JP2012521213A - 医学および診断分野におけるマイクロrna−199b−5pの使用 - Google Patents
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Abstract
Description
CCAGAGGACACCTCCACTCCGTCTACCCAGTGTTTAGACTATCTGTT CAGGACTCCCAAATTGTACAGTAGTCTGCACATTGGTTAGGCTGGGC TGGGTTAGACCCTCGG (配列番号1)
を含む、もしくはからなる、
または対応するリボヌクレオチド配列:
CCAGAGGACACCUCCACUCCGUCUACCCAGUGUUUAGACUAUCUG UUCAGGACUCCCAAAUUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGGCU GGGCUGGGUUAGACCCUCGG (配列番号10)
を含む、もしくはからなるか、
または配列番号10の一部:
CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC(配列番号11)
を含む、もしくはからなるオリゴヌクレオチド配列である。
プライマーフォワード:CGGGAATTCCCAGAGGACACCTCCAC(配列番号3)
プライマーリバース:CGGCTCGAGCCGAGGGTCTAACCCAG(配列番号4)
および配列の発現値を正規化するための対照プライマーの対、例えば、以下のプリマー:
プライマーフォワード:GAA AAG CCT TGT TTG TGC TTG C(配列番号5)
プライマーリバース:GGG CCA TGC TAA TCT TCT CTG T (配列番号6)。
を用いるリアルタイムPCRによって評価できることが好ましい。
a)RNAのレトロ転写;およびb)以下のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:AGGACACCTCCACTCCGTCTAC(配列番号7)
プライマーリバース:GCCTAACCAATGTGCAGACTACTG(配列番号8)
プローブ:CAGTGTTTAGACTATCTGTTCAGGACTCCCAAATTG(配列番号9)
を使用するTaqManアッセイによる前記配列の発現を含むかまたはからなる。
CD133:
プライマーフォワード:CTATGTGGTACAGCCGCGTG (配列番号22)
プライマーリバース:TAATCAATTTTGGATTCATATGCCTTC (配列番号23)
c-myc
プライマーフォワード:ATGAGGAGACACCGCCCAC (配列番号24)
プライマーリバース:AACATCGATTTCTTCCTCATCTTCTT (配列番号25)
Nanog:
プライマーフォワード:GCAAATGTCTTCTGCTGAGATGC (配列番号26)
プライマーリバース:GCTGTCCTGAATAAGCAGATCCAT (配列番号27)
Oct4:
プライマーフォワード:ACTGCAGCAGATCAGCCACA (配列番号28)
プライマーリバース:TGGCGCCGGTTACAGAAC (配列番号29)
TCFL1:
プライマーフォワード:CCGCGGGACTATTTCGC (配列番号30)
プライマーリバース:AAAGAACGCGCTGTCCTGAG (配列番号31)
ZIC1:
プライマーフォワード:CAGTTCGCTGCGCAAACA (配列番号32)
プライマーリバース:GAGCCCTGCGAGGAGGAT (配列番号33)
KLF5:
プライマーフォワード:GCATCCACTACTGCGATTACCC (配列番号34)
プライマーリバース:TGAGAAGACTTGGTATAAACTTTTGTGC (配列番号35)
HMGA1:
プライマーフォワード:AAAAACAAGGGTGCTGCCAA (配列番号36)
プライマーリバース:CCTTCCTGGAGTTGTGGTGGT (配列番号37)
HMGB3:
プライマーフォワード:TTTTCCAAGAAGTGCTCTGAGAGG (配列番号38)
プライマーリバース:TTTCTCTTTCCCGGACATCG (配列番号39)
を使用する以下の配列:
CD133:
CTATGTGGTACAGCCGCGTGATTTCCCAGAAGATACTTTGAGAAAATT CTTACAGAAGGCATATGAATCCAA AATTGATTA (配列番号13)
c-myc:
AGGAGGAACAAGAAGATGAGGAAGAAATCGATGTT (配列番号14)
Nanog:
GCAAATGTCTTCTGCTGAGATGCCTCACACGGAGACTGTCTCTCCTC TTCCTTCCTCCATGGATCTGCTTATTCAGGACAGC (配列番号15)
Oct4:
ACTGCAGCAGATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAG G
ATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAACCGGCGCCA (配列番号16)
TCFL1:
CCGCGGGACTATTTCGCCGAAGTGAGAAGGCCTCAGGACAGCGCG TTCTTT (配列番号17)
ZIC1:
CAGTTCGCTGCGCAAACACATGAAGGTCCACGAATCCTCCTCGCAGG GCTC (配列番号18)
KLF5:
GCATCCACTACTGCGATTACCCTGGTTGCACAAAAGTTTATACCAAGT CTTCTCA (配列番号19)
HMGA1:
AAAAACAAGGGTGCTGCCAAGACCCGGAAAACCACCACAACTCCAG GAAGG (配列番号20)
HMGB3:
TTTTCCAAGAAGTGCTCTGAGAGGTGGAAGACGATGTCCGGGAAAGA GAAA (配列番号21);
のうち少なくとも1つを増幅によって、および
以下の遺伝子配列の発現を正規化するために以下の対のプライマー:
プライマーフォワード:CGT GCT GCT GAC CGA GG(配列番号79)
プライマーリバース:GAA GGT CTC AAA CAT GAT CTG GGT(配列番号80)
を使用して、リアルタイムPCRによって検出される。
cd 133
プライマーフォワード:TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA (配列番号49)
プライマーリバース:GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA (配列番号50)
プローブ:AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC (配列番号51)
c myc:
プライマーフォワード:GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG (配列番号52)
プライマーリバース:TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG (配列番号53)
プローブ CAGCAGCCTCCCGCGACG (配列番号54)
nanog:
プライマーフォワード:CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA (配列番号55)
プライマーリバース:GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA (配列番号56)
プローブ:CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA (配列番号57)
oct 4:
プライマーフォワード:AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT (配列番号58)
プライマーリバース:AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA (配列番号59)
プローブ:CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA (配列番号60)
tcfl1:
プライマーフォワード:CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG (配列番号61)
プライマーリバース:CCGAGGGAGCAGGATCAAG (配列番号62)
プローブ:AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC (配列番号63)
zic 1:
プライマーフォワード:CGCGCTCCGAGAATTTAAAG (配列番号64)
プライマーリバース:CGGTCACAGCCCTCAAACTC (配列番号65)
プローブ:TCCACAAAAGGACGCACACAGGG (配列番号66)
KLF5:
プライマーフォワード:TTTAACCCCACCTCCATCCTATG (配列番号67)
プライマーリバース:GGCAGGGTGGTGGGTAAATT (配列番号68)
プローブ:TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC (配列番号69)
HMGA1:
プライマーフォワード:CCCCAGGCAGACCTTATATGAG (配列番号70)
プライマーリバース:TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA (配列番号71)
プローブ:CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA (配列番号72)
HMGB3:
プライマーフォワード:CGCTATGATCGGGAAATGAAG (配列番号73)
プライマーリバース:TGGCCTTTTGGGAGCATTAG (配列番号74)
プローブ:ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG (配列番号75)
を使用して、以下の配列:
cd 133
TCCACAGAAATTTACCTACATT
GGAAGAGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGCCTGGTCATCTGCT CTCTGCTGACCC (配列番号40)
c myc
GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTGGAAAACCAGCAGCCT
CCCGCGACGATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACCAACAGGAACTA (配列番号41)
nanog:
CCGAAGAATAGCAATGGTGTGACGCAG
AAGGCCTCAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTACTCTTCCTACCACCA GGGATG (配列番号42)
oct 4:
AACCCGGAGGAGGTAGTCCTTTGTTACATGCATGAGTCAGTGAACAG GGAATGGGTGAATGACATTTGTGGGTAGGTTATT (配列番号43)
tcfl1:
CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAGAAGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGT CTTTTGTCCTCAGACTTGATCCTGCTCCCTCGG (配列番号44)
zic 1:
CGCGCTCCGAGAATTTAAAGATCCACAAAAGGACGCACACAGGGAGA AGCCCTTCAAGTGCGAGTTTGAGGGCTGTGACC (配列番号45)
KLF5:
TTTAACCCCACCTCCATCCTATGCTGCTACAATTGCTTCTAAACTGGC AATTCACAATCCAAATTTACCCACCACCCTGCC (配列番号46)
HMGA1:
CCCCAGGCAGACCTTATATGAGACATGGGAGTCCCACCGTATTGTCC AGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAAGCA (配列番号47)
HMGB3:
CGCTATGATCGGGAAATGAAGGATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAA GAAGAAGAAGGATCCTAATGCTCCCAAAAGGCCA (配列番号48);
のうち少なくとも1つの増幅のためのリアルタイムTaqManによって、
遺伝子配列の発現を正規化するために以下の対のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:GCCAACCGCGAGAAGATG (配列番号81)
プライマーリバース:ACAGCCTGGATAGCAACGTACA (配列番号82)
プローブ:CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC (配列番号83)
を使用して、検出され得る。
a)配列番号1を含むかまたはからなる前記配列の増幅の以下のプライマー:
プライマーフォワード:CGGGAATTCCCAGAGGACACCTCCAC(配列番号3)
プライマーリバース:CGGCTCGAGCCGAGGGTCTAACCCAG(配列番号4)
b)前記配列の発現値を正規化するための1対の対照プライマー;
c)前記1つまたは複数の遺伝子の配列を示すための以下の1または複数の対のプライマーおよび対応するプローブ:
cd 133
プライマーフォワード:TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA (配列番号49)
プライマーリバース:GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA (配列番号50)
プローブ:AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC (配列番号51)
c myc:
プライマーフォワード:GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG (配列番号52)
プライマーリバース:TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG (配列番号53)
プローブ:CAGCAGCCTCCCGCGACG (配列番号54)
nanog:
プライマーフォワード:CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA (配列番号55)
プライマーリバース:GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA (配列番号56)
プローブ:CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA (配列番号57)
oct 4:
プライマーフォワード:AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT (配列番号58)
プライマーリバース:AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA (配列番号59)
プローブ:CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA (配列番号60)
tcfl1:
プライマーフォワード:CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG (配列番号61)
プライマーリバース:CCGAGGGAGCAGGATCAAG (配列番号62)
プローブ:AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC (配列番号63)
zic1:
プライマーフォワード:CGCGCTCCGAGAATTTAAAG (配列番号64)
プライマーリバース:CGGTCACAGCCCTCAAACTC (配列番号65)
プローブ:TCCACAAAAGGACGCACACAGGG (配列番号66)
KLF5:
プライマーフォワード:TTTAACCCCACCTCCATCCTATG (配列番号67)
プライマーリバース:GGCAGGGTGGTGGGTAAATT (配列番号68)
プローブ:TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC (配列番号69)
HMGA1:
プライマーフォワード:CCCCAGGCAGACCTTATATGAG (配列番号70)
プライマーリバース:TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA (配列番号71)
プローブ:CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA (配列番号72)
HMGB3:
プライマーフォワード:CGCTATGATCGGGAAATGAAG (配列番号73)
プライマーリバース:TGGCCTTTTGGGAGCATTAG (配列番号74)
プローブ:ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG (配列番号75)
d)前記遺伝子の配列の発現を正規化するための以下のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:GCCAACCGCGAGAAGATG(配列番号81)
プライマーリバース:ACAGCCTGGATAGCAACGTACA(配列番号82)
プローブ:CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC(配列番号83)
を含むかまたはからなる。
プライマーフォワード:GAA AAG CCT TGT TTG TGC TTG C(配列番号5)
プライマーリバース:GGG CCA TGC TAA TCT TCT CTG T(配列番号6)
であり得る。
a1)配列番号1を含むかまたはからなる前記配列の発現を検出するための以下のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:AGGACACCTCCACTCCGTCTAC(配列番号7)
プライマーリバース:GCCTAACCAATGTGCAGACTACTG(配列番号8)
プローブ:CAGTGTTTAGACTATCTGTTCAGGACTCCCAAATTG(配列番号9);
b1)前記1つまたは複数の遺伝子の発現の検出のための、1または複数の対の以下のプライマーおよび対応するプローブ:
cd 133
プライマーフォワード:TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA (配列番号49)
プライマーリバース:GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA (配列番号50)
プローブ:AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC (配列番号51)
c myc:
プライマーフォワード:GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG (配列番号52)
プライマーリバース:TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG (配列番号53)
プローブ CAGCAGCCTCCCGCGACG (配列番号54)
nanog:
プライマーフォワード:CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA (配列番号55)
プライマーリバース:GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA (配列番号56)
プローブ:CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA (配列番号57)
oct 4:
プライマーフォワード:AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT (配列番号58)
プライマーリバース:AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA (配列番号59)
プローブ:CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA (配列番号60)
tcfl1:
プライマーフォワード:CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG (配列番号61)
プライマーリバース:CCGAGGGAGCAGGATCAAG (配列番号62)
プローブ:AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC (配列番号63)
zic 1:
プライマーフォワード:CGCGCTCCGAGAATTTAAAG (配列番号64)
プライマーリバース:CGGTCACAGCCCTCAAACTC (配列番号65)
プローブ:TCCACAAAAGGACGCACACAGGG (配列番号66)
KLF5:
プライマーフォワード:TTTAACCCCACCTCCATCCTATG (配列番号67)
プライマーリバース:GGCAGGGTGGTGGGTAAATT (配列番号68)
プローブ:TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC (配列番号69)
HMGA1:
プライマーフォワード:CCCCAGGCAGACCTTATATGAG (配列番号70)
プライマーリバース:TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA (配列番号71)
プローブ:CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA (配列番号72)
HMGB3:
プライマーフォワード:CGCTATGATCGGGAAATGAAG (配列番号73)
プライマーリバース:TGGCCTTTTGGGAGCATTAG (配列番号74)
プローブ:ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG (配列番号75)
c1)上記の報告された遺伝子の配列の発現の正規化のための、以下の対のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:GCCAACCGCGAGAAGATG(配列番号81)
プライマーリバース:ACAGCCTGGATAGCAACGTACA(配列番号82)
プローブ:CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC(配列番号83)
を含む、およびからなる。
材料および方法
倫理的公開
すべての動物は、国内および国際的指針に従って処理した。倫理的承認は、「Istituzioni per Ia Cura degli Animali e comitato etico CEINGE」-Universita degli Studi di Napoli Federico II、プロトコール番号13-2007年8月1日から、およびすべての実験が法律(low)に従っていることを裏付けるMinistero della Salute Italiano, Dipartimento Sanita Pubblica Veterinaria DL 116/92によって得た。
S相画分および細胞周期速度論のフローサイトメトリー分析を、CELL Questバージョン3.3ソフトウェアを使用するFACSCalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA)を使用して実施した。CD133研究は、Miltenyi Biotec(Auburn, CA)から得た抗体を用い、同一機器を使用して、製造業者の使用説明書に従って実施した。手短には、Fc受容体をブロックする試薬中で細胞をブロックし、抗CD133/1(AC133)-フィコエリトリン抗体(Miltenyi Biotec)とともに、4℃、暗所で10分間インキュベートした。次いで、細胞を洗浄し、PBSに再懸濁した。免疫グロブリンG(IgG)対照よりも高いレベルのCD133を発現する細胞を陽性と考えた。サイドポピュレーションの分析のために、細胞(106/mL)を、2% FBSを含有するEMEM中、37℃で90分間、Hoechst33342(5μmol/L;Sigma)とともにインキュベートした。サイドポピュレーション細胞の正しい同定を確実にするために、細胞を上記のように、50μMベラパミル(Sigma)を添加してインキュベートした。
安定な199bSC1クローンに、または対照の空のベクタークローンに、ルシフェラーゼを発現するベクター(plentiV5ベクターにクローニングされたホタルルシフェラーゼ遺伝子;Invitrogen)をトランスフェクトすることによって、安定なDaoy細胞クローンを作製した。次いで、100,000個の生存199b-Luc1およびCtl-Luc-4細胞を、1:1 PBS:マトリゲル溶液(BD Biosciences, San Jose, CA)と混合した。6週齢の雌の胸腺欠損マウスに、アベルチン(Sigma)をt-アミルアルコール(Fisher)中の3%溶液として体重10gあたり3mgの用量で使用して麻酔した。マウスに総容量0.1mLのマトリゲルPBS細胞懸濁液を用いて各側腹部にs.c.注射した。細胞を移植した後、マウスを撮像し、毎週のIVIS 3D Illumina Imaging System(Xenogen Corp. Alameda, CA)を使用する生物発光獲得(BLI)によって腫瘍増殖をモニタリングした。獲得のために、マウスをイソフルラン(isofluorane)i.p.麻酔し、体重10gあたり100μLのD-ルシフェリン(15mg/ストック1mL)を注射し、ルシフェリン注射の10分後30秒間撮像し;マウスあたり4回の獲得を行った(腹部、背部および各側腹部)。生物発光を定量化するために、Living Imagesソフトウェアパッケージ3.0(Xenogen-Caliper)を使用して注目する各領域内の光子の積分流量(毎秒あたりの光子数)を求めた。腫瘍増殖の開始からの放出データを、少なくとも6週間集め、次いで、注射日の生物発光に対して正規化した。腫瘍の大きさのカリパス測定を、長軸および短軸に沿って毎週行い、式:幅2×長さ×0.52を使用してその容積の推定を行った。
イメージング研究に先立って、マウスを換気したケージ中(26℃)に1時間維持した。ケタミン(100mg/kg)およびキシラジン(10mg/kg)の混合物(注射容量、100μl/10g)の腹膜内投与を用いて麻酔を実施した。外側尾静脈中に3’-デオキシ-3’-[18F]フルオロチミジン([18F]FLT)、腫瘍増殖のマーカー(50μL;7.4MBq;スキャン時間、18分)を投与した1時間後に、動物PETスキャナー(GE Healthcare eXplore Vista, FWHM 1.6mm)を使用してPETを実施した。高分解能CT研究(GE Healtcare eXplore Locus;空間分解能、45μm)を、PETから24時間以内に実施した。
PET研究から、最大(SUVmax)および平均(SUVmean)標準化取り込み値(SUV)を算出した(SUV=組織活性(MBq/cc)/[注射された用量(MBq)/体重(g)])。PET/CT画像を後処理し、Osirix 3.3(MAC OS 10.5 operating system)を使用して多断面再構成(MPR)、最大値投影法(MIP)、3D体積レンダリングおよび融合画像を得た。MicroView(GE eXplore Locus)を使用してさらなる3D再構成を得た。
ヒトDaoyおよびD283-MED MB細胞株は、American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)から入手し、10%ウシ胎児血清(FBS)、10U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプトマイシン(Celbio Pero, Milan, Italy)を補給したイーグル最小必須培地(EMEM;Sigma)で維持した。HEK-293およびSH-5YSY細胞は、10% FBS、10U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプトマイシンを補給した「ダルベッコ改変イーグル培地」(DMEM;Sigma)で維持した。
ルシフェラーゼ-3’UTRが融合している構築物の抑制に対するmiR-199b-5pの活性を調べるために、2-OM(400nM)の不在下または存在下で、pGL3基本ベクターと一緒にPolyfect試薬(Qiagen)を使用して、pREYZO-miR-199b-5p構築物およびpRL-CMV-3’UTR標的構築物を10:1の比で、HEK293細胞に同時トランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性を二重ルシフェラーゼリポーターアッセイシステム(Promega, Madison, Wl)を使用して分析した。
5種のMB細胞株(d283、Daoy、med8a、ons76、uw228)を10% FBSおよび抗生物質を補給したDMEMで増殖させた。85%コンフルエンスに達すると、培地に5-アザ-デオキシシチジン(AZA)(Sigma)を5μMの最終濃度に添加した。72時間にわたって、培地を新鮮AZA増強培地で毎日置換した。RNAを標準フェノール(TRIzol)-クロロホルムプロトコールを使用して抽出した。
Pre-miR-199bを、EcoRI-XhoI制限部位を使用してpcDNA3改変ベクター(pREYZO)(D’angeloら、2004年)にクローニングした。HES1およびGSK-3β標的結合部位(3’UTR)を、XbaI部位で、ウミシイタケ(Renilla)ルシフェラーゼ(RL)のコーディング領域の下流のpRL-サイトメガロウイルス(CMV)ベクター(Promega, Madison, Wl)の3’UTRにタンデムにクローニングした。HES1 3’UTR(199b結合部位を含む)を、以下のプライマー:AAAATCTAGACAGTTCGAAGACATAAAAGCCとしてHES1_3’UTRおよびAAAATCTAGAAACGCAGTGTCACCTTCCとしてHES1_3’UTRを用いてゲノムDNAから増幅し、Xbal部位で、ホタルルシフェラーゼ遺伝子の上流のTKベクター(Promega, Madison, Wl)にクローニングした。HES1全長cDNAを、Daoy cDNAから標準RT-PCRアプローチを用いて得た。
HES1 3’UTR中のmiR-199b-5p結合部位の位置指定突然変異誘発を、QuikChange位置指定突然変異誘発キット(Stratagene, La JoIIa, CA)の製造業者のプロトコールに従って作製した。突然変異誘発に以下のプライマーを使用した(センス配列のみが示されており、コンセンサス配列内の突然変異したヌクレオチドに下線が引かれている):HES1 3’UTRセンスAACAGGAACTTGAATATTTGTAGAGAAGAGGACTTT
リバーストランスクリプターゼ反応
リバーストランスクリプターゼ(RT)反応には、40ng RNAサンプル、50nMステム-ループRTプライマー、1×RTバッファー(P/N:4319981 , Applied Biosystems)、0.25mM 各dNTP、3.33U/ml MultiScribe RT(P/N: 4319983, Applied Biosystems)および0.25U/ml RNアーゼ阻害剤(P/N: N8080119; Applied Biosystems)を含めた。15μlの反応物を、Applied Biosystems 9700 Thermocycler中、16℃で30分間、42℃で30分間、85℃で5分間インキュベートし、次いで、4℃で維持した。
リアルタイムPCRは、Applied Biosystems 7900HT Sequence Detection Systemで標準TaqMan PCRキットプロトコールを使用して実施した。20μlのPCRミックスは、2μlのRT生成物、10μl TaqMan Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems)、0.2mM TaqManプローブを含んでいた。反応物を、96ウェルプレート中、95℃で10分間、続いて、95℃で15秒間および60℃で1分間の60サイクルでインキュベートした。
全RNAを、Trizol試薬(Invitrogen)を使用して細胞株から抽出した。全RNA(4μg)からのcDNAの合成をSuper Script Il First Strandキット(Invitrogen)を使用して実施した。リアルタイム定量的PCRを、Applied Biosystems ABI PRISM 7900HT Seuence Detection systemを用い、標準プロトコールを使用して実施した。miR-199b-5p前駆体の相対的遺伝子発現を算出するために、各pre-miRNAの相対量を、U6 miRNAに対して正規化し;その他の遺伝子はβ-アクチン遺伝子を使用して正規化した。各遺伝子のリアルタイムPCRプライマーは、Primer Expressソフトウェアバージョン2.0(Applied Biosystems)を使用して設計した。プライマー配列は、要求に応じて入手可能である。
30μgの細胞質または核溶解物を12%ポリアクリルアミドゲルにロードし、ポリビニリデンジフルオリドメンブラン(PVDF; BioRad, Milan, Italy)にブロットした。次いで、メンブランを抗HES1(Dr.Tetsuo Sudo TORAY Industries, Tebiro Kamakura, Japanの親切な贈り物)、ポリクローナルウサギ抗体(1:500)、抗GSK3-β(B&D Bioscience)モノクローナル抗体(1:2500)、抗c-Mycポリクローナルウサギ抗体(1:200)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)、抗GABRA6抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA)(1:200)、抗MATH3抗体(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, USA)(1:200)および抗サイクリンD1(1:200)ポリクローナルウサギ抗体(細胞シグナル伝達)とともにインキュベートした。抗β-アクチン抗体(1:1.000)(Sigma)を細胞質溶解物の同等のローディングのための対照として、核溶解物の同等のローディングのためにポリクローナル抗β-ラミニン抗体(1:50)(Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)を使用した。
Daoy細胞および安定な199bクローンを、2% FBSを補給し、0.3%アガロースを含有する1ml EMEMに播種した。培養物を2週間維持し、2% FBSを補給したEMEMを用いて週に2回再び注いだ。Leica(Nussloch, Germany)DC500化合物顕微鏡下で、直径が100μmを超えるコロニーをカウントした
細胞増殖をCellTiter96 AQueous非放射性細胞増殖アッセイキット(Promega Madison, Wl)を使用して調べた。細胞を、FBSを含むか含まないEMEM中、1×103個細胞/ウェルの密度で96ウェルプレートに播種した。0、24、48および72時間後、各ウェルにMTS([3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム])およびPMS(フェナジンメトスルファート)を加え、4時間後に各ウェルの吸光度をMultilabel counter Victor3(Perkin Elmer)を使用して490nm(OD490)で測定した。各条件は5ウェルを用いて実施し、各実験は2回反復した。
脱マスキングを、10mMクエン酸バッファー、pH6中、97℃で45分間実施した。ブロッキングを、Backgroud Reducing Components(Dako Cytomation)とともに抗体希釈液を用いて、室温で30分間実施し;ポリクローナル抗HES1(1:1000)、抗ネスチン(1:1000)、抗GABRA6(1:100)、抗MATH3(1:100)抗体を4℃で一晩使用した。室温で、キットLSAB DAKOを15分間使用して(ビオチン)、およびキットLSAB DAKOを15分間使用して(ストレプトアビジン(Streptavidina)シグナルが示された。
マウス胎生期脳またはヒト多組織アレイから得た乾燥したスライドを、4%パラホルムアルデヒド中、室温で10分間固定し、1×PBS中、室温で3分間、2回洗浄した。洗浄ステップの際に、0.01%トリエタノールアミンおよびジエチレンピロカルボナート(DEPC)水中0.0025mM無水酢酸を含有するアセチル化溶液を新しく調製した。次いで、スライドをアセチル化溶液のビーカー中に入れ、穏やかに10分間撹拌した。次いで、スライドを、DEPC処理水中5μg/m1のプロテイナーゼK処理に付し、続いて、1×PBS中、室温で3分間、3回洗浄し、ハイブリダイゼーション溶液を用いて室温で6時間プレハイブリダイズした。ハイブリダイゼーションは、150μlの変性(denaturizing)ハイブリダイゼーションを含み、1pMのロックド核酸DIG標識プローブ(Exiqon, miRCURY)を含んでいた。ハイブリダイゼーションを、60℃で一晩実施した。スライドを、予温した60℃の5×SSC中に浸漬し、カバースリップを注意深く除去し;次いで、スライドを0.2×SSC中、60℃で1時間インキュベートし、次いで、0.1M Tris、pH7.5、0.15M NaCl中、室温で10分間インキュベートした。過剰な溶液を除去し、スライドを加湿チャンバーに入れ;室温で1時間のインキュベーションの間、500μlのブロッキング溶液(0.1M Tris、pH7.5、0.15M NaCl中、1% FCS)をスライド上に置いた。抗DIG-アルカリホスファターゼ抗体を、ブロッキング溶液で1:2,000希釈し、4℃で一晩インキュベートした。スライドを、0.1M Tris、pH7.5、0.15M NaClで3回洗浄し、次いで、0.1M Tris、pH9.5、0.1M NaCl、50mM MgCl中で平衡化した。スライドをBCIP/NTB(Sigma)を用いて染色し、脱水し、マウントし、Leica(Nussloch, Germany)DC500化合物顕微鏡下で画像を獲得した。
ヒトDaoy細胞株は、American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)から入手し、10%ウシ胎児血清(FBS)(Celbio Pero, Milan, Italy)、10U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプトマイシン(Celbio Pero, Milan, Italy)を補給したEMEM(Sigma Aldrich, Milan, Italy)で維持した。HEK-293およびSH-5YSY細胞は、10% FBS(Celbio)、10U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプトマイシン(Celbio)を補給したDMEM(Sigma)で維持した。
対照DAOY細胞株および安定なDAOY-199bSC1クローンを、「細胞運動性」アッセイに使用した。細胞遊走アッセイは、8μmのポアサイズのTranswells(Costar)を用いて実施した。細胞をトリプシン処理によって懸濁し、洗浄し、0.1% BSA(5×104個細胞)を含有する100μlの血清を含まないDMEMに再懸濁し、Transwellsの上側のチャンバー中に入れた。下側チャンバーは、600μlの、化学誘引物質(chemo-attractor)として0.5% FBSを補給した血清を含まないDMEMで満たした。細胞を37℃で1時間遊走させた。ポリカーボネートメンブレンの下側に遊走した細胞を、2.5%グルタルアルデヒドを用いて固定し、ヘマトキシリン溶液(Sigma)を用いて染色した。細胞をカウントし、分析は各条件に対して3個のTranswellsで実施し、各実験は2回反復した。
3つの異なるセンターから、合計61のMBの症例を集めた:12の外科MB標本はDepartment of Neurosurgery, Santobono Hospital, Naples, Italyから得;18は、Institute Curie, Paris, Franceから得;31は、Hospital for Sick Children, Toronto, Canadaから得た。患者の特徴はTable 2(表2)に示されている。インフォームドコンセントは、腫瘍サンプルの分析の前に得た。試料のすべては、放射線療法または化学療法の前の診断の時点で得、29は、WHO判定基準[14]に従って病理組織学的再調査に付し、すべての患者についてM状態の情報が入手可能であった。対照ヒト組織は、University of Maryland, Baltimore, MarylandのNICHD Brain and Tissue Bank for Developmental Disordersから入手した。全RNAは、細胞株について上記で記載されたようにTrizol試薬(Invitrogen)を使用して抽出し、TaqManマイクロRNAアッセイによってmiR-199b-5p発現レベルについて分析した。miR-199b-5p発現レベルは、中央値に従って2群(低および高)に分け、ピアソンカイ二乗検定を使用して転移性および非転移性群間を比較した。生存分析をログランク検定を使用してSPSSソフトウェアによって得、有意性を確認した。統計的有意性は、0.05のP値で確立された。
miR199b配列を、5’-Xhol、3’-Hindl IIIに向けて、その組換えおよび199bアデノウイルス構築物を提供した、ViraQuest Inc.Innovative Adenovirus Technologies and Reagentから供給されたVQ Ad5CMV K-NpAシャトルベクターにクローニングした(ベクター配列配列番号2を示した図16および配列番号1の配列を含むベクターを示した図15参照のこと)。それらはまた、VQ Ad5CMVeGFPプラスミドから作製された対照骨格E3ルシフェラーゼウイルスを提供した。
組換えウイルスでの感染は、500μlの完全細胞培養培地中で、1時間、細胞をアデノウイルスに曝露することと、それに続いて、その他の培地を添加することによって達成した。本発明者らは、トランスフェクション効率を決定する場合に対照としてアデノウイルス(AdV MOCKおよびAdV 199b)によるGFP発現を使用した。
小脳内異種移植モデルを確立するために、6〜8週齢SCIDマウスに、トリブロムエタノール(アベルチン(登録商標))(50mg/kg)を用いて麻酔し;この後、小さい皮膚切開(1mm)を行い、顕微手術用ドリル(Fine Science Tools, Foster City, CA)を用いて頭蓋穿孔(直径0.7mm)を作製した。アデノウイルスmock、アデノウイル199bが感染したDaoy Luc細胞および199b LUC1安定クローン(105)を5μlのPBSに懸濁し、頭蓋表面に対して垂直に挿入された10-AL、26ゲージHamilton Gastight1701シリンジニードルを使用して、頭蓋穿孔を通って右側小脳半球中にゆっくりと注入した(ブレグマ前後5.5mmからの定位座標;右外側2.1mm;背腹側5.0mm)。動物を、生物発光によって毎週モニタリングし、腫瘍増殖を8週間評価した。
IVISスペクトル:このシステムは、写真の画像および構築された光画像ならびに異なる波長(560〜660nm)での2種以上の生物発光画像を獲得し、被験体の表面トポグラフィー(メッシュ)を作製する。本発明者らは、特定のユーザーが変更可能なDLITアルゴリズムパラメータ(例えば、分析波長、供給源スペクトルおよび組織特性)を改変することによって、被験体中の発光供給源の位置、幾何学および強度を再構成できる。Living Image(登録商標)ソフトウェアは、3D再構築での3D骨格および臓器のディスプレイを可能にするデジタルマウスアトラスを提供する。
次いで、マウスに2.5%のイソフルランを用いて麻酔し、イメージング手順のすべてを通じて1%イソフルラン麻酔下で維持した。[18F]FDGおよび[18F]フッ化物PETイメージングを使用して、腫瘍細胞誘導性代謝および骨格変化をそれぞれ調べた。画像は、Explorer-Vista小動物PET-CTシステム(GE Healthcare)を使用して3ベッドポジション(ベッドポジションあたり10分、合計30分間)および1.2mmの距離分解能で獲得した。
Hsa-miR-199b-5pは、3’UTR結合によってHES1発現を発現停止させる。
本発明者らのmirBase標的データベースのコンピュータによる解析は[27]、HES1、MB細胞増殖の調節における基本的な機序であるノッチ経路のエフェクターをターゲッティングする可能性のあるmiRNAの同定に向けられた。miR-199b-5pおよびmiR-199a-5pは、良好なスコアのmiRNAであり、ヒトbHLH HES1の3’UTRと結合すると予測された。本発明者らは、miR-199a-5pと比較した、一時的な過剰発現下でHES1発現を低下させるその能力のためにmiR-199b-5pに焦点を合わせた(図9A、B)。MiR-199b-5pは、肺腫瘍では失われており[28]、膀胱癌において欠失されるゲノム領域にマッピングされている[29]。MiR-199a*(miR-199a-5pとしても知られ、miR-199b-5pと同一配列を有する)もまた、肝細胞癌において低減する[30〜32]。2種のMB細胞株、ヒト成人組織およびマウス小脳におけるmiR-199b-5p発現の分析が、図9C、Dおよび10A、Bに示されている。
199bSC1および199bMC1クローンは、対照クローンと比較した場合に標準培養条件下で増殖速度を低減させた。したがって、本発明者らは、これらのクローンにおける細胞周期変化の可能性を期待した。199bSC1クローンでのFACS分析は、空のベクタークローンと比較して、S相画分の31%減少およびG0〜G1の細胞の15%の増大を示した(図1A)。これは、細胞周期からの脱出が、Daoy細胞199bSC1クローンの増殖速度の低下において役割を有することを示唆した。対照的に、199bMC1クローンは、その細胞周期において有意な変化を示さなかった。本発明者らは、これらの知見は、HES1タンパク質レベルを低下させる199bMC1の全体的な低い効率によると考えている。199bSC1および199bMC1クローンを、空のベクタークローンおよびmiR-199b-5pに対して設計された2-OMの一時的な形質転換体と比較するin-vitro増殖アッセイによって評価されるように、これらの細胞周期表現型は、in vitroで増殖速度の低下に変換した(図1B)。199bMC1および1999SC1両クローンは、著しく低下した増殖速度を示した。このアンチセンス2-OMのトランスフェクションは、HES1の発現レベルの回復と一致して、安定な199bSC1クローンの著しい増大を誘発した。Daoy細胞増殖に関するこれらの結果はまた、D283およびONS76細胞を用いても確認された(図10F)。miR-199b特異的2-OMの効果はまた、野生型Daoy細胞において確認され、これでは、それは、内因性miR-199bに対して作用する可能性がある(図10G)。
ノッチ経路は、前駆体幹細胞マーカーを有するMB腫瘍細胞の画分と関連しており[36]、HES1は、多能性前駆体細胞の自己再生において役割を有する[23]。腫瘍細胞のこのサイドポピュレーション(SP)は、動物モデルにおける腫瘍の生着において役割を有する[37]。したがって、本発明者らは、Hoechst 33342色素を排除する腫瘍細胞のポピュレーションに対するmiR-199b-5pの影響を調べた、これらのSP細胞を同定するための戦略。これは、Daoy細胞株におけるフローサイトメトリーによって決定され、ベラパミル処理された細胞(陰性対照)と比較されるように、これらのうちSPは、細胞の最大4.9%を占める(図11A、B)。このベラパミル処理は、Hoechst 33342色素排除を担うイオンポンプのベラパミル阻害に基づいおり、したがって、SP細胞を見られようにする[38]。199bSC1および199bMC1細胞の染色は、Hoechst処理サンプルとHoechstおよびベラパミルサンプル間で相違がないに近かったのでSPが除去されたことを示した(図11C〜F)。
本発明者らは、細胞表現型が、HES1のダウンレギュレーションと直接的に相関していることを確認するために、in-vitro細胞レスキュー実験を実施した。本発明者らは、安定な199bSC1クローンによって示される、より一致した表現型をレスキューするよう選択した。全長HES1 cDNAが、安定なDaoy細胞199bSC1クローンにクローニングされ、トランスフェクトされると、イムノブロット法によって評価されるように(図3A)HES1発現を回復させた。本発明者らはまた、安定な199bSC1クローンにおいてダウンレギュレートされたサイクリンD1の再発現に留意した。回復されたHES1発現はまた、細胞増殖に対するmiR-199b-5pの効果を逆転させた(図3B)。同時に、199bSC1クローンへのHES1 cDNAのトランスフェクションは、前神経bHLHおよび分化マーカーの誘導を低減させ、増殖遺伝子のレベルを増大した(図3C)。さらに、安定な199bSC1クローンへのHES1 cDNAの一時的トランスフェクションは、S相の細胞のパーセンテージの増大およびG0〜G1相に対する遮断の除去につながった(図3D)。これは、miR-199b-5pを過剰発現する安定な199bSC1クローンにおいて見られる効果と反対であった(図1Cおよび図3C参照のこと)。安定な199bSC1クローンのSPに対するHES1の発現の回復の効果も評価した。HES1をトランスフェクトされた細胞(GFP陽性)が、Hoechst色素を排除するその能力について評価された場合には、それらは、SPにおいて、最大1.3%の最小の増大しか示さなかった。安定な199bクローンについて測定されたものよりも高かったが(図3E〜H)、これは依然として、野生型細胞のSP細胞のレベルを下回る(図11)。これはおそらくは、一時的トランスフェクション後のHES1の再発現の短い時間のためであり、これは、完全な表現型レスキューを可能にするのに十分ではない可能性がある。次いで、本発明者らは、CD133コンパートメントに対する効果をレスキューしようとしたが、199bSC1クローンにおけるHES1の一時的トランスフェクションは、CD133+細胞の有意な増大はもたらさなかった。本発明者らは、これは、Daoy細胞階層の再組織化を可能にしない短い一時的トランスフェクション時間によると考えている。
ここで、この知見は、miR-199b-5pが腫瘍形成の可能性ある阻害剤であることを示した。したがって、本発明者らは、in-vivo腫瘍モデルにおけるmiR-199b-5pの役割を調べるために、ルシフェラーゼcDNAを保持する発現ベクターを用いて199bSC1および対照Daoyクローンを安定化した。得られたクローンを、ルシフェラーゼ発現レベルについて試験し、またHES1およびmiR-199b-5p発現の両方の点で親の表現型の維持について確認した(図12A〜D参照のこと)。次いで、これらの安定な199b-Luc1およびCtl-Luc-4 Daoyクローンをそれぞれ、5匹の胸腺欠損ヌード/ヌードマウスの左および右側腹部に注射した。腫瘍増殖を毎週の注射されたマウスのin-vivo生物発光イメージング(BLI)によって評価した。8週間で、すべてのマウスが各対照側腹部において可視量を示したのに対し、199b-Luc1を用いて注射された3匹の側腹部しか、腫瘍生着を示さなかった。全体として、対照側腹部とmiR-199b-5p側腹部間の腫瘍体積において有意差が見られた(図4A)。生物発光測定は、対照サイド(例えば、マウス番号4、図4B)と比較して、腫瘍増殖の間のmiR-199b-5pサイドの発光において有意な低減を示した。9週間後、5匹のマウスのうち4匹が、対照サイドとmiR-199b-5p対サイド間でこれらの生物発光シグナルにおいて統計的に有意な相違を示した(図4C)。統合すると、これらのデータは、miR-199b-5pは、胸腺欠損ヌード/ヌードマウスにおいてin vivoで腫瘍形成を損なうことができることを示す。マウス番号5およびマウス番号4に由来する異種移植片腫瘍を外殖し、miR-199b-5pおよびHES1発現について分析し、病理組織学的に評価した(図12E〜H)。
本発明者らは、健常なヒト小児小脳において、miR-199b-5pが効率的に発現されるかどうかを調べるために、Developmental Disorders, at the University of Maryland, USAのNICHD Brain and Tissue Bankから入手した13の対照サンプルを使用した。本発明者らは、miR-199b-5p発現を測定し、0〜1歳の小児から得た5種の小脳サンプルを、13〜16歳の小児から得た6種と比較した(図6A)。MiR-199b-5pは、より若い健常な対照から得た外殖片において、より多い発現を示した(マン-ホイットニー検定、P=0.006)。
標的予測分析によって、miR-199a-5pおよびmiR-199b-5pは、高スコア値を有するHES1をターゲッティングする可能性があるとわかった。この可能性ある結合が、生存細胞において効率的なHES1調節に変換するかどうかを調べるために、本発明者らは、両miRNAをHEK-293細胞株にトランスフェクトした(図9A、B)。本発明者らは、pre-miRNAを、発現がCMVプロモーターによって駆動される2種の構築物にクローニングした。一時的トランスフェクションの48時間後、miR-199b-5pは、実際、HES1発現をダウンレギュレートしなかった。本発明者らは、この段階で、種々の細胞種におけるHES1 3’UTRに対するmiR-199a-5pの効果も排除できた。
本発明者らは、小脳発達の際にmir199がどのように発現されるかについての疑問に対応するために、mmu-miR-199b-5pマウス同族体を使用し、発達中のマウス小脳におけるその発現についてアッセイした。本発明者らは、ジゴキシゲニン(digoxygenin)(DIG)で標識されたロックド核酸プローブの使用のために開発された方法論を適用した。図10Aに示されるように、E14.5の胚およびPOの新生仔マウス脳を、in-situハイブリダイゼーション実験において使用した。mmu-miR-199b-5pの発現を、中枢神経系における大量のmiRNAであるとわかっている対照としてのmiR-124aのものと比較した。mmu-miR-199b-5pの発現は、miR-124aと比較して、より散在性であった。また、mmu-miR-199b-5p発現は、小脳の発達とともに低下し、miR-124aは、内顆粒細胞層(IGL)において、およびプルキンエニューロンにおいてその発現を保有した。次いで、mmu-miR-199b-5pの発現を、成熟miRNAのレベルを測定することによって、また、リアルタイムPCRを使用するその発現分析によって、マウス小脳において、種々の発達段階で評価した。データは、mmu-miR-199b-5pは、miR-124aと比較して低レベルで発現されても、mmu-miR-199b-5p発現は発達において調節され、胎生期16.5から成体に発達したマウス小脳へと低減するということを示した(図10B)。
miR-199b-5pの予測される標的の中には、キナーゼGSK3-β、ShhおよびWnt経路からのシグナル変換に関与するタンパク質、したがって、小脳の細胞ホメオスタシスを調節する経路における重大なキナーゼがある。この理由のために、本発明者らは、すでに得られた安定な199bSC1クローンを使用して、miR-199b-5pの、GSK3-βをダウンレギュレートする能力を評価した。このクローンは、GSK3-βタンパク質のレベルの任意の有意な低減を示さなかった(図10C)。この効果は、実際に、ピタアルゴリズムによって評価される高いΔΔGによって示唆されるように、miR-199b-5pとの結合に利用できないGSK3-βの3’UTRに従って説明できる(表3;[4]参照のこと)。本発明者らはまた、miR-199b-5pによるその可能性ある調節について試験される3種のその他の遺伝子を選択した:Nanog、NHLH2およびサイクリンL1。これらの遺伝子は、ダウンレギュレートされると、安定なmiR-199b-5pクローンにおいて見られるものと同様の表現型につながり得る。本発明者らは、これらの選択された遺伝子3’UTRに対するmiR-199b-5pのダウンレギュレート性の効果は全く検出しなかった(図10D)。より最近、miR-199a*は、MET癌原遺伝子を調節することが示された[3]。miR-199b-5pと同一の配列を共有するので、本発明者らの分析において、この癌原遺伝子のレベルを調べることは注目されるものとなり、これが将来の研究の論点となる。
ルシフェラーゼに基づく、in-vivoイメージングが、同所性動物モデルにおいて腫瘍細胞の生着の可能性を調べるための強力なツールとして最近現れた[5]。in-vivo腫瘍モデルにおけるmiR-199b-5pの役割を調べるために、本発明者らは、ルシフェラーゼcDNAを保持する発現ベクターを用いて199bSC1および対照Daoyクローンを安定化した。クローンをそのルシフェラーゼ発現レベルを評価するために試験した(図12A、B):これらのin-vitro実験は、細胞数と生物発光測定値の間に高い相関を示した。したがって、このルシフェラーゼ発現によって、腫瘍関連生物発光の非侵襲性イメージングおよび腫瘍増殖の定量化が可能となった。補足図12C、Dに示されるように、得られた安定なクローンを、miR-199b-5pおよびHES1発現の両方の点で、その親の表現型の維持について確認した。マウス番号4に由来する異種移植片を外殖し、処理し、ヘマトキシリンおよびエオシン染色を使用してその形態学を調べた。対照サイドで形成された腫瘍は、miR-199b-5pを注射されたサイドで形成されたものよりも、筋肉組織への前者の浸潤によって見ることができるように、より浸潤性であり、侵襲性である(図12E;黒色矢印)。ネスチンに対する抗体を用いる染色は、miR-199b-5pサイドに形成された腫瘍は、ノッチ経路ダウンレギュレーションと一致して、神経前駆細胞の特徴を有する細胞をあまり示さないことを示した(図12G、H)[6]。199b-および対照を注射されたサイドの両方で腫瘍を形成したマウス番号5に由来する外殖片は、導入遺伝子(miR-199b-5p)の発現の喪失を示し、これは、腫瘍能の回復の一因であり得る(図12I)。
本発明者らが、miR-199b-5pの内因性レベルを増大できるかどうかを調べるために、本発明者らは、Daoy細胞株を、プレセニリン-セクレターゼ複合体を効率的に遮断し、結果として、ノッチ反応の活性化を効率的に阻止する[7,8]N-[N-(3,5-ジフルオロフェナセチル)-l-アラニル]-S-フェニルグリシンt-ブチルエステル(DAPT、Sigma-Aldrich)を用いて処理した。図13Aに示されるように、本発明者らは、DAPTを用いる処理の際に、12時間でmiR-199b-5pのレベルが9倍に増大することを見い出した。次いで、この活性化は、処理の24時間以内の、その発現の迅速な阻害に続いた。その後、これらのデータは、ウエスタンブロット分析を使用してHES1のレベルを確認することによって支持され(図13B)、ひいては、miR-199b-5p過剰発現に続いて、HES1タンパク質レベルの阻害が見られることを示す。これらのデータから、本発明者らがDAPT処理の際に、HES1喪失およびmiR199過剰発現が、どの程度、胚性幹(ES)および癌幹細胞に関与する遺伝子の遺伝子発現のサインに影響を及ぼし得るかを調べるよう促された。
動物の準備およびPET/CTイメージング
イメージング研究に先立って、マウスを換気したケージ中(26℃)に1時間維持した。ケタミン(100mg/kg)およびキシラジン(10mg/kg)の混合物(注射容量、100μl/10g)の腹膜内投与を用いて麻酔を実施した。外側尾静脈中に3’-デオキシ-3’-[18F]フルオロチミジン([18F]FLT)、腫瘍増殖のマーカー(50μL;7.4MBq;スキャン時間、18分)を投与した1時間後に、動物PETスキャナー(GE Healthcare eXplore Vista, FWHM 1.6mm)を使用してPETを実施した。高分解能CT研究(GE Healtcare eXplore Locus;空間分解能、45μm)を、PETから24時間以内に実施した。
PET研究から、最大(SUVmax)および平均(SUVmean)標準化取り込み値(SUV)を算出した(SUV=組織活性(MBq/cc)/[注射された用量(MBq)/体重(g)])。PET/CTイメージを後処理し、Osirix 3.3(MAC OS 10.5 operating system)を使用して多断面再構成(MPR)、最大値投影法(MIP)、3D体積レンダリングおよび融合画像を得た。MicroView(GE eXplore Locus)を使用してさらなる3D再構成を得た。
MBにおいて変化しているシグナル伝達経路間の相互接続は、大部分はわかっておらず、治療に関係している死亡率および罹病率を低下させる、リスククラスに従って特定の患者の層別化を規定することは依然として困難である。本発明者らは、本研究において、miRNA miR-199b-5pによるHES1遺伝子調節の機序を同定した。HES1は、小脳顆粒細胞の、Shhを用いる処理がHES1のレベルを増大するという最近の知見によって示されるように[20]、小脳発達の重要な調節因子である。これは、HES1が、Shhおよびノッチ2シグナル伝達カスケード両方の転写標的であるということを示唆する。
材料および方法:
SNALP形成
その他の研究(71〜73)において使用されるSNALP(安定な核酸脂質粒子)技術を、mir 199b-5pおよびLipoid GMBH(Cam, Switzerland)によって提供される種々の脂質によるその関連対照スクランブル(図ではCTRと名づけられている)のためにに考案した。Carlo Erba Reagenti製の分析等級溶媒を使用した。押し出し工程では、Nucleopore Track Membrane 25mmポリカーボネートフィルターは、Whatman(Brentford,UK)製であった。透析のためのメンブラン、塩およびすべてのその他の化学物質は、Sigma-Aldrich (Milan, Italy)から購入した。
増殖アッセイ(MTS)を、キットCellTiter96 AQueous非放射性細胞増殖アッセイ(Promega)によって72時間行った。対照SNALPを用いて、およびmiR 199b-5pを用いて処理された細胞株daoy、MDA-231Tおよび4t1を、100μlの完全培地中1000および3000個細胞の濃度(それぞれ、daoy、MDA-231Tおよび4t1)で96マルチウェルに移した。各実験点について、5回の反復を行った。24、48および72時間後、各ウェルに、20μlの5×溶液を加えた。4時間後、Multilabel counter Victor3(Perkin Elmer)によって490nmでホルマザンの吸光度を読み取った。
ソフトウェアCELL Questバージョン3.3を用いて、FACSCalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA)によって、対照SNALPおよびmiR 199b-5p SNALPを用いて処理したdaoy、MDA-231Tおよび4t1においてアポトーシスアッセイを行った。アネキシンV分析を、抗体Miltenyi Biotec(Auburn, CA)によって行った。細胞をヨウ化プロピジウム(Propidium iodure)を用いて染色し、次いで、抗アネキシンV anticorpo FITC(Miltenyi Biotec)とともに、4℃、暗所で10分間インキュベートした。次いで、細胞をPBSを用いて洗浄した。
RT syber green 199bおよびCD133:以下参照
細胞培養
マウス乳癌細胞株4T1は、American Type Culture Collection(参照74、ATCC, Manassas, VA)によって得、10% FBS、10U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプトマイシン(Celbio Pero, Milan, Italy)を補給した「ダルベッコ改変イーグル培地」(DMEM;Sigma)で継代した。細胞株HT29(ヒト結腸癌腫)およびMDA-231T(ヒト乳癌)は、American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA)によって得、10% FBS、10U/mlペニシリンおよび0.1mg/mlストレプトマイシン(Celbio Pero, Milan, Italy)を含む「ダルベッコ改変イーグル培地」(DMEM; Sigma)で継代した。
髄芽細胞腫、乳癌および結腸癌腫細胞株においてSNALPによって保持されるMiR 199b-5pならびに毒性の評価および標的Hes1阻害の評価。
成熟型のmiR 199b-5p(リボヌクレオチド配列)を、関連対照を用いて材料および方法に記載されるとおりSNALPによって製剤した。Daoy、MDA231T、HT29および4T1細胞株を1μgのオリゴヌクレオチドを用いて処理し、増殖アッセイMTSによって生命力を評価した(図17Aおよび18A)。図17A、18A、20A〜Bに示されるように、株は、miR 199b-5p SNALPを用いる処理後24、48および72時間で、対照に対して増殖速度の低下を示した。処理の72時間後、miR 199b-5pの発現は、両細胞株において増大した(図17Bおよび18B)。処理の72時間後、アネキシンV分析によって処理の毒性を評価した(図17Cおよび18C)。図17Cおよび18Cに示されるように、両細胞株は、対照およびmiR 199b-5p間でアポトーシスレベルにおいて相違を示さなかった。さらに、図17Dおよび18Dに示されるように、処理の72時間後、ウエスタンブロッティングによってHes1発現を評価した。SNALPによるmiR 199b-5pの過剰発現は、Hes1の低減を示し、処理の有効性を示した。
miR 199b-5pの発現を、乳房(29組織)および結腸癌腫(13組織)において評価した。図19において示されるように、miR 199b-5pの発現レベルは、健常な対照に癌腫組織において低く、これはまた、これらの腫瘍において、腫瘍進行の際にmiR 199b-5pが発現停止されることを示す。遺伝子Cd133の発現レベルはまた、癌幹細胞マーカーであるので、癌腫組織に対して健常な対照において低い。
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Claims (13)
- 髄芽細胞腫、リンパ腫、神経膠芽腫、結腸癌腫および乳癌からなる群において選択される、遺伝子CD133の発現を特徴とする腫瘍の治療および/または予防において使用するための、以下の配列:
CAGAGGACACCTCCACTCCGTCTACCCAGTGTTTAGACTATCTGTTCA GGACTCCCAAATTGTACAGTAGTCTGCACATTGGTTAGGCTGGGCTG GGTTAGACCCTCGG (配列番号1)
を含む、もしくはからなる、
または対応するリボヌクレオチド配列:
CCAGAGGACACCUCCACUCCGUCUACCCAGUGUUUAGACUAUCUG UUCAGGACUCCCAAAUUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGGCU GGGCUGGGUUAGACCCUCGG (配列番号10)
を含む、もしくはからなる、
または配列番号10の一部:
CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC(配列番号11)
を含む、もしくはからなるオリゴヌクレオチド配列。 - ウイルスベクターによって、またはSNALP技術、LNA技術によって保持される、またはC1〜7リンカーを介して連結されるコレステロール分子の結合によって修飾されるO-2-メチル基を有する、請求項1に記載の配列。
- ウイルスベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項2に記載の配列。
- アデノウイルスベクターが、図16に示されるゲノムマップ配列を有するAdV5ベクターであり、前記ベクターが、CMVプロモーターを含む6217bpからなり、ベクター中、XhoI/HindIII制限部位に配列番号1からなるかまたは含む配列がクローニングされている、請求項3に記載の配列。
- 生体サンプルにおける、配列番号1を含むかまたはからなる配列の発現およびCD133、c-myc、nanog、oct4、TCFL1、ZIC1、KLF5、HMGA1、HMGB3の中から選択される、癌幹細胞において発現される1つまたは複数の遺伝子の発現の検出によって、腫瘍の病理組織学的ステージおよび転移の存在を評価するためのin vitro診断方法。
- 配列番号1を含むかまたはからなる配列の発現の検出が、以下の増幅プライマー:
プライマーフォワード:CGGGAATTCCCAGAGGACACCTCCAC(配列番号3)
プライマーリバース:CGGCTCGAGCCGAGGGTCTAACCCAG(配列番号4)
および配列の発現値を正規化するために使用される1対の対照プライマーを使用するリアルタイムPCRによって行われる、請求項5に記載の方法。 - 配列の発現値を正規化するために使用される対照プライマーが、以下:
プライマーフォワード:GAA AAG CCT TGT TTG TGC TTG C(配列番号5)
プライマーリバース:GGG CCA TGC TAA TCT TCT CTG T(配列番号6)
である、請求項6に記載の方法。 - 配列番号1を含むかまたはからなる配列の発現の検出が、以下のステップ:
a)RNAのレトロ転写;およびb)以下のプライマーおよびプローブ配列:
プライマーフォワード:AGGACACCTCCACTCCGTCTAC(配列番号7)
プライマーリバース:GCCTAACCAATGTGCAGACTACTG(配列番号8)
プローブ:CAGTGTTTAGACTATCTGTTCAGGACTCCCAAATTG(配列番号9)
を使用するTaqManアッセイによる前記配列の発現
を含む、請求項5に記載の方法。 - 前記1つまたは複数の遺伝子が、以下の対の増幅プライマー:
CD133:
プライマーフォワード:CTATGTGGTACAGCCGCGTG (配列番号22)
プライマーリバース:TAATCAATTTTGGATTCATATGCCTTC (配列番号23)
c-myc
プライマーフォワード:ATGAGGAGACACCGCCCAC (配列番号24)
プライマーリバース:AACATCGATTTCTTCCTCATCTTCTT (配列番号25)
Nanog:
プライマーフォワード:GCAAATGTCTTCTGCTGAGATGC (配列番号26)
プライマーリバース:GCTGTCCTGAATAAGCAGATCCAT (配列番号27)
Oct4:
プライマーフォワード:ACTGCAGCAGATCAGCCACA (配列番号28)
プライマーリバース:TGGCGCCGGTTACAGAAC (配列番号29)
TCFL1:
プライマーフォワード:CCGCGGGACTATTTCGC (配列番号30)
プライマーリバース:AAAGAACGCGCTGTCCTGAG (配列番号31)
ZIC1:
プライマーフォワード:CAGTTCGCTGCGCAAACA (配列番号32)
プライマーリバース:GAGCCCTGCGAGGAGGAT (配列番号33)
KLF5:
プライマーフォワード:GCATCCACTACTGCGATTACCC (配列番号34)
プライマーリバース:TGAGAAGACTTGGTATAAACTTTTGTGC (配列番号35)
HMGA1:
プライマーフォワード:AAAAACAAGGGTGCTGCCAA (配列番号36)
プライマーリバース:CCTTCCTGGAGTTGTGGTGGT (配列番号37)
HMGB3:
プライマーフォワード:TTTTCCAAGAAGTGCTCTGAGAGG (配列番号38)
プライマーリバース:TTTCTCTTTCCCGGACATCG (配列番号39)
を使用する、以下の配列:
CD133:
CTATGTGGTACAGCCGCGTGATTTCCCAGAAGATACTTTGAGAAAATT CTTACAGAAGGCATATGAATCCAA AATTGATTA (配列番号13)
c-myc:
AGGAGGAACAAGAAGATGAGGAAGAAATCGATGTT (配列番号14)
Nanog:
GCAAATGTCTTCTGCTGAGATGCCTCACACGGAGACTGTCTCTCCTC TTCCTTCCTCCATGGATCTGCTTATTCAGGACAGC (配列番号15)
Oct4:
ACTGCAGCAGATCAGCCACATCGCCCAGCAGCTTGGGCTCGAGAAG G
ATGTGGTCCGAGTGTGGTTCTGTAACCGGCGCCA (配列番号16)
TCFL1:
CCGCGGGACTATTTCGCCGAAGTGAGAAGGCCTCAGGACAGCGCGT TCTTT (配列番号17)
ZIC1:
CAGTTCGCTGCGCAAACACATGAAGGTCCACGAATCCTCCTCGCAGG GCTC (配列番号18)
KLF5:
GCATCCACTACTGCGATTACCCTGGTTGCACAAAAGTTTATACCAAGT CTTCTCA (配列番号19)
HMGA1:
AAAAACAAGGGTGCTGCCAAGACCCGGAAAACCACCACAACTCCAG GAAGG (配列番号20)
HMGB3:
TTTTCCAAGAAGTGCTCTGAGAGGTGGAAGACGATGTCCGGGAAAGA GAAA (配列番号21);
のうち少なくとも1つの増幅によって、および
遺伝子配列の発現を正規化するために使用される以下の対のプライマー:
プライマーフォワード:CGT GCT GCT GAC CGA GG(配列番号79)
プライマーリバース:GAA GGT CTC AAA CAT GAT CTG GGT(配列番号80)
を使用することによって、リアルタイムPCRによって検出される、請求項5から8のいずれか一項に記載の方法。 - 前記1つまたは複数の遺伝子が、増幅のための以下のプライマーおよびプローブ:
cd 133
プライマーフォワード:TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA (配列番号49)
プライマーリバース:GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA (配列番号50)
プローブ:AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC (配列番号51)
c myc:
プライマーフォワード:GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG (配列番号52)
プライマーリバース:TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG (配列番号53)
プローブ CAGCAGCCTCCCGCGACG (配列番号54)
nanog:
プライマーフォワード:CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA (配列番号55)
プライマーリバース:GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA (配列番号56)
プローブ:CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA (配列番号57)
oct 4:
プライマーフォワード:AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT (配列番号58)
プライマーリバース:AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA (配列番号59)
プローブ:CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA (配列番号60)
tcfl1:
プライマーフォワード:CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG (配列番号61)
プライマーリバース:CCGAGGGAGCAGGATCAAG (配列番号62)
プローブ:AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC (配列番号63)
zic 1:
プライマーフォワード:CGCGCTCCGAGAATTTAAAG (配列番号64)
プライマーリバース:CGGTCACAGCCCTCAAACTC (配列番号65)
プローブ:TCCACAAAAGGACGCACACAGGG (配列番号66)
KLF5:
プライマーフォワード:TTTAACCCCACCTCCATCCTATG (配列番号67)
プライマーリバース:GGCAGGGTGGTGGGTAAATT (配列番号68)
プローブ:TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC (配列番号69)
HMGA1:
プライマーフォワード:CCCCAGGCAGACCTTATATGAG (配列番号70)
プライマーリバース:TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA (配列番号71)
プローブ:CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA (配列番号72)
HMGB3:
プライマーフォワード:CGCTATGATCGGGAAATGAAG (配列番号73)
プライマーリバース:TGGCCTTTTGGGAGCATTAG (配列番号74)
プローブ:ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG (配列番号75)
を使用する、以下の配列:
cd133
TCCACAGAAATTTACCTACATT
GGAAGAGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGCCTGGTCATCTGCT CTCTGCTGACCC (配列番号40)
c myc
GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTGGAAAACCAGCAGCCT
CCCGCGACGATGCCCCTCAACGTTAGCTTCACCAACAGGAACTA (配列番号41)
nanog:
CCGAAGAATAGCAATGGTGTGACGCAG
AAGGCCTCAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTACTCTTCCTACCACCA GGGATG (配列番号42)
oct 4:
AACCCGGAGGAGGTAGTCCTTTGTTACATGCATGAGTCAGTGAACAG GGAATGGGTGAATGACATTTGTGGGTAGGTTATT (配列番号43)
tcfl1:
CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAGAAGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGT CTTTTGTCCTCAGACTTGATCCTGCTCCCTCGG (配列番号44)
zic 1:
CGCGCTCCGAGAATTTAAAGATCCACAAAAGGACGCACACAGGGAGA AGCCCTTCAAGTGCGAGTTTGAGGGCTGTGACC (配列番号45)
KLF5:
TTTAACCCCACCTCCATCCTATGCTGCTACAATTGCTTCTAAACTGGC AATTCACAATCCAAATTTACCCACCACCCTGCC (配列番号46)
HMGA1:
CCCCAGGCAGACCTTATATGAGACATGGGAGTCCCACCGTATTGTCC AGGCTGGTCTCGAACTCCTGACCTCAAGCA (配列番号47)
HMGB3:
CGCTATGATCGGGAAATGAAGGATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAA GAAGAAGAAGGATCCTAATGCTCCCAAAAGGCCA (配列番号48);
のうち少なくとも1つの増幅によって、および
遺伝子配列の発現を正規化するための以下の対のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:GCCAACCGCGAGAAGATG(配列番号81)
プライマーリバース:ACAGCCTGGATAGCAACGTACA(配列番号82)
プローブ:CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC(配列番号83)
を使用することによって、リアルタイムTaqManアッセイによって検出される、請求項5から8のいずれか一項に記載の方法。 - リアルタイムPCRによる、生体サンプルにおける、配列番号1の配列を含むかまたはからなる配列の発現の検出およびCD133、c-myc、Nanog、Oct4、TCFL1、ZIC1、KLF5、HMGA1、HMGB3の中から選択される、癌幹細胞において発現される1つまたは複数の遺伝子の検出によって、腫瘍の病理組織学的ステージおよび転移の存在を評価するためのin vitro診断キットであって、
a)配列番号1を含むかまたはからなる前記配列の以下の増幅プライマー:
プライマーフォワード:CGGGAATTCCCAGAGGACACCTCCAC(配列番号3)
プライマーリバース:CGGCTCGAGCCGAGGGTCTAACCCAG(配列番号4)
b)前記配列の発現値を正規化するための1対の対照プライマー;
c)前記1つまたは複数の遺伝子の配列を検出するための以下の1または複数の対のプライマーおよびプローブ:
cd133
プライマーフォワード:TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA (配列番号49)
プライマーリバース:GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA (配列番号50)
プローブ:AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC (配列番号51)
c myc:
プライマーフォワード:GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG (配列番号52)
プライマーリバース:TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG (配列番号53)
プローブ CAGCAGCCTCCCGCGACG (配列番号54)
nanog:
プライマーフォワード:CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA (配列番号55)
プライマーリバース:GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA (配列番号56)
プローブ:CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA (配列番号57)
oct 4:
プライマーフォワード:AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT (配列番号58)
プライマーリバース:AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA (配列番号59)
プローブ:CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA (配列番号60)
tcfl1:
プライマーフォワード:CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG (配列番号61)
プライマーリバース:CCGAGGGAGCAGGATCAAG (配列番号62)
プローブ:AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC (配列番号63)
zic 1:
プライマーフォワード:CGCGCTCCGAGAATTTAAAG (配列番号64)
プライマーリバース:CGGTCACAGCCCTCAAACTC (配列番号65)
プローブ:TCCACAAAAGGACGCACACAGGG (配列番号66)
KLF5:
プライマーフォワード:TTTAACCCCACCTCCATCCTATG (配列番号67)
プライマーリバース:GGCAGGGTGGTGGGTAAATT (配列番号68)
プローブ:TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC (配列番号69)
HMGA1:
プライマーフォワード:CCCCAGGCAGACCTTATATGAG (配列番号70)
プライマーリバース:TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA (配列番号71)
プローブ:CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA (配列番号72)
HMGB3:
プライマーフォワード:CGCTATGATCGGGAAATGAAG (配列番号73)
プライマーリバース:TGGCCTTTTGGGAGCATTAG (配列番号74)
プローブ:ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG (配列番号75)
e)前記遺伝子配列の発現を正規化するための以下のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:GCCAACCGCGAGAAGATG(配列番号81)
プライマーリバース:ACAGCCTGGATAGCAACGTACA(配列番号82)
プローブ:CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC(配列番号83)
を含むかまたはからなるキット。 - 配列の発現を正規化するためのb)中の前記対照プライマーが、以下:
プライマーフォワード:GAA AAG CCT TGT TTG TGC TTG C(配列番号5)
プライマーリバース:GGG CCA TGC TAA TCT TCT CTG T(配列番号6)
である、請求項11に記載のキット。 - 配列番号1を含むかまたはからなる配列の発現の、TaqmanリアルタイムPCRを使用する、生体サンプルにおける検出およびCD133、c-myc、Nanog、Oct4、TCFL1、ZIC1、KLF5、HMGA1、HMGB3の中から選択される、癌幹細胞において発現される1つまたは複数の遺伝子の検出によって、腫瘍の病理組織学的ステージおよび転移の存在を評価するためのin vitro診断キットであって、
a1)配列番号1を含むかまたはからなる前記配列の発現を検出するための以下のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:AGGACACCTCCACTCCGTCTAC(配列番号7)
プライマーリバース:GCCTAACCAATGTGCAGACTACTG(配列番号8)
プローブ:CAGTGTTTAGACTATCTGTTCAGGACTCCCAAATTG(配列番号9)
b1)前記1つまたは複数の遺伝子配列の発現の検出のための、以下の1または複数の対のプライマーおよび関連プローブ:
cd 133
プライマーフォワード:TCCACAGAAATTTACCTACATTGGAA (配列番号49)
プライマーリバース:GGGTCAGCAGAGAGCAGATGA (配列番号50)
プローブ:AGTATGATTCATACTGGTGGCTGGGTGGC (配列番号51)
c myc:
プライマーフォワード:GCTGGATTTTTTTCGGGTAGTG (配列番号52)
プライマーリバース:TAGTTCCTGTTGGTGAAGCTAACG (配列番号53)
プローブ CAGCAGCCTCCCGCGACG (配列番号54)
nanog:
プライマーフォワード:CCGAAGAATAGCAATGGTGTGA (配列番号55)
プライマーリバース:GCATCCCTGGTGGTAGGAAGA (配列番号56)
プローブ:CAGCACCTACCTACCCCAGCCTTTA (配列番号57)
oct 4:
プライマーフォワード:AACCCGGAGGAGGTAGTCCTT (配列番号58)
プライマーリバース:AATAACCTACCCACAAATGTCATTCA (配列番号59)
プローブ:CATGCATGAGTCAGTGAACAGGGAA (配列番号60)
tcfl1:
プライマーフォワード:CCAAGGAAGAGAACGTTGACATAG (配列番号61)
プライマーリバース:CCGAGGGAGCAGGATCAAG (配列番号62)
プローブ:AGGCTCTTTGTGTTTTTCCTTGTCTTTTGTCC (配列番号63)
zic 1:
プライマーフォワード:CGCGCTCCGAGAATTTAAAG (配列番号64)
プライマーリバース:CGGTCACAGCCCTCAAACTC (配列番号65)
プローブ:TCCACAAAAGGACGCACACAGGG (配列番号66)
KLF5:
プライマーフォワード:TTTAACCCCACCTCCATCCTATG (配列番号67)
プライマーリバース:GGCAGGGTGGTGGGTAAATT (配列番号68)
プローブ:TGCTTCTAAACTGGCAATTCACAATC (配列番号69)
HMGA1:
プライマーフォワード:CCCCAGGCAGACCTTATATGAG (配列番号70)
プライマーリバース:TGCTTGAGGTCAGGAGTTCGA (配列番号71)
プローブ:CATGGGAGTCCCACCGTATTGTCCA (配列番号72)
HMGB3:
プライマーフォワード:CGCTATGATCGGGAAATGAAG (配列番号73)
プライマーリバース:TGGCCTTTTGGGAGCATTAG (配列番号74)
プローブ:ATTATGGACCAGCTAAGGGAGGCAAG (配列番号75)
c1)前記遺伝子配列の発現を正規化するための、以下の対のプライマーおよびプローブ:
プライマーフォワード:GCCAACCGCGAGAAGATG (配列番号81)
プライマーリバース:ACAGCCTGGATAGCAACGTACA (配列番号81)
プローブ:CCCAATCATGTTTGAGACCTTCAAC (配列番号83)
を含むかまたはからなるキット。
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