JP2012531900A - マイコバクテリウムの増強された検出のための方法および培地 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、2009年7月1日に出願された「マイコバクテリウムの増強された検出のための方法および培地(Method and Culture Medium for Enhanced Detection of Mycobacterium)」と題される米国仮特許出願第61/269,952号の恩恵を主張するものであり、これを本明細書に援用する。
一実施形態では、本発明の新規の培地はマイコバクテリアの増強された増殖を提供する。本明細書で使用する場合、「増強された増殖」とは、マイコバクテリアの増殖を本発明の培地および/またはサプリメントを使って、例えば培養瓶の中で、従来の培地を用いるよりも少なくとも約半日、少なくとも約1日、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約5日または少なくとも約7日早期に検出可能なことを意味する。つまり、マイコバクテリアの増殖を増強することによって、従来の培地におけるマイコバクテリアの増殖と比較して、増殖の検出時間(TTD)を向上すなわち低減させることができる。本発明によれば、本発明の培地を使うと、従来の培地と比較してTTDを少なくとも約半日、少なくとも約1日、少なくとも約2日、少なくとも約3日、少なくとも約5日または少なくとも約7日向上すなわち低減させることができる。一実施形態では、従来の培地は、上述のBacT/ALERT(登録商標)MP処理瓶(バイオメリュー社)の従来の/旧いRFおよび従来の/旧いMASを補給した従来の培地とすることができる。
一般に、本発明は生体試料内に存在する1つまたは複数のマイコバクテリウムの増殖を検出する方法に関するものである。試験する試料には、マイコバクテリウムの存在が疑われる臨床試料と非臨床試料の両方が含まれる。試験する臨床試料には、典型的には臨床実験室で試験される任意のタイプの試料が含まれ、これらの試料としては、以下のものに限定しないが、血液、唾液、吸引液、スワッブおよびスワッブすすぎ液(swab rinsates)および体液などがある。一実施形態では、試料は無菌体の検体または消化、除染された臨床検体とすることができる。試験する非臨床試料は高度に可変性のある物質を含むことができ、この物質としては、以下のものに限定しないが、食品、飲料、医薬品、化粧品、水、空気、土、植物、血液製剤(血小板を含む)、ドナー臓器または組織試料などがある。
一態様では、本発明はマイコバクテリアの増強された増殖および検出のためのMP試薬キットに関するものである。MP試薬キットは基本マイコバクテリウム培地を有する培養瓶、栄養サプリメント(NS)および/またはマイコバクテリア抗菌サプリメント(MAS)を含む。
一実施形態では、本発明は新規かつ改善されたマイコバクテリウム培地を含む瓶または容器(すなわち培養瓶)に関する。一般に、培養瓶は当技術分野において周知である任意の設計またはサイズとすることができ、マイコバクテリアの増殖および/または検出に恩恵のある任意の既知の培地を含むことができる。一実施形態では、培養瓶はMiddlebrook 7H9ブロスおよび/または水を基本培地として含む。従来の(以前の)MP瓶は、マイコバクテリウムの増殖および検出のために、約6.8pHの液体培地を使用する。同様に、新規かつ改善されたMP培養瓶は液体すなわちブロス基本培地を有し、基本培地には、新規の栄養サプリメントおよび/または新規のマイコバクテリア抗菌サプリメント(MAS)を添加することができる。培地は約5.5〜約7.5pH、約6.0〜約7.0pHまたは約6.5〜約7.0pHに調整することができる。別の実施形態では、MP培養瓶の培地のpHは約6.8である。
本発明はまた、マイコバクテリアの増殖および検出を増強させるために本発明の培養瓶に添加することのできる、向上された栄養サプリメント(NS)に関するものである。一般に栄養サプリメント(NS)は、マイコバクテリアを増殖させるための基本培地を含有する培養瓶に、該瓶および培地にマイコバクテリウムの存在の検出が所望される試料を接種する前に添加する。
本発明は、マイコバクテリアの増殖と検出を増強するために本発明の培養瓶に添加することのできる、向上されたマイコバクテリア抗菌サプリメント(MAS)にも関するものである。本発明者は、培地においてマイコバクテリアの増殖を増強させる、向上されたマイコバクテリア抗菌サプリメント(MAS)を開発した。向上されたMASは、マイコバクテリアの増殖を抑制または阻害せずに、汚染呼吸器内細菌叢(CRF)の増殖を抑制または阻害するのに効果的である。汚染呼吸器内細菌叢(CRF)としては、以下のものに限定しないが、緑膿菌、黄色ブドウ球菌、カンジダ・アルビカンス、フェカリス菌、肺炎桿菌、人口呼吸器肺炎菌、カンジダ・トロピカリス、メチシリン耐性黄色ブドウ球菌(MRSA)、バンコマイシン耐性腸球菌(VRE)がある。一実施形態では、マイコバクテリア抗菌サプリメント(MAS)は、マイコバクテリアの基本培地を含む培養瓶に、該瓶と培地にマイコバクテリウムの存在の検出が所望される試料を接種する前に、直接添加することができる。別の実施形態では、栄養サプリメント(NS)は、培地瓶に添加する前に、抗菌サプリメント(MAS)を再懸濁するために使用することができる。
長鎖脂肪酸(FA)のマイコバクテリアの増殖に対する効果を評価するために、脂肪酸を含まない(FAF)BSAをProliant社(アイオワ州エームズ)から選択した。5つの長鎖脂肪酸、すなわちミリスチン酸(C14:0)、パルミチン酸(C16:0)、ステアリン酸(C18:0)、オレイン酸(C18:1)およびリノール酸(C18:2)を、FAプロファイルおよび増殖能力に基づき、可能なFAサプリメントとして認定した。FAF BSAを補給したサプリメントの新規の処方を調製し(新規のサプリメント処方については表1を参照のこと)、5つのFAの補給のある場合とない場合とで試験を行った。FA補給の目標レベルは、過去の評価から得られたFA含有量に基づく。使用したFAF BSAの濃度は10g/Lだった。新規のサプリメントの濾過中のFAの損失は、脂肪酸メチルエステル(FAME)の分析によって決定した。0.45μmフィルタで濾過した後のFAの回収率は80%超と観察された。この処方の分析により、高レベルのBSAはFAの溶解化とBSA-FA結合による安定性を増強させることが証明された(データは示さず)。また分析により、BSAの含有量が下がると、FAの結合が弱くなり、濾過中のFA損失が増えることが証明された。
マイコバクテリアのTTDをさらに向上させるために、マイコバクテリア細胞経路内の二酸化炭素生成酵素の基質および/または補因子をさらなる研究のために選択した。これらの基質および/または補因子には、α‐ケトグルタラート、イソクエン酸、L‐リンゴ酸、オキサロ酢酸、乳酸およびL‐アルギニンがある。FAを含む新規のサプリメントを上述のように調製し、フィルタ滅菌した。基質を新規のサプリメントに異なる濃度で添加した。
ポリミキシンB(POLY B)、アムホテリシンB(AMP B)、ナリジクス酸(NA)、トリメトプリム(TMP)、アズロシリン(AZL)およびバンコマイシン(VAN)を含む6つの薬物の効果を研究することによって、マイコバクテリアの増殖に対する従来のMASの有効性を決定した。これらの研究はまた、マイコバクテリアの増殖に悪影響を及ぼす薬物とその濃度を同定するためにも行った。
マイコバクテリアのTTDを向上させるために、種々の薬物をスクリーニングして汚染呼吸器内細菌叢(CRF)を抑制させる能力について調べた。これらの評価から、ホスホマイシンがCRFの抑制には一番の選択であると考えられた。
さらなる試験のために、新規のMP瓶の処方と栄養サプリメントおよび新規のMASの処方5を選択した。この研究はマイコバクテリウム・アフリカヌム、ウシ型結核菌、ネズミ型結核菌およびヒト型結核菌を含むヒト型結核菌複合体菌株によって行った。処方5の成分は、NS+TMP(50μg/ml)、NA(400μg/ml‐PIまたはIFU)、POLY B(1250単位/ml)、FOS(600μg/ml)、Amp B(180μg/ml‐PIまたはIFU)であった。
さらなる試験のために、新規のMP瓶の処方と、栄養サプリメント(NS)および新規のMASの処方5とを選択した。この研究は、マイコバクテリウム・アビウム、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ、カンサシ菌およびマイコバクテリウム・スクロフラセウムを含む、結核菌以外のマイコバクテリア(MOTT)の菌株によって行った。処方5の組成は、NS+TMP(50μg/ml)、NA(400μg/ml‐PIまたはIFU)、POLY B(1250単位/ml)、FOS(600μg/ml)、Amp B(180μg/ml‐PIまたはIFU)であった。
FOS濃度を600μg/mlから800μg/mlに増やして、CRFのより優れた抑制を達成するために、新規のMASの処方5をさらに精製した。次の研究は、0.5×l03CFU/mlで、10のヒト型結核菌の菌株を使って行った。10の結核菌の菌株は、4つのCDC分離株、5つの毒性ATCC菌株および1つのQC参考菌株から構成される。
FOS濃度を600μg/mlから800μg/mlに増やして、CRFのより優れた抑制を達成するために、新規のMASの処方5をさらに精製した。従来の(以前の)RFおよびMAS(RF+従来の(以前の)MAS)と新規の栄養サプリメントおよび新規のMAS処方(NS+新規のMAS)とを比較して、種々のグラム陽性またはグラム陰性の細菌およびイースト菌培地に関して、増殖があるかない(NG)かを決定した。新規のMAS処方は、処方5+200μg/mlのFOS(合計で800μg/mlのFOS)を含有する。CRFは0.6×104CFU/mlで試験した。羊血液またはトリプチックソイの寒天平板を使ってコロニー数の計数も行い、培地の接種量と純度を検証した。全ての培地に関して、接種されたMP瓶をBacT/ALERT(登録商標)3D(バイオメリュー社)ノンロッキングシステムに35〜37℃で15日間装填した。BacT/ALERT(登録商標)装置によって瓶が陽性であると示されると、検出時間(TTD)データを収集した。
Claims (31)
- マイコバクテリアの増強された増殖の方法において、マイコバクテリアを含有すると疑われる試料を、α‐ケトグルタラートを含む有効量の添加剤を含有する培地に添加するステップと、該培地を前記マイコバクテリアの増殖に適した条件にさらすステップとを含み、前記添加剤は前記マイコバクテリアの増殖を増強させる、方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記増強された増殖は、マイコバクテリアの増殖の検出時間を少なくとも約2日低減させることを含む、方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記増強された増殖は、マイコバクテリアの増殖の誘導期を少なくとも約1日低減させることを含む、方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記培地は約5.5〜約7.5のpHである、方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記培地は約0.1g/L〜約50g/Lの前記α‐ケトグルタラートを含有する、方法。
- 請求項1に記載の方法において、前記培地はさらに抗菌サプリメントを含み、該抗菌サプリメントは、1つまたは複数の抗菌物質を、前記培地において細菌、イースト菌またはカビ汚染を阻害するのに十分な量で含む、方法。
- 請求項6に記載の方法において、前記1つまたは複数の抗菌物質は、抗生物質、静菌剤、殺菌剤、抗菌薬、抗ウィルス剤、抗真菌剤、抗原虫剤および抗寄生虫剤からなる群より選択する、方法。
- 請求項6に記載の方法において、前記1つまたは複数の抗菌物質は、1つまたは複数の抗生物質を含み、該1つまたは複数の抗生物質は、ポリミキシンB、バンコマイシン、アズロシリン、アムホテリシンB、ナリジクス酸、トリメトプリムおよびホスホマイシンからなる群より選択する、方法。
- 請求項6に記載の方法において、前記抗菌サプリメントは、ポリミキシンB、アムホテリシンB、ナリジクス酸、トリメトプリムおよびホスホマイシンを含む、方法。
- 請求項6に記載の方法において、前記抗菌サプリメントはホスホマイシンを含む、方法。
- 請求項10に記載の方法において、前記ホスホマイシンは前記培地において約100μg/ml〜約1000μg/mlで存在する、方法。
- マイコバクテリウム種による感染の診断の方法において、(a)培地を用意するステップと、(b)栄養サプリメントを前記培地に添加するステップであって、前記栄養サプリメント添加物はα‐ケトグルタラートを含むステップと、(c)前記マイコバクテリウム種の有無について決定する試料を添加するステップと、(d)前記マイコバクテリウム種の存在について前記培地を分析するステップと、を含み、前記マイコバクテリウム種の存在の発見は前記感染の陽性診断を示す、方法。
- 請求項12に記載の方法において、前記培地および栄養サプリメントは、マイコバクテリア増殖の検出時間を少なくとも約2日低減させる、方法。
- 請求項12に記載の方法において、前記培地および栄養サプリメントは、マイコバクテリア増殖の誘導期を少なくとも約1日低減させる、方法。
- 請求項12に記載の方法において、前記培地、栄養サプリメントおよび試料はステップ(d)の前に前記マイコバクテリアの増殖に適した条件にさらされる、方法。
- 請求項12に記載の方法において、前記培地のpHは約5.5〜約7.5である、方法。
- 請求項12に記載の方法において、前記試料は、血液、血清、血漿、血液分画、唾液、痰、吸引液およびスワッブ試料からなる群より選択する、方法。
- 請求項12に記載の方法において、前記培地はさらに抗菌サプリメントを含み、該抗菌サプリメントは前記試料をステップ(c)で添加する前に添加する、方法。
- 請求項18に記載の方法において、前記抗菌サプリメントは前記栄養サプリメントを使って懸濁し、前記栄養サプリメントで懸濁した抗菌サプリメントをステップ(b)で前記培地に添加する、方法
- 請求項19に記載の方法において、前記抗菌サプリメントは、ポリミキシンB、バンコマイシン、アズロシリン、アムホテリシンB、ナリジクス酸、トリメトプリムおよびホスホマイシンからなる群より選択した1種または複数種の抗生物質を含む、方法。
- 請求項19に記載の方法において、前記抗菌サプリメントは、ポリミキシンB、アムホテリシンB、ナリジクス酸、トリメトプリムおよびホスホマイシンを含む、方法。
- 請求項19に記載の方法において、前記抗菌サプリメントはホスホマイシンを含む、方法。
- 培地内のマイコバクテリアの増殖を検出するキットであって、該キットは、(1)基本培地を含有する培養瓶と、(2)α‐ケトグルタラートを含む栄養サプリメントと、(3)前記培地内で汚染呼吸器内細菌叢の増殖を抑制する1つまたは複数の抗菌剤を含む抗菌サプリメントとを含む、キット。
- 請求項23に記載のキットにおいて、前記増強された増殖は、マイコバクテリア増殖の検出時間を少なくとも約2日低減させることを含む、キット。
- 請求項23に記載のキットにおいて、前記増強された増殖は、マイコバクテリア増殖の誘導期を少なくとも約1日低減させることを含む、キット。
- 請求項23に記載のキットにおいて、前記基本培地はMiddlebrook 7H9である、キット。
- 請求項23に記載のキットにおいて、前記基本培地は熱不安定性成分を含有しない、キット。
- 請求項27に記載のキットにおいて、前記培養瓶および前記基本培地はオートクレーブによって滅菌される、キット。
- 請求項23に記載のキットにおいて、前記抗菌サプリメントはホスホマイシンを含む、キット。
- 請求項29に記載のキットにおいて、前記抗菌サプリメントは、ポリミキシンB、バンコマイシン、アズロシリン、アムホテリシンB、ナリジクス酸およびトリメトプリムからなるグループより選択した1つまたは複数の付加的な抗生物質をさらに含む、キット。
- 請求項29に記載のキットにおいて、前記抗菌サプリメントは、ポリミキシンB、バンコマイシン、アムホテリシンB、ナリジクス酸およびトリメトプリムをさらに含む、キット。
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