KR102168455B1 - Git1 헤테로 타입 동물모델을 이용한 adhd 치료 약물 스크리닝 방법 - Google Patents

Git1 헤테로 타입 동물모델을 이용한 adhd 치료 약물 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD) 표현형을 보이는 GIT1(G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1) 유전자 결손 헤테로 타입의 인간을 제외한 포유동물을 동물모델을 이용하는 방법 및 동물모델을 이용한 ADHD 치료제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명의 GIT1 유전자 결손 헤테로 타입의 동물모델은 녹-아웃 타입(KO type) 동물모델보다 생존률이 높고 환경에 적응하기 쉬워 ADHD 발병에 대해 감수성이 높은 동물모델로 이용 가능하다.

Description

GIT1 헤테로 타입 동물모델을 이용한 ADHD 치료 약물 스크리닝 방법{METHOD OF SCREENING PHARMACEUTICAL COMPOSITION FOR TREATING ADHD USING A GIT1 HETERO ANIMAL MODEL}
본 발명은 ADHD 표현형을 보이는 GIT1(G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1) 유전자 결손 헤테로 타입 동물모델을 이용한 ADHD 치료 약물 스크리닝 방법에 관한 것이다.
주의력결핍 과잉행동장애(Attention Deficit/Hyperactivity Disorder, 이하, "ADHD"라고 함)는 주의력 결핍, 과잉행동, 충동성, 인지발달 장애, 언어발달 장애, 기억력 및 실행기능의 저하 등을 보이는 널리 알려진 신경발달장애의 일종이다. ADHD는 전 세계 취학 아동의 5% 정도가 ADHD 관련 증상을 보일 정도로 신경발달장애 중에서도 유병률이 가장 높다. 아동기에 나타나는 ADHD 증상들을 치료하지 않고 방치하는 경우 아동기 동안 여러 문제가 지속적으로 발생하게 된다. 게다가, ADHD는 성인기까지 지속되는 비율이 40~60%로 직업 유지 및 결혼생활의 어려움을 겪을 뿐 아니라 알코올을 비롯한 약물 남용 및 의존, 반사회적 행동, 비행, 범죄의 가능성이 높아지고, 학교폭력 및 왕따 문제, 청소년의 자살 등과 관련한 문제점들이 ADHD와 흔히 공존해서 나타난다.
또한, 환자인 당사자 외에 가족이 심리적·경제적으로 부담해야만 하는 비용이 매우 큰 질환으로 사회 전반적으로 ADHD 치료에 대한 필요성이 부각되고 있다. ADHD 기전을 설명하기 위하여 많은 가설이 제시되었으나, 정확한 발병 기전에 대해 현재까지 알려진 바가 없으며 ADHD의 발병 원인을 알기 위한 분자 생물학적, 전기 생물학적, 전기 생리학적 접근법의 필요성이 대두되었다.
기존에 사용되어 왔던 ADHD 동물모델로는 G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1 (이하, "GIT1" 라고 함) 결손 마우스(Knock-out mouse)가 있으나(Soo-Yeon Lim and Won Mah (2015) Abnormal Astrocytosis in the Basal Ganglia Pathway of GIT1(-/-) Mice. Molecules and cells, 38(6): 540-547), 녹-아웃 타입(KO type) 마우스는 태어나기 전 또는 태어난 직후의 사망률이 높아 개체수를 확보하기가 어려워 관련 기전 연구에 많은 애로사항이 발생되는 문제점이 있다.
따라서, 녹-아웃 타입(KO type) 마우스보다는 생존률이 높고 환경에 적응하기 쉬우며 ADHD 발병에 감수성이 높은 동물모델의 개발과 이를 이용한 치료제의 연구가 필요한 실정이다.
본 발명은 전술한 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 ADHD 표현형을 보이면서 GIT1 유전자 결손 녹-아웃(Knock-out) 타입의 동물모델보다 생존률이 높고, ADHD 발병에 대해 감수성이 높은 헤테로 타입 동물모델을 제공하는 것이고, 이를 이용하여 ADHD 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD) 표현형을 보이고, GIT1(G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1) 유전자 결손 헤테로 타입(hetero type)인 인간을 제외한 포유동물을 ADHD 동물모델로 사용하는 방법이 제공된다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, GIT1 유전자 결손 헤테로 타입의 인간을 제외한 포유동물을 준비하는 단계; GIT1 유전자 결손 헤테로 타입의 인간을 제외한 포유동물에 ADHD 치료제 후보물질을 투여하는 단계; 상기 ADHD 치료제 후보물질을 투여한 인간을 제외한 포유동물의 소뇌의 GABA(gamma-aminobutyric acid) 감소를 확인하기 위해 전기생리학 실험을 수행하는 단계; 및 상기 ADHD 치료제 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 소뇌의 GABA의 감소 정도를 비교하여 ADHD 치료 효과를 갖는 후보물질을 선별하는 단계; 를 포함하는, ADHD 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
일 측에 따르면, 상기 ADHD 치료제 후보물질을 투여하는 단계 이후에, 상기 ADHD 치료제 후보물질을 투여한 인간을 제외한 포유동물의 운동조절능력 테스트를 수행하는 단계; 를 더 포함할 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 인간을 제외한 포유동물은 토끼, 원숭이, 마우스 또는 래트(rat)인 것일 수 있다.
일 측에 따르면, 상기 ADHD 치료제 후보물질은 GABA, 발현 벡터, 단백질, 펩티드, 합성 화합물, 또는 천연물인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일 실시예에 따르면, 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD) 표현형을 보이고, GIT1(G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1) 유전자 결손 헤테로 타입(hetero type)인, 동물모델이 제공된다.
본 발명의 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD) 표현형을 보이는 GIT1(G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1) 유전자 결손 헤테로 타입의 동물모델은 녹-아웃 타입(KO type)의 동물모델에 비해 사망률이 낮아 개체수를 확보하기가 쉽고, ADHD 발병에 감수성이 더 높으므로 ADHD의 발병 기전 연구 및 치료제의 스크리닝을 효과적으로 할 수 있다.
본 발명은 ADHD 표현형을 보이는 GIT1 유전자 결손 헤테로 타입의 동물모델을 사용하여 환경적 요인, 유전적 요인 등의 ADHD 발병 원인 기전을 밝히고, ADHD 치료제를 스크리닝 할 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 유전자 결손 헤테로 타입의 동물모델과 야생형인 동물모델의 뇌 절편의 형광면역염색 결과로, 야생형(wild type)인 동물모델보다 GIT1 유전자 결손 헤테로 타입(HE type)인 동물모델에서 소뇌의 GABA가 감소하는 것을 확인한 형광면역염색 결과이다.
도 2는 GIT1 야생형과 GIT1 유전자 결손 헤테로 타입의 GABA, 글루타메이트(Glutamate) 및 푸트레신(Putrescine)의 양을 비교한 그래프이다.
도 3은 GIT1 유전자 결손 헤테로 타입, 녹-아웃 타입(KO type) 및 야생형인 동물모델의 지속적 억제(Tonic current)를 비교하기 위한 전기생리학 실험 결과이다.
도 4는 GIT1 유전자 결손 헤테로 타입 및 야생형인 동물모델의 로타로드 테스트(Rota-rod test) 실험 결과이다.
도 5는 GIT1 유전자 결손 헤테로 타입 및 야생형인 동물모델의 과잉 행동(hyperactivity) 실험 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 GIT1 유전자 결손 헤테로 타입 및 야생형의 별아교세포(astrocyte)가 합성하여 분비하는 GABA의 양의 차이 및 흥분성/억제성의 균형 정도와 전체 행동 차이를 비교하여 도식화한 것이다.
본 명세서에 개시되어 있는 본 발명의 개념에 따른 실시예들에 대해서 특정한 구조적 또는 기능적 설명들은 단지 본 발명의 개념에 따른 실시예들을 설명하기 위한 목적으로 예시된 것으로서, 본 발명의 개념에 따른 실시예들은 다양한 형태로 실시될 수 있으며 본 명세서에 설명된 실시예들에 한정되지 않는다.
본 발명의 개념에 따른 실시예들은 다양한 변경들을 가할 수 있고 여러 가지 형태들을 가질 수 있으므로 실시예들을 도면에 예시하고 본 명세서에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나, 이는 본 발명의 개념에 따른 실시예들을 특정한 개시형태들에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 변경, 균등물, 또는 대체물을 포함한다.
제1 또는 제2 등의 용어를 다양한 구성요소들을 설명하는데 사용될 수 있지만, 상기 구성요소들은 상기 용어들에 의해 한정되어서는 안 된다. 상기 용어들은 하나의 구성요소를 다른 구성요소로부터 구별하는 목적으로만, 예를 들어 본 발명의 개념에 따른 권리 범위로부터 이탈되지 않은 채, 제1 구성요소는 제2 구성요소로 명명될 수 있고, 유사하게 제2 구성요소는 제1 구성요소로도 명명될 수 있다.
본 명세서에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예들을 설명하기 위해 사용된 것으로, 본 발명을 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, “포함하다” 또는 “가지다” 등의 용어는 설시된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것이 존재함으로 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성요소, 부분품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 갖는 것으로 해석되어야 하며, 본 명세서에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
본 명세서에서 사용된 "GIT1(G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1)"는 ARFGAP 도메인, Anykrin 반복 및 GRK 상호작용 도메인을 포함한다. GIT1 유전자는 뇌의 시냅스에 존재하여 신경 돌기의 성장, 수상 돌기 가시 구조형성, 시냅스 형성, 시냅스의 국한(localization) 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 한편, ADHD 아동과 일반 아동을 비교한 경우 GIT1 유전자의 염기 1개가 달라 GIT1 단백질이 적게 만들어지며, GIT1 유전자 결손 녹-아웃 타입(KO type)인 마우스에서 ADHD가 발병한다는 것이 밝혀진 바 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "전기생리학 실험(patch clamp recording)"은 교세포가 관여하는 뇌내 흥분과 억제의 균형 유지 현상을 확인하는 데 주로 사용되는 방법이다. 전기생리학 실험은 패치 클램프 (patch clamp)를 이용한다. 패치 클램프는 세포의 전기, 화학적 신호를 측정할 수 있는 장비로, 현미경, 형광필터, 밸브 컨트롤러(valve controler), 신호 증폭기(amplifier), 석션 시스템(suction system), 매니퓰레이터(manipulator), 헤드 스테이지(head stage) 등 다양한 악세사리 장치 및 모듈, 관련 소프트웨어 등을 포함한다. 뇌내 흥분과 억제의 균형 및 불균형 현상의 관찰은 지속적 가바의 커런트(tonic GABA current 또는 tonic inhibition current)를 측정 및 분석하여 수행할 수 있다. 보다 구체적으로는, 이러한 커런트의 노이즈 레벨 (noise level) 및 진폭 (amplitude)을 분석함으로써 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "로타로드 테스트(Rota-Rod test)"는 소뇌의 운동기능 행동분석실험으로 이용되는 것 중에 하나로, 로타로드 테스트에서는 로타로드(rotarod)라 불리는 장비를 이용하여 마우스가 트래드밀에서 굴러 떨어지기 까지의 시간을 측정한다. 동그란 통나무 굴리기와 유사한 이 실험 기구는 마우스가 회전 실린더를 얼마나 오랫동안 타고 있는 지를 확인하여, 몸의 균형과 소뇌 협응 반응을 측정할 수 있다. 특히, 유전자 변형된 마우스들의 운동 협응 반응에 이상이 있거나 변화가 생기는지 탐구하는데 이용 가능하다.
기존의 보고에서는 GIT1 유전자 결손 헤테로 타입의 동물모델은 야생형과 마찬가지로 정상이고, 녹-아웃 타입(KO type)인 동물모델 만이 ADHD 표현형을 보이는 것으로 기술되어 있으나, 본 발명에서는 생화학적, 생리학적 및 행동학적 실험을 통해 헤테로 타입은 야생형과 유의한 차이를 나타내며, 헤테로 타입 동물이 야생형보다는 녹-아웃 타입에 가까운 특성을 보이는 등 정상으로 볼 수 없음을 발견 및 증명하였다.
또한, 본 발명자는 녹-아웃 타입의 경우 행동실험을 수행하기 어려울 정도로 결손이 심하지만, 헤테로 타입의 경우 야생형에 비해서는 높은 과잉 행동(hyperactivity)을 보이면서 녹-아웃 타입 보다는 결손 행동이 적어 보다 현실적이고 활용 가능성이 높은 ADHD 동물모델이 될 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하였다(도 6).
더욱이, GIT1 유전자 결손 녹-아웃 타입 동물은 태어나기 전 또는 태어난 직후의 사망률이 높아 개체수의 확보가 어렵다는 문제점이 있으나, Git 유전자 결손 헤테로 타입 동물은 녹-아웃 타입 동물보다 생존률이 높고 환경에 적응하기 쉽다는 장점이 있어 보다 효율적이고 경제적인 실험 진행이 가능하다는 장점이 있다.
이에, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD) 표현형을 보이는 GIT1(G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1) 유전자 결손 헤테로 타입(hetero type)인 인간을 제외한 포유동물을 ADHD 동물모델로 사용하는 방법이 제공된다. 또한, 본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD) 표현형을 보이고, GIT1(G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1) 유전자 결손 헤테로 타입(hetero type)인, 동물모델이 제공된다.
구체적으로, 본 발명은 신경발달장애의 일종인 주의력결핍 과잉행동장애(Attention deficit/hyperactivity disorder, ADHD)을 치료하기 위한 약물을 스크리닝하고, 발병 기전을 연구하기 위해 GIT1 유전자 결손 헤테로 타입의 인간을 제외한 포유동물을 ADHD 동물 모델로 사용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 일 실시예에 따르면, GIT1 유전자 결손 헤테로 타입의 인간을 제외한 포유동물을 준비하는 단계; GIT1 유전자 결손 헤테로 타입의 인간을 제외한 포유동물에 ADHD 치료제 후보물질을 투여하는 단계; 상기 ADHD 치료제 후보물질을 투여한 인간을 제외한 포유동물의 소뇌의 GABA(gamma-aminobutyric acid) 감소를 확인하기 위해 전기생리학 실험을 수행하는 단계; 및 상기 ADHD 치료제 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 소뇌의 GABA의 감소 정도를 비교하여 ADHD 치료 효과를 갖는 후보물질을 선별하는 단계; 를 포함하는, ADHD 치료제의 스크리닝 방법이 제공된다.
본 발명자는 GIT1 유전자 결손 헤테로 타입의 동물모델에서 야생형인 동물모델과 비교하여 소뇌의 GABA 밀도가 감소하고, GABA에 의해 매개되는 지속적 억제 커런트(tonic inhibition current)가 감소하는 것을 확인하였으므로(도 1 및 도 3), 전기생리학 실험에서 ADHD 치료제 후보물질을 투여 한 실험군이 후보물질을 투여하지 않은 대조군에 비해 지속적 억제 커런트의 증가가 관찰된 경우, 투여된 후보물질이 치료제로서 효과가 있는 것으로 판단할 수 있다.
한편, ADHD 치료제 후보물질을 투여하는 단계에서, 후보물질은 당 업계에 공지된 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 후보물질의 투여방법은 예를 들어, 경구 투여, 근육 내 투여, 피내투여, 정맥 내 투여, 복강 내 투여, 피하투여, 비강 투여, 구강 및 설하 투여 또는 비경구 투여일 수 있으며, 투여 경로 및/또는 투여 방법은 대상체의 상태, 후보물질의 성질, 원하는 결과에 따라 적절히 선택될 수 있다. 또한, 후보물질의 투여량은 투여 방법, 투여 경로 및 후보물질의 성질 등에 따라 적절히 선택될 수 있다.
GIT1 유전자 결손 헤테로 타입의 인간을 제외한 포유동물은 토끼, 원숭이, 마우스 또는 래트(rat)일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 본 명세서에서 사용된 GIT1 유전자 결손 헤테로 타입 마우스가 가장 바람직하다.
ADHD 치료제 후보물질은 GABA(gamma-aminobutyric acid), 발현 벡터, 단백질, 펩티드, 합성 화합물, 또는 천연물인 것일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 후보물질은 신규한 물질일 수 있고, 공지된 물질이어도 무방하다.
공지된 ADHD 치료제 후보물질로 많이 쓰이는 메틸페니데이트(Metylphenidate), 암페타민, 덱스트로암페타민 및 이의 전구약물 등은 중추신경계를 자극하여 도파민을 방출 및 증가시키는 메커니즘을 통해 집중력을 높이는 효과가 있으나 식욕부진, 불면증, 두통, 불안 등의 부작용이 있다.
한편, GABA(gamma-aminobutyric acid)는 포유류 중추신경계의 대표적인 아미노산 억제성 신경전달물질 중 하나로, 이의 부족 내지 결핍은 간질, 발작과 같은 신경성 질환을 유발하는 것으로 알려져 있고, 신생아에서 성인으로 뇌가 성장하면서 GABA의 역할이 자극에서 억제로 바뀌게 되는 것으로 알려져 있는 물질이다. 앞서 기술한 바와 같이, ADHD 표현형을 보이는 동물모델의 소뇌에서의 GABA 밀도가 대조군(야생형)에 비해 감소하므로, GABA가 ADHD 치료제 후보물질이 될 수 있고, GABA의 생산에 관여하는 물질 등이 ADHD 치료제 후보물질로 고려될 수 있다.
ADHD 치료제 후보물질을 투여하는 단계 이후에, 상기 ADHD 치료제 후보물질을 투여한 인간을 제외한 포유동물의 운동조절능력 테스트를 수행하는 단계; 를 더 포함할 수 있다.
이하, 실시예들을 첨부된 도면을 참조하여 상세하게 설명한다. 그러나, 특허출원의 범위가 이러한 실시예들에 의해 제한되거나 한정되는 것은 아니다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
실시예 1: GIT1 유전자 결손 헤테로 타입 마우스 준비
야생형 마우스와 GIT1 유전자 결손 녹-아웃 타입(KO type)인 마우스를 교배하여 GIT1 유전자 결손 헤테로 타입인 마우스를 얻는다. 얻어진 헤테로 타입 마우스끼리의 mating cage를 만든 후, 유전형질분석(genotyping)을 수행하여 헤테로 타입인 마우스를 분리한다.
실시예 2: GIT1 유전자 결손 헤테로 타입 마우스와 야생형 마우스의 소뇌 GABA 밀도 비교
실제로 마우스의 소뇌에서 발현되는 신경전달물질의 존재양을 비교하기 위하여, 소뇌 절편의 면역 형광 염색법을 수행하였다. 면역 형광 염색법은 마우스를 조직을 고정하여 뇌부분을 동결절편 후, GABA를 검출할 수 있는 항체를 붙인 후, 해당 항체를 타겟으로 하는 2차 형광 항체를 이용하여 신호를 증폭하였다. 이와 같이 증폭된 신호는 공초점 현미경을 이용하여 확인하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 소뇌 절편의 주요 억제성 신경전달물질인 가바 (GABA)의 발현양이 GIT1 헤테로타입 마우스(HE)에서 야생형 마우스(WT)에 비해 감소한 것을 형광 강도 비교를 통해 확인할 수 있었다. 구체적으로, 성상교세포(별아교세포) 표지 단백질인 glial fibril acidic protein (GFAP)과 함께 비교하였을 때, 야생형 마우스와 헤테로 타입 마우스에서 GFAP의 발현 정도는 크게 차이가 나지 않는 반면, GFAP과 함께 발현하는 GABA의 양, 즉 성상교세포 내에 존재하는 GABA의 양은 헤테로 타입 마우스의 경우 야생형 마우스에 비해 확연히 감소해 있는 것을 확인할 수 있다. 이와 같은 실험결과를 통해, 실제로 GIT1 야생형 마우스와 헤테로 타입 마우스의 소뇌에서 성상교세포 내 GABA의 발현양의 차이가 헤테로 타입과 야생형 간에 존재하는 행동인지적 특성의 원인이 될 수 있음을 추론할 수 있다.
실시예 3: GIT1 유전자 결손 헤테로 타입 마우스의 소뇌 GABA 감소 확인을 위한 전기생리학 실험
상기 실시예 1에서 준비한 마우스를 할로탄(halothane)으로 마취한 후, 뇌 부위의 두개골을 열어 뇌 조직을 꺼내고, 차갑게 얼린 컷팅 용액에 담겄다. (차갑게 얼린 컷팅 용액은 다음을 포함한다(in mM): 250 sucrose, 26 NaHCO3, 10 D(+)-glucose, 4 MgCl2, 3 myo-inositol, 2.5 KCl, 2 sodium pyruvate, 1.25 NaH2PO4, 0.5 ascorbic acid, 0.1 CaCl2 , and 1 kynurenic acid, pH 7.4.) (전체 용액은 95 % O2-5 % CO2로 가스처리 되었다.)
소뇌 부위를 트리밍 기계에 올리고 두께를 250㎛ 로 설정하여 parasagittal 슬라이스를 만든다. 이 슬라이스는 extracellular ACSF solution에 담궈 한 시간 정도 회복시간을 갖게 하였다(in mM): 126 NaCl, 24 NaHCO3, 1 NaH2PO4, 2.5 KCl, 2.5 CaCl2, 2 MgCl2, and 10 D(+)-glucose, pH 7.4.
이 후 슬라이스를 인공뇌척수액이 계속 흐르고 있는 레코딩 챔버로 옮겨 현미경 하에서 조직과 세포의 모양을 분별하고, 세포를 패치 한 후 레코딩을 실시했다 (ACSF flow rate = 2 ml/min). 소뇌의 10개의 엽(lobule) 중에 2 내지 5 개의 엽(lobule)에 해당하는 부위에서 과립세포를 타겟으로 했다. 고정막 전위는 -60mV이고 파이펫의 저항은 8-10 MΩ이며 파이펫은 internal solution 으로 채웠다(internal solution in mM): 135 CsCl, 4 NaCl, 0.5 CaCl2, 10 HEPES, 5 EGTA, 2 Mg-ATP, 0.5 Na2-GTP, 10 QX-314, pH adjusted to 7.2 with CsOH (278-285 mOsmol).
측정되는 전기신호는 Digidata 1440A, Multiclamp 700B amplifier (Molecular Devices), pCLAMP 10.2 software를 통해 분석했다.
그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 GIT1 유전자 결손 헤테로 타입은 야생형보다 녹-아웃 타입과 비슷하게 소뇌에서의 GABA에 의해 매개되는 지속적 억제(Tonic current)가 감소한 것을 확인할 수 있다.
실시예 4: GIT1 유전자 결손 헤테로 타입 마우스의 GABA , Glutamate 및 Putrescine 농도 비교
상기 실시예 1에서 준비한 헤테로 타입 마우스와 야생형 마우스의 소뇌에서 in vivo 미세 투석법(microdialysis)을 통해 뇌간질액을 추출한 다음, GABA, Glutamate 등의 신경전달물질과 GABA를 만드는 재료인 putrescine의 양을 mass spectrometry로 측정하여 그 결과를 도 2에 나타냈다.
도 2을 참고하면, 야생형 마우스와 헤테로 타입 마우스간 상기 세 가지 물질양에 유의한 차이가 나타나는 것을 확인할 수 있다. 특히, 억제성 신경전달물질인 GABA의 경우 헤테로 타입에서 매우 유의하게 감소하였는데, 이하에서 나타나는 바와 같이 헤테로 타입 마우스의 흥분성이 높아지는 것은 억제성 물질의 전반적 감소가 일어났기 때문인 것으로 해석할 수 있다.
실시예 5: GIT1 유전자 결손 헤테로 타입 마우스의 운동조절능력 테스트
7~8주차 된 상기 실시예 1에서 준비한 헤테로 타입 마우스와 야생형 마우스를 연속 5일 동안 동일한 시간에 약 10분 간 핸들링(handling) 한다. 이후 트레이닝 세션을 3일간 하루에 4회씩 진행한다. 첫째날, 24rpm에서 최대 60초 동안 로타로드(rota-rod) 위에서 버티는 시간을 기록한다. 둘째날, 28rpm에서 최대 60초 동안 로타로드(rota-rod) 위에서 버티는 시간을 기록한다. 셋째날, 32 rpm에서 최대 60초 동안 로타로드(rota-rod) 위에서 버티는 시간을 기록한다. 한 세션 마다 10분 휴식 후 다시 로타로드(rota-rod) 위에서 버티는 시간을 기록한다.
이후 테스트 세션을 2일에 걸쳐 하루에 2회씩 진행하는데 32rpm에서 최대 600초 동안 로타로드(rota-rod) 위에서 버티는 시간을 기록한다. 1회 트레이닝 한 후 10분 간 휴식을 주고 다시 로타로드(rota-rod) 위에서 버티는 시간을 기록한다.
로타로드 테스트를 이용하여 평가한 결과는 도 4에 나타냈다. 도 4는 GIT1 유전자 결손 헤테로 타입인 마우스와 야생형 마우스의 가속되는 조건에서 트래드밀 위에서 버티는 시간(latency to fall) (sec, 초) 및 최대속도(rpm, 가속 중 떨어지는 순간의 속도)를 비교한 그래프로, 1일에서 4일로 시간이 경과할수록 더 오래 버티는 트레이닝 효과를 보이기는 하나 3일째부터 헤테로 타입이 야생형과 유의한 차이를 보이며 더 빨리 떨어지고, 떨어지는 순간의 속도가 낮은 것을 확인할 수 있다.
실시예 6: GIT1 유전자 결손 헤테로 타입 마우스의 과잉 행동 테스트
상기 실시예 1에서 준비한 헤테로 타입 마우스와 야생형 마우스들은 실험 7일 전, 행동 실험방에서 환경에 익숙하게 하였다. 4일 간 동일한 오전 시간에 핸들링을 하여, 마우스가 실험 환경과 실험자의 손, 실험 시간에 익숙해지도록 하였다. 비디오 카메라는 상향에서 수직으로 케이지를 촬영하였고, 정사각형의 케이지들 가운데에 조심스레 놓았다. 각 케이지의 옆면은 모두 검정색의 불투명한 벽으로 되어 있어, 케이지간 마우스가 서로의 존재를 확인 불가능하였다. 각 촬영 당 4개의 케이지가 동시에 촬영이 되었으며, 실험자의 존재가 마우스의 행동에 영향을 줄 수 있어, 촬영 시간 동안 실험자는 행동 실험방의 밖에 있었다. 촬영은 각 세트 당 30분씩 진행되었으며, 촬영이 끝난 후, 마우스는 원래의 홈케이지로 돌아가고, 실험에 사용된 케이지는 에탄올로 닦은 후, 다시 마른 휴지로 에탄올을 마저 닦아내어, 다음 실험 세트의 마우스들이 전 마우스의 영향을 받지 않도록 하였다. 테스트는 1회 진행되었으며, 촬영된 영상은 오픈 필드 테스트(open field test) 분석 프로그램인 Anymaze를 이용하여 각기 실험 시작부터 5분과 10분으로 나뉘어 분석되었다.
이러한 오픈 필드 테스트(open field test)는 마우스의 중앙의 시작 지점으로부터 촬영이 끝나는 때까지의 움직임을 기록, 분석함으로써, 마우스가 같은 시간동안 얼마나 많이 움직였으며, 한 자리에 오래 있었는지를 확인하게 된다. 즉, 처음 겪는 케이지의 환경에서는 마우스가 잘 움직이지 않게 되기에, 이러한 환경에서 과행동을 보이는 마우스를 일반 마우스와 비교를 할 수 있다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 오픈 필드 테스트에서 야생형 마우스는 헤테로 타입의 마우스에 비해 더 오랜 시간동안 한 자리에 머무는 것을 열지도로 표시된 상단의 그림에서 확인할 수 있었으며, 헤테로 타입의 마우스의 경우 5분과 10분의 경우 모두에서 더 녹색인 영역이 많이 퍼져 있는 것을 통해 지속적인 케이지 전반으로의 움직임을 확인할 수 있다. 도 5의 하단에서는, 분석이 시작되는 점을 빨간색, 분석이 끝나는 점을 파란색으로 하고, 분석 시간 동안의 이동을 보라색 선으로 표시하여 나타냈으며, 이를 통하여 더욱 명확하게 야생형 마우스에 비해 헤테로 타입의 마우스가 활동적으로 케이지를 돌아다니는 것을 5분 및 10분의 분석 모두에서 확인할 수 있었다.
결론적으로, GIT1 유전자 결손 헤테로 타입 마우스가 야생형 마우스에 비해 한 자리에 잘 머무르지 않고 많은 부분을 움직이는 높은 과잉 행동(hyperactivity) 상태를 나타내는 것을 알 수 있다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기를 기초로 다양한 기술적 수정 및 변형을 적용할 수 있다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 청구범위의 범위에 속한다.

Claims (6)

  1. 주의력결핍 과잉행동장애(ADHD) 표현형을 보이고, GIT1(G protein-coupled receptor kinase interacting protein 1) 유전자 결손 헤테로 타입(hetero type)인 인간을 제외한 포유동물을 ADHD 동물모델로 사용하는 방법.
  2. GIT1 유전자 결손 헤테로 타입의 인간을 제외한 포유동물을 준비하는 단계;
    GIT1 유전자 결손 헤테로 타입의 인간을 제외한 포유동물에 ADHD 치료제 후보물질을 투여하는 단계;
    상기 ADHD 치료제 후보물질을 투여한 인간을 제외한 포유동물의 소뇌의 GABA(gamma-aminobutyric acid) 감소를 확인하기 위해 전기생리학 실험을 수행하는 단계; 및
    상기 ADHD 치료제 후보물질을 투여하지 않은 대조군과 비교하여 소뇌의 GABA의 감소 정도를 비교하여 ADHD 치료 효과를 갖는 후보물질을 선별하는 단계; 를 포함하는, ADHD 치료제의 스크리닝 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 ADHD 치료제 후보물질을 투여하는 단계 이후에, 상기 ADHD 치료제 후보물질을 투여한 인간을 제외한 포유동물의 운동조절능력 테스트를 수행하는 단계; 를 더 포함하는, 스크리닝 방법.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 인간을 제외한 포유동물은 토끼, 원숭이, 마우스 또는 래트(rat)인 것인, 스크리닝 방법.
  5. 제2항에 있어서,
    상기 ADHD 치료제 후보물질은 GABA, 발현 벡터, 단백질, 펩티드, 합성 화합물, 또는 천연물인 것인, 스크리닝 방법.


  6. 삭제
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