモリス水迷路の結果（ａは正常マウス及びＧＩＴ１欠損マウスが５日間の訓練期間中、隠されている踏み段を見つけるためにかかる時間が減少されたことを示すものであり、ｂはプローブテスト中に踏み段の位置を通過した回数であり、ｃは水迷路の各四分面における滞留時間である）を示すものである。物体認識及び学習能力観察のための物体認識試験の結果（ａはサンプル期間中の全体物体探索時間であり、ｂは試験期間中に観察される新たな物体に対する選好度であり、ｃはＧＩＴ１欠損マウスの物体認識能力がアンフェタミン処理によって回復されることを示す図）を示すものである。ＧＩＴ１欠損マウスの前頭葉から観察される非正常のシータ波形（ａ）とそれによるパワースペクトル密度（ｂ）、及びアンフェタミン処理による非正常のシータ波形の回復図（ｃ）を示すものである。染色体１７番の２４,９２６,１０１番目塩基位置（ＧｅｎｏｍｅＢｕｉｌｄ３６．３）に存在するｒｓ５５０８１８の１個の単一塩基多型性図である。

以下、本発明を具体的な実施例を参照してより詳細に説明する。しかし、本発明は、下記実施例によって限定されるものではなく、本発明のアイディアと範囲内で様々な変形または修正することができることはこの分野における当業者においては明白なことである。

この時に使用される技術用語及び科学用語において他の定義がない限り、この発明が属する技術分野における通常の知識を有した者が通常理解している意味を有する。

また、従来と同様な技術的構成及び作用に対する重複説明は省略する。

［実施例１］ＧＩＴ１遺伝子欠損マウスの確認
本発明におけるＧＩＴ１欠損マウスの製作に使用された胚性幹細胞（ＥＳｃｅｌｌ、ＦＨＣＲＣ−ＧＴ−Ｓ１０−１２Ｃ１）は、ＦｒｅｄＨｕｔｃｈｉｎｓｏｎＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒから購入した。ＥＳｃｅｌｌ（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃｓｔｅｍｃｅｌｌ）を５００λのβ−ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン、１５％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ（牛胎児血清）を含む培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ、ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）に培養した後、前記細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの胚盤胞（Ｂｌａｓｔｃｙｓｔ）に注入（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）した。注入された胚盤胞はＩＣＲ代理母マウスの子宮に着床させてキメラマウスを製作した。前記キメラマウスはアグチ色の毛の発現と重合酵素連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて遺伝子型を確認した。前記キメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６種と１２９／ＳＶ／Ｊａｅ種とそれぞれ交配して繁殖した。各種から得られた異型接合体（Ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）マウス間の交配により出たマウスを用いて本発明の実験に用いた。

［実施例１−１］重合酵素連鎖反応を用いたＧＩＴ１遺伝子の欠損確認
前記実施例１のＧＩＴ１遺伝子の欠損を確認するために大きく二つの実験方法を使用した。第一の方法は、重合酵素連鎖反応を用いる方法であって、ＧＩＴ１遺伝子の特定部分を増幅することができるプライマーセットを用いて、ＧＩＴ１遺伝子の欠損有無を確認することができた。また、ＧＩＴ１欠損マウスと異型マウスのみに含まれている外来遺伝子であるβｇｅｏを増幅することができるプライマーをともに使用して、各マウスの遺伝子型を正確に把握することができた。重合酵素連鎖反応に使用されたプライマーセットの塩基配列は下記表１のとおりである。

前記表１のプライマーセットの位置は図１に表示されている。前記プライマーセットを使用して重合酵素連鎖反応を行う場合、正常マウスの場合には５００塩基対サイズのＤＮＡ断片が増幅され、ＧＩＴ１欠損マウスの場合には６８０塩基対サイズのＤＮＡ断片が増幅された。異型マウスでは前記の二つのサイズの塩基対断片が増幅された。このような重合酵素連鎖反応の結果は図２ａに示されたように観察された。

前記重合酵素連鎖反応のための混合物は、１４．８μｌの２次蒸留水、１．６μｌの１０ｍＭｄＮＴＰ、２．０μｌのＴａｑ重合酵素バッファー、０．４μｌのＴａｑ重合酵素（Ｓｕｎｇｅｎｅｔｉｃｓ）、０．１μｌ（１００ｐＭ）のプライマー、１μｌ（１００μg／ｍｌ）のＤＮＡ原型で構成した。前記混合液は重合酵素連鎖反応を用いて遺伝子型を確認した。前記重合酵素連鎖反応は９５℃で５分間反応させた後、９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で４０秒に構成されたサイクルを４０回繰り返した。その後、７２℃で５分間反応させた後、前記の生成物を１％アガロースゲルで電気泳動により確認した。

前記実施例１のＧＩＴ１遺伝子欠損を確認するための第二の方法であって、前記ＧＩＴ１タンパク質の欠損をウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ）実験を用いて確認した。ウエスタンブロットに使用する試料の製作のために８週齢以上の正常マウスとＧＩＴ１欠損マウスの全体脳組織を使用した。抽出した脳組織を均質化バッファー（ＨｏｍｏｇｅｎｉｚａｔｉｏｎＢｕｆｆｅｒ；０．３２ＭＳｕｃｒｏｓｅ、４ｍＭＨＥＰＥＳ、１ｍＭＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭＣａＣｌ_２、１ｍＭＰＭＳＦ、５μｇ／ｍｌＰｅｐｓｔａｔｉｎＡ、２ｍＭＢｅｎｚａｍｉｄｉｎ、２μｇ／ｍｌＬｅｕｐｅｐｔｉｎ）と混合して均質機（Ｈｏｍｏｇｅｎｉｚｅｒ）を用いて破砕した後、破砕された脳組織はブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）実験により組織内のタンパク質濃度を確認した。前記のタンパク質を２ＸＳＤＳバッファー（ｐＨ６．８の１００ｍＭＴｒｉｓＣｌ、５％β−Ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏｌ、４％ＳｏｄｉｕｍＤｏｄｅｓｙｌＳｕｌｆａｔｅ、０．２％ＢｒｏｍｏＰｈｅｎｙｌＢｌｕｅ、２０％グリセロール）と混合して、１００℃で１０分間変性（ｄｅｎａｔｕｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）させて脳組織試料を準備した。

前記の過程により準備された脳組織試料を７．５％アクリルアミドゲルに掛けて、１６ｍＡでタンパク質分離がなされるまで電気泳動した。電気泳動後にアクリルアミドゲルをニトロセルローストランスファーメンブレン（Ｎｉｔｒｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅｔｒａｎｓｆｅｒｍｅｍｂｒａｎｅ；Ｗｈａｔｍａｎ）に密着させた後、トランスファーバッファー（１４．４ｇＧｌｙｃｉｎｅ、３．０３ｇＴｒｉｓ、２００ｍｌメタノール、８００ｍｌ蒸留水）に完全に浸漬した後、８５Ｖで９０分間電気泳動した。前記過程によりタンパク質はトランスファーメンブレンに移動され、移動されたタンパク質はＧＩＴ１抗体を用いて検出した。

前記ウエスタンブロットを行うために、トランスファーメンブレンをＰｏｎｃｅａｕＳ染色薬を用いて染色し、タンパク質の大略の位置を確認した。蒸留水でメンブレインを複数回洗浄してＰｏｎｃｅａｕＳ染色薬を除去し、ブロッキング溶液（５％の脱脂粉乳をＴＢＳＴ溶液に溶解したもの）に３０分間停滞した。その後、ＧＩＴ１に対する抗体（Ｎｅｕｒｏｍａｂ）を希釈（１：１０００）したＴＢＳＴ溶液に１時間反応させた。前記ＧＩＴ１タンパク質に結合していない抗体を除去するために１０分間３回ＴＢＳＴ溶液を用いて洗浄した。２次抗体を希釈（１:１００００）したＴＢＳＴ溶液にメンブレインを３０分間停滞して、ＧＩＴ１抗体に２次抗体が結合されるようにした。その後、結合していない２次抗体を除去するために１０分間３回ＴＢＳＴ溶液を用いて洗浄し、前記メンブレインをＥＣＬ溶液（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）に反応させた後、暗室でｘ−ｒａｙフィルム（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ）に露出してＧＩＴ１タンパク質の有無を確認した。前記のような結果は、図２のｂから観察されたように、ＧＩＴ１^−／−である同型マウスのみからＧＩＴ１遺伝子が欠損されることが確認された。

［実施例２］ＧＩＴ１欠損マウスのオープンフィールド試験（Ｏｐｅｎｆｉｅｌｄｔｅｓｔ）
本発明のＧＩＴ１欠損マウスを用いて多動観察のために新たな環境でオープンフィールド試験（Ｏｐｅｎｆｉｅｌｄｔｅｓｔ）を行った。前記ＧＩＴ１欠損マウスと対照群である正常マウス（Ｗｉｌｄｔｙｐｅ）は２ヶ月〜５ヶ月のマウスを準備した。前記オープンフィールドはマウスに露出したことのない４０−４０−４０ｃｍ（横−縦−高さ）の白色のボックスを準備し、マウスをオープンフィールドの中央に配置した後、６０分間の移動距離をビデオ撮影し、行動分析プログラムを用いて全体移動距離、平均移動速度、中央空間侵入の割合などの結果を分析した。前記オープンフィールドにおける行動分析のために、オープンフィールドにマウスを配置する直前に、注意欠陥多動性障害を予防するための薬物として使用されるアンフェタミン（４ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、１回）とメチルフェニデート（２ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、１回）を腹腔注射した後、直ちにオープンフィールド中央に配置した。前記のような実験結果は図３のａに示されたように、正常マウスに比べてＧＩＴ１欠損マウスの移動距離は大きく、アンフェタミンとメチルフェニデートを投与した結果、図３のｂとｃでＧＩＴ１欠損マウスの移動距離は正常マウスのように驚くほど回復することを観察することができた。しかし、正常マウスに前記のような二つの薬物を投与した場合、移動距離が大きいと観察されたことはアナログ応答であると認識された。

［実施例３］ＧＩＴ１欠損マウスのホームケージ活動性試験（Ｈｏｍｅｃａｇｅａｃｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔ）
本発明のＧＩＴ１欠損マウスを用いて見慣れた空間における多動症状を観察するために、ホームケージ活動性試験（Ｈｏｍｅｃａｇｅａｃｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔ）を行った。本発明の試験は２０−３５−１７ｃｍ規格のホームケージに前記の配置されたマウスを行動測定室に２４時間配置して、マウスが行動実験室に馴化（ｈａｂｉｔｕａｔｉｏｎ）するようにした。その後、１２時間の明るい周期と１２時間の暗い周期の間のマウスの行動をビデオ撮影し、動物行動分析プログラムを用いて全体移動距離を分析した。その結果、図４に示されたように、マウスの夜行性のため昼間にはマウスの行動が減少して移動距離が非常に短く、正常マウスとＧＩＴ１欠損マウスの間の移動距離に差がなかったが、行動が活発になる夜の場合には、本発明のＧＩＴ１欠損マウスが、親しい空間で、正常マウスに比べてより多い距離を移動し、多動を示す特徴があることを確認した。

［実施例４］ＧＩＴ１欠損マウスのモリス水迷路試験（Ｍｏｒｒｉｓｗａｔｅｒｍａｚｅｔｅｓｔ）
本発明のＧＩＴ１欠損マウスを用いてモリス水迷路試験（Ｍｏｒｒｉｓｗａｔｅｒｍａｚｅｔｅｓｔ）によるマウスの空間学習及び記憶能力を測定した。前記モリス水迷路は直径１２０ｃｍの白色の水槽に、不透明の直径１０ｃｍの踏み段を準備したものであって、前記マウスは一日に２回、３０分ごとに踏み段の位置を把握して憶えるための訓練機会を有し、訓練は５日間連続して行われた。前記訓練による学習効果は図５に示したように、ａでは正常マウスがＧＩＴ１欠損マウスに比べてより速い時間内に隠された踏み段を見つける結果が確認され、ＧＩＴ１欠損マウスの空間知覚学習及び記憶能力が問題があることを確認することができた。また、ｂとｃは、６日目に踏み段が除去された水槽で１分間のプローブテスト（ｐｒｏｂｅｔｅｓｔ）を行い、水槽の各四分面でマウスが消耗する時間の割合を観察した結果、ＧＩＴ１欠損マウスが実際に踏み段のある四分面で正常マウスに比べて時間を少なく消耗し、踏み段の位置を正確に通過する回数を動物行動分析プログラムにより分析した結果、ＧＩＴ１欠損マウスが正常マウスに比べて踏み段の位置を正確に通過する回数が減少することが確認できた。

［実施例５］ＧＩＴ１欠損マウスの物体認識試験（Ｎｏｖｅｌｏｂｊｅｃｔｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｔｅｓｔ）
本発明のＧＩＴ１欠損マウスを用いて物体に対する認識及び記憶能力を分析するための物体認識試験（Ｎｏｖｅｌｏｂｊｅｃｔｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｔｅｓｔ）は、オープンフィールド試験で使用されたオープンフィールドボックスで行われた。前記物体認識試験はサンプル期間（Ｓａｍｐｌｅｐｈａｓｅ）と試験期間（Ｔｅｓｔｐｈａｓｅ）とで構成された。サンプル期間中のマウスはオープンフィールドボックスに位置した同一の二つの物体を１０分間探索し、これをビデオ撮影して前記マウスが二つの物体を観察した時間を記録した。その結果、図６で確認したように、ａでは正常マウスとＧＩＴ１欠損マウスが物体を探索する時間は統計的に差がないと示された。また、例えば、二つの同一の物体のうち一つをマウスに露出しなかった新たな物体に変更し、２４時間後に試験期間を行った。前記試験期間には１０分が与えられ、この時間の間マウスが二つの物体を観察した時間を測定した。この場合、マウスの鼻先が物体に接触したり、マウスが物体から２ｃｍ以内で物体に向けていることを観察と規定した。本実験の物体認識及び記憶能力の回復を観察するため、サンプル期間２０分前に、本発明のマウスに４ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの量のアンフェタミンあるいは食塩水を腹腔注射してオープンフィールドボックスに配置した。本実験結果、図６のｂからは、ＧＩＴ１欠損マウスが正常マウスに比べて新たな物体を認識する能力が劣ることが確認され、このような物体認識能力はＡＤＨＤ治療薬物であるアンフェタミンによって回復することを図６のｃから確認することができた。

［実施例６］ＧＩＴ１欠損マウスのシータ領域の波形及び電力スペクトル密度（ＰｏｗｅｒＳｐｅｃｔｒｕｍＤｅｎｓｉｔｙ）の分析
本発明のＧＩＴ１欠損マウスを用いて前頭葉における非正常のシータ領域の波形及び電力スペクトル密度（ＰｏｗｅｒＳｐｅｃｔｒｕｍＤｅｎｓｉｔｙ）の分析のための実験は、ケタミン（ｋｅｔａｍｉｎｅ）１５０ｍｇ／ｋｇを腹腔注射して麻酔されたマウスの頭を定位固定（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ）して行った。ＥＥＧ電極（ｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）は右側前頭葉と左側前頭葉に挿入し、具体的な座標はブレグマ（Ｂｒｅｇｍａ）を基準に前方２．８ｍｍ、側面０．８ｍｍであり、定位固定（ｓｔｅｒｅｏｔａｘｉｃ）機器を用いて正確な座標を算定して位置を取る。接地電極（ｇｒｏｕｎｄｉｎｇｅｌｅｃｔｒｏｄｅ）は後頭葉位置に挿入した。前記マウスは電極挿入後、一週間の回復期を送り、脳波測定時にＥＥＧｃｈａｍｂｅｒ内に挿入して１時間測定した。ＥＥＧ信号はＧｒａｓｓｍｏｄｅｌ７Ｈｐｏｌｙｇｒａｐｈ（ＧｒａｓｓＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて増幅した後、ＤＩＧＩＤＡＴＡ１３２０Ａ（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）を用いて２０００Ｈｚのサンプリング周波数（ｓａｍｐｌｉｎｇｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）にデジタル化した後、ｐＣｌａｍｐ８．０プログラム（ＡｘｏｎＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてデータを得て分析した。その分析結果は図７に示したように、ａはＧＩＴ１欠損マウスの非正常のシータ波の波形が前頭葉から現れたことを示すものであり、ｂはパワースペクトル密度を示すものである。特に、アンフェタミンを投与した後には、ｃに示されたように、ＧＩＴ１欠損マウスの多動と損傷された記憶力は、食塩水を投与した群より、非正常のシータ波の波形が回復することが分かった。

Claims

脳の神経シナプスタンパク質であるＧＩＴ１（Ｇｐｒｏｔｅｉｎ−ｃｏｕｐｌｅｄｒｅｃｅｐｔｏｒｋｉｎａｓｅｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ１）遺伝子を欠損した非ヒト哺乳類を注意欠陥多動性障害モデルとして使用する方法。
１）ＧＩＴ１遺伝子を欠損した非ヒト哺乳類に、注意欠陥または多動の予防剤または治療剤の候補物質を投与する段階と、
２）前記段階１）の候補物質を投与した後、前記非ヒト哺乳類の注意欠陥または多動テストを行う段階と、
３）前記候補物質を投与していない対照群と比較して注意欠陥または多動が減少した候補物質を選別する段階と、
を含む注意欠陥または多動の予防剤または治療剤のスクリーニング方法。
段階１）の非ヒト哺乳類は、マウス、ラット、豚または猿であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
段階２）の注意欠陥または多動テストは、注意欠陥、多動、散漫及び行動障害から選択される一つ以上を特徴とする疾患を有したＧＩＴ１遺伝子欠損マウスに行うことを特徴とする請求項２に記載の方法。
段階１）の候補物質は、ペプチド、タンパク質、非ペプチド性化合物、合成化合物、醗酵生成物、細胞抽出液、植物抽出液、動物組織抽出液または血漿であることを特徴とする請求項２に記載の方法。
段階３）のスクリーニング方法は、オープンフィールド試験（Ｏｐｅｎｆｉｅｌｄｔｅｓｔ）、ホームケージ活動性試験（Ｈｏｍｅｃａｇｅａｃｔｉｖｉｔｙｔｅｓｔ）、モリス水迷路試験（Ｍｏｒｒｉｓｗａｔｅｒｍａｚｅｔｅｓｔ）、物体認識試験（Ｎｏｖｅｌｏｂｊｅｃｔｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｔｅｓｔ）及び脳波図（Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈｅａｌｏｇｒａｍ）試験から選択される一つ以上であることを特徴とする請求項２に記載の方法。