JP2012530133A - 時間の経った赤血球の輸血に伴う副作用を改善するための方法 - Google Patents
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Abstract
Description
2009年6月16日付で出願された米国特許仮出願番号第61/187,600号および2009年8月31日付で出願された米国特許仮出願番号第61/275,579号に対する本出願の利益を主張する。前記両出願の内容全体を、すべてが本明細書中に引用されているかのように本明細書中に援用する。
本願発明は、米国立衛生研究所によって支給された助成金番号第R21 HL087906号の下、政府の支援を得て作成された。政府は本発明に特定の権利を有する。
本発明は、とりわけ、鉄キレート剤を使用した、時間の経った(aged)赤血球の急性輸血(acute transfusion)に伴う副作用を改善するための方法、キット、および組成物に向けられる。
合衆国では毎年、約1400万単位の袋詰めされた赤血球(red blood cell)(RBC)が輸血されている[1]。加えて、集中治療室(ICU)は全病床の10%を占め、毎年440万人のアメリカ人が集中治療質に収容され[2]、そして44%のICU患者には彼らの入院中に少なくとも1RBC単位(平均4.6単位)が輸血される[3]。これらの単位の輸血前の平均保存期間は17日間である[1]。いくつかの観察研究[4−9]および大規模無作為前向き臨床研究[10]は、輸血自体が重症患者の罹患率や死亡率、すなわちRBCの保存期間に伴って増大する影響を高めることを示唆している。観察研究では、死亡率[7、11−13]、重篤疾患[7、12、14]、多臓器不全[12、15]、および入院期間[7、13]の増加が、重症患者における古い保存RBCの輸血と相関していた。最近、約6000人の心臓手術患者の後ろ向き試験では、14日未満しか保存していないRBCを輸血した患者に対して、14日超保存したRBCを輸血した患者の院内死亡率、敗血症(sepsis)/菌血症を伴う敗血症(septicemia)、および1年死亡率の有意に高い比率を確認した[12]。異論はあるが[16]、これらの研究では古い保存RBCの輸血の有効性について根本的な疑問を投げ掛けている;加えて、高められた罹患率や死亡率に関与する機構は、大部分が分かっていない[17]。
本発明の一実施形態は、時間の経った赤血球を含む組成物の患者への急性輸血によって引き起こされる患者の副作用を改善するための器具(apparatus)である。その器具は、前記組成物と無菌状態で接触する内部表面および有効量の鉄キレート剤を含んでなる。
本発明の一実施形態は、時間の経った赤血球を含む組成物の患者への急性輸血により引き起こされる患者の副作用を改善するための器具である。その器具は、前記組成物と無菌状態で接触する内部表面および有効量の鉄キレート剤を含んでなる。
白血球除去されたマウスとヒトのRBCの保存は類似する。
マウス血液を、ヒトに使用する標準的な保存溶液中に心臓穿刺によって無菌的に得た:CPDA−1(Baxter、Deerfield, IL)。30〜50匹のマウスからの全血を、小児用白血球除去フィルター(Purecell Neo, Pall Corp.、Port Washington, NY)を使用して白血球除去し、遠心分離し、そして60〜75%のヘマトクリットで4℃にて最長21日間保存した。正常なマウスRBCの寿命がヒトRBCの寿命の約半分なので[86]、マウスRBCに関しては(ヒトに用いられる≦35日間より)21日以下を選択した。マウスRBCの保存前の白血球除去では、白血球の少なくとも3−log10の低減を実現した(LeucoCOUNTキット、BD Biosciences, San Jose,CA;未掲載)。
MCP−1、IL−6(図3)、KC(IL−8のマウス相同体)、MIP−1β、およびTNF−α(未掲載)の血漿レベルの統計的に有意な、かつ、用量応答性の増大が、古い保存RBC輸血の2時間後にそれぞれ観察された(13匹のマウス/群;保存RBCの輸血からの結果を新鮮なRBCと比較したときp<0.05(両側スチューデントt検定))。対照的に、IL−10またはIFN−γに関して有意差は観察されなかった(未掲載)。
マウスに3週間保存したRBCを輸血し、屠殺し、そして肝切片を光学顕微鏡検査によって調べた。古い保存RBCを輸血したマウスにおいて貪食されたRBCを含むクッパー細胞が頻繁に見られたが(>1/高倍率視野)(図4)、新鮮なRBCを輸血したマウスではめったに見ない(未掲載)。よって、より古い保存RBCはインビボにおける貪食によって除去される。
全鉄を、新鮮または保存RBCの輸血(400μLの用量、1群あたり13匹のマウス)の後、剖検時に湿式灰化手順[88]によって様々な臓器において計測した。全鉄は、保存RBCを輸血したマウスの肝臓、脾臓、および腎臓で有意に増加した(p<0.05、両側スチューデントt検定)(図5)。よって、相当量の保存RBCの急速なクリアランスは、肝臓、脾臓、および腎臓における鉄の沈着につながる。典型的な実験では、約140μgの全鉄を各マウスに輸血する。RBC生存データ(図2)に基づくと、輸血の2時間後には、2週間保存したRBCの約25%が除去されている。よって、約35μgの鉄が、単球−マクロファージ系に供給される;これは、これらのマウスの脾臓、腎臓、および肝臓から回収された過剰鉄の量とほとんど同じである(図5)。
保存RBCの保存媒質または上清中の因子の添加よりむしろ、膜カプセル化ヘモグロビン鉄の急激な供給がサイトカインストームを引き起こすのに必要であるかどうか判断するために、試験を実施した。このために、生理的食塩水で洗浄した2週間保存したRBC、保存RBCからの上清、および保存RBC由来のRBCゴーストの輸血の効果を比較した。保存RBCを、10倍量の標準的な生理的食塩水で3回洗浄し、次いで洗浄していない保存RBCのそれと同等の最終的なヘモグロビン濃度に生理的食塩水中に再懸濁した。保存RBCの低浸透圧性溶解によって調製したRBCゴーストを[89]、白色のペレットを得るまで十分に洗浄した。ゴーストの濃度をTrucount(BD Biosciences)を使用したフローサイトメトリーによって定量して、同数のゴースト、保存RBC、および洗浄した保存RBCが輸血されることを確かめた。加えて、ゴーストは、同数の保存RBC中に存在している全鉄の約0.07%しか含んでいなかった(未掲載)。マウス(1群につき6〜13匹)に、規準化した量の新鮮なRBC、保存RBC、保存RBCからの上清、生理的食塩水で洗浄した保存RBCペレット、または保存RBC由来のゴーストを輸血した。炎症誘発性サイトカイン反応は、保存RBCまたは生理的食塩水で洗浄した保存RBCペレットのいずれかの輸血後にのみ見られた;MCP−1およびIL−6の結果を例として示した(図6)。質的に類似し、かつ、統計的に有意な結果を、KC、MIP−1β、およびTNF−αについて得た(未掲載);群間の有意差が見られなかったのは、IL−10およびIFN−γについてであった(未掲載)。RBCゴーストが炎症誘発性応答を引き起こさなかったので、このことは、十分な量のヘモグロビン鉄の供給がこの現象を生じさせるのに必要であることを示唆している。加えて、生理的食塩水で洗浄したペレット中の無傷のRBCの輸血が同様のサイトカイン反応を誘発したが、上清ではそうならなかった。このことは、炎症誘発性応答が保存中に上清中に蓄積する化合物、例えば、市販の添加物、RBC由来のベシクル、サイトカイン、または非トランスフェリン結合鉄などに由来しないことを示唆している。
血漿非トランスフェリン結合鉄を、新鮮なRBC、2週間保存したRBC、洗浄したRBCペレット、または保存RBCからの上清(400μL、5〜7匹のマウス/群)の輸血後に定量した。血漿非トランスフェリン結合鉄は、保存RBCまたは洗浄RBCペレットのいずれかを輸血したマウスでのみ上がった(図7)。非トランスフェリン結合鉄は、その酸化還元電位のため悪影響を引き起こし得るので、このことは、おそらく古い保存RBCの貪食後の鉄の放出の増加によるものであり、無傷の輸血RBCがこれらのレベル上昇の原因であることを示唆している。
C57BL/6マウス(5〜10匹/群)に、新鮮なRBC、2週間保存したRBCまたは保存RBCから調製したゴーストのいずれかの同時輸血と共にまたはそれ無しに、亜致死用量のLPSを注射した。マウスを、輸血の24時間後に屠殺し、そしてサイトカインを計測した(図8)。輸血の24時間後まで、保存RBCを輸血したLPS処理マウスは、KC、MIP−1β、およびTNF−αを含めた多くの炎症誘発性サイトカインの顕著に高いレベルを維持している;例として、MCP−1とIL−6の結果を図8に示す。加えて、保存RBCを輸血したLPS処理マウスはすべて、輸血の24時間後までに瀕死になり、そして自発運動を欠き、鈍い立直り反射しか示さなかった;他の群のマウスはすべて、この時点では健康そうに見えた。最終的に、ヘモグロビン不含ゴーストの輸血は、マウスにおいてLPS誘発性サイトカインストームを助長しなかった。まとめると、このことは、保存RBCの急速なクリアランスがLPSに相乗効果を与えて、サイトカインストームを悪化させ、そして長引かせる;そのため、このマウス・モデルが、患者、例えば敗血症を患っている患者などの副作用により古い保存RBCの輸血が関与することのヒトでの試験を再現していることを示唆している。
マウス
野生型C57BL/6およびFVB/NJマウスを、Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)から購入した。SAA1−ルシフェラーゼレポーターマウスを、Caliper Life Sciences(Hopkinton, MA)から入手した。マウスは、8〜12週齢の時点で使用した。手順は、適当な施設内動物実験委員会に承認された。
FVB/NJおよびC57BL/6マウスから、ジ−(2−エチルヘキシル)フタラート−可塑化ポリ塩化ビニル製ヒト一次採血パック(製品コード4R3611;Baxter)から直接得たリン酸クエン酸デキストロースアデニン−1(CPDA−1)中に、心臓穿刺によって無菌的に出血させた。保存に使用される最終的なCPDA−1濃度は14%であった。30〜50匹のマウスから採血した全血を、プールし、そしてNeonatal High Efficiency Leukocyte Reduction Filter(Purecell Neo, Pall Corp.)を使用して白血球除去し、遠心分離し(400gにて15分間)、そして17.0〜17.5g/dL(保存RBC対Drabkin’s試薬(Ricca Chemical Company、Arlington, TX)の1:251希釈にて改変Drabkin’sアッセイ[106]によって測定した場合、吸光度を540nmで計測し、そしてCount−a−part Cyanmethemoglobin Standards Set(Diagnostic Technology, Inc.、Belrose,Australia)と比較した)の最終ヘモグロビンレベルまで体積を減らした。残留白血球を、フローサイトメトリー(LeucoCOUNTキット、BD Biosciences)によって数えた。保存RBCを、15mLのFalconチューブに入れ、パラフィルムで封をし、そして暗所内で4℃にて最長14日間保存した。輸血の日に、500μlの保存RBCを、Peds Plus/F培養ボトル(BD Diagnostic Systems)内に接種し、そして最長5日間または細菌増殖が検出されるまでBACTEC連続観察血液培養システム(BD Diagnostic Systems)で細菌増殖を検出した(この方法は、97%の感度で少なくとも1mLあたり10コロニー形成単位(CFU)にて検出する)[116]。洗浄した保存RBCを、10倍量のリン酸緩衝食塩水(PBS)を使用した3回の洗浄と、400×gでの遠心分離によって調製した。最後の洗浄の後に、洗浄した保存RBCを、輸血のために17.0〜17.5g/dLの最終ヘモグロビン濃度に合わせてPBS中に再懸濁した。保存RBCの400×gの遠心分離を使用して上清を得、そして400μLのこの溶液を希釈せずに輸血した。RBCゴーストを、PBS対蒸留水(1:15)を用いて2倍量の保存RBCの低浸透圧性溶解によって得(すなわち、400μLのゴーストのために、800μLの保存RBCを溶血させた)、それに続いて白色のペレットを得るまで同じバッファーで複数回洗浄し、そして30,000×gにて遠心分離した。RBCゴーストの白色ペレットをPBS中に再懸濁した。ストローマ不含RBC溶解物を、洗浄した保存RBCを凍結−融解し、続いて16,000×gにて遠心分離して、ストローマをペレット化し、そして取り除くことによって調製した。
RBC(17.0〜17.5g/dLのヘモグロビンにて200または400μL;それぞれ1または2換算ヒト単位)を、イソフルラン麻酔したマウスの眼窩後方の静脈叢を通して輸血した。輸血の2および24時間後に循環している輸血RBGの割合(すなわち、輸血の2および24時間後の生存)を、二重または単一標識法のいずれかによって計測した(予備試験では、この試験の条件についてこれらの方法で有意差がないことを確認した(未掲載))。二重標識法については、先に記載したように[102]、新鮮な、同種同系であるC57BL/6RBCのアリコートを、クロロメチルベンズアミド1,1’−ジオクタデシル−3,3,3’,3’−テトラメチルインドカルボシアニン・ペルクロラート(Dil;Invitrogen、Carlsbad, CA)で標識し、そして同種であるFVB/NJの新鮮なRBCまたは保存したRBCのアリコートを、3,3’−ジヘキサデシルオキサカルボシアニン・ペルクロラート(DiO;Invitrogen)で標識した。輸血後の規定の時点で、1〜2μLの血液を尾静脈から得、そして蛍光標識したRBCのフローサイトメトリー検出のために500μLのPBSに移した。生存を、サンプル中のDil標識RBC対DiO標識RBCの割合を、自身での輸血における割合と比較することによって計算した。単一標識試験については、新鮮なRBCまたは保存したRBCの10%のアリコートをDiOで標識した。生存を測定するために、FACSCalibur(登録商標)フローサイトメーター(BD Biosciences)で得られるDiO標識性RBC対非標識RBCの比を、輸血の10分後のサンプルと最終的な終点で得たサンプルの間で比較した。規定した時点(輸血の2時間または24時間後)では、すべてのマウスをイソフルランで麻酔し、屠殺し、そして血液を心臓穿刺によってヘパリン化シリンジを使用して得た。洗浄した保存RBCを、10倍量のPBSを使用して3回洗浄し、そして400×gにて遠心分離することによって調製した。最後の洗浄に続いて、洗浄した保存RBCを、17.0〜17.5g/dLの最終ヘモグロビン濃度に合わせてPBS中に再懸濁した。保存RBCの400×gの遠心分離後に上清を得、そしてこの溶液400μLを希釈せずに輸血した。RBCゴーストを、PBS:dH2O(1:15)を用いた2倍量の保存RBCの低浸透圧性溶解(すなわち、400μLのゴーストのために、800μLの保存RBCを低浸透圧性溶解した)と、それに続く白色のペレットを得るまでの同じバッファーを用いた複数回の洗浄と30,000×gでの遠心分離によって得た。RBCゴーストの白色のペレットをPBS中に再懸濁した。一部の実験については、100μLのPBS中に溶解したLPS(E.コリ0111:B4(Sigma);マウス1匹あたり30〜100μg)を、輸血直前に尾静脈によってマウスに注射した。LPS処理マウスを、屠殺前にCanon PowerShot SD600を使用してビデオで記録した。一部の実験では、100μLのPBS中に溶解した3mgのデフェロキサミン(DFO、Novartis)、または等モル濃度のクエン酸第二鉄(Sigma−Aldrich)と一緒に1時間プレインキュベートした3mgのDFOを、輸血直前のマウスの尾静脈に注射した。最後に、一部の実験では、2mgのリポソーム化クロドロネートまたはPBS−リポソーム(ともにEncapsula NanoSciences LLC、Nashville, Tennessee製)を、輸血の48時間前にマウスに腹腔内注射した。
剖検では、肝臓と脾臓を取り出し、10%の中性緩衝ホルマリンによって一晩固定し、そしてパラフィン内に包埋した。切片を、ヘマトキシリンおよびエオジンによって染色するか、または脱パラフィン処理し、次いで1:500希釈の抗マウスF4/80モノクローナル抗体(eBioscience、San Diego,California)と、続くビオチン化抗ラット二次抗体(1:200希釈)、ABC試薬(1:50希釈)によって免疫染色し、そして3,3’−ジアミノベンジジン基質キット(すべてVector Laboratorie、Burlingame,California製)を用いて現像した。Olympus BX40顕微鏡およびSPOT INSIGHTデジタルカメラ(Diagnostic Instruments、Sterling Heights,Michigan)を使用して像を得た。
インターロイキン−6(IL−6)、インターロイキン−10(IL−10)、単球遊走因子(MCP−1)、インターフェロン−γ(IFN−γ)、腫瘍壊死因子−α(TNF−α)、マクロファージ炎症性タンパク質−1β(MIP−1β)、およびケラチン生成細胞由来ケモカイン/CXCL1(KC/CXCL1)を含めたサイトカイン/ケモカインを、Cytometric Bead Array Mouse Flex Kit(BD Biosciences)を使用して定量した。心臓穿刺によって得られたヘパリン化血漿を、1:4、および/または1:10希釈にて分析した。FACSCalibur(登録商標)フローサイトメーター(BD Biosciences)で得たフローサイトメトリーデータを、FlowJoソフトウェア(Tree Star,Inc.、Ash land,OR)を使用して分析した。血漿血清アミロイドA(SAA)レベルを、製造業者の使用説明書に従ってマウスSAA ELISA Kit(Life Diagnostics,Inc.、West Chester,PA)を使用して計測した。
血漿NTBIを、ニトリロ三酢酸(NTA)限外濾過アッセイ[107]によって計測した。概略すると、ヘパリン化血漿(90μL)を、800mMのNTA、pH7.0と一緒に、室温にて30分間インキュベートした。血漿タンパクを、限外濾過(NanoSep、30kDaカットオフ、ポリスルホン型(Pall Life Sciences);10,620×g、15℃にて45分間)によって取り除き、そして限外濾過液中の鉄をフェロジン・アッセイ[95]によって測定した。総臓器鉄を湿式灰化手順[88]を用いて計測した。概略すると、剖検で得られた臓器の湿重量を定量し;脾臓全体または肝臓(約100mg)もしくは腎臓(約80mg)の一部を2mLのガラスバイアルに入れる。65℃にて24時間の乾燥後に、200μlの酸混合物(70%の過塩素酸:硝酸、2:1)を加えた。182℃にて5〜6時間の乾燥後に、1mLの3M HClを加え、そして混合した。次いで、酸性化サンプル(50μL)を200μLの色素体(1.6mMのバソフェナントロリン、2Mの酢酸ナトリウム、および11.5mMのチオグリコール酸)と一緒に30分間インキュベートした。535nmにてサンプルおよび鉄標準物質の吸収度を二連で計測し、そして平均値を総臓器鉄を計算するのに使用した。血色素血症を、PowerWave XS分光光度計(BioTek、Winooski,Vermont)を使用して分光光度測定により検出した。
雄SAA1−ルシフェラーゼ・トランスジェニック・マウス[108]に、尾静脈注射によって200μLの新鮮なRBC(<24時間保存)または保存RBCを輸血した。生物発光画像法を、[108]に記載のとおり、In Vivo Imaging System(Caliper Life Sciences)を使用して実施した。マウスをイソフルランで麻酔し、150mg/kgのルシフェリン(Caliper Life Sciences)を腹腔内に注射し、そして10分後に1〜60秒間撮像した。特定の領域から放出された光子を、LivingImageソフトウェア(Caliper Life Sciences)を使用して定量した;ルシフェラーゼ活性を1秒あたりの光子として表す。
尿路感染を患っている匿名の患者から得たE.コリの病原性株を使用した。各実験については、このE.コリの冷凍ストックからのサンプルを、Nutrient Broth(Difco、BD Biosciences)中に接種し、そして中間対数期(約3時間)まで培養した。次いで、細菌をPBSで2回洗浄し、そして約200,000コロニー形成単位(CFU)/μLに合わせて再懸濁した。次いで、5マイクロリットルの細菌懸濁液を、96ウェルEIA/RIAプレート内で100μLのヘパリン化血漿に加えた(Costar、Sigma)。細菌増殖を600nmの吸収度によって計測した。一部の実験では、20μMのクエン酸第二鉄またはクエン酸ナトリウム(Sigma)、ウシ血清アルブミン、2,2’−ジピリジル(すべてSigma−Aldrich製)、プロトポルフィリンIX(Frontier Scientific、Logan,Utah)、またはDFOを細菌接種前に血漿に加えた。
2つの平均の間の有意性を、両側マンホイットニーU検定を使用して計算した。インビトロにおける細菌増殖に関する有意性を、各増殖曲線の濃度曲線下面積(AUC)値への変換と、それに続く各群について平均AUCを比較するための両側マンホイットニーU検定によって判断した。0.05未満のPの値を有意と見なした。統計解析はPrism5(GraphPad Software,Inc.、La Jolla、CA)を使用して実施した。
標準的な保存液であるCPDA−1中で最長2週間保存した白血球除去C57BL/6マウスRBCの輸血後生存は、期限切れ時点でFDA基準に見合っている[109]。本試験において、ドナーFVB/NJマウスRBCを、同種血輸血をモデル化するのに使用した。RBCを保存前に白血球除去したので(>3log10白血球除去(未掲載))、アリコートには5日間の血液培地中でのインキュベーション後でも微生物の増殖がなかった。C57BL/6マウスに輸血した新鮮(すなわち、<24時間の保存)および2週保存した同種FVB/NJのRBCの24時間生存は、同種同系輸血の結果と同様であった(図13a)[109]。これ以降に示した実験については、新鮮なRBCの平均2時間生存は、保存RBCの83.6%(s.e.m.4.7)と比較した場合に、100.1%(s.e.m.3.8)であった;すべての保存RBCは2週間の保存後に輸血した。
鉄キレート化は、古い保存RBCの輸血によってマウスで引き起こされる炎症誘発性サイトカイン応答を阻害する。
AS−1中で保存したマウスRBCの輸血は、炎症を引き起こし、かつ、細菌性敗血症を悪化させる。
健常人への古い保存RBCの輸血は、急性炎症誘発性サイトカイン応答を引き起こす。
自家RBC献血を、2倍RBC採血アフェレーシス装置(ALYX;Baxter)を備えたNYBC献血施設の立地条件が良い5か所のうちの1か所で実施する。自家RBC単位は、現在の適正製造基準(cGMP)品質規準に従ってNYBCによって処理され、そして保存3日目までの保存のためにCUMC血液バンクに輸送される。
CUMCの至る所で配布されていた小冊子に応じた健常な男性(18〜65歳)を採用する。年齢または性別に関する交絡因子(例えば、女性の月経周期は鉄レベルとサイトカイン反応に影響し得る)を回避するために、初期試験を18〜65歳の男性に限定する。この試験への参加は、民族に関して制限されることはない。すべての参加者は、現行の標準的な、ボランティアの2倍RBC献血に関するNYBC要件(例えば、体重>130lbs(約59kg)、身長>5’1”(約154.9cm);ヘモグロビン>13.3g/dL;例えば心臓病、主要組織疾患、または癌などの献血を不可能にするであろう過去の重大な病歴がない;など)を満足していなければならない。加えて、所定の感染症検査を、各献血に対してNYBCにおいて実施する。合併感染症がサイトカイン応答を変え得る可能性のために、どんな肯定的な結果も除外に至る。組み入れおよび除外に関する具体的な基準は、以下のとおりである:
以下のもの:MCP−1、IL−8、IL−6、TNF−α、IFN−γ、およびIL−10を、血清で、多重フローサイトメトリーアッセイ(CBA Flex Kit;BD Biosciences)を用いてそれぞれの時点で計測する。これらのマーカーを、前臨床マウス試験に基づいて選択した(先に開示した実施例を参照のこと)。加えて、将来的な試験のための化合物をそして同定するために、特定のサンプルを、(先に列挙したものを含めた)46種類の炎症性メディエーターに関してHuman Inflammation Multi−Analyte Profile(Rules Based Medicine, Inc.)によってスクリーニングした。46種類の伝達物質に関する全リストを以下の表2に挙げる。
非トランスフェリン結合鉄を計測するために、血液サンプルを規定した時点にて微量元素不含チューブ内に採血する;(ヒト非トランスフェリン結合鉄レベルはマウスにおける前臨床試験のように輸血後に上昇する(図7を参照のこと)と仮定すると)これで輸血受血者の非トランスフェリン結合鉄の動態学的の測定が可能になる。血清非トランスフェリン結合鉄を計測するために、これまでに公になっている方法[93]を、わずかな変更を加えて使用する。概略すると、血液サンプルを室温にて20分間凝固させ、次いで1,000g、4℃にて10分間遠心分離する;血清をデカントし、そして分析まで−80℃にてすぐに冷凍する。トランスフェリン上の空の結合部位によるインビトロにおける鉄の取込みを回避するために、血清サンプルをトリス−カルボナトコバルト酸(III)三水和物[94]で処理する。次いで、800mMのニトリロ三酢酸、pH7.0溶液(50μL)を各450μLのサンプルに加える。室温にて30分間のインキュベーションに続いて、超遠心濾過デバイスを使用して血清タンパク質を除去する(NanoSep、30kDaカットオフ、ポリスルホン・タイプ;Pail Life Sciences;10,620×g、10℃にて45分間)。最後に、限外濾過液中の鉄を、フェロジン・アッセイ[95]を使用して定量する。
先に述べたように、血液サンプルを、CUMCの所定の臨床検査室にCALMのスタッフが輸送する。全血球算定(ヘモグロビン、ヘマトクリット、赤血球数、平均赤血球容積、自動化白血球較差を伴う白血球数算定、血小板数、および絶対網状赤血球算定を含む)をXe−5000 Hematology System(Sysmex,Mississauga,ON)を用いて測定する。総ビリルビン、直接ビリルビン、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、アラニンアミノトランスフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、アルブミン、総タンパク質、グルコース、血中尿素窒素、クレアチニン、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびフェリチンの血清中濃度を、AU−2700 Chemistry Analyzer(Olympus、Center Valley,PA)を用いて計測する。ハプトグロビンを、BNII Analyzer(Dade Behring Inc.,Newark,DE)を用いて計測する。
健常男性ボランティアのこの前向き試験では、各々に2回のRBC輸血、つまり、1回が対照(すなわち、3日間の保存後の「新鮮」)、および1回が実験用(すなわち、42日間の保存後の「古い」)を与える。初期試験の結果は、「新鮮な」RBC輸血と「古い」RBC輸血を比較する、各対象に関する6種類のサイトカイン(表1)の各々の輸血前レベルと輸血後レベルの間の最大差の一対比較である。「新鮮な」RBC輸血と「古い」RBC輸血の間で、輸血前と輸血後の血清非トランスフェリン結合鉄およびヘプシジンレベルを比較した2つの重要な副次的結果を調べる。
これまでに、18〜65歳の年齢の2人の男性ボランティアが試験を完了し、そして(1人の女性を含めた)3人が現在、組み入れられている。2人の対象からの結果を、図20〜26および32に示す。より古い保存RBC単位のみの輸血の0〜4時間後に、両ボランティアとも、総ビリルビン、血清鉄、トランスフェリン飽和度、NTBI、および絶対好中球数の劇的な上昇を示した。加えて、血清ヘプシジンレベルおよび炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン−6(IL−6)が、2人のボランティアのうち1人で上昇した(図32)。「新鮮な」RBC輸血後に、これらの分析物の検出可能な増加はない。ハプトグロビンレベルに検出可能な変化がないということは、RBCが血管外に除去されていることを示唆している。まとめると、このことは、除去されたRBCの処理後に鉄が循環中に解放される証拠を提供する;特に、このクリアランスは血漿NTBlのレベルを上げるのに十分なほど多く、血漿NTBlは健常ボランティアで通常検知されない。加えて、循環好中球およびIL−6の急激な上昇は、古い保存RBC輸血に続く炎症反応の存在を示唆している。
古い保存RBCの輸血は、鎌状赤血球症またはβ−サラセミアを患っている慢性的に輸血を受けている患者において急性炎症誘発性応答を引き起こす。
2〜6週間毎に慢性的に簡易輸血を受けている、あらゆる検出可能なRBC同種抗体を持たない、そして以前の試験研究に参加しながらCUMCにて処置を受けている、鎌状赤血球症またはβ−サラセミアの患者のコホートを特定した[90、91](表3)。彼らの平均年齢は18.8歳(4歳〜42歳の範囲)であり、65%が男性である。過去6カ月にわたる彼らの輸血履歴の再調査では、これらの患者に輸血された単位の保存期間が5〜32日間の範囲にわたり、そしてほとんどの患者が2〜6週間毎に1〜2単位を輸血されていることを示す。β−サラセミア患者の全員が脾摘出術を受けており、そして鎌状赤血球症患者は機能的に無脾症であると推定される;そのため、これらの患者のRBCクリアランスの大部分がおそらく肝臓において起こっている。
この実施例における試験施設は、実施例4に記載されているとおりである。
RBCを、幹細胞治療研究所でビオチン化するが、そこは、外来患者アフェレーシスおよび輸血施設から約25ヤード(約23メートル)離れていて、血液バンクに隣接している。幹細胞治療研究所は、FACT認証されており、同種間および自家造血幹細胞製剤を患者に提供するための最新のヒト製剤の製造/品質管理基準(current Good Tissue Practices)(cGTP)を使用している。よって、RBCアリコートをビオチン化するために、[98]に記載のような、詳細な標準的な操作手順が使用される。手順を以下に詳述する。すべてのビオチン化RBC製剤を、リムルス溶解物アッセイを用いる現行の標準的操作手順のわずかな改法を使用して、提供前にLPS夾雑がないかどうか検証する。得られた製剤のビオチン化と無菌状態の妥当性を立証するために、血液バンクから廃棄されたドナーRBCを使用した予備試験を実施する。
慢性的に簡易輸血療法を受けている鎌状赤血球症およびβ−サラセミアの患者を、あらかじめ試験する。表3には、(以下に詳述した具体的な組み入れおよび除外基準に基づく)この試験の潜在的な患者の匿名リストを示す。この試験への参加は、性別または民族性よって制限を受けないが、1歳より上の年齢に制限する。民族性データを、すべての試験対象について収集する。組み入れと除外の愚弟的な基準は、以下のとおりである:
血液科外来診療所で診察され、そして選定基準を満たす血色素病の成人および小児科の患者を、潜在的試験対象(例えば、表3の人たち)と見なす。あらゆる利害の衝突を回避するために彼らを処置している医師以外の人によって、これらの患者に口頭および書面でこの試験に関する情報を提供する。参加に前向きな人を、インフォームドコンセント後に試験に登録する。
NYBCによって維持されている頻繁なRBCドナー・データベースからのドナーを、各対象の専任の有向ドナーとして採用する。ドナーは、2倍RBC献血のためのNYBC要件を満たさなければならない(例えば、男性は、体重130lbs(約59kg)超であって、5’1”(約154.9cm)より背が高くなければならず;女性は、体重150lbs(約68kg)超であって、5’5”(約165.1cm)より背が高くなければならない)。ニューヨーク州は、16歳超、且つ、76歳未満のドナーを許可したが、ドナーが頻繁な献血歴を有することを確実にし、そして健康または社会的理由によるドナーの脱落を減少させるために、ドナー年齢を21〜65歳に制限する。すべてのドナーに、2〜2.5年間にわたり4回の2倍RBC献血に行くように依頼する。彼らが試験期間中にニューヨーク市の都市部にとどまっていることに十分に確信がもてないドナーを、除外する。加えて、β−サラセミア・コホートのすべてのドナーはABOおよびRh(D)に合致し、そして鎌状赤血球症コホートのすべてのドナーがABO、Rh(D、C、c、E、e)であり、そしてKellは、CUMCのこれらの患者による実施の現行基準のとおり合致した。最後に、対を成す輸血事象が生じた後に専用ドナーが試験から脱落したら、新しい専任ドナーをその後の献血のために採用する(すなわち、このことは、自動的に調査からの輸血受血者の除外につながるわけではない)。組み入れと除外の具体的な基準は、以下のとおりである:
生存試験は任意である(すなわち、患者はRBC生存試験を見合わせるか、全般的な調査に残るかを選ぶことができる)。加えて、患者あたり最高1回のRBC生存試験を実施する。インビボにおけるRBC生存の計測のために、袋詰めされたRBCの10mLのアリコートを、わずかな改変を伴って[98]に記載のとおりビオチン化する。概略すると、袋詰めされたRBCの10mLのアリコートを、輸血当日に試験単位からの無菌様式で取り出す。このアリコートを、4倍量のDulbecco’s PBS(Invitrogen)で3回洗浄し、175mLのチューブ(Nalgene、Rochester,NY)に移し、そしてビオチン化のために7%のヘマトクリットに調整する。10%のDMSO中の2mg/mLのN−ヒドロキシスクシンイミドビオチン(NHS−ビオチン)の原液を、0.5mLのDMSO中に10mgのNHS−ビオチン(Sigma)を溶解し、続いて4.5mLのDulbecco’s PBSを添加することによって調製する。この原液を、DMSO抵抗性材料でできた0.2μmのシリンジ・フイルター(Corning Glassware)を通す濾過によって滅菌する。NHS−ビオチン原液を、ゆるやかに撹拌しながら7%のRBC懸濁液に加えて、1μg/mLの最終的なNHS−ビオチン濃度を得る。室温にて30分間のインキュベーション後に、RBCを、少なくとも3倍量のDulbecco’s PBSで2回洗浄する。その後の2回の洗浄を、注射可能な等張食塩水で実施し、そしてRBCを6〜10mLの注射用生理的食塩水中に再懸濁する。これらのRBCを、RBC単位の輸血前に「IVプッシュ」によって注射する(合計5mL)。注射の5分後と1時間後に得た血液サンプル(EDTA中に1mL)を、1時間RBC生存を計算するのに使用し、次いで、試験輸血を始める。総括的な考え方が、より古い保存RBC輸血からの単球−マクロファージ系へのヘモグロビン鉄の急激な供給が炎症誘発性応答を引き起こすというものなので、そして急激なRBCクリアランスの大部分が輸血後の最初の1時間以内に起こるので[33]、1時間RBC生存だけを計測する。
2単位の献血された2倍RBC単位のうちの1単位の冷凍保存を、採血の24時間以内にNYBCの標準的な操作手順を使用して実施した。古い保存RBC単位の洗浄と冷凍保存RBC単位の脱グリセリン化を、同様にNYBCの標準的な操作手順に従って、輸血の24時間以内にともに実施する。RBC単位の脱グリセリン化と洗浄を、自動細胞洗浄システム(COBE2991、CaridianBCT、Lakewood, CO)を使用してそれぞれ実施する。
すべての分析物を、先に開示した実施例に記載したとおりに計測する。
これは、それぞれ3対のRBC輸血を受ける慢性的な輸血療法に関する血色素病患者の前向き試験である。それぞれの対を成す輸血事象を、1種類の対照および1種類の実験的輸血で構成する(試験の概要については図11を参照のこと)。最初の対を成す輸血事象では、慢性的に輸血を受けている患者においてより古い保存RBCの輸血が急性炎症誘発性応答を引き起こすという考え方を検証する。この輸血事象は、1種類の対照輸血(すなわち、「新鮮:」3〜14日間の保存)および1種類の実験的輸血(すなわち、「古い:」28〜42日間の保存)で構成される。初期試験の結果は、「新鮮な」RBC輸血と「古い」RBC輸血からの得られたレベルを比較する、各対象に関する6種類のサイトカイン(表1)の各々の輸血前レベルと輸血後レベルの間の最大差の一対比較である。他の2回の対を成す輸血事象は、洗浄した古い保存RBCが同様の炎症誘発性サイトカイン反応を引き起こすかどうか、および冷凍保存がさらに重大なサイトカイン反応を引き起こすかどうかという副次的な考え方を検証する。副次的な結果を、慢性的な溶血状況を有する鎌状赤血球症患者と通常は慢性的な溶血状況を有していないβ−サラセミア患者の間のサイトカイン反応の程度を比較することによって調べる。
鉄キレート剤を用いた鎌状赤血球症およびβ−サラセミア患者の処置が、より古い保存RBCの輸血によって誘発される急性炎症誘発性応答を予防する。
この実験では、可能性のある治療的介入を検証する。よって、この実験は、患者が鉄キレート療法中に、「新鮮な」(すなわち、3〜14日間の保存)RBC単位および「古い」(28〜42日間の保存)RBC単位の対を成す輸血事象を含むための、実施例5で開示した2年間の試験の続きを単に表している。実施例5で開示した3回の対を成す輸血事象では、患者は輸血前に一時的にキレート療法を中止する;この実験構成では、キレート化中の炎症誘発性サイトカイン反応が計測され、そしてその結果を実施例5に記載の最初の対を成す輸血事象で得た結果と比較する。同じ専任ドナーを使用し、そして同じ分析物を計測する。よって、すべての試験を図12にまとめる;この4年間のプロジェクトのうちの2年目と3年目に起こることとしてこの図面に記録したが、これらの試験が一部の患者について4年目まで続くことが予想される。例えば、18人の患者が登録されると、これは合計144回の輸血(すなわち、18×8)を必要とする;目標は、平均で1週間に約1.1回の輸血を実施することである。
これは、キレート療法中に2種類のRBC輸血を受け、そしてキレート療法を中止して2種類のRBC輸血を受ける血色素病患者の前向き試験である、1種類の対照輸血(すなわち、「新鮮:」3〜14日間の保存)および1種類の実験的輸血(すなわち、「古い:」28〜42日間の保存)。初期試験の結果は、各対象に関する6種類のサイトカイン(表1)各々の輸血前後のレベルの間の最大差の一対比較であり、「新鮮な」RBC輸血と「古い」RBC輸血の間で、キレート療法中のこの差を、キレート療法を中止して得られた値と比較する。
鉄キレート剤による鎌状赤血球症およびβ−サラセミア患者の処置は、より古い保存RBCの輸血によって誘発される急性炎症誘発性応答を予防すると予想される。
本願明細書において参照された、又は以下に列挙された全ての刊行物及び特許は、あたかもそれらの個々の刊行物又は特許が、具体的に又は個別に参照により組み込まれることが意図されていたかのように、本明細書において参照により完全に組み込まれる。矛盾がある場合には、全ての定義を含む本願が支配的となり得る。
対象発明の具体的な実施形態について議論したが、先の明細書は説明のためのものであって、限定するものではない。本発明の多くの変形形態が、この明細書および以下の請求項を検討することで当業者には明らかになるであろう。本発明の完全な範囲は、同等物のそれらの完全な範囲だけでなく、請求項を参照し、そしてそういった変形形態だけでなく、明細書を参照することによって判断されるべきである。
Claims (42)
- 時間の経った赤血球を含む組成物の患者への急性輸血によって引き起こされる患者の副作用を改善するための器具であって、前記組成物と無菌状態で接触する内部表面、及び有効量の鉄キレート剤を含んでなる、前記器具。
- 前記鉄キレート剤が、前記組成物と無菌状態で接触する前記器具の内部表面に配置される、請求項1に記載の器具。
- 前記鉄キレート剤が、前記組成物と無菌状態で接触する前記内部表面によって形成された前記器具の内部空間内に配置される、請求項1に記載の器具。
- 輸血を必要としている患者への輸血のための赤血球を保存するためのコンテナである、請求項1に記載の器具。
- 前記コンテナが輸血バッグである、請求項4に記載の器具。
- 前記器具が血液フィルターである、請求項1に記載の器具。
- 前記鉄キレート剤が、アポトランスフェリン、ラクトトランスフェリン、金属結合酵素、ヒドロキサム酸重合体、リン酸化ミオイノシトール重合体、ヘムB、ヘムA、ヘムC、デスフェロキサミン(DFO)、デスフェリチオシン(DFT)、デスフェリ−エキソケリン(D−Exo)、(S)−DMFT、(S)−DADMDFT、(S)−DADFT、4’−(OH)−DADFT、4’−(OH)−DADMDFTまたはその六座誘導体BDU、デフェリプロン(L1)、その代謝がヒドロキシピリジノン類似体を生じるヒドロキシピリジノンエステル・プロドラッグ、CP94、CP502、CP365、CP102、CP41、CP38、LiNAII、Pr−(Me−3,2−HOPO)およびその六座類似体TREN−(Me−3,2−HOPO)、CP117、CP165、タキピリジンアルキル類似体、タキピリジン二級アミン連結類似体、タキピリジンピリジル連結類似体、タキピリジンピリジル連結マレイミド誘導体類似体、PIH、SIH、PCIH、PKIH、PIH類似化合物101、PIH類似化合物102、PIH類似化合物103、PIH類似化合物104、PIH類似化合物105、PIH類似化合物106、PIH類似化合物107、PIH類似化合物108、PIH類似化合物109、PIH類似化合物110、PIH類似化合物112、PIH類似化合物113、PIH類似化合物114、PIH類似化合物115、PIH類似化合物201、PIH類似化合物202、PIH類似化合物204、PIH類似化合物205、PIH類似化合物206、PIH類似化合物207、PIH類似化合物208、PIH類似化合物209、PIH類似化合物212、PIH類似化合物215、PIH類似化合物301、PIH類似化合物302、PIH類似化合物305、PIH類似化合物307、PIH類似化合物308、PIH類似化合物309、PIH類似化合物310、PIH類似化合物312、PIH類似化合物315、PCBH、PCHH、PCBBH、PCAH、PCTH、PKBH、PKAH、PK3BBH、PKHH、PKTH、5−HP、トリアピン(Triapine)、NT、N2mT、N4mT、N44mT、N4eT、N4aT、N4pT、DpT、DP2mT、Dp4mT、Dp44mT、Dp4eT、Dp4aT、Dp4pT、デフェラシロクス(deferasirox)(Exjade、ICL670A)、デフェラシロクスの5,5−ジフェニル−1,2,4−トリアゾール類似体、HBED、Faralex−G、4−ヒドロキシ−2−ノニルキノリン、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項1に記載の器具。
- 前記鉄キレート剤が、デスフェロキサミン、デフェラシロクス、およびアポトランスフェリンから成る群から選択される、請求項7に記載の器具。
- 時間の経った赤血球を含む組成物の患者への急性輸血によって引き起こされる患者の副作用を改善するためのキットであって、鉄キレート剤を直接的に組成物へ、血液製剤関連器具へ、またはそれを必要としている患者へ投与する方法についての使用説明書が共に包装された、有効量の鉄キレート剤を含んでなるコンテナを含んでなる、前記キット。
- 前記血液製剤関連器具が、血液フィルターまたは血液バッグである、請求項9に記載のキット。
- 前記鉄キレート剤が、アポトランスフェリン、ラクトトランスフェリン、金属結合酵素、ヒドロキサム酸重合体、リン酸化ミオイノシトール重合体、ヘムB、ヘムA、ヘムC、デスフェロキサミン(DFO)、デスフェリチオシン(DFT)、デスフェリ−エキソケリン(D−Exo)、(S)−DMFT、(S)−DADMDFT、(S)−DADFT、4’−(OH)−DADFT、4’−(OH)−DADMDFTまたはその六座誘導体BDU、デフェリプロン(L1)、その代謝でヒドロキシピリジノン類似体を生じるヒドロキシピリジノンエステル・プロドラッグ、CP94、CP502、CP365、CP102、CP41、CP38、LiNAII、Pr−(Me−3,2−HOPO)およびその六座類似体TREN−(Me−3,2−HOPO)、CP117、CP165、タキピリジンアルキル類似体、タキピリジン二級アミン連結類似体、タキピリジンピリジル連結類似体、タキピリジンピリジル連結マレイミド誘導体類似体、PIH、SIH、PCIH、PKIH、PIH類似化合物101、PIH類似化合物102、PIH類似化合物103、PIH類似化合物104、PIH類似化合物105、PIH類似化合物106、PIH類似化合物107、PIH類似化合物108、PIH類似化合物109、PIH類似化合物110、PIH類似化合物112、PIH類似化合物113、PIH類似化合物114、PIH類似化合物115、PIH類似化合物201、PIH類似化合物202、PIH類似化合物204、PIH類似化合物205、PIH類似化合物206、PIH類似化合物207、PIH類似化合物208、PIH類似化合物209、PIH類似化合物212、PIH類似化合物215、PIH類似化合物301、PIH類似化合物302、PIH類似化合物305、PIH類似化合物307、PIH類似化合物308、PIH類似化合物309、PIH類似化合物310、PIH類似化合物312、PIH類似化合物315、PCBH、PCHH、PCBBH、PCAH、PCTH、PKBH、PKAH、PK3BBH、PKHH、PKTH、5−HP、トリアピン、NT、N2mT、N4mT、N44mT、N4eT、N4aT、N4pT、DpT、DP2mT、Dp4mT、Dp44mT、Dp4eT、Dp4aT、Dp4pT、デフェラシロクス(Exjade、ICL670A)、デフェラシロクスの5,5−ジフェニル−1,2,4−トリアゾール類似体、HBED、Faralex−G、4−ヒドロキシ−2−ノニルキノリン、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項9に記載のキット。
- 前記鉄キレート剤が、デスフェロキサミン、デフェラシロクス、およびアポトランスフェリンから成る群から選択される、請求項11に記載のキット。
- 時間の経った赤血球を含む組成物の患者への急性輸血によって引き起こされる患者の副作用を改善するための方法であって、前記時間の経った赤血球のマクロファージ食作用によって放出された鉄をキレートすることができる鉄キレート剤を供給することを含み、ここで前記キレート剤は前記患者の副作用を改善する、前記方法。
- 前記副作用がサイトカインストームである、請求項13に記載の方法。
- 前記副作用が、患者における鉄依存性病原菌の増大である、請求項13に記載の方法。
- 前記鉄キレート剤が、ペプチド、重合体、有機または無機小分子、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記鉄キレートペプチドが、アポトランスフェリン、ラクトトランスフェリン、金属結合酵素、かかるタンパク質由来の鉄結合性ドメイン、およびかかるタンパク質の鉄結合性部位を模倣するように設計した合成ペプチドから成る群から選択される、請求項16に記載の方法。
- 前記鉄キレート重合体が、ヒドロキサム酸重合体またはリン酸化ミオ−イノシトール重合体である、請求項16に記載の方法。
- 前記鉄キレート剤が、ヘムB、ヘムA、およびヘムCから成る群から選択されるポルフィリン環である、請求項13に記載の方法。
- 前記鉄キレート剤が、シデロホアまたは合成によって得られたその類似体である、請求項13に記載の方法。
- 前記シデロホアが、デスフェロキサミン(DFO)、デスフェリチオシン(DFT)、およびデスフェリ−エキソケリン(D−Exo)から成る群から選択される、請求項20に記載の方法。
- 前記鉄キレート剤が、(S)−DMFT、(S)−DADMDFT、(S)DADFT、4’−(OH)−DADFT、および4’−(OH)−DADMDFTまたはその六座誘導体BDUから成る群から選択されるDFT類似体である、請求項13に記載の方法。
- 前記鉄キレート剤がヒドロキシピリジノンである、請求項13に記載の方法。
- 前記ヒドロキシピリジノンが、デフェリプロン(L1)もしくはその類似体、またはその代謝でヒドロキシピリジノン類似体を生じるヒドロキシピリジノンエステル・プロドラッグから選択される、請求項23に記載の方法。
- 前記デフェリプロン類似体が、CP94、CP502、CP365、CP102、CP41、CP38、LiNAII、Pr−(Me−3,2−HOPO)およびその六座類似体TREN−(Me−3,2−HOPO)から成る群から選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記ヒドロキシピリジノンエステル・プロドラッグが、CP117およびCP165から成る群から選択される、請求項24に記載の方法。
- 前記鉄キレート剤が、タキピリジンまたはその類似体である、請求項13に記載の方法。
- 前記タキピリジン類似体が、タキピリジンアルキル類似体、タキピリジン二級アミン連結類似体、タキピリジンピリジル連結類似体、およびタキピリジンピリジル連結マレイミド誘導体類似体から成る群から選択される、請求項27に記載の方法。
- 前記鉄キレート剤がアロイルヒドラゾンである、請求項13に記載の方法。
- 前記アロイルヒドラゾン鉄キレート剤が、PIH、SIH、311シリーズ類似化合物、PCIH、PKIH、およびそれぞれの親化合物の類似体から成る群から選択される、請求項29に記載の方法。
- 前記PIH類似体が、100シリーズ類似化合物101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、112、113、114および115から成る群から選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記PIH類似体が、200シリーズ類似化合物201、202、204、205、206、207、208、209、212および215から成る群から選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記311シリーズ類似化合物が、化合物301、302、305、307、308、309、310、312および315から成る群から選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記PCIH類似体が、PCBH、PCHH、PCBBH、PCAHおよびPCTHから成る群から選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記PKIH類似体が、PKBH、PKAH、PK3BBH、PKHHおよびPKTHから成る群から選択される、請求項30に記載の方法。
- 前記鉄キレート剤がチオセミカルバゾンである、請求項13に記載の方法。
- 前記チオセミカルバゾンが、5−HP、トリアピン、NTシリーズのメンバー、およびDpTシリーズのメンバーから成る群から選択される、請求項36に記載の方法。
- 前記NTシリーズが、NT、N2mT、N4mT、N44mT、N4eT、N4aT、およびN4pTから成る群から選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記DpTシリーズが、DpT、DP2mT、Dp4mT、Dp44mT、Dp4eT、Dp4aT、およびDp4pTから成る群から選択される、請求項37に記載の方法。
- 前記鉄キレート剤が、デフェラシロクス(Exjade、ICL670A)、デフェラシロクスの5,5−ジフェニル−1,2,4−トリアゾール類似体、HBED、Faralex−G、および4−ヒドロキシ−2−ノニルキノリンから成る群から選択される、請求項13に記載の方法。
- 前記供給ステップが、副作用を改善するのに有効である量の鉄キレート剤を患者に投与することを含む、請求項13に記載の方法。
- 前記供給ステップが、輸血に先立って、時間の経った赤血球を含む組成物を、副作用を改善するのに有効な量の鉄キレート剤と接触させることを含む、請求項13に記載の方法。
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