ES2602467T3 - Método y medio de cultivo para la detección mejorada de micobacterias - Google Patents

Abstract

Un método para el crecimiento mejorado de micobacterias que comprende añadir una muestra que contiene micobacterias a un medio de cultivo que contiene una cantidad eficaz de un aditivo que comprende α-cetoglutarato para proporcionar un medio de cultivo con una concentración final de 5 g/L a alrededor de 50 g/L de α-cetoglutarato, y someter al medio de cultivo a condiciones adecuadas para el crecimiento de dichas micobacterias, en el que dicho aditivo mejora el crecimiento de dichas micobacterias, y reduce el tiempo de detección del crecimiento de las micobacterias en al menos 2 días en comparación con un medio de cultivo que no contiene α-cetoglutarato.

Description

Método y medio de cultivo para la detección mejorada de micobacterias

Campo de la invención

La presente invención se dirige en general a un método para la detección mejorada de micobacterias, un método para el diagnóstico de la infección provocada por una especie de micobacleria, y un kit para la detección del crecimiento de micobacterias. Esto se consigue mediante diversas mejoras en un medio de cultivo, y la presente invención se dirige a métodos para mejorar o reducir el tiempo de detección (TTD) del crecimiento de micobacterias en el medio de cultivo.

Antecedentes de la invención

Las mioobaclerias son un género de bacterias que se caracterizan como bacilos gram-positivos, sin movilidad, acidorresistentes. El género comprende muchas especies, que incluyen Mycobacterium africanum, M avium, M bovis, M bovis-BCG, M. chelonae, M forluitum, M gordonae, M intracellulare, M kansasii, M leprae, M. microti, M scrofulaceum, M paratuberculosis, y M. tuberculosis. Algunas de las micobacterias son patógenas para seres humanos y animales, en particular M tuberculosis, M leprae, y M bovis. Otras especies de micobacterias no son patógenas normalmente, pero provocan infecciones oportunistas en individuos inmunodeprimidos, tales como pacientes de SIDA. Por ejemplo, la infección por M kansasii, M avium, y M intracellulare puede provocar una enfermedad pulmonar grave en sujetos cuyo sistema inmunitario esté reducido o deprimido. De hecho, por primera vez desde 1953, los casos informados de infecciones micobacterianas se están incrementando en los Estados Unidos; muchos de estos casos estan relacionados con la epidemia de SIDA.

La detección de especies de Mycobacterium en las muestras clinicas es importante como herramienta de diagnóstico clínico. Históricamente se creía que M tuberculosis era el único patógeno clinicamente significativo de este género. Un aumento de la incidencia de cepas resistentes a férmacos de M tuberculosis ha resaltado adicionalmente la necesidad de detectar esta especie. La tuberculosis exhibe todas las características principales de una enfermedad epidémica global. Actualmente, la tuberculosis afecta a más de 35 millones de individuos en todo el mundo, y da como resultado mas de 4 millones de muertes al año. Así, la tuberculosis es un problema muy preocupante en todo el mundo. La tuberculosis puede estar provocada por M tuberculosis, M bovis, M africanum y

M. microti, bacilos tuberculosos gram-positivos, acidorresistentes, de la familia Mycobacteriaceae. También se han aíslado algunas cepas patógenas locales de M tuberculosis de pacientes en Madras y otras cíudades de la Indía, que difieren en cierta medida de M tuberculosis H37Rv, que es una cepa virulenta.

Otras especies de micobaclerias, no obstante, también son clínicamente importantes. A veces se denominan "MOTI" las micobaclerias distintas del bacilo tuberculoso, que incluyen habitualmente los organismos del complejo M aviumlintracellulare (M avium, M intracellulare, M. paratuberculosis, habitualmente denominado MAIC), M gordonae, M fortuitum, M chelonae, M. mucogenicum y mezclas de especies de micobacterias en una muestra clinica. Por ejemplo, se ha demostrado que las infecciones oportunistas de crecimiento rapido por bacterias del complejo M. avium (MAC) se dan con frecuencia en individuos con SIDA y otros individuos inmunodeprimidos. En tales individuos infectados, se han hallado al menos 106 células MACfml de sedimento de esputo. Por lo tanto, los ensayos de detección que pueden detectar muchas especies de micobacterias son clínicamente importantes.

Muchos métodos clinicos para detectar e identificar especies de micobacterias en muestras requieren el analisis de las características físicas de las bacterias (p.ej., la tinción acidorresistente y la detección microscópica de los bacilos), las caraclerísticas fisiológicas (p.ej., el crecimiento en medios definidos) o las características bioquimicas (p.ej., la composición de lípidos de la membrana). Estos métodos requieren concentraciones relativamente elevadas de las bacterias en la muestra a deteclar, pueden ser subjetivos dependiendo de la experiencia y pericia del técnico clinico, y consumen tiempo. Debido a que las especies de micobacterias a menudo son dificiles de cultiva r in vitro y puede llevar varias semanas alcanzar una densidad útil en cultivo, estos métodos también pueden dar como resultado un tratamiento retrasado de los pacientes y costes asociados al aislamiento de un individuo infectado hasta que se completa el diagnóstico.

Las micobaclerias en general, y M tuberculosis y M bovis en particular, son microorganismos de cultivo difícil que crecen muy lentamente. Puede llevar de dos a tres semanas cultivar estos organismos en los medios de cultivo usados de manera convencional. Se han hecho varios esfuerzos para hallar un medio o una sustancia que pueda mejorar el crecimiento y reducir el factor tiempo. Por ejemplo, la patente de EE.UU. nO 3.935.073 describe un medio de crecimiento para cultivar micobaclerias que contiene los siguientes nutrientes a los niveles indicados: caldo base 7H9 del 0,47% (que contiene fosfato potásico y sódico, glutamato sódico, citrato sódico, sulfato amónico, piridoxina, citrato férrico-amónico, sulfato magnésico, sulfato de zinc, sulfato de cobre, biotina y cloruro cálcico obtenido de BBL Microbiology Systems en Cockeysville, Maryland), albúmina de suero bovino del 0,5%, hidrolizado de caseína del 0,1%, catalasa a 96 unidadeslvial, sustrato marcado con 14C a 2 uCifvial, equilibrio con agua desionizada a 2 mi, pH finaI6,8±0,1.

Se puede usar albúmina como agente destoxificante en un medio para el crecimiento de micobaclerias La albúmina es una proteína simple hallada en prácticamente todos los animales y en muchos tejidos vegetales Las albúminas

se caracterizan por ser solubles en agua y coagulables mediante calor. Contienen carbono, hidrógeno, nitrógeno, oxígeno y azufre. Una albúmina preferida para los medios de crecimiento usados en la presente invención es la albúmina de suero bovino. La albúmina está presente en general en los medios de crecimiento a un nivel de alrededor del 0,1 por ciento en peso a alrededor del 10 por ciento en peso.

Sin embargo, debido a la lenta velocidad de crecimiento y a la necesidad de un medio enriquecido para el crecimiento micobacteriano en cultivo, la detección de micobaclerias a partir de muestras clínicas (p.ej. esputo, fluidos pulmonares, tejido o heces) todavía representa un desafio biológico significativo. Un factor en este desafío surge por el hecho de que las bacterias que crecen más rapidamente pueden superar al organismo micobacteriano de crecimiento lento de interés, por lo que se impide o dificulta significativamente la detección de micobacterias. A lo largo de décadas, se han desarrollado varias técnicas para descontaminar las muestras de diagnóstico (es decir, destruir o inhibir los organismos no micobaclerianos) sometidas a identificación micobacleriana. Estas técnicas destruyen los contaminantes potenciales o los dañan hasta el punto de que su crecimiento se inhibe o se impide totalmente

De manera convencional, el diagnóstico de laboratorio de las micobacterias se basó en la tinción acidorresistente y el cultivo del organismo, seguido de ensayos bioquimicos. Como resultado del crecimiento lento y del tiempo de generación largo de las micobacterias, el diagnóstico de laboratorio exacto de micobaclerias mediante las técnicas convencionales puede llevar hasta seis semanas. Los sistemas de cultivo automatizados, tales como el sistema BacT/ALER-rt' (bioMérieux, Inc.) pueden disminuir el tiempo para la identificación de micobaclerias hasta dos semanas.

El presente cesionario, bioMérieux, Inc., ofrece el frasco de cultivo BacTlALER-rt' MP de plástico para el uso en los sistemas de detección microbiana BacTfALER~como su sistema basado en cultivo para deteclar micobaclerias en muestras clínicas distintas de sangre. El sistema de detección microbiana BacT/ALERT* utiliza un sensor calorimétrico y la luz reflejada para monitorizar la presencia y la producción de dióxido de carbono (C02) disuelto en el medio de cultivo. Si hay micobacterias en la muestra de ensayo, se produce dióxido de carbono a medida que los microorganismos metabolizan los sustratos del medio de cultivo. Cuando el crecimiento de las micobacterias produce C02, el color del sensor permeable a gases instalado en el fondo de cada frasco de cultivo cambia de azulverde a amarillo

El sistema de reactivos BacT/ALER'-® MP incluye un frasco de cultivo BacT/ALER~MP, fluido de reconstitución (FR) y suplemento antibiótico MB BacT (SAM) (denominado más adelante en la presente memoria FR convencional

o antiguo (o FR convencional/antiguo) y SAM convencional o antiguo (o SAM convencional/antiguo». El frasco de cultivo BacT/ALER'-® MP es un frasco de plástico que contiene algunos componentes del medio. El fluido de reconstitución (FR) contiene los nutrientes restantes para el crecimiento de micobacterias, y se usa para reconstituir el SAM. El SAM es un polvo liofilizado constituido por seis antimicrobianos para inhibir la flora respiratoria indeseada de las muestras de esputo. El FR Y SAM se envasan como el kit SAM. Sin embargo, todavía existe la necesidad en la técnica de reducir adicionalmente el tiempo necesario para el diagnóstico exacto de micobacterias

Nakamura M., "Multiplication of Mycobacterium lepraemurium in Cen-free Medium Containing a-Ketoglutaric Acid and Cytochrome c", J. Gen Microbiology (1972), 73, 193-195 presenta pruebas de la multipl icación de Mycobacterium lepraemurium en medio sin células que contiene ácido a-cetoglutarico y citocromo e

El documento WO 00152139 describe un método de cultivo de micobacterias. El medio de crecimiento es un medio de cultivo quimicamente definido que comprende a-cetoglutarato

Tortoli y Palomino, "Chapter 14' New Diagnostic Methods" en "Tuberculosis textbook" (2007), www.tuberculosistextbook.com. páginas 441 -486, describe diversos suplementos para el diagnóstico de infecciones micobacterianas que comprenden diversos antimicrobianos.

Por lo tanto, un objetivo principal de esta invención es proporcionar un método o kit que usa un medio de cultivo para el crecimiento y la detección mejorada de especies de Mycobacterium que pueden estar presentes en una muestra clinica. También se describe en la presente memoria un nuevo medio de cultivo de micobacterias adecuado para el cultivo in vitro de micobaclerias. Otro objetivo de esta invención es proporcionar un método o kit que usa un medio de cultivo de micobacterias, en el que se inhibe el crecimiento de los organismos contaminantes

Por lo tanto, en la presente memoria se describe una formulación nueva de medios de cultivo, un suplemento de nutrientes (SN) nuevo y una formulación nueva de suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM), y mejoras en el proceso de fabricación que muestran una mejora inesperada del crecimiento y la detección de micobacterias También se describen en la presente memoria métodos para el crecimiento y la detección mejorada de micobacterias.

Sumario de la invención

En la presente memoria se describe un medio de cultivo nuevo para el crecimiento y la detección de Mycobacterium Además, la presente invención proporciona métodos que usan composiciones y métodos de diagnóstico que detectan un amplio espectro de especies de Mycobacterium que pueden estar presentes en una muestra ctínica. La

presente invención también se dirige a un kit MP nuevo y mejorado que muestra un tiempo de detección (nO) mejorado para el crecimiento y la detección de micobacterias, y el kit MP comprende un frasco de cultivo BacTIALER-rt' MP autoclavable, un suplemento de nutrientes (SN) y un suplemento antimicrobiano de micobacterias (SAM) nuevo.

En la presente memoria se describe un medio de cultivo nuevo para cultivar micobacterias, y el medio de cultivo comprende: (a) un medio de cultivo base adecuado para el crecimiento de micobacterias; (b) uno o más aditivos de suplemento de nutrientes; (c) y un suplemento antimicrobiano mejorado; y en el que dicho medio de cultivo exhibe un crecimiento mejorado para dichas micobaclerias

En una realización, la presente invención se dirige a un método para el crecimiento mejorado de micobacterias que comprende añadir una muestra que contiene micobaclerias a un medio de cultivo que contiene una cantidad eficaz de un aditivo que comprende a-cetoglutarato para proporcionar un medio de cultivo con una concentración final de 5 gIL a alrededor de 50 gIL de a-cetoglutarato, y someter al medio de cultivo a condiciones adecuadas para el crecimiento de dichas micobacterias, en el que dicho aditivo mejora el crecimiento de dichas micobacterias, y reduce el tiempo de detección del crecimiento de las micobacterias en al menos 2 días en comparación con un medio de cultivo que no contiene a-cetoglutarato

Otra realización de la presente invención se dirige a un método para el diagnóstico de una infección provocada por una especie de micobacteria, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo; (b) añadir un suplemento de nutrientes a dicho medio de cultivo, y el suplemento de nutrientes comprende a-cetoglutarato para proporcionar un medio de cultivo con una concentración final de 5 gIL a alrededor de 50 gIL de a-cetoglutarato; (c) añadir una muestra en la que se va a detenninar la presencia o ausencia de dicha especie de micobacteria, y (d) analizar en el cultivo la presencia de la especie de micobacteria, en el que un hallazgo de la presencia de la especie de micobacteria indica un diagnóstico positivo para dicha infección, y en el que dicho aditivo de a-cetoglutarato reduce el tiempo de detección del crecimiento de micobaclerias en al menos 2 días en comparación con un medio de cultivo que no contiene a-cetoglutarato

En otra realización, la presente invención se dirige a un kit de reactivos BacT/ALER~MP mejorado. El kit de reactivos BacTIALERre MP mejorado incluirá un frasco de cultivo MP mejorado que incluye un medio de cultivo base para el crecimiento de micobacterias; un suplemento de nutrientes que comprende a-cetoglutarato; y un suplemento antimicrobiano que comprende uno o más agentes antimicrobianos para inhibir el crecimiento de la flora respiratoria contaminante en dicho medio de cultivo. en el que dicho a-cetoglutarato del suplemento de nutrientes está a una concentración tal que después de mezclar el suplemento de nutrientes y el suplemento antimicrobiano con el medio de cultivo base contenido en el frasco de cultivo, dicho aditivo de a-cetoglutarato presente en el medio de cultivo está a una concentración final de 5 gIL a alrededor de 50 gIL, yen el que dicho aditivo de a-cetoglutarato reduce el tiempo de detección del crecimiento de micobaclerias en al menos 2 días en comparación con un medio de cultivo que no contiene a-cetoglutarato. Opcionalmente, el medio de cultivo del frasco de cultivo MP nuevo no incluirá ningún componente termolábil, y de ese modo permitirá que el frasco de cultivo MP nuevo sea autoclavable El suplemento de nutrientes (SN) puede incluir un medio de cultivo base para el crecimiento de micobacterias y/o una o más fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, carbohidratos, sales, nutrientes, proteínas, aminoácidos, ácidos grasos, u otros nutrientes.

Breve descripción de las figuras

Figura 1A es una gráfica de cajas que muestra el tiempo de detección (nO) de M. tuberculosis con y sin suplemento de ácidos grasos.

Figura 1 B es una gráfica de cajas que muestra el tiempo de detección (TTO) de M. inlracellulare con y sin suplemento de ácidos grasos.

Figura 1C -es una gráfica de cajas que muestra el tiempo de detección (nO) de M. avium con y sin suplemento de ácidos grasos.

Figura 2 -es una gráfica de cajas que muestra el tiempo de detección (TTO) de cepas de micobacterias con y sin acetoglutarato.

Figura 3 -es una gráfica de cajas que muestra el tiempo de detección (nO) de cepas de micobacterias con azlocilina

Figura 4 -es una gráfica de cajas que muestra el efecto de vancomicina sobre el crecimiento de cepas micobacterianas.

Figura 5A -es una gráfica de cajas que muestra el tiempo de detección (nO) de M. tuberculosis 18283 con diversas formulaciones de suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM).

Figura 5B -es una gráfica de cajas que muestra el tiempo de detección (nO) de M tuberculosis 27294 con diversas formulaciones de suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM).

Figura se • es una gráfica de cajas que muestra el tiempo de detección (nO) de M. avium 569 con diversas formulaciones de suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM)

Figura 50 • es una gráfica de cajas que muestra el tiempo de detección (nO) de M. intracellulare 13950 con diversas formulaciones de suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM)

Figura SE -es una gráfica de cajas que muestra el tiempo de detección (nO) de M. scrofulaceum 19981 con diversas formulaciones de suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM)

Figura 5F· es una gráfica de cajas que muestra el tiempo de detección (nO) de M. kansasii 12478 con diversas formulaciones de suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM).

Figura 6 • es una gráfica de cajas que muestra una comparación de la formulación anterior de SAM frente a la formulación nueva de suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM) por el tiempo de detección (TTO) del crecimiento del complejo M. tuberculosis

Figura 7 • es una gráfica de cajas que muestra una comparación de la formulación anterior de SAM frente a la formulación nueva de suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM) por el tiempo de detección (nO) del crecimiento de otras cepas de micobacterias

Descripción detallada de la invención

El cultivo de microorganismos en proliferación proporcionando las condiciones nutricionales y ambientales adecuadas es muy conocido. Un medio de crecimiento o cultivo adecuado deberia contener todos los nutrientes requeridos por el microorganismo que se va a cultivar. Por ejemplo, un medio de cultivo microbiológico típico deberia contener fuentes disponibles de agua, una fuente de carbono, una fuente de nitrógeno, vitaminas, oligoelementos tales como potasio, magnesio, calcio y hierro, y minerales, tales como azufre y fósforo. En general, estos requerimientos se suministran a partir de varias fuentes. Otros factores para las condiciones de proliferación adecuadas pueden incluir el pH, la temperatura, la aireación, la concentración salina y la presión osmótica del medio.

Además, se sabe que pueden ser necesarios ciertos factores de crecimiento. Un factor de crecimiento es un compuesto orgánico que debe contener un microorganismo para crecer, pero que es incapaz de sintetizar. Muchos microorganismos, cuando se les proporcionan los nutrientes enumerados anteriormente, son capaces de sintetizar todos los constituyentes orgánicos de su protoplasma, que incluyen los aminoácidos, las vitaminas, las purinas y pirimidinas, los ácidos grasos y otros compuestos. Cada uno de estos compuestos esenciales se sintetiza mediante una secuencia discreta de reacciones enzimáticas, y cada enzima se produce bajo el control de un gen específico Sin embargo, algunos microorganismos no pueden sintetizar uno o más de estos factores de crecimiento, y deben obtener esos compuestos del medio. Los faclores de crecimiento necesarios pueden incluir, pero sin limitación, aminoácidos, vitaminas, purinas y pirimidinas, ácidos grasos y otros compuestos necesarios para el crecimiento

Como se discutió anteriormente en la presente memoria, el actual cesionario, bioMérieux:, Inc., produce y vende un frasco de medio de cultivo para el crecimiento y la detección de micobaclerias (Frasco de Proceso BacT/ALER-¡-® MP). El Frasco de Proceso BacT/ALER"-® MP está diseñado para el uso con los sistemas BacT/ALER"-® o BacT/ALER-¡-® 30 para la recuperación y detección de micobacterias de muestras corporales estériles y de muestras clinicas digeridas-descontaminadas El Frasco de Proceso MP se puede usar junto con el Suplemento Antimicrobiano MB/Bac~ (SAM) y/o el Fluido de Reconstitución MB/Bac~ (FR) (denominados en la presente memoria SAM convencional o antiguo y FR convencional o antiguo).

El frasco de cultivo desechable BacT/ALER"-® MP tiene un cierre extraíble y contiene aproximadamente 10 mi de medio y un sensor interno que detecta el dióxido de carbono como indicador del crecimiento microbiano. La formulación del medio de cultivo consiste en: caldo Middlebrook 7H9 (0,47% pfv), digestión pancreática de caseina (0,1% plv), albúmina de suero bovino (0,5% p/v), y catalasa (48 u/mi) en agua purificada (denominado en la presente memoria medio de cultivo convencional o antiguo).

El Suplemento Antimicrobiano MBfBac¡-® convencional o antiguo (SAM convencionaVantiguo) es un suplemento liofilizado formulado para contener anfotericina B (0,0180% plv), azlocilina (0,0034% p/v), ácido nalidixico (0,0400% p/v ), polimixina B (10.000 unidades), trimetoprima (0,00105% pfv), y vancomicina (0,0005% pfv).

El Fluido de Reconstitución MB/Bac~convencional/antiguo (FR convencional/antiguo) contiene ácido oleico (0,05% p/v ), glicerol (5% p/v), amaranto (0,004%), y albúmina de suero bovino (1% p/v) en agua purificada. El Fluido de Reconstitución (FR) y el Suplemento Antimicrobiano MB BacT/ALER"-® (SAM) constituyen un kit de suplemento que se puede añadir al frasco MP.

La presente invención se dirige a métodos y kits que usan un medio de cultivo nuevo y mejorado, y un método para el crecimiento mejorado de micobacterias. El medio de cultivo y los métodos de la presente invención se pueden usar para el cultivo de cualquier micobacleria conocida, que incluye, pero sin limitación, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Mycobacterium microti, Mycobacterium africanum, Mycobacterium canetti, Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium scrofulaceum, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium

malmoense, Mycobacterium xenopi, Mycobacterium marinum, Mycobacterium simiae, Mycobacterium terrae, Mycobacterium ulcerans, Mycobacterium abscessus, Mycobacterium torluitum, Mycobacterium chelonae, y Mycobacterium gordonae_Ahora se ha descubierto una formulación nueva de medios de cultivo, un suplemento de nutrientes nuevo (denominado en la presente memoria SN nuevo) y una formulación nueva de suplemento antimicrobiano (denominado en la presente memoria SAM nuevo), y mejoras en el proceso de fabricación que muestran una mejora inesperada en el crecimiento y la detección de micobacterias

Las caracteristicas nuevas del sistema MP de la presente invención pueden incluir: (1) la transferencia de componentes termolabiles del medio de cultivo MP a un suplemento de nutrientes, lo que permite la esterilización terminal del frasco MP; (2) el uso de fuentes de carbono nuevas para optimizar la producción de CO2; (3) la optimización del suplemento de nutrientes; y/o (4) la optimización de los antimicrobianos del SAM y/o la concentración de antimicrobianos_ Estas mejoras conducen a varias mejoras inesperadas del crecimiento y la detección de micobacterias, que incluyen: (1) el rendimiento mejorado del frasco MP en cuanto al tiempo de detección (nD) del crecimiento micobacleriano; (2) la recuperación mejorada de micobacterias clinicamente relevantes; (3) la reducción de la intercurrencia de la flora respiratoria contaminante (FRC); y/o (4) la minimización de falsos positivos. Las mejoras adicionales incluyen la simplificación del proceso de fabricación, de forma que se pueden almacenar los frascos BacT/ALER-Y® MP y enviarlos a temperatura ambiente

Medio de Cultivo

El medio de cultivo nuevo de la presente invención proporciona un crecimiento mejorado de las micobacterias. Tal como se usa en la presente memoria, ~crecimiento mejorado" significa que el crecimiento de las micobacterias se puede detectar mediante el uso del medio de cultivo y/o los suplementos de la presente invención, por ejemplo en un frasco de cultivo, al menos alrededor de 0,5 días, al menos alrededor de 1 dia, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 5 días, o al menos alrededor de 7 días antes que con el uso de los medios de cultivo convencionales. En otras palabras, se puede mejorar el crecimiento de las micobacterias, y de ese modo se permite una mejora o reducción en el tiempo de detección (TTD) del crecim iento en comparación con el crecimiento de las micobacterias en un medio de cultivo convencional. De acuerdo con esta invención, el no se puede mejorar o reducir en al menos alrededor de 0,5 días, al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 dias, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 5 dias, o al menos alrededor de 7 días con el uso del medio de cultivo de la presente invención en comparación con los medios de cultivo convencionales_ En una

realización , el medio de cultivo convencional puede ser el medio de cultivo convencional complementado con el FR convencional/antiguo y SAM convencional/antiguo del Frasco de Proceso BacT/ALER-Y® MP (bioMérieux, Inc_), descrito anteriormente en la presente memoria.

El medio de cultivo nuevo usado en la presente invención puede proporcionar una disminución del tiempo de latencia para el crecimiento de micobaclerias. Tal como se usa en la presente memoria, "tiempo de latencia disminuido" significa una disminución en el tiempo de incubación o de latencia antes de que la micobacteria entre en la fase logarítmica de crecimiento_De acuerdo con la presente invención, el uso del medio de cultivo y/o los suplementos en los métodos y kits de la invención da como resultado una disminución o reducción del tiempo de latencia de al menos alrededor de 0,5 dias, o al menos alrededor de 1 dia, o al menos alrededor de 2 dias, o al menos alrededor de 3 días, en comparación con la fase de latencia de la micobacteria en el medio de cultivo convencional/antiguo. El medio de cultivo convencionalfantiguo puede ser el medio de cultivo convencional complementado con el FR convencional/antiguo y el SAM convencional/antiguo del Frasco de Proceso BacT/ALER~MP (bioMérieux, Inc_), descrito anteriormente en la presente memoria.

El medio de cultivo que se usa en los métodos y kits de la presente invención comprende un medio líquido de nutrientes o caldo de nutrientes_ El medio de cultivo o caldo de nutrientes comprende en general uno o más nutrientes conocidos, por ejemplo, el medio de cultivo puede contener una o mas fuentes de carbono (p_ej., glicerol), fuentes de nitrógeno (p.ej., sales de amonio), carbohidratos, sales (p.ej., K·, Mg2., Ca2., Zn2+), nutrientes, y/o agua. El medio de cultivo usado en la presente invención puede comprender Middlebrook 7H9. Como se discutió anteriormente en la presente memoria, el Middlebrook 7H9 comprende sales de potasio, sales de sodio, glutamato sódico, citrato sódico, sulfato amónico, piridoxina, citrato férrico-amónico, sulfato magnésico, sulfato de zinc, sulfato de cobre, biotina y cloruro cálcico

El medio de cultivo usado en la presente invención puede comprender además nutrientes y/o componentes adicionales que penniten la detección mejorada del crecimiento de micobacterias_ Los nutrientes y/o componentes adicionales que se pueden añadir al medio de cultivo de la presente invención incluyen, pero sin limitación, proteínas, aminoácidos, ácidos grasos, extractos celulares o vegetales, y/u otros nutrientes. Por ejemplo, el medio de cultivo usado en la presente invención puede comprender además caseína (p_ej_, una digestión pancreatica de caseína), albúmina (p_ej_, albúmina de suero bovino), catalasa y/o amaranto_ Como se discute adicionalmente en la presente memoria, estos nutrientes y/o componentes adicionales pueden comprender un suplemento de nutrientes diferente que se puede añadir a un medio de cultivo base antes de la inoculación del medio de cultivo con una muestra para la que se puede desear la determinación de la presencia o ausencia de una micobacteria.

Se ha descubierto que los niveles elevados de ácidos grasos de cadena corta y media (p_ej_, ácidos grasos que tienen alrededor de 8 o menos átomos de carbono) asociados a la albúmina de suero bovino (ASS) en el frasco de

medio de cultivo pueden dar como resultado lecturas de falsos positivos. Como tal, se puede preferir evitar el uso de acidos grasos de cadena corta o media. Por ejemplo, se debería evitar el uso de acidos grasos que tengan 8 o menos átomos de carbono (p.ej., ácido caprílico)

Sin embargo, también se ha descubierto que estos falsos positivos inducidos por el reactivo se pueden eliminar o reducir significativamente mediante el uso de ASB sin acidos grasos y complementando la formulación del medio de cultivo con acidos grasos de cadena larga. Por lo tanto, el medio de cultivo puede comprender además ASB sin acidos grasos (ASB sin AG) y uno o mas acidos grasos de cadena larga saturada o ¡nsaturada, o sales de los mismos. Se puede preferir utilizar uno o mas ácidos grasos de cadena larga que tengan 10 o mas átomos de carbono. En general, se puede usar cualquier ácido graso de cadena larga conocido, que incluye, pero sin limitación, acido mirístico, ácido palmítico, acido estearico, acido oleico, acido linoleico, y las sales de los mismos. Como se discute adicionalmente en la presente memoria, se ha descubierto que los acidos grasos se pueden transferir desde los medios de cultivo del frasco a un suplemento de nutrientes que se puede añadir por separado a los medios de cultivo antes de la inoculación con una muestra de ensayo. Como se muestra en la presente memoria (véase, p.ej., el Ejemplo 1 y las Figuras 1A-1C), el uso de una ASB sin ácidos grasos y la complementación del medio de cultivo con ácidos grasos de cadena larga dio como resultado una mejora en el tiempo de detección (ITD) de 2 a 2,5 días para el crecimiento y la detección de M tuberculosis (véase la Figura 1A), M intracellulare (véase la Figura 1B), y M avium (véase la Figura 1C).

En un aspecto de la presente invención, el medio de cultivo de la presente invención se puede complementar con uno o mas sustratos o intermedios conocidos de rutas metabólicas. Se ha descubierto sorprendentemente que incluyendo un sustrato de ruta metabólica de a-cetoglutarato en los medios de cultivo, se pudo mejorar el crecimiento y la detección de micobacterias en comparaCión con un medio de cultivo que no contuvo el sustrato de ruta metabólica de a-cetoglutarato. Aunque sin desear limitarse por la teoría, se cree que el uso de un sustrato de ruta metabólica de a-cetoglutarato en el medio de cultivo puede aumentar la producción de COl por las micobacterias presentes en el cultivo. De acuerdo con esta realización, se pueden usar los sustratos o intermedios del ciclo del ácido cítrico, la glucolisis o la ruta del glioxilato. Se pueden usar sustratos o cofactores de enzimas que producen CO2, o los intermedios, precursores o derivados de los mismos, en el medio de cultivo. Por ejemplo, pueden ser útiles los intermedios del ciclo del ácido cítrico, tales como piruvato, citrato, cis-aconitato, isocitrato, oxalosuccinato, a-cetoglutarato, succinil-CoA, succinato, fumarato, malato, oxalacetato. En otra variación, se puede incluir uno o mas de a-cetoglutarato, un precursor de a--cetoglutarato, y/o un derivado de a-cetoglutarato en el medio de cultivo descrito en la presente memoria (se usa a-cetoglutarato en la presente invención). Los precursores o derivados de a--cetoglutarato pueden incluir, pero sin limitación, glutamato, isocitrato, oxalosuccinato, o las mezclas de los mismos. El a-cetoglutarato, precursor(es) de a-cetoglutarato, y/o derivado(s) de a-cetoglutarato puede(n) estar presente(s) en el medio de cultivo a una concentración final de alrededor de 0,1 gIL a alrededor de 50 gIL, de alrededor de 0,5 gIL a alrededor de 20 gIL, o de alrededor de 1 gIL a alrededor de 20 gIL Como se discute adicionalmente en la presente memoria, el a-cetoglutarato, el precursor de a-cetoglutarato, y/o el derivado de acetoglutarato se pueden incluir en un suplemento de nutrientes que se puede añadir por separado a los medios de cultivo

En otro aspecto de la presente invención, el medio de cultivo de la presente invención puede comprender adicionalmente uno o más agentes o sustancias antimicrobianas. Un antimicrobiano es un agente o sustancia que destruye, reduce, o inhibe de otra manera el crecimiento de los microbios. En general, se puede usar cualquier agente antimicrobiano conocido, tal como farmacos, productos quimicos, u otras sustancias que destruyen, reducen,

o ralentizan el crecimiento de los microbios. Los agentes antimicrobianos útiles incluyen, pero sin limitación, antibióticos, bacteriostaticos, bactericidas, antibacterianos, antivirales, antifúngicos, antiprotozoarios y antiparasitarios. En general, el antimicrobiano se usa en una cantidad suficiente para destruir, reducir, o inhibir el crecimiento de las bacterias contaminantes que pueden estar presentes en el medio de cultivo. Por ejemplo, como entendería un experto en la técnica, se puede preferir inhibir el crecimiento de la flora respiratoria contaminante (FRC) en el medio de cultivo. La FRC puede interferir con el crecimiento de las micobacterias, agotar los nutrientes necesarios para el crecimiento micobacteriano ylo conducir a falsos positivos. La flora respiratoria contaminante (FRC) puede incluir, pero sin limitación, P. aeruginosa, S. aureus, C. albicans, E. faecalis, K. pneumoniae, S. maltophilia , C. tropica/is, S. aureus resistente a meticilina (es decir, SARM), E. faeca/is resistente a vancomicina (es decir, ERV)

El antimicrobiano puede ser uno o más antibióticos o fármacos sintéticos, que incluyen, pero sin limitación, polimixina B, vancomicina, azlocilina, anfotericina B, ácido nalidíxico, trimetoprima y fosfomicina. Preferiblemente, los antibióticos útiles inhiben la flora respiratoria contaminante (FRC) sin reducir o inhibir el crecimiento micobacteriano

El suplemento antimicrobiano puede comprender uno o mas antibióticos antifúngicos, antibióticos para gramnegativos, antibióticos para gram-positivos, un antibiótico antifúngico, y antibióticos de amplio espectro. Por ejemplO, el suplemento antimicrobiano de la presente invención puede comprender un antifúngico (p.ej., anfotericina B), un antibiótico para gram-negativos que altera la permeabilidad de la membrana citoplasmática (p.ej., polimixina B), un antibiótico de amplio espectro que inhibe la ADN girasa (p.ej., ácido nalidíxico), un agente quimioterápico (p.ej., un agente que inhibe la dihidrofolato reductasa (p.ej., trimetoprima)) y un antibiótico de amplio espectro que inhibe la enolpiruvato transferasa (p.ej., fosfomicina). En general, se puede usar cualquier antifúngico, antibiótico para gramnegativos, antibiótico de amplio espectro, antibiótico inhibidor de la ADN Girasa, o agente quimioterápico conocidos

en la práctica de esta invención. En una realización, el suplemento antimicrobiano puede comprender anfotericina B, polimixina B, ácido nalidíxico, trimetoprima y fosfomicina

Como se muestra en la presente memoria (véanse, p.ej., los Ejemplos 3-4 y las Figuras 3-4), el uso de vancomicina y/o azlocilina puede inhibir, reducir o ralentizar el crecimiento de ciertas especies de micobacterias. Así, se puede preferir evitar el uso de vancomicina yfo azlocilina. Se ha descubierto que se puede usar fosfomicina en vez de azlocilina y vancomicina para producir un suplemento antimicrobiano (SAM) que se puede usar para mejorar el crecimiento y la detección de las micobacterias en cultivo, en comparación con el Suplemento Antimicrobiano MB/Sacr®. Por ejemplo, sustituyendo azlocilina y vancomicina con fosfomicina, se ha descubierto que el suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM) nuevo mejora o reduce el tiempo de detección (TTD) del crecimiento de micobacterias en 2-9 días, en comparación con el SAM convencionalfantiguo (véanse, p.ej., el Ejemplo 5 y las Figuras 5A-5F). Por lo tanto, en ciertas realizaciones, se puede preferir el uso de polimixina B, anfotericina S, ácido nalidixico, trimetoprima y fosfomicina. Estos antibióticos se pueden usar en cantidades suficientes para inhibir el crecimiento de las bacterias contaminantes que pueden estar presentes en el medio de cultivo. Por ejemplo, el medio de cultivo puede contener una concentración final de alrededor de 400 unidades/mi a alrededor de 2000 unidades/mi de polimixina B, de alrededor de 50 IJg/ml a alrededor de 400 IJg/ml de anfotericina B, de alrededor de 100 IJg/ml a alrededor de 1000 IJg/ml de acido nalidíxico, de alrededor de 10 IJg/ml a alrededor de 100 IJg/ml de trimetoprima y de alrededor de 100 IJg/ml a alrededor de 1000 IJg/ml de fosfomicina. En una realización, como se discute adicionalmente en la presente memoria, estos agentes antimicrobianos pueden comprender un suplemento diferente que se puede añadir a un medio de cultivo base antes de la inoculación del medio de cultivo con una muestra para la que se puede desear la determinación de la presencia o ausencia de una micobacleria

El medio de cultivo discutido en la presente memoria puede comprender uno o más de Middlebrook 7H9, albúmina de suero bovino, a-cetoglutarato, caseína, catalasa, y/o agua. El medio de cultivo puede comprender ademas uno o más nutrientes y/o componentes adicionales conocidos para los expertos en la técnica por ser beneficiosos para el cultivo de micobacterias. Por ejemplo, el medio de cultivo puede comprender además uno o más carbohidratos o fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, minerales, sales, aminoacidos, vitaminas, purinas y pirimidinas, ácidos grasos y otros compuestos. El medio de cultivo puede comprender Middlebrook 7H9, glicerol, ácido esteárico (p.ej., estearato SÓdico), ácido mirística (o la sal del mismo), ácido palmítico (p.ej., palmitato SÓdico), ácido oleico (p.ej., oleato SÓdico), albúmina de suero bovino, caseína (p_ej., digestión pancreática de caseina), catalasa, piruvato sódico, a-cetoglutarato, amaranto yagua.

Además, el medio de cultivo puede comprender además uno o más agentes antimicrobianos (p.ej., fosfomicina) Por ejemplo, el medio de cultivo puede comprender además una mezcla de agentes antimicrobianos, seleccionados de uno o más de polimixina S, azlocilina, vancomicina, anfotericina S, acido nalidixico, trimetoprima y/o fosfomicina. El medio de cultivo puede comprender ademas una mezcla de antibióticos que comprende polimixina S, anfotericina S, ácido nalidíxico, trimetoprima y fosfomicina.

El medio de cultivo se puede ajustar a un pH de alrededor de 5,5 a alrededor de 7,5, un pH de alrededor de 6,0 a alrededor de 7,0, o un pH de alrededor de 6,5 a alrededor de 7,0. El medio de cultivo puede mejorar o reducir el tiempo de detección (TTD) del crecimiento micobacleriano en al menos alrededor de 0,5, al menos alrededor de 1, al menos alrededor de 2, al menos alrededor de 3, al menos alrededor de 5, o al menos alrededor de 7 días en comparación con el medio de cultivo micobacteriano convenciona1fantiguo.

Método para la Defección Mejorada de Micobacterias

En general, la presente invención también se dirige a un método para detectar el crecimiento de una o más micobacterias que pueden estar presentes en una muestra biológica . Las muestras que se pueden ensayar incluyen muestras tanto clínicas y como no clínicas, en las que se puede sospechar la presencia de una micobacteria. Las muestras clínicas que se pueden ensayar incluyen cualquier tipo de muestra ensayada en general en los laboratorios clinicos, que incluyen, pero sin limitación, sangre, esputo, aspirados, torundas y lavados de torundas, otros fluidos corporales, y similares. La muestra puede ser una muestra corporal estéril o una muestra clínica digeridadescontaminada. Las muestras no clínicas que se pueden ensayar también incluyen sustancias muy variables, que abarcan, pero sin limitación, productos alimenticios, bebidas, productos fannacéuticos, cosméticos, agua, aire, tierra, plantas, productos sanguíneos (lo que incluye plaquetas), muestras de órganos o tejidos de donantes, y similares.

En un aspecto, la presente invención se dirige a un método para el crecimiento y/o la detección mejorada de micobacterias que comprende añadir una muestra que se sospecha que contiene micobacterias a un medio de cultivo que contiene una cantidad eficaz de un aditivo que comprende a-cetoglutarato para proporcionar un medio de cultivo con una concentración final de 5 gIL a alrededor de 50 gIL de a--cetoglutarato, para mejorar el crecimiento de dichas micobaclerias y someler al medio de cultivo a condiciones adecuadas para el crecimiento de dichas micobacterias, lo que reduce el tiempo de detección del crecimiento de las micobacterias en al menos 2 días en comparación con un medio de cultivo que no contiene a-cetoglutarato. Se ha descubierto inesperadamente que mediante el uso de a-cetoglutarato, un precursor de a-cetoglutarato o un derivado de a-cetoglutarato en el medio de cultivo y el método de la presente invención, se puede reducir el tiempo de detección (nD) del crecimiento micobacteriano en al menos alrededor de 0,5 días, al menos alrededor de 1 día, al menos alrededor de 2 días, al menos alrededor de 3 días, al menos alrededor de 5 días, o al menos alrededor de 7 días antes que con el uso del

medio de cultivo convencional/antiguo (es decir, el medio de cultivo que no tiene a-cetoglutarato, un precursor y/o derivado de a-cetoglutarato). Como se muestra en el Ejemplo 2 y la Figura 2, el tiempo de detección (TT D) de las cepas de micobacterias en un medio de cultivo que contiene a-cetoglutarato se mejora o reduce en aproximadamente dos días en comparación con el no en un medio de cultivo que no contiene a-cetoglutarato.

La presente invención también se dirige a un método para el diagnóstico de una infección provocada por una especie de micobacleria, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo; (b) añadir un suplemento de nutrientes a dicho medio de cultivo, y dicho aditivo de suplemento de nutrientes comprende el sustrato de ruta metabólica a-cetoglutarato para proporcionar un medio de cultivo con una concentración final de 5 gIL a alrededor de 50 gIL de a-cetoglutarato; (c) añadir una muestra en la se va a determinar la presencia o ausencia de dicha especie de micobacleria; y (d) analizar en dicho cultivo la presencia de dicha especie de micobacleria, en el que un hallazgo de la presencia de dicha especie de micobacteria indica un diagnóstico positivo para dicha infección, y en el que dicho aditivo de a-cetoglutarato reduce el tiempo de detección del crecimiento de micobaclerias en al menos 2 días en comparación con un medio de cultivo que no contiene a-cetoglutarato. Como se discutió anteriormente en la presente memoria, el uso de a-cetoglutarato, un precursor de a-cetoglutarato y/o un derivado de a-cetoglutarato en el medio de cultivo y el método de la presente invención puede reducir el TTD en al menos alrededor de 0,5 días, al menos alrededor de 1 dia, al menos alrededor de 2 dias, al menos alrededor de 3 dias, al menos alrededor de 5 días, o en al menos alrededor de 7 días. De acuerdo con este método, el suplemento de nutrientes (SN) puede usar opcionalmente ASB sin acidos grasos, y comprende ademas uno o más acidos grasos de cadena larga (p.ej., acidos grasos que tienen 10 o más átomos de carbono). Se ha descubierto que el uso de ASB sin acidos grasos y uno o mas acidos grasos de cadena larga en el SN da como resultado una reducción sustancial de las lecturas de falsos positivos. Además, como se muestra en la presente memoria (véase el Ejemplo 1 y las Figuras 1A-1C), el uso de una ASB sin acidos grasos y la complementación del medio de cultivo con ácidos grasos de cadena larga dio como resultado una mejora en el tiempo de detección (TTD) de 2 a 2,5 días para el crecimiento y la detección de M. tuberculosis (véase la Figura 1A), M. intracellulare (véase la Figura 1B), y M. avium (véase la Figura 1C).

También se describe en la presente memoria un método para inhibir la contaminación bacteriana en un cultivo de micobacterias, y el método comprende cultivar una muestra que se sospecha que contiene micobacterias en un medio de cultivo que comprende fosfomicina en una cantidad suficiente para inhibir el crecimiento de las baclerias contaminantes en condiciones adecuadas para el crecimiento de dichas micobacterias. De acuerdo con este método, se pueden añadir uno o más agentes o sustancias antimicrobianas al medio de cultivo antes o de manera concurrente con la inoculación del medio de cultivo con la muestra biológica a ensayar. Posteriormente, se puede cultivar el medio de cultivo y la muestra durante un tiempo suficiente y a una temperatura suficiente para permitir el crecimiento y la detección de cualquier micobacteria que pueda estar presente en la muestra de ensayo. El o los antimicrobianos se pueden incluir en un suplemento antimicrobiano micobacleriano (SAM) que se puede añadir al medio de cultivo base antes o de manera concurrente con la inoculación del medio de cultivo con la muestra a ensayar. Como se describió anteriormente en la presente memoria, el SAM puede constar de uno o más de polimixina B, anfotericina B, ácido nalidíxico, trimetoprima, y fosfomicina

En otra realización, la presente invención se dirige a un método que emplea el uso de un kit de reactivos BacT/ALERr«' MP mejorado para el crecimiento y/o la detección de micobacterias que pueden estar presentes en una muestra biológica. De acuerdo con esta realización, como se describe con mas detalte en la presente memoria, el sistema de reaclivos BacT/ALERr«' MP mejorado incluira un frasco de cultivo MP mejorado que incluye un medio de cultivo base para el crecimiento de micobaclerias, un suplemento de nutrientes (SN) nuevo que comprende acetoglutarato y un suplemento antimicrobiano micobacleriano (SAM) nuevo, en el que dicho a-cetoglutarato del suplemento de nutrientes está a tal concentración que después de mezclar el suplemento de nutrientes y el suplemento antimicrobiano con el med io de cultivo base contenido en el frasco de cultivo, dicho ad itivo de 0cetoglutarato presente en el medio de cultivo está a una concentración final de 5 gIL a alrededor de 50 giL, Y en el que dicho aditivo de o-cetoglutarato reduce el tiempo de detección del crecimiento de micobacterias en al menos 2 dias en comparación con un medio de cultivo que no contiene a-cetoglutarato. El suplemento de nutrientes (SN) y/o suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM) se pueden añadir al medio de cultivo base del frasco antes, o de manera concurrente con la inoculación del medio de cultivo con la muestra biológica a ensayar en busca de la presencia de micobacterias. El frasco inoculado se cultivará durante un tiempo suficiente y a una temperatura suficiente para permitir el crecimiento y/o la detección de cualquier micobacteria que pueda estar presente en la muestra biológica. En una realización, el medio de cultivo del frasco de cultivo MP nuevo no incluirá ningún componente termolábil, y de ese modo permitirá que el frasco de cultivo MP nuevo sea autoclavable

Kit de Reactivos MP

En un aspecto, la presente invención se dirige a un kit de reactivos MP para el crecimiento y la detección mejorada de micobaclerias. El kit de reactivos MP incluirá un frasco de cultivo que tiene un medio de cultivo base de micobaclerias, un suplemento de nutrientes (SN) que comprende a-cetoglutarato, y un suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM), en el que dicho a-cetoglutarato del suplemento de nutrientes está a tal concentración que después de mezclar el suplemento de nutrientes y el suplemento anlimicrobiano con el medio de cultivo base contenido en el frasco de cultivo, dicho aditivo de a-cetoglutarato presente en el medio de cultivo esta a una concentración final de 5 gIL a alrededor de 50 gIL, yen el que dicho aditivo de a-cetoglutarato reduce el tiempo de

detección del crecimiento de micobaclerias en al menos 2 dias en comparación con un medio de cultivo que no contiene a-cetoglutarato

Frasco de Cultivo

En la presente memoria se describe un frasco o recipiente (es decir, un frasco de cultivo) que contiene un medio de cultivo de micobaclerias nuevo y mejorado. En general, el frasco de cultivo puede ser de cualquier diseño o tamaño conocido en la técnica, y puede comprender cualquier medio de cultivo conocido beneficioso para el crecimiento y/o la detección de micobacterias. El frasco de cultivo puede comprender caldo Middlebrook 7H9 y/o agua como medio de cultivo base. El frasco MP convenciona1fantiguo usa un medio de cultivo líquido con un pH de alrededor de 6,8 para el crecimiento y la detección de Mycobaclerium. De forma similar, el frasco de cultivo MP nuevo y mejorado tiene un medio de cultivo base líquido o caldo al que se puede añadir un suplemento de nutrientes nuevo y/o un suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM) nuevo. El medio de cultivo se puede ajustar a un pH de alrededor de 5,5 a alrededor de 7,5, un pH de alrededor de 6,0 a alrededor de 7,0, o un pH de alrededor de 6,5 a alrededor de 7,0. Opcionalmente, el medio de cultivo del frasco de cultivo MP tiene un pH de alrededor de 6,8.

Se ha descubierto sorprendentemente que eliminando ciertos nutrientes de crecimiento del frasco de medio de cultivo, que incluyen, por ejemplO, albúmina de suero bovino, catalasa de higado bovino y/o caseína, el frasco se puede esterilizar de manera terminal. Por ejemplo, eliminando los componentes termolabiles, el frasco se puede esterilizar en autoclave. Las mejoras relacionadas con la esterilización terminal del frasco incluyen el almacenamiento y envio mejorados. Por ejemplo, el frasco esterilizado de manera terminal (p.ej., frasco esterilizado en autoclave) se puede almacenar y enviar a temperatura ambiente, lo que da como resultado una reducción de costes considerable. El frasco esterilizado de manera terminal puede dar como resultado ademas una duración de almacenamiento mejorada y/o un nivel de esterilidad (SAL) incrementado

Suplemento de Nutrientes (SN)

En la presente memoria se describe un suplemento de nutrientes (SN) mejorado que se puede añadir al frasco de cultivo para mejorar el crecimiento y la detección de micobacterias. En general, el suplemento de nutrientes (SN) se añade a un frasco de cultivo que contiene un medio de cultivo base para el crecimiento de micobacterias, antes de la inoculación del frasco y del medio de cultivo con una muestra para la que se desea la detección de la presencia de una micobacleria.

El suplemento de nutrientes (SN) mejorado puede incluir cualquier nutriente o suplemento conocido beneficioso para el crecimiento de micobaclerias. Por ejemplo, el suplemento de nutrientes puede incluir una o más fuentes de carbono, fuentes de nitrógeno, carbohidratos, sales, nutrientes, proteinas, aminoácidos, ácidos grasos, y/u otros nutrientes conocidos para los expertos en la técnica.

En cier10s casos, el suplemento de nutrientes puede comprender además a-cetoglutarato, un precursor de acetoglutarato y/o un derivado de o-cetoglutarato. En general, se puede usar cualquier precursor o derivado de 0cetoglutarato conocido, que incluye, pero sin limitación, glutamato, isocitrato, oxalosuccinato, o mezclas de los mismos. El a-cetoglutarato, precursor(es) de a-cetoglutarato, y/o derivado(s) de a-cetoglutarato puede(n) estar presente(s) en el suplemento de nutrientes en una cantidad suficiente, de forma que tras la adición al medio de cultivo del frasco de cultivo, la concentración final de a-cetoglutarato, precursor de o-cetoglutaralo y/o derivado de 0celoglutarato sea de alrededor de 0,1 gIL a alrededor de 50 gIL.

El suplemento de nutrientes puede comprender además uno o mas acidos grasos de cadena larga saturada o insaturada, o sales de los mismos. Se puede preferir utilizar uno o mas ácidos grasos de cadena larga que tengan 10 o más átomos de carbono. En general, se puede usar cualquier ácido graso de cadena larga conocido, que incluye, pero sin limitación, ácido mirística, ácido palmítica, ácido esteárico, ácido oleica, ácido linoleico, y las sales de los mismos. A veces se puede preferir evitar el uso de acidos grasos de cadena corta, o media. Por ejemplo, se deberia evitar el uso de acidos grasos que tengan 8 o menos atamos de carbono (p.ej., ácido caprilico)

Como se mencionó anteriormente en la presente memoria, se puede preferir usar albúmina de suero bovino (ASB) sin acidos grasos en el suplemento de nutrientes descrito en la presente memoria. Como se mencionó previamente, el uso de ASB sin ácidos grasos puede reducir o eliminar sustancialmente los falsos positivos basados en el reactivo

El suplemento de nutrientes (SN) puede comprender glicol, uno o mas acidos grasos de cadena larga, albúmina de suero bovino (ASB) sin ácidos grasos, digestión pancreatica de caseína, piruvato sódico, amaranto y a-cetoglutarato El suplemento de nutrientes se puede añadir al frasco de cultivo junto con el medio de cultivo base, o se puede añadir al frasco de cultivo justo antes de la inoculación can una muestra de ensayo. De manera alternativa, el suplemento de nutrientes se puede usar para resuspender el suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM) y después añadirlo al frasco de medio de cultivo

Suplemento Antimicrobiano Micobacleriano (SAM)

También se describe en la presente memoria un suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM) mejorado que se

puede añadir al frasco de cultivo para mejorar el crecimiento y la detección de micobacterias. Se ha desarrollado un suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM) mejorado que aumenta el crecimiento de las micobacterias en cultivo. El SAM mejorado es eficaz para reducir o inhibir el crecimiento de la flora respiratoria contaminante (FRC) sin reducir o inhibir el crecimiento micobacteriano. La flora respiratoria contaminante (FRC) puede incluir, pero sin limitación, P. aeruginosa, S. aureus, C. albicans, E. faecalis, K. pneumoniae, S. maltophilia, C. tropicalis, S. aureus resistente a meticilina (SARM), E. faecalis resistente a vancomicina (ERV). El suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM) se puede añadir directamente a un frasco de cultivo que comprende un medio de cultivo base para el crecimiento de micobacterias, antes de la inoculación del frasco y del medio de cultivo con una muestra para la que se desea la detección de la presencia de una micobacteria. El suplemento de nutrientes (SN) se puede usar para resuspender el suplemento antimicrobiano (SAM), antes de añadirto al frasco de medio de cultivo

En general, se puede usar cualquier agente o sustancia antimicrobiana conocida, que incluye, pero sin limitación, antibióticos, bacteriostaticos, bactericidas, antibacterianos, antivirales, antifúngicos, antiprotozoarios ylo antiparasitarios. Sin embargo, los agentes antimicrobianos preferidos incluyen cualquier antimicrobiano que reduzca

o inhiba el crecimiento de la flora respiratoria contaminante (FRC) sin reducir o inhibir el crecimiento de las micobacterias. El SAM puede comprender uno o mas antimicrobianos en una cantidad suficiente para inhibir la contaminación bacteriana en dicho medio de cultivo

El medio de cultivo descrito en la presente memoria puede incluir uno o mas antibióticos Los antibióticos útiles incluyen, por ejemplo, los antibióticos que reducen o inhiben el crecimiento de la FRC, que incluyen, pero sin limitación, polimixina B (POLI B), vancomicina (VAN), azlocilina (AZL), anfotericina B (AMP B), acido nalidíxico (NA), trimetoprima (TMP) y fosfomicina (FOS). Los antibióticos usados para tratar las infecciones micobacterianas y que pueden destruir, reducir o inhibir el crecimiento de las micobacterias no son útiles en el suplemento antibiótico descrito en la presente memoria, e incluyen, por ejemplo, isoniazida, rifampina, pirazinamida, estreptomicina y etambutol. Como se discutió previamente en la presente memoria, el presente cesiona rio comercializa y vende un Suplemento Antimicrobiano MBIBac~ que es un suplemento liofilizado formulado para contener anfotericina B (0,0180% plv), azlocilina (0,0034% plv), ácido nalidixico (0,0400% plv), polimixina B (10.000 unidades), trimetoprima (0,00105% plv), Y vancomicina (0,0005%, p/v). Sin embargo, se ha descubierto inesperadamente que la fosfomicina se puede complementar con azlocilina y vancomicina para producir un suplemento antimicrobiano (SAM) que se puede usar para el crecimiento y la detección mejorada de micobacterias en cultivo, en comparación con el Suplemento Antimicrobiano MB/Bacr® convencional/antiguo.

Como tal, el suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM) mejorado comprende un suplemento liofilizado formulado para contener anfotericina B (AMP B), polimix:ina B (POLI B), trimetoprima (TMP), ácido nalidíxico (NA) y fosfomicina (FOS). El suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM) se puede formular de forma que el medio de cultivo final contendra una concentración final de alrededor de 400 unidades/mi a alrededor de 2000 unidades/mi de pOlimixina B, de alrededor de 50 IJglml a alrededor de 400 IJg/ml de anfotericina B, de alrededor de 100 IJglml a alrededor de 800 IJglml de ácido nalidíxico, de alrededor de 10 ¡..Iglml a alrededor de 100 IJglml de trimetoprima y de alrededor de 100 IJg/ml a alrededor de 1000 IJglml de fosfomicina

El suplemento de nutrientes (SN) y el suplemento antimicrobiano (SAM) pueden formar un kit diferente que se puede añadir después a un frasco de medio de cultivo esterilizado de manera terminal. En este caso, el kit de SN/SAM se puede comercializar y vender por separado como aditivo para el frasco BacTfALERT MP.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar adicionalmente las características de los medios y los métodos descritos en la presente memoria

Ejemplos

EJEMPLO 1. TTD de diversas cepas de micobacterias con y sin complementación de ácidos grasos

Para estudiar el efecto de los acidos grasos (AG) de cadena larga sobre el crecimiento de las micobacterias, se seleccionó ASB sin ácidos grasos (SAG) de Proliant, Inc. (Ames, lowa). Se identificaron cinco AG de cadena larga: acido mirístico (C14:0), ácido palmítico (C16:0), ácido estearico (C18:0), acido oleico (C18: 1), yacido linoleico (C18: 2) como posibles suplementos de AG basándose en el pertil de AG y el rendimiento del crecimiento. Se preparó una fonnulación nueva de suplemento con ASB SAG y se ensayó con y sin los cinco AG (véase la Tabla 1 para la fonnulación nueva de suplemento). Los niveles objetivo de la complementación de AG se basaron en el contenido de AG obtenido de las determinaciones previas. La concentración de ASB SAG usada fue 10 gIL. La pérdida de AG durante la filtración del suplemento nuevo se determinó mediante análisis de éster metílico de ácidos grasos (EMAG). Se observó que la recuperación de AG fue >80% tras la filtración con un filtro de 0,45 IJm. El analisis de esta formulación demostró que los niveles mayores de ASB mejoraron la solubilización y la estabilidad de AG mediante la unión ASB-AG (datos no mostrados). El análisis también demostró que cuanto menor fue el contenido de ASB, menor fue la unión de AG, lo que dio como resultado una pérdida mayor de AG durante la filtración

Se ideó un frasco de cultivo nuevo autoclavable transfiriendo los componentes termolábiles del medio de cultivo presente en el frasco convencional o antiguo al FR convencional/antiguo. El frasco de cultivo nuevo autoclavable comprendió Middlebrook 7H9. El suplemento de FR nuevo se preparó mediante el uso de la compOSición de FR

convencional o antiguo, pero modificandola para acomodar los componentes termolábiles transferidos desde la fonnulación del frasco MP antiguo. La Tabla 1 siguiente muestra la composición de un frasco MP nuevo autoclavable (como se describió anteriormente en la presente memoria) y un suplemento nuevo. El ASB usado en este suplemento nuevo fue ASB sin ácidos grasos (SAG) (Proliant Inc., Ames, lowa) en vez del ASB convencional usado en el FR convencional/antiguo

Tabla 1 -Frasco MP nuevo y formulaciones nuevas de suplemento

Frasco MP Nuevo

FR Modificado o Suplemento Nuevo

Frasco de Cultivo MP

Fluido de Reconstitución

Materia Prima

g iL Materia Prima giL

Middlebrook 7H9

4,7 Albúmina de Suero Bovino 210

Digestión pancreática de Caseína

20

Catalasa de Hígado Bovino

0,86

Glicerol

50

Ácido oleico

0,475

Piruvato sódico

20

Amaranto

0,04

Para el rendimiento del crecimiento, se ensayaron cinco organismos (M tuberculosis, M avium, y M intracellulare) Se usó la formulación de SAM convencional para estos experimentos. Se usó el suplemento nuevo con/sin

10 complementación con AG y FR convencionalfantiguo para rehidratar un polvo liofilizado del suplemento antibiótico MB BacT convencional o antiguo (SAM convencional/antiguo) (bioMérieux, Inc.). El SAM convencional/antiguo contuvo 1000 unidadesfml de polimixina B (POLI B), 180 IJgfml de anfotericina B (AMP B), 400 IJglml de ácido nalidíxico (NA), 10,5¡.Jg/ml de trimetoprima (TMP), 34¡.Jglml de Azlocilina (AZL) y 5¡.Jgfml de Vancomicina (VAN)

Para el suplemento nuevo, se usó el frasco BacTfALERr4' MP nuevo autoclavable (como se describió anterionnente

15 en la presente memoria), y para el FR convencional/antiguo se usó el frasco MP convencional/antiguo. Antes de la inoculación de los frascos de cultivo MP nuevos y convencionales/antiguos (bioMérieux, Inc.) con cultivos de micobacterias, se añadieron 0,5 mi de suplemento nuevo confsin AG o 0,5 mi de FR convencionalfantiguo a un grupo de frascos de cu ltivo BacT/ALER~MP. El SAM convencional rehidratado (con el uso del suplemento nuevo con/sin AG y FR convencional/antiguo) se añadió al segundo grupo de frascos de cultivo MP. El crecimiento (como

20 nD del crecimiento) se comparó en estos frascos para los cultivos de Mycobacterium avium, Mycobacterium intraceflulare y Mycobacterium tuberculosis tras inocularlos con aproximadamente 0,5x103 UFCfml. También se llevaron a cabo recuentos de colonias mediante el uso de placas de agar Middlebrook 7H10 para verificar los niveles de los inóculos y la pureza de los cultivos. Los frascos MP inoculados se cargaron en un sistema BacT/ALERI" 3D (bioMérieux, Inc.) a 35-37 oC sin balanceo durante 35 días. Los datos del tiempo de detección (TTD) se recogieron

25 cuando el instrumento BacTfALERr4' declaró los frascos positivos. Los resultados se muestran en la Tabla 2 y en las Figuras 1A-1C

Tabla 2 -Resultados de TTD para M tuberculosis, M intracellulare y M. avium

Organismo

Suplemento ASS Ácidos Grasos TID Med. TID Desv. Est. TID Min. TID Max. N° de Positivos N' Ensayado

M. avium 25291

Medio solo Convencional SinAG 15,1 0 ,7 14,3 16,0 5 5

SAG

AG SinAG 15,3 17,0 0 ,5 0 ,6 14,8 16,2 15,8 17 ,7 5 5 5 5

Medio+ SAM

Convencional SinAG 18,1 0 ,9 16,7 19,0 5 5

SAG

AG SinAG 16,8 21 ,0 0 ,9 D, 8 15,8 20,3 17,7 22 ,0 5 5 5 5

M. infracellulare 13950

Medio solo Convencional SinAG 8,3 0 ,3 7,8 8,7 5 5

SAG

AG SinAG 7,9 12,5 0 ,3 0 ,5 7,5 11 ,7 8,2 12,8 5 5 5 5

Medio+ SAM

Convencional SinAG 18,7 2,7 16,0 22,5 5 5

12

Organismo

Suplemento AS. Ácidos TIO TIO TIO TIO Wde N'

Grasos

Med. Desv. Es\. Min. Max. Positivos Ensayado

SAG

AG 13,8 1,4 11.5 16,0 10 10

SinAG

24 .8 6,1 17.3 33.5 10 10

Medio solo

Convencional SinAG 19,3 O,, 18.7 19.7 5 5

SAG

AG 18,7 0,8 17.7 19,5 5 5

MTB 25177

SinAG 19,9 0,5 19,3 20,3 5 5

Medio+ SAM

Convencional SinAG 25,6 , ,O 20.2 31 ,S 5 5

SAG

AG 23,4 0,6 22.3 23,8 5 5

SinAG

27,6 1,8 25,8 30,0 5 5

La Figura 1A muestra los resultados de TTD para Mycobacterium tuberculosis en los cultivos que contenían ASB sin AG (SAG) con y sin complementación de ácidos grasos de cadena larga. Como se muestra en la Figura 1A, se observó una reducción en el TTO en las muestras que contenian ASB sin AG complementado con AGs en comparación con las muestras que contenían ASB sin complementación con AG

La Figura 1 B muestra los resultados de TTO para Mycobacterium intracelfulare en los cultivos que contenian ASB sin AG (SAG) con y sin complementación de acidos grasos de cadena larga. Como se muestra en la Figura 1 S, se observó una reducción en el TTO en las muestras que contenían ASB sin AG complementado con AGs en comparación con las muestras que contenian ASB sin complementación con AG.

La Figura 1C muestra los resultados de TTO para Mycobacterium avium en los cultivos que contenían ASB sin AG (SAG) con y sin complementación de ácidos grasos de cadena larga. Como se muestra en la Figura 1C, se observó una reducción en el TTO en las muestras que contenian ASB sin AG complementado con AGs en comparación con las muestras que contenian ASB sin complementación con AG.

Los resultados demostraron una mejora en el TTO de M. tuberculosis, M. intracellulare, y M. avium de 2 a 2,5 días en presencia del suplemento antimicrobiano micobacteriano (SAM) y del suplemento de nutrientes (SN) nuevo. Como se discutió anteriormente en la presente memoria, el SN nuevo comprende ASB sin <'.leidos grasos y complementado con ácidos grasos de cadena larga.

EJEMPLO 2. TTO de cepas de micobacterias con y sin o-cetoglutarato

Para mejorar adicionalmente el TTD de las micobacterias, se seleccionaron sustratos y/o cofactores de enzimas productoras de C02 de las rutas de las células micobacterianas para su estudio adicional, lo que incluye 0cetoglutarato, isocitrato, L-malato, ácido oxalacético, lactato y L-arginina. Se preparó el suplemento nuevo con AG y se esterilizó mediante filtración como se explicó anteriormente Los sustratos se añadieron a diferentes concentraciones en el suplemento nuevo

Se ensayaron cuatro especies de micobaclerias a O,5x103 UFC/mL Se estudió el efecto de diferentes concentraciones de a-cetoglutarato sobre el crecimiento (como TTO del crecimiento) de cultivos de Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare y Mycobacterium tuberculosis. Se usó un frasco de cultivo BacTIALER~MP nuevo autoclavable (como se describió anteriormente en la presente memoria). Antes de la inoculación de los frascos de cultivo MP con los cultivos de micobacterias, se añadieron 0,5 mi de suplemento nuevo con diversas cantidades de o-cetoglutarato a los frascos de cultivo BacTIALER~ MP nuevos. También se llevaron a cabo recuentos de colonias mediante el uso de placas de agar Middlebrook 7H10 para verificar los niveles de los inóculos y la pureza de los cultivos. Los frascos MP inoculados se cargaron a 35-37 oC en un sistema BacTIALER~3D sin balanceo durante 35 días. Los datos del tiempo de detección (TTO) se recogieron cuando el instrumento BacTIALER~declaró los frascos positivos.

Los resultados para el TTO de las especies de micobacterias clave con la inclusión de dos concentraciones de 0cetoglutarato de 5 y 15 gIL se presentan en la Tabla 3 y la Figura 2. La Tabla 3 y la Figura 2 muestran que la adición de a-cetoglutarato (5 gIL o 15 gIL) a un medio de cultivo dio como resultado una reducción aproximada de dos dias en el tiempo de detección (TTO) del crecimiento en cultivos de Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare y Mycobacterium tuberculosis en comparación con un medio de cultivo que no contenía a-cetoglutarato.

Se llevaron a cabo experimentos similares mediante el uso de diferentes concentraciones de isocitrato, L-malato, <'.leido oxalacético, lactato y L-arginina, sin embargo, a diferencia de o-cetoglutarato, estos otros sustratos no mostraron una reducción en el TTO (datos no mostrados)

Tabla 3 -TTO de especies de micobacterias con y sin a-cetoglutarato

Organismo

Sustrato TIO Med. TIO Oesv. Est. HO Min. TIO Máx. N° de positivos N' ensayado

M. avium 25291

Sin a-ceto glutarato 15,6 0,2 15,5 15,8 3 3

a-ceto glutarato-5 9

13,8 1,1 12,7 14,8 3 3

a-ceto glutarato-15 9

13,5 1,3 12,2 14,8 3 3

M. intracellulare 13950

Sin a-ceto glutarato 11 ,6 1,3 10,7 13,0 3 3

a-ceto glutarato-5 9

9,0 0 ,3 8,7 9 ,2 3 3

a-ceto glutarato-15 9

8,8 0,4 8,5 9,2 3 3

MTB 27294

Sin a-ceto glutarato 15,7 0 ,8 14,8 16,2 3 3

a-ceto glutarato-5 9

14,3 0,8 13,8 15,2 3 3

a-ceto glutarato-15 9

13,9 0,2 13,7 14,0 3 3

EJEMPLO 3. TTO de especies de micobacterias con SAM convencional

La eficacia del SAM convencional hacia el crecimiento de micobaclerias se determinó estudiando el efecto de seis

5 fármacos que incluían polimixina B (POLI B), anfotericina B (AMP B), ácido nalidíxico (NA), trimetoprima (TMP), Azlocilina (AZL) y Vancomicina (VAN). Estos estudios se llevaron a cabo también para identificar los fármacos y las concentraciones que tuvieron efeclos adversos sobre el crecimiento de las micobacterias.

Para el rendimiento del crecimiento, se preparó FR convencional/antiguo, y se añadieron diferentes concentraciones de seis antimicrobianos. Las concentraciones se seleccionaron como niveles 25-50% menores o mayores que las

10 concentraciones del SAM convencional que son 1000 unidades/mi de polimixina B (POLI B), 180 fJg/ml de anfotericina B (AMP B), 400 fJglml de ácido nalidíxico (NA), 10,5 fJg/mi de trimetoprima (TMP), 34 fJg/ml de Azlocilina (AZL) y 5 ~g/ml de Vancomicina (VAN)

Se determinó el crecimiento (como TTO del crecimiento) para Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium scrofulaceum, y Mycobacterium tuberculosis mediante el uso de azlocilina en el medio de cultivo.

15 También se estudió la inhibición de gram-positivos, gram-negativos y levaduras que podrían estar presentes en una muestra de esputo (denominada flora respiratoria contaminante, o FRC) en paralelo con las mismas formulaciones (datos no mostrados)

Para este estudio, se usó la formulación MP convencional o antigua (bioMérieux, Inc.). Antes de la inoculación de los frascos de cultivo MP con micobaclerias u otros cultivos bacterianos/de levaduras, se añadieron 0,5 mi de FR 20 convencional/antiguo con diferentes fármacos a los frascos de cultivo BacT/ALER~ MP convencionales (bioMérieux, Inc.). También se llevaron a cabo recuentos de colonias mediante el uso de placas de agar MiddJebrook 7H10 o agar-sangre de oveja o agar-triptona de soja para verificar los niveles del inóculo y la pureza de los cultivos. Los frascos MP inoculados se cargaron a 35-37 oC en un sistema BacT/ALER~30 (bioMérieux, Inc.) sin balanceo durante 35 días para los cultivos de micobacterias y hasta 15 días para otros cultivos. Los datos del tiempo de

25 detección (nO) se recogieron cuando el instrumento BacT/ALERT declaró los frascos positivos. Los resultados se muestran en las Tablas 4-5 y las Figuras 3-4

Como se muestra en la Tabla 4 y la Figura 3, el uso de azlocilina en un medio de cultivo tuvo un efecto negativo sobre el crecimiento (como se determinó mediante el no del crecimiento) de Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium kansasii, Mycobacterium scrofulaceum, y Mycobacterium tuberculosis, en comparación con un medio

30 de cultivo que no contuvo agentes antimicrobianos

Se determinó el crecimiento (como TTO del crecimiento) para Mycobacterium kansasii, Mycobacterium scrofulaceum, y Mycobacterium tuberculosis mediante el uso de vancomicina en el medio de cultivo

Como se muestra en la Tabla 5 y la Figura 4, el uso de vancomicina en un medio de cultivo tuvo un efecto negativo sobre el crecimiento (como se determinó mediante el TTO del crecimiento) de Mycobacterium kansasii,

35 Mycobacterium scrofulaceum, y Mycobacterium tuberculosis, en comparación con un medio de cultivo que no contuvo agentes antimicrobianos.

El uso de otros fármacos en un medio de cultivo no tuvo ningún impacto adverso sobre el crecimiento de las micobacterias (datos no mostrados) incluso a las concentraciones superiores ensayadas. Las concentraciones superiores de los fármacos fueron capaces de inhibir la mayoría de FRC durante 10-15 días, con algunas

40 excepCiones de gram-negativos (datos no mostrados).

Tabla 4 -TTD de especies de micobaclerias en presencia de Azlocilina (AZL)

Organismo

Suplemento TIO Medio HO Desv. Est. TIO Min. HO Máx. N° de Positivos N' Ensayado

M. avium 25291

Medio+ AZL 12 20,1 2,2 17,8 22,8 4,0 4,0

Medio+ AZL 24

22 ,2 1,8 20 ,7 24 ,3 4,0 4,0

Medio+ AZL 48

21 ,2 1,6 19,8 23,0 4,0 4,0

Medio-Sin farm .

18,6 0,9 17,7 19,5 3,0 3,0

M. fortuitum 6841

Medio+ AZL 12 4,0 0,2 3,8 4,2 4,0 4,0

Medio+ AZL 24

4,2 0,3 3,8 4,5 4,0 4,0

Medio+ AZL 48

4,1 0,2 3,8 4,3 4,0 4,0

Medio-Sin farm

3,8 0,3 3,5 4,0 3,0 3,0

M. intracellulare 13950

Medio+ AZL 12 16,4 1,1 15,3 18,0 4,0 4,0

Medio+ AZL 24

19,8 4,7 16,8 26 ,8 4,0 4,0

Medio+ AZL 48

20,0 1,1 19,2 20 ,8 2,0 4,0

Medio-Sin farm

8,5 0,2 8,3 8,7 3,0 3,0

M. kansasií 12478

Medio+ AZL 12 18,5 1,1 17,7 19,7 3,0 4,0

Medio+ AZL 24

18,9 1,8 16,5 20,5 4,0 4,0

Medio+ AZL 48

20,5 #DIVfO! 20 ,5 20 ,5 1,0 4,0

Medio-Sin fárm

14,8 1,8 13,0 16,5 3,0 3,0

M. scrofulaceum 19981

Medio+ AZL 12 24 ,2 0,2 24,0 24,3 2,0 4,0

Medio+ AZL 24

4,0

Medio+ AZL 48

21 ,7 #DIVfO! 21 ,7 21 ,7 1,0 3,0

Medio-Sin farm .

15,4 0,5 15,0 16,0 3,0 3,0

M. tuberculosis 27294

Medio+ AZL 12 15,4 0,8 14,7 16,5 4,0 4,0

Medio+ AZL 24

16,0 0,9 15,3 17,3 4,0 4,0

Medio+ AZL 48

15,4 0,5 14,7 15,8 4,0 4,0

Medio-Sin farm .

15,5 0,8 14,7 16,2 3,0 3,0

M. tuberculosis 25177

Medio+ AZL 12 22,4 3,7 17,0 24 ,8 4,0 4,0

Medio+ AZL 24

23,8 4,2 20 ,8 26 ,8 2,0 4,0

Medio+ AZL 48

24 ,8 0,1 24,7 24,8 2,0 4,0

Medio-Sin farm

23,6 1,3 22,2 24,8 3,0 3,0

Tabla 5 -TTD de especies de micobacterias en presencia de Vancomicina (VAN)

Organismo

Suplemento TTD Medio TIO Desv. Est. HO Min. HD Máx. N° de Positivos N' Ensayado

M. avium 25291

Medio+VAN 1,75 Medio+VAN 3,5 Medio+VAN 7 Medio-Sin fá rm. 20 ,6 21 ,2 20,6 19,4 2,2 1,6 2,0 0,4 18,5 19,8 18,3 19,0 22,8 22,7 23,2 19,8 3,0 4,0 4,0 3,0 4,0 4,0 4,0 3,0

M. fortuitum 6841

Medio+VAN 1,75 Medio+VAN 3,5 4,7 4,1 0,3 0,3 4,5 3,7 5,2 4,5 4,0 4,0 4,0 4,0

Organismo

Suplemento TTD Medio TTD Oesv_ Es! TTD Min TTD Max_ N° de Positivos N' Ensayado

Medio+VAN 7 Medio-Sin fárm.

4,8 4,2 0 ,5 0 ,3 4,3 4,0 5,3 4,5 4,0 3,0 4,0 3 ,0

M. intracellulare 13950

Medio+VAN 1,75 9,4 0 ,1 9,2 9,5 4,0 4,0

Medio+VAN 3,5

9,7 0,3 9,5 10,2 4,0 4,0

Medio+VAN 7 Medio-Sin fá rm.

10,3 9 ,3 0 ,7 0 ,2 9,7 9,2 11 ,2 9,5 4,0 3,0 4,0 3 ,0

M. kansasii 12478

Medio+VAN 1,75 17,7 0,8 17,0 18,8 4,0 4,0

Medio+VAN 3,5

21 ,5 0,4 21 ,2 21 ,8 2,0 4,0

Medio+VAN 7 Medio-Sin fárm

16,5 0,2 16,3 16,7 3,0 4,0 3,0

M. scrofulaceum 19981

Medio+VAN 1,75 14,2 1,0 12,8 15,3 4,0 4,0

Medio+VAN 3,5

14,0 1,2 12,2 15,0 4,0 4,0

Medio+VAN 7 Medio-Sin fá rm.

15,3 13,9 -0 ,8 15,3 13,2 15,3 14,8 1,0 3 ,0 1,0 3,0

MTe 25177

Medio+VAN 1,75 23,7 0,9 23,0 24,3 2,0 4,0

Medio+VAN 3,5 Medio+VAN 7

4,0 4,0

Medio-Sin fánn

22,6 0,8 21 ,8 23,3 3,0

MTe 27294

Medio+VAN 1,75 16,3 0,7 15,3 16,8 4,0 4,0

Medio+VAN 3,5

16,0 0,6 15,5 16,8 4,0 4,0

Medio+VAN 7 Medio-Sin fárm

18,3 15,4 0 ,9 1,1 17,2 14,7 19,0 16,7 4,0 3,0 4,0 3,0

EJEMPLO 4. TTD de diversas especies de micobacterias con diversas formulaciones de SAM

Para mejorar et no de micobaclerias, se cribaron diversos fármacos por su capacidad de inhibir ta flora respiratoria contaminante (FRC). A partir de estas determinaciones, se consideró que la fosfomicina fue la mejor elección para la 5 inhibición de la FRC

Se llevó a cabo un estudio para determinar la mejor formulación posible para un cóclel de SAM nuevo, se ensayaron diversas formulaciones que contenían diferentes concentraciones de TMP, NA, FOS Y POLI B_ Se evaluaron las siguientes fórmulas· (1) SN· Frasco nuevo + Suplemento de Nutrientes (SN); (2) FR" Frasco MP convencionallantiguo + Fluido de Recon. convencional/antiguo; (3) Fórmula 1 SN + TMP (30 119/ml), NA (600 119/ml), 10 POLI B (1250 unidades/mI), FOS (600 I1g/ml), Amp B (180 I1g/ml-PI o IFU); (4) Fónnula 2: SN + TMP (30 I1g/ml), NA (400 l1g1ml-PI o IFU), POLI B (1250 unidadesfml), FOS (600 I1gfml), Amp B (180 l1g1ml-PI o IFU); (5) Fórmula 3: SN + TMP (30 I1gfml ), NA (400 I1gfml-PI o IFU), POLI e (1500 unidadesfml), FOS (600 I1gfml), Amp e (180 I1gfml-PI o IFU); (6) Fónnula 4: SN + TMP (30 I1gfml), NA (600 I1g/ml), POLI e (1250 unidadesfml), FOS (600 I1gfml ), Amp e (180 I1gfml-PI o IFU); y (7) Fórmula 5: SN + TMP (50 I1gfml), NA (400 l1g1ml-PI o IFU), POLI B (1250 unidadesfml),

15 FOS (600 l1g1ml), Amp e (180 I1gfml-PI o IFU); En los que TMP es trimetoprima, NA es acido nalidixico, POLI e es potimixina e, FOS es fosfomicina, y Amp e es anfotericina e

El suplemento nuevo que contenía ASe sin ácidos grasos (SAG), 5 ácidos grasos de cadena larga ya-cetoglutarato, denominado suplemento de nutrientes (SN), se preparó y se esterilizó mediante filtración como se explicó previamente_Se usó el frasco de cultivo MP nuevo autoclavable (como se describió anteriormente en la presente

20 memoria) para este estudio. La Tabla 6 muestra la composición del frasco de cultivo MP nuevo y del suplemento de nutrientes (SN).

Tabla 6 -Frasco de cultivo nuevo y formulaciones nuevas de suplemento de nutrientes

Frasco de cultivo BacTfALERT MP nuevo

Suplemento de Nutrientes (SN)

Frasco de Cultivo MP

Descripción del Material Cantidad por litro

Materia Prima

giL Glicerol 50g

Middlebrook

4,7 Estearato Sódico nO 1 0,113g

Sal Sódica de Ácido Mirística nO 2

0,167 g

Palmitato Sódico nO 3

0,088 g

Olealo Sódico nO 4

0,113g

Ácido Linoleico Sodio nO 5

0,111 g

Albúmina de Suero Bovino (ASB)

210 g

Catalasa

0,064 g

Digestión pancreática de Caseína

20g

Piruvato Sódico

20g

Amaranlo

0,04 g

a-Ceto-glutarato

5g

Para el SN nuevo, se usó un frasco 8acTfALERT* MP esterilizado en autoclave o nuevo (como se describió anteriormente en la presente memoria), y para el FR convencional/antiguo, se usó un frasco MP 5 convencional/antiguo (bioMérieux, Inc.). Antes de la inoculación de los frascos de cultivo MP antiguos o nuevos con micobacterias u otros cultivos baclerianosfde levaduras, se añadieron 0,5 mi del suplemento de nutrientes (SN nuevo) o 0,5 mi de FR convencional/antiguo con diferentes fármacos a un grupo de los frascos de cultivo 8acT/ALERT* MP. Las fórmulas del SAM convencional (con el uso de FR convencionalfantiguo) y del SAM nuevo (con el uso de SN) se añadieron al segundo grupo de frascos de cultivo MP. El experimento se llevó a cabo con 10 especies de micobacterias a 0,5x103 UFCfml y cultivos de FRC a 0,5x105 UFC/ml. También se llevaron a cabo recuentos de colonias mediante el uso de placas de agar Middlebrook 7H10 o agar-sangre de oveja o agar-lriptona de soja para verificar los niveles del inóculo y la pureza de los cultivos. Los frascos MP inoculados se cargaron a 3537 oC en un sistema BacT/ALERT* 3D (bioMérieux, Inc.) sin balanceo durante 35 días para los cultivos de micobacterias y hasta 15 dias para otros cultivos. Los datos del tiempo de detección (nO) se recogieron cuando el

15 instrumento BacT/ALERT* declaró los frascos positivos. Los resultados se muestran en la Tabla 7 yen las Figuras 5A-5F.

Todas las fórmulas nuevas de SAM consiguieron una mejor inhibición de las bacterias gram-negativas en comparación con el SAM convencionalfantiguo. Hubo un crecimiento intercurrente de especies de estafilococos y enterococos con las fórmulas nuevas en comparación con el SAM convencional/antiguo

20 La Tabla 7 y la Figura 5A muestran el no de M. tuberculosis 18283 con diversas formulaciones de SAM. Las 5 formulaciones nuevas mostraron una mejora en el no en comparación con la formulación convencional/antigua para el SAM. La mejora en el no para M. tuberculosis 18283 con la formulación nueva de SAM fue de aproximadamente 6-8 días

La Tabla 7 y la Figura 58 muestran el no de M tuberculosis 27294 con diversas formulaciones de SAM. Las 5

25 formulaciones nuevas mostraron una mejora en el no en comparación con la formulación convencional/antigua para el SAM. La mejora en el no para M. tuberculosis 27294 con la formulación nueva de SAM fue de aproximadamente 3-4 días.

La Tabla 7 y la Figura 5C muestran el no de M. avium 569 con diversas formulaciones de SAM. Las 5 formulaciones nuevas mostraron una mejora en el no en comparación con la formulación convencional/antigua

30 para el SAM. La mejora en el TTO para M. avium 569 con la formulación nueva de SAM fue de aproximadamente 67 días.

La Tabla 7 y la Figura 50 muestran el no de M. inlracellulare 13950 con diversas formulaciones de SAM. Las 5 formulaciones nuevas mostraron una mejora en el no en comparación con la formulación convencional/antigua para el SAM. La mejora en el TTO para M. infracellulare 13950 con la formulación nueva de SAM fue de

35 aproximadamente 8-9 días.

La Tabla 7 y la Figura SE muestran el TTO de M. scrofulaceum 19981 con diversas formulaciones de SAM Las 5

fonnulaciones nuevas mostraron una mejora en el nD en comparación con la fonnulación convencional/antigua para el SAM. La mejora en el lTD para M scrofulaceum 19981 con la formulación nueva de SAM fue de aproximadamente 6-7 días. En particular, 2 de las 5 muestras ensayadas para M scrofulaceum 19981 no mostraron crecimiento con la formulación de SAM convencional/antiguo.

5 La Tabla 7 y la Figura 5F muestran el nD de M kansasii 12478 con diversas formulaciones de SAM. Las 5 formulaciones nuevas mostraron una mejora en el nD en comparación con la formulación convencional/antigua para el SAM. La detección en el lTD para M. kansasii 12478 fue de aproximadamente 13-14 días con el SAM nuevo en comparación con la ausencia de crecimiento detectada con la formulación de SAM convencional/antiguo

Tabla 7 -lTD de diversas especies

Organismo

FR Suplemento no Med io no Desv. Est TTO Min TTO Max. N° de Positivos N' Ensayado

M 8vium 569

1 SN-sin farmacos 9 ,2 0,5 8,7 9,7 3,0 3,0

3_

SN+Fórmula 1 9 ,0 0,6 8,5 10,0 5,0 5,0

SN+Fórmula 2

9,3 0,6 8,8 10,3 5,0 5,0

5

SN+Fórmula 3 8,_ 0,3 8,0 8,7 5,0 5,0

6

SN+Fórmula 4 8 ,5 0,2 8,3 8,8 5,0 5,0

7

SN+Fórmula 5 9,2 0,3 8,7 9,5 5,0 5,0

8

FR-sin farmacos 9,_ 0,_ 9,0 9,7 3,0 3,0

9

FR+SAM ant 14,6 0,_ 14,3 15,0 3,0 3,0

M intracellulare 13950

1 SN-sin fármacos 9 ,2 0,1 9,2 9,3 3,0 3,0

3_

SN+Fórmula 1 9,5 0,3 9,0 9,7 5,0 5,0

SN+Fórmula 2

9,4 0,1 9,3 9,5 5,0 5,0

5

SN+Fórmula 3 9,4 0,3 9,0 9,7 5,0 5,0

6

SN+Fórmula 4 10,0 0,2 9,7 10,3 5,0 5,0

7

SN+Fórmula 5 9 ,2 0,2 9,0 9,5 5,0 5,0

8

FR-sin farmacos 8,1 0,1 8,0 8,2 3,0 3,0

9

FR+SAM ant. 17,2 1,3 15,8 18,2 3,0 3,0

M kansasii 12478

1 SN-sin fármacos 12,3 0,6 11 ,7 12,8 3,0 3,0

3_

SN+Fórmula 1 13,7 0,3 13,3 14,2 5,0 5,0

SN+Fórmula 2

13,4 0,7 12,7 14,3 5,0 5,0

5

SN+Fórmula 3 13,4 0,5 13,0 14,2 5,0 5,0

6

SN+Fórmula 4 13,9 0,6 13,2 14,8 5,0 5,0

7

SN+Fórmula 5 14,0 0,8 13,0 15,3 5,0 5,0

8

FR-sin fármacos 17,3 0,5 16,7 17,7 3,0 3,0

9

FR+SAM ant 3,0

M. scrofulaceum 19981

1 SN-sin fármacos 12,3 0,4 12,0 12,7 3,0 3,0

3_

SN+Fórmula 1 11 ,0 0,5 10,3 11 ,5 5,0 5,0

SN+Fórmula 2

11 ,1 0,1 11 ,0 11 ,3 5,0 5,0

5

SN+Fórmula 3 11,1 0,3 10 ,5 11,3 5,0 5,0

6

SN+Fórmula 4 11 ,3 0,2 11 ,2 11 ,5 5,0 5,0

7

SN+Fórmula 5 10,8 0,3 10,5 11 ,2 5,0 5,0

8

FR-sin farmacos 12,3 0,2 12,2 12,5 3,0 3,0

9

FR+SAM ant. 17,5 1,1 16,7 18,3 2,0 3,0

Organismo

FR Suplemenlo no Medio no Oesv. Est TTO Min TTO Max N° de Positivos N' Ensayado

MTB 18283

1 SN-sin fármacos 9,3 0,1 9,2 9,3 3,0 3,0

3

SN+Fórmula 1 10,1 0,9 9,2 11 ,3 5,0 5,0

4

SN+Fórmula 2 9,5 0,4 9,0 10,0 5,0 5,0

5

SN+Fórmula 3 9,7 0,3 9,5 10,3 5,0 5,0

6

SN+Fórmula 4 10,8 0,3 10,5 11 ,2 5,0 5,0

7

SN+Fórmula 5 10,1 0,6 9,5 10,8 5,0 5,0

8

FR-sin farmacos 11 ,3 0,5 10,8 11,7 3,0 3,0

9

FR+SAM anl 17,5 0,9 16,5 18,2 3,0 3,0

MTB 27294

1 SN-sin fánnacos 13,6 0,6 13,3 14,3 3,0 3,0

3

SN+Fórmula 1 12,9 0,1 12,8 13,0 5,0 5,0

4

SN+Fórmula 2 13,1 0,3 12,7 13,5 5,0 5,0

5

SN+Fórmula 3 13,0 0,3 12,8 13,5 5,0 5,0

6

SN+Fórmula 4 13,2 0,4 12,7 13,7 5,0 5,0

7

SN+Fórmula 5 12,5 0,3 12,2 13,0 5,0 5,0

8

FR-sin farmacos 12,6 0,_ 12,2 13,0 3,0 3,0

9

FR+SAM anl. 14,8 0,8 14,0 15,5 3,0 3,0

EJEMPLO 5. Comparación de la formulación anterior de SAM frente a la formulación nueva de SAM para el no del crecimienlo del complejo M tuberculosis

Se seleccionó la fórmula del frasco MP nuevo y del suplemenlo de nutrientes y la fórmula 5 del SAM nuevo para los

5 ensayos ad icionales. Este estudio se llevó a cabo con cepas del complejo M tuberculosis que incluyen Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium microti, y Mycobacterium tuberculosis. La composición de la fórmula 5 fue: SN + TMP (50 IJg/ml), NA (400 IJg/ml-PI o IFU), POLI B (1250 unidades/mI), FOS (SOO IJg/ml), Amp B (180 IJg/ml-PI o IFU).

Para las fórmulas nuevas de SAM y SN , se usó un frasco BacT/ALER~MP nuevo, esterilizado en autoclave (como

10 se describió anleriormenle en la presente memoria), y para FR convencional/antiguo, se usó un frasco MP convencional/antiguo (l:>ioMérieux, Inc.). Antes de la inoculación de los frascos de cultivo MP antiguos o nuevos con cultivos de micobaclerias, se añadieron 0,5 mI del suplemento de nutrientes (SN nuevo) o 0,5 mi de FR convencional/antiguo con diferentes fármacos a un grupo de los frascos de cultivo BacTfALER~MP. Las fórmulas del SAM convencional (con el uso de FR convencional/antiguo) y del SAM nuevo (con el uso de SN) se añadieron al

15 segundo grupo de frascos de cultivo MP.

El inóculo de micobaclerias fue 0,5x103 UFCfmL También se llevaron a cabo recuentos de colonias mediante el uso de placas de agar Middlebrook 7H10 o agar-sangre de oveja o agar-Iriplona de soja para verificar los niveles del inóculo y la pureza de los cultivos. Los frascos MP inoculados se cargaron en un sistema BacTfALER~ 30 (bioMérieux, Inc.) a 35-37 oC sin balanceo duranle 35 días para los cultivos de micobaclerias. Los datos del tiempo

20 de detección (nO) se recogieron cuando el instrumento BacTfALERT declaró los frascos positivos

Se determinó el crecimienlo (como no del crecimiento) para las cepas del complejo M tuberculosis comparando el FR convencional/antiguo y SAM (FR + SAM convencional/antiguo) y el suplemento de nutrientes nuevo y SAM nuevo (SN + SAM Nuevo). Se determinó el no para cuatro de cinco cepas del complejo M tuberculosis, es decir, Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium microti, y Mycobacterium tuberculosis en un medio

25 de cultivo de FR + SAM Convencional/antiguo y medio de cultivo SN + SAM Nuevo. Los resultados se muestran en la Tabla 8 y la Figura 6.

Como se muestra en la Tabla 8 y la Figura 6, SN + SAM nuevo muestra una mejora aproximada de 1-10 días en el no para el crecimiento de las cepas del complejo M tuberculosis en comparación con FR + SAM convencional/antiguo.

Tabla 8 -TTD del complejo M tuberculosis

Organ ismo

Suplemento TTD Medio nD Desv_ nDMin nDMáx N° de N'

(días)

Est. (días) (días) (días) Positivos Ensayado

M_ africanum 25420

SN+Fórmula 5 FR+SAM Ant. 14,2 15,5 0,3 0 ,8 13,8 14,8 14,7 16,3 5,0 3,0 5,0 3,0

SN+Fórmula 5

18,4 1,3 17,2 19,7 5,0 5,0

M bovis 8131

FR+SAM Ant.

20,4 2 ,1 18,2 22,3 3,0 3,0

M micrati 19422

SN+Fórmula 5 FR+SAM Ant 15,0 16,6 1,4 0,3 12,8 16,2 16,3 16,8 5,0 3,0 5,0 3,0

SN+Fórmula 5

10,1 0 ,2 9,7 10,2 5,0 5,0

MTS 18283

FR+SAM Ant

20,9 1,8 19,2 22,7 3,0 3,0

SN+Fórmula 5

19,9 1,3 18,3 21 ,2 5,0 5,0

MTS 25177

FR+SAM Ant.

32,4 1,6 31 ,3 34,2 3,0 3,0

SN+Fórmula 5

14,1 0 ,4 13,7 14,7 5,0 5,0

MTS 27294

FR+SAM Ant

16,8 0,5 16,3 17,3 3,0 3,0

EJEMPLO 6. Comparación de la formulación anterior de SAM frente a la formulación nueva de SAM para el nD del crecimiento de micobac1erias distintas del bacilo tuberculoso (MOTT)

5 Se seleccionó la fórmula del frasco MP nuevo, del suplemento de nutrientes (SN) y la fórmula 5 del SAM nuevo para los ensayos adicionales, Este estudio se nevó a cabo mediante cepas de micobacterias distintas del bacilo tuberculoso (MOTT) que incluyen Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare, Mycobacterium kansasii, y Mycobacterium scrafulaceum. La composición de la fórmula 5 fue: SN + TMP (50 ¡..Iglml), NA (400 ¡..Ig/ml-PI o IFU), POLI B (1250 unidadesfml), FOS (600 ¡..Ig/ml), Amp B (180 ¡..Ig/ml-PI o IFU)

10 Para las fórmulas nuevas y SN, se usó un frasco BacTfALER~MP esterilizado en autoclave o nuevo (como se describió anteriormente en la presente memoria), y para FR convencional/antiguo, se usó un frasco MP convencional/antiguo (bioMérieux, Inc_)_ Antes de la inoculación de los frascos de cultivo MP antiguos o nuevos con cultivos de micobacterias, se añadieron 0,5 mi del suplemento de nutrientes (SN nuevo) o 0,5 mi de FR convencional/antiguo con diferentes farmacos a un grupo de los frascos de cultivo BacTfALERr«' MP_ Las fórmulas

15 del SAM convencional (con el uso de FR convencional/antiguo) y del SAM nuevo (con el uso de SN) se añadieron al segundo grupo de frascos de cultivo MP_

El inóculo de micobacterias fue 0,5x103 UFCfml. También se llevaron a cabo recuentos de colonias mediante el uso de placas de agar Middlebrook 7H10 o agar-sangre de oveja o agar-triptona de soja para verificar los niveles del inóculo y la pureza de los cultivos. Los frascos MP inoculados se cargaron en un sistema SacTfALERT 3D

20 (bioMérieux, Inc_) a 35-37 oC sin balanceo durante 35 dias para los cultivos de micobacterias_ Los datos del tiempo de detección (TTD) se recogieron cuando el instrumento SacT/ALER~declaró los frascos positivos. Los resultados se muestran en la Tabla 9 y la Figura 7.

Como se muestra en la Tabla 9 y la Figura 7, SN + SAM nuevo muestra una mejora aproximada de 1·12 días en el nD para las micobacterias distintas del bacilo tuberculoso (MOTT) en comparación con FR + SAM

25 convencional/antiguo.

Tabla 9 · TTD de micobacterias distintas del bacilo tuberculoso (MOTT)

Organismo

Suplemento TTD Medio (días) nD Desv. Est. (días) TTD Min. (días) TTD Máx. (días) N° de Positivos N' Ensayado

M avium 25291

SN+Fórmula 5 FR+SAM Ant 11 ,8 12,9 0,4 0,7 11 ,5 12,3 12,5 13,7 5,0 3,0 5,0 3,0

M avium 569

SN+Fórmula 5 FR+SAM Ant 14,2 20,0 1,3 1,8 12,7 18,7 15,7 21 ,2 5,0 2,0 5,0 3,0

Organismo

Suplemento TTo Medio nD TTo Min. TTo Máx. N° de N'

(dias)

Desv. Es! (días) (días) Positivos Ensayado

(días)

M. intracellulare

SN+Fórmula 5 8,6 0,3 8,2 9,0 5,0 5,0

13950

FR+SAM Ant 16,0 0,9 15,0 16,8 3,0 3,0

M. intracellulare

SN+Fórmula 5 13,8 1,0 12,7 14,7 5,0 5,0

644

FR+SAM Anl. 29 ,9 2,6 28 ,0 31,7 2,0 3,0

M kansasii 12478

SN+Fórmula 5 13,6 0,6 12,8 14,5 5,0 5,0

FR+SAM Anl.

31 ,5 2,6 30 ,0 34 ,5 3,0 3,0

M scrofulaceum

SN+Fórmula 5 10,0 0,3 9,7 10,5 5,0 5,0

19981

FR+SAM Anl. 17,9 0,3 17,7 18,2 3,0 3,0

EJEMPLO 7. Comparación de la formulación anterior de SAM frente a dos formulaciones nuevas de SAM con diferentes concentraciones de FOS para el TTO de cepas de M. tuberculosis

La fórmula 5 del SAM nuevo se refinó adicionalmente para conseguir una mejor inhibición de la FRC incrementando

5 la concentración de FOS de 600 IJg/ml a 800 IJgfml. Se llevó a cabo el siguiente estudio con 10 cepas de M. tuberculosis a 0,5x103 UFC/ml. Diez cepas de M. tuberculosis constituidas por cuatro aislamientos del COC, cinco cepas virulentas de la A TCC y una cepa de referencia de QC

Para las fórmulas nuevas y SN nuevo, se usó un frasco BacTfALER~MP esterilizado en autoclave o nuevo (como se describió anteriormente en la presente memoria), y para FR convencional/antiguo, se usó un frasco MP

10 convencional/antiguo (bioMérieux, Inc.). Antes de la inoculación de los frascos de cultivo MP antiguos o nuevos con cultivos de micobacterias, se añadieron 0,5 mi del suplemento de nutrientes (SN nuevo) o 0,5 mi de FR convencional/antiguo con diferentes fiumacos a un grupo de los frascos de cultivo BacT/ALERr® MP. Las fórmulas del SAM convencional (con el uso de FR convencional/antiguo) y del SAM nuevo (con el uso de SN nuevo) se añadieron al segundo grupo de frascos de cultivo MP

15 El inoculo de micobacterias fue 0,5x10UFCfml. También se llevaron a cabo recuentos de colonias mediante el uso de placas de agar Middlebrook 7H10 o agar-sangre de oveja o agar-triptona de soja para verificar los niveles del inóculo y la pureza de los cultivos. Los frascos MP inoculados se cargaron en un sistema BacTfALERr«' 3D (bioMérieux, Inc.) a 35-37 oC sin balanceo durante 35 días para los cultivos de micobacterias. Los datos del tiempo de detección (TTo) se recogieron cuando el instrumento BacT/ALERr® declaró los frascos positivos. Los resultados

20 se muestran en la Tabla 10

Como se muestra en la Tabla 10, las fórmulas nuevas de SAM mostraron una mejora aproximada de 2-8 días en el TTo para las cepas de M. tuberculosis en comparación con el FR + SAM convencional/antiguo.

~ ~

Tabla 10 -TTD de diversas cepas de M. tuberculosis con fórmulas nuevas de SAM que contieoen 600 IJg/ml (SAM 5) y 800 lJg/ml (Fórmula 5+ FOS 200 IJg/ml)

Organismo

ID de la cepa Suplemento TTO Medio (dias) TTO Oesv. Est. (dias) TTO Min. (dlas) TTO Max. (dias) N° de Positivos W Ensayado

Mycobacterium tuberculosis

2663 SN+Fórmula 5 SN+Fórmula 5+FOS 200 FR+SAM Ant. 15,1 15,3 17,9 0,8 0,3 0,2 14,0 14,8 17,7 16.0 15.7 18,3 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

2677

SN+Fórmula 5 SN+Fórmula 5+FOS 200 FR+SAM Ant. 17,3 17,2 22 ,1 0,5 0,6 0,6 16,7 16,5 21 ,3 18,0 18,0 22.8 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

18283

SN+Fórmula 5 SN+Fórmula 5+FOS 200 FR+SAM Ant. 8,9 9,5 17,0 0,5 0,3 0,8 8,3 9,0 16,0 9,5 9,7 18,2 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

18292

SN+Fórmula 5 SN+Fórmula 5+FOS 200 FR+SAM Ant. 13,9 14,1 15,8 0,7 0,3 0,8 13,3 13,7 15,2 14,7 14,5 17.2 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

25177

SN+Fórmula 5 SN+Fórmula 5+FOS 200 FR+SAM Ant. 16,0 16,3 19,1 0,4 0,8 0,3 15,5 15,2 18,8 16.3 17.3 19,5 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

27294

SN+Fórmula 5 SN+Fórmula 5+FOS 200 FR+SAM Ant. 14,1 14,5 16,3 0,4 0,5 0,4 13,5 13,8 15,7 14,5 15.2 16,7 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

35822

SN+Fórmula 5 SN+Fórmula 5+FOS 200 FR+SAM Ant. 15,0 15,7 17,9 0,8 0,3 0,6 13,7 15,3 17,2 16,0 16,2 18.8 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

35837

SN+Fórmula 5 SN+Fórmula 5+FOS 200 FR+SAM Ant. 14,8 15,2 17,8 1,0 0,2 0,4 13,5 15,0 17,2 16.3 15,3 18,2 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

35838

SN+Fórmula 5 SN+Fórmula 5+FOS 200 FR+SAM Ant. 15,5 15,7 17,0 0,6 0,4 0,6 14,8 15,2 16,2 16.2 16.2 17,5 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0

EJEMPLO 8. Comparación de la fonnulación anterior de SAM frente a dos formulaciones nuevas de SAM con diferentes concentraciones de FOS para la inhibición de la nora respiratoria contaminante (FRC) La fórmula 5 del SAM nuevo se refinó adicionalmente para conseguir una mejor inhibición de la FRC incrementando la concentración de FOS de 600 IJg/ml a 800 IJg/ml. Se determinó el crecimiento o no crecimiento (NC) para diversos

5 cultivos bacterianos gram-posilivos o gram-negativos y de levaduras comparando el FR convencional/antiguo y SAM (FR + SAM convencional/antiguo) y las formulaciones nuevas de suplemento de nutrientes y de SAM (SN + SAM nuevo). Las formulaciones nuevas de SAM contuvieron la fórmula 5 + 200 IJg/ml de FOS (un total de 800 ~gfml de FOS). Se ensayó la FRC a 0,6X1 04 UFCfml. También se nevaron a cabo recuentos de colonias mediante el uso de placas de agar Middlebrook 7H10 o agar-sangre de oveja o agar-triptona de soja para verificar los niveles del inoculo

10 y la pureza de los cultivos. Los frascos MP inoculados se cargaron en un sistema BacTfALER~3D (bioMérieux, Inc.) a 35-37 oC sin balanceo durante 15 días para todos los cultivos. Los datos del tiempo de detección (nD) se recogieron cuando el instrumento BacTfALERT"" declaró los frascos positivos.

La Tabla 11 muestra que la formulación nueva de SAM fue una formulación mejor para inhibir el crecimiento de la FRC en comparación con la formulación de SAM convenciona1fantiguo.

15 Tabla 11 • Tabla que muestra la inh ibición de la flora respiratoria contaminante (FRC)

Organismo Gandida albicans Enferococcus faecalis Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus

ID de la cepa 11006 302876 8711 8340 (ERV) 109241 27853 106159 12535 25923 13305 (SARM) Suplemento SN + Fórmula 5 SN + Fórmula 5 + FOS 200 FR + SAM Ant SN + Fórmula 5 SN + Fórmula 5 + FOS 200 FR + SAM Anl. SN + Fórmula 5 SN + Fórmula 5 + FOS 200 FR + SAM Anl. SN + Fórmula 5 SN + Fórmula 5 + FOS 200 FR + SAM Ant SN + Fórmula 5 SN + Fórmula 5 + FOS 200 FR + SAM Anl. SN + Fórmula 5 SN + Fórmula 5 + FOS 200 FR + SAM Ant SN + Fórmula 5 SN + Fórmula 5 + FOS 200 FR + SAM Anl. SN + Fórmula 5 SN + Fórmula 5 + FOS 200 FR + SAM Anl. SN + Fórmula 5 SN + Fórmula 5 + FOS 200 FR + SAM Ant SN + Fórmula 5 Contaminación Intercurrente NC NC NC NC NC 115 5/5 115 NC 5/5 NC 3/5 NC NC NC NC NC 115 NC NC NC 5/5 NC NC 5/5 2/5 NC 5/5

23 24

Organ ismo Staphylococcus epidermidis Stenotrophomonas maltophilia Streptococcus oratis Streptococcus pneumoniae

ID de la cepa 7104 13637 106259 12975 6305 Suplemento SN + Fórmula 5 + FOS 200 FR + SAM Ant. SN + Fórmula 5 SN + Fórmula 5 + FOS 200 FR + SAM Ant. SN + Fórmula 5 SN + Fórmula 5 + FOS 200 FR + SAM Ant SN + Fórmula 5 SN + Fórmula 5 + FOS 200 FR + SAM Ant SN + Fórmula 5 SN + Fórmula 5 + FOS 200 FR + SAM Ant. SN + Fórmula 5 SN + Fórmula 5 + FOS 200 FR + SAM Ant. Contaminación Inlercurrenle NC NC 515 115 NC NC NC NC 515 NC 215 NC NC NC 515 NC NC

Claims (8)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un método para el crecimiento mejorado de micobacterias que comprende añadir una muestra que contiene micobaclerias a un medio de cultivo que contiene una cantidad eficaz de un aditivo que comprende a-cetoglutarato para proporcionar un medio de cultivo con una concentración final de 5 gI L a alrededor de 50 gIL de a-cetoglutarato, y someter al medio de cultivo a condiciones adecuadas para el crecimiento de dichas micobaclerias, en el que dicho aditivo mejora el crecimiento de dichas micobacterias, y reduce el tiempo de detección del crecimiento de las micobacterias en al menos 2 dias en comparación con un medio de cultivo que no contiene a-cetoglutarato.

2. 2.

   El método de la reivindicación 1, en el que dicho crecimiento mejorado comprende reducir la fase de latencia del crecimiento de micobaclerias en al menos 1 día.

3. 3.

   El método de las reivindicaciones 1 o 2, en el que dicho medio de cultivo está a un pH de entre alrededor de 5 ,5 a alrededor de 7,5 .

4. 4.

   El método de las reivindicaciones 1-3, en el que dicho medio de cultivo comprende además un suplemento antimicrobiano, y en el que dicho suplemento antimicrobiano comprende uno o más antimicrobianos en una cantidad suficiente para inhibir la contaminación bacteriana, por levaduras o fúngica en dicho medio de cultivo, y preferiblemente en el que dicho o dichos antimicrobianos comprenden uno o mas antibióticos, y en el que dicho o dichos antibióticos se seleccionan del grupo que consiste en pOlimixina B, vancomicina, azlocilina, anfotericina B, acido nalidíxico, trimetoprima y fosfomicina

5. 5.

   El método de la reivindicación 4, en el que dicho suplemento antimicrobiano comprende polimixina B, anfotericina B, ácido nalidixico, trimetoprima y fosfomicina.

   6 Un método para el diagnóstico de una infección provocada por una especie de micobacleria, que comprende las etapas de: (a) proporcionar un medio de cultivo; (b) añadir un suplemento de nutrientes a dicho medio de cultivo, y dicho aditivo de suplemento de nutrientes comprende a-cetoglutarato para proporcionar un medio de cultivo con una concentración final de 5 gIL a alrededor de 50 gfL de o-cetoglutarato; (c) añadir una muestra en la se va a determinar la presencia o ausencia de dicha especie de micobacleria; y (d) analizar en dicho cultivo la presencia de dicha especie de micobacteria, en el que un hallazgo de la presencia de dicha especie de micobacteria indica un diagnóstico positivo para dicha infección, yen el que dicho aditivo de a-cetoglutarato reduce el tiempo de detección del crecimiento de micobacterias en al menos 2 dias en comparación con un medio de cultivo que no contiene 0cetoglutarato

   7 El método de la reivindicación 6, en el que dicho medio de cultivo y suplemento de nutrientes reducen la fase de latencia del crecimiento de micobacterias en al menos 1 día.

   8 El método de las reivindicaciones 6 o 7, en el que dicho medio de cultivo comprende además un suplemento antimicrobiano, y en el que dicho suplemento antimicrobiano se añade antes de la adición de dicha muestra en la etapa (e)
6. 9. El método de la reivindicación 8, en el que dicho suplemento antimicrobiano se suspende mediante el uso de dicho suplemento de nutrientes, y dicho suplemento antimicrobiano suspendido mediante el suplemento de nutrientes se añade a dicho medio de cultivo en la etapa (b), y opcionalmente en el que dicho suplemento antimicrobiano comprende uno o más antibióticos seleccionados del grupo que consiste en polimixina B, vancomicina, azlocilina, anfotericina B, ácido nalidíxico, trimetoprima y fosfomicina.

   10 Un kit para detectar el crecimiento de micobacterias en un medio de cultivo, y dicho kit comprende: (1) un frasco de cultivo que contiene un medio de cultivo base; (2) un suplemento de nutrientes que comprende 0cetoglutarato; y (3) un suplemento antimicrobiano que comprende uno o más agentes antimicrobianos para inhibir el crecimiento de la flora respiratoria contaminante en dicho medio de cultivo, en el que dicho a-cetoglutarato del suplemento de nutrientes está a una concentración tal que después de mezclar el suplemento de nutrientes y el suplemento antimicrobiano con el medio de cultivo base contenido en el frasco de cultivo, dicho aditivo de 0cetoglutarato presente en el medio de cultivo está a una concentración final de 5 gIL a alrededor de 50 gil, Y en el que dicho aditivo de a-cetoglutarato reduce el tiempo de detección del crecimiento de micobacterias en al menos 2 dlas en comparación con un medio de cultivo que no contiene a-cetoglutarato.

   11 El kit de la reivindicación 10, en el que dicho crecimiento mejorado comprende reducir la fase de latencia del crecimiento de micobacterias en al menos 1 dia

7. 12.

   El kit de las reivindicaciones 10 o 11 , en el que dicho medio de cultivo base es Middlebrook 7H9.

8. 13.

   El kit de las reivindicaciones 10-12, en el que dicho medio de cultivo base no contiene componentes termolábiles, y preferiblemente en el que dicho frasco de cultivo y dicho medio de cultivo base se esterilizan en autoclave

   14 El kit de las reivindicaciones 10-13, en el que dicho suplemento antimicrobiano comprende fosfomicina y, opcionalmente, comprende ademas polimixina B, vancomicina, anfotericina B, ácido nalidíxico, y trimetoprima

   26