JP2012525827A - 高グリセリン濃度を用いる１，３−プロパンジオール生産のための連続培養 - Google Patents

Abstract

本発明は、高グリセリン含量の培養培地で微生物を培養することを含んでなる１，３−プロパンジオールの新規な生産方法に関する。本発明はまた、高グリセリン含量を含んでなる培地からの１，３−プロパンジオールの生産に適合された新規な微生物または微生物株に関する。本発明はまた、グリセロール代謝が１，３−プロパンジオール生産に向けられ、高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖可能とされた「適合微生物」に関する。
本発明はまた、その方法によって得られた生物起源の１，３−プロパンジオールに関する。最後に、本発明は、熱可塑性ポリウレタンにおける鎖延長剤としての、ポリトリメチレンテレフタレートにおけるモノマーとしての、また、化粧用処方物における成分としての、前記生物起源の１，３−プロパンジオールの使用に関する。

Description

本発明は、高グリセリン含量の培養培地で微生物を培養することを含んでなる１，３−プロパンジオールの新規な生産方法に関する。本発明はまた、高グリセリン含量を含んでなる培地からの１，３−プロパンジオールの生産に適合された新規な微生物または微生物株に関する。本発明はまた、グリセロール代謝が１，３−プロパンジオール生産に向けられ、高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖可能とされた「適合微生物(adapted micro organism)」に関する。本発明はまた、本発明の方法によって得られた生物起源の１，３−プロパンジオールに関する。最後に、本発明は、熱可塑性ポリウレタンにおける鎖延長剤(extender chain)としての、ポリトリメチレンテレフタレートにおけるモノマーとしての、また、化粧用処方物における成分としての、前記生物起源の１，３−プロパンジオールの使用に関する。

１，３−プロパンジオール（ＰＤＯ）は、最も古い既知の発酵産物の１つである。ＰＤＯは、１８８１年という初期にAugust Freundにより、活性生物としてクロストリジウム・パスツリアヌム(Clostridium pasteurianum)を明らかに含有するグリセロール発酵混合培養物において同定確認された。ＰＤＯ（トリメチレングリコール、プロピレングリコール）を生産する種々の腸内細菌の発酵の定量分析は、１９２８年という初期にデルフトの微生物学校で始まり、１９４０年代にアイオワ州エームズで継続された。１９６０年代には、関心はグリセロールに作用する酵素へ、特に、グリセロールデヒドラターゼおよびジオールデヒドラターゼが補酵素Ｂ１２を要求するという点で特異であったのでこれらの酵素へ移った。ＰＤＯ生成クロストリジウム菌は１９８３年に初めて、グリセロール排泄藻類からの特異産物を得るプロセスの一部として記載された(Nakas et al., 1983)。ＰＤＯはグリセロール発酵の典型的な産物であり、他の有機基質の嫌気的変換では見られたことはなかった。生物種としては極めて少ないが、これらの微生物は全てがＰＤＯを生成することができる。これらの微生物には、クレブシエラ属（肺炎桿菌(K. pneumoniae)）、エンテロバクター属（Ｅ．アグロメランス(E. agglomerans)）およびシトロバクター属（Ｃ．フレウンディー(C. freundii)）、乳酸桿菌属（乳酸短桿菌(L. brevis)およびブーフナー乳酸桿菌(L. buchneri)、Ｃ．ブチリカム(C. butyricum)およびＣ．パスツリアヌム(C. pasteurianum)種のクロストリジウム属が含まれる。

発酵産物の分析は、グリセロール部分は、この種々の種の糖発酵の場合と同じ産物、すなわち、酢酸、２，３−ブタンジオール、酪酸、乳酸、エタノールおよびコハク酸に変換されることを示す。この変換は成長に必要なエネルギーを与えるが、これらの産物の多くの還元型のものも放出され、それらがグリセロールからＰＤＯへの還元的変換に用いられる。クロストリジウム属でＰＤＯ収量を低下させるブチレートの生成は、クレブシエラ属のエタノール生成に幾分か匹敵するが、成長速度により依存的であると思われる。ブチレートは、過剰量の基質の不在下であっても希釈率とともに急速に減少する。どんな場合でも、アセテート／ブチレート比の変化はＰＤＯ収量に大きな影響を及ぼさない。

二官能性有機化合物としてのＰＤＯは、多くの合成反応に、特に、ポリエステル、ポリエーテルおよびポリウレタンを生産するための重縮合のモノマーとして潜在的に用いることができる。ＰＤＯは種々の化学経路によって生産することができるが、極度な汚染物質を含有する廃液流を出し、そして、生産コストは高く、化学的に生産されたＰＤＯは、石油化学的に利用可能な１，２−エタンジオール、１，２−プロパンジオールおよび１，４−ブタンジオールのようなジオールと競合し得ない。従って、それまでのところ、ＰＤＯはわずかな市場規模のニッチ利用しか見出せていない。これが、１９９５年にデュポンがグルコースのＰＤＯへの生物変換に関する研究プログラムを始めた理由である。このプロセスは環境に優しいが、ｉ）価格が極めて高い補因子ビタミンＢ１２を使用する、およびｉｉ）生産株が不安定であるために不連続なプロセスである、という欠点がある。バイオディーゼル工業から出る大量のグリセロールが利用できるため、ビタミンＢ１２に頼らず、炭素収量のより高い連続的プロセスが有利となる。

ＰＤＯが、グリセロールと塩および水の混合物をおよそ８０〜８５％含むバイオディーゼル生産の望まない副産物であるグリセリンから生産可能であることは当技術分野で公知である。

Ｃ．ブチリカムは、バッチ法および二段階連続発酵において増殖し、工業用グリセロールからＰＤＯを産生可能であったことが従前に記載されている(Papanikolaou et al., 2000)。しかしながら、最高グリセロール濃度において、得られる最大ＰＤＯ力価は、希釈率０．０２ｈ^−１で４８．１ｇ／Ｌであり、生産性０．９ｇ／Ｌ／Ｈということであった。培養は、供給培地中最大グリセロール濃度９０ｇ／Ｌで、当業者には細菌バイオマス生産を増やすことに役立つことで知られている高価な有機窒素含有化合物である酵母抽出物の存在下で行われた。

ＷＯ２００６／１２８３８１には、天然ＰＤＯ生産生物、例えば、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、Ｃ．ブチリカムまたはＣ．パスツリカム(C. pasteuricum)などを用いたバッチ培養および流加培養でのＰＤＯ生産のためのこのグリセリンの使用が開示されている。さらに、ＷＯ２００６／１２８３８１において使用された培地はまた、酵母抽出物も含有する。この特許出願に記載のとおり、到達した最大の生産性は０．８〜１．１ｇ．ｌ．ｈ^−１の間である。

Ｃ．アセトブチリカム(C. acetobutylicum)ＤＧ１ ｐＳＰＤ５と呼ばれる、Ｃ．ブチリカム由来のビタミンＢ１２非依存性グリセロールデヒドラターゼとＰＤＯデヒドロゲナーゼを含有するように改変されたＣ．アセトブチリカム株の能力は、Gonzalez-Pajuelo et al., 2005に記載されている。この株は、１２０ｇ．ｌ^−１までの純粋なグリセロールを含有する供給培地では最初は増殖し、ＰＤＯを産生する。さらに、最大６０ｇ．ｌ^−１の純粋なグリセロールまたは工業用グリセロールを含有する供給培地での分析ではいかなる違いも確認されなかった。Ｃ．ブチリカムをＣ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５と比較したときには、著者らによって全体的類似行動が観察されたGonzalez-Pajuelo et al., 2006。

しかしながら、有機窒素を含まない合成供給培地中１０５ｇ．ｌ^−１の工業用グリセロールで試験した同じＣ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５株は、同じ濃度の純粋なグリセロールの場合と同じ能力を発揮することができなかった（実施例１参照）。

本発明は、高濃度の工業用グリセリンを用いる１，３−プロパンジオール生産のための、より高いＰＤＯ力価および生産性に到達することができる手段を提供する。

本発明は、グリセリンの連続発酵プロセスにおける１，３−プロパンジオールの生産方法であって、グリセロールから１，３−プロパンジオールへの変換が可能な生産微生物を培養培地で培養すること、および１，３−プロパンジオールを回収することを含んでなり、前記培養培地が高濃度の、グリセロールを含んでなる工業用グリセリンを含んでなることを特徴とし、前記生産微生物が高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖するように予め適合された微生物である方法に関する。

好ましい実施形態では、グリセロールは培養培地中に９０〜１２０ｇ／Ｌの間、好ましくは約１０５ｇ／Ｌの濃度で存在する。

培養培地は、好ましくは、いかなる有機窒素源も添加していない、特には酵母抽出物を含まない合成培地である。

工業用グリセリンは、特にはバイオディーゼル生産の副産物である。

生産微生物は、好ましくは細菌であり、より好ましくはクロストリジウム属のメンバーから選択され、特にはクロストリジウム・アセトブチリカムである。

生産微生物は、有利には、グリセロールからの１，３−プロパンジオール生産が改善可能であるように遺伝的に改変された微生物である。

好ましい実施形態では、生産微生物におけるグリセロールデヒドラターゼ活性は、補酵素Ｂ１２またはその前駆体の１つの存在に依存せず、クロストリジウム・ブチリカムに由来する。

好ましくは、生産微生物は、高濃度の工業用グリセリンを含んでなる培養培地で微生物を低希釈率で培養し、適合微生物を選択することによって、高濃度の工業用グリセリンを含む培養培地で増殖するように予め適合された微生物である。

最終的には、１，３−プロパンジオールはさらに精製される。

本発明はまた、高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖するように適合された微生物への微生物の改変方法であって、高濃度の工業用グリセリンを含んでなる培養培地で微生物を低希釈率で培養し、高濃度の工業用グリセリンを含む培養培地で増殖が可能な適合微生物を選択することを含む方法に関する。

微生物は、有利には、低希釈率で２４時間から１０日まで、好ましくは２日より長い、より好ましくは約８日の期間にわたって培養される。

希釈率は、一般的には０．００５〜０．１ｈ^−１の間、好ましくは０．００５〜０．０２ｈ^−１の間である。希釈率は、適合法中に変更することができ、最終的には、第１工程で０．００５〜０．０２ｈ^−１の間に、第２工程で希釈率は０．１ｈ^−１、好ましくは０．０６ｈ^−１まで高められる。

本発明はまた、適合微生物、すなわち、上記および下記の方法によって得ることができる、高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖するように適合された生産微生物に関する。

本発明はまた、本発明の方法によって得られる生物起源の１，３−プロパンジオールに関する。

本発明はまた、−３４‰より低いδ^１３Ｃと、２１，９‰〜０，５‰の間のδ^１８Ｏ、好ましくはδ^１３Ｃが−３５‰より低く、δ^１８Ｏが２１，９‰〜０，５‰の間である、より好ましくはδ^１３Ｃが−３５，０５‰〜−３６，０９‰の間であり、δ^１８Ｏが２１，９‰〜１７，３４‰の間の中から選択される^１３Ｃ同位体値と^１８Ｏ同位体値の組合せを特徴とする、生物起源の１，３−プロパンジオールに関する。

好ましい実施形態では、生物起源の１，３−プロパンジオールは、−２〜０の間、好ましくは−１〜−０，２の間、より好ましくは−０，６５〜−０，４の間のδ^１３Ｃ／δ^１８Ｏ同位体比値を特徴とする。

本発明はまた、熱可塑性ポリウレタンにおける鎖延長剤としての、ポリトリメチレンテレフタレートにおけるモノマーとしての、または化粧用処方物における成分としての、本発明の方法によって得られる、または上記で定義された生物起源の１，３−プロパンジオールの使用に関する。

発明の具体的説明

本発明は、グリセリンの連続発酵プロセスにおける１，３−プロパンジオールの生産方法であって、グリセロールから１，３−プロパンジオールへの変換が可能な生産微生物を培養培地で培養すること、および１，３−プロパンジオールを回収することを含んでなり、前記培養培地は高濃度の、グリセロールを含んでなる工業用グリセリンを含んでなり、前記生産微生物は高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖するように予め適合された微生物である方法に関する。

「微生物」という用語は、細菌、酵母および真菌からなる群の中から選択される微生物を意味する。優先的には、微生物は、好ましくは、腸内細菌科、バシラス科、クロストリジウム科、ストレプトマイセス科およびコリネバクテリア科からなる群の中から選択される細菌である。より優先的には、細菌は、エシェリキア種（好ましくは大腸菌(Escherichia coli)）、クレブシエラ種（好ましくは肺炎桿菌）、バチルス種（好ましくは枯草菌(Bacillus subtilis)）、クロストリジウム種（好ましくはクロストリジウム・アセトブチリカムおよびクロストリジウム・ブチリカム）およびコリネバクテリウム種（好ましくはコリネバクテリウム・グルタミカム(Corynebacterium glutamicum)）からなる群の中から選択される。

「エシェリキア」、「クレブシエラ」、「バチルス」、「クロストリジウム」および「コリネバクテリウム」という用語は、これらの科または属に属するあらゆる種類の微生物を指す。

「生産微生物」または「生産微生物株」という用語は、微生物のグリセロール代謝が１，３−プロパンジオール生産に向けられた微生物または微生物株を意味する。

「適合された微生物」とは、高濃度の工業用グリセリンで増殖可能であるように改変された微生物を意味する。

「適当な培養培地」または「培養培地」とは、生産株の成長およびジオール生産用に最適化された培養培地を指す。

「高グリセリン含量」または「高濃度のグリセリン」という用語は、培養培地中のグリセロールが９０ｇ／ｌより高いことを意味する。好ましい実施形態では、培養培地は、グリセロールを９０〜１２０ｇ／Ｌの間、好ましくは約１０５ｇ／Ｌの濃度で含んでなる。

「工業用グリセリン」とは、実質的に精製することなく工業プロセスから得られるグリセリン製品を意味する。工業用グリセリンはまた、「粗製グリセリン」、「粗製グリセロール」または「工業用グリセロール」と呼ばれることもある。工業用グリセリンは、約７０％を超える、好ましくは約８０％を超えるグリセロール、１５％未満の水および無機塩や脂肪酸などの不純物を含有する。無機塩の濃度は、１０％未満、好ましくは５％未満である。脂肪酸の濃度は、２０％未満、好ましくは５％未満である。工業用グリセリンの最も代表的な脂肪酸は、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノレン酸、リノール酸およびアラキジン酸である。

工業用グリセリンが得られる工業プロセスは、とりわけ、脂肪および油、特に植物由来の脂肪および油が、洗剤または潤滑剤などの工業製品へと加工される製造方法である。かかる製造方法では、工業用グリセリンは副産物と考えられる。

特定の実施形態では、工業用グリセリンはバイオディーゼル生産の副産物であり、バイオディーゼル生産から得られるグリセリンの既知の不純物を含んでなり、約８０〜８５％のグリセロールと、塩、水および、脂肪酸などのいくつかの他の有機化合物を含んでなる。バイオディーゼル生産から得られる工業用グリセリンは、さらなる精製工程に付されていない。

「合成培地」という用語は、生物を成長させる化学的に定義された基質を含んでなる培養培地を意味する。

本発明の培養培地において、グリセロールは、有利には単一炭素源である。好ましくは、この培養培地は有機窒素源を含有しない。窒素は、植物および動物の両方において成長および生殖に必須である天然に存在する元素である。窒素は、アミノ酸においても多くの他の有機化合物および無機化合物においても見つけられる。「有機窒素」とは、本発明によれば、生きている生物から得られる、窒素を含む有機化合物を意味する。細菌培養用の通常の有機窒素源は、酵母抽出物を含んでなる。

好ましい実施形態では、生産微生物はクロストリジウム株、より好ましくはクロストリジウム・アセトブチリカムである。

本発明のもう１つの実施形態では、生産微生物は遺伝的に改変された細菌である。

「遺伝的に改変された微生物」という用語は、その株がその遺伝的特徴を変化させる目的のために形質転換されていることを意味する。内在性遺伝子を減弱、欠失、または過剰発現させることができる。外来遺伝子を導入したり、プラスミドによって運ばせたり、またはその株のゲノムに組み込んだりして、細胞内で発現させることができる。

本明細書において「プラスミド」または「ベクター」という用語は、細胞の中心の代謝の一部ではない遺伝子を多くの場合運び、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である染色体外要素を指す。

本発明のもう１つの実施形態では、前記方法は、生産微生物が、補酵素Ｂ１２またはその前駆体の１つの存在に依存しない、クロストリジウム・ブチリカムに由来するグリセロールデヒドラターゼ活性を有することを特徴とする。

特に、生産微生物は、プラスミドによって過剰発現されるかまたは微生物の染色体に組み込まれる（ビタミンＢ１２非依存性１，３−プロパンジオール経路に関与する酵素をコードする）、Ｃ．ブチリカム由来の１，３−プロパンジオールオペロンの追加のコピーを導入することによって１，３−プロパンジオール生産のフラックスの増大を示す。例えば、１，３−プロパンジオールオペロンの過剰発現には、ｐＳＰＤ５プラスミドを使用することができる。

グリセロール代謝を１，３−プロパンジオール生産に向けるための方法は、当技術分野で公知である（例えば、ＷＯ２００６／１２８３８１、Gonzalez-Pajuelo & al. 2006を参照）。

本発明のもう１つの実施形態では、生産微生物は、高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖するように予め適合された微生物である。生産微生物の前記「適合」は、高濃度の工業用グリセリンを含んでなる培養培地で微生物を低希釈率で培養し、高濃度の工業用グリセリンを含む培養培地で増殖が可能な適合微生物を選択することによって得られる。

本発明はまた、高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖するように適合された微生物への微生物の改変方法に関する。

生産微生物を高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖が可能な生産微生物へと形質転換するために、当業者はいくつかの「適合プロセス」を選択することができる。

本発明によれば、高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖するように適合された微生物への微生物の改変は、高濃度の工業用グリセリンを含んでなる培養培地で微生物を低希釈率で培養し、高濃度の工業用グリセリンを含む培養培地で増殖が可能な適合微生物を選択することを含んでなる。

微生物は、有利には、低希釈率で２４時間から１０日まで、好ましくは２日より長い、より好ましくは約８日の期間にわたって培養される。

希釈率は、一般的には０，００５〜０，１ｈ^−１の間、好ましくは０，００５〜０，０２ｈ^−１の間である。希釈率は、適合法中に変更することができ、最終的には、第１工程で０．００５〜０，０２ｈ^−１の間に、第２工程で希釈率は０，１ｈ^−１、より好ましくは０，０６ｈ^−１まで高められる。適合法中に希釈率を改変する場合、０．００５〜０．０２ｈ^−１の間の希釈率を「低希釈率」と呼び、一方、０．０２〜０．１ｈ^−１の間の希釈率を普通希釈率と呼ぶ。

本発明はまた、上記の方法によって得ることができる、高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖するように適合された微生物に関する。

本発明の方法を用いて適合された微生物は、好ましくは、高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖するようにさらに適合された生産微生物である。

前記適合微生物はまた、最初に高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖するように適合され、さらにグリセロール代謝を１，３−プロパンジオール生産へ向けるように改変された微生物でもある。

本発明による「適合微生物」は、高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖するように適合された生産微生物であり、
−そのグリセロール代謝が１，３−プロパンジオール生産に向けられている、および
−前記微生物は、高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖が可能である
という２つの基本特性を有する。

本発明の特定の実施形態では、Ｃ．アセトブチリカムＤＧ１ ｐＳＰＤ５株は、バイオディーゼル生産からの１０５ｇ．ｌ^−１の粗製グリセロールを含有する供給培地を用いて、０．００５〜０．０２ｈ^−１の間、好ましくは０．０２ｈ^−１の低希釈率での連続培養により培養される。最大１０日、好ましくは５〜８日の間の期間かかって、その株は供給培地中に存在する高グリセリン濃度に適合され、希釈率を０．１ｈ^−１まで、好ましくは０．０６ｈ^−１まで高めることができる（実施例２参照）。

希釈率の段階的上昇は、バッチ期終了時〜１０日の間に、優先的には５日、５〜８日の間、約７日の後に行うことができ、結果として、連続培養の生産性の向上がもたらされる（実施例３参照）。

有利には、適合期の後、供給培地中のグリセロール濃度を１２０ｇ．ｌ^−１まで高めることができる。しかしながら、１２０ｇ．ｌ^−１の工業用グリセロールを用いて前記株を適合させる直接的な試みは、グリセロール濃度１０５ｇ．ｌ^−１に関しては希釈率０．０２ｈ^−１でも不可能であり、これはまた前記株が事前の適合なしに供給培地中高グリセリン濃度の存在下で増殖することができないことを示している。

本発明の方法は、その種々の実施形態（遺伝的に改変された微生物の使用および／または有機窒素源を添加していない培地の使用）において１，３−プロパンジオールの生産を導き、その際、０．０５〜０．６ｇ．ｈ^−１の間の希釈率では、収量は０，４〜０．６ｇ．ｇ^−１の間であり、生産性は１．８〜３．５ｇ．ｌ^−１．ｈ^−１の間である。好ましくは、収量は０．５〜０．５６ｇ．ｇ^−１の間であり、生産性は２〜２．９ｇ．ｌ^−１．ｈ^−１の間である。

本発明の特定の態様では、生産された１，３−プロパンジオールをさらに精製する。

連続発酵プロセスは当業者には公知である。

その発酵プロセスは、一般的には、少なくともグリセリン、グリセロールを含有するバイオディーゼル生産の副産物、および必要に応じて代謝産物の生産のための補基質を含有する、使用する微生物に適合した既知の定義された組成の無機培養培地の入ったリアクターで行われる。

本発明のこの方法は、好ましくは、連続的プロセスにより実現される。当業者ならば、これらの各実験条件を管理する方法、および本発明による微生物の培養条件を決定する方法を熟知している。特に、クロストリジウムは、Ｃ．アセトブチリカムの場合には２０℃〜６０℃の間、優先的には２５℃〜４０℃の間の温度で発酵させる。

発酵培地から１，３−プロパンジオールを回収し、最終的に精製するための方法は当業者には公知である。１，３−プロパンジオールは蒸留によって単離し得る。ほとんどの実施形態では、１，３−プロパンジオールは、発酵培地からアセテートなどの副産物とともに蒸留され、その後、公知の方法によってさらに精製される。

本発明はまた、上記の方法に従って得られた生物起源の１，３−プロパンジオールに関する。

本発明はまた、その同位体比を特徴とする生物起源の１，３−プロパンジオールに関する。水素（Ｄ／Ｈ）と炭素（^１３Ｃ／^１２Ｃ）の同位体比の分析により、蜂蜜(Grenier-Lcustalot et al., 2006)やワイン(Guillou et al, 2001)などの特定製品の真正性指標が得られる。^１３Ｃ／^１２Ｃ同位体比は、起源識別の指標となり、特定製品および使用原料の生合成代謝経路を反映する。実際には、カルビン・ベンソン光合成回路を用いるＣ３植物とハッチ・スラック光合成回路を用いるＣ４植物とを識別することができる。ＷＯ０１／１１０７０には、グルコースから生産された生物起源の１，３−プロパンジオールの^１３Ｃ／^１２Ｃ同位体比が−１０，９〜−１５，４の間であり；グリセロールから生産された生物起源の１，３−プロパンジオールの^１３Ｃ／^１２Ｃ同位体比が−２２，４１〜−２２，６０の間であり、一方、化学的に生産された１，３−プロパンジオールの^１３Ｃ／^１２Ｃ同位体比が−１７，９５〜−１８，３３の間であることが記載されている。

本発明によれば、１，３−プロパンジオールＤ／Ｈ比（δＤと記述）、^１３Ｃ／^１２Ｃ比（δ^１３Ｃと記述）、^１８Ｏ／^１６Ｏ比（δ^１８Ｏと記述）は、燃焼後の質量分析によって決定した。同位体^１３Ｃ／^１２Ｃ比は、国際標準（ＰＤＢ＝ベレムナイト(Pee Dee Belemite)）を基準にしてδパーミル（‰）として算出した。同位体^１８Ｏ／^１６Ｏ比は、国際的な標準平均海水（ＳＭＯＷ）を基準にしてδパーミル（‰）として算出した。同位体Ｄ／Ｈ比は、国際的な標準平均海水（ＳＭＯＷ）と比較してｐｐｍとして算出した。

Ｄ／Ｈ比および^１３Ｃ／^１２Ｃ比は、製品の評価として周知であるが、^１８Ｏ／^１６Ｏ比は主に、水分析のために古気候指標として用いられる。

種々のタイプの１，３−プロパンジオールの間での比較では、δＤに識別力がないことが分かる。グリセロールからの生物起源の１，３−プロパンジオール（本発明の対象）のδＤは１４７．３８ｐｐｍ〜１４５．８４ｐｐｍの間であるのに対し、グルコースからの生物起源の１，３−プロパンジオールのδＤは１４５ｐｐｍであり、化学製品の１，３−プロパンジオールのδＤは１５０．１９ｐｐｍ〜１３９．３７ｐｐｍの間である。

本発明は、δ^１３Ｃ同位体値が−３４‰より低く、好ましくは−３５‰より低く、より好ましくは−３５．０５‰〜−３６．０９‰の間であることを特徴とする、上記の方法に従って得ることができる生物起源の１，３−プロパンジオールに関する。

本発明はまた、δ^１８Ｏ同位体値が２１．５‰〜０．５‰の間、好ましくは２１．９‰〜１５‰の間であり、より好ましくは２１．９‰〜１７．３４‰の間であることを特徴とする、上記の方法に従って得ることができる生物起源の１，３−プロパンジオールに関する。

本発明はまた、下記の特性の１つまたはその組合せ：
３４‰より低いδ^１３Ｃと、２１．９‰〜０．５‰の間のδ^１８Ｏの中から選択される^１３Ｃ同位体値と^１８Ｏ同位体値、
好ましくはδ^１３Ｃが−３５‰より低く、δ^１８Ｏが２１．９‰〜０．５‰の間である、
より好ましくはδ^１３Ｃが−３５．０５‰〜−３６．０９‰の間であり、δ^１８Ｏが２１．９‰〜１７．３４‰の間である（実施例４参照）
を特徴とする生物起源の１，３−プロパンジオールに関する。

本発明の一実施形態では、生物起源の１，３−プロパンジオールは、^１８Ｏ／^１３Ｃ同位体比値が−２〜０の間；好ましくは−１〜−０．２の間、より好ましくは−０．６５〜−０．４の間であることを特徴とする。

好ましくは、上記同位体比を特徴とする生物起源の１，３−プロパンジオールは、原料としてのグリセロールに基づく発酵によって得られる。より好ましくは、上記同位体比を特徴とする生物起源の１，３−プロパンジオールは、１，３−プロパンジオールの生産のための本発明の方法から得られる。

本発明はまた、熱可塑性ポリウレタンにおける鎖延長剤としての、ポリトリメチレンテレフタレートにおけるモノマーとしての、または化粧用処方物における成分としての、本発明の方法によって得られる、または上記で定義される生物起源の１，３−プロパンジオールの使用に関する。生物起源の１，３−プロパンジオールは、化学製品の１，３−プロパンジオールのあらゆる既知用途に使用し得る。当業者ならば、１，３−プロパンジオールからこれらの最終産物を得る方法を熟知している。

本発明は、本発明による生物起源の１，３−プロパンジオールを鎖延長剤として使用する熱可塑性ポリウレタンの製造方法に関する。本発明はまた、本発明による生物起源の１，３−プロパンジオールを含有する化粧用組成物の製造方法に関する。本発明はまた、本発明による生物起源の１，３−プロパンジオールをモノマーとして使用するポリトリメチレンテレフタレートの合成方法に関する。

実施例１
クロストリジウムのバッチ培養に使用した合成培地は、脱イオン水１リットル当たり：グリセロール、３０ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．５；Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ；ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ；ＣｏＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ、Ｈ２ＳＯ４、０．１ｍｌ；ＮＨ４Ｃｌ、１．５ｇ、ビオチン、０．１６ｍｇ；ｐ−アミノ安息香酸、３２ｍｇおよびＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．０２８ｇを含有するものであった。培地のｐＨは、ＮＨ４ＯＨ ３Ｎを用いて６．３に調整した。バッチ培養には、Sigmaから購入した市販のグリセロール（純度９９．５％）を使用した。連続培養用の供給培地は、水道水１リットル当たり：粗製グリセロール、１０５ｇ；ＫＨ２ＰＯ４、０．５；Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ；ＭｇＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．２ｇ；ＣｏＣｌ２ ６Ｈ２Ｏ、０．０２６ｇ；ＮＨ４Ｃｌ、１．５ｇ、ビオチン、０．１６ｍｇ；ｐ−アミノ安息香酸、３２ｍｇ；ＦｅＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、０．０４ｇ、消泡剤、０，０５ｍｌ；ＺｎＳＯ４、７Ｈ２Ｏ、８ｍｇ；ＣｕＣｌ２、２Ｈ２Ｏ、４ｍｇ；ＭｎＳＯ４、Ｈ２Ｏ、４０ｍｇ、Ｈ３ＢＯ３、２ｍｇ；Ｎａ２ＭｏＯ４、２Ｈ２Ｏ、０．８ｍｇを含有するものであった。この場合には培地のｐＨを調整しなかった。バイオディーゼル生産のエステル交換プロセスから生じる粗製グリセロールは、ＳＡＩＰＯＬ(Le Meriot, France)によって供給されたものであり、８３％グリセロール（ｗ／ｗ）を含有していた。

連続培養は、作業容量１０００ｍｌの２ＬバイオリアクターＴｒｙｔｏｎ(Pierre Guerin, France)で実施した。培養物量は、培養物の高さを自動調節することにより１０００ｍｌに一定に保った。培養物を２００ＲＰＭで、３５℃の温度で攪拌し、ＮＨ４ＯＨ ３Ｎを自動添加することによりｐＨを６．５に維持した。培養培地の酸化還元力（ｍＶで表される）は、実験中制御し、記録した。嫌気性条件を作り出すために、容器に入った滅菌培地を６０℃で１時間無菌無酸素窒素でフラッシュし、さらに、３５℃に達するまでフラッシュした。バイオリアクターのガス出口は、ピロガロールを準備することにより酸素から保護した(Vasconcelos et al., 1994)。滅菌後、供給培地も室温に到達するまで無菌無酸素窒素でフラッシュし、Ｏ２が入らないように２００ミリバールの窒素圧下で維持した。

細胞濃度は、６２０ｎｍで比濁分析により測定し、直接評価した細胞乾燥重量と相関させた。グリセロール、１，３−プロパンジオール、エタノール、ブタノール、酢酸および酪酸ならびに他の微量レベルの酸の濃度をＨＰＬＣ分析により測定した。分離は、Ｂｉｏｒａｄ Ａｍｉｎｅｘ ＨＰＸ−８７Ｈカラムで実施し、屈折率により検出をなし得た。操作条件は以下の通りであった：移動相 硫酸０．５ｍＭ；流速０．５ｍｌ／分、温度、２５℃。

対数増殖期終了時に採取した、合成培地（上記のバッチ培養培地と同じものに酢酸、２．２ｇ．ｌ^−１およびＭＯＰＳ、２３．０３ｇ．ｌ^−１の添加を行ったもの）において１００ｍｌフラスコ中で増殖中の培養物を接種材料（５％ｖ／ｖ）として用いた。培養物はまずバッチ式に増殖させた。対数増殖期初期に市販のグリセロールのパルスを添加した：パルスは、市販のグリセロール１２０ｇ．ｌ^−１を含む合成培地（バッチ培養で記載した同じもの）の、流速５０ｍｌ．ｈ^−１で３時間の添加（すなわち、１８ｇのグリセロールの添加）と定義される。その後、バッチ式増殖を続け、対数増殖期終了前に連続供給を希釈率０．０６ｈ^−１および１０５ｇ．ｌ^−１の粗製グリセロールを含有する供給培地で開始した。

表１：１０５ｇ．ｌ^−１の粗製グリセロールにおけるＣ．アセトブチリカムＤＧ１（ｐＳＰＤ５）の連続培養（Ｄ＝０．０６ｈ−１、ｐＨ６．５およびＴ℃＝３５℃）。示した値は、３回の体積変化後に得られた定常状態条件における７ポイントの平均を表す。

炭素回収率の算出では、二酸化炭素濃度を最終産物濃度から推定した。

実施例２
使用した合成培地は、実施例１に記載のものと同じであった。前培養、接種およびバッチ式増殖は、上記と同じ条件で実施した。

連続供給は、希釈率０．０２ｈ^−１および１０５ｇ．ｌ^−１の粗製グリセロールを含有する供給培地で開始した。これらの条件で数日後（すなわち、少なくとも、３回の体積変化に相当する、バイオリアクターへの接種の８〜１０日後）に下記スキームに従って希釈率を０．０２ｈ^−１から０．０５ｈ^−１へと高めた：ｉ）４８時間に０．０１ｈ^−１単位の上昇およびｉｉ）２４〜４８時間の休止工程、を３回繰り返した。培養物の安定後に前述のＨＰＬＣプロトコールを用いて産物の分析を行った。特に、本発明者らは、残留グリセロールが可能な限り少なくなるのを待ち、希釈率を４８時間に０．０６ｈ^−１まで最終上昇させた。

表２：１０５ｇ．ｌ^−１の粗製グリセロールにおけるＣ．アセトブチリカムＤＧ１（ｐＳＰＤ５）の連続培養（Ｄ＝０．０５ｈ−１および０．０６ｈ−１、ｐＨ６．５およびＴ℃＝３５℃）。示した値は、定常状態条件における３または４ポイントの平均を表す。

炭素回収率の算出では、二酸化炭素濃度を最終産物濃度から推定した。
同じ条件で実施した別の培養物でも同じ結果に至った。

実施例３
使用した合成培地は、実施例１に記載のものと同じであったが、供給培地は１２０ｇ．ｌ^−１の粗製グリセロールを含有するものとした。前培養、接種およびバッチ式増殖は、上記と同じ条件で実施した。

Ａ）連続供給は、希釈率０．０２ｈ^−１および１２０ｇ．ｌ^−１の粗製グリセロールをそのまま含有する供給培地で開始した。

表３：１２０ｇ．ｌ^−１の粗製グリセロールにおけるＣ．アセトブチリカムＤＧ１（ｐＳＰＤ５）の連続培養（Ｄ＝０．０２ｈ^−１、ｐＨ６．５およびＴ℃＝３５℃）。示した値は、３回の体積変化後に得られた定常状態条件における７ポイントの平均を表す。

炭素回収率の算出では、二酸化炭素濃度を最終産物濃度から推定した。

Ｂ）連続供給は、希釈率０．０２ｈ^−１および１０５ｇ．ｌ^−１の粗製グリセロールを最初に含有する供給培地で開始した。これらの条件で数日後（少なくとも、３回の体積変化に相当する）に上記スキームに従って希釈率を０．０２ｈ^−１から０．０６ｈ^−１へと高めた。その後、連続供給を、希釈率０．０５ｈ^−１および１２０ｇ．ｌ^−１の粗製グリセロールを含有する供給培地に変えた。

表４：１０５ｇ．ｌ^−１粗製グリセロールで、Ｄ＝０．０６ｈ^−１での供給後の、１２０ｇ．ｌ^−１の粗製グリセロールにおけるＣ．アセトブチリカムＤＧ１（ｐＳＰＤ５）の連続培養（Ｄ＝０．０５ｈ^−１、ｐＨ６．５およびＴ℃＝３５℃）。示した値は、少なくとも２０回の体積変化後に得られた３ポイントの平均を表す。

炭素回収率の算出では、二酸化炭素濃度を最終産物濃度から推定した。

実施例４
δ^１３Ｃ値およびδ^１８Ｏ値の算出方法
^１３Ｃおよび^１８Ｏのレベルは、慣例により相対値として表される。通常、それらは２つの国際標準と比べたときの割合（δ）として表される。
^１３Ｃの場合、標準は、^１３Ｃ値が既知の化石炭酸塩であるベレムナイト石灰(Vienna. PD belemnite)」である。δの算出式は以下の通りである。

^１８Ｏの場合、標準は、既知の^１８Ｏ値を有する「標準平均海水」（ＳＭＯＷ）である。式は、^１３Ｃのものと同じであり、Ｏ^１８基準値を用いる。

使用材料および試料調製
^１３Ｃ
ＰＤＯの^１３Ｃ／^１２Ｃ同位体比は、実験的に測定した二酸化炭素試料に基づいて算出した。この目的のために、試料を元素分析計で燃やし、得られた二酸化炭素を、同位体比測定用の元素分析計（ＣＡＲＬＯ ＥＲＢＡ ＮＡ ２１００）と連結された質量分析計（Ｆｉｎｎｉｇａｎ ＭＡＴ ＤＥＬＴＡ）に注入した。このようにして質量４４、４５および４６の二酸化炭素を分離し、定量した。次いで、それらの結果を、国際標準に対して事前に較正された常用基準（グルタミン酸）のものと比較することにより、^１３Ｃ／^１２Ｃ同位体比をδの千分の一スケールで算出した。

^１８Ｏ
^１８Ｏ／^１６Ｏ同位体比の測定は、有機化合物の連続フラックス中で行った。この目的のために、マイクロアナライザーの炉のレベルでの熱分解により試料を燃やし、生じた一酸化炭素を質量分析計（元素分析計Ｆｉｓｏｎｓ ＮＡ１５００ ２シリーズと連結されたＯＰＴＩＭＡ、またはThermoelectron製の元素分析計ＴＣ／ＥＡと連結された質量分析計Ｄｅｌｔａ Ｖ）に送った。熱分解によって生じた一酸化炭素において２８、２９、３０の異なる同位体を確認した。次いで、それらの結果をＳＭＯＷと比較することにより、^１８Ｏ／^１６Ｏ同位体比をδの千分の一スケールで算出した。

結果
粗製グリセロールから生産されたＰＤＯでは、本発明者らは平均δ^１３Ｃ値−３５．５７±０．５２‰を得、グルコースから生産されたＰＤＯは平均δ^１３Ｃ値−１２．６‰を有し、化学的に生産されたＰＤＯは平均δ^１３Ｃ値−３０．０５±５．０２‰を有していた。

粗製グリセロールから生産されたＰＤＯは平均δ１８Ｏ値１９．７６±２．４２‰を有し、グルコースから生産されたＰＤＯは平均δ^１８Ｏ値２２．０‰を有し、化学的に生産されたＰＤＯは平均δ^１８Ｏ値−０．８０±１．２７‰を有していた。

このように、δ^１３Ｃの測定によって、多様な原料から発酵プロセスによって生産されたＰＤＯを識別することが可能である。化学的に生産されたＰＤＯのδ^１３Ｃは、大きなばらつきを示し（−３０．０５±５．０２）、グリセロールから生産されたＰＤＯのδ^１３Ｃよりもわずかだけ大きい。化学的に生産されたＰＤＯのδ^１８Ｏは、非常に低い値を有し（−０．８±１．２７）、この値により、化学的に生産されたＰＤＯとグルコースまたはグリセロールのいずれかに基づく生物学的起源のＰＤＯとを識別することが可能である（図１）。

δ^１８Ｏ／δ^１３Ｃ値により、異なるＰＤＯを同定することが可能であることは明らかであり（図２）、グリセロールに基づくＰＤＯのδ^１８Ｏ／δ^１３Ｃ比は−０．５６、グルコースに基づくＰＤＯでは−１．７５、化学的に生産されたＰＤＯでは０．０３である。結論として、グリセロールから生産されたＰＤＯは、δ^１３Ｃおよびδ^１８Ｏの測定、続いてのδ^１８Ｏ／δ^１３Ｃの決定により同定することができる。

参考文献

ＰＤＯ δ^１３Ｃおよびδ^１８Ｏ（国際標準の‰）：ＰＤＯ１：記載したプロセスに従って生産されたＰＤＯ；ＰＤＯ２：基質としてのグルコースから生産されたＰＤＯ；ＰＤＯ３：化学的プロセスによって生産されたＰＤＯ。 ＰＤＯのδ^１８Ｏ／δ^１３Ｃ比：ＰＤＯ１：記載したプロセスに従って生産されたＰＤＯ；ＰＤＯ２：基質としてのグルコースから生産されたＰＤＯ；ＰＤＯ３：化学的プロセスによって生産されたＰＤＯ。

Claims (22)

1. グリセリンの連続発酵プロセスにおける１，３−プロパンジオールの生産方法であって、グリセロールから１，３−プロパンジオールへの変換が可能な生産微生物を培養培地で培養すること、および１，３−プロパンジオールを回収することを含んでなり、前記培養培地は、高濃度の、グリセロールを含んでなる工業用グリセリンを含んでなり、前記生産微生物は、高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖するように予め適合された微生物である、方法。
2. グリセロールが、培養培地中に、９０〜１２０ｇ／Ｌの間、好ましくは約１０５ｇ／Ｌの濃度で存在する、請求項１に記載の方法。
3. 工業用グリセリンが、バイオディーゼル生産の副産物である、請求項１または２に記載の方法。
4. 培養培地が、有機窒素源を添加していない、特には酵母抽出物を添加していない、合成培地である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 生産微生物が、クロストリジウム属のメンバーから選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
6. 生産微生物が、クロストリジウム・アセトブチリカムである、請求項５に記載の方法。
7. 生産微生物が、遺伝的に改変された細菌である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 生産微生物におけるグリセロールデヒドラターゼ活性が、補酵素Ｂ１２またはその前駆体の１つの存在に依存せず、クロストリジウム・ブチリカムに由来する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記生産微生物が、高濃度の工業用グリセリンを含んでなる培養培地で微生物を低希釈率で培養し、高濃度の工業用グリセリンを含む培養培地で増殖が可能な適合微生物を選択することによって生産微生物に適合される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. １，３−プロパンジオールがさらに精製される、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
11. 高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖するように適合された微生物への微生物の改変方法であって、高濃度の工業用グリセリンを含んでなる培養培地で微生物を低希釈率で培養すること、および、高濃度の工業用グリセリンを含む培養培地で増殖が可能な適合微生物を選択することを含んでなる、方法。
12. 微生物が、低希釈率で、２４時間から１０日までの期間にわたって培養される、請求項１１に記載の方法。
13. 希釈率が、０．００５〜０．１ｈ^−１の間である、請求項１１または１２に記載の方法。
14. 請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法によって得ることができる、高濃度の工業用グリセリンの存在下で増殖するように適合された微生物。
15. 請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法によって得られる生物起源の１，３−プロパンジオール。
16. −３４‰より低い、好ましくは−３５‰より低い、より好ましくは−３５．０５‰〜−３６．０９‰の間のδ^１３Ｃ同位体値を特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法に従って得ることができる生物起源の１，３−プロパンジオール。
17. δ^１８Ｏ同位体値が、２１．５‰〜０．５‰の間、好ましくは２１．９‰〜１５‰の間、より好ましくは２１．９‰〜１７．３４‰の間であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法に従って得ることができる生物起源の１，３−プロパンジオール。
18. 下記の値：
    ａ）δ^１３Ｃ値が−３４‰より低く、δ^１８Ｏ値が２１．５‰〜０．５‰の間である、
    ｂ）δ^１３Ｃ値が−３５‰より低く、δ^１８Ｏ値が２１．９‰〜１５‰の間である、または
    ｃ）δ^１３Ｃ値が−３５．０５‰〜−３６．０９‰であり、δ^１８Ｏ値が２１．９‰〜１７．３４‰の間である
    の中から選択されるδ^１３Ｃ同位体値とδ^１８Ｏ同位体値の組合せを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法に従って得ることができる生物起源の１，３−プロパンジオール。
19. ^１８Ｏ／^１３Ｃ同位体比値が、−２〜０の間、好ましくは−１〜−０．２の間、より好ましくは−０．６５〜−０．４の間であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法に従って得ることができる生物起源の１，３−プロパンジオール。
20. 熱可塑性ポリウレタン合成における鎖延長剤としての、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の１，３−プロパンジオールの使用。
21. 化粧用処方物における成分としての、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の１，３−プロパンジオールの使用。
22. ポリトリメチレンテレフタレートの合成におけるモノマーとしての、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載の１，３−プロパンジオールの使用。

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