JP5927252B2 - 小脳でのｇａｂａ放出調節剤 - Google Patents

小脳でのｇａｂａ放出調節剤 Download PDF

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Description

本発明は、ベストロフィン（Bestrophin）１チャネル抑制剤を有効成分として含有する小脳（cerebellum）でのγ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ：gamma-aminobutyric acid)放出抑制剤及びＧＡＢＡ過剰放出による病的症状治療用組成物；ベストロフィン１チャネル活性化剤を有効成分として含有する小脳でのＧＡＢＡ放出促進剤及びＧＡＢＡ不足による病的症状治療用組成物；及び小脳のベストロフィン１チャネルをターゲットとする小脳でのＧＡＢＡ放出調節剤スクリーニング方法；に関する。
ＧＡＢＡは、哺乳類中枢神経系の代表的な抑制性神経伝達物質のうち一つである。
ＧＡＢＡは、次のような２種の作用モードで作用すると知られている：緊張性（tonic）モード及び位相性（phasic）モード。ＧＡＢＡの位相性分泌（phasic release）メカニズムは、Ｃａ２＋依存的小胞性分泌（Ｃａ２＋ dependent vesicular release）であると明確に定立されているが、ＧＡＢＡの緊張性分泌（tonic release）のソース及びメカニズムは、さらに多くの研究が必要な状況である。
このために、本発明者らは、ＧＡＢＡの緊張性分泌メカニズムを究明し、本発明を完成するに至った。
本発明の一例は、ベストロフィン１チャネル活性調節剤を有効成分として含む小脳でのＧＡＢＡ放出調節剤を提供するものである。
具体的には、ベストロフィン１チャネル遮断剤を有効成分として含む小脳でのＧＡＢＡ放出抑制剤を提供するものである。
また、ベストロフィン１チャネル活性化剤を有効成分として含む小脳でのＧＡＢＡ放出促進剤を提供するものである。
さらに他の例は、ベストロフィン１チャネル活性を調節し、小脳でのＧＡＢＡ放出を調節する方法を提供するものである。
具体的には、ベストロフィン１チャネル活性を抑制し、小脳でのＧＡＢＡ放出を抑制する方法を提供するものである。
また、ベストロフィン１チャネルを活性化し、小脳でのＧＡＢＡ放出を促進する方法を提供するものである。
本発明の一例は、ベストロフィン１チャネル活性調節剤の小脳でのＧＡＢＡ放出調節のための有効成分としての用途を提供する。
具体的には、ベストロフィン１チャネル遮断剤の小脳でのＧＡＢＡ放出抑制のための有効成分としての用途を提供する。
また、ベストロフィン１チャネル活性化剤の小脳でのＧＡＢＡ放出促進のための有効成分としての用途を提供する。
さらに他の例は、ベストロフィン１チャネル活性調節剤を有効成分として含む、ＧＡＢＡ過放出または不足によって発生する疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療用の組成物を提供する。
具体的には、ベストロフィン１チャネル遮断剤を有効成分として含む、ＧＡＢＡ過放出による疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療用の組成物を提供する。
また、ベストロフィン１チャネル活性化剤を有効成分として含む、ＧＡＢＡ不足による疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療用の組成物を提供する。
さらに他の例は、ベストロフィン１チャネル活性調節剤を有効成分として使用するＧＡＢＡ過放出または不足によって発生する疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療の方法を提供する。
具体的には、ベストロフィン１チャネル遮断剤を有効成分として使用するＧＡＢＡ過放出による疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療の方法を提供する。
また、ベストロフィン１チャネル活性化剤を有効成分として使用するＧＡＢＡ不足による疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療の方法を提供する。
さらに他の例は、ベストロフィン１チャネル活性調節剤のＧＡＢＡ過放出または不足によって発生する疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療のための有効成分としての用途を提供する。
具体的には、ベストロフィン１チャネル遮断剤のＧＡＢＡ過放出による疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療のための有効成分としての用途を提供する。
また、ベストロフィン１チャネル活性化剤のＧＡＢＡ不足による疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療のための有効成分としての用途を提供する。
さらに他の例は、候補物質を小脳サンプルと接触させ、小脳のベストロフィン１チャネル活性化いかんを確認し、小脳でのＧＡＢＡ放出調節剤をスクリーニングする方法を提供する。
小脳膠細胞はＧＡＢＡを含み、直接透過によってＧＡＢＡを放出するベストロフィン１（Ｂｅｓｔ１）チャネルを発現するということを示し、ＧＦＡＰ−ＧＦＰ形質転換マウス小脳でのＧＦＰ，Ｂｅｓｔ１及びＧＡＢＡに対する抗体を利用した免疫組織化学共焦点イメージである。 小脳膠細胞はＧＡＢＡを含み、直接透過によってＧＡＢＡを放出するベストロフィン１（Ｂｅｓｔ１）チャネルを発現するということを示し、２−細胞スニファパッチの概略図である。 小脳膠細胞はＧＡＢＡを含み、直接透過によってＧＡＢＡを放出するベストロフィン１（Ｂｅｓｔ１）チャネルを発現するということを示し、ＧＡＢＡの透過程度を示す結果である。 小脳膠細胞はＧＡＢＡを含み、直接透過によってＧＡＢＡを放出するベストロフィン１（Ｂｅｓｔ１）チャネルを発現するということを示し、記載された条件下でのＧＡＢＡ放出活性化程度を示すグラフである。 Ｃｒｅ−ｌｏｘ調節ｐＳｉｃｏＲ−ｓｈＲＮＡレンチウイルス構造体の様子を示す概略図である。 Ｂ６またはＧＦＡＰ−ＧＦＰマウスを使用する実験日程を示す図面である。 ＧＦＡＰ−ＧＦＰ（緑色）染色、Ｂｅｓｔ１（紫紅色）及びｍCherry（赤色）を含むＢ１−ｓｈＲＮＡレンチウイルスの形態を示す図面である。 ランププロトコル（ramp protocol、Ｖｈ＝−７０ｍＶ）を使用した膠細胞パッチ記録結果を示す図面である。 scrambled ｓｈＲＮＡ注入されたＧＦＡＰ−ＧＦＰマウスでの電流−電圧トレースを示すグラフである。 Ｂｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡ注入されたＧＦＡＰ−ＧＦＰマウスでの電流−電圧トレースを示すグラフである。 記載された条件に係わるＮＰＰＢ敏感性電流の電流−電圧トレースの平均を求めてフローティングしたところを示すグラフである。 Ｃｌ−とＧＡＢＡとの流出を比較するために、図２Ｇで得た−８０ｍＶでの電流大きさを示すグラフである。 緊張性ＧＡＢＡ電流は、陰イオンチャネル遮断剤によって抑制され、ベストロフィンチャネルの遺伝子沈黙によって減少するということを示し、半透明プルキンエ細胞層（黒色矢印）によって分離された、明るい蛍光色の顆粒細胞層の顆粒細胞体と、分子層内に位置する平行線維とを示すＣＬＭ１ Clomeleonマウスの小脳切片の様子を示すイメージである。 緊張性ＧＡＢＡ電流は、陰イオンチャネル遮断剤によって抑制され、ベストロフィンチャネルの遺伝子沈黙によって減少するということを示し、Clomeleonの比率イメージ（ratiometric imaging）であり、経時的な［Ｃｌ−］ｉ変化を示すグラフである。 緊張性ＧＡＢＡ電流は、陰イオンチャネル遮断剤によって抑制され、ベストロフィンチャネルの遺伝子沈黙によって減少するということを示し、ＮＰＰＢによる［Ｃｌ−］ｉ変化と、ＳＲによる［Ｃｌ−］ｉ変化との相関関係を示すグラフである。 緊張性ＧＡＢＡ電流は、陰イオンチャネル遮断剤によって抑制され、ベストロフィンチャネルの遺伝子沈黙によって減少するということを示し、scrambled−ｓｈＲＮＡレンチウイルス注入されたマウスから得たClomeleonイメージ結果である。 緊張性ＧＡＢＡ電流は、陰イオンチャネル遮断剤によって抑制され、ベストロフィンチャネルの遺伝子沈黙によって減少するということを示し、Ｂ１−ｓｈＲＮＡ注入されたマウスから得たClomeleonイメージ結果である。 緊張性ＧＡＢＡ電流は、陰イオンチャネル遮断剤によって抑制され、ベストロフィンチャネルの遺伝子沈黙によって減少するということを示し、それぞれのウイルスタイプと、それぞれの層とでのClomeleonイメージ結果を要約したグラフである。 緊張性ＧＡＢＡ電流は、陰イオンチャネル遮断剤によって抑制され、ベストロフィンチャネルの遺伝子沈黙によって減少するということを示し、８週齢Ｂ６マウスの小脳スライス（維持電位（holding potential）：−６０ｍＶ）の顆粒細胞から得た緊張性ＧＡＢＡ電流の加工前トレースを示す図面である。 緊張性ＧＡＢＡ電流は、陰イオンチャネル遮断剤によって抑制され、ベストロフィンチャネルの遺伝子沈黙によって減少するということを示し、天然（naive），scrambled及びＢ１−ｓｈＲＮＡ注入されたマウスから得たＧＡＢＡzine−敏感性電流を要約したグラフである。 緊張性ＧＡＢＡ電流は、陰イオンチャネル遮断剤によって抑制され、ベストロフィンチャネルの遺伝子沈黙によって減少するということを示し、ＮＰＰＢ敏感性電流を要約したグラフである。 Ｂｅｓｔ１チャネルの膠細胞特異的構造（rescue）が緊張性ＧＡＢＡ電流を回復させるということを示し、ｈＧＦＡＰ−ＣｒｅＥＲＴマウスに係わる試験日程を示した図面である。 Ｂｅｓｔ１チャネルの膠細胞特異的構造（rescue）が緊張性ＧＡＢＡ電流を回復させるということを示し、膠細胞特異的構造メカニズムを模式的に示す図面である。 Ｂｅｓｔ１チャネルの膠細胞特異的構造（rescue）が緊張性ＧＡＢＡ電流を回復させるということを示し、膠細胞での全細胞パッチクランプ記録を示す図面である。 Ｂｅｓｔ１チャネルの膠細胞特異的構造（rescue）が緊張性ＧＡＢＡ電流を回復させるということを示し、天然（naive）、ｓｈＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ＋タモキシフェン（ＴＡＭ）の場合のＧＡＢＡzine−敏感性緊張性ＧＡＢＡ電流を示すグラフである。 Ｂｅｓｔ１チャネルの膠細胞特異的構造（rescue）が緊張性ＧＡＢＡ電流を回復させるということを示し、天然（naive）、ｓｈＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ＋タモキシフェンの場合のＮＰＰＢ敏感性緊張性ＧＡＢＡ電流を示すグラフである。 Ｂｅｓｔ１チャネルの膠細胞特異的構造（rescue）が緊張性ＧＡＢＡ電流を回復させるということを示し、小脳での緊張性ＧＡＢＡ放出の提案モデルである。 成体マウス小脳の膠細胞において、ｍＢｅｓｔ１とＧＡＢＡとが強力に発現するということを示し、ａは、マウス小脳でのＧＡＢＡ、Ｂｅｓｔ１及びＧＦＡＰ−ＧＦＰの免疫組織化学的共焦点イメージであり、ｂは、小脳のＧＡＢＡ染色及びＧＦＡＰ−ＧＦＰ染色の高倍率イメージであり、ｃは、Ｂｅｓｔ１染色とＧＦＡＰ染色との高倍率（Ｘ６０）イメージである。 脳顆粒細胞層での緊張性ＧＡＢＡ放出は、Ｃａ２＋依存的であり、非小胞性であり、陰イオン遮断剤によって抑制されるということを示し、以下図６Ｂないし図６Ｇの結果を得るのに使われた試片顆粒細胞及び分子細胞層の顕微鏡観察写真を示すイメージ（上側：Ｘ４０、下側：Ｘ６００）である。 脳顆粒細胞層での緊張性ＧＡＢＡ放出は、Ｃａ２＋依存的であり、非小胞性であり、陰イオン遮断剤によって抑制されるということを示し、１００μＭニフルム酸処理した場合の緊張性ＧＡＢＡ電流記録を示した図面である。 脳顆粒細胞層での緊張性ＧＡＢＡ放出は、Ｃａ２＋依存的であり、非小胞性であり、陰イオン遮断剤によって抑制されるということを示し、１５０μＭ ＢＡＰＴＡ−ＡＭと共にインキュベーティングする場合の緊張性ＧＡＢＡ電流記録を示した図面である。 脳顆粒細胞層での緊張性ＧＡＢＡ放出は、Ｃａ２＋依存的であり、非小胞性であり、陰イオン遮断剤によって抑制されるということを示し、０．５μＭコンカナマイシンＡ（concanamycin Ａ）と共にインキュベーティングする場合の緊張性ＧＡＢＡ電流記録を示した図面である。 脳顆粒細胞層での緊張性ＧＡＢＡ放出は、Ｃａ２＋依存的であり、非小胞性であり、陰イオン遮断剤によって抑制されるということを示し、３０μＭ ＮＰＰＢ処理した場合の緊張性ＧＡＢＡ電流記録を示した図面である。 脳顆粒細胞層での緊張性ＧＡＢＡ放出は、Ｃａ２＋依存的であり、非小胞性であり、陰イオン遮断剤によって抑制されるということを示し、無処理（untreated）、コンカナマイシンＡ，ＢＡＰＴＡ−ＡＭ処理時のＧＡＢＡzine敏感性電流結果を要約したグラフである。 脳顆粒細胞層での緊張性ＧＡＢＡ放出は、Ｃａ２＋依存的であり、非小胞性であり、陰イオン遮断剤によって抑制されるということを示し、Ｃａ２＋敏感性Ｃｌ−チャネル遮断剤による緊張性電流の抑制率（％）を示すグラフである。 ＮＰＰＢは、ＧＡＢＡ受容体に直接影響を及ぼさないということを示し、ＧＡＢＡｃを発現するＨＥＫ２９３細胞を、１００μＭ ＮＦＡの不在下または存在下でパッチクランピングし、１００μＭ ＧＡＢＡで感染（challenge）させた結果を示す図面である。 ＮＰＰＢは、ＧＡＢＡ受容体に直接影響を及ぼさないということを示し、ＧＡＢＡｃを発現するＨＥＫ２９３細胞を、１００μＭ ＮＰＰＢの不在下または存在下でパッチクランピングし、１００μＭ ＧＡＢＡで感染（challenge）させた結果を示す図面である。 ＮＰＰＢは、ＧＡＢＡ受容体に直接影響を及ぼさないということを示し、ＮＰＰＢの適用が、小脳顆粒細胞上のＧＡＢＡ受容体には影響を及ぼさないということを示し、ＮＰＰＢ処理（２分及び５分）時のＧＡＢＡ誘導電流をbaselineと比較して示した図面である。 ＮＰＰＢは、ＧＡＢＡ受容体に直接影響を及ぼさないということを示し、ＮＰＰＢの適用が小脳顆粒細胞上のＧＡＢＡ受容体には影響を及ぼさないということを示し、ＮＰＰＢ処理（２分及び５分）時のＧＡＢＡ誘導電流をbaselineと比較して示した図面である。 ｓｈＲＮＡ及びscrambled ＲＮＡ注入されたマウスでのｍCherry信号の蛍光イメージである（scale bar：２００μｍ（Ｘ１０）；５０μｍ（Ｘ４０））。 ｈＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスでの遺伝子沈黙によるＢｅｓｔ１ノックダウン実験を示し、左側パネルは、タモシキフェン注入されたｈＧＦＡＰ−Ｃｒｅマウスに注入されたＢ１−ｓｈＲＮＡレンチウイルスの様子を示し（赤色）、真ん中のパネルは、同じ部位でのＢｅｓｔ１染色されたイメージであり、右側パネルは、膠細胞のマーカーであるＧＦＡＰを染色したイメージと共に、左側パネルと真ん中のパネルとのイメージを併合させたイメージであり、Ｂｅｓｔ１（紫紅色）は、レンチウイルス感染部位と非感染部位とで、同様に染色されるということを示すイメージである（scale bar：１００μＭ）。
本発明者らは、緊張性γ-アミノ酪酸（ＧＡＢＡ：gamma-aminobutyric acid）抑制が、小脳（cerebellum）内の膠細胞（glial cell）からのＧＡＢＡ分泌に起因し、このようなＧＡＢＡの分泌（release）は、最近特性が明らかになった陰イオンチャネルであるベストロフィン１（Ｂｅｓｔ１）チャネルを直接的に通過して起こるということを明らかにした。まず、２−細胞スニファパッチ技法（two-cell sniffer patch technique）を利用し、Ｂｅｓｔ１チャネルが、ＧＡＢＡを直接通過させることができるということを示した。第二に、細胞類型特異的遺伝子スライシング技術と、成体マウスでの緊張性ＧＡＢＡ分泌を測定するための一般的な電子生理学的アプローチだけではなく、最近の光遺伝学的方法（optogenetic tool）とを利用し、膠細胞が、Ｂｅｓｔ１チャネルを介して分泌可能なＧＡＢＡを含み、その分泌は、多様な陰イオンチャネルの遮断剤によって抑制されるということを確認した。このようなＧＡＢＡ分泌は、Ｂｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡレンチウイルスを小脳部位に注入した後、標的遺伝子であるＢｅｓｔ１遺伝子のノックダウンによって顕著に減少した。
最終的には、Ｃｒｅ−ｌｏｘ調節ｓｈＲＮＡシステムと、ｈＧＦＡＰ−ＣｒｅＥＲＴ２形質転換（transgenic）マウスとの組み合わせによって、遺伝子沈黙（gene silencing）による緊張性ＧＡＢＡ電流の減衰（attenuation）が完全に回復するということを確認し、これは、膠細胞から分泌されたＧＡＢＡが、ambient ＧＡＢＡを担当するということを意味する。本発明者らのかような発見は、非小胞性（non-vesicular）ＧＡＢＡ分泌における膠細胞機能と、チャネル媒介放出メカニズムと関連した概念とを最初に提示し、また、ニューロン・プロセシングのglial integrationの重要性を強調するものである。
緊張性ＧＡＢＡ電流は、歯状回（dentate gyrus）顆粒細胞で初めて観察されて以来、緊張性抑制（tonic inhibition）は、小脳、海馬、視床、皮質、脳幹などを含む中枢神経系にわたって、異なって分布すると報告されている。緊張性抑制は、興奮性（excitability）の一般的緊張度（general tone）調節において、位相性抑制（phasic inhibition）より優勢であり、ニューロン出力（neuronal output）の情報処理（information processing）において重要な役割を果たす。緊張性抑制の多様な機能的役割は、癲癇（epilepsy）、睡眠、記憶及び認知と関連している（Walker and Semyanov，2008）。小脳で、主要な興奮性入力（excitatory input）をプルキンエ細胞（Purkinje cell）に提供する顆粒細胞は、シナプス外の高親和性サブユニット含有ＧＡＢＡＡ受容体によって媒介される継続的な緊張性ＧＡＢＡ抑制によって、強力に抑制される（Hamann et al．，2002；Rossi et al．，2003）。小脳の緊張性ＧＡＢＡ抑制は、運動行動を損傷させる低容量アルコール中毒（low dose alcohol intoxication）の重要な標的であると報告されている（Hanchar et al．，2005）。しかし、その機能性重要性に係わる研究は非常に微小であり、放出メカニズムに係わる理解不足によって、部分的でしかないという実情である。
小脳顆粒細胞は、タイプII糸球体（typeII glomerulus）と呼ばれる独特の形状を形成し、これは、細胞外ambient ＧＡＢＡを、グルタミン酸作動性（glutamatergic）苔状線維（mossy fiber）、ゴルジ細胞のアクソン（axon）、顆粒細胞突起及び膠細胞鞘（glial sheath）と共に蓄積させ、糸球体は、放出されたＧＡＢＡを維持させる層状膠細胞鞘（lamella glial sheath）で完壁に囲まれている。小脳の星状膠着細胞（astrocyte）の他の独特な類型であるベルグマン膠細胞（Bergmann glial cell）は、プルキンエ細胞の近傍に位置し（図１Ａ）、生後顆粒細胞移動及びプルキンエ細胞突起成熟のための足場を提供する発生上の重要な役割を行う。成人において、ベルグマン膠細胞は、顆粒細胞からの励起性シナプス末端（excitatory synaptic termination）と共に、バスケット細胞からのＧＡＢＡ作動性シナプス末端を含む膠細胞鞘で、自身の細胞体（somata）とシナプスとをしっかりと覆い包むことによって、プルキンエ細胞に対して、密接な解剖学的及び機能的なパートナーとして残っている。
成人脳で、ニューロンが独占的にＧＡＢＡを合成して含有して放出すると考えられるが、一方で、脳幹と小脳との星状膠細胞がＧＡＢＡを含むと見たりもする。成人小脳で、ＧＡＢＡが膠細胞に含まれていることを確認するために、下記の実施例で、ＧＦＡＰ陽性星状膠細胞細胞体と微細突起とがＧＦＰで標識されているＧＦＡＰ−ＧＦＰ形質転換マウスに対して、免疫組織化学的実験を行った。その結果、顆粒細胞層内の層状星状膠細胞だけではなく、あらゆるＧＦＰ陽性ベルグマン膠細胞の細胞体と突起とで、強力な免疫反応性を有するＧＡＢＡに対する抗体が発見された（図５のａ，ｂ）。特に、膠細胞ＧＡＢＡ免疫反応性の強度は、隣接するニューロンと比較して、同等以上であると分かった。かような結果は、ＧＡＢＡの膠細胞放出に係わる潜在的根源を提供する。
これまで、成体ラットの小脳顆粒細胞のＧＡＢＡＡ受容体の緊張性活性化は、ＧＡＢＡの活動電位独立的（action-potential-independent）非小胞性放出に起因すると知られている。かような発見は、ambient ＧＡＢＡのソースが、膠細胞でもあるという仮説と符合しているのである。さらに、タイプII星状膠細胞から由来する細胞株において、プリン作動性（purinergic）受容体Ｐ２Ｘ７の活性化が、［３Ｈ］−ＧＡＢＡの放出を誘導し、これは、塩化物チャネル抑制剤である４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸（ＤＩＤＳ）や４−アセトアミド−４’−イソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸（ＳＩＴＳ）のようなＨＣＯ３ −／Ｃｌ−交換体、または体積調節陰イオンチャネルの抑制剤に対して、予測不可能なほどに敏感である。従って、本発明者らは、引き続き、ＧＡＢＡ放出の分子的標的になりうる陰イオンチャネルを探索した。
陰イオンチャネルのうち、ベストロフィン１（Ｂｅｓｔ１）チャネルの重複する特有な特徴に基づいて、Ｂｅｓｔ１を候補陰イオンチャネルとして採択した。ベストロフィンのうち、ヒトベストロフィン１（ｈＢｅｓｔ１）をクローニングし、常染色体優性Ｂｅｓｔ卵黄上黄斑ジストロフィー（vitelliform macular dystrophy）での突然変異を確認し、ｈＢｅｓｔ１が体積変化だけではなく、Ｃａ２＋によっても活性化され、ニフルム酸（ＮＦＡ）、５−ニトロ−２（３−フェニルプロピルアミノ）−ベンゾ酸（ＮＰＰＢ）及び４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸（ＤＩＤＳ）によって容易に遮断されるＣｌ−チャネルを構成するということを立証した。また、ｈＢｅｓｔ１は、Ｃｌ−よりＳＣＮ−のような巨大陰イオンに対してさらに高い透過性を有し、Ｃｌ−に比べて、ＨＣＯ３ −に対して顕著な透過率を示す（ＰＨＣＯ３／ＰＣｌ＝０．４４）。
前述のように、本発明では、小脳膠細胞で、ベストロフィン１チャネルを介して、ＧＡＢＡの放出がなされるということを発見し、かような発見に基づいて、ベストロフィン１チャネルを調節し、ＧＡＢＡ放出を調節することによって、放出の過剰放出または不足によって誘発される疾病または症状を、予防、改善、緩和及び／または治療できるということを提案する。
これにより、本発明の一例は、ベストロフィン１チャネル活性調節剤を有効成分として含む小脳でのＧＡＢＡ放出調節剤、ベストロフィン１チャネル活性を調節し、小脳でのＧＡＢＡ放出を調節する方法；及びベストロフィン１チャネル活性調節剤の小脳でのＧＡＢＡ放出調節のための有効成分としての用途；を提供する。
具体的には、本発明の具体例は、ベストロフィン１チャネル遮断剤を有効成分として含む小脳でのＧＡＢＡ放出抑制剤；ベストロフィン１チャネル活性を抑制し、小脳でのＧＡＢＡ放出を抑制する方法；及びベストロフィン１チャネル遮断剤の小脳でのＧＡＢＡ放出抑制のための有効成分としての用途；を提供する。または、本発明の具体例は、ベストロフィン１チャネル活性化剤を有効成分として含む小脳でのＧＡＢＡ放出促進剤；ベストロフィン１チャネルを活性化し、小脳でのＧＡＢＡ放出を促進する方法；及びベストロフィン１チャネル活性化剤の小脳でのＧＡＢＡ放出促進のための有効成分としての用途；を提供する。
さらに他の例は、ベストロフィン１チャネル活性調節剤を有効成分として含む、ＧＡＢＡ過放出または不足によって発生する疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療用の組成物；ベストロフィン１チャネル活性調節剤を有効成分として使用するＧＡＢＡ過放出または不足によって発生する疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療の方法；及びベストロフィン１チャネル活性調節剤のＧＡＢＡ過放出または不足によって発生する疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療のための有効成分としての用途；を提供する。
具体的には、本発明の具体例は、ベストロフィン１チャネル遮断剤を有効成分として含む、ＧＡＢＡ過放出による疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療用の組成物；ベストロフィン１チャネル遮断剤を有効成分として使用するＧＡＢＡ過放出による疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療の方法；及びベストロフィン１チャネル遮断剤のＧＡＢＡ過放出による疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療のための有効成分としての用途；を提供する。または、本発明の具体例は、ベストロフィン１チャネル活性化剤を有効成分として含む、ＧＡＢＡ不足による疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療用の組成物；ベストロフィン１チャネル活性化剤を有効成分として使用するＧＡＢＡ不足による疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療の方法；及びベストロフィン１チャネル活性化剤のＧＡＢＡ不足による疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療のための有効成分としての用途；を提供する。
前記ベストロフィン１は、塩化物イオンチャネルの一種であって、本発明において、塩化物イオンチャネルがＧＡＢＡに対して透過性を有するということを示す代表的な例として使われた。前記ベストロフィン１遺伝子は、哺乳類由来、望ましくは、齧歯類（rodent）由来または霊長類由来のものであって、例えば、マウスベストロフィン１（ｍＢｅｓｔ１）遺伝子（ＮＭ＿０１１９１３、配列番号１）またはヒトベストロフィン１（ｈＢｅｓｔ１）遺伝子（ＮＭ＿００４１８３、配列番号２）であるが、これらに制限されるものではない。
前記ベストロフィン１チャネル抑制剤は、ベストロフィン１チャネルの発現を抑制したり、あるいは発現したベストロフィン１の活性を直間接的に妨害及び／または遮断する活性を有するあらゆる物質を含み、例えば、陰イオンチャネル遮断剤、ベストロフィン１チャネルコーディング・ヌクレオチド配列に係わるアンチセンスＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなどからなる群から選択された１種以上のものであるが、それらに制限されるものではない。
前記陰イオンチャネル遮断剤は、ニフルム酸、flumenamic acid、５−ニトロ−２（３−フェニルプロピルアミノ）−ベンゾ酸（ＮＰＰＢ）、４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸（ＤＩＤＳ）などからなる群から選択された１種以上のものであるが、これらに制限されるものではない。前記アンチセンスＲＮＡは、配列番号１または配列番号２のヌクレオチド配列に係わるアンチセンスＲＮＡであってもよい。また、前記ｓｈＲＮＡは、ｃＤＮＡ配列で示すとき、次の配列番号３、配列番号４及び配列番号７からなる群から選択された１種以上であるが、これらに制限されるものではない：
５’−ＧＡＴＣＣＣＣＴＴＧＣＣＡＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＡＴＴＴＴＴＡ−３’（配列番号３）
３’−ＧＧＧＡＡＣＧＧＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＡＣＴＴＡＡＧＴＴＣＴＣＴＡＡＧＴＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＣＣＧＴＴＡＡＡＡＡＴＴＣＧＡ−５’（配列番号４）
５’−ＣＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＣＣＡＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＡＧＡＣＡ−３’（配列番号７）
かようなベストロフィン１チャネル活性抑制によって、小脳膠細胞でのＧＡＢＡ放出が抑制されれば、ＧＡＢＡによる神経抑制作用、例えば、緊張性抑制作用が低下し、ＧＡＢＡ過剰放出によって引き起こされる疾病または症状の予防、改善、緩和及び／または治療の効果をもたらしうる。ＧＡＢＡ過剰放出によって引き起こされる疾病または症状には、癲癇、睡眠障害、記憶障害、知覚障害、認知障害、運動障害、学習障害、アルコール中毒、例えば、低容量アルコール中毒（low dose alcohol intoxication）や運動失調症（ataxia）などがあるが、これらに制限されるものではない。
従って、ベストロフィン１チャネル活性抑制剤を有効成分として含む、ＧＡＢＡ過剰放出によって引き起こされる疾病または症状の予防、改善、緩和及び／または治療用の組成物は、癲癇、睡眠障害、記憶障害、知覚障害、認知障害、運動障害、学習障害、アルコール中毒、運動失調症などからなる群から選択された１種以上の疾病または症状に対して、予防、改善、緩和及び／または治療の効果を有するものである。
さらに他の側面において、ベストロフィン１チャネル活性化剤を介して、小脳でのＧＡＢＡ放出を促進することによって、ＧＡＢＡによる神経抑制、例えば、緊張性抑制を増大させ、例えば、興奮性神経伝達物質の過剰放出による過大な神経興奮効果を相殺することができる。かようなベストロフィン１チャネル活性化剤は、ベストロフィン１チャネルを直接的または間接的に活性化させる作用を有するあらゆる物質を含み、例えば、ペプチドＴＦＬＬＲやブラジキニン（Bradykinin）のようなＧ−蛋白質結合受容体（ＧＰＣＲ：Ｇ−protein coupled receptor）アゴニストなどであるが、こらに制限されるものではない。かようなベストロフィン１チャネル活性化は、ＧＡＢＡ放出を促進させ、放出されたＧＡＢＡの神経抑制、例えば、緊張性抑制作用によって、神経の過剰興奮による病的症状、例えば、記憶と関連した疾病（アルツハイマー、老化性記憶減退など）、発作（epileptic seizure）、神経伝達物質誘発興奮毒性（excitotoxicity）、虚血（ischemia）、脳卒中、脳出血、癲癇、脳外傷、低酸素症（hypoxia）などの予防、改善、緩和及び／または治療の効果を示すことができる。従って、ベストロフィン１チャネル活性抑制剤を有効成分として含む、ＧＡＢＡ不足によって引き起こされる疾病または症状の予防、改善、緩和及び／または治療用の組成物は、記憶と関連した疾病（アルツハイマー、老化性記憶減退など）、発作、神経伝達物質誘発興奮毒性、虚血、脳卒中、脳出血、癲癇、脳外傷、低酸素症などからなる群から選択された１種以上の予防、改善、緩和及び／または治療の効果を有するものである。
本発明によるＧＡＢＡ放出調節剤、ＧＡＢＡ過放出または不足によって発生する疾病及び／または症状の予防、改善、緩和及び／または治療用の組成物、方法及び／または用途は、哺乳類、望ましくは、ヒトを対象に投与するためのものであってもよい。
本発明のさらに他の例は、小脳、さらに具体的には、小脳膠細胞上のベストロフィン１チャネルをターゲットとして、新規の小脳でのＧＡＢＡ放出調節剤をスクリーニングする方法に関する。
前記スクリーニング方法は、小脳サンプルを準備する段階と、候補物質を前記サンプルと接触させる段階と、前記小脳サンプルでのベストロフィン１チャネルの活性化いかんを確認する段階と、を含んでもよい。
このとき、ベストロフィン１チャネルが活性化された場合、前記候補物質をＧＡＢＡ放出促進剤として決定し、ベストロフィン１チャネルが非活性化される場合、前記候補物質をＧＡＢＡ放出抑制剤として決定することを特徴とする。
前記ベストロフィン１チャネルの活性化いかんは、本発明が属する技術分野に公知のあらゆる方法によって測定可能であり、例えば、小脳膠細胞上のベストロフィン１チャネルを除外した他のチャネル及び受容体を非活性化させた後、細胞内向電流変化を測定して決定できる。例えば、候補物質の処理後、細胞内向電流値が上昇すれば、ベストロフィン１チャネルが活性化されたということを意味し、細胞内向電流値が低下すれば、ベストロフィン１チャネルが非活性化されたということを意味するのである。前記他のチャネル及び受容体の非活性化、並びに内向電流値測定は、本発明が属する技術分野に周知の技術であり、当該技術分野の当業者であるならば、容易に実施することができるであろう。例えば、細胞内向電流値測定は、スニファパッチ方法を利用して行うことができる（Lee，C．J． et al．，Astrocytic control of synaptic NMDA receptors．J Physiol 581，1057-81(2007）；前記文献は、本明細書に参照として含まれる）。
本発明によるスクリーニング方法において、前記小脳サンプルは、哺乳類由来のもの、望ましくは、齧歯類由来または霊長類由来のものであってもよい。
本発明において、小脳でのベストロフィン１チャネルを介した緊張性ＧＡＢＡの放出メカニズムが究明されることにより、ＧＡＢＡ放出及びＧＡＢＡ関連病的症状の調節が可能であると期待される。
以下、本発明について、下記の実施例によってさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明を具体的に例示するためのものであるのみ、本発明の範囲がそれら実施例によって制限されるものではない。
〔実施例１：遺伝子クローニング及びｓｈＲＮＡウイルスベクター構築〕
（１．１：Ｂｅｓｔ１のクローニング）
全長マウスベストロフィン１（ｍＢｅｓｔ１）ｃＤＮＡをクローニングするために、生後Ｐ０−Ｐ３マウス（Ｃ５７ＢＬ／６、大脳皮質、ＳＰＦ room、Center for Neural Science、ＫＩＳＴ、Seoul、Korea）から得た培養星状膠細胞、または成体オスマウス（Ｃ５７ＢＬ／６）から得た精巣から全体ＲＮＡを精製し、Super ScriptIII逆転写酵素（Invitrogen）を利用してｃＤＮＡを合成した。ＮＣＢＩデータベースｃＤＮＡ［ＧｅｎＢａｎｋ accession numbers ＮＭ＿０１１９１３ＸＭ＿１２９２０３］に基づいたオープンリーディング・フレーム（ＯＲＦ）に符合する２１塩基プライマー対（ｍＢｅｓｔ１−Ｆ：５’−ａｇｇａｃｇａｔｇａｔｇａｔｔｔｔｇａｇ−３’（配列番号５）、ｍＢｅｓｔ１−Ｒ：５’−ｃｔｔｔｃｔｇｇｔｔｔｔｔｃｔｇｇｔｔｇ−３’（配列番号６））を使用してＰＣＲを行い、ｍＢｅｓｔ１の全長オープンリーディング・フレームを得た。得られたＰＣＲ産物をｐＧＥＭ−Ｔイージーベクター（Promega）内にクローニングして配列を分析した。
（１．２：Ｂｅｓｔ１のプラスミド構築及び発現）
哺乳類細胞でｍＢｅｓｔ１を発現させるために、ｐＧＥＭ−Ｔ easyプラスミド（６．６５ｋｂ、Promega）から得たｍＢｅｓｔ１全長試片を、ＨｉｎｄIII（ＮＥＢ）及びＮｏｔＩ（ＮＥＢ）認識部位を利用し、ｐｃＤＮＡ ３．１（Invitrogen）内にサブクローニングするか、あるいはＸｂａＩ（ＮＥＢ）及びＸｍａＩ（ＮＥＢ）認識部位を利用し、ｐＩＲＥＳ２−ｄｓＲＥＤ（Invitrogen）内にサブクローニングした。前記得られたｐＩＲＥＳ２−ｄｓＲＥＤまたはｐｃＤＮＡ ３．１ベクターを、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）内に形質感染させ、ｍＢｅｓｔ１を発現する細胞を選別した。ｐｃＤＮＡ ３．１−ｍＢｅｓｔ１プラスミドの場合、エフェクテン形質感染試薬（Effectene transfection reagent、Qiagen）を使用し、１／１０量のｐＥＧＦＰ−Ｎ１プラスミド（Invitrogen）と共に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）内に形質感染させ、ｍＢｅｓｔ１を発現する細胞を選別した。前記選別は、ｐｃＤＮＡ ３．１−ｍＢｅｓｔ１とｐＥＧＦＰ−Ｎ１との同時形質感染の場合、緑色蛍光を帯びる細胞を選別し、ｐＩＲＥＳ ｄｓＲＥＤベクタープラスミドである場合、赤色蛍光を出す細胞を選別して行った。電子生理学的記録のために、前記細胞をガラス・カバースリップ上にリプレーティングした。前記形質感染された細胞は、２４−３６時間内にパッチクランプ実験に使用した。
（１．３：Ｂｅｓｔ１ ｓｈＲＮＡ及びレンチウイルス生産）
プラスミド・ベースのｓｈＲＮＡ発現のために、次のような相補的オリゴヌクレオチドをアニーリングし、ｐＳＵＰＥＲ−ＧＦＰベクター（Oligo Engine）のＨｉｎｄIII／ＢｇIII部位に挿入した
５’−ＧＡＴＣＣＣＣＴＴＧＣＣＡＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＡＴＴＴＴＴＡ−３’（配列番号３）
３’−ＧＧＧＡＡＣＧＧＴＴＧＡＡＣＡＧＴＴＡＣＴＴＡＡＧＴＴＣＴＣＴＡＡＧＴＡＡＣＴＧＴＴＣＡＡＣＣＧＴＴＡＡＡＡＡＴＴＣＧＡ−５’（配列番号４）
（ｍＢｅｓｔ１のヌクレオチド配列のうち、５６３−５８２配列該当部位を含む、残りは、構造的（ヘアピン構造）及びクローニングのための必要性によって含まれる）。
レンチウイルス・ベースのｓｈＲＮＡ発現のために、合成二重鎖オリゴヌクレオチド５’−ＣＧＣＴＧＣＡＧＴＴＧＣＣＡＡＣＴＴＧＴＣＡＡＴＧＡＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＴＴＣＡＴＴＧＡＣＡＡＧＴＴＧＧＣＡＡＴＴＴＴＴＧＡＴＡＴＣＴＡＧＡＣＡ−３’（配列番号７）を、ｓｈＬｅｎｔｉ２．４ＣＭＶレンチウイルス・ベクター（Macrogen）のｐｓｔＩ−ＸｂａＩ制限酵素部位に挿入し、ｍＢｅｓｔ１遺伝子を含むレンチウイルス・ベクターを構築して配列分析して確認した。scrambledオリゴヌクレオチド包含−ｓｈＬｅｎｔｉ構造体（特定塩基配列を認識し、ｍＲＮＡを分解する標的ｓｈＲＮＡのcontrol概念として使われたものであり、cellular ｍＲＮＡをdegradationしない塩基配列で構成；Macrogen）を対照群として使用した。レンチウイルス生産は、Macrogen Ｉｎｃに依頼して行った（Dull，T．et al．，A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system．J Virol 72，8463-71(1998)、該文献は、本明細書に参照として含まれる）。
下記実施例では、Ｂｅｓｔ１標的ｓｈＲＮＡレンチウイルスであって、配列番号７を挿入したレンチウイルスを使用した。
〔実施例２：免疫化学的試験：ＧＡＢＡとＢｅｓｔ１との共同発現確認〕
Ｂｅｓｔ１が小脳で発現するか否かを確認するために、ＧＦＡＰ−ＧＦＰ形質転換マウスで、Ｂｅｓｔ１とＧＡＢＡとに対して生成された抗体を使用し、免疫組織化学法を行った（図５のｃ参照）。
成体ＧＦＡＰ−ＧＦＰマウス（ＳＰＦ room、Center for Neural Science、ＫＩＳＴ、Seoul、Korea）、またはレンチウイルス（下記実施例４のＢｅｓｔ１標的ｓｈＲＮＡレンチウイルス）注入されたＧＦＡＰ−ＧＦＰマウスを、４％パラホルムアルデヒドで固定させた。小脳の３０μｍ厚の視床クライオスタット薄切薄片（sagittal cryostat section）をＰＢＳで３回すすぎ、ブロッキング溶液（０．３％Triton−Ｘ、２％normal serum in ０．１Ｍ ＰＢＳ、Sigma）で、１時間インキュベーティングした。ラビット抗血清ベストロフィン抗体（１：１００、Soria et al．，2006）、ニワトリ抗ＧＦＰ抗体（１：１，０００、Abcam）及びギニアピッグ抗ＧＡＢＡ抗体（１：１，０００、Chemicon）の混合物と共に、４℃で一晩振盪培養した。ＰＢＳで３回洗浄し、引き続き、対応する二次抗体共役されたＡｌｅｘａ ４８８，５５５及び６４７で洗浄した。ＰＨＳで３回洗浄し、蛍光物質搭載培地（Dako、Ｓ３０２３）にマウンティングした。ＦＶ１０００共焦点顕微鏡（Olympus）を使用し、一連の共焦点蛍光イメージを得た。前記イメージは、Olympus FLUOVIEW software ｖｅｒ．１．７で加工した。
前記で得られたＧＦＡＰ−ＧＦＰ形質転換マウス小脳でのＧＦＰ、Ｂｅｓｔ１及びＧＡＢＡに対する抗体を利用した免疫組織化学共焦点イメージを図１Ａに示した。
図１Ａの上段左側は、ＧＦＡＰ−ベルグマン膠細胞（矢印）と、層状星状膠細胞（lamella astrocyte、空色矢印ヘッド）とを表示するＧＦＰ染色の共焦点イメージ（緑色）である。プルキンエ細胞（Purkinje cell、星印）は、ＧＦＡＰ−ＧＦＰ染色が観察されていない。上段右側は、Ｂｅｓｔ１染色（赤色）とＧＦＡＰ−ＧＦＰとを共に示す共焦点イメージである。Ｂｅｓｔ１は、プルキンエ細胞（星印）及び他のニューロン（矢印ヘッド）だけではなく、顆粒層の膠細胞（空色矢印ヘッド）及び分子層のベルグマン膠細胞（矢印）でも多く発現した。下段左側は、ＧＦＡＰ−ＧＦＰとＧＡＢＡ（紫紅色）とを共に示す共焦点イメージであり。ＧＡＢＡは、ＧＡＢＡ作動性ニューロン以外にも、層状星状膠細胞（空色矢印ヘッド）及びベルグマン膠細胞（矢印）で、ＧＦＡＰ−ＧＦＰと共に強力に共同発現する。下段右側は、ＧＦＡＰ−ＧＦＰ、ｍＢｅｓｔ１及びＧＡＢＡを共に示す共焦点イメージである。図１Ａによれば、ベルグマン膠細胞（矢印）、層状星状膠細胞（空色矢印ヘッド）及びＧＡＢＡ作動性ニューロン（星印及び白色矢印ヘッド）でのＢｅｓｔ１免疫反応性強度が観察されるが、顆粒細胞では示されていない。
また、図５のａ−ｃは、成体マウス小脳の膠細胞において、ｍＢｅｓｔ１とＧＡＢＡとが強力に発現するということを示す免疫組織化学写真である。
図５のａは、マウス小脳でのＧＡＢＡ、Ｂｅｓｔ１及びＧＦＡＰ−ＧＦＰの免疫組織化学的共焦点イメージである。ＧＡＢＡ（最初のパネル）とＢｅｓｔ１（二番目のパネル）とが、顆粒層より分子層で強力に発現するということが分かった。三番目のパネルは、ベルグマン膠細胞突起が、分子層のほとんどを占めるということを示す。最後のパネルは、ＧＡＢＡ、Ｂｅｓｔ１及びＧＦＡＰ−ＧＦＰが合わさった共焦点イメージを示している。
図５のｂは、小脳のＧＡＢＡ染色及びＧＦＡＰ−ＧＦＰ染色の高倍率イメージを示している。ＧＡＢＡは、分子層のプルキンエ細胞とＧＡＢＡ作動性インターニューロンとで濃く染色された。しかし、ベルグマン細胞（星印）もまた、細胞体と突起（小さい黒色矢印ヘッド）とで、強力なＧＡＢＡ免疫反応性を示した。顆粒層（矢印）内の顆粒細胞は、明るい強度を有するＧＡＢＡで染色され、顆粒細胞突起もまた、ＧＡＢＡ（小さい白色矢印）で染色された。
図５のｃは、Ｂｅｓｔ１染色とＧＦＡＰ染色との高倍率（Ｘ６０）イメージを示している。ｍＢｅｓｔ１は、分子層内のベルグマン膠細胞（星印）と、顆粒層内の膠細胞（矢印）とで多く発現した。大きい矢印ヘッドは、ｍＢｅｓｔ１を発現するが、ＧＦＡＰで染色されていないプルキンエ細胞を示す。小さい矢印ヘッドは、顆粒層の星状膠細胞突起を示す。星状膠細胞突起もまた、ｍＢｅｓｔ１を発現した。一番右のパネルは、ＤＡＰＩで濃く染色された顆粒細胞を示すが、ｍＢｅｓｔ１とＧＦＡＰとの免疫反応性は、観察されていない。
前記図５のａないしｃに示されているように、平行線維（parallel fiber）と上行線維（climbing fiber）とが接しており、密接に相互作用する分子層内のプルキンエ細胞細胞体と樹状突起（dendritic tree）とに沿って位置するベルグマン膠細胞突起が、Ｂｅｓｔ１とＧＡＢＡとを共同発現させる。かような結果は、Ｂｅｓｔ１が小脳膠細胞でのＧＡＢＡ放出の分子的標的として作用しうるという可能性を提案することが可能である。
〔実施例３：２−細胞スニファパッチ−Ｂｅｓｔ１チャネル媒介ＧＡＢＡ放出の確認〕
Ｂｅｓｔ１チャネルがＧＡＢＡ放出を媒介するために、チャネル開放時に、ＧＡＢＡが透過可能でなければならないので、Ｂｅｓｔ１がＧＡＢＡ放出通路であることを確認するために、Ｂｅｓｔ１のＧＡＢＡ透過性を試験することが重要である。Ｂｅｓｔ１チャネルのＧＡＢＡ透過性を試験するために、２−細胞スニファパッチ法（two-cell sniffer patch technique）を利用し、ＧＡＢＡｃを発現するセンサ（sensor）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（cell）でのＢｅｓｔ１チャネルと、ソース（source）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（cell）とで発現する異なるチャネルを介したＧＡＢＡ放出を直接的に測定した（図１Ｂ）。
ｐＩＲＥＳ−Ｂｅｓｔ１−ｄｓＲＥＤプラスミド（Invitrogenから購入したｐＩＲＥＳ−ｄｓＲＥＤ vectorにＢｅｓｔ１をクローニングしたもの）と、ＧＦＰを有するＧＡＢＡｃ（Invitrogenから購入したｐｃＤＮＡ ３．１ vectorにＧＡＢＡｃをクローニングしたもの）とを、エフェクテン形質感染試薬（Effectene transfection reagent、Qiagen）を使用し、それぞれＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）内に形質感染させた。形質感染１８ないし２４時間後、電子生理学的記録のために、細胞を共にガラス・カバースリップ上にリプレーティングし、前記細胞を２４ないし３６時間以内にパッチクランプ実験に使用した。記録のために、一つはｄｓＲＥＤを含み、他の一つはＧＦＰを含む、隣接した２つの細胞を選択してパッチした。このとき、前記隣接した２つの細胞の選択は、一つは、ＧＡＢＡｃを有している緑色蛍光を帯びる細胞、他の一つは、ｐＩＲＥＳ−Ｂｅｓｔ１−ｄｓＲＥＤが形質感染された赤色蛍光を出す細胞を選別して行った。
パッチピペット用内部溶液としては、次の通り、ＧＡＢＡ放出のソースとしての３ｍＭまたは１４０ｍＭＧＡＢＡと、Ｂｅｓｔ１チャネルを活性化させるための生理学的範囲のマイクロモル濃度の遊離Ｃａ２＋（〜４．５μＭ）とを含むものを使用した。図１Ｂは、２−細胞スニファパッチの概略図であり、標識された構造体Ｂｅｓｔ１（ｄｓＲｅｄ共同発現）またはＧＡＢＡｃ（ＧＦＰ共同発現）を発現するＨＥＫ細胞を示している。３ｍＭまたは１４５ｍＭのＧＡＢＡ及び０または４．５μＭのＣａ２＋をソース内に、細胞内ピペッティングする様子を示している。ソース細胞とセンサ細胞との明るい部分と蛍光イメージは、下部分に示されている。
ＧＡＢＡ放出のソース用として、３ｍＭ ＧＡＢＡ（Tocris）、１４６ｍＭ ＣｓＣｌ、５ｍＭ（Ｃａ２＋）−ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）−ＮＭＤＧ（Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン）、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭスクロース、４ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ２−ＧＴＰ（ｐＨ：７．３）を含むピペット溶液を使用した。センサ用として、１１０ｍＭ Ｄ−グルコネート、１１０ｍＭ ＣｓＯＨ、３０ｍＭ ＣｓＣｌ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、４ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＧＴＡ（エチレングリコールビス（２−アミノエチル−エーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）、４ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ２−ＧＴＰ（ｐＨ：７．３）を含むピペット溶液を使用した。３ｍＭ ＧＡＢＡ Zero Ｃａ２＋実験のために、５ｍＭ（Ｃａ２＋）−ＥＧＴＡ−ＮＭＤＧを、５ｍＭ ＥＧＴＡ−ＮＭＤＧの代わりに使用した。１４０ｍＭ ＧＡＢＡ実験のために、３ｍＭ ＧＡＢＡ及び１４６ｍＭ ＣｓＣｌを、１４０ｍＭ ＧＡＢＡに替えた。ｐＨは、ＣｓＣｌで調整して、浸透圧は、２９０ｍＯｓｍｏｌに調節した。
内部溶液として、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＣａＣｌ２，２ｍＭ ＭｇＣｌ２及び５．５ｍＭグルコースを含む溶液を使用した。ソースチャネルがＧＡＢＡを通過させることができるならば、隣接する細胞上のＧＡＢＡｃ受容体は、放出されたＧＡＢＡと結合し、Ｃｌ−内部電流が誘導される。１００μＭ ＧＡＢＡのバス（bath）適用によって、ＧＡＢＡ電流の全体的な活性化が得られ、比較のために、これを標準化した。
ソース細胞での全細胞形象（configuration）を調べるためのメンブレン・パッチの貫流（break-though）によって、ＧＡＢＡ放出が誘導され、かようなＧＡＢＡ放出は、隣接したセンサ細胞によってモニタして探知した。ＧＡＢＡ電流は、１００μＭ ＧＡＢＡのバス適用によって完全に活性化され、完全な活性化程度（percentage）を計算し、図１Ｃ及び図１Ｄに示した。
図１Ｃは、ＧＡＢＡの透過程度の試験結果を示している。透過されたＧＡＢＡは、センサでの内向電流として測定した（下側トレース）。全細胞モードに進入するメンブレン貫流時点を、ソーストレース（上側トレース）上に、黒色矢印ヘッドで表示した。ＮＰＰＢは、１００μＭ濃度でもって使用した。Ｂｅｓｔ１＊（Ｂ１＊）は、Ｂｅｓｔ１−Ｗ９３Ｃの気孔変異体（pore mutant）（Qu et al．，2006）を示す。前記変異体のＧＡＢＡ透過程度は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）に、前記変異体を形質転換させて得られた細胞を使用して実験した。ＡＮＯ１は、最近知られたＴＭＥＭ１６Ａ Ｃａ２＋活性化塩化物チャネルである（Yang et al．，2008，Caputo et al．，2008：慶尚大、パク・チェヨン教授実験室）。前記ＡＮ０１のＧＡＢＡ透過程度は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、前記チャネルで形質転換させて得られた細胞を使用して実験した。
図１Ｄは、多様な条件でのＧＡＢＡ放出程度を要約して示している。センサ細胞内の内向電流でもって測定されたＧＡＢＡ放出を、１００μＭ ＧＡＢＡを利用した完全な活性化（full activation）として標準化し、完全な活性化に係わる％でもって示した。ＮＰＰＢとＮＦＡは、１００μＭ濃度で使用した。ＳＫ１は、伝導度の低いＣａ２＋活性化Ｋ＋チャネル（small conductance Ｃａ２＋ activated Ｋ＋ channel、Ｄｒ．Adelman Ｌａｂ）である。前記ＳＫ１のＧＡＢＡ透過程度は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）を、前記チャネルで形質転換させて得られた細胞を使用して実験した。平均値をmean＋ＳＥＭ（standard error of the mean）で表示した。全体的にstudent’s t-testを使用した（unpaired、２−tailed）。
図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄに示されているように、Ｂｅｓｔ１チャネルのみが、ＧＡＢＡに対して顕著な透過性を示した一方、最近特性が明らかになったＡｎｏ１（またはＴＭＥＭ−１６Ａ、Yang et al．，2008，Caputo et al．，2008）、またはＣａ２＋活性化カリウムチャネルであるＳＫ１は、ＧＡＢＡに対して透過性を示していない。かようなＢｅｓｔ１を介したＧＡＢＡの放出は、ＮＦＡやＮＰＰＢのような陰イオンチャネル遮断剤によって完壁に抑制され、細胞内のＣａ２＋濃度及びＧＡＢＡ濃度に依存的であった。また、図１Ｄに示されているように、公知のＢｅｓｔ１の気孔変異体であるＢｅｓｔ１−Ｗ９３Ｃ（Qu et al．，2006）は、ＧＡＢＡ透過性を全く示さず、これは、Ｂｅｓｔ１チャネルの気孔を介して、ＧＡＢＡが通過するということを支持するものである。
また、図７は、ＮＦＡ及びＮＰＰＢｋによるＧＡＢＡ放出抑制は、前記化合物がＧＡＢＡｃ受容体に直接的に作用することによって得られるものではないことを示している。図７Ａ及び図７Ｂは、ＧＡＢＡｃを発現するＨＥＫ２９３細胞を、１００μＭ ＮＦＡと１００μＭ ＮＰＰＢとの不在下（図７Ａ）または存在下（図７Ｂ）で、パッチクランピングし、１００μＭ ＧＡＢＡで感染（challenge）させた結果を示すものである。図７Ａと図７Ｂとから分かるように、ＧＡＢＡｃを発現するＨＥＫ２９３細胞では、ＧＡＢＡ放出が、ＮＦＡまたはＮＰＰＢの処理いかんと大きく関係していないと分かった。
かような結果は、Ｂｅｓｔ１チャネルが、本来の（native）細胞で直接透過を介したＧＡＢＡ放出を媒介するという可能性を提案するものである。
〔実施例４：形質転換マウス試験−Ｂｅｓｔ１チャネル媒介ＧＡＢＡ放出の確認〕
（４．１：形質転換マウス作り）
本来の（naive）ベルグマン膠細胞がＧＡＢＡを透過させることができる機能的Ｂｅｓｔ１チャネルを発現し、Ｂｅｓｔ１チャネルを分子レベルで操作できるか否かを試験するために、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰ組み合わせの調節下にあり、Ｃｒｅ−発現形質転換マウスとの組み合わせ時に、細胞類型特異的遺伝子沈黙を誘導するｍCherry−tagged ｓｈＲＮＡｉ（small hairpin-forming interference ＲＮＡ）を運搬するレンチウイルスを構築した（図２Ａ、Ventura et al．，2004）。図２Ａは、Ｃｒｅ−ｌｏｘ調節（regulated）ｐＳｉｃｏＲ−ｓｈＲＮＡレンチウイルス構造体（lentivirus construct）（ADDGeneから購入したｐＳｉｃｏＲ vectorにＢｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡをクローニングしたもの）の形態を示すものである。前記ｍCherry−tagged ｓｈＲＮＡｉを運搬するレンチウイルスは、Ｃｒｅ−ｌｏｘ調節ｐＳｉｃｏＲ−ｓｈＲＮＡレンチウイルス構造体にｍCherryを付けたものである。２つのｌｏｘＰ部位が、Ｕ６プロモータ下のｓｈＲＮＡと、ＣＭＶプロモータ下のｍCherryとを含む部位内に位置する。Ｃｒｅリコンビナーゼの発現時、この酵素は、前記カセットを除去してｓｈＲＮＡを非活性化させる。
Ｂｅｓｔ１標的ｓｈＲＮＡレンチウイルス（実施例１．３で作る）を、６−７週齢のＧＦＡＰ−ＧＦＰマウス（ＳＰＦ room、Center for Neural Science、ＫＩＳＴ、Seoul、Korea）の小脳皮質内に正位（streotactically）注入した（図２Ｂ）。図２Ｂは、Ｂ６野生型（ＳＰＦroom、Center for Neural Science、ＫＩＳＴ、Seoul、Korea）、またはＧＦＡＰ−ＧＦＰマウスを使用する実験日程（time line）を示すものである。６−７週齢マウスの小脳に、前記作られたレンチウイルスを注入した。小脳へのレンチウイルス注入７日後、免疫組織化学法記録または全細胞パッチクランプ記録を行った。
（４．２：形質転換マウスを利用した免疫組織化学的分析）
前記レンチウイルス感染された細胞は、顆粒細胞層だけではなく、分子層内に広範囲に分布した（図２Ｃ右側及び図８Ａ）。図２Ｃは、ＧＦＡＰ−ＧＦＰ染色（緑色）、Ｂｅｓｔ１（紫紅色）及びｍCherry（赤色）を含むＢ１−ｓｈＲＮＡレンチウイルスの形態である。Ｂｅｓｔ１免疫反応性は、ウイルスが注入された部位で、ウイルスが注入されていない部位と比較し、顕著に低下していることが分かる。一方、２つの部位でのＧＦＡＰ−ＧＦＰ強度は、相対的に大きい違いがなかった。右側のイメージで、ノックダウン効果を、ＧＦＡＰ−ＧＦＰでスレッショルディングさせた後、ＧＦＡＰ−ＧＦＰ強度によって標準化されたＢｅｓｔ１強度でもって示した。ｍＢｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡ発現部位は、感染された部位（infected region）でのＢｅｓｔ１の免疫反応性は、非感染部位（uninfected region）と比較して顕著に低下した（図２Ｃの右側グラフ）。かような結果は、Ｂｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡの高効率と、Ｂｅｓｔ１抗体の高い特異性とを確認させるのである。
（４．３：形質転換マウスを利用した全細胞パッチクランプ記録）
［４．３．１：小脳薄片作り］
脳薄片を、Rossi et al．，2003に記載されているように作った。すなわち、薄片記録のために、約Ｐ２８日のマウスまたは８週齢以上のマウスを使用した。動物をハロタン（halothane）で深く麻酔させた。頭を切った後、頭蓋骨から脳を素早く切除し、切断溶液（ice-cold cutting solution）に浸漬させた。前記溶液は、２５０ｍＭスクロース、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ Ｄ（＋）−グルコース、４ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭ myo−イノシトール、２．５ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭピルビン酸ナトリウム、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍＭアルコルビン酸、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２及び１ｍＭキヌレン酸（ｐＨ７．４）を含む。あらゆる溶液を、９５％Ｏ２−５％ＣＯ２でガス処理した。小脳虫部（vermis）両側をトリミングした後、小脳葉（cerebellar lobe）を含む２５０μｍ厚のいくつかの視床周囲薄片を、マイクロトーム（Leica ＶＴ １０００）で切断し、細胞外ＡＣＳＦ溶液に移した。前記溶液は、１２６ｍＭ ＮａＣｌ、２４ｍＭ ＮａＨＣＯ３、１ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２．５ｍＭ ＫＣｌ、２．５ｍＭ ＣａＣｌ２，２ｍＭ ＭｇＣｌ２及び１０ｍＭ Ｄ（＋）−グルコース（ｐＨ７．４）を含む。薄片を、少なくとも常温で１時間インキュベーティングした。
［４．３．２：全細胞パッチ記録］
記録のために、薄片をflower controller（Synaptosoft）と真空ポンプ（Charles Austen、model Ｃａｐｅｘ ８Ｃ）とによって調節され、ＡＳＣＦ（artificial cerebrospinal fluid、Sigma）溶液で継続して過冷却する（superfusing、流率：２ｍｌ／ｍｉｎ）電子生理学的記録チャンバ（ＲＣ−２６Ｇ、Warner Instruments）に移した。スライスチャンバを正立顕微鏡（upright microscope、Olympus、Japan）の載物台（stage）上に載せ、微分干渉対比（differential interference contrast）及び赤外線オプティックでＸ６０水浸体（water immersion objective）で観察した。細胞形態を、Imaging Workbench ６．０（INDEC Systems、Ｉｎｃ）、camera controller（Hamamatsu、Ｃ４７４２−９５）及びlight microscope controller（Olympus、ＴＨ４−２００）を介して視覚的に確認した。水銀ランプ（Olympus、Ｕ−ＲＦＬ−Ｔ）を利用し、蛍光イメージを観察した。ほぼ２−５小脳小葉に位置するベルグマン膠細胞または顆粒細胞細胞体から全細胞電圧−クランプ記録を得た。
ベルグマン膠細胞記録のために、厚壁ボロシリケートガラス毛細管（thick-walled borosilicate glass capillaries、ＳＣ１５０Ｆ−１０、Warner instrument Ｃｏｒｐ）からパッチピペット（８−１０ＭΩ）を作った。ＧＡＢＡを使用しない対照実験のために、ピペットを、次の組成を含む内部溶液で充填させた：１４６ｍＭ ＣｓＣｌ、５ｍＭ（Ｃａ２＋）−ＥＧＴＡ−ＮＭＤＧ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、８ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭスクロース、４ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ２−ＧＴＰ（ｐＨ：７．３）。
１４０ｍＭ ＧＡＢＡを使用する実験のために、次の調整を有する内部溶液を使用した：１４０ｍＭ ＧＡＢＡ、５ｍＭ（Ｃａ２＋）−ＥＧＴＡ−ＮＭＤＧ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１０ｍＭスクロース、４ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰ及び０．３ｍＭ Ｎａ２−ＧＴＰ（ｐＨ：７．３、ＣｓＯＨで調整）。浸透圧は、２９７及び２９０ｍＯｓｍｏｌに調整した。ＧＦＰ蛍光イメージを介して、ベルグマン膠細胞を確認した。ベルグマン膠細胞の電圧クランピングのための維持電位（holding potential）を−７０ｍＶとした。
顆粒細胞のためのピペット抵抗を、典型的に１０−１２ＭΩとし、ピペットを次の組成を有する内部溶液で充填させた：１３５ｍＭ ＣｓＣｌ、４ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５ｍＭ ＥＧＴＡ、２ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰ、０．５ｍＭ Ｎａ２−ＧＴＰ及び１０ｍＭ ＱＸ−３１４、ＣｓＯＨでｐＨ７．２に調整（２７８−２８５ｍＯｓｍｏｌ）（Rossi et al．，2003）。かような内部溶液、電圧クランプＥｃｌ＝０ｍＶ及び維持電位−６０ｍＶで内向電流（inward current）が誘導された。
ベルグマン膠細胞記録のための電極接点電位（electrode junction potential）を補正したが、顆粒細胞記録では、接点電位を補正していない。接点電位は、ＧＡＢＡ無処理実験及び１４０ｍＭ ＧＡＢＡ処理実験で、それぞれ＋３．５ｍＶ及び−９．７ｍＶとした。
パフィング（puffing）実験のために、１００ｍＭ ＧＡＢＡで充填されたガラス電極（５−６ＭΩ）をパッチされた顆粒細胞に隣接するように置き、MiniDigi（Molecular Device）と連結されたPicospritzerIII（Parker instrumentation）によって、５００ｍｓの間簡単にパフィングさせた。
プルキンエ細胞記録のために、パッチピペット（２−３ＭΩ）を、次の組成を有する内部溶液で充填させた：１４０ｍＭ Ｋ−グルコネート、１０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、０．０２ｍＭ ＥＧＴＡ、４ｍＭ Ｍｇ−ＡＴＰ及び０．４ｍＭ Ｎａ２−ＧＴＰ、ＫＯＨでｐＨ７．３５に調整（Ｏｓｍｏｌ：２７８−２８５）。前記細胞から記録されたデータのうち、３０ＭΩ以上のアクセス抵抗（access resistance）で記録されたデータは廃棄した。
前記得られた信号を計数化し、ｐＣＬＡＭＰ １０．２ software（Molecular Devices）を使用し、Digidata １４４０Ａ（Molecular Devices）及びMulticlamp ７００Ｂ amplifier（Molecular Devices）で、５０μｓ間隔でサンプリングした。Clampfit １０．２（Molecular Devices）、Minianalysis（Synaptosoft、ＵＳＡ）、SigmaPlot １０．０（ＳＰＳＳ）及びExcel ２００３（Microsoft）を利用し、オフライン分析を行った。
［４．３．３：薬物適用］
本実施例で使われたあらゆる薬物と化学物質は、次のような取り立てての言及がない限り、Sigma-Aldrich社から購入したものである：リドカインＮ−エチルブロマイド（ＱＸ−３１４、Sigma）、ＳＲ９５５３１ヒドロブロマイド（ＧＡＢＡzine、Tocris）、コンカナマイシンＡ（concanamycinＡ）（Tocris）、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ（１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸テトラキス（アセトキシメチルエステル））（Tocris）、Fluronic（登録商標）Ｆ−１２７（invitrogen）、ニフルム酸（Sigma）、ＮＰＰＢ（５−ニトロ−２−（３−フェノールプロピルアミノ）安息香酸）（Tocris）、ＤＩＤＳ（４，４’−ジイソチオシアナトスチルベン−２，２’−ジスルホン酸二ナトリウム塩水和物、Sigma）。
［４．４．４：データ分析及び統計分析］
数値データは、means±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で示した。比較用データの有意性は、Student’s two-tailed unpaired t testによって求め、有意レベルは、＊（ｐ＜０．０５）、＊＊（ｐ＜０．０１）及び＊＊＊（ｐ＜０．００１）で示した。データは、２ｋＨｚでフィルタリングした。
Goldman-Hodgkin-Katz方程式を次の通り計算し、ＰＸ／ＰＣｌ−を計算した。
Ｅｒｅｖ＝ＲＴ／Ｆ・ｌｎ｛ＰＣｌ−［Ｃｌ−］ｉ＋Ｐｘ［Ｘ］ｉ｝／｛ＰＣｌ−［Ｃｌ−］ｏ＋Ｐｘ［Ｘ］ｏ｝
［４．４．５：結果］
天然（naive）マウスと、レンチウイルス注入された成体マウスとの小脳内のベルグマン膠細胞から、全細胞パッチクランプ記録を行い、Ｂｅｓｔ１の機能的発現を探索した。内部溶液で、前述のように陰イオンで、主にＣｌ−またはＧＡＢＡを含み、ここに加えて、て内在Ｂｅｓｔ１チャネル活性化のための４．５μＭ遊離Ｃａ２＋を含むものを使用した。５０μＭ ＮＰＰＢ適用の間のランプ電流トレース（ramp current trace、２秒後に１００ｍＶないし−１００ｍＶ）を、ＮＰＰＢ適用前の基礎条件のランプ電流トレースから控除し、陰イオン電流を分離した（図２Ｄ）。ランプトレースの時間を電圧に変換し、各細胞に係わるＮＰＰＢ敏感性陰イオン電流の電流−電圧関係を得た（図２Ｄ、図２Ｅ及び図２Ｆ）。図２Ｄは、ランププロトコル（ramp protocol、Ｖｈ＝−７０ｍＶ）を使用した膠細胞パッチ記録結果を示している。陰イオン電流は、naive ＧＦＡＰ−ＧＦＰマウスで、陰イオンチャネル遮断剤ＮＰＰＢ（５０μＭ）によって減少した。ＧＡＢＡ及びＣｌ−の内部溶液組成物は、前述の通りである。電流−電圧トレースがそれぞれのランプトレースから発生した。控除された電流（subtracted current）は、ＮＰＰＢ敏感性電流を示す。一方、図２Ｅと図２Ｆは、それぞれscrambled ｓｈＲＮＡ注入されたＧＦＡＰ−ＧＦＰマウス（図２Ｅ）と、Ｂｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡ注入されたＧＦＡＰ−ＧＦＰマウス（図２Ｆ）とでの電流−電圧トレースを示している。
図２Ｇは、それぞれの条件に係わるＮＰＰＢ敏感性電流の電流−電圧トレースの平均を求めてフローティングしたものを示している。逆転電位（reversal potential）と、Goldman-Hodgkin-Huxley方程式とを利用し、ＧＡＢＡ透過性を計算した。天然（naive）ベルグマン膠細胞でのＣｌ−内部溶液下でのＮＰＰＢ敏感性陰イオン電流は、−６．９ｍＶの逆転電位を示した（図２Ｇ、黒色トレース、−３．５ｍＶ接触電位（junction potential）に対して補正）。これは、ビカーボネートの寄与を仮定し（ＰＨＣＯ３／ＰＣｌ＝０．４４、Qu and Hartzell，2008）、Goldman-Hodgkin-Huxley方程式を使用し、＋１ｍＶの逆転電位から計算した値と大きく異なっていない。類似した方法で、ＧＡＢＡ内部溶液下でのＮＰＰＢ敏感性陰イオン電流のＧＡＢＡ透過率を測定し、ＰＧＡＢＡ／ＰＣｌ＝０．１９を得た（図２Ｇ、緑色トレース）。天然（naive）細胞から得たＧＡＢＡ透過率は、scrambled−ｓｈＲＮＡ発現ベルグマン膠細胞のＧＡＢＡ透過率と有意味な違いがなかった（図２Ｇ、青色トレース）。ＮＰＰＢ敏感性電流をＢｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡ発現ベルグマン膠細胞虜から分離するとき、電流−電圧トレース傾度で表示される伝導度は、逆転電位変化なしに非常に減少した（図２Ｇ、赤色トレース）。
Ｃｌ−の流入を示す１００ｍＶで測定された外向電流は、Ｃｌ−内部溶液とＧＡＢＡ内部溶液との間の有意味な違いを示さず（２１２．２３±４９．５２ｐＡ（ｎ＝９）、１１２．５２±２０．９３ｐＡ（ｎ＝８）、ｐ＝０．１）、これは、Ｃｌ−の流入が、内部的にＣｌ−をＧＡＢＡで置換することに大きく影響を受けないということを示している。ＧＡＢＡの流出を示す−８０ｍＶで測定された内向電流と、ＧＡＢＡ内部溶液下で、Ｃｌ−の流入を示す１００ｍＶで測定された外向電流は、いずれもscrambled ｓｈＲＮＡ細胞及びＢｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡ細胞間で相当な差を示した（内向電流：−４４．６２±５．０１ｐＡ（ｎ＝１０）、−１２．９９±５．９２ｐＡ（ｎ＝９）、ｐ＜０．００１、図２Ｈ；外向電流：１１０．２６±２３．２５ｐＡ（ｎ＝１０）、３８．３１±１２．０２ｐＡ（ｎ＝９）、ｐ＝０．０２）。図２Ｈは、Ｃｌ−とＧＡＢＡとの流出を比較するために、前記図２Ｇで得た−８０ｍＶでの電流大きさを示している。Ｂ１−ｓｈＲＮＡ注入によるベストロフィンチャネルのノックダウンによって、ＧＡＢＡ電流が顕著に減少したということが分かる。
かような結果は、ベルグマン膠細胞で観察されるＮＰＰＢ敏感性陰イオン電流が、ほとんど休止膜電位（resting membrane potential）で、ＧＡＢＡに係わる相当な透過性を示すＢｅｓｔ１チャネルによって媒介されるということを示すのである。
〔実施例５：Ｂｅｓｔ１沈黙によるＧＡＢＡ放出抑制の確認〕
（５．１：ウイルス注入）
Ｂ６野生型マウス、ＧＦＡＰ−ＧＦＰ形質転換マウス及びｈＧＦＡＰ−ＣｒｅＥＲＴ２形質転換マウス（ＳＰＦ room、Center for Neural Science、ＫＩＳＴ、Seoul、Korea）に、２％アベルチン（avertin、２０μｌ／ｇ、Sigma）を腹膜内注射して麻酔させ、立体正位固定台（stereotaxic frame、David Kopf instrument）に置いた。ｐＳｉｃｏＲ−ｂ１ｓｈＲＮＡ−ｍCherryウイルス−（Macrogen）またはscrambledウイルス（Macrogen）を、注射器ポンプ（Harvard apparatus）と２５μｌ注射器（Hamilton company）とを使用し、０．２μｌ／ｍｉｎ（総２μｌ）の速度で小脳皮質にステレオ注入した。注射部位のコーディネーション（coordination）は、ラムダ（lambda）から１．７ｍｍであり、深さは、頭蓋骨から１．５−１．７ｍｍとした。
（５．２：クロメレオンイメージ（Clomeleon imaging））
Ｂｅｓｔ１チャネルが、小脳での緊張性ＧＡＢＡ放出を担当するということを試験するために、小脳の顆粒細胞での独占的発現を有するClomeleon形質転換マウスのＴｈｙ１：：ＣＬＭ１ライン（Department of Neurobiology，Duke University Medical Center，Durham，North Carolina，ＵＳＡ）を使用し、顆粒細胞でのＧＡＢＡＡ受容体媒介［Ｃｌ−］ｉ挙動を光遺伝学的（optogenetic）アプローチを介して測定した（図３Ａ及びBerglund and Augustine 2008）。
図３Ａは、Clomeleonイメージ半透明（translucent）プルキンエ細胞層（黒色矢印）によって分離された、明るい蛍光色の顆粒細胞層の顆粒細胞体と、分子層内に位置する平行線維とを示すＣＬＭ１ Clomeleonマウスの小脳切片のＣＦＰ−ＹＦＰ ＦＲＥＴ imaging技法を介して、細胞内Ｃｌ−濃度の変化を測定した結果を示すものである。緑色と赤色との四角形は、分子層（緑色）と顆粒細胞層（赤色）との目的部位を示す。
Clomeleonは、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ：fluorescence resonance energy transfer）に基づく遺伝的にコーディングされたＣｌ−に係わる蛍光指示剤であり、可変ペプチドリンカ（flexible peptide linker）を介して、塩化物無感応性シアン蛍光蛋白質と融合された塩化物敏感性黄色蛍光蛋白質を含む（Kuner and Augustine，2000）。Clomeleonマウスは、追加された空間情報と共に、小脳顆粒細胞での緊張性ＧＡＢＡ放出を測定するのに有用である（Berglund et al．，submitted）。
前記Clomeleon形質転換マウスに、ｐＳｉｃｏＲ−ｂ１ｓｈＲＮＡ−ｍCherryウイルス（Macrogrn）を注入した後、７−１０日後に、前記ウイルス注入されたClomeleon形質転換マウスから、一般的な方法で小脳薄片を作った。略述すれば、イソフルランで麻酔させた後、頭を切ったマウスから脳を切除し、冷たいＡＣＳＦ（artificial cerebrospinal fluid、１２５ｍＭ ＮａＣｌ、２．５ｍＭ ＫＣｌ、１．２５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、２６ｍＭ ＮａＨＣＯ３、２０ｍＭｄ（＋）−グルコース、２ｍＭ ＣａＣｌ２及び１．３ｍＭ ＭｇＣｌ２を含む、９５％Ｏ２／５％ＣＯ２、ｖ／ｖでバブルリングした後、ｐＨ７．４に調整）に入れた。ビブラトム（vibratome、ＬＥＩＣＡ）を使用し、２００μｍ厚の矢状切片（sagittal section）を得た。前記薄片を、使用前まで３６℃で３０分間インキュベーティングした。
イメージングのために、顆粒細胞層と分子層とをカバーする２つのＲＯＩ（regions of interest）を描画した。励起フィルタ（４４０±１０ｎｍ）及び放出フィルタ（ＣＦＰ用：４８５±１５ｎｍ、ＹＦＰ用：５３０±１５ｎｍ）（Cameleons ２フィルタセット７１００７、Chroma Technologies、Rockingham、ＶＴ）を使用した。０．５Ｈｚでの２００ないし５００ｍｓ間の連続的な２回の長い光パルスによって蛍光励起を発生させ、蛍光放出は、オンチップ・マルチプリケーション・ゲインコントロール（on-chip multiplication gain control）（Cascade ５１２Ｂ、Photometrics）を装着した背面照射（back-illuminated）冷却ＣＣＤカメラで、各波長で交互に収集した。イメージ獲得は、RatioTool software（ISee Imaging Systems、Raleigh、ＮＣ）及びPowerMac Ｇ４（Apple Computer）で調節した。
予想されるように、シナプス外ＧＡＢＡＡ受容体の遮断が、Ｃｌ−の内向挙動を低減させるにつれ、１０μＭ ＧＡＢＡzine（ＳＲ９５５３１）のバス適用によって、分子層内の平行線維（図３Ｂ、緑色トレース）と、顆粒細胞体（図３Ｂ、赤色トレース）内の［Ｃｌ−］ｉとが顕著に減少した。興味深いことに、［Ｃｌ−］ｉの減少は、顆粒細胞と分子層の平行線維とで、同等なほどに顕著に示された。１０μＭ ＮＰＰＢを適用する場合、やはり２層いずれでも［Ｃｌ−］ｉを減少させた（図３Ｂ）。これは、緊張性ＧＡＢＡの減少を意味する。図３Ｂは、Clomeleonの比率イメージ（ratiometric imaging）であり、経時的な［Ｃｌ−］ｉ変化を示している。１０μＭ ＳＲ（ＳＲ９５５３１またはＧＡＢＡzine）、陰イオンチャネル遮断剤及びＮＰＰＢ（１０μＭ）は、［Ｃｌ−］ｉを減少させるということが分かった。
ＮＰＰＢによる［Ｃｌ−］ｉ変化程度は、ＧＡＢＡzine（ＳＲ）による［Ｃｌ−］ｉの変化と密接な関連がある（図３Ｃ、ｒ＝０．９６）。図３Ｃは、ＮＰＰＢによる［Ｃｌ−］ｉ変化と、ＳＲによる［Ｃｌ−］ｉ変化との相関関係を示すグラフであり、ＮＰＰＢによる［Ｃｌ−］ｉ変化は、ＳＲによる［Ｃｌ−］ｉ変化と密接な相関関係があるということを示す。
かようなＧＡＢＡＡ受容体活性化誘導［Ｃｌ−］ｉ変化が、Ｂｅｓｔ１チャネル依存的であるか否かを試験するために、Ｂｅｓｔ１遺伝子沈黙を有するClomeleonマウスの顆粒細胞の［Ｃｌ−］ｉ濃度を測定した。ＧＡＢＡzineによる［Ｃｌ−］ｉ濃度変化は、scrambled ｓｈＲＮＡ注入された小脳切片（４．２９±０．９１ｍＭ、３．８４±０．８２ｍＭ、（ｎ＝８）、図３Ｄ）と比較し、Ｂｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡ注入された小脳切片（molecular layer：１０．６３±１．４５ｍＭ、granule cell layer：１１．４４±１．５ｍＭ、（ｎ＝８）、図３Ｅ）で顕著に低下するということが分かった。前記図３Ｄ及び図３Ｅに示されたscrambled ｓｈＲＮＡ注入された小脳切片、及びＢｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡ注入された小脳切片でのＳＲによる［Ｃｌ−］ｉ変化を整理し、図３Ｆに示した（ｐ＜０．００５）。かような結果は、Ｂｅｓｔ１チャネルの遺伝子沈黙が、顆粒細胞の平行線維だけではなく、細胞体でも、緊張性ＧＡＢＡ放出を減少させるということを示す。
（５．３：全細胞パッチクランプ記録）
Clomeleonマウスから得た結果を、Ｂｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡレンチウイルスが注入された成体マウスの顆粒細胞での全細胞パッチクランプ記録によって確認した。ＧＡＢＡzine−敏感性電流は、天然（naive）マウス（３５．６８±４．０５ｐＡ（ｎ＝８）、ｐ＜＜０．００１、図３Ｇ上側パネル）、またはscrambledマウス（２６．６２±２．８５ｐＡ（ｎ＝１３）、ｐ＜＜０．００１、図３Ｇ真ん中のパネル）の場合と比較し、Ｂｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡレンチウイルス注入されたマウスで、顕著に減少した（図３Ｇ下側パネル、８．２８±０．５７ｐＡ、ｎ＝１４）。図３Ｇの上側トレースは、８週齢Ｂ６マウスの小脳薄片（維持電位（holding potential）：−６０ｍＶ）の顆粒細胞から得た緊張性ＧＡＢＡ電流の加工前トレースを示している。緊張性ＧＡＢＡ電流は、５０μＭ ＮＰＰＢのバス適用によって減少した。青色矢印は、ＧＡＢＡzine（ＳＲ）敏感性緊張性ＧＡＢＡ電流を示し、朱黄色矢印は、ＮＰＰＢ敏感性緊張性ＧＡＢＡ電流を示す。真ん中のトレースは、scrambled ｓｈＲＮＡレンチウイルス注入されたマウスに係わるものであり、下側トレースは、Ｂ１−ｓｈＲＮＡレンチウイルス注入されたマウスに係わるものである。
一方、ＧＡＢＡzine−敏感性電流（sensitive current）は、天然マウスとscrambledマウスとで、大きい差を示していない（ｐ＞０．０９、図３Ｈ）。図３Ｈは、naiveマウス、scrambled ｓｈＲＮＡ注入されたマウス、及びＢ１−ｓｈＲＮＡ注入されたマウスから得たＧＡＢＡzine−敏感性電流を要約したものである。Ｂｅｓｔ１チャネルの遺伝子沈黙は、Ｂｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡ注入されたマウスでの緊張性ＧＡＢＡ電流のＮＰＰＢ敏感性成分を事実上除去し（−１．２３±３．０８ｐＡ、ｎ＝４）、これは、天然マウス（１８．９５±２．４７ｐＡ（ｎ＝８）、ｐ＜０．００２）またはscrambledマウス（１２．９８±２．５７ｐＡ（ｎ＝４）、ｐ＜０．０２、ｎ＝４）と比較するとき、顕著な差を示すものである（図３Ｉ参照）。図３Ｉは、ＮＰＰＢ敏感性電流に係わる要約を示している。
ＮＰＰＢは、ＧＡＢＡ−誘導全細胞電流に直接的な影響を及ぼさないために（図７Ｃ及び図７Ｄ）、ＮＰＰＢによる緊張性ＧＡＢＡ電流の遮断は、顆粒細胞で発現するＧＡＢＡＡ受容体上の該化合物の直接的作用に起因するものではないと考えられる。図７Ｃと図７Ｄは、野生型Ｂ６マウスへのＮＰＰＢ適用が、小脳顆粒細胞内のＧＡＢＡ受容体に影響を及ぼさないということを示し、ＮＰＰＢ適用（２分及び５分）によるＧＡＢＡ誘導電流（induced current）大きさを示すグラフである。
さらに他の陰イオン遮断剤であるＮＦＡ及びＤＩＤＳも、ＧＡＢＡzine−敏感性電流を顕著に遮断すると分かった（図６Ｂ及び図６Ｇ参照）。図６Ｂは、顆粒細胞での１００μＭニフルム酸処理による緊張性ＧＡＢＡ電流を示すものであり、図６Ｇは、Ｃａ２＋敏感性Ｃｌ−チャネル遮断剤による緊張性電流の抑制率（％）を示す（使われたマウスの年齢：２９．５±０．７９、２７±０、２７．５±０．８７、２８±０．７１及び７４日（ＤＩＤＳ））。
かような結果は、ＮＰＰＢ敏感性緊張性ＧＡＢＡ放出が、小脳のＢｅｓｔ１チャネルによって媒介されるということと、緊張性ＧＡＢＡ電流は、陰イオンチャネル遮断剤によって抑制され、ベストロフィンチャネルの遺伝子沈黙によって減少するということと、を示している。
〔実施例６：膠細胞特異的Ｂｅｓｔ１チャネル構造による緊張性ＧＡＢＡ電流の回復試験〕
膠細胞特異的に、Ｂｅｓｔ１遺伝子沈黙が起こらないようにするために、タモシキフェン（tamoxifen）とＢｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡレンチウイルスとが共に注入されたｈＧＦＡＰ−ＣｒｅＥＲＴ２マウスを利用し、緊張性ＧＡＢＡ放出が、膠細胞Ｂｅｓｔ１によるか否かを試験した（図４Ａ及び図４Ｂ）。
レンチウイルス注入前に、５日間タモシキフェンを腹膜内注入し、膠細胞特異的ＣｒｅＥＲＴ活性化を開始させた（図４Ａ、図４Ｂ）。図４Ａは、ｈＧＦＡＰ−ＣｒｅＥＲＴマウスに係わる試験設計を概略的に示すものである。タモキシフェンまたはひまわりオイルを、レンチウイルス注入前５日間、一日に１回ずつ腹膜内注入した。かような試験設計下で、前記発現したＣｒｅＥＲＴは、核（nucleus）に移動してＢｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡを含むカセットを除去し、Ｂｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡを非活性化させる（図４Ｂ参照）。図４Ｂは、膠細胞特異的構造を模式的に示し、Ｃｒｅ−ＥＲＴは、ＧＦＡＰプロモータ（promoter）下で膠細胞特異的に発現し、タモキシフェン注入によって活性化され（activated）、ｓｈＲＮＡによって非活性化される（inactivated）。
Ｂｅｓｔ１の膠細胞特異的構造の効果を、タモシキフェンまたはひまわりオイルの注入されたｈＧＦＡＰ−ＣｒｅＥＲＴ２マウスのうち一つで、Ｂｅｓｔ１抗体を使用する免疫組織化学的方法で確認した（図８Ｂ参照）。一方、図４Ｃは、膠細胞での全細胞パッチクランプ記録を示している。上側トレースは、ひまわりオイル処理後、Ｂ１−ｓｈＲＮＡレンチウイルス注入されたｈＧＦＡＰ−ＣｒｅＥＲＴマウスでの緊張性ＧＡＢＡ電流を示している。下の左側は、タモキシフェン処理後、Ｂ１−ｓｈＲＮＡレンチウイルス注入されたｈＧＦＡＰ−ＣｒｅＥＲＴでの緊張性ＧＡＢＡ電流の加工前トレースを示している。Ｂｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡレンチウイルスが注入され、ひまわりオイル処理されたｈＧＦＡＰ−ＣｒｅＥＲＴ２マウスで、ＧＡＢＡzine−敏感性電流が、同じレンチウイルス注入された野生型Ｂ６マウス（図３Ｂ）と類似したレベルまで顕著に減少した（図４Ｃ、上側トレース、３５．６８±４．０５ｐＡ（naive、ｎ＝８）、１１．２７±１．２２ｐＡ（ひまわりオイル処理、ｎ＝９）、ｐ＜０．００３）。しかし、タモシキフェン処理され、Ｂｅｓｔ１−ｓｈＲＮＡレンチウイルス注入されたｈＧＦＡＰ−ＣｒｅＥＲＴ２マウスで、ＧＡＢＡzine−敏感性電流は、天然レベルに完全に回復した（図４Ｃ、下側トレース、タモキシフェン処理：３１．３１±２．１９ｐＡ（ｎ＝８）、naive：３５．６８±４．０５ｐＡ（ｎ＝１２）、ｐ＝０．３６）。
図４Ｄは、タモシキフェン処理、あるいは未処理の場合のＧＡＢＡzine−敏感性電流を示すものである。図４Ｄから分かるように、タモシキフェン処理、あるいは未処理の場合のＧＡＢＡzine−敏感性電流は、相当な差を示している（ｐ＜＜０．００１）。図４Ｅは、タモシキフェン処理、あるいは未処理の場合のＮＰＰＢ敏感性電流を示すものである。図４Ｅから分かるように、ＮＰＰＢ敏感性電流はまた、タモシキフェン処理されたマウスで、完全に回復している（naive：１８．９５±２．４７ｐＡ、ｎ＝８；タモキシフェン処理：１９．２７±２．２ｐＡｎ＝９、ｐ＝０．９３；タモキシフェン未処理：１．９３±１．５６ｐＡ、ｎ＝４、ｐ＝０．００００５）。かような結果は、膠細胞Ｂｅｓｔ１チャネルが、小脳顆粒細胞で検出されるほとんどの緊張性ＧＡＢＡ放出を担当するということを示すものである。
ＮＰＰＢ敏感性及びＢｅｓｔ１媒介の緊張性ＧＡＢＡ放出量は、全体ＧＡＢＡzine敏感性電流の約７０％ほどである。残存するＧＡＢＡzine敏感性電流、ＮＰＰＢ−無感応性電流及びＢｅｓｔ１独立的電流のソースが、現在まで知られない状態であり、これに係わるさらなる研究が必要である。クローニングされたベストロフィンチャネルは、〜２００ｎＭ範囲で、Ｃａ２＋による活性化のための見かけＫｄを有する低いＣａ２＋濃度範囲で活性化されると知られている（Hartzell et al．，2008）。天然（naive）Ｂｅｓｔ１チャネルが、同じＣａ２＋敏感性を有するならば、基底遊離細胞質Ｃａ２＋が、一般的に約１００ｎｍであるために、Ｂｅｓｔ１チャネルは、いつも部分的に活性化されていなければならず、これは、前記チャネルを介したＧＡＢＡの構成的放出（constitutive release）を誘発することになる。かような提案に符合し、２５ｍｉｎ ＢＡＰＴＡ−ＡＭ処理による遊離細胞質Ｃａ２＋のキレーティングによって、ＧＡＢＡzine−敏感性電流が顕著に減少すると分かった（図６Ｃ、図６Ｄ、図６Ｆ及び図６Ｇ参照）。図６Ｃは、顆粒細胞での１５０μＭ ＢＡＰＴＡ−ＡＭと共にインキュベーティングした（incubated）場合の緊張性ＧＡＢＡ電流を示したものであり、図６Ｄは、０．５μＭコンカナマイシンＡ（concanamycin Ａ）と共にインキュベーティングした場合の緊張性ＧＡＢＡ電流を示したものであり、前記図６Ｃ及び図６Ｄから分かるように、ＢＡＰＴＡ−ＡＭ処理時には、緊張性ＧＡＢＡ電流が顕著に減少した一方、コンカナマイシンＡ処理時には、そうではなかったということである。図６Ｆは、無処理（untreated）、コンカナマイシンＡ処理及びＢＡＰＴＡ−ＡＭ処理時のＧＡＢＡzine敏感性電流を示している。
Clomeleonイメージから得られたかような結果は、緊張性ＧＡＢＡが、分子層の平行線維から検出され、このように、ベルグマン細胞の幹から放出されたかようなＧＡＢＡは、強力な抑制性の役割を行い、さらに、プルキンエ細胞のデンドライト上のグルタメートのシナプス放出及び平行線維の局部的興奮にも深い影響を及ぼすということを提案する（図４Ｆ）。図４Ｆは、小脳での緊張性ＧＡＢＡ放出の提案モデル（suggested model for tonic ＧＡＢＡ release）である。
要約するに、本発明は、最近特徴が明らかになった小脳膠細胞のベストロフィンチャネルを介した緊張性ＧＡＢＡ放出のメカニズム、直接的透過による伝達物質のチャネル媒介放出での特有な役割、及びニューロン興奮性を調節する主要抑制性伝達物質ＧＡＢＡを放出する際の膠細胞の新規の機能を初めて提案するものである。かような抑制性膠細胞伝達物質（gliotransmitter）のチャネル媒介放出の重要性は、脳機能での膠細胞のまだ明らかにされていない多くの生理学的役割に係わる理解を提供するものである。

Claims (3)

  1. 小脳サンプルに対して候補物質を接触させる段階と、
    前記小脳サンプルでベストロフィン１チャネルの内向電流変化を測定する段階と、を含み、
    候補物質を処理する前と比較して、ベストロフィン１チャネルの内向電流値が低下する前記候補物質をＧＡＢＡ放出抑制剤として決定することを特徴とする、小脳でのＧＡＢＡ放出抑制剤のスクリーニング方法。
  2. 小脳膠細胞でベストロフィン１チャネルの内向電流変化を測定することを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
  3. ベストロフィン１チャネルの内向電流は、スニファパッチ法により内向電流を測定することによって確認することを特徴とする請求項１に記載のスクリーニング方法。
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