JP2012519494A - マトリックスメタロプロテアーゼ１の温度感受性突然変異体およびその使用 - Google Patents

マトリックスメタロプロテアーゼ１の温度感受性突然変異体およびその使用 Download PDF

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Abstract

温度依存的活性を呈する改変マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）酵素およびその使用を提供する。本MMPは、例えば1つまたはそれ以上のECM構成要素の増加した沈着または蓄積を特徴とする、ECM介在疾患または障害を処置するために使用することができる。

Description

［関連出願］
2009年3月6日に出願された、「Temperature Sensitive Mutants of Matrix Metalloproteases and Uses Thereof」と題する、Louis Bookbinder, Gregory I. Frost, Gilbert Keller, Gerhard Johann Frey, Hwai Wen ChangおよびJay Milton Shortの米国仮特許出願第61/209,366号に基づく優先権の利益を主張する。許される場合、上記出願の内容は、引用によりそのまま本明細書に組み込まれる。
本願は、米国仮特許出願第61/209,366号に基づく優先権を主張する、「Temperature Sensitive Mutants of Matrix Metalloproteases and Uses Thereof」と題する米国特許出願第12/660,894号に関連する。
本願は、それぞれ「In Vivo Temporal Control of Activatable Matrix-Degrading Enzymes」と題し、それぞれ米国仮特許出願第61/068,667号および米国仮特許出願第61/127,725号に基づく優先権を主張する、Gilbert KellerおよびGregory FrostのPCT国際出願番号PCT/US2009/001486ならびにGilbert KellerおよびGregory Frostの米国特許出願第12/381,063号に関連する。
許される場合、上記関連出願の内容は、引用によりそのまま本明細書に組み込まれる。
［電子形式で提出された配列表の引用による組込み］
本願と共に電子形式の配列表が提出され、その内容は引用によりそのまま本明細書に組み込まれる。電子ファイルはサイズが12.8メガバイトであり、ファイル名は3077seq.PC1.txtである。
［発明の分野］
温度依存的活性を呈する改変（modified）マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）酵素およびその使用を提供する。制御された作用持続時間を有するMMPは、例えば、1つまたはそれ以上のECM構成要素の増加した沈着または蓄積を特徴とするECM介在（ECM-mediated）疾患または障害を処置するために使用することができる。
［背景］
細胞外マトリックス（ECM）は細胞および組織に決定的に重要な構造的支持を提供する。ECM構成要素の過剰な沈着または蓄積の結果として生じる細胞外マトリックスの欠陥または変化は、ECM介在疾患または状態につながりうる。これらには、豊富なコラーゲンの線維性中隔（septae）の存在を特徴とするコラーゲン媒介疾患または状態が含まれる。多くの場合、そのような疾患または状態に対して唯一承認されている処置は外科手術であり、それは著しく侵襲的になりうる。デュピュイトラン症候群を処置するための穿刺腱膜切開やセルライトに対する脂肪吸引などといった他の処置も、著しく侵襲的である。
コラーゲンを分解する中性pHにおいて活性な酵素である細菌コラゲナーゼ（マトリックスメタロプロテイナーゼ1；MMP-1とも呼ばれる）は、セルライト（例えば米国特許出願公開番号US20070224184参照）；デュピュイトラン症候群（例えば米国特許番号USRE39941；5589171；6086872参照）；およびペイロニー病（例えば米国特許第6022539号参照）などといった、ECM介在状態を処置するために使用されてきた。しかしコラゲナーゼは、I型、II型およびIII型のコラーゲンを不可逆的に切断する。細菌コラゲナーゼは血管に関連するIV型コラーゲンも切断するので、その投与は出血および漏出性血管を引き起こしうる。コラゲナーゼの持続的活性は、投与することができる投薬量を制限し、持続的活性に伴う副作用のリスクも生じる。したがって、ECM介在疾患および状態の代替的処置が必要とされている。したがって、本発明における目的の一つは、ECM介在疾患および状態を処置するための代替的選択肢を提供することである。
［概要］
改変マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）酵素、およびそれらの使用、とりわけECM介在疾患または状態を処置するための使用を提供する。これらの酵素には、無改変酵素とは異なる温度で活性を呈するように改変された改変MMPが含まれる。したがってMMPの温度感受性突然変異体を提供する。特に、本突然変異体（mutant）は、高温よりも低温において、より活性であり、典型的には、高温では実質的に不活性である。例えば、本突然変異体は、25℃またはその前後の温度における活性の方が、それよりも高い34℃〜37℃またはその前後の温度における活性よりも高い。また、本突然変異体は低温において無改変酵素の活性を保持している。
したがって、本発明は、改変マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）を提供する。本MMPは、MMPポリペプチドのアミノ酸残基の配列中に1つまたはそれ以上の改変（modification）を含有するか、MMPの対立遺伝子変異体（allelic variant）または種変異体（species variant）中に改変を含有するか、その成熟型もしくはMMPの触媒活性フラグメント中に改変を含有する。一次アミノ酸配列における改変には、アミノ酸の置き換え（replacement）、挿入、欠失およびそれらの組合せが含まれる。本MMPは改変を1つだけ含むか、2つだけ、3つだけ、または4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個もしくはそれ以上の置き換えを含むことができる。改変は野生型MMPに対して行われるか、他の何らかの目的または活性のために既に改変されたMMP、または既に突然変異しているMMPに対して行われる。本発明が提供する改変は、MMP、その対立遺伝子変異体もしくは種変異体、またはその活性フラグメントに、少なくとも1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、20.0、30、40、50、60、70、80、90、100またはそれ以上の、非許容温度と比較した許容温度における酵素活性の比を付与する。本MMPは、指定された酵素活性の比を付与するために、1つだけ、2つだけ、または4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個もしくはそれ以上の置き換えを含むことができる。
一部の実施形態において、改変MMPポリペプチドは、許容温度において、野生型MMPとはいくらか異なる活性を保持することができる。例えば、それは、少なくともまたは約10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、140％、150％またはそれ以上の活性を保持し、または呈することができる。
改変MMPには、そのような改変を含むコラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシン、マトリライシン、メタロエラスターゼ、エナメライシンおよび膜型MMP、その対立遺伝子変異体または種変異体および活性フラグメントなどがあるが、これらに限るわけではない。代表的なMMPには、本明細書の表に掲載するもの、例えばMMP-1（コラゲナーゼ1）、MMP-8（コラゲナーゼ2）、MMP-13（コラゲナーゼ3）、MMP-18（コラゲナーゼ4）、MMP-2（ゼラチナーゼA）、MMP-9（ゼラチナーゼB）、MMP-3（ストロメライシン1）、MMP-10（ストロメライシン2）、MMP-11（アトロメライシン（atromelysin）3；ストロメライシン3）、MMP-7（マトリライシン）、MMP-26（マトリライシン2）、MMP-12（メタロエラスターゼ）、MMP-14（MT1-MMP）、MMP-15（MT2-MMP）、MMP-16（MT3-MMP）、MMP-17（MT4-MMP）、MMP-24（MT5-MMP）、MMP-25（MT6-MMP）、MMP-20（エナメライシン）、MMP-19、MMP-21、MMP-23、CA-MMP、MMP-27、CMMPおよびMMP-28（エピライシン（epilysin）などがあるが、これらに限るわけではない。これらには、対立遺伝子変異体および種変異体ならびにその活性フラグメントが含まれる。対立遺伝子変異体および種変異体は、対応する改変を含有し、それらはアラインメントなどによって容易に同定することができる。活性フラグメントは、そのような改変を少なくとも1つは含む。
改変MMPには、非許容温度において、非許容温度における改変を含まないMMPよりも低い活性を有するものが含まれる。許容温度は非許容温度より低い場合も高い場合もある。改変MMPは無改変MMPと比較して変化した活性を有することができる。活性は無改変MMPの活性より低下していてもよく、例えば95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、3％、1％未満またはそれ以下であることができる。また活性は、例えば同じパーセンテージだけ、増加していてもよい。許容温度としては、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃もしくは30℃、または約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃もしくは30℃、例えば25℃またはその前後が挙げられるが、これらに限るわけではない。非許容温度としては、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃もしくは39℃、または約34℃、35℃、36℃、37℃、38℃もしくは39℃が挙げられるが、これらに限るわけではない。例えば、ある実施形態では、非許容温度が34℃もしくは37℃またはその前後であり、許容温度が25℃または約25℃である。
一部の実施形態では、触媒活性フラグメントだけが提供されるか、または本発明が提供する任意の方法において触媒活性フラグメントだけが使用される。触媒活性フラグメントは、例えば融合タンパク質、または異なるタンパク質に由来する追加アミノ酸もしくは治療剤などの他の部分への化学的コンジュゲートのように、連結されていてもよい。触媒ドメインなどの触媒活性フラグメントが提供される場合、それは、上記の酵素活性比を付与するアミノ酸の置き換えを、少なくとも1つは含有する。
本発明は改変MMP-1ポリペプチドを提供する。代表的な改変MMP-1ポリペプチドは、配列番号3〜705、779〜3458、3507〜3536のいずれかに示すアミノ酸の配列を有する、本発明が提供する任意のもの、またはその対立遺伝子変異体もしくは種変異体、チモーゲン型、成熟型、またはその触媒活性フラグメントである。
上記の比を付与する改変を含有する、本発明が提供する改変MMPには、改変がアミノ酸の置き換えであって、その置き換えが、配列番号2に示すアミノ酸の配列を含むMMP-1ポリペプチドにおいて、またはMMPポリペプチド中の対応する残基において、位置84、85、95、98、99、100、103、104、105、106、109、110、111、112、118、123、124、126、147、150、151、152、153、155、156、158、159、170、171、176、178、179、180、181、182、183、185、187、188、189、190、191、192、194、195、197、198、206、207、208、210、211、212、218、223、227、228、229、230、233、234、237、240、251、254、255、256、257および258の任意の1つまたはそれ以上に対応する位置にあるものが含まれる。本明細書において説明するとおり、対応する残基は、実質的な相同性を有するタンパク質間では、例えば標準的アラインメントプログラムを使って、同定することができる。
特に、無改変MMP-1ポリペプチドが配列番号2に示すアミノ酸の配列を含有するか、アミノ酸の置き換えを含有するその対立遺伝子変異体もしくは種変異体またはその成熟型である、改変MMP-1ポリペプチドを提供する。そのような改変には、T84F、E85F、L95K、L95I、R98D、I99Q、E100V、E100R、E100S、E100T、E100F、E100I、E100N、T103Y、P104A、P104M、D105A、D105F、D105G、D105I、D105L、D105N、D105R、D105S、D105T、D105W、D105E、L106C、L106S、A109H、D110A、V111R、D112S、A118T、S123V、N124D、T126S、G147P、R150P、R150V、R150D、R150I、R150H、D151G、N152A、N152S、S153T、F155L、F155A、D156H、D156L、D156A、D156W、D156V、D156K、D156T、D156R、D156M、P158T、P158G、P158K、P158N、G159V、G159T、G159M、G159I、G159W、G159L、G159C、P170D、P170A、G171P、G171E、G171D、A176F、A176W、F178T、F178L、D179N、D179V、D179C、E180Y、E180R、E180T、E180F、E180G、E180S、E180N、E180D、E181T、D181L、D181K、D181C、D181G、E182T、E182Q、E182M、E182G、E183G、R183S、T185R、T185Y、T185H、T185G、T185V、T185Q、T185A、T185E、T185D、N187R、N187M、N187W、N187F、N187K、N187I、N187A、N187G、N187C、N187H、F188V、R189N、R189T、R189Q、E190G、E190Y、E190D、Y191V、N192H、N192S、N192D、N192C、H194P、R195C、R195W、R195L、R195G、R195Q、R195A、R195D、R195V、A197V、A197C、A198G、A198L、A198M、G206A、G206S、L207R、L207V、L207I、L207G、S208R、S208L、S210V、S210A、T211L、D212G、D212H、Y218S、F223C、F223E、F223G、F223A、F223S、F223K、F223M、V227C、V227D、V227E、V227L、V227S、V227W、V227G、V227H、V227Q、V227R、Q228P、L229A、L229T、L29I、A230V、D233E、I234A、I234T、I234E、I234Q、I237L、I237W、I237N、I240S、I240A、I240C、I251S、I251W、Q254S、T255H、P256C、K257P、K257TおよびA258P、例えばL95K、D105I、D105N、D105L、D105A、D105G、R150P、D156R、D156H、D156K、D156T、G159V、G159T、D179N、E180T、E180F、E182T、T185Q、N187I、A198L、V227E、I234EおよびI240S、またはL95K、D105N、R150P、D156K、D156T、G159V、D179N、E180T、A198L、V227E、およびI240Sなどがあるが、これらに限るわけではない。
別の改変MMPポリペプチドは、改変がアミノ酸の置き換えであって、その置き換えが、配列番号2に示すアミノ酸の配列を有するMMP-1ポリペプチドにおいて、またはMMPポリペプチド中の対応する残基において、位置95、105、150、151、155、156、159、176、179、180、181、182、185、187、195、198、206、210、212、218、223、227、228、229、230、233、234、および240の任意の1つまたはそれ以上に対応する位置にあり、その改変が、当該MMP、その対立遺伝子変異体もしくは種変異体、またはその活性フラグメントに、少なくとも1.5の、非許容温度と比較した許容温度における酵素活性の比を付与するものである。MMP-1に関して言えば、そのような改変には、L95K、D105A、D105F、D105G、D105I、D105L、D105N、D105R、D105S、D105T、D105W、R150P、D151G、F155A、D156K、D156T、D156L、D156A、D156W、D156V、D156H、D156R、G159V、G159T、A176F、D179N、E180Y、E180T、E180F、D181L、D181K、E182T、E182Q、T185R、T185H、T185Q、T185A、T185E、N187R、N187M、N187F、N187K、N187I、R195V、A198L、A198M、G206A、G206S、S210V、Y218S、F223E、V227C、V227E、V227W、Q228P、L229T、L229I、D233E、I234A、I234T、I234E、I240S、およびI240Cなどがあるが、これらに限るわけではない。
別の改変MMPポリペプチドは、改変がアミノ酸の置き換えであって、その置き換えが、配列番号2に示すアミノ酸の配列を有するMMP-1ポリペプチドにおいて、またはMMPポリペプチド中の対応する残基において、位置95、105、150、156、159、179、180、182、185、187、195、198、212、223、227、234、および240の任意の1つまたはそれ以上に対応する位置にあり、改変MMPポリペプチドが、25℃において、25℃における野生型MMP-1と比較して、少なくともまたは約30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、140％、150％またはそれ以上の活性を保持しているものである。これには、改変が、L95K、D105A、D105G、D105I、D105L、D105N、D105S、D105W、D105T、R150P、D156K、D156T、D156V、D156H、D156R、G159V、G159T、D179N、E180Y、E180T、E180F、E182T、T185H、T185Q、T185E、N187M、N187K、N187I、R195V、A198L、F223E、V227E、I234EおよびI240Sの中から選択される改変MMPポリペプチドが含まれる。
改変MMPポリペプチドには、非許容温度にばく露した時にポリペプチドの活性が可逆性であるもの、例えば非許容温度にばく露して許容温度に戻した時に、ポリペプチドが、非許容温度における活性と比較して、120％、125％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、200％またはその前後もしくはそれ以上の活性を呈するものなどが含まれる。これらには、改変がアミノ酸の置き換えであって、その置き換えが、MMPポリペプチドにおいて、位置D105A、D105F、D105G、D105S、D105T、R150P、G159T、E180Y、E180T、E180F、T185H、T185Q、T185A、T185E、N187R、N187M、N187K、R195V、A198L、A198M、S210V、Y218S、F223E、V227W、L229IおよびI240Cの任意の1つまたはそれ以上に対応する位置にある、改変MMPポリペプチドが含まれる。
改変MMPポリペプチドには、非許容温度にばく露するとポリペプチドの活性が不可逆的に不活性になるもの、例えば非許容温度にばく露して許容温度に戻した時に、ポリペプチドが、非許容温度における活性の約50％、60％、70％、80％、90％、100％、105％、110％、115％もしくはその前後、または120％未満の活性を呈する改変MMPポリペプチドなどが含まれる。限定するわけではないが、これらには、L95K、D105I、D105L、D105N、D105R、D105W、D151G、F155A、D156K、D156T、D156L、D156A、D156W、D156V、D156H、D156R、G159V、A176F、D179N、D181L、D181K、E182T、E182Q、T185R、N187F、N187I、G206A、G206S、V227C、V227E、Q228E、L229T、D233E、I234A、I234T、I234EおよびI240Sの中から選択される改変をMMPポリペプチ中に有する改変MMPポリペプチドが含まれる。
上述した改変MMP-1ポリペプチドはいずれも、改変を含有しないMMP-1と比較して増加した活性を付与する活性突然変異（activity mutation）を、さらに含むことができる。例えば、そのような改変MMP-1ポリペプチドは、配列番号2に示すアミノ酸の配列を含むMMP-1ポリペプチドにおける位置81、84、85、86、87、89、104、105、106、107、108、109、124、131、133、134、135、143、146、147、150、152、153、154、157、158、160、161、164、166、167、180、183、189、190、207、208、211、213、214、216、218、220、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、235、236、238、239、244、249、254、256、257および258の任意の1つまたはそれ以上に対応する位置に、アミノ酸の置き換えを含むことができる。例えば、アミノ酸の置き換えは、F81L、F81A、F81G、F81Q、F81R、F81H、T84H、T84L、T84D、T84R、T84G、T84A、E85S、E85V、G86S、N87P、N87R、N87G、N87Q、R89A、R89T、R89G、R89K、P104E、P104D、P104Q、D105V、L106V、P107T、P107S、P107A、R108E、R108A、R108K、R108S、A109S、A109R、A109G、A109M、A109V、N124G、T131D、K132R、V133T、V133L、S134E、S134D、E135M、S143I、R146S、G147R、G147F、R150E、R150G、R150M、T150T、R150A、R150N、R150K、R150L、R150V、R150D、N152G、N152F、N152L、N152I、S153T、S153P、S153F、S153D、S153Y、P154S、P154I、G157F、P158V、P158I、G160Q、N161L、N161R、N161Y、N161E、N161T、N161I、N161V、N161F、N161Q、H164S、F166W、Q167R、Q167A、Q167S、Q167F、Q167P、Q167T、Q167V、Q167M、E180D、R183S、R189N、R189T、R189Q、E190D、L207M、S208K、S208R、S208L、T211N、I213G、G214L、G214E、L216I、Y218W、S220R、S220A、S220Q、S220T、S220G、S220M、S220V、S220N、T222R、T222P、T222S、T222F、T222N、F223Y、F223H, 2224Q、S224K、S224D、G225Q、G225E、G225H、D226S、D226E、D226P、D226I、V227T、Q228A、Q228D、Q228E、Q228G、Q228H、Q228K、Q228L、Q228M、Q228N、Q228R、Q228S、Q228T、Q228W、Q228Y、L229Q、L229P、L229V、A230G、A230W、A230D、A230I、A230S、A230C、A230V、A230T、A230M、A230N、A230H、Q231I、Q231A、Q231F、Q231D、Q231G、Q231V、Q231W、Q231S、Q231H、Q231M、D232H、D232G、D232R、D232P、D232Y、D232S、D232F、D232V、D232K、D232W、D232Q、D232E、D232T、D232L、D235G、D235A、D235L、D235E、D235R、D235Q、D235T、D235N、G236M、G236R、G236S、G236T、G236C、G236K、G236E、G236L、G236N、Q238T、A239S、A239V、A239L、A239I、A239G、A239K、A239H、A239R、S244W、S244Q、Q249W、Q254S、P256S、K257E、K257R、またはA258Pであることができる。少なくとも1つの温度感受性突然変異と少なくとも1つの活性突然変異とを含有する代表的な改変MMP-1ポリペプチドとして、アミノ酸の置き換えS208K/G159V；S208K/D179N；S208K/V227E；G214E/G159V；G214E/D179N；およびI213G/D179Nを有するものが挙げられる。
本発明は、改変を含有しないMMP-1と比較して増加した活性を呈する、活性突然変異体である改変MMP-1ポリペプチドも提供する。代表的な活性突然変異体は、上の段落に示す、そしてまた本明細書のセクションD.2.に示す、アミノ酸の置き換えを有する任意のものである。
改変することができるMMPには、MMP-1、MMP-8、MMP-13、MMP-18、MMP-2、MMP-9、MMP-3、MMP-10、MMP-7、MMP-6、MMP-12、およびその対立遺伝子変異体もしくは種変異体、成熟型、または触媒活性フラグメントなどがあるが、これらに限るわけではない。代表的な改変MMPには、無改変MMPポリペプチドが配列番号1、711、714、717、720、723、726、729、732、735、738、741、744、747、750、753、756、759、762、765、768、771、774または777のいずれかに示すアミノ酸の配列を有するもの、そのチモーゲン型、その対立遺伝子変異体もしくは種変異体、またはその活性フラグメントなどがある。そのような改変MMPは、本発明が提供するMMP-1中の改変のいずれかと比較してそのMMP中の対応する位置に、改変を有することができる。そのような対応する位置の代表例を図2および3に示し、代表的な突然変異を本明細書のセクションDに示す。これらには、例えば、配列番号2に示すアミノ酸の配列を有するMMP-1ポリペプチドにおいて、またはMMPポリペプチド中の対応する残基において、位置95、105、151、156、159、176、179、180、181、182、185、195、198、206、210、212、218、223、228、229、233、234、および240の任意の2つまたはそれ以上に対応する位置に、アミノ酸の置き換えを含有するポリペプチドなどがある。
2つまたはそれ以上の改変を有する改変MMPポリペプチドであって、それらの改変のうちの少なくとも1つが、または2つが、またはそれ以上が、上記の比を付与するものを提供する。改変MMPポリペプチドは、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上の改変を含有することができる。これらの一部または全部が、許容温度と非許容温度との間に、所望する活性の比を付与するか、その一因になることができる。代表的な改変MMPポリペプチドは、2つまたはそれ以上のアミノ酸の置き換えを含有して、それらの置き換えが、配列番号2に示すアミノ酸の配列を有するMMP-1ポリペプチドにおいて、またはMMPポリペプチド中の対応する残基において、位置95、105、150、156、159、179、180、182、185、187、198、227、234および240の任意の2つまたはそれ以上に対応する位置にあるもの、例えばMMPポリペプチドにおける2つまたはそれ以上の改変が、L95K、D105N、R150P、D156K、D156T、G159V、D179N、E180T、A198L、V227E、およびI240Sの中から選択されるもの、またはMMPポリペプチドにおける2つまたはそれ以上の改変が、表15に示す任意の改変の中から選択されるものなどである。
上記のとおり、改変MMPポリペプチドは、チモーゲン、または活性酵素であるか、触媒活性ドメインなどの触媒活性フラグメントだけを含有するか、プロリンリッチリンカーおよび/またはヘモペキシンドメインの全部または一部を欠くことができる。
改変MMPポリペプチドは、活性比を付与するものに加えて、1つまたはそれ以上の追加の改変、例えば限定するわけではないが、増加した安定性、増加した半減期、変化した基質特異性および/または阻害因子に対する増加した耐性を付与する改変などを含有することができる。例えば、改変MMPポリペプチドは、発現時にグリコシル化するか、またはグリコシル化されるように改変することができ、あるいは改変MMPポリペプチドはPEG化などの他の修飾を含有することができる。改変MMPポリペプチドは、別のタンパク質との融合タンパク質、例えばFc融合物であることができ、あるいは改変MMPポリペプチドを、二量体もしくはヘテロ二量体または他の多量体として提供することができる。
改変MMPポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子および/またはベクターも提供する。ベクターには、原核生物ベクター、ウイルスベクター、ならびに哺乳動物ベクターおよび酵母ベクターを含む真核生物ベクター、例えばアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、サイトメガロウイルスおよびピキア（Pichia）ベクター、ならびに人工染色体などがある。細菌細胞および藻類細胞などの原核細胞ならびに哺乳動物細胞などの真核細胞を含む細胞であって、それらのベクターを含有するものも提供する。細胞は改変MMPポリペプチドを発現することができ、その改変MMPポリペプチドは、その分泌または細胞中の他の部位への輸送を指示する核酸によってコードされうる。コード化されたMMPを細胞中で発現させることによってMMPを生産するための方法も提供する。本発明が提供するMMPは、凍結乾燥形態または他の乾燥形態もしくは非液状形態で提供することができる。
任意の改変MMPポリペプチドまたは改変MMPポリペプチドの混合物を含有する医薬組成物を含む組成物も提供する。医薬組成物は、MMPによる処置に馴染む任意の疾患を処置するために、特に本発明が提供する方法においては、細胞外マトリックス（ECM）の疾患または状態を処置するために、製剤化することができる。組成物は、1回投薬量投与用に製剤化することができ、複数回分の投薬量を含有することができ、あるいは希釈または他の薬剤の添加を必要とすることができる。1回投薬量あたりの量としては、例えば、1回投薬量あたり10μg〜100mg、50μg〜75mg、100μg〜50mg、250μg〜25mg、500μg〜10mg、1mg〜5mg、または2mg〜4mgが挙げられる。
ECMの疾患または症状を処置するための改変MMPの使用、またはそのための医薬の製剤、および細胞外マトリックス（ECM）の疾患または状態を処置するための方法、およびECMの疾患または状態を処置するためのプロセスも提供する。本方法を実施する際には、MMPポリペプチドまたはMMPポリペプチドを含有する医薬組成物を、ECMに投与または提供された時に酵素に温度活性化条件を与えてMMPが活性になるようにする活性化因子と共に、ECMに投与する。改変MMPポリペプチドは、許容温度における活性が、非許容性の生理的温度における活性よりも強く、活性化因子の投与前には、ECMには活性化条件が存在しない。
本発明は、ECMに改変MMP-1ポリペプチドもしくはその組成物、または温度感受性を呈する他の改変MMPを投与することによって、ECMの疾患または状態を処置するための方法であって、改変MMP-1が身体の生理的温度より低い許容温度で活性を呈する方法も提供する。本方法では、MMP-1を許容温度またはそれより低い温度で投与する。改変MMP-1は、投与の直前に許容温度またはそれより低い温度の組成物と混合するか、許容温度またはそれより低い温度の組成物として提供することができる。本方法では、投与に先だって、例えばMMPの投与個所に投与される冷温パック（cold pack）を使用することなどによって、ECMを、身体の生理学的温度より低い温度まで冷却することができる。さらに、MMPの条件付き活性化を、予め定められた時間にわたって制御することができる。例えば、ECMを、予め定められた時間にわたって、身体の生理学的温度より低い温度に維持することができる。
本発明は、上記と類似する方法であって、改変MMPが身体の生理的温度よりも高い許容温度で活性である方法も提供する。したがってMMPは、許容温度またはそれより高い温度で投与される場合には、投与の直前に許容温度またはそれより高い温度の組成物と混合するか、許容温度またはそれより高い温度の組成物として提供することができる。条件付き活性化は、ECMを温めるための熱による投与個所のばく露によって達成することができる。これは予め定められた時間にわたって行うことができる。
本発明が提供する方法、使用およびプロセスにおいて、MMPは、投与前にプロセシング因子（processing agent）などによってプロセシングされるチモーゲンであることができる。プロセシング因子には、プラスミン、血漿カリクレイン、トリプシン1、トリプシン2、好中球エラスターゼ、カテプシンG、トリプターゼ、キマーゼ、プロテイナーゼ3、プロテイナーゼ3、フューリン、尿プラスミノーゲン活性化因子（uPA）、活性MMP、酢酸4-アミノフェニル水銀（AMPA）、HgCl2、N-エチルマレイミド、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、カオトロピック剤、酸化型グルタチオン、反応性酸素、Au（I）塩、酸性pHおよび熱などがあるが、これらに限るわけではない。改変MMPには、本発明が提供する任意のもの、例えば限定するわけではないが、改変MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-26およびMT1-MMPが含まれる。プロセシング因子は、投与前に改変MMPポリペプチドから精製除去され、MMPポリペプチドの任意の非活性切断産物も同様に精製除去することができる。改変MMPポリペプチドは、活性化条件下で（すなわちそれが許容温度にばく露される期間中に）疾患または状態を処置する量で投与される。MMPに先だって、またはMMPに続いて、またはMMPとは断続的に（intermittently）、活性化因子を投与または提供することができる。代表的な活性化因子には、温熱パック（hot pack）または冷温パック、熱いまたは冷たい液体、バッファーまたは溶液、例えば冷却されたバッファーに入れたMMPの提供などがあり、この場合は冷却されたバッファーが活性化因子である。バッファーは、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃もしくはそれ以上、またはこれらの温度のいずれかの前後まで、冷却することができる。
投与は、例えば限定するわけではないが皮下、筋肉内、病巣内、皮内、局所外用、経皮、静脈内、経口および直腸投与を含む任意の適切な経路によって、例えば皮下投与を含む表皮下投与などによって、達成することができる。
改変MMPポリペプチドは、例えば小分子薬物化合物（すなわち高分子または生体分子ではない化合物）を含む医薬剤、分散剤、麻酔薬および血管収縮薬ならびにそれらの組合せなどといった他の活性剤と共に、同時に、断続的に、逐次的に、または同じ組成物に入れて、投与することができる。代表的な分散剤は、例えばヒアルロニダーゼなどのヒアルロナン分解酵素である。代表的なヒアルロニダーゼは、PH20、例えばその可溶性切断型であり、これには、配列番号3475に示すアミノ酸の配列を含有するまたは有するヒアルロニダーゼ、またはその対立遺伝子変異体もしくは種変異体または他の変異体、例えば配列番号3475に示すアミノ酸の配列に対して少なくとも60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、95％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性、例えば91％またはそれ以上の配列同一性を有するものが含まれる。ヒアルロニダーゼはグリコシル化されたものであることができる。麻酔薬には、例えばリドカインなど、任意の適切な麻酔薬が含まれる。血管収縮薬は、例えばレボノルデフリン、エピネフリンまたはノルエピネフリンなどのαアドレナリン作動性受容体アゴニストをはじめとする任意の適切な血管収縮薬であることができる。本方法では、MMPの投与に先だって、他の薬剤を投与することができる。
処置による影響を受けるECM構成要素には、例えばコラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンまたはプロテオグリカンが含まれうる。影響を受ける構成要素は選択したMMPに依存する。ECM構成要素がコラーゲンである場合、そのコラーゲンは、I型、II型、III型またはIV型コラーゲンの中から選択することができる。どの実施形態においても、例えば標的がコラーゲンである場合はコラゲナーゼを選択するなど、MMPは特定の標的を分解するものであるように選択される。複数のECM構成要素を分解するために、MMPの混合物を使用することができる。処置される疾患および状態には、コラーゲン介在疾患または状態、例えば限定するわけではないが、セルライト、デュピュイトラン病、ペイロニー病、レダーホース線維症、関節のこわばり（stiff joint）、既存の瘢痕、強皮症、リンパ浮腫およびコラーゲン性大腸炎、椎間板ヘルニア（herniated disc）、五十肩（frozen shoulder）などの関節のこわばり、術後癒着に起因する瘢痕、またはケロイド、肥厚性瘢痕および陥凹性瘢痕などの瘢痕がある。
本発明が提供する任意の改変MMPポリペプチドとその活性化因子との組合せも提供する。上記の組合せと、投与のための器具（device）、所望により投与に関する指示書、ならびに他の容器および構成要素、例えば、遊離スルフヒドリル基を有する酵素などの活性を増加させる還元剤などの1つまたはそれ以上とを含有するキットも提供する。
チモーゲンMMPのアラインメントであり、プロペプチド、触媒ドメイン、リンカー領域、ヘモペキシンドメイン1〜4、フィブロネクチンII型リピート、塩基性領域、システインスイッチ、カルシウム（Ca）結合部位IおよびII、ならびに亜鉛結合部位が示されている。アラインメントには、MMP-1（配列番号2）、MMP-8（配列番号711のアミノ酸21〜467）、MMP-13（配列番号714のアミノ酸20-471）、MMP-18（配列番号717のアミノ酸18〜467）、MMP-2（配列番号720のアミノ酸30〜660）、MMP-9（配列番号723のアミノ酸20〜707）、MMP-3（配列番号726のアミノ酸18〜477）、MMP-10（配列番号729のアミノ酸18〜476）、MMP-11（配列番号732のアミノ酸32〜488）、MMP-7（配列番号735のアミノ酸18〜267）、MMP-26（配列番号738のアミノ酸18〜261）、MMP-12（配列番号741のアミノ酸17〜470）、およびMMP-19（配列番号765のアミノ酸19〜508）を含むチモーゲンMMPが含まれている。「*」は、その列の残基またはヌクレオチドがアラインメント中の全ての配列において同一であることを意味し、「:」は、保存的置換（conserved substitution）が観察されたことを意味し、「.」は、半保存的置換（semi-conserved substitution）が観察されることを意味する。 代表的MMPの触媒ドメインのアラインメントであり、代表的な保存アミノ酸残基（conserved amino acid residue）と保存的アミノ酸残基（conservative amino acid residue）を示している。保存アミノ酸残基および保存的アミノ酸残基が、他にも、2つまたは3つ以上のMMP間に存在することは言うまでもない。したがって、この図および残基の同定は、2つまたは3つ以上のMMP間における対応する残基を限定しようとするものではない。代表的MMPには以下に挙げるものが含まれる：MMP-1（配列番号2のアミノ酸81〜242）、MMP-8（配列番号711のアミノ酸101〜242）、MMP-13（配列番号714のアミノ酸104〜248）、MMP-18（配列番号717のアミノ酸100〜246）、MMP-2（配列番号720のアミノ酸110〜417）、MMP-9（配列番号723のアミノ酸94〜425）、MMP-3（配列番号726のアミノ酸100〜247）、MMP-10（配列番号729のアミノ酸99〜246）、MMP-11（配列番号732のアミノ酸98〜228）、MMP-7（配列番号735のアミノ酸95〜242）、MMP-26（配列番号738のアミノ酸90〜236）、MMP-12（配列番号741のアミノ酸106〜247）、およびMMP-19（配列番号765のアミノ酸98〜239）。2つまたは3つ以上のMMP間における代表的な保存位置（conserved position）および保存的位置（conservative position）を強調表示している。 図2に図示したものと同様のアラインメントである。このアラインメントでは、2つまたは3つ以上の他のMMP間における、MMP-1活性突然変異体に対応する代表的な保存位置および保存的位置を、強調表示している。
［詳細な説明］
概要
A．定義
B．概観−温度感受性マトリックスメタロプロテアーゼ
C．マトリックスメタロプロテアーゼおよび細胞外マトリックス
1．細胞外マトリックス
a．ECMの構成要素
i．コラーゲン
ii．エラスチン
iii．フィブロネクチン
iv．グリコサミノグリカン（GAG）
1）プロテオグリカン
2）ヒアルロン酸
b．皮膚の組織構造
i．表皮
ii．真皮
iii．皮下組織
c．ECMの疾患
2．マトリックスプロテアーゼ
a．機能
b．構造および活性化
3．マトリックスプロテアーゼ1（MMP-1）
D．改変マトリックスメタロプロテアーゼ1ポリペプチド
1．温度感受性マトリックスプロテアーゼ1（tsMMP-1突然変異体）
代表的な温度感受性改変
2．マトリックスメタロプロテアーゼ活性突然変異体
3．組合せ
4．追加の改変
5．他のMMP
E．tsMMPをコードする核酸およびそのポリペプチドを製造する方法
1．ベクターと細胞
2．発現
a．原核細胞
b．酵母細胞
c．昆虫細胞
d．哺乳動物細胞
e．植物
3．精製技法
F．tsMMPの製造、製剤および投与
1．注射剤、溶液剤および乳剤
凍結乾燥粉末
2．局所外用投与
3．他の投与経路のための組成物
4．活性化因子
5．併用療法
ヒアルロニダーゼ
G．tsMMPの包装および製品
1．単一チャンバー装置（single chamber apparatus）
2．二重チャンバー装置（dual chamber apparatus）
3．キット
H．tsMMPの活性を評価する方法
1．酵素活性を評価する方法
2．ECM分解を評価する方法
a．インビトロアッセイ
b．インビボアッセイ
c．非ヒト動物モデル
I．ECMの疾患または欠陥を処置する代表的方法
1．コラーゲン介在疾患または状態
a．セルライト
b．デュピュイトラン病
c．ペイロニー病
d．レダーホース線維症
e．関節のこわばり
f．既存の瘢痕
i．術後癒着
ii．ケロイド
iii．肥厚性瘢痕
iv．陥凹性瘢痕
g．強皮症
h．リンパ浮腫
i．コラーゲン性大腸炎
2．脊椎病変
J．実施例
A．定義
別段の定義をしない限り、本明細書において使用する技術用語および科学用語は全て、本発明が属する技術分野の当業者に共通して理解されているものと同じ意味を有する。本明細書の開示全体にわたって言及する特許、特許出願、出願公開および刊行物、Genbank配列、データベース、ウェブサイトおよび他の公表された資料はいずれも、別段の注記がない限り、引用によりその全てが本明細書に組み込まれる。用語に関する定義が本明細書に複数存在する場合は、このセクションにおける定義が優先される。URLまたは他の同様の識別子もしくはアドレスに言及する場合、そのような識別子は変更されることがあり、インターネット上の特定情報は移り変わることもあるが、インターネットを検索することによって等価な情報を見つけ出すことができると理解される。それらへの言及は、そのような情報が入手可能であること、および公に流布されていることを証明している。
本明細書にいう細胞外マトリックス（ECM）は、特殊化した組織および器官の細胞を取り囲んでそれらに構造的支持を提供する複雑な網目構造を指す。ECMは、コラーゲンおよびエラスチンなどの構造タンパク質；フィブロネクチンなどの専門タンパク質；およびプロテオグリカンから構成されている。厳密な生化学的組成は組織ごとに異なる。例えば皮膚の場合、ECMを含有しているのは真皮層である。本明細書では、ECMを指すために、互換的に、「間質」（interstitium）ともいう。
本明細書にいうECMの構成要素とは、結合組織の細胞によって産生されて間質中に分泌される任意の物質を指す。本明細書に関して言えば、ECM構成要素への言及は、タンパク質および糖タンパク質を指し、他の細胞性構成要素またはECMの他の構成要素を指さない。代表的なECM構成要素には、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチンおよびプロテオグリカンなどがあるが、これらに限るわけではない。
本明細書にいうマトリックス分解酵素は、ECMの1つまたはそれ以上の構成要素を分解する任意の酵素を指す。マトリックス分解酵素には、ペプチド共有結合の加水分解を触媒する酵素であるプロテアーゼが含まれる。マトリックス分解酵素には、当業者に知られるものが全て含まれる。代表的なマトリックス分解酵素には、マトリックスメタロプロテアーゼ、その対立遺伝子変異体もしくは種変異体または他の変異体などがある。
本明細書にいうマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）は、活性に要求される活性部位Zn2+を含有する亜鉛依存的エンドペプチダーゼであるマトリックス分解酵素の一タイプを指す。MMPには、例えば限定するわけではないが、コラーゲン、フィブロネクチン、エラスチンおよびプロテオグリカンなどといったECMの構成要素を分解する酵素が含まれる。MMPは一般に、プロペプチド、触媒ドメイン、プロリンリンカーおよびヘモペキシン（ヘモペキシン様C末端とも呼ばれる）ドメインを含有する。一部のMMPは追加のドメインを含有する。代表的なMMPを表5に示す。MMPへの言及には、例えば前駆体型（シグナル配列を含有するもの）、プロ酵素型（プロペプチドを含有するもの）、プロセシングされた活性型、およびその1つまたはそれ以上のドメインを欠く形態など、全ての形態が包含される。例えばMMPへの言及は、触媒活性ドメインだけを含有するMMPを指す。代表的なMMPのドメインを図1において同定する。MMPには、その対立遺伝子変異体もしくは種変異体または他の変異体も含まれる。
本明細書にいう改変マトリックス分解酵素または改変MMP（互換的に変異体（variant）または突然変異体（mutant）ともいう）は、野生型酵素と比較して一次配列中に1つまたはそれ以上の改変を有する酵素を指す。1つまたはそれ以上の突然変異は、1つまたはそれ以上のアミノ酸の置き換え（置換）、挿入、欠失、およびそれらの任意の組合せであることができる。改変酵素には、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上の改変位置を伴うものが含まれる。改変はその酵素に変化した性質を与えうる。改変の代表例として、酵素の温度感受性活性を付与する、本明細書に記載するものが挙げられる。他の改変には、変化した基質特異性、安定性および/または阻害因子（例えばIMP）に対する感受性を付与するものなどがある。改変酵素は、典型的には、野生型酵素の対応するアミノ酸配列に対して、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有する。典型的には、改変酵素は、野生型酵素の活性または十分な活性（例えばECM構成要素の分解）を保持している。温度感受性を付与する改変は、必要温度（requisite temperature）では、生理的温度における野生型酵素と比較して、活性または十分な活性を保持すると理解される。
本明細書にいう、活性突然変異体または突然変異または変異体または改変とは、その特定の改変を含有しない酵素と比較して増加した活性を呈する改変酵素、例えば改変MMP-1などの改変マトリックスメタロプロテアーゼを指す。例えば酵素は、1.2倍〜100倍またはそれ以上増加した酵素活性、例えば1.2倍、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍またはそれ以上増加した酵素活性を呈する。酵素活性を決定する際に、突然変異体と無改変酵素（例えば野生型）の酵素活性が同じアッセイ条件下で測定されることは言うまでもない。本明細書における活性突然変異体への言及は温度には依存しない。例えば、本発明が提供する活性突然変異体は、その改変を含有しない酵素と比較して、許容温度でも非許容温度でも、増加した活性を呈することができる。
本明細書にいう、温度感受性を付与する温度感受性（ts）突然変異体または突然変異または変異体または改変とは、許容温度と呼ばれる何らかの温度において、非許容温度と呼ばれる他の温度と比較して、より高い酵素活性を呈するように改変されたポリペプチドを指す。一般に、温度感受性突然変異体は、高い温度よりも低い温度において、より高い酵素活性を呈する。
本明細書にいう許容温度は、ポリペプチドが、非感受性温度と呼ばれる第2の温度における酵素活性よりも高い酵素活性を呈する温度である。したがって本発明が提供する改変酵素は、異なる温度において異なる活性を呈し、ある温度では別の温度よりも活性が高くなる。酵素がより高い活性を呈する温度が許容温度である。例えば許容温度は、身体の生理学的温度よりも低い温度、例えば18℃〜30℃、特に20℃〜25℃である。したがって酵素は、身体の生理学的温度より低い温度において、例えば間質に見られるような身体の生理学的温度における活性よりも増加した活性を呈する。例えば許容温度は、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃もしくは30℃またはその前後である。
本明細書にいう非許容温度は、ポリペプチドが許容温度における活性よりも低い酵素活性を呈し、改変されていない酵素と比較して低下した活性を呈するような温度である。本発明が提供する温度感受性突然変異体は、非許容温度において、許容温度における活性の1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％もしくは90％またはその前後、100％未満までの酵素活性を呈する。また、本発明が提供する温度感受性突然変異体は、非許容温度において、その非許容温度における改変されていない酵素（例えば野生型酵素）と比較して、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％または90％、100％未満までの活性を呈する。例えば非許容温度は、身体の生理学的温度に近いか、身体の生理学的温度であるか、または身体の生理学的温度より高い温度、例えば32℃〜39℃、例えば32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、または39℃である。
本明細書にいう、非許容温度と比較した許容温度における酵素活性の比は、許容温度と非許容温度における酵素活性の関係を指す。これは、許容温度における活性を非許容温度における活性で割った商によって表される。酵素活性および酵素活性の比を決定する際に、許容温度および非許容温度における酵素活性が、温度の相違以外は同じアッセイ条件下で測定されることは言うまでもない。
本明細書において、生理学的温度とは、身体内で維持されている温度条件を指し、それは約37℃、例えば34℃、35℃、36℃、37℃、38℃もしくは39℃またはその前後である。ヒト身体温度の正常範囲が、代謝速度、特定器官などの因子、および他の因子に依存して変動することは言うまでもない。本明細書に関して言えば、生理学的温度とは、通常の室温（例えば22.7〜24.4℃）に保たれた室内にいる、空腹状態でない楽な服装をした被験者に見られる温度である。
本明細書において、可逆性とは、非許容温度へのばく露と許容温度への再暴露後に、許容温度におけるその活性が回復するか部分的に回復しうるような改変酵素を指す。したがって、いったん非許容温度にばく露された可逆性酵素の活性は、許容条件にのみばく露された酵素の活性と比較して、同じであるか、実質的に保持されており、非許容温度にのみばく露された酵素の活性よりも高い。例えば、非許容条件から許容条件に戻されると、可逆性酵素は、非許容温度にのみばく露された酵素の活性の120％、125％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、200％またはその前後もしくはそれ以上の活性を呈し、許容温度のみにばく露された酵素の活性を保持している。
本明細書にいう不可逆性または非可逆性とは、非許容温度へのばく露と許容温度への再暴露後に、許容温度におけるその酵素活性が回復しない改変酵素を指す。したがって、いったん非許容温度にばく露された不可逆性酵素の活性は、許容温度にのみばく露された酵素の活性よりも低く、また、非許容条件のみにばく露された酵素の活性よりも低いか、非許容条件のみにばく露された酵素の活性と同じであるか、または実質的に同じである。例えば許容条件に戻されると、不可逆性酵素は、非許容温度における活性の20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、105％、110％、115％、もしくは120％またはその前後であって、かつ許容温度のみにばく露された酵素の活性の100％未満である活性を呈する。
本明細書にいうドメインとは、構造的および/または機能的に識別または特定することができるポリペプチドの一部分（3つまたはそれ以上のアミノ酸、一般的には5個もしくは7個またはそれ以上のアミノ酸の配列）を指す。例えばドメインには、1つまたはそれ以上の構造モチーフ（例えばループ領域によって連結されたαヘリックスおよび/またはβストランドの組合せ）から構成された、タンパク質内で独立して折りたたまれる構造を形成しうるものおよび/またはキナーゼ活性などの機能的活性に基づいて認識されるものが含まれる。タンパク質は1つまたはそれ以上の異なるドメインを有しうる。例えばドメインは、その中の配列の、関連ファミリーメンバーに対する相同性によって、例えば細胞外ドメインを特定する相同性およびモチーフによって、同定、特定または識別することができる。もう一つの例では、ドメインは、その機能によって、例えばキナーゼ活性などの酵素活性によって、または生体分子と相互作用する能力、例えばDNA結合、リガンド結合、および二量体化などによって識別することができる。ドメインは独立して機能または活性を呈することができるので、ドメインは独立して、または別の分子に融合されて、例えばタンパク質分解活性またはリガンド結合などの活性を果たすことができる。ドメインは、ポリペプチドに由来するアミノ酸の一次配列であるか、アミノ酸の非一次配列であることができる。多くのポリペプチドは複数のドメインを含有する。例えばMMPのドメイン構造を図1に示す。当業者はドメインに精通しており、他のそのようなドメインとの構造的および/または機能的相同性に基づいて、それらを同定することができる。
本明細書にいう触媒ドメインとは、触媒機能または酵素機能を呈するポリペプチドの任意の部分を指す。そのようなドメインまたは領域は、典型的には、基質と相互作用してその触媒作用をもたらす。MMPの場合、触媒ドメインは亜鉛結合モチーフを含有し、このモチーフは、3つのヒスチジン残基によって結合されたZn2+イオンを含有して、保存された配列HExxHxxGxxHによって表される。
本明細書にいうプロリンリッチリンカー（ヒンジ領域とも呼ばれる）は、決定可能な機能をもたない柔軟なヒンジまたはリンカー領域を指す。そのような領域は、典型的にはドメイン間または領域間に見いだされ、ポリペプチドの柔軟性に寄与する。
本明細書にいうヘモペキシン結合ドメインまたはヘモペキシン様C末端ドメインは、MMPのC末端領域を指す。これは4枚の羽根を持つβプロペラ構造であり、タンパク質-タンパク質相互作用に関与する。例えば、MMPのヘモペキシン結合ドメインはさまざまな基質と相互作用し、組織性メタロプロテアーゼ阻害因子（TIMP）などの阻害因子とも相互作用する。
本明細書において、本質的に特定ドメイン（例えば触媒ドメイン）からなるという表現、またはポリペプチドが本質的に特定ドメイン（例えば触媒ドメイン）からなるという叙述は、そのポリペプチドの唯一のMMP部分が、そのドメインまたはその触媒活性部分であることを意味する。ポリペプチドは、所望により、典型的には少なくとも3、4、5、6個またはそれ以上の、非MMP由来の追加アミノ酸配列も、例えば別のポリペプチドへの挿入またはそれへの連結などによって含むことができる。
本明細書にいう「チモーゲン」は、不活性前駆体であって、活性になるにはそのポリペプチドの化学修飾（chemical modification）またはタンパク質分解などといった何らかの変化を必要とする酵素を指す。一部のチモーゲンは、活性化のために、例えば限定するわけではないが、pH、イオン強度、金属イオン、還元剤、または温度などの補因子の追加も必要とする。チモーゲンには、プロ酵素型の酵素が含まれる。したがって、チモーゲンは一般に不活性であり、追加の補因子の存在下または非存在下で、化学修飾によって、またはチモーゲンからのプロ領域の触媒的もしくは自己触媒的切断によって、成熟ポリペプチドに変換することができる。
本明細書にいうプロセグメントまたはプロ領域またはプロペプチドは、それが切断されると成熟タンパク質が生成する領域またはセグメントを指す。プロペプチドは、成熟ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸の配列であって、わずか数アミノ酸である場合もあるし、マルチドメイン構造物である場合もある。これは、触媒機構を遮蔽することによって酵素活性を抑制するように機能するセグメントを含みうる。プロペプチドは酵素の安定性を維持するように作用することもできる。
本明細書にいう「プロセシング因子」は、チモーゲンまたは不活性型の酵素からのプロペプチドまたはプロ領域の除去を助長することによって、MMPを活性化する作用因子を指す。プロセシング因子には、化学剤、プロテアーゼ、および他の作用因子、例えば酸性pHまたは熱などが含まれる。代表的なプロセシング因子には、トリプシン、フューリン、または酢酸4-アミノフェニル水銀（AMPA）などがあるが、これらに限るわけではない。他の代表的なプロセシング因子を表4に掲載する。
本明細書にいう「触媒活性フラグメント」は、酵素の触媒活性ドメインを含有するポリペプチドフラグメントを指す。触媒活性フラグメントへの言及は、必ずしもそのフラグメントが活性を呈することを意味するわけではなく、ただ単に、それが触媒活性ドメインまたは活性に必要なその一部を含有することを意味するに過ぎないと理解される。したがって、触媒活性フラグメントは、適当な条件下（例えば許容温度）において、触媒活性を呈することができる部分である。例えば、tsMMP-1の触媒活性フラグメント（温度感受性表現型を付与する突然変異を少なくとも1つは含有するもの）は、必要許容温度（例えば18℃〜25℃）で提供された場合には活性を呈するが、非許容温度（例えば身体の生理学的温度）では実質的に低下した活性を呈するか、または活性を呈さない。
本明細書にいう活性酵素は、酵素活性を呈する酵素を指す。本明細書に関して言えば、活性酵素とは、ECMの任意の1つまたはそれ以上の構成要素、例えばコラーゲンなどを切断するものである。活性酵素には、チモーゲン型から成熟型へとプロセシングされたものが含まれる。
本明細書において、「成熟」型または「プロセシングされた成熟」型の酵素への言及は、酵素のプロセグメントまたはプロ領域を含まない酵素を指す。これは、プロ酵素のプロセグメントまたはプロ領域がプロセシングされて成熟型を生成するような活性化切断により、チモーゲンまたはプロ酵素から生成しうる。したがって、プロセシングされた成熟酵素は、プロセグメントまたはプロ領域に対応するアミノ酸の配列を欠く。プロセシングされた成熟型の酵素への言及は合成配列を包含し、したがってプロセグメントまたはプロ領域を除去するために酵素が実際にプロセシングされることを必ずしも必要としないと理解される。プロセグメントまたはプロ領域配列を欠くMMP酵素はいずれも成熟酵素であると理解される。例えば配列番号709はMMP-1の成熟配列である。プロセシングされた成熟型の酵素は、適当な条件下で活性を呈することができ、したがって活性酵素である。例えば、生理的条件下で、成熟型のMMP-1は活性酵素である。これに対し、本発明が提供するtsMMP-1変異体は、18℃〜25℃の許容温度において酵素活性を呈し、身体の生理学的温度では実質的に低下した活性を呈するか、または活性を呈さない。
本明細書にいう活性化条件は、酵素の活性に要求される任意の物理的条件または条件の組合せを指す。本明細書に関して言えば、活性化可能な（activatable）マトリックス分解酵素（AMDE）、例えばマトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）に関する活性化条件には、酵素の活性化に要求される量（すなわち分量、度合、レベルまたは他の物理的尺度）では投与部位に存在しないもの、例えば細胞マトリックスに存在しないものが含まれる。代表的な活性化条件として温度が挙げられる。例えば、間質の場合、生理学的温度は37℃またはその前後である。活性化条件は、37℃またはその前後ではなく、それより冷たいか温かい温度である。活性化条件が酵素の投与部位には存在せず、外部から加えられなければならないという事実により、活性化条件は、温度が順応するにつれて経時的に消散し、酵素を活性化する活性化条件はもはや存在しなくなる。したがって酵素は、投与後の限られた時間または予め定められた時間だけ活性になる。
本明細書にいう活性化因子は、活性化可能なマトリックス分解酵素に活性化条件を提供する任意の組成物または他の物質もしくはアイテム（item）を指す。本明細書に関して言えば、活性化因子とは、酵素の許容温度にある温度条件を提供することができる任意のアイテムを指す。活性化因子の例には、温もしくは冷バッファーまたは温もしくは冷温パックなどがあるが、これらに限るわけではない。
本明細書にいう「活性化可能なマトリックス分解酵素（AMDE）」は、活性であるためには活性化条件を必要とするマトリックス分解酵素を指す。本明細書に関して言えば、例えばAMDEは、AMDEの投与前に、またはAMDEの投与と一緒に、またはAMDEの投与後に、活性化因子にばく露されることによってその酵素のための活性化条件が提供されない限り、ECMにおいて実質的に不活性である。したがって、あるインビボ個所（locus）または部位（site）においてその酵素が活性である期間が、活性化条件の消散および/または中和の結果として予め決定および/または制御されうるように、活性化可能な酵素の活性化は外因的条件によって制御される（すなわち、時間的に制御可能である、または時間制御される）。このように活性化条件へのばく露により、酵素は、ECMにおいて、限られた時間および/または限られた程度に、活性である（すなわち条件付きで活性である）。活性化の程度および時間は、活性化因子または活性化条件の選択によって制御することができ、予め定められた時間であることができる。例えば、tsMMPなどの温度感受性酵素は、例えば冷バッファーまたは他の溶液によって提供されるような活性化温度条件へのばく露によって活性化することができるので、活性化可能である。活性化された酵素を活性化因子と共にECMの生理的温度環境に投与すると、活性化因子の初期温度、投与部位、投与の深さおよび他の因子に基づいて予め決定することができる期間で、温度は生理的温度に順応し、ついには生理的温度に戻って、その結果、酵素は不活性になるか、より低活性になるだろう。
本明細書にいう「治療有効量」（therapeutically effective amount）または「治療有効用量」（therapeutically effective dose）は、治療効果を生じるのに少なくとも十分である化合物を含有する薬剤、化合物、物質、または組成物を指す。
本明細書にいう、限られた時間または限られた持続時間にわたって活性である酵素とは、時間の経過と共に消散するおよび/または中和される活性を有する活性酵素を指す。したがって、活性化条件が存在しなければ、酵素は不活性になる。
本明細書にいう、予め定められた時間とは、前もってわかっていて、制御することができる、限られた時間を意味する。酵素の活性に必要な活性化条件の消散および/または中和は、活性酵素が不活性になるまでに要する時間がわかるように、タイトレート（titrate）するか、他の方法で経験的に決定することができる。本明細書に関して言えば、例えば酵素は、約1分、2分、3分、4分、5分、6分、7分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、1時間、2時間、3時間、もしくは4時間またはその前後である予め定められた時間にわたって、活性であることができる。例えば冷温パックまたは温熱パックを活性化因子として使用する場合、予め定められた時間は、対象または処置医によって制御されうる。さらに、可逆性酵素は、許容条件へのばく露によって再活性化することができ、追加の予め定められた時間にわたって活性になりうると理解される。
本明細書にいう表皮下投与は、皮膚の最外層の下への酵素の送達をもたらす任意の投与を指す。表皮下投与は皮膚の外層上への局所外用適用を包含しない。表皮下投与の例には、皮下、筋肉内、病巣内および皮内投与経路などがあるが、これらに限るわけではない。
本明細書にいう基質は、酵素によって切断される分子を指す。最小の場合、標的基質には、プロテアーゼによって認識される切断配列を含有するペプチドが含まれるので、標的基質は2、3、4、5、6残基またはそれ以上の長さを持ちうる。基質には、酵素によって切断される完全長タンパク質、その対立遺伝子変異体、アイソフォームまたは任意の一部分も含まれる。また、基質には、酵素による基質の切断には影響を及ぼさない追加部分を含有するペプチドまたはタンパク質も含まれる。例えば基質として、蛍光原部分に化学的に連結された4アミノ酸ペプチドまたは完全長タンパク質を挙げることができる。
本明細書にいう切断は、1つまたはそれ以上の分解産物をもたらす、酵素によるペプチド結合または他の結合の破壊を指す。
本明細書にいう活性は、完全長（完全）タンパク質に付随するポリペプチドまたはその一部分の1つまたは複数の機能的活性を指す。機能的活性には、生物学的活性、触媒活性または酵素活性、抗原性（抗ポリペプチド抗体に結合する能力または抗ポリペプチド抗体への結合に関してポリペプチドと競合する能力）、免疫原性、多量体を形成する能力、およびポリペプチドの受容体またはリガンドに特異的に結合する能力などがあるが、これらに限るわけではない。
本明細書にいう酵素活性または触媒活性または切断活性は、選択された基質のタンパク質分解を検出するインビトロタンパク質分解アッセイにおいて評価されるプロテアーゼの活性を指す。
本明細書にいう不活性酵素は、活性（すなわち触媒活性または切断活性）を実質的に呈さない酵素、例えば活性がその酵素の最大活性の10％未満である酵素を指す。酵素は、そのコンフォメーション、その活性に必要な活性化条件の不在、または阻害因子の存在、またはその酵素を実質的に不活性にする他の任意の条件もしくは因子もしくは形態の存在ゆえに、不活性であることができる。
本明細書にいう「活性を保持している」は、別の条件における活性または別のポリペプチドと比較した、特定の条件において改変MMPポリペプチドが呈する活性を指す。例えば、これは、同じ形態および同じ条件下にある無改変MMPポリペプチドと比較した、改変MMPポリペプチドが呈する活性である。これは、異なる条件下、例えば異なる温度条件下にある改変MMPポリペプチドと比較した、改変MMPポリペプチドが呈する活性であることもできる。一般に、活性を保持している改変MMPポリペプチドは、同じ条件下にある無改変ポリペプチドと比較して、または異なる条件下にある無改変ポリペプチドと比較して、増加または減少した活性を呈する。例えば改変MMPポリペプチドは、酵素活性の40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、300％、400％、500％またはそれ以上を保持することができる。
本明細書にいうヒトタンパク質は、ヒトのゲノム中に存在するDNAなどの核酸分子によってコードされるもの（そのあらゆる対立遺伝子変異体および保存的変異（conservative veriation）を含む）である。あるタンパク質の変異体または改変は、その改変がヒトタンパク質の野生型または主要な配列に基づくのであれば、ヒトタンパク質である。
本明細書にいうヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を分解する酵素を指す。ヒアルロニダーゼには、細菌ヒアルロニダーゼ（EC 4.2.99.1）、ヒル、他の寄生虫および甲殻類由来のヒアルロニダーゼ（EC 3.2.1.36）、ならびに哺乳類型ヒアルロニダーゼ（EC 3.2.1.35）が含まれる。また、ヒアルロニダーゼには、非ヒト由来のもの、例えば限定するわけではないが、マウス、イヌ、ネコ、ウサギ、トリ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、魚、カエル、細菌由来のもの、ならびにヒル、他の寄生虫、および甲殻類に由来するものが、どれでも包含される。代表的な非ヒトヒアルロニダーゼとしては、配列番号3482〜3505のいずれかに示されるものをどれでも挙げることができる。代表的なヒトヒアルロニダーゼには、HYAL1（配列番号3469）、HYAL2（配列番号3470）、HYAL3（配列番号3471）、HYAL4（配列番号3472）、およびPH20（配列番号3473）などがある。ヒアルロニダーゼには、可溶性ヒトPH20および可溶性rHuPH20も含まれる。
ヒアルロニダーゼへの言及には、前駆体ヒアルロニダーゼポリペプチドおよび成熟ヒアルロニダーゼポリペプチド（例えばシグナル配列が除去されているもの）、活性を有するその切断型が包含され、対立遺伝子変異体および種変異体、スプライス変異体によってコードされる変異体、および他の変異体、例えば配列番号3473に示される前駆体ポリペプチドまたはその成熟型に対して少なくとも40％、45％、50％、55％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドが包含される。ヒアルロニダーゼには、化学修飾または翻訳後修飾を含有するもの、および化学修飾または翻訳後修飾を含有しないものも含まれる。そのような修飾には、例えばPEG化、アルブミン付加、グリコシル化、ファルネシル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、リン酸化、および当技術分野において知られる他のポリペプチド修飾が含まれるが、これらに限るわけではない。
本明細書にいう可溶性ヒトPH20またはsHuPH20には、発現した時にポリペプチドが可溶性になるような形でC末端のグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）付着部位の全部または一部を欠いている成熟ポリペプチドが包含される。代表的なsHuPH20ポリペプチドには、配列番号3476〜3481のいずれか1つに示すアミノ酸配列を有する成熟ポリペプチドがある。そのような代表的sHuPH20ポリペプチドの前駆体ポリペプチドは、アミノ酸シグナル配列を含む。前駆体の代表例は配列番号3473に示されるものであり、これは35アミノ酸のシグナル配列をアミノ酸位置1〜35に含有している。可溶性HuPH20ポリペプチドは、本発明が提供する生産および精製方法の途中またはその後に、分解されうる。
本明細書にいう可溶性rHuPH20は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞中で組換え発現されるヒトPH20の可溶型を指す。可溶性rHuPH20は、シグナル配列を含み配列番号3475に示される核酸によってコードされる。また、その対立遺伝子変異体および他の可溶性変異体であるDNA分子も含まれる。可溶性rHuPH20をコードする核酸は成熟ポリペプチドを分泌するCHO細胞中で発現される。培養培地中に生産された状態ではC末端に不均一性が存在するので、生成物は配列番号3476〜3481の分子種の混合物を含む。対応する対立遺伝子変異体および他の変異体も含まれる。他の変異体は、それらがヒアルロニダーゼ活性を保持していて、かつ可溶性である限りにおいて、配列番号3476〜3481のいずれかと60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはそれ以上の配列同一性を有することができる。
本明細書にいうヒアルロニダーゼ活性は、ヒアルロニダーゼポリペプチドが呈する任意の活性を指す。そのような活性はインビトロおよび/またはインビボで試験することができ、これには例えば、ヒアルロン酸の切断を達成する活性などの酵素活性、分散剤（dispersing agent）または展着剤（spreading agent）として作用する能力、および抗原性などが含まれるが、これらに限るわけではない。
本明細書にいう天然α-アミノ酸の残基とは、ヒトにおけるアミノアシルtRNA分子とそのコグネートmRNAコドンとの特異的認識によってタンパク質中に組み込まれる、自然界に見いだされる20種類のα-アミノ酸の残基である。
本明細書にいう核酸には、DNA、RNA、およびその類似体、例えばペプチド核酸（PNA）、ならびにその混合物が含まれる。核酸は一本鎖または二本鎖であることができる。プローブまたはプライマー（これは、例えば、蛍光ラベルまたは放射性ラベルなどの検出可能なラベルによって標識されていてもよい）に関する場合は、一本鎖分子が考えられる。そのような分子は、典型的には、ライブラリーをプローブまたはプライミングするために、その標的が統計的にユニークであるか、低いコピー数（典型的には、5未満、一般的には3未満）を持つことになるような、長さを有する。一般にプローブまたはプライマーは、目的の遺伝子と相補的なまたは同一な配列の少なくとも14、16または30個の連続するヌクレオチドを含有する。プローブおよびプライマーは10、20、30、50、100核酸長（nucleic acids long）またはそれ以上の長さであることができる。
本明細書にいうペプチドは、長さが2〜40アミノ酸であるポリペプチドを指す。
本明細書において、本発明が提供するさまざまなアミノ酸の配列に見いだされるアミノ酸は、その公知の三文字記号または一文字記号（表1）に従って識別される。さまざまな核酸フラグメント中に見いだされるヌクレオチドは、当技術分野において日常的に使用される標準的な一文字表記で指定される。
本明細書にいう「アミノ酸」は、アミノ基とカルボン酸基とを含有する有機化合物である。ポリペプチドは2つまたはそれ以上のアミノ酸を含有する。本明細書に関して言えば、アミノ酸には、20種の天然アミノ酸、非天然アミノ酸およびアミノ酸類似体（すなわちα-炭素が側鎖を有するアミノ酸）が含まれる。
本明細書にいう「アミノ酸残基」は、ポリペプチドがそのペプチド結合において化学的に消化（加水分解）された時に形成されるアミノ酸を指す。本明細書に記載するアミノ酸残基は、「L」異性体型であると考えられる。「D」異性体型の残基は、そのように表記され、ポリペプチドが所望の機能的性質を保持する限り、任意のLアミノ酸残基の代わりにそれを使用することができる。NH2は、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離のアミノ基を指す。COOHは、ポリペプチドのカルボキシル末端に存在する遊離のカルボキシル基を指す。J.Biol.Chem., 243:3552-3559 (1969)に記載され、37C.F.R.§1.821〜1.822で採用されている標準的ポリペプチド命名法に従って、アミノ酸残基の略号を表1に示す。
［表1］対応表
Figure 2012519494
本明細書において式で表されるアミノ酸残基配列は、全て、左から右に、アミノ末端からカルボキシル末端に向かう通常の向きで表されていることに注意すべきである。また、「アミノ酸残基」という表現は、対応表（表1）に掲載したアミノ酸ならびに修飾アミノ酸および異常アミノ酸、例えば37C.F.R.§1.821〜1.822において言及されていて引用により本明細書に組み込まれるものを包含すると、広く定義される。さらにまた、アミノ酸残基配列の最初または最後にあるダッシュ記号は、1つまたはそれ以上のアミノ酸残基のさらなる配列へのペプチド結合、アミノ末端基（例えばNH2）またはカルボキシル末端基（例えばCOOH）へのペプチド結合を示すことに注意すべきである。
本明細書にいう「天然アミノ酸」とは、ポリペプチド中に見いだされる20種類のL-アミノ酸を指す。
本明細書にいう「非天然アミノ酸」は、天然アミノ酸と類似する構造を有するが、天然アミノ酸の構造および反応性を模倣するように構造的に改変されている有機化合物を指す。したがって、非天然アミノ酸は、例えば20種類の天然アミノ酸以外のアミノ酸またはアミノ酸の類似体を包含し、例えばアミノ酸のD-アイソステレオマー（isostereomer）を含むが、これらに限るわけではない。代表的な非天然アミノ酸は本明細書に記載され、当業者に知られている。
本明細書にいう、アミノ酸の適切な保存的置換は当業者には知られており、一般に、結果として生じる分子の生物学的活性を変化させずに行うことができる。一般に、ポリペプチドの非必須領域における単一のアミノ酸置換は、生物学的活性を実質的に変化させないと、当業者には認識されている（例えばWatsonら「Molecular Biology of the Gene」第4版、1987、The Benjamin/Cummings Pub. Co.）の224頁参照）。そのような置換は以下の表2に示すものに従って行うことができる。
［表2］
Figure 2012519494
他の置換も許容され、それらは経験的に決定することができるか、既知の保存的置換に合致しうる。
本明細書にいうDNAコンストラクトは、DNAのセグメントが自然界には見いだされない形で組み合わされ隣接して配置されている一本鎖または二本鎖の線状または環状DNA分子である。DNAコンストラクトは、人為的操作の結果として存在し、操作された分子のクローンおよび他のコピーを含む。
本明細書にいうDNAセグメントは、指定された属性を有する、より大きなDNA分子の一部分である。例えば、指定されたポリペプチドをコードするDNAセグメントは、プラスミドまたはプラスミドフラグメントなどといった、より長いDNA分子の一部であって、5'から3'に向かって読んだ場合に、指定されたポリペプチドのアミノ酸配列をコードするものである。
本明細書で使用するポリヌクレオチドという用語は、5'端から3'端に向かって読み取られるデオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基の一本鎖または二本鎖ポリマーを意味する。ポリヌクレオチドにはRNAおよびDNAが包含され、自然源から単離するか、インビトロで合成するか、天然分子と合成分子の組合せから製造することができる。ポリヌクレオチド分子の長さは、本明細書においては、ヌクレオチド数（「nt」と略記）または塩基対数（「bp」と略記）で与えられる。ヌクレオチドという用語は、文脈に応じて、一本鎖分子および二本鎖分子に使用される。この用語が二本鎖分子に適用される場合、それは全長を表すために使用され、塩基対という用語と等価であると理解されるだろう。二本鎖ポリヌクレオチドの2本の鎖の長さがわずかに異なりうること、およびそれらの末端がずれていてもよいこと、したがって二本鎖ポリヌクレオチド分子内の全てのヌクレオチドが対合しているとは限らないことは、当業者には理解されるだろう。そのような非対合末端は、一般的には、20ヌクレオチド長を超えないだろう。
本明細書において、2つのタンパク質または核酸間の「類似性」（similarity）とは、タンパク質のアミノ酸配列間または核酸のヌクレオチド配列間の類縁性（relatedness）を指す。類似性は、残基の配列およびそこに含まれる残基の同一性および/または相同性の度合いに基づくことができる。タンパク質間または核酸間の類似性の度合いを評価するための方法は、当業者には知られている。例えば、配列類似性を評価する方法の一つでは、2つのアミノ酸配列またはヌクレオチド配列を、それらの配列間の同一性が最大レベルになるようにアラインメントする。「同一性」とは、アミノ酸配列またはヌクレオチド配列が不変である程度を指す。アミノ酸配列のアラインメントでは（また、ある程度はヌクレオチド配列のアラインメントでも）、アミノ酸（またはヌクレオチド）の保存的相違および/または頻繁な置換も考慮することができる。保存的相違とは、関与する残基の物理化学的性質が保存される相違である。アラインメントはグローバル（配列の全長にわたり、全ての残基を含む、比較配列のアラインメント）またはローカル（配列のうち、最も類似する1または複数の領域だけを含む部分のアラインメント）であることができる。
「同一性」そのものは、当技術分野で認められている意味を有し、公表された技法を使って算出することができる（例えば「Computational Molecular Biology」Lesk,A.M.編、Oxford University Press、ニューヨーク、1988；「Biocomputing: Informatics and Genome Projects」Smith,D.W.編、Academic Press、ニューヨーク、1993；「Computer Analysis of Sequence Data, Part I」Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、Humana Press、ニュージャージー、1994；「Sequence Analysis in Molecular Biology」von Heinje,G.、Academic Press、1987；および「Sequence Analysis Primer」Gribskov,M.およびDevereux,J.編、M Stockton Press、ニューヨーク、1991）参照）。2つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の同一性を測定するための方法はいくつか存在し、「同一性」という用語は当業者にはよく知られている（Carillo,H.およびLipton,D., SIAM J Applied Math 48:1073 (1988)）。
本明細書にいう相同的（核酸および/またはアミノ酸配列に関して）は、約25％以上の配列相同性、典型的には、25％以上、40％以上、50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、85％以上、90％以上または95％以上の配列相同性を意味し、必要であれば正確なパーセンテージを指定することができる。本明細書に関して言えば、「相同性」および「同一性」という用語は、別段の表示がない限り、しばしば互換的に使用される。一般に、相同性パーセントまたは同一性パーセントを決定するには、最も高度な一致が得られるように配列をアラインメントする（例えば「Computational Molecular Biology」Lesk,A.M.編、Oxford University Press、ニューヨーク、1988；「Biocomputing: Informatics and Genome Projects」Smith,D.W.編、Academic Press、ニューヨーク、1993；「Computer Analysis of Sequence Data, Part I」Griffin,A.M.およびGriffin,H.G.編、Humana Press、ニュージャージー、1994；「Sequence Analysis in Molecular Biology」von Heinje,G.、Academic Press、1987；および「Sequence Analysis Primer」Gribskov,M.およびDevereux,J.編、M Stockton Press、ニューヨーク、1991；Carilloら (1988) SIAM J Applied Math 48:1073参照）。配列相同性により、保存されているアミノ酸の数が、標準的なアラインメントアルゴリズムプログラムで決定され、それは、各供給者によって設定されたデフォルトのギャップペナルティで使用することができる。実質的に相同な核酸分子は、典型的には、中ストリンジェンシーまたは高ストリンジェンシーにおいて、目的の核酸の全長にわたってハイブリダイズする。ハイブリダイズする核酸分子中のコドンの代わりに縮重したコドンを含有する核酸分子も考えられる。
任意の2分子が、少なくとも60％、70％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％または99％「同一」または「相同」なヌクレオチド配列またはアミノ酸配列を有するかどうかは、「FASTA」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを使用し、例えばPearsonら (1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:2444に記載されているようなデフォルトパラメータを使って決定することができる（他のプログラムには、GCGプログラムパッケージ（Devereux,J.ら, Nucleic Acids Research 12(I):387 (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA（Atschul,S.F.ら, J Molec Biol 215:403 (1990))などがある；「Guide to Huge Computers」Martin J.Bishop編、Academic Press、サンディエゴ、1994、およびCarilloら (1988) SIAM J Applied Math 48:1073）。例えば、米国国立バイオテクノロジー情報センターデータベースのBLAST機能を使って同一性を決定することができる。他の市販プログラムまたは公に利用可能なプログラムには、DNAStarの「MegAlign」プログラム（ウィスコンシン州マディソン）およびUniversity of Wisconsin Genetics Computer Group（UWG）の「Gap」プログラム（ウィスコンシン州マディソン）などがある。タンパク質分子および/または核酸分子の相同性パーセントまたは同一性パーセントは、例えば、GAPコンピュータプログラム（例えばNeedlemanら (1970) J.Mol.Biol. 48:443、SmithおよびWaterman (1981) Adv.Appl.Math. 2:482による改訂版）を使って配列情報を比較することによって決定することができる。簡単に述べると、GAPプログラムは、類似性を、アラインメントさせた記号（すなわちヌクレオチドまたはアミノ酸）のうち、類似しているものの数を、それら2つの配列の短い方の配列中の記号の総数で割ったものと定義する。GAPプログラムのデフォルトパラメータとしては、（1）SchwartzおよびDayhoff編「ATLAS OF PROTEIN SEQUENCE AND STRUCTURE」National Biomedical Research Foundation、353〜358頁（1979）に記載されているように、単項比較マトリックス（unary comparison matrix）（一致に対して1の値を、不一致に対して0の値を含むもの）およびGribskovら (1986) Nucl.Acids Res. 14:6745の加重比較マトリックス（weighed comparison matrix）；（2）各ギャップに対して3.0のペナルティおよび各ギャップ中の各記号に対して0.10の追加ペナルティ；ならびに（3）エンドギャップ（end gap）に対するペナルティなしを挙げることができる。
したがって、本明細書で使用する「同一性」または「相同性」という用語は、試験ポリペプチドまたは試験ポリヌクレオチドと基準ポリペプチドまたは基準ポリヌクレオチドの間の比較を表す。本明細書で使用する「〜と少なくとも90％同一」という用語は、そのポリペプチドの基準核酸配列または基準アミノ酸配列に対する90〜99.99％の同一性パーセントを指す。90％以上のレベルの同一性とは、例えば、比較される試験ポリペプチドと基準ポリペプチドの長さが100アミノ酸であるとすると、基準ポリペプチド中のアミノ酸とは異なる試験ポリペプチド中のアミノ酸が10％（すなわち100個中10個）を上回らないという事実を示す。同様の比較を、試験ポリヌクレオチドと基準ポリヌクレオチドの間でも行うことができる。そのような相違は、ポリペプチドの全長にわたってランダムに分布する点突然変異として現れる場合も、許容される最大値までの、例えば100個中10個のアミノ酸相違（約90％の同一性）までの、さまざまな長さを有する1つ以上の位置にクラスターを形成する場合もありうる。相違は、核酸またはアミノ酸の置換、挿入または欠失と定義される。約85〜90％を上回る相同性または同一性のレベルでは、結果が、プログラムにも、設定されたギャップパラメータにも、依存しないはずであり、そのような高レベルの同一性は、多くの場合、ソフトウェアに頼らなくても手作業でのアラインメントによって、容易に評価することができる。
本明細書にいう、アラインメントされた配列とは、相同性（類似性および/または同一性）を使って、ヌクレオチドまたはアミノ酸の配列における対応する位置をアラインメントすることを指す。典型的には、50％またはそれ以上の同一性によって関連づけられる2つまたはそれ以上の配列がアラインメントされる。アラインメントされた一組の配列とは、対応する位置でアラインメントさせた2つまたはそれ以上の配列を指し、RNAに由来する配列、例えばESTおよび他のcDNAを、ゲノムDNA配列とアラインメントさせたものを含みうる。
本明細書にいう「プライマー」は、適当な条件下（例えば4つの異なるヌクレオシド三リン酸およびDNAポリメラーゼ、RNAポリメラーゼまたは逆転写酵素などの重合因子の存在下）、適当なバッファー中、適切な温度で、テンプレートに基づく（template-directed）DNA合成の開始点として作用することができる核酸分子を指す。一定の核酸分子が「プローブ」としても「プライマー」としても役立ちうることは理解されるだろう。ただしプライマーは伸長のために3'ヒドロキシル基を有する。プライマーは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、逆転写酵素（RT）-PCR、RNA PCR、LCR、マルチプレックスPCR、パンハンドル（panhandle）PCR、キャプチャ（capture）PCR、発現（expression）PCR、3'および5'RACE、インサイチュー（in situ）PCR、ライゲーションによる（ligation-mediated）PCR、および他の増幅プロトコールなどを含む、さまざまな方法で使用することができる。
本明細書にいう「プライマー対」は、（例えばPCRによって）増幅されるべき配列の5'端にハイブリダイズする5'（上流）プライマーと、増幅されるべき配列の3'端の相補鎖にハイブリダイズする3'（下流）プライマーとを含む、一組のプライマーを指す。
本明細書にいう「特異的にハイブリダイズする」とは、ある核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）が相補的塩基対合によって標的核酸分子にアニーリングすることを指す。特異的ハイブリダイゼーションに影響を及ぼすインビトロおよびインビボパラメータ、例えばその分子の長さおよび組成などは、当業者にはよく知られている。インビトロハイブリダイゼーションにとって特に関係の深いパラメータには、さらに、アニーリング温度および洗浄温度、バッファー組成および塩濃度が含まれる。非特異的に結合した核酸分子を除去するための代表的な洗浄条件は、高ストリンジェンシーでは0.1×SSPE、0.1％SDS、65℃であり、中ストリンジェンシーでは0.2×SSPE、0.1％SDS、50℃である。等価なストリンジェンシー条件が当技術分野では知られている。当業者は、ある核酸分子がある特定用途に適した標的核酸分子に特異的にハイブリダイズするように、これらのパラメータを容易に調節することができる。2つのヌクレオチド配列に関して相補的という場合、それは、それら2つのヌクレオチド配列が、ハイブリダイズする能力を有し、相対するヌクレオチド間のミスマッチが典型的には、25％、15％または5％未満であることを意味する。必要であれば、相補性のパーセンテージが指定されるであろう。典型的には、2つの分子は、それらが高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズするように選択される。
本明細書において、ある物品と実質的に同一であるとは、十分に類似しているので、その物品の代わりに実質的に同一な物品を使用しても、目的の性質が十分に不変であることを意味する。
また、本明細書において使用される「実質的に同一」または「類似する」という用語は、当業者には理解されるとおり、文脈によって異なると理解される。
本明細書にいう対立遺伝子変異体または対立遺伝子変異は、同じ染色体座位を占める遺伝子の2つまたはそれ以上の代替的形態のいずれかを指す。対立遺伝子変異は突然変異によって自然に発生し、集団内の表現型多型をもたらしうる。遺伝子突然変異はサイレント（コードされるポリペプチドを変化させない）であるか、変化したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。「対立遺伝子変異体」という用語は、本明細書では、ある遺伝子の対立遺伝子変異体によってコードされるタンパク質を表すためにも使用される。典型的には、基準型の遺伝子は、ある集団またはある種の単一基準メンバーのポリペプチドの野生型および/または優勢型をコードする。典型的には、対立遺伝子変異体（2種間および3種以上の間での変異体を含む）は、同じ種から得られる野生型および優勢型と、典型的には少なくとも80％、90％またはそれ以上のアミノ酸同一性を有する。また、同一性の度合いは、遺伝子に依存し、比較が種間比較であるか種内比較であるかにも依存する。一般に、種内対立遺伝子変異体は、野生型および/または優勢型と少なくとも約80％、85％、90％または95％の同一性またはそれ以上の同一性（例えば野生型および/または優勢型のポリペプチドと96％、97％、98％、99％またはそれ以上の同一性）を有する。本明細書における対立遺伝子変異体への言及は、一般に、同じ種のメンバー間でのタンパク質中の変異を指す。
本明細書にいう「対立遺伝子」は、本明細書では「対立遺伝子変異体」と互換的に使用され、遺伝子またはその一部の代替型を指す。対立遺伝子は相同染色体上の同じ座位または位置を占める。ある対象がある遺伝子について2つの同一対立遺伝子を有する場合、その対象はその遺伝子または対立遺伝子に関してホモ接合であるという。ある対象がある遺伝子について2つの異なる対立遺伝子を有する場合、その対象はその遺伝子についてヘテロ接合であるという。ある特定遺伝子の対立遺伝子は互いに1個のヌクレオチドまたは数個のヌクレオチドが異なる場合があり、ヌクレオチドの置換、欠失および挿入を含む場合がある。ある遺伝子の対立遺伝子は、突然変異を含有する遺伝子の一形態であることもできる。
本明細書にいう種変異体は、異なる種間（マウスとヒトなどといった異なる哺乳動物種間を含む）のポリペプチドにおける変異体を指す。
本明細書にいうスプライス変異体は、2タイプ以上のmRNAをもたらすゲノムDNAの一次転写産物の異なるプロセシングによって生成する変異体を指す。
本明細書にいう改変は、ポリペプチドのアミノ酸の配列または核酸分子中のヌクレオチドの配列の改変に関し、それぞれアミノ酸およびヌクレオチドの欠失、挿入および置き換えを含む。ポリペプチドを改変する方法は、組換えDNA法を用いる方法など、当業者に常用されている。
本明細書で使用するプロモーターという用語は、RNAポリメラーゼの結合と転写の開始に備えたDNA配列を含有する、遺伝子の一部分を意味する。プロモーター配列は、常にというわけではないが、一般的には遺伝子の5'非コード領域中に見いだされる。
本明細書にいう単離されたまたは精製されたポリペプチドもしくはタンパク質またはその生物学的活性部分は、そのタンパク質が得られる細胞または組織に由来する細胞性物質または他の夾雑タンパク質を実質的に含まないか、または化学合成される場合は化学的前駆体または他の化学薬品を実質的に含まない。当業者が純度を評価するために使用する薄層クロマトグラフィー（TLC）、ゲル電気泳動および高速液体クロマトグラフィー（HPLC）などの標準的分析方法で決定した場合に調製物が容易に検出できる不純物を含まないと考えられるか、または調製物が十分に純粋であって、さらなる精製を行ってもその物質の物理的および化学的性質（例えば酵素活性および生物学的活性）が検出できるほどには変化しないであろう場合に、調製物は不純物を実質的に含まないと決定することができる。実質的に化学的に純粋な化合物を製造するために化合物を精製する方法は、当業者に知られている。ただし、実質的に化学的に純粋な化合物は、立体異性体の混合物であることができる。そのような場合は、さらなる精製により、化合物の比活性が増加するかもしれない。
細胞性物質を実質的に含まないという用語は、タンパク質がその単離源または組換え生産源となった細胞の細胞性構成要素から分離されているタンパク質の調製物を包含する。ある実施形態において、細胞性物質を実質的に含まないという用語は（乾燥重量で）約30％未満の非酵素タンパク質（ここでは夾雑タンパク質ともいう）、一般的には約20％未満の非酵素タンパク質または約10％未満の非酵素タンパク質または約5％未満の非酵素タンパク質を含む酵素タンパク質の調製物を包含する。酵素タンパク質が組換え生産される場合、それは培養培地も実質的に含まない。すなわち培養培地は、酵素タンパク質調製物の体積の約20％、10％もしくは5％未満に相当するか、または20％、10％もしくは5％に相当する。
本明細書で使用する、化学的前駆体または他の化学薬品を実質的に含まないという用語は、タンパク質がそのタンパク質の合成に関与した化学的前駆体または他の化学薬品から分離されている酵素タンパク質の調製物を包含する。この用語は、（乾燥重量で）約30％未満、20％未満、10％未満、5％未満またはそれ以下の化学的前駆体または非酵素化学薬品もしくは構成要素を含む酵素タンパク質の調製物を包含する。
本明細書において、例えば合成核酸分子または合成遺伝子または合成ペプチドなどに関していう合成とは、組換え法および/または化学合成法によって製造される核酸分子またはポリペプチド分子を指す。
本明細書において、組換えDNA法を使った組換え手段による生産とは、クローン化されたDNAによってコードされるタンパク質を発現させるために、分子生物学の周知の方法を使用することを意味する。
本明細書にいうベクター（またはプラスミド）は、異種核酸をその発現またはその複製を目的として細胞中に導入するために使用される孤立した（discrete）要素を指す。ベクターは典型的には、エピソームであり続けるが、ゲノムの染色体への遺伝子またはその一部の組込みが達成されるように設計することもできる。酵母人工染色体および哺乳類人工染色体などの人工染色体であるベクターも考えられる。そのような媒体（vehicle）の選択と使用は当業者にはよく知られている。
本明細書にいう発現ベクターは、当該DNAフラグメントの発現を達成する能力を有するプロモーター領域などの調節配列に作動的に連結されたDNAを発現する能力を有するベクターを包含する。そのような追加セグメントはプロモーター配列およびターミネーター配列を含むことができ、場合により、1つまたはそれ以上の複製起点、1つまたはそれ以上の選択可能マーカー、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルなども含むことができる。発現ベクターは一般にプラスミドまたはウイルスDNAから誘導されるか、または両方の要素を含有することができる。したがって、発現ベクターとは、適当な宿主細胞に導入された時にクローン化されたDNAの発現をもたらす、プラスミド、ファージ、組換えウイルスまたは他のベクターなどの組換えDNAまたはRNAコンストラクトを指す。適当な発現ベクターは当業者にはよく知られており、真核細胞および/または原核細胞中で複製可能なものや、エピソームであり続けるもの、または宿主細胞ゲノム中に組み込まれるものがある。
本明細書にいうベクターには「ウイルスベクター（virus vector）」または「ウイルス系ベクター（viral vector）」も包含される。ウイルス系ベクターは（媒体またはシャトルとして）細胞中に外来遺伝子を導入するためにそれら外来遺伝子に作動的に連結された工学的ウイルス（engineered virus）である。
本明細書において、DNAセグメントに関して作動可能に連結または作動的に連結という場合、それは、複数のセグメントが、その意図された目的のために協調して機能するように配置されていること、例えば転写がプロモーターで開始し、コードセグメントを通ってターミネーターまで進行するように配置されていることを意味する。
本明細書において使用する、評価するという用語は、試料中に存在するプロテアーゼまたはそのドメインの活性について絶対値を得るという意味での、そしてまた活性のレベルを示す指数、比、パーセンテージ、視覚表示または他の値を得るという意味での、定量的および定性的決定を包含するものとする。評価は直接的または間接的であることができ、実際に検出される化学種は、もちろん、加水分解産物そのものである必要はなく、例えばその誘導体または他の何らかの物質であることができる。例えば、SDS-PAGEおよびクマシーブルーを使ったタンパク質染色などによる、基質の切断産物の検出。
本明細書にいう生物学的活性とは、化合物のインビボ活性、または化合物、組成物もしくは他の混合物をインビボ投与した時に起こる生理学的応答を指す。したがって生物学的活性には、そのような化合物、組成物および混合物の治療効果および薬理活性が包含される。生物学的活性は、そのような活性を試験または使用するために設計されたインビトロ系で観察することができる。したがって、本明細書に関して言えば、プロテアーゼの生物学的活性とは、ポリペプチドが加水分解されるその触媒活性である。
本明細書において、2つの核酸配列に関して、等価という場合、それは、問題の2つの配列が同じアミノ酸の配列または等価なタンパク質をコードすることを意味する。2つのタンパク質またはペプチドに関して等価という場合、それは、それら2つのタンパク質またはペプチドが実質的に同じアミノ酸配列を有し、アミノ酸置換はそのタンパク質またはペプチドの活性または機能を実質的に変化させないものだけであることを意味する。等価が性質を指す場合、その性質は同程度に存在する必要はないが（例えば2つのペプチドは同じタイプの酵素活性を異なる比率で示すことができる）、それらの活性は通常は実質的に同じである。
本明細書にいう「調整する」（modulate）および「調整」（modulation）または「変化させる」（alter）は、タンパク質などの分子の活性の変化を指す。代表的な活性には、シグナル伝達などの生物学的活性があるが、これに限るわけではない。調整には、活性の増加（すなわちアップレギュレーションまたはアゴニスト活性）、活性の低下（すなわちダウンレギュレーションまたは阻害）または活性の他の任意の変化（例えば周期性、頻度、持続時間、反応速度または他のパラメータの変化）が含まれうる。調整は文脈に依存する場合があり、典型的には、調整は指定した状態、例えば野生型タンパク質、構成的状態におけるタンパク質、または指定した細胞タイプもしくは条件において発現されるタンパク質と比較される。
本明細書にいう組成物は任意の混合物を指す。それは、水性、非水性またはその任意の組合せである溶液、懸濁液、液体、粉末、ペーストであることができる。
本明細書にいう組合せは、2つまたはそれ以上のアイテムの間の任意の関連（association）を指す。組合せは、2つまたはそれ以上の別々のアイテム、例えば2つの組成物または2つの集合体であるか、その混合物、例えば、それら2つまたはそれ以上のアイテムの単一混合物であるか、それらの任意のバリエーション（variation）であることができる。組合せの要素は、一般に、機能的に関連または関係する。
本明細書にいうキットは、場合により、他の要素、例えば追加の試薬および当該組合せまたはその要素の使用に関する指示書などを含む、梱包された組合せである。
本明細書にいう「疾患または障害」は、感染、後天的状態、遺伝的状態などを含む（ただしこれらに限るわけではない）原因または状態に起因し、同定可能な症状を特徴とする、ある生物における病理学的状態を指す。本明細書における目的の疾患および障害は、ECMの構成要素が関与するものである。
本明細書にいうECM介在疾患または症状は、1つまたはそれ以上の任意のECM構成要素がその病理または病因に関与しているものを指す。本明細書に関して言えば、ECM介在疾患または状態には、1つまたはそれ以上のECM構成要素の増加した沈着または蓄積によって引き起こされるものが含まれる。そのような状態には、セルライト、デュピュイトラン症候群、ペイロニー病、五十肩、ケロイドなどの既存の瘢痕、強皮症およびリンパ浮腫などがあるが、これらに限るわけではない。
本明細書にいう、ある疾患または状態を有する対象を「処置する」とは、処置後に、その対象の症状が部分的にまたは完全に軽減すること、または静的状態を保つことを意味する。したがって、処置は、予防、治療および/または治癒を包含する。予防とは、潜在的疾患の防止および/または疾患の症状の悪化または疾患の進行の防止を指す。処置には、本発明が提供する改変インターフェロンおよび組成物の任意の医薬的使用も包含される。
本明細書にいう医薬有効剤は、任意の治療剤または生物活性剤、例えば限定するわけではないが、麻酔薬、血管収縮薬、分散剤、従来の治療薬（小分子薬および治療用タンパク質を含む）を包含する。
本明細書にいう処置は、ある状態、障害もしくは疾患またはその処置の他の適応の症状を寛解させるか、または他の有益な形で変化させる、任意の方法を意味する。
本明細書にいう治療効果は、疾患または状態の症状を変化（典型的には、改善または寛解）させるか、疾患または状態を治癒させる、対象の処置に起因する効果を意味する。治療有効量とは、対象への投与後に治療効果をもたらす、組成物、分子または化合物の量を指す。治療有効量によって処置が達成される。
本明細書で使用する「対象」という用語は、ヒトなどの哺乳動物を含む動物を指す。
本明細書にいう患者は、ヒト対象を指す。
本明細書において、処置による、例えば医薬組成物または他の治療薬の投与による、特定の疾患または障害の症状の寛解とは、その組成物または治療薬の投与に起因すると考えることができる、またはその組成物もしくは治療薬の投与に関連づけることができる、症状の減縮（永続的であるか一時的であるか、持続的であるか一過性であるかを問わない）を指す。
本明細書にいう防止または予防は、疾患または状態が発生するリスクを低下させる方法を指す。
本明細書にいう有効量は、疾患または障害の症状を防止し、治癒させ、寛解させ、抑止し、または部分的に抑止するのに必要な治療剤の量である。
本明細書にいう単位投与剤（unit dose form）は、当技術分野で知られているように、ヒトおよび動物対象に適し、個別に包装された、物理的に孤立した単位を指す。
本明細書にいう、1回投薬量製剤（single dosage formulation）は、直接投与するための製剤を指す。
本明細書にいう「製品」は、製造され、販売される物品である。本願の全体にわたって使用されるこの用語は、包装物（article of packaging）に含まれている活性化可能なマトリックス分解酵素を包含するものとする。
本明細書にいう流体（fluid）は、流動しうる任意の組成物を指す。したがって流体は、半固形、ペースト、溶液、水性混合物、ゲル、ローション、クリームおよび他のそのような組成物の形態をとる組成物を包含する。
本明細書にいう「キット」は、例えば限定するわけではないが活性化、投与、診断、および生物学的活性または性質の評価などを目的とする、本発明が提供する活性化可能なマトリックス分解酵素ともう一つのアイテムとの組合せを指す。キットは使用に関する指示書を含んでもよい。
本明細書にいう細胞抽出物または細胞溶解物とは、溶解または破壊された細胞でできた調製物または画分を指す。
本明細書にいう動物には、任意の動物、例えば限定するわけではないが、ヒト、ゴリラおよびサルを含む霊長類；マウスおよびラットなどの齧歯類；ニワトリなどの家禽；ヤギ、ウシ、シカ、ヒツジなどの反芻動物；ブタなどのイノシシ科動物（ovine）、および他の動物が含まれる。非ヒト動物として想定される動物にヒトは含まれない。本発明が提供する酵素は、任意の供給源、動物、植物、原核生物および真菌に由来する。大半の酵素は動物由来（哺乳動物由来を含む）である。
本明細書にいう対照は、それが試験パラメータで処置されない点以外は、またはそれが血漿試料である場合には、目的の状態に冒されていない正常ボランティアから得られたものでありうる点以外は、試験試料と実質的に同一である試料を指す。対照は内部対照であることもできる。
本明細書において使用する「ある」「一つの」および「その」という単数形は、文脈上そうでないことが明らかでない限り、複数の指示物を包含する。したがって、例えば「細胞外ドメイン」を含む化合物への言及は、1つまたは複数の細胞外ドメインを含む化合物を包含する。
本明細書において、範囲および量は、特定の値または範囲の「前後（または約）」と表現する場合がある。この「前後（または約）」には、その量そのものも包含される。したがって「約5塩基」は「約5塩基」を意味すると共に「5塩基」も意味する。
本明細書にいう「随意の」（optional）または「場合により」（または「〜されていてもよい」）（optionally）は、それに続けて述べられる事象または状況が起こることまたは起こらないこと、およびその説明が、該事象または状況が起こる場合と起こらない場合とを包含することを意味する。例えば、置換されていてもよい基とは、その基が無置換であるか、または置換されていることを意味する。
本明細書において使用する、任意の保護基、アミノ酸および他の化合物の略号は、別段の表示がない限り、その一般的使用法、広く認識されている略号、またはIUPAC-IUB生化学命名委員会（(1972) Biochemistry 11:1726参照）に従う。
B．概観−温度感受性マトリックスメタロプロテアーゼおよび他の改変メタロプロテアーゼ
本発明は、細胞外マトリックス（ECM）の1つまたはそれ以上の構成要素を分解する改変MMPポリペプチド、例えばマトリックスメタロプロテアーゼの温度感受性（ts）突然変異体（tsMMP）を提供する。tsMMPはECMの1つまたはそれ以上の構成要素を温度依存的に分解することができる。特に、本発明が提供する突然変異体はコラーゲンを分解する。一部の例では、突然変異体が、高い温度、例えば生理的温度（例えば37℃）よりも、低い温度において、より高い活性を示す。別の例では、突然変異体が、低い温度よりも、生理的温度において、より高い活性を示す。したがって、例えば身体に投与された時のtsMMPの活性化は、温度の変化に基づいて、時間的にまたは条件的に制御することができる。
制御されないMMP活性は、組織の完全性にとって著しく破壊的でありうる。活性化可能なtsMMPの条件付き活性化によって、一時的な活性化が達成され、それによって、酵素の不必要な長時間にわたる活性化に伴う有害な副作用が低減するように、細胞外マトリックス（ECM）構成要素に対する酵素作用の持続時間が調節される。これが既存のコラゲナーゼ処置と比較した本tsMMPの利点である。したがって、そのような突然変異体の利点は、それらの活性を調節することができ、それによってECMの疾患および/または状態を処置するためにtsMMPを使用することが可能になることである。
本発明が提供する改変MMPポリペプチドは、非許容温度と比較して許容温度では活性が増加することによって温度感受性を呈するように改変され、かつ/または活性突然変異体として、改変を含有しないMMPポリペプチドと比較して増加した活性を呈するように改変されている。本発明が提供する改変MMPポリペプチドは、例えばアミノ酸の置換、挿入または置き換えによって改変されている。例えばtsMMPは、そのタンパク質を非許容温度よりも許容温度においてより活性にするような1つまたはそれ以上のアミノ酸の置き換えを、その一次配列中に含有する。本発明が提供する改変MMPポリペプチドは、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上のアミノ酸改変を含有することができる。特に、本発明が提供する改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPは、1、2、3、4、5、6、7、8、9または10個のアミノ酸改変を含有する。
本発明が提供するtsMMPは許容温度において活性化可能であるが、他の非許容温度では活性が低いか不活性である。本発明が提供するtsMMPは、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、30、40、50またはその前後もしくはそれ以上の、非許容温度と比較した許容温度における活性の比を有する。したがって、非許容温度における本発明が提供するtsMMPの活性は、許容温度における活性の70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％またはその前後もしくはそれ以下である。
例えば、生理学的温度（例えば37℃）において正常に活性であるMMPを改変し、より低温、すなわち身体の生理学的温度より低い温度（例えば37℃未満、例えば20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃もしくは30℃またはその前後）では活性であるが、生理的温度では活性が低いか不活性である酵素を選択する。そのような改変酵素は、活性化条件が低温である活性化可能なマトリックス分解酵素（AMDE）として使用することができる。酵素の活性化は、インビボ温度が37℃の生理学的温度に戻るにつれて、時間的に制御される。したがって例えば本発明が提供するtsMMPは、25℃またはその前後である許容温度では活性であるが、それより高い温度、例えば33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃もしくは39℃またはその前後では低活性である。本発明が提供するtsMMPは、例えば33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃もしくは39℃またはその前後である非許容温度と比較して、25℃またはその前後である許容温度において、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、30、40、50またはその前後もしくはそれ以上である活性の比を有する。したがって、34℃もしくは37℃またはその前後である非許容温度における本発明が提供するtsMMPの活性は、25℃またはその前後である許容温度における活性の70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％またはその前後もしくはそれ以下である。
例えば、温度感受性を呈する本発明が提供する改変MMPポリペプチド、特に改変MMP-1ポリペプチドは、条件付きで活性であり、ECM介在疾患および障害を処置する用途、方法およびプロセスにおいて使用することができる。例えばそのようなtsMMPポリペプチドは、ECMの正常温度より低い許容温度で活性である。したがって、許容温度またはそれを下回る温度でECMに投与された場合に、この酵素は活性を呈する。ある例では、投与前に、tsMMP、例えばtsMMP-1を、冷バッファーに再構成することができ、かつ/または許容温度もしくはそれを下回る低温で保存することができる。tsMMPは、許容温度（例えば18℃〜25℃）にばく露されたときに、活性を呈する。tsMMPが、例えば身体に投与された時に、身体の生理的温度ゆえに、徐々に温かい温度にばく露されて非許容温度に近づくか非許容温度に達するにつれて、MMPの活性は低下する。このようにtsMMPは、許容温度の維持を条件とする条件付き活性を呈する。例えばECMの活性は、ECMを身体の生理学的温度より低く維持することによって、予め定められた時間、制御することができる。
このように活性化条件が温度である場合は、活性化に必要な許容温度にtsMMPをばく露する活性化因子を提供することができる。活性化因子へのばく露はインビトロまたはインビボで起こりうる。活性化因子は、インビボ投与前に、またはインビボ投与と同時に、またはインビボ投与に続いて、またはインビボ投与後、断続的に、tsMMPにばく露させることができる。活性化因子は、活性化に要求される必要な熱または冷たさを提供することができる。例えば活性化条件が低温である場合は、活性化因子を、冷バッファーとして、または投与部位に適用されるアイスパック（ice pack）として提供することができる。活性化条件が熱である場合は、活性化因子を、温バッファーとして、または投与部位に適用される温感パック（heat pack）として提供することができる。活性化条件は、使用直前に許容温度でtsMMPを貯蔵することによって提供することもできる。活性化因子へのばく露の持続時間は持続的であるか、予め定められた時間であるか、または断続的（例えばtsMMPが可逆性である場合）であることができる。このように活性化を許す期間は柔軟であり、使用されるその特定酵素、処置される疾患または状態、投与部位、または他の要因に適合させることができる。活性化因子へのばく露の持続時間を決定することは、当業者の技能レベルの範囲内である。
活性化条件を提供する活性化因子へのばく露が存在しない場合、非許容温度に存在するtsMMPは不活性であるか、許容温度における活性と比較して実質的に不活性である。投与部位には通常は存在しない許容温度（例えば低温）の活性化条件は、約37℃の生理的温度を呈する間質などといった器官および組織の生理学的パラメータの一時的調節および変更を可能にする。正常な生理的条件下では、間質の温度は約37℃である。したがって例えば低温で活性なtsMMPは、間質中に存在する時は、間質の生理的温度ゆえに、通常、触媒的に不活性であるだろう。隣接する表面に適用された冷バッファーまたは冷温パックへのばく露によって間質の温度を一時的に冷たくした場合、その間質に投与されたtsMMPは活性化された状態になるだろう。温度が上昇して生理的レベルに戻ると、tsMMPは不活性または実質的に不活性になり、その酵素活性を発揮するのを止める。したがって、外因的活性化条件のための要件を利用することにより、tsMMPは活性化可能であり、使用時に、例えば身体へのインビボ投与後に、限られた時間だけ、一時的に活性にすることができる。
本発明が提供するtsMMPには、非許容温度へのばく露に続いて不可逆的に不活性になるものが含まれる。そのような突然変異体は、許容温度条件（例えば25℃）にばく露した時には活性であるが、温度を非許容温度（例えば37℃、身体へのインビボ投与と外因的活性化因子（例えば冷温パック）の除去後に起こりうるものなど）に変えると、活性が低下するか、不活性になる。許容条件に戻した場合、本発明が提供する不可逆性tsMMPポリペプチドは、非許容温度における活性の50％、60％、70％、80％、90％、100％、105％、110％、115％、もしくは120％またはその前後を呈する。活性は可逆性でない。
本発明は、非許容温度へのばく露に続いて可逆的に不活性になるtsMMPも提供する。そのような突然変異体は、許容温度条件にばく露された場合は活性であるが、温度を非許容温度に変えると、活性が低下するか、不活性になる。許容温度を提供する活性化条件（例えば冷温パック）に再びばく露すると、tsMMPの活性が回復することにより、その酵素は、ECMの1つまたはそれ以上の構成要素を分解するのに十分な活性を示すようになる。例えば、非許容条件から許容条件に戻すと、本発明が提供する可逆性tsMMPポリペプチドは、非許容温度における活性の120％、125％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、200％またはその前後もしくはそれ以上を呈する。
本発明が提供するtsMMPは、野生型MMPの1つまたはそれ以上の活性、例えばコラーゲンなどのECM構成要素を切断する酵素活性を保持している。例えば、本発明が提供するtsMMPは、許容温度において、許容温度における野生型MMPの活性の30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、140％、150％またはその前後もしくはそれ以上である活性を保持している。したがって、本発明が提供するtsMMPには、許容温度において野生型MMP-1よりも活性であるものが含まれ、許容温度において野生型MMP-1よりも活性が低いものも含まれる。しかし一般に、本発明が提供するtsMMPは、非許容温度では野生型MMP-1より活性が低い。例えば、本発明が提供するtsMMPは、生理的温度（例えば34℃または37℃）において野生型MMP-1の95％、90％、80％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、一般的には40％、30％、25％、20％、15％、10％、または5％の残存活性を呈する。
典型的には、本発明が提供する改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPは、チモーゲン（プロペプチドを含有するもの）またはプロセシングされた酵素（例えばプロペプチドを欠く成熟酵素）、またはその触媒活性型である。後述するように、MMPを含む大半の酵素はチモーゲンであり、活性には、そのポリペプチドのN末端からプロペプチドセグメントを除去することによる初期プロセシング事象を必要とする。プロテアーゼまたは化学剤などのプロセシング因子は、プロペプチドセグメントの除去および/またはMMPの活性部位を露出させるコンフォメーション変化によって活性MMPを生成させるための1つまたはそれ以上の切断を、直接的または間接的に開始する。したがって通常、酵素が成熟型へとプロセシングされると、その酵素は活性になる。プロセシングされた酵素の活性は可逆性ではないので、プロセシングされた酵素を身体に投与すると、ECMの無制御な分解が起こる。本発明では、温度感受性を追加的に付与する酵素の改変が、プロセシングされたMMPの持続的な活性化を回避する目的でMMPの活性化を条件的および時間的に制御するための機構を提供すると考えられる。
合成物であれ、自然源から単離されたものであれ、MMPはどれでも、例えば表5または本明細書の他の項に記載されているもの、プロペプチドを欠くその成熟型、および触媒活性ドメインまたはその一部だけを含有するポリペプチドを含む触媒活性型、ならびにその対立遺伝子変異体もしくは種変異体または他の変異体など、または当業者に知られるものはどれでも、温度感受性になりかつ/または増加した活性を有するように、本明細書で説明するように改変することができ、本発明の提供する組成物、組合せ、方法および装置に使用することが考えられる。本発明が提供する改変酵素型はいずれも、増加した活性および/または温度感受性を呈する、すなわち本酵素は、温度活性化条件の要件ゆえに、活性化可能であると理解される。例えば温度感受性になるように改変することができる代表的なMMPを表1に示すが、これには、例えば配列番号1、711、714、717、720、723、726、729、732、735、738、741、744、747、750、753、756、759、762、765、768、771、774または777、そのチモーゲン型または成熟型、その触媒活性型、および対立遺伝子変異体もしくは種変異体または他の変異体が、それら他の形態が温度感受性および/または増加した活性を付与する突然変異を含有する限り、いずれも含まれる。例えば配列番号2は配列番号1のチモーゲン型である。図1に、他の代表的MMPのチモーゲン型を例示する。当業者はtsMMPを知っているか、tsMMPを同定することができるだろう。例えば当業者は、常用の分子生物学的技法を使用して、本発明のアミノ酸突然変異をMMP中に導入し、それぞれを許容温度および非許容温度下での酵素活性化について試験して、任意の所望する酵素の持続的または可逆的活性化のための外因的活性化条件の要件を評価することができる。酵素活性化に関する代表的なアッセイは本明細書に記載され、当技術分野では知られている。
したがって、本発明が提供する改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPには、チモーゲン型（例えばプロ酵素）、プロペプチドを欠くプロセシングされた成熟型、およびその触媒活性ドメインのみを含有するポリペプチドが含まれる。例えばtsMMPには、そのtsMMPが許容温度において酵素活性を呈する限り、チモーゲン型（例えばプロ酵素）、プロペプチドを欠くプロセシングされた成熟型、およびその触媒活性ドメインのみを含有するポリペプチドが含まれる。そのようなtsMMPの代表例はtsMMP-1である。本発明が提供するtsMMP-1は、その一次配列中に、配列番号2に示す野生型MMP-1におけるアミノ酸の置き換えに相当する1つまたはそれ以上のアミノ酸改変を含有する。代表的な改変については本明細書のセクションDに項を改めて説明する。本発明が提供する改変MMP、例えばtsMMP-1突然変異体または活性突然変異体には、チモーゲンであるもの、またはプロペプチドを欠く成熟型であるものが含まれる。本発明が提供するチモーゲンまたは成熟ポリペプチドには、完全長であるもの、プロリンリッチリンカーまたはヘモペキシン結合ドメインの全部または一部を含むもの、プロリンリッチリンカーまたはヘモペキシン結合ドメインの全部または一部を欠くもの、またはその触媒活性ドメインのみ（例えば配列番号1に示すアミノ酸の配列のアミノ酸81〜242に対応するもの）を含むポリペプチドが、そのtsMMP-1が許容温度において酵素活性を保持しておりかつ/または増加した活性を呈する限り、含まれる。
チモーゲン型で提供される場合、改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPは、不活性であり、活性にはプロセシング因子によるプロセシングが要求されると理解される。一般に、酵素のプロセシングは、使用前に、例えばインビボ投与前に、達成される。例えばプロセシング因子は、活性化条件（例えば低温）へのtsMMPのばく露および身体への投与と同時に、またはそれとは断続的に、またはそれに引き続いて、適用することができる。一般に、対象への投与に関して許容されるプロセシング因子が選択される。所望であれば、投与前に、プロセシング因子を酵素調製物から透析除去するか、他の方法で精製除去することができる。したがって、チモーゲン型の酵素については、活性化には次の2段階が要求される：1）プロセシング因子へのばく露；および2）活性化条件へのばく露。チモーゲン型であれ、プロセシングされた形態であれ、許容温度における活性化因子へのtsMMPのばく露により、tsMMPの活性は時間的に制御される。
本発明が提供する改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPは、任意の1つまたはそれ以上の性質または活性を変化させるために、さらに改変することができる。例えば、改変された性質または活性は、酵素をより安定にし、基質特異性を変化させ、かつ/または1つもしくはそれ以上の阻害因子に対する耐性を増加させる改変などを含むが、これらに限るわけではない。一例として、改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPは、その基質特異性が変化するように改変することができる。例えば、酵素は、ある特定基質に対して増加した特異性を有するように改変することができる。したがって例えば、I型およびIV型コラーゲンに対する基質特異性を呈する改変MMPポリペプチドは、それがI型コラーゲンに対して増加した基質特異性を有し、IV型コラーゲンに対しては増加した基質特異性を有さないように、またはその逆になるように、改変することができる。所望であれば、酵素のPEG化またはグリコシル化によって酵素安定性を増加させることもできる。
ポリペプチドの改変は常用の分子生物学的技法によって達成することができ、当業者の技能の範囲内である。本明細書に関して言えば、改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPは、許容温度において野生型MMPの1つまたはそれ以上の活性を保持している。保持されている活性は、許容温度において、野生型MMPの40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％またはそれ以上の活性であることができる。改変酵素は、本明細書に記載するようなまたは当技術分野で知られているような基質切断に関する日常的アッセイを使って、その基質特異性について試験することができる。例えば基質切断は蛍光原ペプチドまたは精製タンパク質で評価することができる。切断はインビトロまたはインビボアッセイを使って評価することができる。例えば切断は、酵素を基質と共にインキュベートした後、その混合物をSDS-PAGEゲルに流すことによって評価することができる。分解は、ウェスタンブロットによって、またはクマシーブルーまたは銀染色試薬などの標準的タンパク質染色を使って、評価することができる。
改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPは、本発明では、組成物、組合せおよび容器として提供される。改変MMP、例えばtsMMPは、治療有効量で提供され、これが、活性化されると、投与時に、例えば表皮下投与時に、ECMの1つまたはそれ以上の構成要素を分解する。結果として得られる改変MMP、例えばtsMMPは、ECM介在疾患または状態を処置するための治療薬として使用することができる。活性化可能なマトリックス分解タンパク質を使用する組成物、組合せ、容器および方法の説明は、関連する米国仮特許出願第61/068,667号および同第61/127,725号、米国特許出願第12/81,063号およびPCT国際出願番号PCT/US2009/001489に記載されており、これらはそれぞれ引用によりそのまま本明細書に組み込まれる。組成物、組合せ、容器および方法のそのような説明は、改変MMP（例えばtsMMP）の組成物、組合せおよび容器を製造して提供する目的、ならびにECM介在疾患および状態を処置するためにそれを使用する目的に、使用することができる。
例えば、tsMMPは、活性化条件を提供する活性化因子と共に、組成物、組合せおよび/または容器に入れて提供することができる。また、いくつかの例では、改変MMP、例えばtsMMPが、プロセシング因子と共に、組成物、組合せおよび/または容器に入れて提供される。活性化因子および/またはプロセシング因子は、tsMMPとは、同じ組成物に含まれていても、別個の組成物に含まれていてもよく、同じ容器に入っていても、別個の容器に入っていてもよい。また、改変MMP、例えばtsMMPは、他の薬剤、例えば麻酔薬、α-アドレナリン作動薬、分散剤、または治療剤の任意の1つまたはそれ以上と組み合わせること、または例えば容器中で組み合わせて提供することができる。改変MMP、例えばtsMMPは、他の薬剤と同じ組成物または別個の組成物に入れて提供することができ、かつ/または同じ容器または別個の容器に入れて提供することができる。
改変MMP、例えばtsMMPは、治療有効濃度で、液体として、または凍結乾燥した形態で、提供することができる。あるいは、tsMMPは、十分な量の活性化因子の添加が治療有効濃度の酵素をもたらすように、濃縮液として提供することもできる。酵素は、溶液または懸濁液として提供するか、適切な送達媒体、例えばリポソーム、ガラス粒子、毛細管、薬物送達媒体、ゼラチン、ゲル、錠剤、カプセル剤、丸剤、持続放出性コーティング、ならびに経皮パッチ調製物および乾燥粉末吸入器その他の媒体に封入することができる。活性化因子は、典型的には、単独で、またはtsMMPの再構成および/もしくはtsMMPへのばく露後に、間質中に投与するための、溶液または懸濁液として提供される。一部の例では、活性化因子が外因的に提供され、投与部位に適用される。例えば活性化因子は、tsMMPの投与前、またはtsMMPの投与と同時に、またはtsMMPの投与に続いて、またはtsMMPの投与後、断続的に投与部位（例えば皮膚）に適用することができる温熱パックまたは冷温パックであることができる。後述のように、これらの組合せを含有するキットを提供し、容器などの製品も提供する。
したがって、所望する時に、酵素が活性化因子にばく露されて活性な酵素を生成する活性化条件に、tsMMP酵素を供する。活性化因子へのばく露はインビトロまたはインビボで達成することができる。例えば、活性化可能な酵素および活性化因子が別々に提供され、それらを一緒にまたは別々に投与することができる。別々に投与される場合、tsMMPは、活性化因子と同時に、または活性化因子に続いて、または活性化因子とは断続的に、投与することができる。もう一つの例では、凍結乾燥された形態または濃縮された液体の形態をしたtsMMPを、使用直前に活性化因子で再構成することができる。そのような例では、tsMMPと活性化因子の混合物が、一緒に投与される。そのような活性化の方法は当業者が経験的に決定することができ、酵素および活性化因子の選択、所望する処置方法および処置レジメンに依存して異なりうる。
tsMMPは、製品単独で、または活性化因子と組み合わせて提供することができる。例えば、酵素を活性化因子と組み合わせて提供する場合、製品は、1つの区画に凍結乾燥された形態または液状の酵素を含有し、隣の区画に冷たいまたは冷たくすることができるバッファーを含有することができる。区画は分割部材によって分離することができる。製品はさらにプロセシング因子を含有することができる。そのような製品について、本明細書では項を改めて説明する。
これらの組合せは以下に詳述する他の薬剤をさらに含むこともできる。例えば、tsMMPなどの改変MMPポリペプチドは、麻酔薬、血管収縮薬、分散剤または他の治療剤の1つまたはそれ以上を含有する組合せで提供される。
以下のセクションでは、細胞外マトリックスおよびその疾患の概観を述べ、改変MMPとして（例えば温度感受性の活性化可能な酵素として）製造するための代表的MMP；そのような改変MMPを製造する方法；改変MMP-1ポリペプチドである代表的改変MMP、例えばtsMMP；その組成物および組合せ、ならびに改変MMP、例えば改変MMP-1ポリペプチドまたは組成物を、ECM介在疾患および状態の処置に使用する方法を記載する。
C．マトリックスメタロプロテアーゼおよび細胞外マトリックス
本発明は改変マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）を提供する。改変MMPには、温度による活性化が可能であって、細胞外マトリックス（ECM）の1つまたはそれ以上のタンパク質構成要素を、非許容温度と比較して許容温度における増加した活性により、温度制御的に分解するものが含まれる。したがって、本改変MMPは温度感受性である。そのような一時的インビボ活性化ゆえに、ECMの疾患および/または状態を処置することができる。もう一つの例において、本発明は、改変を含有しないMMPと比較して増加した活性を呈する改変MMPも提供する。増加した活性を付与する突然変異を、温度感受性を付与する少なくとも1つの突然変異と組み合わせることにより、活性突然変異を含有しないtsMMPと比較して、許容温度において増加した活性を有する改変MMPポリペプチドを生成させることができる。改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPは、ECMの任意の構成要素を分解することができ、酵素の選択は、標的とする構成要素および/または処置されるべき特定の疾患または状態に依存しうる。
1．細胞外マトリックス
ECMは、細胞の外側の空間ならびに脈管系およびリンパ系を取り囲む結合組織または間質を構成することにより、異なる組織との、そして異なる組織間の、機構的および構造的支持を提供している。ECMの複雑で動的な微小環境は、皮膚などの結合組織内での構造およびシグナリング系を表す。ECMはその複雑さゆえに、例えば細胞に支持および固定手段を提供し、組織を隔離し、細胞間コミュニケーションを調節し、細胞増殖因子を隔離するなど、多様な機能を果たすことができる。ECMの組織化または構成における欠陥または変化は、いくつかの疾患または状態の一因になりうる。例えば、コラーゲン線維の合成、分解および組織化における変化は、リポジストロフィー（例えばセルライト）およびリンパ浮腫の一因になる。
ECMは、コラーゲンなどの線維性構造タンパク質、プロテオグリカンおよびヒアルロン酸などの多糖類、ならびにマトリックスの構成要素を互いに連結し、細胞にも連結する接着タンパク質から構成される。腱および軟骨など、一部の結合組織は、主としてECMから構成されている。しかし皮膚の結合組織を構成するECMには、線維芽細胞、血管および他の構成要素も分布している。またECMは、血漿からリンパ管へと水およびその溶解構成成分が移動する空間としての役割も果たす。間質液は細胞質とほぼ等張であり、炭酸水素塩で緩衝化されていて、中性pHである細胞外環境を提供している。
a．ECMの構成要素
ECM（間質マトリックスとも呼ばれる）は、コラーゲン、エラスチンおよびフィブロネクチンなどの線維性タンパク質を含む多数の構造高分子を含有し、グリコサミノグリカン（GAG）が水和されたゲル様の物質を形成している、複雑な三次元動的構造である。ECMの構成要素は、常在細胞、典型的には線維芽細胞または線維芽細胞ファミリーの細胞によって産生されて、エキソサイトーシスによって分泌され、そこで、ECMの他の構成要素と相互作用する。骨、皮膚または角膜などの多様な組織を生じさせるのは、これらの構成要素が一緒になって組織化し、形を為す際の、相対量および方法の相違である（Albertら「Cell Junctions, Cell Adhesions and the Extracellular Matrix」Molecular Biology of the Cells ニューヨーク：Garland Publishers、1994、972頁）。
i．コラーゲン
コラーゲンは、皮膚などの結合組織の主要な構造構成成分であり、組織アーキテクチャ、組織強度および細胞間相互作用の発生および維持において、役割を果たす。コラーゲンには、コラーゲン三重ヘリックスのコンフォメーションを有する1つまたはそれ以上のドメインを含有する、構造的に関連するECMタンパク質のファミリーが含まれる（Van der Restら (1991) FASEB J., 5:2814-2823）。コラーゲンは、コラーゲン鎖がヘリックス構造にねじれることを可能にするGly-X-Y繰り返し構造を含有する。各コラーゲン分子は、互いに撚り合わさってα1-α3と呼ばれる三重ヘリックスを形成する3本の鎖を含有する。この三重ヘリックス構造は、コラーゲン分子に高い機械的強度を与える。コラーゲンには、アミノ酸配列および鎖の組成が異なる少なくとも27の異なるタイプが存在する。例えばコラーゲンのタイプに依存して、三重ヘリックスを形成する3本の鎖は同じである場合も、異なる場合もある。コラーゲンは、ホモ三量体（すなわち三重ヘリックスの3つのポリペプチド鎖が同じコラーゲンで構成されている）であるか、ヘテロタイプ（すなわち2つ以上のコラーゲンタイプで構成された原線維）であることができる。コラーゲンは、それが形成する構造に応じて、いくつかのファミリーに分類することができる。これらには、線維状コラーゲン（間質コラーゲンとも呼ばれる；例えばI、II、III、VおよびXI型）およびFACITなどの非線維状コラーゲン（例えばIX、XII、XIV型）、短鎖（例えばVIII型、X型）、基底膜（例えばIV型）および他のコラーゲン類（例えばVI、VII、およびXIII型）が含まれる。下記の表3に、一般的なコラーゲンタイプとそれらの代表的な位置を示す（Van der Restら (1991) FASEB J., 5:2814-2823)；www.collagenlife.com/page_1167323108078.html；www.indstate.edu/thcme/mwking/extracellularmatrix.html）。
間質コラーゲン間ではコラーゲン分子が会合して独特な縞模様を有する大きな原線維を形成する。この縞模様は隣接分子間の重なりによって生じる。コラーゲン線維の強さは、結合組織の密なコラーゲン線維ネットワークを形成するコラーゲン線維の分子内および分子間結合の多重性に基づいている。最も一般的な線維状コラーゲンには、I、IIおよびIII型コラーゲンが含まれる。I型コラーゲンは、皮膚、骨、腱および角膜など大半の結合組織に見いだされ、2つのα1(I)鎖と1つのα2(I)鎖とで構成されている（[α1(I)]2α2(I)）。II型コラーゲンは、ホモ三量体（[α1(II)]3）であり、主として軟骨に見いだされる。III型もホモ三量体（[α1(III)]3）であり、主として皮膚および脈管に見いだされる。
全てのコラーゲンが原線維ネットワークを形成するわけではない。例えば基底膜IV型コラーゲンは非線維性であって、ヘリックス中に非ヘリックス的中断を有し、それがより大きな柔軟性を分子に与えるヒンジとして作用する。したがってIV型コラーゲンは、線状原線維ではなくフィラメントの網目構造でできたシートを形成する。
最も豊富な皮膚のタンパク質はコラーゲンであり、これは、主としてI型（80〜85％）およびIII型（8〜11％）コラーゲンから構成されている。I型コラーゲンはIII型コラーゲンと会合して、真皮の主要コラーゲン線維を形成する。皮膚の引張強さは、主としてこれらの線維状コラーゲン分子によるものであり、それらは、ヘッドトゥーテールにかつ横方向は互い違いに側面を接した配置（head-to-tail and staggered side-to-side lateral arrangement）で集合してミクロフィブリルになる。コラーゲン分子は隣接するコラーゲン分子に架橋されて、コラーゲン線維のさらなる強さおよび安定性を生み出す。例えばV型コラーゲンもI/III型コラーゲン線維と会合して、原線維直径を調節する。皮膚における他のコラーゲンタイプには、例えばIV型、VI型、VII型、XII型、XIV型およびXVII型などがある。
［表3］コラーゲンのタイプ
Figure 2012519494
ii．エラスチン
ECMにおける弾性線維のネットワークは、伸展後に跳ね返るための弾力性を要求する組織、例えば皮膚、動脈および肺に、柔軟性を与える。弾性線維の主要構成要素はエラスチン分子であり、これは隣接するエラスチンへの架橋を生成する。これらの分子は弾性線維の芯を形成し、エラスチンに結合する大きな糖タンパク質であって弾性線維の完全性にとって重要なフィブリリンによって覆われる。
iii．フィブロネクチン
フィブロネクチンは、カルボキシル末端付近の一対のジスルフィド結合によって接合された2つの大きなサブユニットのペアとして存在する糖タンパク質である。各サブユニットは、他のマトリックス高分子および細胞表面上の受容体に特異的な、機能的に異なるドメインを含有する。例えば、フィブロネクチン上の異なるドメインは、コラーゲン（I、IIおよびIII型用に別々のドメイン）、ヘパリン、フィブリン、およびインテグリンなどの細胞表面受容体に結合する。フィブロネクチンは血漿にも組織にも存在する。組織では、フィブロネクチンが、異なるタイプのECM分子と細胞を一つに連結するように機能する。これは、3つのアミノ酸Arg-Gly-Asp（RGD）から構成される重要な細胞結合ドメインも含有し、それが細胞の形質膜にあるインテグリン受容体によって認識される。細胞上のインテグリン受容体へのフィブロネクチン分子の結合は、細胞の付着、移動および分化を促進するシグナリング経路の刺激につながる。これらの特徴により、フィブロネクチンは細胞接着に重要な役割を果たすこと、および細胞とECMの構成要素との間のシグナルを伝達することが可能になる。
iv．グリコサミノグリカン（GAG）
GAGは、強く親水性である繰り返し二糖単位で構成された非分岐多糖鎖である。GAGは強く負に帯電しているので、浸透活性を持つNa+を誘引することにより、大量の水をその構造中に引き込んでECMを水和された状態に保つ。デルマタン硫酸などのGAGは、典型的には、線状のタンパク質コアから分岐した70〜200糖の長さのグリコサミノグリカン鎖（繰り返し二糖単位から形成されたもの）を多数含有している。その結果、GAGは、その質量と比較して非常に大きい体積を占め、極めて低い濃度でゲルを形成することになる。GAGの親水性は、ECMが圧縮圧に耐えることを可能にする膨潤圧（swelling pressure）または膨圧（turgor）を引き起こす。
ECMでは、GAGはECMタンパク質に結合してプロテオグリカンを形成するか、ヒアルロン酸（ヒアルロナンとも呼ばれる）の場合は、非プロテオグリカンマトリックス構成要素として存在する。細胞外プロテオグリカンは、ECMにおいて細胞の衝撃を和らげるのに役立つ、大きくて高度に水和された分子である。ヒアルロナンなどのグリコサミノグリカンは、その粘性および水和水によって間質コラーゲンマトリックスを通るバルク流体流に対する障壁を作り出すことにより、「礎質」（ground substance）に寄与している。ECMではプロテオグリカンおよび非プロテオグリカンGAGが会合して大きなポリマー複合体を形成する。これらは互いに会合すると共に、コラーゲンなどの線維性タンパク質とも会合する。
1）プロテオグリカン
ECMのプロテオグリカンを形成するGAGには、デルマタン硫酸およびコンドロイチン硫酸、ヘパリンおよびヘパラン硫酸、ならびにケラタン硫酸を含む、3つの主要タイプがある。一般に、プロテオグリカンは、95重量％が糖質であり、それらは、典型的には長い非分岐GAG鎖の形態をとっている。細胞の周りに水和した空間を提供することの他に、プロテオグリカンは、分子および細胞の輸送を調節し、シグナリング分子に結合することによって細胞活性化に役割を果たし、他の分泌タンパク質、例えばプロテアーゼおよびプロテアーゼインヒビターなどに結合することによって、分泌タンパク質の活性を調節する（Albertら「Cell Junctions, Cell Adhesions and the Extracellular Matrix」Molecular Biology of the Cell ニューヨーク：Garland Publishers、1994、972〜978頁）。例えば、プロテオグリカンのヘパリン硫酸鎖は、線維芽細胞増殖因子（FGF）を含むいくつかの異なる増殖因子に結合して、それらがその特異的細胞表面受容体に結合するのを助ける。
アグリカンは、主としてコンドロイチン硫酸およびヘパラン硫酸GAGを含有するプロテオグリカンであり、典型的には、軟骨に見いだされ、ヒアルロナンとの大きな凝集体を形成して機械的支持を提供している。デコリンは、主としてコンドロイチン硫酸およびデルマタン硫酸GAGから構成される、結合組織のもう一つの代表的GAGである。これはI型コラーゲン原線維に結合する。パーレカンおよびベータグリカンもECMの代表的プロテオグリカンである。全てのプロテオグリカンがECMと会合しているわけではなく、例えばセルグリシンは分泌小胞と会合していて、そこで分泌分子のパッケージングと貯蔵を助けており、シンデカンは細胞表面上に見いだされ、補助受容体として作用する（Albertら「Cell Junctions, Cell Adhesions and the Extracellular Matrix」Molecular Biology of the Cell、ニューヨーク：Garland Publishers、1994、972〜978頁）。
ヘパラン硫酸プロテオグリカン（HSPG）は、脊椎動物組織および無脊椎動物組織の広範囲にわたる細胞の細胞表面および細胞外マトリックス（ECM）と会合している遍在的高分子である（Wight, T.N., Kinsella, M.G.およびQwarnstromn, E.E. (1992) Curr. Opin. Cell Biol., 4,793-801；Jackson, R.L., Busch, S.J.およびCardin, A.L. (1991) Physiol. Rev., 71,481-539；Wight, T.N. (1989) Arteriosclerosis, 9,1-20；Kjellen, L.およびLindahl, U. (1991) Annu. Rev. Biochem., 60,443-475；ならびにRuoslahti, E.およびYamaguchi, Y. (1991) Cell, 64,867-869）。基本的なHSPG構造は、いくつかの線状ヘパラン硫酸鎖が共有結合しているタンパク質コアを有する。多糖鎖は、典型的には、N-およびO-結合硫酸部分およびN-結合アセチル基でさまざまな程度に置換された繰り返しヘキスロン酸およびD-グルコサミン二糖単位から構成される。細胞の付着、成長および分化へのECM分子の関与に関する研究により、胚形態形成、血管新生、転移、神経突起伸長および組織修復におけるHSPGの中心的役割が明らかになった。多数のタンパク質に結合する能力を有する点でユニークなヘパラン硫酸（HS）鎖は、広範囲にわたるさまざまなエフェクター分子が細胞表面に付着することを保証する。HSPGは血管の主立った構成要素でもある。それらは、大血管では、大部分が内膜および内側の中膜に濃縮されているのに対し、毛細管では、主として内皮下の基底膜に見いだされ、そこでは、増殖し移動する内皮細胞を支持し、毛細管壁の構造を安定化している。コラーゲン、ラミニンおよびフィブロネクチンなどのECM高分子と相互作用し、形質膜上の異なる付着部位と相互作用するというHSPGの能力から、ECM構成要素の自己集合および不溶性、ならびに細胞接着および移動運動における、このプロテオグリカンの重要な役割が示唆される。
2）ヒアルロン酸
ヒアルロン酸（HA；ヒアルロナンとも呼ばれる）は、水を誘引し、水と結合した場合には粘稠なゲル様の形態で存在する、大きなGAGである。したがってHAは、ゲル様結合組織を一つにまとめる潤滑剤としての役割を果たす。HAは、二糖類のポリマー（時には25,000リピートもの長さになる）であり、2つの修飾単糖、すなわちグルクロン酸およびN-アセチルグルコサミンの繰り返し単位から構成される。HAは多くの結合組織のECMの一部である。HAは皮膚に最も多量に見いだされ、身体のHAのほとんど50％が皮膚に見いだされる。HAは、水を結びつけることにより、皮膚に絶え間なく水分を供給する。加齢などによるHA産生量の減少は、しわの寄った不健康な皮膚をもたらす。
HAは、主としてその受容体CD44を介して、胚発生および胚形態形成、創傷治癒、修復および再生、炎症ならびに腫瘍の進行および浸潤時に、細胞の挙動を調節する機能も果たす（Haradaら (2006) J. Biol. Chem., 8:5597-5607）。HAはヒアルロニダーゼによって分解される。損傷した組織または成長中の組織、ならびにさまざまな炎症状態では、HAの分解産物を、増加した量で見いだすことができる。HAフラグメントは血管新生を促進し、組織損傷および皮膚移植時にマクロファージおよび樹状細胞によるサイトカイン産生を刺激することができる。
b．皮膚の組織構造
皮膚は、身体の温度を37℃という生理的温度に維持するのを助ける。皮膚は、いくつかの異なる層、主として表皮および真皮から構成される。表皮は外胚葉に由来する特殊化した上皮である。その下には真皮があり、これは、中胚葉の派生物であって、脈管緻密結合組織である。これらの2層は互いに堅く接着して、身体のさまざまな区域に、約0.5〜4mmの範囲のさまざまな全厚を持つ領域を形成する。真皮の下には、疎性（areolar）から脂肪性までさまざまな特徴を有する疎性結合組織の層がある。これを、皮下組織というが、典型的には、皮膚の一部ではないと見なされる。真皮は、層間を貫く結合組織線維によって皮下組織につながれている。
i．表皮
表皮は、真皮のすぐ上にある皮膚層であり、皮膚の表面層である。表皮の主要機能は、水分喪失、化学傷害および侵入病原体に対する保護障壁として作用することである。表皮は、主としてケラチノサイトから構成される厚さが約0.1〜1.5ミリメートルの約15の細胞層からなる薄い層である（Inlander, Skin, New York, N.Y.：People's Medical Society, 1-7 (1998)）。表皮はそれ自体、ケラチノサイトの分化の状態に基づいて、数層（例えば基底層、有棘層、顆粒層、透明層、角質層）に分割される。ケラチノサイトは基底層においてケラチノサイト幹細胞から派生する。ケラチノサイトは、成長し分裂するにつれて、徐々に分化を起こし、最終的に角質層に到達して、そこで、扁平上皮細胞と呼ばれる除核された扁平で高度に角化した細胞（角質細胞とも呼ばれる）の層を形成する。角質層は、角質細胞で構成されるだけでなく、皮脂も含有する。皮脂は、通常は毛髪で覆われた領域に毛包につながった状態で見いだされる皮脂腺によって分泌される。皮脂は、角質細胞を一つにまとめるのを助け、内部に水分を保持する弱酸性の層である。この酸性度は、皮脂を構成する両性アミノ酸、乳酸および脂肪酸の存在によるものである。したがって、皮膚表面のpHは通常5〜6であり、典型的には約5.5である。皮脂は、毛髪および皮膚に耐水性を持たせ、それらが乾燥し、脆くなり、ひび割れるのを防ぐように作用し、皮膚上での微生物の成長も阻害する。「酸外套」という用語は、皮膚の大半の領域に水溶性物質が存在することを指す。
ii．真皮
皮膚の結合組織は真皮と呼ばれる。真皮は厚さが1.5〜4ミリメートルである。皮膚では真皮がECM構成要素を含有し、主要なタンパク質構成要素はコラーゲンおよびエラスチンである。また真皮には、毛穴（pore）と呼ばれる皮膚（skill）の開口部または面皰から物質を分泌する汗腺および脂腺、毛包、神経終末、ならびに血管およびリンパ管を含む皮膚の構造物の大半が含まれている(Inlander, Skin, New York, N.Y.：People's Medical Society, 1-7 (1998)）。また、真皮は温度調節に役割を果たす血管も含有している。
iii．皮下組織
真皮の下には皮下組織がある。これは脂肪層であり、皮膚の最も深い層である。これは、体熱温存のための断熱材として、また器官保護のための緩衝装置として作用する（Inlander, Skin, New York, N.Y.：People's Medical Society, 1-7 (1998)）。また、皮下組織はエネルギー備蓄のためにも脂肪を貯蔵する。
c．ECMの疾患
一定の疾患および状態は、ECM構成要素の異常な発現または産生による細胞外マトリックスのアーキテクチャの欠陥または変化に起因する。例えば、創傷治癒時に起こるような一部の炎症状態では、サイトカインが分泌され、それが線維芽細胞を刺激してコラーゲンなどのECM構成要素を分泌させる。それらのECM構成要素は蓄積して局所的に沈着した状態になり、それが広範囲にわたる線維症状態をもたらす。マトリックス沈着は、多くの慢性炎症性疾患ならびに他の疾患および状態において頻出する特徴である。これらには、コラーゲン介在疾患状態、例えばケロイドおよび肥厚性瘢痕などの瘢痕、デュピュイトラン症候群、ペイロニー病およびリンパ浮腫などが含まれるが、これらに限るわけではない。セルライトも、よく知られるECMの疾患であり、これは、増加した脂肪生成性に加えて、コラーゲンの異常な線維性中隔ネットワークをもたらす結合組織マトリックスの変化を特徴とする（Rawlingsら (2006) Int. J Cos. Science, 28:175-190）。
マトリックス構成要素の蓄積と望ましくない沈着とをもたらすマトリックス構成要素の異常発現または過剰産生を特徴とするECMの疾患および症状は、本発明が提供するtsMMPによって処置することができる。インビボ投与時の上記酵素の一時的活性化により、上述した疾患および状態の処置は、マトリックス構成要素の酵素的分解を制限するように調節される。例えば、マトリックス分解の作用の持続時間を制限することにより、無制御なタンパク質分解に付随する望ましくない副作用が最小限に抑えられる。
2．マトリックスメタロプロテアーゼ
本発明は温度感受性である改変MMP（tsMMP）を提供する。本改変MMPには、高温よりも低温において増加した活性を呈するものが含まれ、低温よりも高温において増加した活性を呈するものも含まれる。tsMMPは組成物、組合せおよび容器として提供され、ECM介在疾患または状態を処置するための方法、プロセスおよび用途に使用することができる。MMPは、細胞外マトリックス（ECM）のタンパク質構成要素、例えば限定するわけではないが、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチンおよびプロテオグリカンなどを分解するマトリックス分解酵素である。本発明が提供する活性化可能なtsMMPは、1つまたはそれ以上のECM構成要素を分解するその能力により、組織のマトリックスを、特に1つまたはそれ以上の過剰なECMタンパク質による、またはコラーゲンなどの1つもしくはそれ以上のECMタンパク質に富む線維性組織の望ましくない蓄積による、構造的欠陥または構造変化を呈するものを、改変するために使用することができる。したがって、上記の酵素はECMタンパク質が関与する疾患または状態の処置に有用である。
a．機能
マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）は亜鉛依存性およびカルシウム依存性エンドペプチダーゼのファミリーである。例えばMMPは活性に必要な活性部位Zn2+を含有する。大半のMMPは細胞外マトリックスの分解に関与している。例えば、これらの酵素の多くは、基底膜および細胞外マトリックスの構成要素を切断することができる。これらは、組織リモデリング、例えば創傷治癒、妊娠および血管新生などのプロセスに関与する。また、MMPは、いくつかの細胞表面サイトカイン、受容体および他の可溶性タンパク質をプロセシングすることもできる。MMPのタンパク質分解活性は、生理学的および病理学的状態における組織リモデリングのエフェクター機序として作用し、炎症の調整因子としても作用する。MMPの過剰な合成および産生は、例えば骨ホメオスタシス、関節炎、がん、多発性硬化症および関節リウマチなどといった種々の疾患および状態に関連するECM分解の加速につながる。神経炎症性疾患に関連して、MMPは、（a）血液脳関門（BBB）および血液神経関門の開口、（b）血管由来免疫細胞による神経組織の侵害、（c）サイトカインおよびサイトカイン受容体の脱落、ならびに（d）末梢神経系および中枢神経系の疾患における直接的な細胞損傷などといったプロセスに関連づけられている（Leppertら, Brain Res. Rev. 36(2-3):249-57 (2001)；Borkakotiら, Prog. Biophys. Mol. Biol. 70(1):73-94 (1998)）。これらの酵素は、組織性マトリックスメタロプロテアーゼ阻害因子（TIMP）と呼ばれる内在性阻害因子によって、特異的に調節される。
b．構造および活性化
一般にMMPは、3つの共通するドメイン、すなわちプロペプチド、触媒ドメインおよびヘモペキシン様C末端ドメインを含有する。MMPはチモーゲンとして合成される。チモーゲンの活性化は、プロテアーゼが常に活性型で存在したとすると起こりうる望ましくないタンパク質分解を防止する。一般にチモーゲンは、プロテアーゼの活性部位を立体的にブロックし、プロテアーゼの活性部位への基質の接近を防止する、N末端部分（またはプロセグメントまたはプロ領域またはプロペプチド）を含有する。プロペプチドはポリペプチドを安定化するようにも作用する。チモーゲン型のMMPのプロペプチドは、サイズが約80〜100残基長の範囲にある。MMPのプロペプチドは、一般的には保存された配列PRCxxPD中に含まれるシステイン残基を含有する（例外はMMP-23であり、これは、決定的システインと、異なる周辺アミノ酸とを含有する）。このシステイン残基は、活性部位の亜鉛と相互作用して、基質の結合および切断を防止することにより、酵素を不活性型に保っている。したがって、プレプロ酵素型から分泌された時点では、プロ酵素（プロペプチドを含有するもの）は不活性である。例えば、MMP-1では、プロペプチドのシステイン残基が配列番号2に示すアミノ酸の配列におけるアミノ酸残基73に相当する。
MMPは活性化にプロセシングを必要とする。一般に、プロセシングは、プロペプチドの除去および/または酵素のコンフォメーション変化によるプロセシングされた成熟型の生成を伴う。MMPの活性には、プロペプチドの除去による酵素のプロセシングが必要である。本発明が提供するような条件付き活性を示さない通常のMMP（例えば野生型）の場合、プロセシングされた成熟型は活性酵素である。したがって、プロセシングされた成熟型の野生型MMPは酵素的に活性であり、したがってこれらの酵素については、これが活性型であると理解される。しかし、本発明が提供するtsMMPは、完全に活性になるには、さらに許容温度条件を必要とする。
プロセシング（およびそれによる活性化）は、プロセシング因子、例えば前もって活性化された他のMMPなどといったプロテアーゼによって；化学的活性化、例えばチオール修飾剤（酢酸4-アミノフェニル水銀、HgCl2およびN-エチルマレイミド）、酸化型グルタチオン、SDS、カオトロピック剤および反応性酸素などによって；および低いpHまたは熱処理によって誘導することができる。例えば下記表4に代表的なプロセシング因子を掲載する（Visseら (2003) Circ. Res., 92:827-839；Khanら (1998) Protein Science, 7:815-836；Okadaら (1988) Biochem J., 254:731-741；OkadaおよびNakanashi (1989) FEBS Lett., 249:353-356；Nagaseら (1990) Biochemistry, 29:5783-5789；Koklitisら (1991) Biochem J., 276:217-221；Springmanら (1990) PNAS, 87:364-8；Murphyら (1997) Matrix Biol., 15:511-8も参照されたい）。
［表4］チモーゲン活性化因子（すなわちプロセシング因子）
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MMPの活性化は段階的に起こる。例えば、プロテアーゼによる活性化では、まず最初に、プロペプチドの第1ヘリックスと第2ヘリックスの間に見いだされる露出したループ領域であるベイト（bait）領域（プロMMP-1（配列番号2）のアミノ酸32〜38に相当）のタンパク質分解的攻撃が起こる。ベイト領域の配列が切断特異性を付与する。最初の切断に続いて残りのプロペプチドが不安定になり、他の部分活性MMP中間体または活性MMPによる分子間プロセシングを可能にする。例えば、プロテアーゼであるプラスミンは、プロMMP-1とプロMMP-3をどちらも活性化する。ひとたび活性化されると、MMP-3は、プロMMP-1の最終活性化を達成する。あるいは、APMAなどの化学薬品による活性化が、まず最初に、プロペプチドシステイン残基の修飾を引き起こし、それが次に、プロペプチドの部分的活性化と分子内切断を引き起こす。次に、残りのプロペプチドセグメントが、他のプロテアーゼまたはMMPによってプロセシングされる。
メタロプロテイナーゼは、触媒活性にとって必要な酵素の活性中心にZn2+イオンを含有する。一般にこれらの酵素は、共通する亜鉛結合モチーフ（HExxHxxGxxH）をその活性部位に有し、活性部位の後に、保存されたメチオニンターンを有する。メタロプロテイナーゼの活性部位における亜鉛結合モチーフは、そのイミダゾール側鎖がZn2+への配位子になっている2つのヒスチジン残基を含む。触媒作用の際は、Zn2+が、活性部位における水分子の酸素原子によるカルボニル炭素への求核攻撃を促進する。活性部位塩基（カルボキシペプチダーゼ中のグルタミン酸残基）は、攻撃する水分子からプロトンを引き抜くことによって、この反応を容易にする。したがって、グルタミン酸（E）残基は、亜鉛に結合したH2O分子を活性化し、それによって、ペプチド結合を切断する求核剤を与える。これらのヒスチジンのいずれか1つの突然変異は、触媒活性を消失させる。触媒ドメインは、亜鉛結合モチーフの両側に、2つのカルシウム結合部位も含有する。これらのCa2+結合部位は高度に保存されたGlu-およびAsp-リッチ領域であると特徴づけられる。
多くのMMPは柔軟なプロリンリッチヒンジ領域も含有し、これは、約75アミノ酸までの長さであるが、構造は不明である。MMPは、基質認識の機能を果たし、阻害因子、特に組織性メタロプロテイナーゼ阻害因子（TIMP）とも相互作用する、ヘモペキシン様C末端ドメインも含有する。MMP-7、MMP-23およびMMP-26はヘモペキシンドメインを含有しない。MMP-2およびMMP-9は、触媒ドメイン中に、これらの酵素にゼラチン結合特性を付与するフィブロネクチンII型モジュールの3つのタンデムリピートから構成されるインサートも含有する。
25を超えるMMPが知られており、それらは、機能、基質特異性および/または配列類似性に基づいて、異なるファミリーに分類される。MMPのファミリーには、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ、ストロメライシンおよびマトリライシンが含まれる。さまざまなファミリーの中で、一部のMMPは追加のドメインを含有する。例えば膜型MMPは膜貫通ドメインまたはGPIアンカリングドメインを含有する。代表的なMMPを表5に示す。代表的プロテアーゼのそれぞれについて、前駆体ポリペプチドのヌクレオチド配列およびコードされているアミノ酸配列に関する配列識別子（配列番号）を、表に記載する。プロプロタンパク質およびチモーゲンが活性化された（zymogen-activated）プロセシングされた成熟型のタンパク質（プロペプチドを欠くもの）のアミノ酸配列に関する配列識別子（配列番号）も、表に記載する。ドメインの位置も示す。当業者はそのようなドメインについて精通しており、他のそのようなドメインとの構造的および/または機能的相同性に基づいて、それらを同定することができる。ポリペプチドおよびそのドメインの記述は、類似するポリペプチドとの相同性解析およびアラインメントに基づいて、理論的に導き出されると理解される。したがって、正確な個所は変動することがあり、各ポリペプチドについて必ずしも同じではない。MMPの変異は、対立遺伝子変異体および種変異体ならびに当技術分野で知られる他の変異体の間にも存在し、以下に説明する活性化可能なtsMMPとしての改変には、そのような変異体も考えられる。表には、各酵素について、代表的なECM標的基質も示す。そのような基質への言及は参考までに例示するものであって、全ての標的基質の網羅的リストを表すものではない。当業者は、所望の酵素のECM標的基質を知っているか、または本明細書に記載するような常用のアッセイを使って、それを経験的に決定することができる。
［表5］メタロプロテアーゼ
Figure 2012519494
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3．マトリックスメタロプロテアーゼ1（MMP-1）
MMP-1（コラゲナーゼとも呼ばれる）は、プレプロコラゲナーゼ（配列番号1）をもたらす配列番号708に示す核酸分子によってコードされ、このプレプロコラゲナーゼは翻訳時にプロセシングを受けてプロコラゲナーゼチモーゲン型（配列番号2）を生成する。プロコラゲナーゼは、80アミノ酸のプロペプチド（配列番号2に示すアミノ酸の配列のアミノ酸残基1〜80に相当）、162アミノ酸の触媒ドメイン（配列番号2に示すアミノ酸の配列のアミノ酸残基81〜242に相当）、16残基のリンカー（配列番号2に示すアミノ酸の配列のアミノ酸残基243〜258に相当）および189アミノ酸残基のヘモペキシン（Hpx）ドメイン（配列番号2に示すアミノ酸の配列のアミノ酸残基259〜450に相当）を含有している。プロセシングされると、プロペプチドが除去されて、配列番号709に示すアミノ酸の配列を有するプロセシングされた成熟型が生じる。
上述のように、MMP-1は、皮膚の最も豊富なタンパク質であるコラーゲンI型およびコラーゲンIII型を切断する。これらのコラーゲンタイプは、本明細書のセクションIで説明するように、ECMの状態の多くと関連している。これに対し、他のコラーゲン、例えばコラーゲンIV型は、血管の基底層の主要構成要素である。したがって、IV型コラーゲンを標的にすることは漏出性血管につながる可能性があり、これは、本明細書に記載する細胞外マトリックスを標的にすることを意図した処置の副作用になりうる。例えば、セルライトの既知の処置法である細菌コラゲナーゼは、出血を誘発しうる（例えばVargaftigら (2005) Inflammation Research, 6:627-635）。したがって、ECMの状態を処置するための治療剤としてMMP-1を使用すること、特に条件的にまたは時間的に制御することができるtsMMP-1を使用することの利点は、それがIV型コラーゲンを切断しないことである。
D．改変マトリックスメタロプロテアーゼ1ポリペプチド
本発明は改変MMP-1ポリペプチドを提供する。ある例において、本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドは温度感受性を呈し、改変ポリペプチドは、非許容温度よりも許容温度において、高い活性を呈する。本発明は、改変を含有しない無改変MMP-1（例えば野生型）と比較して、許容温度でも非許容温度でも増加した活性を呈する改変MMP-1ポリペプチドも提供する。もう一つの例において、本発明は、温度感受性と活性の両方を増加させる改変を呈する改変MMP-1ポリペプチドを提供する。
出発無改変基準ポリペプチドの、本発明が提供する改変には、アミノ酸の置き換えもしくは置換、アミノ酸の付加もしくは欠失、またはそれらの任意の組合せが含まれる。例えば、改変MMP-1ポリペプチドには、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上の改変位置を伴うものが含まれる。本発明は、出発基準MMP-1ポリペプチドと比較して2つまたはそれ以上の改変を伴う改変MMP-1ポリペプチドも提供する。改変MMP-1ポリペプチドには、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上の改変位置を伴うものが含まれる。いくつかの例において、本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドは改変を一つだけ含有する。別の例において、本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドは、2、3、4、5または6個の改変を含有する。さらなる例では、結果として生じる改変MMP-1ポリペプチドが、プロセシングされた成熟型である時に酵素活性を保持している限り、本発明が提供する任意の改変を、当業者に知られる他の任意の改変と組み合わせることができる。改変MMP-1が温度感受性を付与する突然変異を含有する場合、そのような組合せ突然変異体の酵素活性は、非許容温度と比較して、許容温度では高くなる。本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドは、酵素活性を保持しているものを同定するために、さまざまな条件下（例えば許容温度および非許容温度）で酵素活性についてアッセイすることができる。
MMP-1ポリペプチドにおける改変は、不活性（例えばチモーゲン）型またはプロセシングされた成熟型（活性化型）、対立遺伝子変異体および種変異体、スプライス変異体、当技術分野で知られる変異体、またはハイブリッドもしくはキメラMMP-1ポリペプチドを含む、任意の形態のMMP-1ポリペプチドに対して行うことができる。例えば、本発明が提供する改変は、配列番号1に示す前駆体MMP-1ポリペプチド、配列番号2に示すプロペプチドを含有する不活性プロ酵素MMP-1、配列番号709に示すプロペプチドを欠く成熟MMP-1ポリペプチド、または配列番号1、2もしくは709に示すMMP-1ポリペプチドのいずれかに対して40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する任意の種、対立遺伝子もしくは改変変異体、およびそれらの活性フラグメントにおいて行うことができる。改変は、そのMMP-1ポリペプチドが酵素活性を保持している限り、1つまたはそれ以上のドメインを欠くMMP-1ポリペプチドにおいて行うことができる。例えば改変は、配列番号2に示すプロ酵素MMP-1ポリペプチドの触媒ドメイン（アミノ酸81〜242に相当）だけを含むMMP-1ポリペプチドにおいて行うことができる。改変は、プロリンリッチリンカー（配列番号2に示すプロ酵素MMP-1ポリペプチドのアミノ酸243〜258に相当）の全部または一部を欠く、および/またはヘモペキシン結合ドメイン（配列番号2に示すプロ酵素MMP-1ポリペプチドのアミノ酸259〜450に相当）の全部または一部を欠く、MMP-1ポリペプチドにおいて行うこともできる。MMP-1ポリペプチドの対立遺伝子変異体および他の変異体には、配列番号3506および3549に示す任意の1つまたはそれ以上のアミノ酸変異体を含有する任意のMMP-1ポリペプチドが含まれるが、これらに限るわけではない。本発明における改変のための代表的種変異体には、例えば配列番号3459〜3464のいずれかに示すブタ、ウサギ、ウシ、ウマ、ラット、およびマウスが含まれるが、これらに限るわけではない。
本発明が提供するMMP-1ポリペプチド、例えば、温度感受性および/または増加した活性を付与する改変を含有するMMP-1における改変は、他の改変、例えば一次配列の改変およびポリペプチドの一次配列ではない部分の改変を含む当技術分野において記載があるものをも含有するMMP-1ポリペプチドに対して行うことができる。対立遺伝子変異体もしくは種変異体または他の変異体における改変には、例えば活性型または不活性型、触媒ドメインのみを含む形態、またはプロリンリッチリンカーもしくはヘモペキシン結合ドメインの全部または一部を欠く形態など、その任意の形態における改変が含まれると理解される。後述するように、対応するMMP-1改変を、他のMMPポリペプチドの類似する形態に対して行うことができる。
したがって、結果として生じる改変MMP-1ポリペプチドには、不活性なチモーゲンプロ酵素であるもの、およびプロセシングされた成熟ポリペプチドであるものが含まれる。例えば、チモーゲンプロ酵素である本発明が提供する改変ポリペプチドはいずれも、プロセシングされた成熟MMP-1ポリペプチドを生成させるためのプロセシング因子によって活性化することができる。MMP-1ポリペプチドの活性は、典型的には、プロペプチドの切断および/または酵素の分子間および分子内プロセシングによるプロペプチドの除去後に、そのプロセシングされた成熟型において呈される（例えばVisseら (2003) Cir. Res., 92:827-839参照）。本明細書の他の項で述べるように、完全に活性であるためには、tsMMPは許容温度を必要とする。
本発明が提供する改変は、当業者に常用されている標準的組換えDNA技法によって行うことができる。標的タンパク質における任意の1つまたはそれ以上のアミノ酸の突然変異を達成するために当技術分野で知られている方法はいずれも使用することができる。コード核酸分子の標準的な部位特異的突然変異誘発法（例えばStratageneから入手することができるQuikChangeなどのキットを使用する方法）または固相ポリペプチド合成法による方法などがある。
例えば限定するわけではないが、糖質部分の付加、ポリエチレングリコール（PEG）部分の付加、Fcドメインの付加など、ポリペプチドの一次配列におけるまたは一次配列以外の部分における他の改変も、改変MMP-1ポリペプチドに含めることができる。例えばそのような追加の改変は、タンパク質の安定性または半減期を増加させるために行うことができる。
そのような改変MMP-1ポリペプチドの代表例は、配列番号3〜705、779〜3458および3532のいずれかに示すもの、ならびにそのプロセシングされた成熟型および他の形態、ならびにその対立遺伝子変異体および種変異体である。
1．温度感受性マトリックスメタロプロテアーゼ1（tsMMP-1）突然変異体
本発明は、無改変MMP-1ポリペプチドと比較してポリペプチドの一次配列における改変ゆえに温度感受性であるtsMMP-1ポリペプチドを提供する。tsMMP-1ポリペプチドは、非許容温度におけるtsMMP-1ポリペプチドの活性と比較して、許容温度では増加した酵素活性を呈する。例えば本発明が提供するtsMMP-1ポリペプチドは、37℃未満の低温において、例えば18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃もしくは30℃またはその前後、特に18℃〜25℃またはその前後、例えば25℃またはその前後である低温において、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃もしくは39℃またはその前後、特に34℃もしくは37℃またはその前後である非許容高温と比較して、増加した酵素活性を呈する。tsMMP-1ポリペプチドの温度依存的活性により、MMP-1の活性は、条件的に制御することができ、それによって、ECMの長期間にわたる望ましくない分解を防ぐために、活性化を時間的に調節することができる。特に、そのようなtsMMP-1ポリペプチドは、ECMの疾患または状態を処置するための用途、プロセスまたは方法に、例えばセルライトなどのコラーゲン介在疾患または状態を処置するために、使用することができる。
本発明が提供するtsMMP-1ポリペプチドは、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100またはその前後もしくはそれ以上の、非許容温度と比較した許容温度における活性の比を有する。したがって、非許容温度における、本発明が提供するtsMMP-1ポリペプチドの活性は、許容温度における活性の70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％またはその前後もしくはそれ未満である。本発明が提供するtsMMP-1ポリペプチドは、許容温度における野生型MMP-1ポリペプチドの1つまたはそれ以上の活性、例えばコラーゲンなどのECM構成要素を切断する酵素活性などを保持している。典型的には、そのような活性は、野生型または出発タンパク質と比較して、実質的に不変（1％、5％、10％、20％または30％未満の変化）である。他の例では、改変MMP-1ポリペプチドの活性が、野生型または出発MMP-1ポリペプチドと比較して、増加または減少する。活性は許容温度で評価され、許容温度または非許容温度における出発無改変MMP-1ポリペプチド（すなわち改変を含有しないポリペプチド）の活性と比較される。例えば、本発明が提供するtsMMP-1ポリペプチドは、許容温度または非許容温度における野生型MMP-1の活性の10％、20％、30％、40％、50％、60％,70％、80％、90％、100％、110％、120％、140％、150％またはその前後もしくはそれ以上である活性を許容温度において保持している。活性は、インビトロ、エクスビボまたはインビボで評価することができ、無改変MMP-1ポリペプチド、例えばプロセシング因子によって活性化された配列番号2に示す不活性MMP-1ポリペプチド、または出発物質として使用される当業者に知られる他の任意のMMP-1ポリペプチドのそれと比較することができる。本明細書の他の項で論じるように、MMP-1または改変MMP-1のチモーゲン不活性型は、使用前または活性の測定前に、活性にとって必要なプロセシングされた成熟型へとプロセシングされなければならないと理解される。
代表的な温度感受性改変
本発明は、出発無改変MMP-1ポリペプチド中に1つまたはそれ以上のアミノ酸改変を含有する改変tsMMP-1ポリペプチドを提供する。典型的には、改変はアミノ酸の置き換えである。1つまたは複数のアミノ酸の置き換えは、配列番号2に示すアミノ酸の配列を有する無改変MMP-1ポリペプチドの位置84、85、95、98、99、100、103、104、105、106、109、110、111、112、118、123、124、126、147、150、151、152、153、155、156、158、159、170、171、176、178、179、180、181、182、183、185、187、188、189、190、191、192、194、195、197、198、206、207、208、210、211、212、218、223、227、228、229、230、233、234、237、240、251、254、255、256、257、258、259のいずれかに対応する任意の1つまたはそれ以上の位置にあるか、または配列番号2に示すMMP-1ポリペプチドに対して少なくとも60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはその前後もしくはそれ以上の配列同一性を有するMMP-1ポリペプチドの対立遺伝子変異体もしくは種変異体または他の変異体における対応する位置にあることができる。アミノ酸の置き換えには、酸性（DまたはE）；塩基性（H、KまたはR）；中性（C、N、Q、T、Y、S、G）または疎水性（F、M、W、I、V、L、A、P）アミノ酸残基へのアミノ酸の置き換えが含まれる。例えば、記載の位置におけるアミノ酸の置き換えには、アミノ酸残基E、H、R、C、Q、T、S、G、M、W、I、V、L、A、P、N、F、D、YまたはKによる置き換えが含まれる。
そのような改変MMP-1ポリペプチドには、34℃または37℃の非許容温度と比較して25℃の許容温度における増加した活性ゆえに温度感受性である、MMP-1ポリペプチドが含まれる。例えば、本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドとして、T84F（すなわち、配列番号2に示すMMP-1ポリペプチドの位置84に対応する位置におけるTのFによる置き換え）、E85F、L95K、L95I、R98D、I99Q、E100V、E100R、E100S、E100T、E100F、E100I、E100N、T103Y、P104A、P104M、D105A、D105F、D105G、D105I、D105L、D105N、D105R、D105S、D105T、D105W、D105E、L106C、L106S、A109H、D110A、V111R、D112S、A118T、S123V、N124D、T126S、G147P、R150P、R150V、R150D、R150I、R150H、D151G、N152A、N152S、S153T、F155L、F155A、D156H、D156L、D156A、D156W、D156V、D156K、D156T、D156R、D156M、P158T、P158G、P158K、P158N、G159V、G159T、G159M、G159I、G159W、G159L、G159C、P170D、P170A、G171P、G171E、G171D、A176F、A176W、F178T、F178L、D179N、D179V、D179C、E180Y、E180R、E180T、E180F、E180G、E180S、E180N、E180D、D181T、D181L、D181K、D181C、D181G、E182T、E182Q、E182M、E182G、R183G、R183S、T185R、T185Y、T185H、T185G、T185V、T185Q、T185A、T185E、T185D、N187R、N187M、N187W、N187F、N187K、N187I、N187A、N187G、N187C、N187H、F188V、R189N、R189T、R189Q、E190G、E190Y、E190D、Y191V、N192H、N192S、N192D、N192C、H194P、R195C、R195W、R195L、R195G、R195Q、R195A、R195D、R195V、A197C、A197V、A198G、A198L、A198M、G206A、G206S、L207R、L207V、L207I、L207G、S208R、S208L、S210V、S210A、T211L、D212G、D212H、Y218S、F223C、F223E、F223G、F223A、F223S、F223K、F223M、V227C、V227D、V227E、V227L、V227S、V227W、V227G、V227H、V227Q、V227R、Q228P、L229A、L229T、L229I、A230V、D233E、I234A、I234T、I234E、I234Q、I237L、I237W、I237N、I240S、I240A、I240C、I251S、I251W、Q254S、T255H、P256C、K257P、K257T、A258PおよびC259Qの任意の1つまたはそれ以上の改変に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを挙げることができる。代表的な改変MMP-1ポリペプチドは、配列番号6、18、22、25、27、29、31〜33、35〜36、38〜39、41、43、55〜56、59、70、95〜96、99〜101、105、110〜111、113〜115、122、125、129〜133、148、150、159〜160、170、174、177、179、181〜185、195、197、200、203、209、218〜219、222、224、231〜233、235、238〜239、241、246、248、252〜255、260〜264、267、269、273、275、279、282、284〜286、299、301、305、317、324、341、343、354、365、367、369、374〜376、381、383〜385、387〜388、390、393〜394、397、399、420、429、436、438、440、460、466〜467、476、483、488、495、500、502、504、506、508、511〜512、524、543、554〜555、572〜573、581、583、607、611、613、616、620、648、653、660、664〜665、669、678、703、847、866、1083、1109、1172、1177、1183、1188、1237、1271、1277、1301、1414、1516、1520、1567、1975、2023、2031、2075、2078、2080、2083、2281、2299、2403、2411、2423〜2424、2486、2495〜2497、2552、2563、2703、2715、2753、3066、3074、3076、3317、3321、3373、3385、3407、3439、3428、3458、3532のいずれかに示すアミノ酸の配列、ならびにそのプロセシングされた成熟型および他の形態、ならびにその対立遺伝子変異体および種変異体を有する。
いくつかの例では、そのような改変MMP-1ポリペプチドとして、配列番号2に示すアミノ酸の配列を有する無改変MMP-1ポリペプチドの位置95、100、103、105、150、151、153、155、156、159、171、176、179、180、181、182、185、187、190、191、192、194、195、198、206、207、210、212、218、223、227、228、229、230、233、234、237、240および259のいずれかに対応する任意の1つまたはそれ以上の位置、または配列番号2に示すMMP-1ポリペプチドに対して少なくとも60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはその前後もしくはそれ以上の配列同一性を有するMMP-1ポリペプチドの対立遺伝子変異体もしくは種変異体または他の変異体における対応する位置に、1つまたは複数のアミノ酸の置き換えを有するポリペプチドが挙げられる。例えば、本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドには、L95K、E100V、T103Y、D105A、D105F、D105G、D105I、D105L、D105N、D105R、D105S、D105T、D105W、R150P、D151G、S153T、F155L、F155A、D156H、D156L、D156A、D156W、D156V、D156K、D156T、D156R、G159V、G159T、G171P、A176F、D179N、E180Y、E180R、E180T、E180F、D181T、D181L、D181K、E182T、E182Q、T185R、T185Y、T185H、T185G、T185V、T185Q、T185A、T185E、N187R、N187M、N187W、N187F、N187K、N187I、N187A、E190G、Y191V、N192H、N192S、N192D、N192C、H194P、R195C、R195W、R195L、R195G、R195Q、R195A、R195D、R195V、A198G、A198L、A198M、G206A、G206S、L207R、L207V、S210V、D212G、Y218S、F223C、F223E、F223G、F223A、F223S、V227C、V227D、V227E、V227L、V227S、V227W、Q228P、L229A、L229T、L229I、A230V、D233E、I234A、I234T、I234E、I234Q、I237L、I240S、I240A、I240C、およびC259Qの任意の1つまたはそれ以上の改変に対応するアミノ酸改変を有するポリペプチドが含まれる。そのような改変MMP-1ポリペプチドは、34℃または37℃の非許容温度と比較して、25℃の許容温度では少なくとも1.2倍またはそれ以上の活性、例えば1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍またはそれ以上の活性を呈する。そのような改変MMP-1ポリペプチドの代表例は、配列番号6、25、27、29、31〜33、35〜36、38〜39、59、70、95〜96、99〜101、105、111、113〜115、125、132、148、160、177、181〜182、185、195、200、209、218〜219、232〜233、235、238〜239、241、246、248、253〜254、261〜264、267、269、273、275、279、282、284〜286、299、301、305、317、324、341、354、365、369、374〜375、381、383〜384、388、393、397、399、420、429、436、438、440、460、466〜467、476、483、488、495、512、524、543、572、583、607、611、613、616、620、648、653、665、678、703、3076および3532のいずれかに示すアミノ酸の配列、ならびにそのプロセシングされた成熟型および他の形態、ならびにその対立遺伝子変異体および種変異体を有する。
別の例では、そのような改変MMP-1ポリペプチドとして、配列番号2に示すアミノ酸の配列を有する無改変MMP-1ポリペプチドの位置95、105、150、151、155、156、159、176、179、180、181、182、185、187、195、198、206、210、212、218、223、227、228、229、230、233、234、240、259のいずれかに対応する任意の1つもしくはそれ以上の位置、または配列番号2に示すMMP-1ポリペプチドに対して少なくとも60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはその前後もしくはそれ以上の配列同一性を有するMMP-1ポリペプチドの対立遺伝子変異体もしくは種変異体または他の変異体における対応する位置に、1つまたは複数のアミノ酸の置き換えを有するポリペプチドが挙げられる。例えば、本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドには、L95K、D105A、D105F、D105G、D105I、D105L、D105N、D105R、D105S、D105T、D105W、R150P、D151G、F155A、D156K、D156T、D156L、D156A、D156W、D156V、D156H、D156R、G159V、G159T、A176F、D179N、E180Y、E180T、E180F、D181L、D181K、E182T、E182Q、T185R、T185H、T185Q、T185A、T185E、N187R、N187M、N187F、N187K、N187I、R195V、A198L、A198M、G206A、G206S、S210V、Y218S、F223E、V227C、V227E、V227W、Q228P、L229T、L229I、D233E、I234A、I234T、I234E、I240S、I240CおよびC259Qの任意の1つまたはそれ以上の改変に対応するアミノ酸改変を有するポリペプチド含まれる。そのような改変MMP-1ポリペプチドは、34℃または37℃の非許容温度と比較して、25℃の許容温度では、少なくとも1.5倍またはそれ以上の活性、例えば1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、15、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍またはそれ以上の活性を呈する。そのような改変MMP-1ポリペプチドの代表例は、配列番号6、25、27、29、31〜33、35〜36、38〜39、59、70、96、99〜101、105、111、113〜115、125、132、148、160、181〜182、185、195、209、218〜219、232〜233、235、238、248、253〜254、261〜262、264、284、301、305、317、324、341、354、365、384、388、397、420、429、436、440、460、467、476、483、488、3532のいずれかに示すアミノ酸の配列、ならびにそのプロセシングされた成熟型および他の形態、ならびにその対立遺伝子変異体および種変異体を有する。
さらなる例では、本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドとして、25℃の許容温度で温度感受性であり、25℃における野生型MMP-1と比較して、25℃で、少なくとも30％、例えば30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、140％、150％またはそれ以上の活性を呈する改変MMP-1ポリペプチドが挙げられる。例えば、野生型MMP-1と比較して増加した活性を呈するtsMMP-1ポリペプチドには、配列番号2に示すアミノ酸の配列を有する無改変MMP-1ポリペプチドの位置95、105、150、156、159、179、180、182、185、187、195、198、212、223、227、234、および240のいずれかに対応する1つまたはそれ以上の位置、または配列番号2に示すMMP-1ポリペプチドに対して少なくとも60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはその前後もしくはそれ以上の配列同一性を有するMMP-1ポリペプチドの対立遺伝子変異体もしくは種変異体または他の変異体における対応する位置に、1つまたは複数のアミノ酸の置き換えを有するポリペプチドが含まれる。例えば、野生型MMP-1と比較して25℃の許容温度において増加した活性を有する、本発明が提供する改変tsMMP-1ポリペプチドには、L95K、D105A、D105G、D105I、D105L、D105N、D105S、D105W、D105T、R150P、D156K、D156T、D156V、D156H、D156R、G159V、G159T、D179N、E180Y、E180T、E180F、E182T、T185H、T185Q、T185E、N187M、N187K、N187I、R195V、A198L、F223E、V227E、I234EおよびI240Sの任意の1つまたはそれ以上の改変に対応するアミノ酸改変を有するポリペプチドが含まれる。そのような改変MMP-1ポリペプチドの代表例は、配列番号6、27、29、31〜32、35〜36、38〜39、59、99〜101、105、113、125、132、160、181〜182、185、219、232〜233、238、253、262、264、284、305、365、384、460、488に示すアミノ酸の配列、またはそのプロセシングされた成熟型および他の形態、ならびにその対立遺伝子変異体および種変異体を有する。
特に、温度感受性である、本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドは、配列番号2に示すアミノ酸の配列を有する無改変MMP-1ポリペプチドの位置95、105、150、156、159、179、180、182、185、187、198、227、234および240のいずれかに対応する1つまたはそれ以上の位置、または配列番号2に示すMMP-1ポリペプチドに対して少なくとも60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはその前後もしくはそれ以上の配列同一性を有するMMP-1ポリペプチドの対立遺伝子変異体もしくは種変異体または他の変異体における対応する位置に、1つまたは複数のアミノ酸の置き換えを有する。そのような本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドには、L95K、D105I、D105N、D105L、D105A、D105G、R150P、D156R、D156H、D156K、D156T、G159V、G159T、D179N、E180T、E180F、E182T、T185Q、N187I、A198L、V227E、I234EおよびI240Sの任意の1つまたはそれ以上の改変に対応するアミノ酸改変を有するポリペプチドが含まれる。より具体的には、本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドには、L95K、D105N、R150P、D156K、D156T、G159V、D179N、E180T、A198L、V227E、およびI240Sの任意の1つまたはそれ以上の改変に対応するアミノ酸改変を有するポリペプチドが含まれる。
本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドには、可逆性または不可逆性（非可逆性ともいう）の温度依存的活性を呈するものが含まれる。いずれの場合も、上記本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドは、非許容温度（例えば34℃または37℃）と比較して許容温度（例えば25℃）では増加した活性を呈する。非可逆性ポリペプチドの場合、許容温度へのばく露の前、許容温度へのばく露の後、または許容温度へのばく露とは断続的に非許容温度にばく露すると、ポリペプチドは不可逆的に不活性になる。したがって、温度許容条件、例えば25℃に戻した改変MMP-1ポリペプチドは、非許容温度、例えば34℃または37℃におけるMMP-1ポリペプチドと同じまたは類似する活性を呈する。例えば、許容条件に戻した場合、本発明が提供する不可逆性改変MMP-1ポリペプチドは、非許容温度における活性の50％、60％、70％、80％、90％、100％、105％、110％、115％、もしくは120％またはその前後を呈する。本発明が提供する非可逆性改変MMP-1ポリペプチドの代表例には、L95K、D105I、D105L、D105N、D105R、D105W、D151G、F155A、D156K、D156T、D156L、D156A、D156W、D156V、D156H、D156R、G159V、A176F、D179N、D181L、D181K、E182T、E182Q、T185R、N187F、N187I、G206A、G206S、V227C、V227E、Q228E、L229T、D233E、I234A、I234T、I234E、I240Sの任意の1つまたはそれ以上の改変に対応するアミノ酸改変を有するポリペプチド、例えば配列番号6、25、27、35〜36、38、70、96、99〜101、105、111、113〜115、132、148、160、195、209、218〜219、235、261、264、317、324、384、388、403、429、440、460、467、476、488のいずれかに示すもの、またはそのプロセシングされた成熟型および他の形態、ならびにその対立遺伝子変異体および種変異体が含まれる。
可逆性ポリペプチドの場合、許容温度へのばく露の前、許容温度へのばく露の後、または許容温度へのばく露とは断続的に非許容温度にばく露すると、ポリペプチドは可逆的に活性になる。したがって、温度許容条件に戻した改変MMP-1ポリペプチドは活性を回復し、よって、非許容温度と比較して許容温度では増加した活性を呈する。そのような例において、回復する活性は、完全である場合も、部分的である場合もある。したがって、温度許容条件、例えば25℃に戻した改変MMP-1ポリペプチドは、非許容温度、例えば34℃または37℃における活性と比較して増加した活性を呈する。例えば、許容条件に戻した場合、本発明が提供する可逆性改変MMP-1ポリペプチドは、非許容温度における活性の120％、125％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、200％またはその前後もしくはそれ以上を呈する。本発明が提供する可逆性改変MMP-1ポリペプチドの代表例には、D105A、D105F、D105G、D105S、D105T、R150P、G159T、E180Y、E180T、E180F、T185H、T185Q、T185A、T185E、N187R、N187M、N187K、R195V、A198L、A198M、S210V、Y218S、F223E、V227W、L229IおよびI240Cの任意の1つまたはそれ以上の改変に対応するアミノ酸改変を有するポリペプチド、例えば配列番号29、31〜33、39、59、125、181〜182、185、232〜233、238、248、253〜254、262、284、301、305、341、354、365、397、436、483のいずれかに示すもの、またはそのプロセシングされた成熟型および他の形態、ならびにその対立遺伝子変異体および種変異体が含まれる。
2．マトリックスメタロプロテアーゼ1活性突然変異体
本発明は、許容温度および非許容温度において野生型MMP-1と比較して増加した活性を呈する改変MMP-1ポリペプチドも提供する。本発明が提供するtsMMP-1ポリペプチドとは異なり、上記活性突然変異体は、許容温度でも非許容温度でも、改変を含有しないMMP-1（例えば野生型）と比較して、増加した活性を呈する。例えば、本発明が提供する改変MMP-1は、37℃未満の低温、例えば18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃もしくは30℃またはその前後、特に18℃〜25℃、例えば25℃またはその前後である低温において、野生型と比較して増加した活性を有する。増加した活性を有する、本発明が提供する改変MMP-1は、野生型と比較して、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃もしくは39℃またはその前後、特に34℃もしくは37℃またはその前後である高温でも、増加した活性を呈する。本発明が提供する改変MMP-1は、同じ温度（許容または非許容）において、改変を含有しないMMP-1（例えば野生型）よりも、1.1倍、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、20.0倍またはそれ以上増加した活性を呈する。例えば、本発明が提供する改変MMP-1は、同じ温度（許容または非許容）において、改変を含有しないMMP-1（例えば野生型）よりも、110％、120％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、190％、200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％またはそれ以上増加した活性を呈する。
典型的には、改変はアミノ酸の置き換えである。1つまたは複数のアミノ酸の置き換えは、配列番号2に示すアミノ酸の配列を有する無改変MMP-1ポリペプチドの位置81、84、85、86、87、89、104、105、106、107、108、109、124、131、133、134、135、143、146、147、150、152、153、154、157、158、160、161、164、166、167、180、183、189、190、207、208、211、213、214、216、218、220、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、235、236、238、239、244、249、254、256、257、258のいずれかに対応する1つまたはそれ以上の位置、または配列番号2に示すMMP-1ポリペプチに対して少なくとも60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはその前後もしくはそれ以上の配列同一性を有するMMP-1ポリペプチドの対立遺伝子変異体もしくは種変異体または他の変異体における対応する位置にあることができる。アミノ酸の置き換えには、酸性（DまたはE）；塩基性（H、KまたはR）；中性（C、N、Q、T、Y、S、G）または疎水性（F、M、W、I、V、L、A、P）アミノ酸残基へのアミノ酸の置き換えが含まれる。例えば、記載の位置におけるアミノ酸の置き換えには、アミノ酸残基E、H、R、C、Q、T、S、G、M、W、I、V、L、A、P、N、F、D、YまたはKによる置き換えが含まれる。
例えば、本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドとして、F81L（すなわち、配列番号2に示すMMP-1ポリペプチドの位置81に対応する位置におけるFのLによる置き換え）、F81A、F81G、F81Q、F81R、F81H、T84H、T84L、T84D、T84R、T84G、T84A、E85S、E85V、G86S、N87P、N87R、N87G、N87Q、R89A、R89T、R89G、R89K、P104E、P104D、P104Q、D105V、L106V、P107T、P107S、P107A、R108E、R108A、R108K、R108S、A109S、A109R、A109G、A109M、A109V、N124G、T131D、K132R、V133T、V133L、S134E、S134D、E135M、S143I、R146S、G147R、G147F、R150E、R150G、R150M、T150T、R150A、R150N、R150K、R150L、R150V、R150D、N152G、N152F、N152L、N152I、S153T、S153P、S153F、S153D、S153Y、P154S、P154I、G157F、P158V、P158I、G160Q、N161L、N161R、N161Y、N161E、N161T、N161I、N161V、N161F、N161Q、H164S、F166W、Q167R、Q167A、Q167S、Q167F、Q167P、Q167T、Q167V、Q167M、E180D、R183S、R189N、R189T、R189Q、E190D、L207M、S208K、S208R、S208L、T211N、I213G、G214L、G214E、L216I、Y218W、S220R、S220A、S220Q、S220T、S220G、S220M、S220V、S220N、T222R、T222P、T222S、T222F、T222N、F223Y、F223H、2224Q、S224K、S224D、G225Q、G225E、G225H、D226S、D226E、D226P、D226I、V227T、Q228A、Q228D、Q228E、Q228G、Q228H、Q228K、Q228L、Q228M、Q228N、Q228R、Q228S、Q228T、Q228W、Q228Y、L229Q、L229P、L229V、A230G、A230W、A230D、A230I、A230S、A230C、A230V、A230T、A230M、A230N、A230H、Q231I、Q231A、Q231F、Q231D、Q231G、Q231V、Q231W、Q231S、Q231H、Q231M、D232H、D232G、D232R、D232P、D232Y、D232S、D232F、D232V、D232K、D232W、D232Q、D232E、D232T、D232L、D235G、D235A、D235L、D235E、D235R、D235Q、D235T、D235N、G236M、G236R、G236S、G236T、G236C、G236K、G236E、G236L、G236N、Q238T、A239S、A239V、A239L、A239I、A239G、A239K、A239H、A239R、S244W、S244Q、Q249W、Q254S、P256S、K257E、K257R、またはA258Pの任意の1つまたはそれ以上の改変に対応するアミノ酸改変を有するポリペプチドを挙げることができる。
特に、増加した活性を有する、本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドは、N161I、S208K、I213G、G214E、Q228A、Q228D、Q228E、Q228G、Q228H、Q228K、Q228L、Q228M、Q228N、Q228R、Q228S、Q228W、Q228Y、L229V、A230G、A230D、A230S、A230C、A230T、A230M、A230N、A230H、Q231A、Q231D、Q231G、Q231V、Q231S、D232H、D232G、D232P、D232V、D232K、D232W、D232Q、D232E、またはD232Tの任意の1つまたはそれ以上の改変に対応するアミノ酸改変を有する。一例として、本発明が提供するMMP-1の活性突然変異体には、S208K、I213G、またはG214Eの1つまたはそれ以上の改変を有する改変MMP-1ポリペプチドが含まれる。
代表的な改変MMP-1ポリペプチドは、配列番号37、41、42、44、46、48、51、53、56、57、58、174、358、366、373、391、402、403、404、405、406、408、409、410、411、412、414、415、418、419、428、437、439、535、543、544、546、553、573、662、687、689、692、693、695、697、698、700、701、702、703、781、783、786、795、796、790、838、836、840、852、846、853、864、870、884、911、897、903、899、938、941、948、934、1160、1159、1166、1194、1205、1207、1215、1217、1219、1225、1233、1239、1245、1246、1248、1251、1530、1653、1675、1699、1707、1710、1711、1741、1895、1947、1961、1968、2024、2025、2028、2030、2043、2048、2087、2088、2098、2111、2114、2116、2117、2118、2124、2125、2121、2126、2176、2218、2228、2241、2231、2233、2235、2236、2239、2242、2423、2495、2496、2497、2702、2703、2715、2743 2767、2776、2791、2828、2874、2887、2876、2877、2878、2880、2882、2885、2912、2914、2917、2919、2926、2927、2930、2934、2947、2948、2953、2965、2974、2979、2983、2984、2986、2993、2994、2995、2996、2997、2998、2999、3001、3003、3004、3005、3006、3009、3010、3011、3012、3013、3014、3016、3018、3019、3021、3022、3025、3027、3028、3029、3032、3038、3039、3042、3044、3046、3047、3049、3051、3057、3086、3100、3101、3102、3108、3109、3113、3114、3115、3181、3187、3282、3373、3412、3422、3424、または3458のいずれかに示すアミノ酸の配列、ならびにそのプロセシングされた成熟型および他の形態、ならびにその対立遺伝子変異体および種変異体を有する。
3．組合せ
本発明は、出発または基準MMP-1ポリペプチドと比較して、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上の改変を含有する改変MMP-1ポリペプチドを提供する。本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドは、上述した改変の任意の2つまたはそれ以上を含有することができる。それら2つまたはそれ以上の改変は、2つまたはそれ以上の温度感受性改変、2つまたはそれ以上の活性改変、または少なくとも1つの温度感受性改変と少なくとも1つの活性改変を含むことができる。
例えば、本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドは、配列番号2に示すアミノ酸の配列を有する無改変MMP-1ポリペプチドの位置84、85、95、98、99、100、103、104、105、106、109、110、111、112、118、123、124、126、147、150、151、152、153、155、156、158、159、170、171、176、178、179、180、181、182、183、185、187、188、189、190、191、192、194、195、197、198、206、207、208、210、211、212、218、223、227、228、229、230、233、234、237、240、251、254、255、256、257、258または259のいずれかに対応する任意の2つまたはそれ以上の位置、または配列番号2に示すMMP-1ポリペプチドに対して少なくとも60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはその前後もしくはそれ以上の配列同一性を有するMMP-1ポリペプチドの対立遺伝子変異体もしくは種変異体または他の変異体における対応する位置に、アミノ酸の置き換えを含有する。一般に、そのような複合突然変異体（combination mutant）は、温度感受性であり、非許容温度におけるtsMMP-1ポリペプチドの活性と比較して、許容温度では増加した酵素活性を呈する。典型的には、複合突然変異体は、許容温度または非許容温度における単一突然変異体MMP-1ポリペプチドのみと比較して、またはアミノ酸変化を含有しない無改変MMP-1ポリペプチド（例えば配列番号2に示す野生型MMP-1ポリペプチドまたはその活性型もしくは他の形態）と比較して、許容温度における活性も保持している。
本発明が提供する代表的なMMP-1複合突然変異体は、配列番号2に示すアミノ酸の配列を有する無改変MMP-1ポリペプチドの位置95、105、150、156、159、179、180、182、185、187、198、227、234および240のいずれかに対応する任意の2つまたはそれ以上の位置、または配列番号2に示すMMP-1ポリペプチドに対して少なくとも60％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％またはその前後もしくはそれ以上の配列同一性を有するMMP-1ポリペプチドの対立遺伝子変異体もしくは種変異体または他の変異体における対応する位置に、アミノ酸の置き換えを含有する。例えば、本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドには、L95K、D105I、D105N、D105L、D105A、D105G、R150P、D156R、D156H、D156K、D156T、G159V、G159T、D179N、E180T、E180F、E182T、T185Q、N187I、A198L、V227E、I234EおよびI240Sの任意の2つまたはそれ以上の改変に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドが含まれる。より具体的には、本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドには、L95K、D105N、R150P、D156K、D156T、G159V、D179N、E180T、A198L、V227E、およびI240Sの任意の2つまたはそれ以上の改変に対応するアミノ酸改変を有するポリペプチドが含まれる。本発明が提供する複合突然変異体では少なくとも2つの異なる位置が改変されていると理解される。本発明が提供する代表的なMMP-1複合突然変異体ポリペプチドを実施例3の表15に示す。例えば、本発明が提供する複合突然変異体であって温度感受性を呈するものには、D156K/G159V/D179N；R150P/V227E；D156T/V227E；G159V/A198L；D105N/A198L；D179N/V227E；A198L/V227E；E180T/V227E；D179N/A198L；D156K/D179N；D105N/R150P/D156K/G159V/D179N/E180T；D105N/R150P/E180T；G159V/I240S；D156T/D179N/I240S；D156T/G159V；R150P/E180T；D156T/D179N；D179N/I240S；L95K/D156T/D179N；G159V/D179N；L95K/D105N/E180T；R150P/D156T/A198L；L95K/D105N/R150P/D156T/G159V/A198L/V227E/I240S；L95K/R150P；またはD105N/E180Tが含まれる。代表的な改変MMP-1ポリペプチドは、配列番号3507〜3531のいずれかに示すアミノ酸の配列、ならびにそのプロセシングされた成熟型および他の形態、ならびにその対立遺伝子変異体および種変異体を有する。
本発明が提供する複合突然変異体は、アミノ酸改変C259Qと少なくとも1つの他の改変とを含むこともできる。それら他の改変は、もう一つの温度感受性改変、例えば改変L95K、D105I、D105N、D105L、D105A、D105G、R150P、D156R、D156H、D156K、D156T、G159V、G159T、D179N、E180T、E180F、E182T、T185Q、N187I、A198L、V227E、I234EおよびI240Sのいずれかであることができる。そのような複合突然変異体の代表例には、C259Q/D105N；C259Q/R150P；C259Q/G159V；C259Q/D179NまたはC259Q/E180T、例えば配列番号3533〜3537に示すものが含まれる。
本発明が提供する複合突然変異体には、少なくとも1つの温度感受性改変と少なくとも1つの活性改変とを含有し、かつ温度感受性を保持しているMMP-1ポリペプチドも含まれる。例えば、そのような複合突然変異体は、本明細書において上述したように、非許容温度と比較して許容温度では増加した活性を呈する。上記セクションD.1に記載した温度感受性突然変異体の任意の1つまたはそれ以上を、上記セクションD.2に記載した活性突然変異体の任意の1つまたはそれ以上と組み合わせることができる。例えば、本発明が提供する複合突然変異体は、L95K、D105I、D105N、D105L、D105A、D105G、R150P、D156R、D156H、D156K、D156T、G159V、G159T、D179N、E180T、E180F、E182T、T185Q、N187I、A198L、V227E、I234EおよびI240Sの少なくとも1つの改変と、N161I、S208K、I213G、G214E、Q228A、Q228D、Q228E、Q228G、Q228H、Q228K、Q228L、Q228M、Q228N、Q228R、Q228S、Q228W、Q228Y、L229V、A230G、A230D、A230S、A230C、A230T、A230M、A230N、A230H、Q231A、Q231D、Q231G、Q231V、Q231S、D232H、D232G、D232P、D232V、D232K、D232W、D232Q、D232E、またはD232Tの少なくとも1つの改変とを含有する。例えば本発明が提供する複合突然変異体は、L95K、D105N、R150P、D156K、D156T、G159V、D179N、E180T、A198L、V227E、またはI240Sの少なくとも1つの改変と、S208K、I213G、またはG214Eの少なくとも1つの改変とを含有する。本発明が提供する代表的な複合突然変異体には、S208K/G159V；S208K/D179N；S208K/V227E；G214E/G159V；G214E/D179N；またはI213G/D179N、例えば配列番号3541-3546のいずれかに示すものが含まれる。
4．追加の改変
本発明が提供する任意の改変MMP-1ポリペプチドは、当技術分野において記載された1つまたはそれ以上の他の改変も含有することができる。それら追加の改変には、例えば当技術分野において知られる任意のアミノ酸置換、欠失または挿入を含めることができる。上記セクションD.1およびD.2に記載した1つまたはそれ以上の改変を含有することに加えて、本発明が提供する改変MMP-1ポリペプチドはいずれも、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上の追加の改変を含有することができる。典型的には、MMP-1ポリペプチドは、許容温度または非許容温度において野生型MMP-1の酵素活性を保持しているか、または野生型MMP-1より増加した酵素活性を呈する。一般に、少なくとも1つの改変が温度感受性突然変異である場合、MMP-1ポリペプチドは、非許容温度（例えば34℃または37℃）と比較して許容温度（例えば25℃）では増加した活性も呈する。追加の改変は、酵素に追加の性質、例えば増加した安定性、増加した半減期および/またはTIMPなどの阻害因子に対する増加した耐性などを付与することができる。追加の改変には、ポリペプチドの一次配列に対する改変、ならびに他の改変、例えばポリペプチドのPEG化およびグリコシル化などが含まれる。一般に、そのようなポリペプチドは、本発明が提供する1つまたはそれ以上の改変を含み、低温では高温における活性よりも増加した活性を呈する。例えば、配列番号3506または3549に示すような対立遺伝子変異体および当技術分野において知られる他の変異体を含めて、任意のアミノ酸の置き換えを、ここに含めることができる。本発明が提供するポリペプチドに含まれうる代表的な改変には、例えば、配列番号2に示すポリペプチドの改変T4P、Q10P、R30M、R30S、T96R、A114V、F166C、I172V、D181H、R189T、H199A；E200A、G214E、D232N、D233G、R243S、Q254P、I271A、R272A、T286A、I298T、E314G、F315S、V374M、R386Q、S387T、G391S、およびT432Aなどがあるが、これらに限るわけではない。
5．他のMMP
マトリックスメタロプロテアーゼは、高度に相同なポリペプチドであり、細胞外マトリックス構成要素に対して類似する特異性を呈する。MMPの代表的な配列を表5に示すが、例えば配列番号1、711、714、717、720、723、726、729、732、735、738、741、744、747、750、753、756、759、762、765、768、771、774または777に示すもの、またはそのチモーゲン型、プロセシングされた成熟型、もしくは他の形態、またはその対立遺伝子変異体または種変異体である。図1に、代表的なMMPポリペプチドのチモーゲン型のアラインメントを示す。したがって、MMP-1における本発明が提供する改変はいずれも、他の任意のMMPポリペプチドで行うことができる。したがって、本明細書の説明に基づいて、任意のMMP、種、対立遺伝子変異体または他の変異体を、非許容温度（一般的には高温）と比較した許容温度（一般的には低温）における活性に基づいて、一時的に活性（可逆性または不可逆性）にすることができる。そのようなtsMMP突然変異体を、当業者は使用することができ、ECM介在疾患または状態を処置するための組成物、プロセスまたは方法に使用することができる。
さまざまなMMPをMMP-1（例えば配列番号2に示すもの）とアラインメントして、対応する残基を同定することは、当業者の技能レベルの範囲内である。本発明が提供する改変はいずれも、他の任意のMMPの対応する残基に加えることができる。当業者は、結果として得られた改変ポリペプチドの活性を、非許容温度と比較した許容温度における酵素活性および/または温度感受性について試験することができる。特に、MMPの対応する位置における保存的アミノ酸相違は機能的には異ならないと理解される。したがって、MMP-1中の残基がもう一つのMMP中の保存的残基と整列する場合、本発明ではそのような残基を改変することが考えられると理解される。例えば、配列番号2に示すMMP-1における位置95は、ロイシン（L）である。配列番号2と他のMMPとのアラインメントにより、他のMMPにおける位置95は、ロイシン、イソロイシン（I）またはバリン（V）残基であることが示される（図1参照）。L、IおよびVのそれぞれは保存的残基である。
特に、本発明は、対応する残基において対応するMMP-1改変を達成することによって温度感受性および/または増加した活性を付与するために1つまたはそれ以上のアミノ酸の置き換えによって改変された、改変MMPポリペプチドを提供する。本発明が提供する代表的な改変には、任意のMMP、例えばMMP-8、MMP-13、MMP-18、MMP-2、MMP-9、MMP-3、MMP-10、MMP-11、MMP-7、MMP-26およびMMP-12の、以下の位置のいずれかに対応する1つまたはそれ以上の位置における改変が含まれる：配列番号2に示すアミノ酸の配列を有する無改変MMP-1ポリペプチドの位置95、105、151、156、159、176、179、180、181、182、185、195、198、206、210、212、218、223、228、229、233、234、および240。他の例では、本発明が提供する代表的な改変として、任意のMMP、例えばMMP-8、MMP-13、MMP-18、MMP-2、MMP-9、MMP-3、MMP-10、MMP-11、MMP-7、MMP-26およびMMP-12の、以下の位置のいずれかに対応する1つまたはそれ以上の位置における改変が挙げられる：81、89、109、131、133、154、157、158、160、164、166、180、207、216、218、223、228、229、231、232、236、238、256。改変には、列挙したMMP-1中の位置に対応する位置における、本明細書のセクションD.1およびD.2に記載した改変の任意の1つまたはそれ以上が含まれる。例えば、配列番号2に示すMMP-1ポリペプチドにおける残基95は、配列番号711に示すMMP-8ポリペプチドにおける残基113に対応する。したがって本発明は、配列番号711に示すアミノ酸の配列を有する無改変MMP-8ポリペプチドのアミノ酸改変L113Kを有する改変MMP-8ポリペプチドを提供する。本発明では、この説明に基づいて、類似の改変が提供される。
本発明が提供する任意の改変MMPポリペプチドは、当技術分野において記載された1つまたはそれ以上の他の改変も含有することができる。追加の改変としては、例えば、当技術分野において知られる任意のアミノ酸置換、欠失または挿入を挙げることができる。本発明が提供する任意の改変MMPポリペプチドは、上記セクションD.1およびD.2に記載した1つまたはそれ以上の改変を含有することに加えて、結果として得られるMMPポリペプチドが非許容温度（例えば34℃または37℃）と比較して許容温度（例えば25℃）では増加した活性を呈し、許容温度または非許容温度における野生型MMPの活性を保持している限りにおいて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上の追加の改変を含有することができる。追加の改変は、酵素に追加の性質、例えば増加した安定性、増加した半減期および/またはTIMPなどの阻害因子に対する増加した耐性などを付与することができる。追加の改変には、ポリペプチドの一次配列への改変、ならびに他の改変、例えばポリペプチドのPEG化およびグリコシル化などが含まれる。一般に、そのようなポリペプチドは、本発明が提供する1つまたはそれ以上の改変を含み、高温よりも低温において増加した活性を呈する。本発明が提供するポリペプチドに含めることができる代表的な改変には、以下の表6に示す任意の改変があるが、これらに限るわけではない。
［表6］MMP中の代表的改変
Figure 2012519494
Figure 2012519494
E．tsMMPをコードする核酸およびそのポリペプチドを製造する方法
改変MMPポリペプチド、例えば本明細書に示すtsMMPは、タンパク質精製および組換えタンパク質発現のための、当技術分野において周知の方法によって得ることができる。所望の遺伝子をコードする核酸を同定するための、当業者に知られている方法は、どれでも使用することができる。当技術分野において利用できる任意の方法を使って、所望のMMPをコードする完全長（すなわち全コード領域を包含する）cDNAまたはゲノムDNAクローンを、例えば細胞源または組織源から得ることができる。改変または変異体tsMMPは、野生型ポリペプチドから、例えば部位特異的突然変異誘発法などによって、工学的に作製することができる。
ポリペプチドは、核酸分子をクローニングおよび単離するための、当技術分野で知られる任意の利用可能な方法を使って、クローニングまたは単離することができる。そのような方法には、核酸のPCR増幅およびライブラリーのスクリーニング、例えば核酸ハイブリダイゼーションスクリーニング、抗体に基づくスクリーニングおよび活性に基づくスクリーニングなどがある。
核酸を増幅するための方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）法などを使って、所望のポリペプチドをコードする核酸分子を単離することができる。核酸含有材料を出発材料として使用し、そこから所望のポリペプチドコード核酸分子を単離することができる。例えばDNAおよびmRNA調製物、細胞抽出物、組織抽出物、体液試料（例えば血液、血清、唾液）、健常対象および/または疾患対象から採取した試料を、増幅方法に使用することができる。核酸ライブラリーも出発材料の供給源として使用することができる。所望のポリペプチドを増幅するためにプライマーを設計することができる。例えばプライマーは、そこから所望のポリペプチドが生成する発現配列に基づいて、設計することができる。プライマーはポリペプチドアミノ酸配列の逆翻訳に基づいて設計することができる。増幅によって生成する核酸分子を配列決定して、それが所望のポリペプチドをコードすることを確認することができる。
ポリペプチドコード核酸分子には、追加のヌクレオチド配列、例えば合成遺伝子をベクター（例えばタンパク質発現ベクターまたはコアタンパク質をコードするDNA配列を増幅するために設計されたベクター）中にクローニングするための制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するリンカー配列などを接合することができる。さらにまた、機能的DNA要素を指定する追加のヌクレオチド配列を、ポリペプチドコード核酸分子に作動的に連結することができる。そのような配列の例には、細胞内タンパク質発現を容易にするように設計されたプロモーター配列、およびタンパク質分泌を容易にするように設計された分泌配列、例えば異種シグナル配列などがあるが、これらに限るわけではない。そのような配列は当業者には知られている。例えば代表的な異種シグナル配列には、配列番号3468に示すヒトカッパIgG異種シグナル配列があるが、これに限るわけではない。細菌発現の場合、代表的な異種シグナル配列はpelBリーダー配列、例えば配列番号3547に示すものである。酵素コード核酸分子には、タンパク質結合領域を指定する塩基の配列などといった追加のヌクレオチド残基配列も連結することができる。そのような領域には、特異的標的細胞への酵素の取込を容易にする残基の配列、もしくはそのような取込を容易にするタンパク質をコードする残基の配列、または合成遺伝子の産物の薬物動態を他の形で変化させる残基の配列などがあるが、これらに限るわけではない。例えば、酵素はPEG部分に連結することができる。
また、例えばポリペプチドの検出またはアフィニティ精製を補助するために、タグまたは他の部分を付加することもできる。例えば、エピトープタグまたは他の検出可能マーカーを指定する塩基の配列などといった追加のヌクレオチド残基配列も、酵素コード核酸分子に連結することができる。そのような配列の代表例には、Hisタグ（例えば6×His、HHHHHH；配列番号3465）またはFlagタグ（DYKDDDDK；配列番号3467）をコードする核酸配列などがある。
次に、同定され単離された核酸を、適当なクローニングベクター中に挿入することができる。当技術分野で知られる数多くのベクター-宿主系を使用することができる。考えうるベクターには、プラスミドまたは改変ウイルスなどがあるが、これらに限るわけではなく、ベクター系は使用する宿主細胞と適合しなければならない。そのようなベクターには、例えばλ誘導体などのバクテリオファージ、またはpCMV4、pBR322もしくはpUCプラスミド誘導体またはBluescriptベクター（Stratagene、カリフォルニア州ラホーヤ）などのプラスミドがあるが、これらに限るわけではない。他の発現ベクターには、本明細書に例示する発現ベクターであるpET303CTHis（配列番号3466；Invitrogen、カリフォルニア州）またはpET-26Bベクター（配列番号3548）などがある。クローニングベクターへの挿入は、例えば、相補的付着末端を有するクローニングベクター中にDNAフラグメントをライゲーションすることによって達成することができる。挿入はTOPOクローニングベクター（INVITROGEN、カリフォルニア州カールズバッド）を使って達成することができる。DNAをフラグメント化するために使用される相補的制限部位がクローニングベクター中に存在しない場合は、DNA分子の末端を酵素的に改変することができる。あるいは、DNA末端上にヌクレオチド配列（リンカー）をライゲーションすることによって所望する任意の部位を作り出すこともでき、ライゲーションされるこれらのリンカーは、制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードする特異的な化学合成オリゴヌクレオチドを含有することができる。もう一つの方法として、切断されたベクターおよびタンパク質遺伝子をホモポリマーテイリング（homopolymeric tailing）によって改変することもできる。組換え分子は、例えば形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションおよびソノポレーションなどにより、その遺伝子配列のコピーが数多く生成するように、宿主細胞中に導入することができる。
特別な実施形態では、単離されたタンパク質遺伝子、cDNAまたは合成DNA配列を組み込んだ組換えDNA分子による宿主細胞の形質転換が、その遺伝子の複数コピーの生成を可能にする。したがって、形質転換体を成長させ、その形質転換体から組換えDNA分子を単離し、必要であれば、単離した組換えDNAから、挿入されている遺伝子を回収することにより、遺伝子を大量に得ることができる。
1．ベクターおよび細胞
所望のタンパク質の1つまたはそれ以上、例えば本明細書に記載するものなどを組換え発現させるには、そのタンパク質をコードするヌクレオチド配列の全部または一部を含有する核酸を、適当な発現ベクター、すなわち挿入されたタンパク質コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入することができる。必要な転写および翻訳シグナルは、酵素遺伝子のネイティブプロモーターおよび/またはその隣接領域によって供給されうる。
また、酵素をコードする核酸を含有するベクターも提供する。そのベクターを含有する細胞も提供する。細胞には、真核生物細胞および原核生物細胞が含まれ、ベクターはそこでの使用に適した任意のベクターである。
ベクターを含有する原核生物細胞および真核生物細胞、例えば内皮細胞を提供する。そのような細胞には、細菌細胞、酵母細胞、真菌細胞、古細菌、植物細胞、昆虫細胞および動物細胞が含まれる。これらの細胞は、コードされているタンパク質が細胞によって発現されるような条件下で上記の細胞を成長させ、発現されたタンパク質を回収することによってそのタンパク質を製造するために使用される。本発明に関して言えば、例えば酵素は培地中に分泌させることができる。
ネイティブシグナル配列または異種シグナル配列と結合されたプロ酵素ポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列、およびその複数コピーを含有するベクターを提供する。ベクターは、酵素タンパク質が細胞中で発現するように選択するか、または酵素タンパク質が分泌タンパク質として発現されるように選択することができる。プロ酵素（すなわちチモーゲン）型の酵素は、本発明において活性化可能な（すなわち条件付きで活性な）酵素として使用するために、精製することができる。あるいは、分泌後に、プロセグメントを化学剤によって切断するか、触媒的または自己触媒的に切断することにより、プロセシング因子を利用して成熟酵素を生成させることもできる。このプロセシング段階は、精製段階中および/または酵素の使用直前に行うことができる。所望であれば、投与前に、プロセシング因子を酵素調製物から透析除去するか、他の方法で精製除去することができる。上記に代えて、または上記に加えて、必要ならば、プロセグメントが調製物から除去されるように、酵素を精製することができる。
さまざまな宿主-ベクター系を使ってタンパク質コード配列を発現させることができる。これらには、プラスミドDNAでトランスフェクションされた哺乳動物細胞系、ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルスおよび他のウイルス）に感染させた哺乳動物細胞系；ウイルス（例えばバキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；微生物、例えば酵母ベクターを含有する酵母；またはバクテリオファージ、DNA、プラスミドDNA、またはコスミドDNAで形質転換された細菌などが含まれるが、これらに限るわけではない。ベクターの発現要素はその強さおよび特異性がさまざまである。使用する宿主-ベクター系に応じて、いくつかある適切な転写および翻訳要素を、どれでも使用することができる。
DNAフラグメントをベクター中に挿入するための、当業者に知られる任意の方法を使って、適当な転写/翻訳制御シグナルおよびタンパク質コード配列を含有するキメラ遺伝子を含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法にはインビトロ組換えDNAおよび合成技法ならびにインビボ組換え体（遺伝子組換え）を含めることができる。タンパク質またはそのドメイン、誘導体、フラグメントもしくはホモログをコードする核酸配列の発現は、その遺伝子またはそのフラグメントが組換えDNA分子で形質転換された宿主中で発現するように、第2の核酸配列によって調節することができる。例えばタンパク質の発現は、当技術分野で知られる任意のプロモーター/エンハンサーによって制御することができる。ある特別な実施形態では、プロモーターが所望するタンパク質の遺伝子にとってネイティブではない。使用することができるプロモーターには、SV40初期プロモーター（BernoistおよびChambon, Nature 290:304-310 (1981)）、ラウス肉腫ウイルスの3'長末端反復に含まれるプロモーター（Yamamotoら, Cell 22:787-797 (1980)）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Wagnerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinsterら, Nature 296:39-42 (1982)）；原核生物発現ベクター、例えばβ-ラクタマーゼプロモーター（Jayら, (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5543）またはtacプロモーター（DeBoerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)）；Scientific American 242:79-94 (1980)の「Useful Proteins from Recombinant Bacteria」も参照されたい）；ノパリンシンターゼプロモーター（Herrara-Estrellaら, Nature 303:209-213 (1984)）またはカリフラワーモザイクウイルス35S RNAプロモーター（Gardnerら, Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)）、および光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Herrera-Estrellaら, Nature 310:115-120 (1984)）を含有する植物発現ベクター；酵母および他の真菌由来のプロモーター要素、例えばGal4プロモーター、アルコールデヒドロゲナーゼプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター、アルカリホスファターゼプロモーター、および組織特異性を呈し、トランスジェニック動物において使用されてきた、以下の動物転写制御領域：膵腺房細胞において活性なエラスターゼI遺伝子制御領域（Swiftら, Cell 38:639-646 (1984)；Ornitzら, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986)；MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)）；膵ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域（Hanahanら, Nature 315:115-122 (1985)）、リンパ系細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedlら, Cell 38:647-658 (1984)；Adamsら, Nature 318:533-538 (1985)；Alexanderら, Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)）、精巣細胞、乳房細胞、リンパ系細胞および肥満細胞において活性なマウス乳房腫瘍ウイルス制御領域（Lederら, Cell 45:485-495 (1986)）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinckertら, Genes and Devel. 1:268-276 (1987)）、肝臓において活性なα-フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlaufら, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985)；Hammerら, Science 235:53-58 1987)）、肝臓において活性なα1アンチトリプシン遺伝子制御領域（Kelseyら, Genes and Devel. 1:161-171 (1987)）、骨髄性細胞において活性なβグロビン遺伝子制御領域（Magramら, Nature 315:338-340 (1985)；Kolliasら, Cell 46:89-94 (1986)）、脳の乏突起膠細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readheadら, Cell 48:703-712 (1987)）、骨格筋において活性なミオシン軽鎖2遺伝子制御領域（Shani, Nature 314:283-286 (1985)）、および視床下部の性腺刺激ホルモン分泌細胞において活性な性腺刺激ホルモン放出ホルモン（gonadotrophic releasing hormone）遺伝子制御領域（Masonら, Science 234:1372-1378 (1986)）などがあるが、これらに限るわけではない。
ある特別な実施形態では、所望するタンパク質またはそのドメイン、フラグメント、誘導体もしくはホモログをコードする核酸に作動的に連結されたプロモーター、1つまたはそれ以上の複製起点、および場合によっては1つまたはそれ以上の選択可能マーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）を含有するベクターを使用する。大腸菌細胞を形質転換するための代表的なプラスミドベクターには、例えばpQE発現ベクター（Qiagen、カリフォルニア州バレンシアから入手可能；この系を説明するQiagen発行の文献も参照のこと）がある。pQEベクターは、大腸菌における組換えタンパク質の緻密に調節された高レベル発現を提供するためのファージT5プロモーター（大腸菌RNAポリメラーゼによって認識される）および二重lacオペレータ抑制モジュール、効率のよい翻訳のための合成リボソーム結合部位（RBS II）、6×Hisタグコード配列、t0およびT1転写ターミネーター、ColE1複製起点、およびアンピシリン耐性を付与するためのβ-ラクタマーゼ遺伝子を有する。pQEベクターを使えば、組換えタンパク質のN末端またはC末端のどちらかに6×Hisタグを配置することができる。そのようなプラスミドには、3つ全ての読み枠のために複数のクローニング部位を提供し、N末端に6×Hisタグを付けたタンパク質の発現に備える、pQE32、pQE30、およびpQE31などがある。大腸菌細胞を形質転換するための他の代表的なプラスミドベクターには、例えば、pET発現ベクター（米国特許第4,952,496号参照；NOVAGEN（ウィスコンシン州マディソン）から入手可能；この系を説明するNovagen発行の文献も参照のこと）がある。そのようなプラスミドには、T7lacプロモーター、T7ターミネーター、誘導性大腸菌lacオペレーター、およびlacリプレッサー遺伝子を含有するpET11a；T7プロモーター、T7ターミネーター、および大腸菌ompT分泌シグナルを含有するpET12a-c；Hisカラムによる精製に使用されるHis-Tag（商標）リーダー配列と、カラムでの精製後に切断を可能にするトロンビン切断部位、T7-lacプロモーター領域およびT7ターミネーターを含有するpET15bおよびpET19b（NOVAGEN、ウィスコンシン州マディソン）、ならびにpET-26B（配列番号3548）などがある。もう一つのpETベクターは、T7lacプロモーター、T7ターミネーター、誘導性大腸菌lacオペレーター、アンピシリン耐性を付与するためのβ-ラクタマーゼ遺伝子を含有し、精製に使用するためのHis-Tag配列も含有する、pET303CTHis（配列番号3466に示す；Invitrogen、カリフォルニア州）である。
哺乳動物細胞発現用ベクターの代表例は、HZ24発現ベクターである。HZ24発現ベクターはpCIベクターバックボーン（Promega）から誘導された。これは、β-ラクタマーゼ耐性遺伝子（AmpR）をコードするDNA、F1複製起点、サイトメガロウイルス前初期エンハンサー/プロモーター領域（CMV）、およびSV40後期ポリアデニル化シグナル（SV40）を含有する。この発現ベクターは、ECMVウイルス（Clontech）由来の配列内リボソーム進入部位（IRES）およびマウスジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）遺伝子も有する。
2．発現
改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPは、インビボ法およびインビトロ法を含む、当業者に知られる任意の方法によって製造することができる。所望のタンパク質は、そのタンパク質を生産するのに適した任意の生物において、要求される量および形態（例えば投与および処置に必要とされる量および形態）で発現させることができる。発現宿主には、原核生物および真核生物、例えば大腸菌、酵母、植物、昆虫細胞、哺乳動物細胞（ヒト細胞株およびトランスジェニック動物を含む）が含まれる。発現宿主は、そのタンパク質産生レベルが異なりうると共に、発現されたタンパク質上に存在する翻訳後修飾のタイプも異なりうる。発現宿主の選択は、これらの因子および他の因子、例えば調節および安全性に関する考慮事項、生産コスト、ならびに精製の必要性および精製の方法などに基づいて行うことができる。
多くの発現ベクターが利用可能であって、当業者に知られており、それらをタンパク質の発現に使用することができる。発現ベクターの選択は、宿主発現系の選択によって左右されるだろう。一般に発現ベクターは、転写プロモーターを含み、場合によってはエンハンサー、翻訳シグナル、ならびに転写および翻訳終結シグナルを含むことができる。安定形質転換に使用される発現ベクターは、典型的には、形質転換細胞の選択と維持を可能にする選択可能マーカーを有する。いくつかの例では、複製起点を使用してベクターのコピー数を増幅することができる。
改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPは、タンパク質融合物として利用すること、またはタンパク質融合物として発現させることもできる。例えば、酵素に追加の機能を加えるために、酵素融合物を作製することができる。酵素融合タンパク質の例には、シグナル配列、タグ、例えば位置確認（localization）用のタグ、例えばhis6タグもしくはmycタグ、または精製用のタグ、例えばGST融合物、ならびにタンパク質の分泌および/または膜結合を指示するための配列の融合物などがあるが、これらに限るわけではない。
一般に、改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPは、不活性チモーゲン型として発現される。化学剤、他のプロテアーゼ、または自己触媒作用へのばく露によって、チモーゲンの変換を達成することにより、本明細書の他の項で説明する成熟酵素を生成させることができる。本発明ではあらゆる形態の酵素が考えられる。チモーゲン型として提供され発現される場合、それは使用前にプロセシング因子によって活性化されると理解される。
a．原核細胞
原核生物、特に大腸菌は、大量のタンパク質を生産するための系を提供する。大腸菌の形質転換は当業者に周知の簡便で迅速な技法である。大腸菌用の発現ベクターは誘導性プロモーターを含有することができ、そのようなプロモーターは、高レベルのタンパク質発現を誘導するのに有用であり、宿主細胞に対して何らかの毒性を示すタンパク質を発現させるのにも有用である。誘導性プロモーターの例には、lacプロモーター、trpプロモーター、ハイブリッドtacプロモーター、T7およびSP6 RNAプロモーター、ならびに温度感受性λPLプロモーターなどがある。
タンパク質、例えば本明細書に記載する任意のタンパク質は、大腸菌の細胞質環境中で発現させることができる。細胞質は還元的環境であり、一部の分子にとって、これは不溶性封入体の形成をもたらしうる。タンパク質を再可溶化するにはジチオスレイトール（dithiothreotol）やβ-メルカプトエタノールなどの還元剤およびグアニジン-HClや尿素などの変性剤を使用することができる。代替的アプローチは、細菌の細胞膜周辺腔におけるタンパク質の発現である。細菌の細胞膜周辺腔は、酸化的環境ならびにシャペロニン様およびジスルフィドイソメラーゼを提供し、可溶性タンパク質の産生をもたらすことができる。典型的には、タンパク質をペリプラズムに向かわせるリーダー配列が、発現されるべきタンパク質に融合される。その場合、リーダーは、ペリプラズムの内部で、シグナルペプチダーゼによって除去される。ペリプラズムを標的とする（periplasmic-targeting）リーダー配列には、ペクチン酸リアーゼ遺伝子由来のpelBリーダー（配列番号3547）、およびアルカリホスファターゼ遺伝子由来のリーダーなどがある。いくつかの例では、ペリプラズム発現が、発現されたタンパク質の培養培地への漏出を可能にする。タンパク質の分泌は培養上清からの迅速かつ簡便な精製を可能にする。分泌されないタンパク質は浸透圧溶解によってペリプラズムから得ることができる。細胞質発現と同様に、時には、タンパク質が不溶性になることもあり、可溶化と再フォールディングが容易になるように、変性剤および還元剤を使用することができる。誘導温度および成長温度も、発現レベルと溶解性に影響を及ぼすことがあり、典型的には、25℃〜37℃の温度が使用される。典型的には、細菌は非グリコシル化タンパク質を産生する。したがって、タンパク質が機能するためにグリコシル化を要求する場合には、宿主細胞からの精製後に、インビトロでグリコシル化を追加することができる。
b．酵母細胞
Saccharomyces cerevisae、Schizosaccharomyces pombe、Yarrowia lipolytica、Kluyveromyces lactisおよびPichia pastorisなどの酵母は、タンパク質、例えば本明細書に記載する任意のタンパク質の生産に使用することができる、周知の酵母発現宿主である。酵母は、エピソーム複製ベクターで形質転換させるか、相同組換えによる安定染色体組込みで形質転換させることができる。典型的には、遺伝子発現を調節するために、誘導性プロモーターが使用される。そのようなプロモーターの例には、GAL1、GAL7およびGAL5、ならびにメタロチオネインプロモーター、例えばCUP1、AOX1、または他のPichiaプロモーターもしくは他の酵母プロモーターがある。発現ベクターは、多くの場合、形質転換されたDNAを選択し維持するために、LEU2、TRP1、HIS3およびURA3などの選択可能マーカーを含む。酵母中で発現されたタンパク質は可溶性であることが多い。Bipなどのシャペロニン類およびタンパク質ジスルフィドイソメラーゼとの共発現により、発現レベルおよび可溶性が改善されうる。また、酵母中で発現されるタンパク質は、例えばSaccharomyces cerevisaeに由来する酵母接合型α因子分泌シグナルなどの分泌シグナルペプチド融合物、およびAga2p接合付着受容体（mating adhesion receptor）またはArxula adeninivoransグルコアミラーゼなどの酵母細胞表面タンパク質との融合物を使って、分泌するように指示することもできる。発現されたポリペプチドが分泌経路を出た時に、融合された配列を発現されたポリペプチドから除去するために、プロテアーゼ切断部位、例えばKex-2プロテアーゼの切断部位を、工学的に作り出すことができる。酵母はAsn-X-Ser/Thrモチーフにおけるグリコシル化能も有する。
c．昆虫細胞
昆虫細胞、特にバキュロウイルス発現を用いるものは、マトリックス分解酵素などのポリペプチドを発現させるのに有用である。昆虫細胞は高レベルのタンパク質を発現し、高等真核生物が使用する翻訳後修飾の大半を行う能力を有する。バキュロウイルスは宿主域が制限されており、それが安全性を向上させ、真核細胞発現に関する規制上の懸念を減少させる。典型的な発現ベクターは、高レベル発現用のプロモーター、例えばバキュロウイルスのポリヘドリンプロモーターを使用する。よく使用されるバキュロウイルス系は、例えばAutographa californica核多核体病ウイルス（AcNPV）およびBombyx mori核多核体病ウイルス（BmNPV）などのバキュロウイルスと、例えばSpodoptera frugiperdaに由来するSf9、Pseudaletia unipuncta（A7S）およびDanaus plexippus（DpN1）などの昆虫細胞株とを含む。高レベル発現には、発現させようとする分子のヌクレオチド配列を、ウイルスのポリヘドリン開始コドンのすぐ下流に融合する。哺乳類分泌シグナルは昆虫細胞では正確にプロセシングされ、これらのシグナルを使って、発現したタンパク質を培養培地中に分泌させることができる。加えて、細胞株Pseudaletia unipuncta（A7S）およびDanaus plexippus（DpN1）は、哺乳動物細胞系と類似するグリコシル化パターンを有するタンパク質を産生する。
昆虫細胞におけるもう一つの発現系は安定形質転換細胞の使用である。発現には、シュナイダー（Schneider）2（S2）細胞およびKc細胞（Drosophila melanogaster）ならびにC7細胞（Aedes albopictus）などの細胞株を使用することができる。Drosophilaメタロチオネインプロモーターを使って、カドミウムまたは銅による重金属誘導の存在下で高レベル発現を誘導することができる。発現ベクターは、典型的には、ネオマイシンやハイグロマイシンなどの選択可能マーカーを使用することによって維持される。
d．哺乳動物細胞
tsMMPなどのタンパク質を発現させるために、哺乳類発現系を使用することができる。発現コンストラクトは、アデノウイルスなどのウイルス感染によって、またはリポソーム、リン酸カルシウム、DEAE-デキストランなどの直接的DNA導入によって、また、エレクトロポレーションやマイクロインジェクションなどの物理的手段によって、哺乳動物細胞に導入することができる。哺乳動物細胞用の発現ベクターは、典型的には、mRNAキャップ部位、TATAボックス、翻訳開始配列（コザック（Kozak）コンセンサス配列）およびポリアデニル化要素を含む。選択可能マーカーなどのもう一つの遺伝子との2シストロン性発現が可能になるように、IRES要素も加えることができる。そのようなベクターは、多くの場合、高レベル発現のための転写プロモーター-エンハンサー、例えばSV40プロモーター-エンハンサー、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターおよびラウス肉腫ウイルス（RSV）の長末端反復などを含む。これらのプロモーター-エンハンサーは多くの細胞タイプにおいて活性である。発現には、組織型および細胞型のプロモーターおよびエンハンサー領域も使用することができる。代表的なプロモーター/エンハンサー領域には、エラスターゼI、インスリン、免疫グロブリン、マウス乳房腫瘍ウイルス、アルブミン、αフェトプロテイン、α1アンチトリプシン、βグロビン、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン軽鎖2、および性腺刺激ホルモン放出ホルモン遺伝子制御領域（gonadotropic releasing hormone gene control）などの遺伝子に由来するものがあるが、これらに限るわけではない。発現コンストラクトを伴う細胞を選択し、維持するために、選択可能マーカーを使用することができる。選択可能マーカー遺伝子の例には、ハイグロマイシンBホスホトランスフェラーゼ、アデノシンデアミナーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）およびチミジンキナーゼなどがあるが、これらに限るわけではない。例えば、DHFR遺伝子を発現する細胞だけを選択するために、メトトレキサートの存在下で発現を行うことができる。TCR-ζやFcεRI-γなどの細胞表面シグナリング分子との融合により、細胞表面における、活性な状態での、タンパク質の発現を指示することができる。
哺乳類発現には、マウス細胞、ラット細胞、ヒト細胞、サル細胞、ニワトリ細胞およびハムスター細胞など、多くの細胞株を利用することができる。代表的な細胞株には、CHO、Balb/3T3、HeLa、MT2、マウスNS0（非分泌性）および他の骨髄腫細胞株、ハイブリドーマおよびヘテロハイブリドーマ細胞株、リンパ球、線維芽細胞、Sp2/0、COS、NIH3T3、HEK293、293S、2B8、およびHKB細胞などがあるが、これらに限るわけではない。細胞培養培地からの分泌タンパク質の精製を容易にする無血清培地に適合した細胞株も利用することができる。例として、CHO-S細胞（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド、カタログ番号11619-012）および無血清EBNA-1細胞株（Phamら (2003) Biotechnol.Bioeng. 84:332-42）が挙げられる。発現量が最大になるように最適化された特別な培地での成長に適合した細胞株も利用することができる。例えばDG44 CHO細胞は、動物性産物を含まない合成培地における懸濁培養での成長に適合している。
e．植物
タンパク質、例えば本明細書に記載する任意のタンパク質を発現させるために、トランスジェニック植物細胞およびトランスジェニック植物を使用することができる。発現コンストラクトは、典型的には、微粒子銃（microprojectile bombardment）やプロトプラストへのPEGによる導入などといった直接的DNA導入を使って、またアグロバクテリウムによる形質転換を使って、植物に導入される。発現ベクターは、プロモーターおよびエンハンサー配列、転写終結要素および翻訳制御要素を含むことができる。発現ベクターおよび形質転換技法は、通常は、Arabidopsisやタバコなどの双子葉植物宿主と、トウモロコシやイネなどの単子葉植物宿主とで分けられる。発現に使用される植物プロモーターの例には、カリフラワーモザイクウイルスプロモーター、ノパリンシンターゼプロモーター、リボース二リン酸カルボキシラーゼプロモーター、ならびにユビキチンプロモーターおよびUBQ3プロモーターなどがある。
形質転換細胞の選択と維持が容易になるように、多くの場合、ハイグロマイシン、ホスホマンノースイソメラーゼおよびネオマイシンホスホトランスフェラーゼなどの選択可能マーカーが使用される。形質転換植物細胞は、細胞、凝集体（カルス組織）として培養維持するか、全植物体に再生させることができる。トランスジェニック植物細胞には、マトリックス分解酵素を産生するように工学的に操作された藻類も含めることができる。植物は哺乳動物細胞とは異なるグリコシル化パターンを有するので、これは、これらの宿主中で生産されるタンパク質の選択に影響を及ぼしうる。
3．精製技法
tsMMPなどの改変MMPポリペプチドまたは他のタンパク質などといったポリペプチドを宿主細胞から精製するための方法は、選択した宿主細胞と発現系とに依存するだろう。分泌される分子の場合、タンパク質は一般に、細胞を除去した後に、培養培地から精製される。細胞内発現の場合は、細胞を溶解し、タンパク質を抽出物から精製することができる。トランスジェニック植物やトランスジェニック動物などのトランスジェニック生物を発現に使用する場合は、組織または器官を、溶解細胞抽出物を作るための出発材料として使用することができる。また、トランスジェニック動物生産には、乳または卵におけるポリペプチドの生産を含めることができ、それらは、収集し、必要であれば、当技術分野における標準的方法を使って、タンパク質を抽出し、さらに精製することができる。遊離のシステインが存在する場合は、それらを他のアミノ酸、例えばセリンで置き換えることができる。遊離システインの置き換えにより、望ましくない凝集を防止することができる。
一般に、tsMMPなどの改変MMPポリペプチドは、不活性型（チモーゲン型）で発現し、精製されてから、本発明が提供する系および方法で述べるような活性化を受ける。したがって、発現に続いて、プロセシング因子および化学修飾、触媒作用および/または自己触媒作用を使ってプロセグメントを除去することにより、成熟型を生成させることができる。一般的に、対象に投与することが許容されるプロセシング因子を選択する。必要であれば、精製調製物からプロセシング因子を除去するために、追加の精製段階を行うことができる。また、必要であれば、精製調製物からプロセグメントを除去するために、追加の精製段階を行うこともできる。活性化は、SDS-PAGE（例えば3キロダルトンシフト）および酵素活性（蛍光原基質の切断）によってモニタリングすることができる。活性酵素が望まれる場合、典型的には、精製前に酵素を＞75％活性化させる。典型的には、プロペプチドまたはプロセグメントを除去してチモーゲン型から成熟型を生成させる活性化切断によって、MMPを活性にする。しかし、非許容温度下でのいくつかの応用では、tsMMPが、その成熟型にあっても、本明細書に記載する必要許容温度にばく露されるまでは不活性である。例えば、本発明が提供する多くのMMPは、非許容温度では活性でないか、実質的に不活性である。
タンパク質、例えばtsMMPなどの改変MMPポリペプチドは、当技術分野において知られる標準的なタンパク質精製技法、例えば限定するわけではないが、SDS-PAGE、サイズ分画およびサイズ排除クロマトグラフィー、硫酸アンモニウム沈殿、およびアニオン交換などのイオン交換クロマトグラフィーを使って精製することができる。効率および調製物の純度を改善するためにアフィニティ精製技法を利用することもできる。アフィニティ精製では、例えばMMPに結合する抗体、受容体および他の分子を使用することができる。発現コンストラクトを工学的に操作して、mycエピトープ、GST融合物またはHis6などのアフィニティタグをタンパク質に付加し、それぞれmyc抗体、グルタチオンレジンおよびNiレジンを使ってアフィニティ精製することもできる。純度は、例えばゲル電気泳動と染色および分光測光技法など、当技術分野で知られる任意の方法によって評価することができる。
F．tsMMPの製造、製剤および投与
本発明が提供する医薬組成物は、本明細書に記載する改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPおよび/または活性突然変異体を含有する。化合物は、例えば経口投与用の溶液剤、懸濁剤、錠剤、分散性錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放性製剤またはエリキシル剤、ならびに経皮パッチ調製物および乾燥粉末吸入器などの、任意の適切な医薬調製物に製剤化することができる。典型的には、化合物は、当技術分野において周知の技法および手法を使って医薬組成物に製剤化される（例えばAnsel「Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms」第4版、1985、126参照）。本医薬組成物は、活性化のための必要温度を与える活性化因子の前に、活性化因子と同時に、活性化因子後に、または活性化因子とは断続的に投与される。
選択された改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPは、成熟型に活性化しかつ必要であれば許容温度にばく露した時に、処置される患者に望ましくない副作用を及ぼすことなく治療上有用な効果を発揮するのに十分な量で含まれる。改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPを含有する組成物は、医薬上許容される担体を含むことができる。治療有効濃度は、化合物を、既知のインビトロ系およびインビボ系、例えば本明細書に記載するアッセイで試験することによって経験的に決定される。組成物における、選択した改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPの濃度は、例えば複合体の吸収、不活化および排泄率、複合体の物理化学的特徴、投薬スケジュール、および投与される量、ならびに当業者に知られる他の因子に依存する。例えば、正確な投薬量と処置の持続時間は、処置される組織の関数であり、既知の試験プロトコールを使って経験的に決定するか、インビボまたはインビトロ試験データからの推論によって決定することができると理解される。濃度および投薬量の値は、処置される個体の年齢によっても異なりうることに注意すべきである。どの特定対象についても、具体的投薬レジメンは、その個体の必要に応じて、また製剤を投与する人または製剤の投与を指図する人の専門家としての判断に応じて、時間の経過と共に調節すべきであること、および本明細書に示す濃度範囲が単なる例示であって、その範囲を限定しようとするものではないことを、さらに理解すべきである。
ある疾患または症状、例えばセルライトまたはリンパ浮腫などのECM介在疾患または状態を処置するために投与されるべき、選択した改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPの量は、標準的な臨床技法によって決定することができる。加えて、最適な投薬量範囲の特定を支援するために、インビボアッセイおよび動物モデルを使用することもできる。経験的に決定することができる正確な投薬量は、その特定酵素、投与経路、処置される疾患のタイプ、および疾患の重症度に依存しうる。代表的な投薬量は、10μg〜100mgまたはその前後、特に50μg〜75mg、100μg〜50mg、250μg〜25mg、500μg〜10mg、1mg〜5mg、または2mg〜4mgの範囲にある。特定の投薬量およびその製剤は、適応症および個体に依存する。必要であれば、投薬量を経験的に決定することができる。典型的には、本明細書に記載する適応症には、その投薬量が、活性化因子（例えば冷バッファー）の添加などによる再構成後に、1〜100ml、特に1〜50ml、10〜50ml、10〜30ml、1〜20ml、または1〜10mlの体積で、投与される。典型的には、そのような投薬量は、10〜50mlの最終体積で、100μg〜50mgまたはその前後、一般的には1mg〜5mgである。
改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPは、一度に投与するか、いくつかの低用量に分割して、それらをある時間間隔で投与することができる。選択した改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPは、処置期間の間、例えば数時間、数日、数週間、または数ヶ月にわたって、1つまたはそれ以上の用量で投与することができる。いくつかの例では連続的な投与が有用である。正確な投薬量および投与の経過は、想定される活性化の方法および系に依存すると理解される。
また、正確な投薬量および処置の継続期間は処置される疾患の関数であり、既知の試験プロトコールを使って経験的に、またはインビボもしくはインビトロ試験データからの推論によって、決定することができると理解される。濃度および投薬量の値は、軽減しようとする状態の重症度によっても変動しうることに注意すべきである。どの特定対象についても、具体的投薬レジメンはその個体の必要に応じて、その組成物を投与する人またはその組成物の投与を指図する人の専門家としての判断に応じて、時間の経過と共に調節すべきであること、および本明細書に示す濃度範囲が単なる例示であって、それらを含有する組成物および組合せの範囲または使用を限定しようとするものではないことを、さらに理解すべきである。組成物は、1時間ごと、1日ごと、1週間ごと、1ヶ月ごと、1年ごとに、または1回だけ、投与することができる。一般に、投薬レジメンは、毒性が制限されるように選択される。担当医には、毒性、または骨髄、肝臓もしくは腎臓または他の組織の機能不全ゆえに、治療を停止し、中断し、または投薬量を下げる方向に調節する方法および時期がわかるであろうことに、注意すべきである。逆に担当医には、臨床応答が十分でない場合に（毒性副作用を防止しつつ）処置を高レベル側に調節する方法および時期も、わかるだろう。
医薬上許容される組成物は、規制当局または他の政府機関の承認を考慮して製造され、動物およびヒトで使用するために、一般に認められた薬局方に従って製造される。組成物は、溶液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、および徐放性製剤の形態をとることができる。組成物は、伝統的な結合剤および担体、例えばトリグリセリドを使って、坐剤として製剤化することができる。経口製剤は、医薬用のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、および他の同様の薬剤などといった標準的担体を含むことができる。製剤は投与様式に適さなければならない。
医薬組成物は、酵素と一緒に投与される担体、例えば希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を含むことができる。適切な医薬担体の例は、E.W.Martin「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。そのような組成物は、治療有効量の化合物を、一般的には精製された形態で、患者に適正に投与するための形態になるように、適切な量の担体と共に含有するだろう。そのような医薬担体として、滅菌された液体、例えば水および油（石油由来、動物由来、植物由来の油または合成油を含む）、例えばラッカセイ油、ダイズ油、鉱油、およびゴマ油などを挙げることができる。水は医薬組成物が静脈内投与される場合の典型的な担体である。食塩溶液ならびにデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液も液状担体として、特に注射用溶液剤に、使用することができる。組成物は、活性成分と共に、希釈剤、例えばラクトース、スクロース、リン酸二カルシウム、またはカルボキシメチルセルロース；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムおよびタルク；ならびに結合剤、例えばデンプン、アラビアゴムなどの天然ゴム、ゼラチン、グルコース、糖みつ、ポリビニルピロリジン、セルロースおよびその誘導体、ポビドン、クロスポビドンおよび当業者に知られる他の同様の結合剤を含有することができる。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、穀粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、およびエタノールなどがある。組成物は、所望であれば、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはpH緩衝剤、例えば酢酸塩、クエン酸ナトリウム、シクロデキストリン誘導体、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミン、酢酸ナトリウム、オレイン酸トリエタノールアミンおよび他の同様の薬剤も含有することができる。
製剤は、ヒトおよび動物に、適切な量の化合物またはその医薬上許容される誘導体を含有する錠剤、カプセル剤、丸剤、散剤、顆粒剤、滅菌非経口溶液剤または懸濁剤、および経口溶液剤または懸濁剤、ならびに油水乳剤などの単位剤形（unit dosage form）で投与するために提供される。医薬的治療活性化合物およびその誘導体は、典型的には、単位剤形または複数回用剤形（multiple dosage form）として製剤化され、投与される。各単位用量（unit dose）は、所望する治療効果を生み出すのに十分な前もって決定された量の治療活性化合物を、必要な医薬担体、媒体または希釈剤と一緒に含有する。単位用量型（unit dose form）の例として、アンプルおよびシリンジならびに個別包装された錠剤またはカプセル剤が挙げられる。単位用量型は、それを分割して投与するか、それを何倍かにして投与することができる。複数回用量型は、複数の同じ単位剤形が単一の容器に包装されていて、隔離された単位用量型として投与されるものである。複数回用量型の例には、バイアル、錠剤またはカプセル剤の瓶、またはパイント瓶もしくはガロン瓶などがある。したがって、複数回用量型は、分離されずに包装された複数の単位用量である。一般に、0.005％〜100％の範囲の活性成分を含有し、残りが無毒性担体で構成される剤形または組成物を、製造することができる。
組成物は、例えば筋肉内、静脈内、皮内、病巣内、腹腔内注射、皮下、硬膜外、鼻、経口、膣、直腸、局所外用、局所、耳、吸入、口腔粘膜（例えば舌下）、および経皮投与その他、当業者に知られる任意の経路によって投与するために製剤化することができる。投与は、処置個所に応じて局所的（local）、局所外用的（topical）、または全身的であることができる。処置を必要とする領域への局所投与は、例えば限定するわけではないが、手術中の局所注入、局所外用（例えば手術後に創傷被覆材を併用して）によって、注射によって、カテーテルを利用して、坐剤を利用して、またはインプラントを利用して達成することができる。組成物は、他の生物学的活性剤と共に、逐次的に、断続的に、または同じ組成物に入れて投与することもできる。投与には、例えば放出制御製剤およびポンプなどによる器具放出制御などといった、放出制御系を含めることもできる。
いかなる場合も、最も最適な経路は、例えば疾患の性質、疾患の進行、疾患の重症度、使用する特定組成物など、さまざまな因子に依存する。本明細書に関して言えば、改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPを、それらが皮膚または組織の間質に到達するように投与することが望ましい。したがって、例えば表皮下投与法による、皮膚下への直接投与が考えられる。これらには、例えば皮下投与経路、皮内投与経路および筋肉内投与経路が含まれる。したがってある例では、局所投与を、例えばシリンジまたは針などの注射器具を含有する他の製品からの注射によって、達成することができる。他の投与様式も考えられる。医薬組成物は各投与経路に適した剤形に製剤化することができる。
ある例では、医薬調製物が、例えば、溶液剤、シロップ剤または懸濁剤などの液状であることができる。液状で提供される場合、例えばtsMMPの医薬調製物は、許容温度へのばく露時に、例えば活性化因子（例えば冷バッファー）の添加時に、治療有効濃度まで希釈される濃縮調製物として提供することができる。活性化因子は投与前に調製物に加えるか、活性化因子をtsMMP調製物と同時に、断続的に、または逐次的に加えることができる。さらに、液状で提供する場合は、活性化にとって望ましい温度になるように、調製物の温度を使用前に調節することができる。例えば液状調製物は、使用および投与前に、氷桶で冷却するか、冷蔵庫または冷蔵室で冷却することができる。そのような液状調製物は、従来の手段により、医薬上許容される添加剤、例えば懸濁化剤（例えばソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（例えばレシチンまたはアラビアゴム）；非水性媒体（例えばアーモンド脂、油状エステル、または分画植物油）；および保存剤（例えばメチルもしくはプロピル-p-ヒドロキシベンゾエートまたはソルビン酸）を使って製造することができる。
もう一つの例では、医薬調製物を、水または他の適切な媒体で使用前に再構成するための凍結乾燥型として提示することができる。例えば、tsMMPの医薬調製物は、活性化因子を含有する必要温度の溶液、一般的には冷たいバッファーもしくは溶液または室温のバッファーもしくは溶液で、再構成することができる。あるいは、いったん再構成してから、活性化にとって望ましい温度になるように、使用前に調製物を調節することもできる。例えば、再構成された液状調製物を、身体の生理学的温度より低い温度、例えば4℃〜25℃に保存することができる。
典型的には、本発明が提供する改変MMPポリペプチドは、活性に要求される必須金属を含有する組成物として製造される。例えばMMPはZn依存性およびCa依存性のポリペプチドである。活性に要求される亜鉛およびカルシウムの至適濃度を経験的に決定することは、当業者の技能レベルの範囲内にある。改変MMPポリペプチドがtsMMPである場合、亜鉛およびカルシウムの至適濃度は、温度感受性表現型を維持する濃度である。例えば、本明細書（例えば実施例13および14）で述べるように、亜鉛の存在はMMPポリペプチドの温度感受性表現型に影響を及ぼしうる。例えば、本発明が提供するMMP組成物におけるZnCl2の至適濃度は、典型的には、0.01mMより低く、例えば0.0005mM〜0.009mM、特に0.0005mM〜0.005mM、例えば0.001mMである。CaCl2の至適濃度は、典型的には、約1mMより高く、例えば2mM〜50mM、特に5mM〜20mM、例えば10mM〜15mM、例えば10mMである。他の金属も、活性に要求されるとおりに、組成物に含めることができる。
タンパク質分解や、抗原応答および免疫原応答による免疫学的介入などといった、分解プロセスへの、改変MMPポリペプチドの曝露を減少させるような投与方法を、使用することができる。そのような方法の例には処置部位における局所投与がある。治療薬のPEG化は、タンパク質分解に対する耐性を増加させ、血漿中半減期を増加させ、抗原性および免疫原性を減少させると報告されている。PEG化法の例は当技術分野では知られている（例えばLuおよびFelix, Int. J. Peptide Protein Res., 43: 127-138, 1994；LuおよびFelix, Peptide Res., 6: 142-6, 1993；Felixら, Int. J. Peptide Res., 46:253-64, 1995；Benharら, J. Biol. Chem., 269:13398-404, 1994；Brumeanuら, J Immunol., 154:3088-95, 1995を参照されたい；また、Calicetiら (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. 55(10):1261-77およびMolineux (2003) Pharmacotherapy 23 (8 Pt 2):3S-8Sも参照されたい）。PEG化はインビボでの核酸分子の送達にも使用することができる。例えば、アデノウイルスのPEG化は、安定性および遺伝子導入を増加させることができる（例えばChengら (2003) Pharm. Res. 20(9):1444-51を参照されたい）。
1．注射剤、溶液剤および乳剤
本発明では、一般に、皮下、筋肉内または皮内への注射を特徴とする非経口投与が考えられる。注射剤は、従来の形態で、液状の溶液剤または懸濁剤として製造するか、注射前に液体に溶解または懸濁するのに適した固形剤として製造するか、または乳剤として製造することができる。適切な賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロールまたはエタノールである。医薬組成物は、他の微量の無毒性補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、pH緩衝剤、安定剤、溶解促進剤（solubility enhancer）、および他の同様の薬剤、例えば酢酸ナトリウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンおよびシクロデキストリンなども含有することができる。本発明では、一定レベルの投薬量が維持されるように遅放性（slow-release）または徐放性（sustained-release）系を植え込むこと（例えば米国特許第3,710,795号参照）も考えられる。そのような非経口組成物に含有される活性化合物の百分率は、その具体的性質、ならびに化合物の活性および対象の要求に強く依存する。
組成物の非経口投与には、一般に、皮内、皮下および筋肉内投与などの表皮下投与経路が含まれる。所望であれば、静脈内投与も考えられる。注射剤は局所投与用および全身投与用に設計される。本明細書に関して言えば、患部間質に直接投与するための局所投与が望ましい。非経口投与用の調製物には、調製済注射用（ready for injection）滅菌溶液剤、使用直前に溶媒とすぐに混合できるようになっている凍結乾燥粉末などの滅菌乾燥可溶性製品、例えば皮下注射薬錠剤（hypodermic tablet）、調製済注射用滅菌懸濁剤、使用直前に媒体とすぐに混合できるようになっている滅菌乾燥不溶性製品、および滅菌乳剤などがある。溶液剤は水性または非水性であることができる。静脈内投与される場合、適切な担体には、生理食塩水、またはリン酸緩衝食塩水（PBS）、ならびにグルコース、ポリエチレングリコール、およびポリプロピレングリコールなどの増粘剤および可溶化剤ならびにその混合物を含有する溶液などがある。
非経口調製物に使用される医薬上許容される担体には、水性媒体、非水性媒体、抗微生物剤、等張化剤、バッファー、酸化防止剤、局所麻酔薬、懸濁化剤および分散剤、乳化剤、金属イオン封鎖剤またはキレート剤、および医薬上許容される他の物質などがある。水性媒体の例には、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、等張性デキストロース注射液、滅菌水注射液、デキストロースおよび乳酸加リンゲル注射液などがある。非水性非経口媒体には、植物由来の固定油、綿実油、トウモロコシ油、ゴマ油およびラッカセイ油などがある。複数回用量容器に包装された非経口調製物には、静細菌濃度または静真菌濃度の抗微生物剤、例えばフェノールまたはクレゾール、水銀剤、ベンジルアルコール、クロロブタノール、メチルおよびプロピルp-ヒドロキシ安息香酸エステル、チメロサール、塩化ベンザルコニウムおよび塩化ベンゼトニウムなどを加えることができる。等張化剤には塩化ナトリウムおよびデキストロースなどがある。バッファーにはリン酸塩およびクエン酸塩などがある。酸化防止剤には硫酸水素ナトリウムがある。局所麻酔薬には塩酸プロカインがある。懸濁化剤および分散剤にはナトリウムカルボキシメチルセルロース（sodium carboxymethylcelluose）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンなどがある。乳化剤にはPolysorbate 80（TWEEN80）がある。金属イオン封鎖剤または金属イオンのキレート剤にはEDTAがある。医薬担体には、水混和性媒体用のエチルアルコール、ポリエチレングリコールおよびプロピレングリコール、ならびにpH調節用の水酸化ナトリウム、塩酸、クエン酸または乳酸も含まれる。
医薬活性化合物の濃度は、注射によって有効量が提供されて所望の薬理学的効果が得られるように調節される。正確な用量は、当技術分野では知られているとおり、患者または動物の年齢、体重および状態に依存する。単位用量非経口調製物は、例えばアンプル、カートリッジ、バイアルまたは針付きシリンジに包装することができる。医薬活性化合物を含有する液状の溶液剤または再構成された粉末調製物の体積は、処置されるべき疾患、および包装のために選択した特定製品の関数である。例えば、セルライトの処置の場合、非経口注射に関して、注射体積は約10〜50ミリリットルまたはその前後である。非経口投与用の調製物は全て、当技術分野では知られ、実践されているように、滅菌状態でなければならない。
凍結乾燥粉末
本発明では、投与のために溶液剤、乳剤および他の混合物として再構成することができる凍結乾燥粉末が重要である。それらは、固形物またはゲル剤として再構成し、製剤化することもできる。
滅菌凍結乾燥粉末は、不活性酵素の化合物をバッファー溶液に溶解することによって製造される。バッファー溶液は、安定性を改善する賦形剤、またはその粉末もしくはその粉末から調製される再構成溶液の他の薬理学的構成要素を含有しうる。次に、その溶液を滅菌濾過してから、当業者に知られる標準的条件下で凍結乾燥することにより、所望の製剤が得られる。簡単に述べると、凍結乾燥粉末は、賦形剤、例えばデキストロース、ソルビトール、フルクトース、コーンシロップ、キシリトール、グリセリン、グルコース、スクロースまたは他の適切な薬剤を、適切なバッファー、例えばクエン酸バッファー、リン酸ナトリウムもしくはリン酸カリウムバッファー、または当業者に知られる他の同様のバッファーに溶解することによって製造される。次に、その結果生じた混合物に選択した酵素を加え、それが溶解するまで撹拌する。その結果生じた混合物を滅菌濾過するか、粒状物を除去して滅菌性を保証するための処理に付し、凍結乾燥用のバイアルに分注する。各バイアルは単回投薬量（1mg〜1g、一般的には1〜100mg、例えば1〜5mg）または複数回投薬量の化合物を含有することになる。凍結乾燥粉末は適当な条件下で、例えば約4℃〜室温で貯蔵することができる。
この凍結乾燥粉末をバッファー溶液で再構成することにより、非経口投与に使用するための製剤が得られる。再構成用に選択される溶液は任意のバッファーであることができる。再構成には、1mLのバッファーまたは他の適切な担体につき、約1μg〜20mg、好ましくは10μ〜20mg、より好ましくは約100μgを加える。正確な量は処置される適応症および選択した化合物に依存する。そのような量は経験的に決定することができる。
2．局所外用投与
局所外用混合物は、局所投与および全身投与に関して説明したように製造される。その結果得られる混合物は、溶液、懸濁液、乳液などであることができ、クリーム剤、ゲル剤、軟膏、乳剤、溶液剤、エリキシル剤、ローション剤、懸濁剤、チンキ剤、ペースト剤、フォーム（foam）、エアロゾル、灌注剤、噴霧剤、坐剤、包帯、皮膚パッチまたは局所外用投与に適した他の任意の製剤として製剤化される。
化合物または医薬上許容されるその誘導体は、吸入（例えば炎症性疾患、特に喘息の処置に役立つステロイドを送達するためのエアロゾルが記載されている米国特許第4,044,126号、同第4,414,209号、および同第4,364,923号を参照されたい）などによる局所外用適用のためのエアロゾルとして製剤化することができる。気道に投与するためのこれらの製剤は、ネブライザー（nebulizer）用のエアロゾルまたは溶液の形態をとるか、単独で、またはラクトースなどの不活性担体と組み合わされて、吹送（insufflation）用の微細粉末としての形態をとることができる。そのような場合、製剤の粒子は、典型的には、50ミクロン未満、好ましくは10ミクロン未満の直径を有するだろう。
組成物は、局所適用または局所外用適用のために、ゲル剤、クリーム剤、ローション剤の形態で、例えば目などの皮膚および粘膜への局所外用適用のために、目への適用のために、または槽内もしくは髄腔内適用のために、製剤化することができる。局所外用投与は、経皮送達、目または粘膜への投与、または吸入治療に関して考えられる。活性化合物のみの点鼻液または他の医薬上許容される賦形剤と組み合わされた活性化合物の点鼻液も投与することができる。
経皮投与に適した製剤を提供する。それらは、例えば長期間にわたってレシピエントの表皮と密接に接触した状態で残るように適合させた別々のパッチなど、任意の適切な形式で提供することができる。そのようなパッチは、例えば活性化合物に関して0.1〜0.2Mの濃度を有する、緩衝化されていてもよい水溶液中に、活性化合物を含有することができる。経皮投与に適した製剤は、イオントフォレシス（例えばPharmaceutical Resaerch 3(6), 318 (1986)参照）によって送達することもでき、典型的には、緩衝化されていてもよい活性化合物の水溶液の形態をとることができる。
3．他の投与経路のための組成物
処置される状態によっては、例えば局所外用適用、経皮パッチ、経口および直腸投与などといった他の投与経路も、本発明では考えられる。例えば、直腸投与のための医薬剤形は、全身作用のための直腸坐剤、カプセル剤および錠剤である。直腸坐剤には、体温で融解または軟化して1つまたはそれ以上の薬理学活性成分または治療活性成分を放出する、直腸に挿入するための固形物が含まれる。直腸坐剤に利用される医薬上許容される物質は、基剤または媒体および融点を上昇させるための薬剤である。基剤の例には、カカオ脂（カカオ油）、グリセリン-ゼラチン、カーボワックス（ポリオキシエチレングリコール）ならびに脂肪酸のモノ-、ジ-およびトリ-グリセリドの適当な混合物などがある。さまざまな基剤の組合せを使用することができる。坐剤の融点を上昇させるための薬剤には鯨蝋およびワックスがある。直腸坐剤は、圧縮法または成形法によって製造することができる。直腸坐剤の典型的な重量は約2〜3gである。直腸投与用の錠剤およびカプセル剤は、経口投与用の製剤と同じ医薬上許容される物質および同じ方法を使って製造される。
直腸投与に適した製剤は、単位用量坐剤として提供することができる。これらは、活性化合物を1つまたはそれ以上の従来の固形担体、例えばカカオ脂と混合し、次に、その結果生じた混合物を付形することによって、製造することができる。
経口投与の場合、医薬組成物は、例えば、通常の手段により、結合剤（例えばアルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、充填剤（例えばラクトース、微結晶セルロースまたはリン酸水素カルシウム）、滑沢剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ）、崩壊剤（例えばバレイショデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）、または湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの医薬的に許容できる賦形剤を使って製造される錠剤またはカプセル剤などの形態をとることができる。錠剤は、当技術分野において周知の方法で、コーティングすることができる。
口腔粘膜（舌下）投与に適した製剤には、例えば、フレーバー付き基剤、通常はスクロースおよびアラビアゴムまたはトラガカント中に活性化合物を含有する口中錠；ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアラビアゴムなどの不活性基剤中に化合物を含有するトローチ剤（pastille）などがある。
医薬組成物は、放出制御製剤および/または送達器具によって投与することもできる（例えば米国特許第3,536,809号；同第3,598,123号；同第3,630,200号；同第3,845,770号；同第3,847,770号；同第3,916,899号；同第4,008,719号；同第4,687,610号；同第4,769,027号；同第5,059,595号；同第5,073,543号；同第5,120,548号；同第5,354,566号；同第5,591,767号；同第5,639,476号；同第5,674,533号および同第5,733,566号参照）。
例えば限定するわけではないが、リポソームへの封入、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現する能力を有する組換え細胞、受容体介在エンドサイトーシス、および選択したマトリックス分解酵素をコードする核酸分子の送達、例えばレトロウイルス送達系など、さまざまな送達系が知られており、選択したtsMMPを投与するためにそれらを使用することができる。
したがって、一定の実施形態では、リポソームおよび/またはナノ粒子も、マトリックス分解酵素の投与に使用することができる。リポソームは、水性媒質中に分散されて自発的にマルチラメラ同心二重層小胞（マルチラメラ小胞（MLV）とも呼ばれる）を形成するリン脂質から形成される。MLVは一般に25nm〜4μmの直径を有する。MLVの超音波処理により、コア中に水溶液を含有する、直径が200〜500オングストロームの範囲の小さなユニラメラ小胞（SUV）の形成が起こる。
リン脂質は、水に分散させると、脂質対水のモル比に応じて、リポソーム以外のさまざまな構造を形成することができる。低い比ではリポソームが形成される。リポソームの物理的特徴はpH、イオン強度および二価カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性物質および極性物質に対して低い透過性を示しうるが、温度が上昇すると、その透過性を著しく変化させる相転移を起こす。相転移は、ゲル状態として知られる密にパッケージングされた秩序正しい構造から、流動状態として知られる緩くパッケージングされた秩序の低い構造への変化を伴う。これは、特有の相転移温度で起こり、イオン、糖類および薬物に対する透過性の増加をもたらす。
リポソームは、次に挙げるさまざまな機序で、細胞と相互作用する：マクロファージおよび好中球などの網内系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的な弱い疎水力または静電力によるか、細胞表面構成要素との特異的相互作用による、細胞表面への吸着；リポソーム内容物の細胞質への同時放出を伴う、形質膜へのリポソームの脂質二重層の挿入による形質細胞膜との融合；およびリポソーム内容物の関与を伴わないリポソーム脂質の細胞膜もしくは細胞内成分膜への移動またはその逆。リポソーム製剤を変えることで、どの機序が作動するかを変えることができる。ただし、2つ以上の機序が同時に作動する場合もある。ナノカプセルは一般に、化合物を、安定にかつ再現性のある方法で封入することができる。細胞内ポリマー過負荷による副作用を避けるために、それらの超微細粒子（0.1μm程度のサイズ）は、インビボで分解されうるポリマーを使って設計される。本発明での使用には、これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル-シアノアクリレートナノ粒子が考えられ、そのような粒子は容易に作製することができる。
4．活性化因子
一般に、tsMMPは、酵素の活性化のための必要許容温度を提供する活性化因子の存在下で投与される。言い換えると、本発明が提供するtsMMPは、必要許容温度における投与に備えている。したがって、本発明が提供する活性化因子には、熱いまたは冷たい温度条件を提供する能力を有し、かつ外部から提供されない限り投与部位には存在しないものが含まれる。したがってtsMMPは、温度条件へのばく露のタイミングおよび持続時間を制御することによって、調節することができる。活性化因子は、その特定酵素と活性化のために設けられた許容温度要件とに応じて、温かい温度または冷たい温度を提供するように選択される。
例えば、許容温度が25℃である場合、活性化因子として、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、11℃、10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃またはその前後もしくはそれ以下であるバッファーまたは他の液状希釈剤が挙げられる。言い換えると、tsMMPは、25℃、24℃、23℃、22℃、21℃、20℃、19℃、18℃、17℃、16℃、15℃、14℃、13℃、12℃、11℃、10℃、9℃、8℃、7℃、6℃、5℃またはその前後もしくはそれ以下であるバッファーまたは他の液状希釈剤に提供および/またはばく露される。バッファーまたは液体は、tsMMPと同じ組成物として提供することもできるし、別個の組成物として提供することもできる。別々に提供する場合は、tsMMPより前に投与するか、tsMMPと同時に投与するか、tsMMP後に投与するか、tsMMPとは断続的に投与することができる。生理的温度が37℃またはその前後であるインビボに投与すると、バッファーの温度は、tsMMPを活性化するための許容温度を与える温度まで温まるだろう（これは、液体の温度に依存して、直ちにまたはほとんど直ちに起こり得る）。インビボでの生理的温度条件ゆえに、温度は非許容条件まで温まり、その結果、酵素の不活化とその時間的制御がもたらされるだろう。
もう一つの例として、活性化因子は、その特定酵素および与えられた許容温度に応じて、冷温パックまたは温熱パックであることができる。そのような活性化因子には、アイスラップ（ice wrap）、ゲルアイスパック、寒冷療法（cold therapy）、アイスパック、冷湿布、アイスブランケット（ice blanket）、または他の類似のアイテムがあるが、これらに限るわけではない。言い換えると、同じ個所へのtsMMPの投与の前に、または同時に、またはその後に、投与部位をそれぞれ身体の生理学的温度より低くまたは高く冷却しまたは温めるために、tsMMPの投与個所の部位を冷温パックまたは温熱パックにばく露することができる。例えば冷温パックは凍結していてもよいし（例えばアイスパック）、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃またはそれ以上の温度に維持された液体冷温パックであってもよい。冷温または温熱パックは、処置個所に直接適用することができ、一般的には、皮膚の、tsMMPを投与する部位に局所的に適用することができる。当業者は、処置されている組織の特定の標的深度、使用されている特定酵素、および既知の試験プロトコールに基づく他の因子に応じて、またはインビボもしくはインビトロ試験データからの推論によって、適用に必要な時間の長さを経験的に決定することができる。温熱パックまたは冷温パックは、tsMMPの前、後、tsMMPと同時、またはtsMMPとは断続的に適用することができる。例えば、その特定酵素が可逆的に活性である場合は、冷温パックを、数時間または数日の間、断続的に適用することができる。冷温パックを投与すると、対象は通例、冷感、痛みおよび灼熱感ならびにしびれ感を覚え、対象または処置医は、そのような症状をモニタリングすることができると理解される。
特定の実施形態では、tsMMPが、投与の直前に身体の許容温度またはそれ以下である温度にばく露される。例えば、tsMMPを低温で貯蔵し、かつ/または冷たいバッファー中に再構成する。いくつかの例では、tsMMPの投与個所も、投与部位を身体の生理的温度未満に冷却するために、冷温パックへのばく露によって、低温にばく露される。tsMMPを投与すると、tsMMPは許容温度にばく露され、それが、非許容性である身体の生理的温度（例えば約37℃）まで徐々に温まることになる。温度が非許容温度に到達すると、tsMMPは不活性になるか、実質的に不活性になる。したがってtsMMPの活性化は条件的に制御される。身体の生理学的温度より低い許容温度へのばく露の持続時間は、予め定められた時間にわたる投与部位における冷温パックへの継続的ばく露によって制御することができる。
もう一つの実施形態では、tsMMPが、投与直前に、身体の許容温度またはそれ以上である温度にばく露される。例えば、tsMMPを、身体の生理学的温度より高い、温かい温度で貯蔵し、かつ/または温かいバッファー中に再構成する。いくつかの例では、tsMMPの投与個所も、投与部位を身体の生理的温度より高く温めるために、温熱パックへのばく露によって温められる。tsMMPを投与すると、tsMMPは許容温度にばく露され、それが、非許容性である身体の生理的温度（例えば約37℃）まで徐々に冷めることになる。温度が非許容温度に到達すると、tsMMPは不活性になるか、実質的に不活性になる。したがってtsMMPの活性化は条件的に制御される。身体の生理学的温度より高い許容温度へのばく露の持続時間は、予め定められた時間にわたる投与部位における温熱パックへの継続的ばく露によって制御することができる。
5．併用療法
本明細書に記載する改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPは、いずれも、他の治療的または薬理学的な薬剤または手法（procedure）と共に、その前に、それとは断続的に、またはその後に、共処方（co-formulate）または共投与（co-administer）することができる。そのような薬剤には、他の生物製剤（biologics）、小分子化合物、分散剤、麻酔薬、血管収縮薬、および外科手術、ならびにそれらの組合せなどがあるが、これらに限るわけではない。例えば、上に例示したものを全て含めて、いかなる疾患または状態についても、そのための他の薬剤および処置を利用することができるのであれば、その疾患および状態のために選択した改変MMP、例えばtsMMPを、それと組み合わせて使用することができる。もう一つの例では、疼痛軽減のために局所麻酔薬、例えばリドカインを投与することができる。いくつかの例では、麻酔薬を、麻酔効果の持続時間を増加させるために、血管収縮薬と組み合わせて提供することができる。本発明が提供する薬理学的薬剤はいずれも、例えば皮下投与後の医薬剤の組織へのアクセスを容易にするために、分散剤と組み合わせることができる。そのような物質は当技術分野では知られており、例えば、ヒアルロニダーゼ糖タンパク質ファミリーのメンバーなど、可溶性グリコサミノグリカナーゼ酵素が挙げられる（US20050260186、US20060104968）。
本発明が提供する改変MMP（例えばtsMMP）の組成物は、局所麻酔と共処方または共投与することができる。麻酔には、短時間作用型および長時間作用型局所麻酔薬製剤が含まれる。短時間作用型局所麻酔薬製剤は、食塩水または他の適切な注射媒体中に、リドカインまたは関連局所麻酔薬を含有する。短時間作用型局所麻酔薬による局所麻酔は、典型的には、約20〜30分間持続する。代表的な麻酔薬には、例えば、非吸入局所麻酔薬、例えばアムブカイン類；アモキセカイン類；アミロカイン類；アプトカイン類；アルチカイン類；ベノキシネート類；ベンジルアルコール類；ベンゾカイン類；ベトキシカイン類；ビフェナミン類；ブクリカイン類；ブメカイン類；ブピバカイン類；ブタカイン類；ブタムベン類；ブタニリカイン類；カルビゾカイン類；クロロプロカイン類；クリブカイン類；クロダカイン類；コカイン類；デキシバカイン類；ジアモカイン類；ジブカイン類；ジクロニン類；エルカイン類；エチドカイン類；エウプロシン類；フェキシカイン類；フォモカイン類；ヘプタカイン類；ヘキシルカイン類；ヒドロキシプロカイン類；ヒドロキシテトラカイン類；イソブタムベン類；ケトカイン類；ロイシノカイン類；リドカイン類；メピバカイン類；メプリルカイン類；オクトカイン類；オルトカイン類；オキセタカイン類；オキシブプロカイン類；フェナカイン類；ピノルカイン類；ピペロカイン類；ピリドカイン類；ポリドカノール類；プラモカイン類；プリロカイン類；プロカイン類；プロパノカイン類；プロピポカイン類；プロポキシカイン類；プロキシメタカイン類；ピロカイン類；カタカイン類；キニソカイン類；リソカイン類；ロドカイン類；ロピバカイン類；サリチルアルコール類；スイカイン類；テトラカイン類；トラペンカイン類；およびトリメカイン類；ならびにさまざまな他の非吸入麻酔薬、例えばアルファキサロン類；アモラノン類；エトキサドロール類；フェンタニル類；ケタミン類；レボキサドロール類；メチツラール類；メトヘキシタール類；ミダゾラム類；ミナキソロン類；プロパニジド類；プロポキセート類；プラモキシン類；プロポフォール類；レミフェンタニル類；スフェンタニル類；チレタミン類およびゾラミンなどがある。製剤中の有効量は、その特定患者、処置されるべき疾患、投与経路および他の考慮すべき事項に依存してさまざまであるだろう。そのような投薬量は経験的に決定することができる。
局所麻酔薬は半減期が短いので、多くの場合、そのような麻酔薬を血管収縮薬と共投与または共処方することが望ましい。血管収縮薬の例には、カテコールアミン類およびカテコールアミン誘導体を含むαアドレナリン作動性受容体アゴニストがある。具体例としてレボノルデフリン、エピネフリンおよびノルエピネフリンが挙げられるが、これらに限るわけではない。例えば、リドカインなどの局所麻酔薬製剤は、低濃度のエピネフリンまたはレボノルデフリンなどの他のアドレナリン作動性受容体アゴニストを含有するように製剤化することができる。局所麻酔薬をアドレナリン作動性受容体アゴニストと併用することは、医薬品では一般的である（例えば米国特許第7,261,889号および同第5,976,556号を参照されたい）。麻酔薬の半減期を増加させるには血管収縮薬が必要である。エピネフリンなどの血管収縮薬は、注射された組織において血管上のα-アドレナリン作動性受容体を刺激する。これは、組織中の血管を収縮させる効果を有する。血管収縮は局所麻酔薬を組織内にはるかに長時間留まらせることになり、その結果、麻酔効果の持続時間を大きく増加させる。
一般に、血管収縮薬は、本発明では、麻酔薬と組み合わせて使用される。麻酔剤と血管収縮薬は、単一医薬組成物の一部として一緒に投与するか、別個の医薬組成物の一部として投与され、血管収縮薬が投与された麻酔剤に近接する血管を収縮するように作用する限り、麻酔の効果を共同して引き延ばすように作用することができる。ある例では、麻酔剤と血管収縮薬を、溶液状態にして一緒に投与する。また、麻酔剤と血管収縮薬は、活性化可能なマトリックス分解酵素および活性化因子と一緒に製剤化するか、別々に製剤化することができる。単一の製剤が好ましい。麻酔剤と血管収縮薬は、注射、浸透、または局所外用投与により、例えばゲル剤またはペースト剤の一部として投与することができる。典型的には、麻酔剤と血管収縮薬は、麻酔されるべき部位への直接的な注射によって、例えば皮下投与によって、投与される。製剤中の有効量は、その特定患者、処置されるべき疾患、投与経路および他の考慮すべき事項に依存してさまざまであるだろう。そのような投薬量は経験的に決定することができる。例えば、リドカインの代表的な量は、10mg〜1000mg、100mg〜500mg、200mg〜400mg、20mg〜60mg、もしくは30mg〜50mg、またはその前後である。投与されるリドカインの投薬量は、その個体および投与経路に依存してさまざまであるだろう。エピネフリンは、例えば10μg〜5mg、50μg〜1mg、50μg〜500μg、50μg〜250μg、100μg〜500μg、200μg〜400μg、1mg〜5mgまたは2mg〜4mgなどの量で投与することができる。典型的には、エピネフリンをリドカインと1：100,000〜1：200,000の希釈度で組み合わせることができ、これは100mlの麻酔薬が0.5〜1mgのエピネフリンを含有することを意味する。投与される体積は、処置される疾患および投与経路に応じて、調節することができる。本発明では、セルライトなどのECM介在疾患または状態を処置するために、1〜100ml、1〜50ml、10〜50ml、10〜30ml、1〜20ml、または1〜10ml、典型的には10〜50mlの麻酔薬/血管収縮薬製剤を、皮下に投与することができると考えられる。投与は、活性化可能なマトリックス分解酵素および活性化因子の投与の後、またはそれと同時、またはそれとは断続的に行うことができる。
本発明が提供する改変MMPポリペプチド（例えばtsMMP）の組成物は、分散剤と共処方または共投与することもできる。分散剤は、他の薬理学的薬剤、例えば麻酔薬、血管収縮薬、または生物学的作用因子（biologic agent）と、共処方または共投与することもできる。分散剤の代表例は、グリコサミノグリカンの分解によって間質腔にチャネルを開けるグリコサミノグリカナーゼである。これらのチャネルは、用量および製剤に依存して、24〜48時間にわたり、比較的開いた状態に留まることができる。そのようなチャネルは、外から加えた分子、例えば流体、小分子、タンパク質（マトリックス分解酵素など）、核酸および遺伝子治療ベクター、ならびにサイズが約500nm未満である他の分子の核酸を容易にするために使用することができる。また、そのようなチャネルの形成は、間質腔内でのバルク流体流を容易にすることができ、それは結果として、時に「対流輸送」または単に対流と呼ばれるプロセスにおいて流体によって効果的に運ばれる溶質（例えば、検出可能な分子もしくは他の診断剤、麻酔薬または他の組織修飾剤、薬学的または医薬的に有効な薬剤、または化粧品その他の美容剤）の分散または移動を促進することができると考えられる。そのような対流輸送は、分子拡散の速度および累積効果を実質的に超えることができ、したがって、治療分子または他の投与された分子を、より迅速かつ効果的に組織に灌流させることができる。さらにまた、ある薬剤、例えば改変MMP（例えばtsMMP）、麻酔薬その他の薬剤が、グリコサミノグリカナーゼと共処方または共投与され、両者が比較的限定された局所部位、例えば非静脈内非経口投与の部位（例えば皮内、皮下、筋肉内、または他の体内組織、内臓、または身体内の他の比較的限定された空間）に注射される場合は、投与される用量に付随する流体は、局所的駆動力（すなわち静水圧）を与えると共に、流れに対するインピーダンスを（間質マトリックス内にチャネルを切り開くことによって）低下させることができ、それらはどちらも、流体流を増加させ、それに伴って、流体内に含まれる治療剤その他の分子の対流輸送を増加させることになるだろう。結果として、グリコサミノグリカナーゼの使用は、共処方または共投与される薬剤、例えばマトリックス分解酵素の、バイオアベイラビリティを改善すると共に、他の薬物動態および/または薬力学的特徴を操作するのに、大いに役立ちうる。
ヒアルロニダーゼ
グリコサミノグリカナーゼの代表例はヒアルロニダーゼである。ヒアルロニダーゼは、ヒアルロン酸を分解する酵素のファミリーである。ヒアルロニダーゼは、間質障壁の主要構成要素であるヒアルロン酸の加水分解を触媒することによって、ヒアルロン酸の粘度を低下させ、それによって組織の透過性を増加させる。ヒアルロニダーゼには、次に挙げる3つの一般クラスがある。四糖および六糖を主要最終産物とするエンド-β-N-アセチルヘキソサミニダーゼである哺乳動物型ヒアルロニダーゼ（EC 3.2.1.35）。これらは、加水分解活性とグリコシル基転移活性の両方を持ち、ヒアルロナンおよびコンドロイチン硫酸（CS）、一般的にはC4-SおよびC6-Sを分解することができる。ヒアルロナンを分解すると共に、CSおよびDSをさまざまな程度に分解する、細菌ヒアルロニダーゼ（EC 4.2.99.1）。これらは、主として二糖最終産物を与えるβ脱離反応によって作用するエンド-β-N-アセチルヘキソサミニダーゼである。β1-3結合の加水分解によって四糖および六糖最終産物を生成するエンド-β-グルクロニダーゼである、ヒル、他の寄生虫、および甲殻類に由来するヒアルロニダーゼ（EC 3.2.1.36）。
ヒトゲノムには6つのヒアルロニダーゼ様遺伝子、すなわちHYAL1（配列番号3469）、HYAL2（配列番号3470）、HYAL3（配列番号3471）、HYAL4（配列番号3472）、PH20/SPAM1（配列番号3473）および1つの発現偽遺伝子HYALP1がある。ヒアルロニダーゼのうち、PH20はプロトタイプの中性活性酵素であり、他の酵素は、ヒアルロナンに対して、またはどの既知基質に対しても、触媒活性を呈さないか、酸性pH条件下でのみ活性である。ヒアルロニダーゼ様酵素は、ヒトHYAL2およびヒトPH20など、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカーで一般に形質膜に固定されているもの（Danilkovitch-Miagkovaら (2003) Proc Natl Acad Sci USA. 100(8):4580-5）、およびヒトHYAL1など、一般に可溶性であるもの（Frostら, (1997) Biochem Biophys Res Commun. 236(1):10-5）によって、特徴づけることもできる。一部のヒアルロニダーゼのN結合型グリコシル化は、その触媒活性および安定性にとって極めて重要でありうる。糖タンパク質を修飾するグリカンのタイプを変化させることは、タンパク質の抗原性、構造フォールディング、溶解度、および安定性に劇的な影響を有しうるが、多くの酵素は、最適な酵素活性にグリコシル化を必要としないと考えられている。したがって、N結合型グリコシル化の除去がほぼ完全なヒアルロニダーゼ活性の不活化をもたらすヒアルロニダーゼは、この点でユニークである。そのようなヒアルロニダーゼにとっては、N結合型グリカンの存在が、活性酵素の生成にとって決定的に重要である。
ヒトPH20（精子表面タンパク質PH20とも呼ばれる）は、本来、精子-卵子接着に関与し、ヒアルロン酸を消化することによって精子が卵丘細胞の層を貫通するのを助ける。通常、PH20 mRNA転写産物（配列番号3474に示す配列のヌクレオチド1058〜2503に対応する）は翻訳されて、N末端（アミノ酸残基位置1〜35）に35アミノ酸のシグナル配列を含有し、C末端に19アミノ酸のGPIアンカー（アミノ酸残基491〜509に対応する）を含有する、509アミノ酸の前駆体タンパク質を生成する。その前駆体配列を配列番号3473に示す。配列番号3474に示す核酸の配列のヌクレオチド位置2188にC→Tの突然変異を含有するmRNA転写産物も存在し、これは、配列番号3473に示す翻訳産物をもたらすサイレント突然変異である。したがって成熟PH20は、配列番号3473に示すアミノ酸の配列のアミノ酸36〜509に対応する474アミノ酸ポリペプチドである。ヒアルロニダーゼ活性に要求される潜在的N結合型グリコシル化部位は、配列番号3473に例示するヒトPH20のN82、N166、N235、N254、N368、N393、N490にある。システイン残基C60とC351およびC224とC238（配列番号3473に示すアミノ酸に対応）の間にジスルフィド結合が形成されて、コアヒアルロニダーゼドメインを形成する。中性酵素触媒活性には、配列番号3473のアミノ酸36〜464が最小活性ヒトPH20ヒアルロニダーゼドメインを含有するように、カルボキシ末端に追加のシステインが要求される。
可溶型の組換えヒトPH20は作製されており、組織中への拡散を可能にするために、tsMMP、活性化因子、麻酔薬、血管収縮薬、他の医薬剤もしくは治療剤、またはそれらの組合せと共投与または共処方して、本明細書に記載する方法において使用することができる。そのような可溶型のPH20の作製は、関連出願第11/065,716号および同第11/238,171号に記載されている。可溶型には、配列番号3476〜3481に示すアミノ酸の配列のアミノ酸1〜アミノ酸442、443、444、445、446および447を含有するポリペプチドを生成させるC末端切断を有するものがいずれも含まれるが、これらに限るわけではない。そのようなポリペプチドの代表例は、配列番号3475に示すアミノ酸1〜482をコードする核酸分子から生成するものである。結果として得られる精製rHuPH20は、生産時および精製時の培養培地中に存在するペプチダーゼにより、不均一でありうる。ヒアルロニダーゼの触媒活性および安定性にとってグリコシル化は重要であるから、一般に可溶型のPH20は、ポリペプチド活性を保っていることを保証するために、正しいN-グリコシル化を容易にするタンパク質発現系を使って生産される。そのような細胞には、例えばチャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞（例えばDG44 CHO細胞）がある。
可溶性PH20は、本明細書の他の項で説明するように任意の適切な経路によって投与することができる。典型的には、投与は、皮内、筋肉内、皮下または血管内投与などの、非経口投与による。本発明が提供する化合物は、例えばボーラス注射または持続注入などの注射による非経口投与用に製剤化することができる。注射用の製剤は、単位剤形で、例えばアンプルに入れて、または多用量型容器に入れて、保存剤を添加して、提示することができる。組成物は、油性または水性媒体中の懸濁液、溶液または乳液であることができ、懸濁化剤、安定剤および/または分散剤などの製剤用薬剤を含有することができる。あるいは、活性成分は、使用前に適当な媒体、例えば滅菌パイロジェンフリー水または他の溶媒を使って再構成するための粉末状であることもできる。例えば本発明では、安定化された溶液または懸濁液中の、または凍結乾燥型の、有効量の可溶性PH20、例えば10単位〜500,000単位、100単位〜100,000単位、500単位〜50,000単位、1000単位〜10,000単位、5000単位〜7500単位、5000単位〜50,000単位、または1,000単位〜10,000単位、一般に10,000〜50,000単位を含有する、非経口製剤を提供する。製剤は、例えば限定するわけではないが、アンプル、シリンジおよび個別包装された錠剤またはカプセル剤などの単位用量型で提供することができる。分散剤は単独で、または他の薬理学的に有効な薬剤と共に、1〜100ml、1〜50ml、10〜50ml、10〜30ml、1〜20ml、または1〜10ml、典型的には10〜50mlの総体積で投与することができる。
併用療法の一例として、本発明では、麻酔薬、血管収縮薬および分散剤を、その後に投与されるか、それと同時に投与されるか、それとは断続的に投与されるtsMMPと、共投与または共処方することが考えられる。代表的な製剤は、リドカイン、エピネフリンおよび可溶性PH20、例えば配列番号3476に示す可溶性PH20を含有するものである。可溶性PH20は、リドカイン（キシロカイン）と、また場合によってはエピネフリンと、直接混合することができる。製剤は、単位剤形で、例えばシリンジなどの形態に、製造することができる。例えば、リドカイン/エピネフリン/可溶性PH20製剤は、例えば1〜100ml、1〜50ml、10〜50ml、10〜30ml、1〜20ml、または1〜10ml、典型的には10〜50mlの体積で、使用のためにシリンジに前もって予め包装された状態で、提供することができる。
併用療法では、他の医薬剤、例えばリドカイン/エピネフリン/可溶性PH20製剤を、活性化可能なマトリックス分解酵素（および活性化因子）の投与と一緒に、またはその投与と時間的に近接して、共投与することができる。典型的には、麻酔薬および/または分散剤を、医薬剤の直前（例えば5〜60分前）に投与するか、便宜上、一緒に投与することが好ましい。当業者には理解されるであろうように、共投与の望ましい近接性は、その特定組織環境における薬剤の有効半減期、および処置されるその特定疾患に、かなりの部分、依存し、適切なモデル、例えば適切な動物モデルにおいて、それらの薬剤をさまざまな間隔で投与した効果を調べることによって、容易に最適化することができる。
tsMMPの包装および製品
改変MMP、例えばtsMMP、または改変MMPをコードする核酸、またはそれらの誘導体もしくは変異体の医薬化合物は、包装材料、疾患または障害の処置に有効な医薬組成物、および選択された改変MMPまたは核酸分子が、その疾患または障害を処置するために使用されるべきものであることを示すラベルを含有する製品として包装することができる。使用指示書を提供することができる。例えば、tsMMPが投与の直前に低温に保たれた添付の液状バッファーまたは溶液で再構成されるべきであることを明記した指示書を提供することができる。tsMMPの投与部位における冷温パックの投与に関する指示書を提供することもできる。改変MMP、例えばtsMMP、またはその誘導体もしくは変異体と、活性化因子（例えば冷温パックまたは液状バッファー）との組合せも、製品中に包装することができる。いくつかの例において、組合せは、プロセシング因子も含むことができる。
本発明が提供する製品は包装材料を含有する。医薬製品を包装するのに使用される包装材料は当業者にはよく知られている。例えば米国特許第5,323,907号、同第5,052,558号および同第5,033,252号（これらはそれぞれその全てが本明細書に組み込まれる）を参照されたい。医薬包装材料の例として、限定するわけではないが、ブリスター包装、瓶、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、シリンジ、瓶、および選ばれた製剤および意図する投与および処置の様式に適した任意の包装材料が挙げられる。製品は、局所注射のために、投与（例えば表皮下投与）が容易になるよう、針または他の注射器具を含むことができる。本明細書が提供する化合物および組成物には、多種多様な製剤が考えられ、任意のECM介在疾患または障害のためのさまざまな処置も同様である。
包装の選択は、tsMMPおよび活性化因子（それと共に含まれる場合）に依存すると共に、それらの組成物が一緒に包装されるか、別々に包装されるかにも依存する。一般に、包装は、tsMMPの活性化が活性化因子の添加前に起こらないように、そこに含有される組成物とは非反応性である。ある例では、改変MMPを、再構成用のバッファーまたは希釈剤と一緒に、凍結乾燥状態で包装することができる。バッファーまたは希釈剤は、活性化された条件を提供する温度で別々の保存するか、所望する時に活性化条件を提供する能力を有する形態で提供することができる。例えば、使用前にバッファーまたは希釈剤を冷蔵または冷却および/または温めるように、指示書を提供することができる。あるいは、例えば酵素の再構成とその投与後に、投与個所で冷温パックまたは温感パックを使って酵素を活性化するように、指示書を提供することができる。
活性化因子へのばく露は、必要許容温度へのtsMMPのばく露により、tsMMPの投与に先だって、いつでも行うことができる。例えば容器は、tsMMPを含有する単一の区画であって、使用者が例えばその区画の開口部を通して活性化因子（例えば冷温または室温の液状バッファーまたは溶液）を添加することが可能な区画を有しうる。tsMMPを封じ込めるための限定された空間を有することが可能であり、活性化に必要な最終構成要素の添加を可能にするための簡単な操作が可能である、任意の容器または他の製品が考えられる。活性化因子は使用前に加えられる。活性化因子へのばく露は、間質への投与後に行うこともできる。例えば、熱が活性化因子である場合は、tsMMPを投与し、その局所的注射部位を熱にさらすことができる。低温が活性化因子である場合は、tsMMPを投与し、その局所的注射部位を例えば冷温パックによって冷気にさらすことができる。
別の例では、マトリックス分解酵素の活性化が、使用者によるその容器内での自由な活性化を許すように、tsMMPを活性化因子と共に容器に包装する。一般に、そのような容器の例としては、マトリックス分解酵素を含有する閉じた限定的空間と、活性化因子を含有する別個の閉じた限定的空間とを有し、それら2つの空間が容易に除去できる膜で分離されていて、その膜を除去すれば、構成要素が混合され、それによって反応させることができ、その結果、プロテアーゼの活性化が起こるようになっているものが挙げられる。容器は、活性化因子が、MMPの活性化のための必要許容温度にあるか、またはそれに近くなるような条件下で、貯蔵することができる。あるいは、酵素の使用および再構成の直前に、活性化因子を含有する容器の側面だけを（例えばそれをアイスラップまたは他の温度条件にばく露することによって）所望の温度に冷却しまたは温めることもできる。tsMMPが活性化因子から分離されている限り、任意の容器または他の製品が考えられる。tsMMPへの活性化因子のばく露は使用前に行われる。例えば、物理的分離手段は、使用者によって容易に除去されて混合を可能にし、酵素の活性化をもたらすものである。例えば、製品はtsMMPを一つの区画に含有し、活性化因子（例えば冷温または室温の液状バッファーまたは溶液）を隣接する区画に含有することができる。区画は、製品を圧迫すると破裂して分離された構成要素の混合を可能にする膜などの分割部材によって分離される。適切な実施形態については、例えば米国特許第3,539,794号および同第5,171,081号に記載の容器を参照されたい。
以下に、活性化可能なマトリックス分解酵素のさまざまな最終用途の包装要件の例を、いくつか挙げる。これらは例示に過ぎず、決して限定を意図するものではない。
1．単一チャンバー装置
本発明における最も簡単な実施形態には、装置が単一のチャンバーまたは容器を含有し、必要であれば排出手段を含有するものがある。単一チャンバーの筐体または容器には、その容器内にtsMMPを含んでいる任意のアイテムが含まれる。tsMMPは、液相として、または粉末または他のペーストまたは他の都合の良い組成物として、器（vessel）内に収容される。器または液体は、許容温度またはそれ以下である温度で貯蔵し、かつ/または、投与前に許容温度またはそれ以下である温度に冷却することができる。あるいは、tsMMPを適当な液状希釈剤またはバッファーで再構成し、活性化因子を投与部位に局所的に適用するか（例えば冷温パック）、投与部位に別個に投与する。これらのアイテムおよび活性化因子を含有するキットも提供される。
2．二重チャンバー装置
本発明での使用が考えられる装置の一例は二重チャンバー容器である。一般に、この装置は、活性化条件を提供する能力を有する活性化因子から、活性化が望まれるまで、tsMMPを離しておくための、2つのチャンバーまたは区画を有する。この装置は、装置から吐出する前に構成要素の混合を可能にするための混合チャンバーを含むことができる。あるいは、混合は、活性化因子を一方のチャンバーからtsMMPを含有するもう一つのチャンバーに排出することによって行うこともできる。例えば、活性化可能なtsMMPは凍結乾燥型として提供することができ、再構成は活性化因子（例えば冷温または室温のバッファーまたは液状の溶液）を第1チャンバーから凍結乾燥酵素を含有する第2チャンバー中に排出することによって達成することができる。装置全体の温度を合わせて制御することができ、かつ/または、酵素の使用および再構成前に、活性化因子を含有するチャンバーを所望の温度にすることができると理解される。
ある実施形態において、二重チャンバー装置は、その稼働にメカニカルポンプ機構を使用する。そのような例では、調剤装置（dispensing apparatus）が構成要素を別々のチャンバーに維持する。ポンプ機構を稼働させると、各チャンバーから混合チャンバへと、または一方のチャンバーから第2のチャンバーへと、その内容物が引き抜かれる。混合すると、チャンバー中の構成要素の反応によって、その混合組成物が活性化される。ポンプ機構は、手動で、例えばプランジャーによって稼働させることができる。そのような二重チャンバー装置の代表例には二重チャンバーシリンジがある（例えば米国特許第6972005号、同第6692468号、同第5971953号、同第4529403号、同第4202314号、同第4214584号、同第4983164号、同第5788670号、同第5395326号；および国際特許出願番号WO2007006030、WO2001047584を参照されたい）。
本発明での使用が考えられる二重チャンバー流体調剤装置のもう一つの実施形態は、圧縮ボトルもしくはチューブまたは他の類似する器具の形態をとる。器具は内部に2つの区画を有し、その中で構成要素は分離された状態に保たれる。器具のフタが混合チャンバとして役立つか、混合チャンバが2つのチャンバーとフタの間に配置されるか、または混合を一方のチャンバ内で達成することができる。構成要素は圧迫により、別々の区画から混合チャンバへと追いやられる。次に、それらは混合チャンバから吐出される。例えば、混合された内容物は、吐出末端にプランジャー/シリンジ装置を取り付け、それを通して内容物を引き抜くことによって、器具から取り出すことができる。そのような器具は当技術分野では知られている（例えば国際特許出願番号WO1994015848を参照されたい）。
3．キット
選ばれた改変MMPポリペプチド、例えばtsMMPおよび/またはその製品は、キットとして提供することもできる。キットは、場合によっては、活性化因子および/またはプロセシング因子を含むことができる。キットは、製品として提供される、本明細書に記載する医薬組成物および投与のためのアイテムを含むことができる。例えば選ばれたtsMMPを投与のための器具、例えばシリンジ、吸入器、投薬量カップ、点滴具、またはアプリケーターなどと一緒に供給することができる。組成物は、投与用のアイテムに含まれるか、後で加えられるように別々に提供することができる。一般に、キットは、tsMMPを伴うアイテムと、場合によっては、プロセシング因子および/または活性化条件を提供する能力を有する活性化因子とを含有する。キットは、場合によっては、投薬量、投与レジメンを含む適用の関する指示書、活性化因子の使用（例えばバッファーを温めることもしくは冷却すること、または冷温パックもしくは温熱パックを適用すること）に関する指示書、ならびに投与様式に関する指示書を含むことができる。キットは、本明細書に記載する医薬組成物および診断用のアイテムも含むことができる。例えば、そのようなキットは、対象における選ばれたプロテアーゼの濃度、両または活性を測定するためのアイテムを含むことができる。
H．tsMMPの活性を評価する方法
1．酵素活性を評価する方法
tsMMPを含む改変MMPは、既知の基質に対して、その酵素活性を試験することができる。活性評価は、活性化因子の存在下または非存在下にさまざまな温度で行うことができる。活性評価は、条件培地もしくは他の上清で、または精製タンパク質で行うことができる。
酵素活性は、その酵素の既知の基質を使って基質切断についてアッセイすることにより、評価することができる。基質は、精製タンパク質の形態をとるか、ペプチド基質として提供することができる。例えば、MMPの酵素活性は、コラーゲンの切断によって評価することができる。酵素による精製タンパク質の切断は、例えば限定するわけではないが、HPLC、SDS-PAGE分析、ELISA、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学、免疫沈降、NH2末端配列決定、タンパク質標識および蛍光測定法など、任意のタンパク質検出方法を使って評価することができる。例えば、実施例5では、FITC標識されたコラーゲンの切断に関する酵素活性を評価するためのアッセイを説明する。上清の蛍光はタンパク質の酵素活性のしるしであり、比活性評価のためにタンパク質濃度および標準曲線に対して規格化することができる。
また、酵素活性は、テトラペプチド基質で評価することもできる。基質上の蛍光原基を利用することで、切断の検出が容易になる。例えば基質は、ACC-または7-アミノ-4-メチルクマリン（courmarin）（AMC)-テトラペプチドなどといった、蛍光原でタグ付けされたペプチド基質のテトラペプチドとして提供することができる。他の蛍光原基も知られており、それらを使用して、タンパク質基質またはペプチド基質に結合することができる。それらには、例えば7-アミノ-4-メチル-2-キノリノン（AMeq）、2-ナフチルアミン（NHNap）および7-アミノ-4-メチルクマリン（NHMec）などがある（Robert J. BeynonおよびJudith S. Bond編「Proteolytic Enzymes: A Practical Approach」（Oxford University Press、2001）の45〜76頁、Sarathら著「Protease Assay Methods」）。ペプチド基質は当業者に知られており、代表的な蛍光原ペプチド基質も同様である。例えば、MMP用の代表的な基質には、Mca-K-P-L-G-L-Dpa-A-R-NH2（配列番号707；Mca＝(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル；Dpa＝N-3-(2,4-ジニトロフェニル)-L-2,3-ジアミノプロピオニル；R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス、カタログ番号ES010）と呼ばれるペプチドIX、およびそのバリエーション、例えば異なる蛍光原基を持つものがある。蛍光強度によって酵素活性を測定するための酵素アッセイが標準的であり、典型的には、酵素と基質のインキュベーション時間の関数として行われる（例えばDehrmannら (1995) Arch. Biochem. Biophys., 324:93-98；Barrettら (1981) Methods Enzymol., 80:536-561）。蛍光基質を用いる代表的なアッセイを本明細書の実施例2に記載する。
蛍光原化合物の検出は蛍光計を使って行うことができるが、検出は、当業者に周知のさまざまな他の方法によって行うこともできる。したがって例えば、発蛍光団が可視波長で発光する場合、検出は単に、光源による励起に応答して起こる蛍光の目視検査によって行うことができる。検出は、ディジタイザーまたは他の画像取得システムに接続されたビデオカメラを利用する画像解析システムを使って行うこともできる。検出は、蛍光顕微鏡下で行われるように、フィルターによる可視化によって行うこともできる。顕微鏡は、オペレーターによって簡単に可視化されるシグナルを与えることができる。あるいは、シグナルを写真フィルムに記録するか、ビデオ解析システムを使って記録することもできる。シグナルは、画像解析システムまたは光度計を使って、リアルタイムで簡単に定量することもできる。
したがって例えば、試料の酵素活性の基本的アッセイでは、例えばHarrisら (1998) J Biol Chem 273:27364に示されているように、試料を（アッセイするその特定プロテアーゼに最適なpHの）バッファーに懸濁または溶解し、バッファーに蛍光原酵素ペプチド指示薬を加え、その結果生じる蛍光の変化を分光蛍光計を使ってモニタリングする。分光蛍光計は、発蛍光団をその発蛍光団の励起波長で励起するように設定される。蛍光原酵素指示薬は、その指示薬を切断するプロテアーゼによって蛍光が変化する、酵素（例えばプロテアーゼ）の基質配列である。
2．ECM分解を評価する方法
改変MMP（例えばtsMMP、tsMMP-1などの上述のものを含むが、それらに限るわけではない）による細胞外マトリックスタンパク質の分解は、インビトロまたはインビボで評価することができる。そのような評価のためのアッセイは当業者に知られており、さまざまな細胞外マトリックスタンパク質、例えば限定するわけではないが、コラーゲン（I、II、IIIおよびIV）、フィブロネクチン、ビトロネクチンおよびプロテオグリカンに対する、さまざまな改変MMP（例えばtsMMP）の活性を調べるために使用することができる。アッセイは許容温度および非許容温度で行うことができる。温度感受性になるように改変されていないMMPの存在下で、実験を行うこともできる。酵素活性に関するアッセイはプロセシング因子による酵素の活性化に続いて行われると理解される。さらなる対照として、チモーゲン酵素の活性も評価することができる。
a．インビトロアッセイ
代表的なインビトロアッセイには、改変MMP、例えばtsMMPと共にインキュベートした後に細胞外マトリックスタンパク質の分解産物を評価するためのアッセイが含まれる。いくつかの例では、アッセイが単一の特異的分解産物を検出する。別の例では、アッセイが複数の分解産物を検出し、その分解産物の実体は既知であっても未知であってもよい。分解産物の評価は、当技術分野で周知の方法、例えば限定するわけではないが、HPLC、CE、質量分析、SDS-PAGE分析、ELISA、ウェスタンブロッティング、免疫組織化学、免疫沈降、NH2末端配列決定、およびタンパク質標識などを使って行うことができる。細胞外マトリックス分解産物は、例えば、tsMMPなどのMMPと共に適当な時間、適当な温度でインキュベートした後に、SDS-PAGE分析によって可視化することができる。例えば、コラーゲンは、成熟改変MMP（例えばtsMMP）と共にインキュベートし、例えば4-20％Tris/グリシンゲルを用いるSDS-PAGEに供して、生成物を分離することができる。ゲルのクマシー染色は、インタクトなコラーゲンと比較して、小さな分解産物の可視化、またはコラーゲンバンドの消失の可視化を容易にする。例えば、細胞外マトリックスタンパク質に特異的なポリクローナルIgを使ったイムノブロッティングも、SDS-PAGEによる分離後に分解産物を可視化するために使用することができる。
細胞外マトリックスタンパク質の分解後に単一の生成物を特異的に検出するアッセイも
当技術分野では知られており、細胞外マトリックスタンパク質を分解するtsMMPの能力を評価するために使用することができる。例えば、ヒドロキシプロリン（HP）アッセイを使って、コラーゲンの分解を測定することができる。4-ヒドロキシプロリンは、コラーゲンの重量の約12％を構成する修飾イミノ酸である。HPアッセイは、マトリックス分解酵素と共にインキュベートした後の上清中のHPの量を決定することによって、可溶性コラーゲンの量を測定する（例えばReddyおよびEnwemeka (1996) Clinical Biochemistry 29:225-229を参照されたい）。HPの測定は、例えば比色法、光速液体クロマトグラフィー、質量分析および酵素法などによって達成することができる（例えばEdwardsら (1980) Clin. Chim. Acta 104:161-167；Green (1992) Anal. Biochem. 201:265-269；Tredgetら (1990) Anal. Biochem. 190:259-265；Itoら (1985) Anal. Biochem. 151:510-514；Garneroら (1998) J. Biol. Chem 273:32347-32352を参照されたい）。
そのようなインビトロアッセイで使用されるコラーゲン源としては、市販の精製コラーゲン、骨片、皮膚、軟骨およびラット尾腱などを挙げることができるが、これらに限るわけではない。改変MMP（例えばtsMMP-1などのtsMMP）のコラーゲン分解活性は、活性化された酵素を不溶性コラーゲン懸濁液と共にインキュベートし、次にHClなどを使って加水分解することによって評価することができる。可溶化された（分解された）コラーゲンに由来するヒドロキシプロリンの量は、エールリヒ試薬とのインキュベーション後に550nmにおける吸光度を測定することなどの分光測光法で、決定することができる。いくつかの例では、コラーゲン源が、麻酔下の動物から外科的に取り出された後、温度活性化因子の前、後、温度活性化因子と同時または断続的に、tsMMP、例えばtsMMP-1で灌流された、ラットまたはブタ皮膚外植片である。次に、灌流液におけるHPレベルを評価することができる。この方法の変法では、外植片中の線維性中隔に対する効果も評価することができる。簡単に述べると、酵素による灌流後に、外植片を小片に切断し、パラフィンに包埋し、コラーゲンを可視化するためのマッソントリクローム染色後に顕微鏡で分析する。コラーゲン線維性中隔の数を可視化し、酵素で処理していない組織と比較することができる。
特定コラーゲンの分解を検出するためのアッセイも当技術分野では知られている。そのようなアッセイでは、その特定コラーゲンにユニークな分解産物を検出するために、免疫学的方法を使用することができる。例えば、いくつかのMMPによるコラーゲンIの分解は、イムノアッセイを使って検出することができる異なるエピトープを持つ、テロペプチドを放出する。そのようなアッセイでは、架橋されたN-テロペプチド（NTx）と架橋されたC-テロペプチド（CtxおよびICTP）（これらはそれぞれ、ユニークなエピトープを含有する）を検出する。典型的には、CTxアッセイでは、α1鎖のC末端テロペプチド領域中の8アミノ酸配列EKAHD-β-GGRオクタペプチド（ここではアスパラギン酸がβ異性化した配置をとっている）を認識するCrossLaps (Nordic Biosciences）抗体を利用する（Eastell (2001)「Bone Markers: Biochemical and Clinical Perspectives」40頁）。ICTPを検出するためのイムノアッセイも当技術分野では知られており、コラーゲンIの分解を検出するために使用することができる（米国特許第5,538,853号）。別の例では、コラーゲンI型をMMPなどのプロテアーゼと共にインキュベートしてからNTxを検出するために、ELISAなどのイムノアッセイを使用することができる（Atleyら (2000) Bone, 26:241-247）。分解されたコラーゲンに特異的な他の抗体およびアッセイも当技術分野において知られており、それらを使って、マトリックス分解酵素による分解を検出することができる。それらには、分解されたコラーゲンI（Hartmannら (1990) Clin. Chem. 36:421-426）、コラーゲンII（Hollanderら (1994) J. Clin. Invest. 93:1722-1732）、コラーゲンIII（米国特許第5,342,756号）、およびコラーゲンIV（Wilkinsonら (1990) Anal. Biochem. 185:294-6）に特異的な抗体およびアッセイが含まれる。
b．インビボアッセイ
ECMのインビボ分解を検出するためのアッセイも当技術分野では知られている。そのようなアッセイでは、上述の方法を利用して、例えば、尿、血液、血清および組織などの生物学的試料におけるヒドロキシプロリンならびにN-およびC-テロペプチドならびに分解されたコラーゲンまたは他のECMを検出することができる。分解されたECMの検出は、1つまたはそれ以上の酵素を患者に投与した後に行うことができる。ピリジノリン（PYD）およびデオキシピリジノリン（DPYD）の検出も、コラーゲンの分解を評価するために使用することができる。それぞれヒドロキシリジルピリジノリンおよびリジルピリジノリンとも呼ばれるPYDおよびDPYDは、I型コラーゲン鎖を安定化する2つの非還元性三価架橋であり、成熟コラーゲン原線維の分解時に放出される。ピリジノリンが骨および軟骨に豊富に存在するのに対し、デオキシピリジノリンはおおむね骨に限定される。III型コラーゲンもピリジノリン架橋をアミノ末端に含有する。総PYDおよびDPYDは、例えば加水分解された尿試料または血清において、逆相HPLC後の蛍光検出によって測定することができる（Hataら (1995) Clin.Chimica. Acta. 235:221-227）。
c．非ヒト動物モデル
非ヒト動物モデルを使って、マトリックス分解酵素の活性を評価することができる。例えば、非ヒト動物を疾患または状態のモデルとして使用することができる。酵素の投与に先だって、非ヒト動物に、疾患および/または表現型誘発物質を注射する。遺伝学的モデルも有用である。1つまたはそれ以上の遺伝子の過剰発現、過少発現またはノックアウトによって、ある疾患または状態を模倣するマウスなどの動物を作出することができる。例えば、限定するわけではないが、ペイロニー病（Davilaら (2004) Biol. Reprod., 71:1568-1577）、腱症（Wardenら (2006) Br. J. Sports Med. 41:232-240）および強皮症（Yamamoto (2005) Cur. Rheum. Rev. 1:105-109）などの状態に関する動物モデルが、当技術分野では知られている。
非ヒト動物は、非疾患動物におけるインビボでの酵素の活性を試験するためにも使用することができる。例えば、マウス、ラットまたはブタなどの非ヒト動物に酵素を投与して、ECM分解のレベルを決定することができる。いくつかの例では、動物を使って、ECM分解のエクスビボ評価のための外植片を得る。別の例では、ECM分解をインビボで評価する。例えば、麻酔された動物の皮膚のコラーゲン分解を評価することができる。簡単に述べると、尾の皮膚の真皮層への針の挿入により、tsMMP-1などのMMPを、温度活性化因子の前に、または温度活性化因子と同時に、温度活性化因子の後に、または温度活性化因子とは断続的に灌流する。灌流液画分を尾の皮膚から集め、ヒドロキシプロリン分析により、コラーゲン分解について分析する。他の方法、例えば限定するわけではないが、上述したアッセイのいずれか、例えば特異的分解産物を検出するためのイムノアッセイを使って、分解を検出することもできる。
I．ECMの疾患または欠陥を処置する代表的方法
本発明が提供する改変MMP、例えばtsMMPは、任意の1つまたはそれ以上のECM構成要素が介在する任意の状態を処置するために使用することができる。この項では、tsMMPなどの改変MMPについて、代表的な用途および投与方法を述べる。ここに記載する治療法は代表例であって、酵素の応用を限定するものではない。そのような方法には、例えば、任意の1つまたはそれ以上のECM構成要素の過剰な、異常な、または蓄積した発現によって引き起こされる任意のECM状態または疾患の処置方法などがあるが、これらに限るわけではない。処置される疾患または状態の代表例は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、またはグリコサミノグリカン、例えばプロテオグリカンが介在するものである。例えば、コラーゲン介在疾患または障害の代表例には、セルライト、デュピュイトラン病（デュピュイトラン拘縮ともいう）、ペイロニー病、五十肩、慢性腱症または腱の瘢痕組織、限局性強皮症およびリンパ浮腫などがあるが、これらに限るわけではない。そのような疾患または症状を特定することは、処置医の技量の範囲内である。
処置される特定の疾患または症状は、選択される酵素を決定する。例えば、コラーゲン介在疾患または障害の処置は、コラーゲンを切断する改変MMP、例えばtsMMPの投与によって達成することができる。例えば、コラーゲンを切断するために、tsMMP-1などの改変MMP-1を選択することができる。そのようなMMPには、上記表5に列挙したおよび/または当業者に知られる任意のMMPの改変型が含まれる。tsMMP、ならびに活性化のための系および方法は、特定の疾患または状態を処理するために、相応に選択することができる。
改変MMP、例えばtsMMPによる疾患および症状の処置は、本明細書に記載するような適切な製剤を使って、例えば限定するわけではないが皮下注射、筋肉内、皮内、経口、ならびに局所外用および経皮投与など任意の適切な投与経路によって、達成することができる。上述のように、典型的には、皮膚下で患部への直接的な投与をもたらすような、改変MMP（例えばtsMMP）の投与経路が選択される。そのような投与経路の代表例には、皮下、筋肉内、または皮内などがあるが、これらに限るわけではない。
必要であれば、特定の投薬量および持続時間および処置プロトコールを、経験的に決定するか、推論することができる。例えば、組換えおよびネイティブ活性MMPまたは改変MMP（例えばtsMMP）の代表的な用量を、適当な投薬量を決定するための出発点として使用することができる。投薬量レベルは、個体の体重、全身の健康状態、年齢、使用する具体的化合物の活性、性別、食餌、投与時間、排泄率、併用薬、疾患の重症度および経過、ならびにその疾患に対する患者の素因および処置医の判断など、さまざまな因子に基づいて決定することができる。単一の剤形を製造するために担体材料と組み合わせることができる活性成分の量は、特定マトリックス分解酵素、処置対象、特定投与様式、および活性化に要求される活性化条件、および/または活性化が望まれる予め定められた時間の長さに依存して変動するだろう。医薬組成物は、典型的には、約1μg/ml〜約20mg/mlの投薬量を提供すべきである。一般的には、投薬量は、1回分の投薬量の投与につき約10μg/ml〜1mg/ml、典型的には約100μg/mlである。投与すべき量は、選択したtsMMPおよび活性化条件、処置される適応症、そして場合によっては、認容されるであろう副作用の関数であるだろう。投薬量は、一般に認められた各障害のモデルを使って、経験的に決定することができる。また、本明細書の他の項で述べるように、改変MMP、例えばtsMMPは、他の薬剤と組み合わせて、逐次的に、同時に、または断続的に投与することができる。そのような薬剤の代表例には、リドカイン、エピネフリン、分散剤、例えばヒアルロニダーゼ、およびそれらの組合せなどがあるが、これらに限るわけではない。
患者の状態が改善した後、必要であれば、維持量の化合物または組成物を投与することができ、投薬量、剤形、もしくは投与頻度、またはそれらの組合せを変更することができる。いくつかの例では、対象が、長期的に、疾患症状の再発時に断続的処置を必要としうる。
コラーゲン介在疾患または状態へのコラーゲンの関与を、多様な疾患および状態におけるECM構成要素の役割の例として、以下に説明する。そのような説明は、単なる例示であって、特定の改変MMPもしくはtsMMPまたは特定のECM介在疾患もしくは状態に限定されない。当業者は、所望する任意のECM介在疾患の処置に使用するべき改変MMP、例えばtsMMPおよびその活性化のための活性化条件を、その特定疾患または状態に関与するECM構成要素を切断または分解する特定酵素の能力に基づいて選択することができる。例えば、本明細書で説明するように、MMP-1は、I型およびIII型コラーゲン、例えば皮膚に豊富に存在するものを切断する。したがって改変MMP-1は、コラーゲン介在疾患または状態を処置するための処置、用途およびプロセスに使用することができる。当業者は、特定の処置および投薬量を決定することができる。処置を評価する際に考慮すべき事項には、例えば処置される疾患、疾患に関与するECM構成要素、疾患の重症度および経過、その改変MMP、例えばtsMMPが予防目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、以前の治療、患者の臨床歴および治療に対する応答、ならびに担当医の判断などがある。
コラーゲン介在疾患または症状
コラーゲンは哺乳類生物の主要構造構成成分であり、動物体の皮膚および他の部位の総タンパク質含有量の大きな部分を占めている。数多くの疾患および状態が、例えばコラーゲンに富む線維性組織の不規則（erratic）な蓄積または他の原因による、過剰なコラーゲン沈着と関連している。コラーゲン介在疾患または状態（線維性組織障害ともいう）は当業者に知られている（例えば米国特許出願公開第20070224183号；米国特許第6,353,028号；同第6,060,474号；同第6,566,331号；同第6,294,350号を参照されたい）。過剰のコラーゲンは、例えば限定するわけではないが、瘢痕形成をもたらす線維性疾患または状態、セルライト、デュピュイトラン症候群、ペイロニー病、五十肩、限局性強皮症、リンパ浮腫、間質性膀胱炎（IC）、毛細血管拡張症（Telangrectase）、バレット化生、腸壁嚢胞状気腫（Pneumatosis cytoides intestinalis）、コラーゲン性大腸炎などの疾患および状態と関連づけられている。例えば、しわ、セルライト形成および新生物性線維形成など、外観を損なう皮膚の状態は、正常組織アーキテクチャの望ましくない結束と変形をもたらす過剰なコラーゲン沈着に起因する。
改変MMPポリペプチド、例えば本明細書に記載するtsMMP（限定するわけではないが改変MMP-1およびtsMMP-1を含む）は、コラーゲン介在疾患または状態を処置するために使用することができる。本明細書に記載する疾患および状態を処置するためのtsMMPの代表例は、身体の生理学的温度より低い非許容温度、例えば25℃またはその前後において、投与部位における非許容性の生理的温度と比較して、より活性なtsMMP-1である。例えば、皮膚間質などの細胞外マトリックスの一時的冷却は、冷たい緩衝溶液または他の液体を患部に直接注入すること、および/または投与個所に直接冷温パックを適用することによって達成することができる。ある例では、ECM構成要素が存在して蓄積している部位に直接的に投与が達成されるように、冷バッファーを表面下投与によって、すなわち皮膚の下に投与することができる。他の活性化方法を使用することもでき、それらは、本明細書の説明に照らせば、当業者にはわかる。
a．セルライト
改変MMPポリペプチド、例えば本明細書に記載するようなtsMMP、例えば改変MMP-1ポリペプチドまたはtsMMP-1は、セルライトを処置するために使用することができる。正常な脂肪組織では、血管およびリンパ管の目の細かい網目が、組織に必要な栄養素および酸素を供給し、代謝産物の除去を引き受けている。例えばトリグリセリドは、毛細管に富む小葉にグループ分けされている個々の脂肪細胞中に貯蔵される。各脂肪小葉は脂肪細胞から構成される。線維性中隔と呼ばれるコラーゲン線維の垂直な鎖（vertical strand）が、脂肪小葉を分離し、上にある表在筋膜を下にある筋に繋ぎとめる。
セルライトは、典型的には、皮膚の真皮レベルおよび真皮下レベルでの血管完全性の崩壊および毛細管ネットワークの喪失による真皮劣化を特徴とする。血管劣化は、真皮の代謝作用を低下させる傾向がある。この低下した代謝作用は、タンパク質合成および修復プロセスを妨害し、それが真皮の菲薄化をもたらす。この状態はさらに、脂肪細胞が脂質で充満した状態になり、膨張し、互いに凝集すること、ならびに皮膚の真皮領域および真皮下領域における過剰な体液貯留も特徴とする。脂肪球または脂肪細胞の蓄積は、より大きな血液供給の必要を生み出す。組織に血液を供給するために新しい毛細管が形成され、それが、より多くの濾過液を放出して、組織を間質液で飽和させ、脂肪組織における浮腫を引き起こす。間質組織中の豊富な細網線維が、凝集した脂肪細胞の周りに蓄積して密になり、それらが被膜または中隔を形成し、それが徐々にコラーゲン線維へと形を変えて、小結節として感じられるようになる。コラーゲン線維は、間質組織腔にも置かれ、結合組織を硬性（硬質）にする。
したがって、その状態がさらに進行すると、脂肪細胞の硬い小結節および中隔に囲まれた脂肪の塊が真皮領域に形成されることになる。これは、かなりの不均一性を示して「カッテージチーズ」または「オレンジ皮」状の外観を有すると記述される皮膚表面をもたらす。皮膚を真皮およびより深い組織層につなぐ線維性中隔が皮膚中で堅くなり引っ張ると、陥凹形成が起こる。したがって、セルライトの「オレンジ皮」状の外観は、脂肪組織上の外向きの力の結果として起こる脂肪小葉の変形によるものである。脂肪小葉は、例えば幅1cmまで大きくなることがあり、上にある真皮中に容易に突き出して、皮膚表面に目に見える変形を引き起こす。最終結果は、脂肪が上向きに押すことによる、外側の皮膚の波打った外観である。結合中隔はこれらの外向きの力と同じ方向に走っているので、それらは、脂肪が真皮中に突き出すのを防ぐ逆向きの力を提供することができない。
セルライトは男性より女性に多い。セルライトの有病率は女性集団の60％〜80％と推定され、その重症度は肥満と共に悪化する傾向がある。最近、公表された研究が、セルライトを持つ女性では、セルライトを持たない女性または男性よりも垂直線維性中隔のパーセンテージが高いことを、インビボ核磁気共鳴イメージングによって示した（Querleuxら (2002) Skin Research and Technology, 8:118-124, 8:118-124）。セルライトは臀部、大腿部および上腕に生じることが最も多い。例えば、閉経前の婦人は、主として、セルライトが最もよく見られる臀部/大腿部領域の皮下に、脂肪を蓄積しがちである。臨床的にはセルライトは、表皮の菲薄化、体液の真皮下蓄積につながる微小脈管構造の減少および破壊、ならびに脂肪組織の真皮下凝塊形成を含む症状を伴う。
b．デュピュイトラン病
改変MMPポリペプチド、例えば改変MMP-1またはtsMMP-1などのtsMMP、例えば本明細書に記載するものは、デュピュイトラン症候群（デュピュイトラン拘縮ともいう）を処置するために使用することができる。デュピュイトラン拘縮（デュピュイトラン病（Morbus Dupuytren）とも呼ばれている）は、指が手のひらに向かって曲がり、完全に伸ばすことができない、手の固定性屈曲拘縮である。同様の病変が足に生じる場合もある。手の中の結合組織は異常に厚くなり、線維芽細胞およびコラーゲン、特にIII型コラーゲンを含有する小結節の存在を伴う。コラーゲンの線維索には、しばしば、中隔様に配置された脂肪組織が点在する。これらは、臨床的には、さまざまなサイズのマットレス型の「塊」（lump）として存在し、デュピュイトラン病では小結節と呼ばれる。これは、指がねじ曲がる原因となり、指、特に小指および薬指の機能障害をもたらしうる。デュピュイトラン病は主として男性に起こる。一般的には、中年および高齢者、北欧に祖先を持つ人々、および一定の慢性病を持つ人々、例えば糖尿病患者、アルコール依存症患者および喫煙者に見いだされる。
デュピュイトラン病は、何年もかけて起こる緩徐進行性の疾患であり、指の中手指節関節（MP）および近位指節間関節（PIP）に固定性屈曲変形を引き起こす。小指および薬指の罹患が最も多い。この疾患は3段階にわたって進行する（Luckら (1959) J. Bone Joint Surg., 41A:635-664）。初期増殖期は手掌腱膜における小結節形成を特徴とし、ここでは筋線維芽細胞と呼ばれる細胞が出現して増殖を始める。退行期または中間病期は筋線維芽細胞の増殖と活性III型コラーゲンの形成を伴う。末期または残遺期では小結節が消失して、無細胞組織およびコラーゲンの厚いバンドが残る。I型コラーゲンに対するIII型コラーゲンの比率が増加する。活性化可能なマトリックス分解酵素によるデュピュイトラン病の処置は、典型的には、中間病期および残遺期に行われる。
c．ペイロニー病
改変MMP-1、例えば改変MMP-1またはtsMMP-1などのtsMMP、例えば本明細書に記載するものは、ペイロニー病を処置するために使用することができる。ペイロニー病は陰茎の軟組織における線維性プラークの増殖を伴う結合組織障害であり、1〜4％もの男性が罹患している。コラーゲンはペイロニー病におけるプラークの主要構成成分である。具体的には、陰茎海綿体を取り囲む線維性被膜である白膜で、線維化プロセスが起こる。ペイロニー病に関連する痛みと醜形は、海綿体と呼ばれる2つの勃起性桿状体と、膀胱から出た尿が流れる導管（尿道）と、海綿体を陰茎の皮膚の外層から隔離する白膜とが見いだされる、陰茎の身体構造に関係する。ペイロニー病を呈する人では、白膜と皮膚のこれら外層との間（本願では「真皮下」という）に、プラークまたは瘢痕組織の形成が起こることになる。白膜の瘢痕またはプラーク蓄積がその弾性を減少させるため、患部領域は（たとえ伸張したとしても）周囲の非罹患組織と同じ程度には伸張しなくなる。したがって、勃起した陰茎は瘢痕またはプラーク蓄積の方向に曲がり、多くの場合、ある程度の痛みを伴う。ペイロニー病の症状が発現すると、ごく一部を除いていずれも、患者はある程度の性機能障害を生じる。より重症な症例では、性交は不可能であるか、事実上阻止されるほどの痛みを伴う。
男性集団の約1パーセントにおけるペイロニー病の発生を示す経験的証拠がある。この疾患はほとんどの場合中年男性に起こるが、若年および高齢の男性でも罹患することはありうる。また、ペイロニー病を有する男性の約30パーセントは、身体の他の弾性組織、例えば手または足にも、線維症（硬化した細胞）を発症する。そのような他の状態の一般的な例として、手のデュピュイトラン拘縮および足のレダーホース線維症が挙げられる。
d．レダーホース線維症
改変MMPポリペプチド、例えばtsMMP、例えば本明細書に記載するような改変MMP-1またはtsMMP-1は、レダーホース線維症を処置するために使用することができる。レダーホース線維症は、線維芽細胞増殖およびコラーゲン沈着による線維症が足に発生する点以外は、デュピュイトラン病およびペイロニー病と類似している。レダーホース病は、足底内側部を覆う足底線維症を特徴とし、足底線維症と呼ばれることもある。
e．関節のこわばり
改変MMPポリペプチド、例えば改変MMP-1またはtsMMP-1などのtsMMP、例えば本明細書に記載するものは、関節のこわばり、例えば五十肩を処置するために使用することができる。五十肩（癒着性関節包炎）は、肩における痛みおよび動きの低下またはこわばりを特徴とする関節包の慢性線維化状態である。一般人口の約2％がこれを罹患している。五十肩は増加した線維芽細胞マトリックス合成に起因する。この合成は、サイトカインおよび増殖因子の過剰産生をもたらす過剰な炎症応答によって引き起こされる。線維芽細胞および筋線維芽細胞が肩の関節包内に、コラーゲン、特にI型およびIII型コラーゲンの緻密なマトリックスを構築する。これが、瘢痕を有する拘縮した肩関節包をもたらし、関節のこわばりを引き起こす。
関節のこわばりの他の例として、限定するわけではないが、筋骨格手術に起因する関節包拘縮、癒着性関節包炎および関節線維症によって引き起こされるものが挙げられる。そのような関節のこわばりは、例えば膝、肩、肘、足首および臀部の関節などの関節で起こりうる。五十肩と同様に、そのような関節疾患は、増加したマトリックス合成および瘢痕形成によって引き起こされる。関節のこわばりは、必然的に、患部領域の関節軟骨に異常に強い力が伝えられる原因になりうる。これらの力は、時間をかけて、変性関節疾患および関節炎の発生をもたらす。例えば、関節線維症および関節包拘縮では、線維芽細胞が、関節脱臼などの局所的外傷に応答して過剰な量のマトリックスを形成する。
f．既存の瘢痕
改変MMP-1、例えば改変MMP-1またはtsMMP-1などのtsMMP、例えば本明細書に記載するものは、既存の瘢痕を処置するために使用することができる。コラーゲンは創傷治癒プロセスおよび自然加齢のプロセスにおいてとりわけ重要であり、これらのプロセスにおいては、コラーゲンが線維芽細胞によって産生される。しかし時には、過大な治癒応答が、瘢痕組織とも呼ばれるおびただしい量の治癒組織（礎質）の産生をもたらすこともある。例えば、熱傷、手術、感染、創傷および事故などといったさまざまな皮膚外傷は、コラーゲンに富む線維性組織の不規則な蓄積を特徴とすることが多い。プロテオグリカン含有量の増加が起こることも多い。損傷を受けたまたは破壊された正常組織と置き換わるだけでなく、時には、新しい組織の過剰な、そして外観を損なう沈着物が、治癒プロセス中に形成される。過剰なコラーゲン沈着は、コラーゲン合成とコラーゲン分解の間のバランスの乱れに原因があると考えられている。瘢痕には、例えば、慢性腱症または腱の瘢痕組織、術後癒着、ケロイド、肥厚性瘢痕、および陥没性瘢痕が含まれる。
i．術後癒着
術後癒着は、瘢痕形成によって器官または組織が互いに付着することであり、深刻な臨床上の問題を引き起こしうる。手術後または組織傷害後に起こる多少の瘢痕組織の形成は正常である。しかし、時には、瘢痕組織が傷害領域を越えて増殖し、術後癒着を生じて、それが、罹患身体部分の正常な可動性および機能を制限しがちになる。特に、そのような軟組織傷害後は、線維芽細胞増殖およびマトリックス合成が局所的に増加する。次に、身体が治癒応答を誘導することによって組織を修復しようとするときに、癒着が形成される。例えば、この治癒プロセスは、本来ならば健常な2つまたはそれ以上の別個の構造の間で（例えば腹部手術後の腸管ループの間で）起こりうる。あるいは、末梢神経の局所的外傷後に、線維性癒着が形成され、それが通常動作時に激痛をもたらすこともある。
ii．ケロイド
ケロイドは、真皮および隣接する皮下組織に（通常は外傷後に）生じる、過形成腫瘤（hyperplastic mass）を含有する結合組織の瘢痕である。ケロイドは、一般に、ピンク色または赤色から暗褐色まで、さまざまな色を有しうる線維性小結節である。ケロイドは、創傷修復に関与するコラーゲンの過剰増殖の結果として、瘢痕組織中に形成される。ケロイド病変は、局所皮膚線維芽細胞が局所的刺激に応答して活発な過形成および増殖を起こした場合に形成される。その結果生じる病変は元の瘢痕より何倍も大きい塊をもたらしうる。ケロイドは、創傷または他の外傷の結果として起こるほか、穿孔、面皰、擦過傷、重度のざ瘡、水痘瘢痕化、創傷部位の感染、ある領域への反復的外傷、または創傷閉鎖時の過剰な皮膚張力からも形成されることがある。
iii．肥厚性瘢痕
肥厚性瘢痕は、創傷部位に形成される隆起した瘢痕である。一般にこれらが元の創傷の境界を越えて増殖することはない。ケロイド瘢痕と同様に、肥厚性瘢痕も身体がコラーゲンを過剰産生した結果である。
iv． 陥凹性瘢痕
陥凹性瘢痕は、一般に、炎症性エピソードに起因して、皮膚の拘縮を特徴とし、美容上気になる永続的な瘢痕を残す。最も一般的な例は、炎症性ざ瘡後に起こる瘢痕化である。陥凹は創傷治癒の自然な帰結として起こり、陥凹を引き起こす瘢痕組織は、主として、線維芽細胞の増殖および代謝に起因するコラーゲンで構成される。
g．強皮症
改変MMPポリペプチド、例えばtsMMP、例えば本明細書に記載するような改変MMP-1またはtsMMP-1は、強皮症の処置に使用することができる。強皮症はコラーゲンの肥厚を特徴とする。この疾患の、より一般的な形態である限局性強皮症は、皮膚だけを、通常は数カ所だけ冒し、顔面を冒す場合もある。これはCREST症候群と呼ばれる場合もある。症状には、皮膚の硬化および付随する瘢痕化が含まれる。また皮膚は、赤みを帯びるか、鱗状の外観を呈し、血管が見えやすくなる場合もある。より深刻な症例では、強皮症が血管および内臓を冒す場合もある。汎発性強皮症は、筋骨格、肺、胃腸、腎臓その他の合併症による心臓、腎臓、肺または腸損傷の結果として、命にかかわる場合もある。
この状態は、弾力性の喪失につながるコラーゲンの蓄積を特徴とする。コラーゲンの過剰産生は、T細胞の蓄積と線維芽細胞からのコラーゲン沈着を刺激するサイトカインその他のタンパク質産生とをもたらす自己免疫機能障害に原因があると考えられている。
h．リンパ浮腫
改変MMPポリペプチド、例えばtsMMP、例えば本明細書に記載するような改変MMP-1またはtsMMP-1は、リンパ浮腫を処置するために使用することができる。リンパ浮腫は、腕および下肢に腫脹を引き起こすリンパ液の蓄積である。リンパ浮腫は進行して、例えばリンパうっ帯性線維症、硬化症および乳頭腫（良性皮膚腫瘍）ならびに腫脹などの皮膚変化を含むようになる場合がある。リンパ浮腫に関連する組織変化には、線維芽細胞などの結合組織細胞の増殖、コラーゲン線維の産生、脂肪沈着物の増加および線維性変化が含まれる。これらの変化は、初めは下肢、すなわち指およびつま先で起こる。リンパ浮腫は、四肢の腫大の程度に基づいて同定することができる。例えば、リンパ浮腫を評価するための一方法は、患肢および健常肢の4つの比較対照点間で2cmまたは3cmの差を同定することに基づく。
i．コラーゲン性大腸炎
改変MMPポリペプチド、例えば改変MMP-1またはtsMMP-1などのtsMMP、例えば本明細書に記載するものは、コラーゲン性大腸炎を処置するために使用することができる。コラーゲン性大腸炎は、最初は、慢性水様下痢症と記載された（Lindstromら (1976) Pathol. Eur., 11:87-89）。コラーゲン性大腸炎はコラーゲン沈着を特徴とし、これはおそらく、粘膜線維芽細胞によるコラーゲン産生とコラーゲン分解の間の不均衡に起因するのだろう。これは分泌性下痢をもたらす。コラーゲン性大腸炎の発生率は、原発性胆汁性肝硬変に似ている。この疾患は、100,000人あたり1.8人という年間発生率および100,000人あたり15.7人という有病率を有し、これは、原発性胆汁性肝硬変（100,000人あたり12.8人）と同等であり、潰瘍性大腸炎（100,000人あたり234人）、クローン病（100,000人あたり146人）またはセリアック病（100,000人あたり5人）より低い。慢性下痢症の患者では、約0.3〜5％がコラーゲン性大腸炎を有する。コラーゲン性大腸炎は、線維芽細胞の増殖を刺激するサイトカインその他の作用因子の産生量を増加させ、その結果、コラーゲン蓄積を増加させる、炎症性の疾患である。
2．脊椎病変
本明細書で説明するように、本発明が提供する改変MMPは、ECMの、またはECMが関与する、疾患および状態を処置するために使用することができる。これには、本発明が提供するMMPを投与して本明細書に記載するように活性化することによって処置することができる脊椎病変（通例、椎間板ヘルニアまたは椎間板膨隆（bulging disc）と呼ばれる）が含まれる。処置することができる椎間板ヘルニアには、椎間板突出（protruded disc）および椎間板脱出（extruded disc）が含まれる。椎間板突出は、インタクトではあるが膨隆しているものである。椎間板脱出では、線維輪（fibrous wrapper）が裂け、髄核（NP）は漏れ出しているが、まだ椎間板とつながっている。NPはヘルニア形成の原因ではないが、NPは、痛みを引き起こす神経への圧力の一因になる。NPは、ヒアルロン酸、軟骨細胞、コラーゲン原線維、および水を誘引するヒアルロン酸長鎖を有するプロテオグリカンの一種アグリカン類を含有する。各ヒアルロン酸鎖には、コンドロイチン硫酸およびケラタン硫酸の側鎖が結合している。
椎間板ヘルニアは、典型的には、椎間板への薬物の局所的導入により、キモパパインおよびコラゲナーゼなどの化学的髄核融解薬（chemonucleolytic drug）で処置されてきた。化学的髄核融解薬はNPの1つまたはそれ以上の構成要素を分解し、それによって圧力を軽減する。化学的髄核融解術は椎間板突出および椎間板脱出に有効である。化学的髄核融解術は、腰椎（下部脊椎）ヘルニアおよび頸椎（上部脊椎）ヘルニアの処置に使用されている。したがって本発明が提供するMMPを化学的髄核融解薬として使用し、MMPを活性化する条件下で患部椎間板に、例えば注射によって、投与することができる。
J．実施例
以下の実施例は、説明を目的として記載するに過ぎず、本発明の範囲を限定しようとするものではない。
実施例1
hMMP-1のクローニングと発現
A．hMMP-1ライブラリーのクローニングとハイスループット発現
この実施例では、ヒトMMP-1をコードするDNAをプラスミド中にクローニングし、次に形質転換およびタンパク質の発現/単離を行うことにより、ヒトマトリックスメタロプロテアーゼ1（hMMP-1）ライブラリーを作製した。このライブラリーは、不活性なチモーゲンであるプロMMP-1（配列番号2に示すもの）をコードする配列番号706に示すヌクレオチドの配列を有する親ヒトMMP-1 DNA配列に突然変異を導入して、ポリペプチドの触媒ドメインおよびプロリンリッチリンカードメインの全体にわたってMMP-1の単一アミノ酸変異体を生成させることによって作製した。このhMMP-1ライブラリーは、ヒトMMP-1の触媒ドメイン（配列番号2のアミノ酸81〜242）およびリンカー領域（配列番号2のアミノ酸243〜258）内にある178のアミノ酸位置のそれぞれに少なくとも15のアミノ酸変異体を含有するように設計された（下記表7参照）。
［表7］hMMP-1ライブラリー
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個々のhMMP-1突然変異体をコードするcDNAは、下記表8に示す178のアミノ酸位置のそれぞれをコードする野生型コドンを、所望のアミノ酸置換をコードするコドンに変えることによって作製した。野生型コドンを配列番号706に示す。配列番号706にはコードされているアミノ酸も記載する。アミノ酸置換とそれに対応する突然変異コドンを下記表8に掲載する。
［表8］各アミノ酸置換をコードするコドン
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1．発現
標準的なDNA合成プロトコールに従って個々のライブラリーメンバーをコードするDNAを作製し、常用の分子生物学的技法を使ってタンパク質を発現させた。簡単に述べると、常用の分子生物学的技法を使ってDNAをベクターpET303CTHis（Invitrogen、配列番号3466）中にライゲーションした。1つの個別hMMP-1突然変異体を含有するプラスミドを、BL21（DE3）大腸菌細胞（Tigen、中国・北京）に、製造者の勧める手順に従って形質転換した。このプロセスを全てのライブラリーメンバーについて繰り返した。形質転換培養物を使って、アンピシリン添加剤を含有するLB培地1mLに接種した。培養物を振とうしながら37℃で16時間成長させた。1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG）の添加によってタンパク質発現を誘導し、培養物を振とうしながら25℃でインキュベートした。6時間後に6,000gで10分間遠心分離することによって細胞をペレット化し、上清を除去した。細胞を、50μlのOSバッファー（200mM Tris-HCl、pH7.5、20％スクロース、1mM EDTA）中で、4μlのDNAse（10μg/ml）、4μlのRNAse（10μg/ml）および4μlのリゾチーム（10μg/ml）と共に、25℃で10分間インキュベートすることによって、ペリプラズムタンパク質を濃縮した。50μlの水を各ウェルに加えた後、6000gで10分間遠心分離することにより、細胞片を除去した。hMMP-1タンパク質を含有する上清を−20℃で貯蔵した。上清の活性を次の実施例で説明するようにスクリーニングした。
B．野生型hMMP-1のクローニングと発現
この実施例では野生型hMMP-1を大腸菌とCHO-S細胞の両方で個別に発現させた。
1．大腸菌における発現
野生型hMMP-1（クローンBAP006_10、配列番号706にヌクレオチドとして示すヌクレオチドの配列を有し、配列番号3547に示すpelBシグナル配列を含有するもの）をベクターpET303CTHis（Invitrogen、配列番号3466）中にクローニングし、BL21(DE3)大腸菌中で増殖させた。pET303CTHisベクターはC末端Hisタグ（配列番号3465）を含有した。上述のように1mMイソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG）を添加してタンパク質発現を誘導した。発現に続いて、タンパク質を実施例1Aで説明したように濃縮した後、標準的な分子生物学のプロトコールに従い、HiTrap Ni2+カラム（GE Healthcare）を使って精製した。発現と精製はSDS/PAGEおよびウェスタンブロット分析によってモニタリングした。
2．CHO-S細胞における発現
野生型hMMP-1（クローンBAP006_2、配列番号708にヌクレオチド72〜1478として示すヌクレオチドの配列と、C末端Hisタグをコードする配列とを有するもの）をCHO-S細胞で発現させ、培地中に分泌させた。トランスフェクト細胞をCD-CHO無血清培地（Invitrogen）中、37℃で培養した。野生型hMMP-1タンパク質を、標準的な分子生物学のプロトコールに従い、HiTrap Ni2+カラム（GE Healthcare）を使って精製した。
実施例2
蛍光原ペプチド基質を使ったhMMP-1突然変異体の酵素活性の決定
この実施例では、温度感受性hMMP-1突然変異体を同定するために、実施例1で作製したhMMP-1突然変異体ライブラリーを、ハイスループット蛍光活性アッセイを使ってスクリーニングした。時間的に感受性（temporally sensitive）であるhMMP-1突然変異体をスクリーニングするために、Mca-K-P-L-G-L-Dpa-A-R-NH2（配列番号707；Mca＝(7-メトキシクマリン-4-イル)アセチル；Dpa＝N-3-(2,4-ジニトロフェニル)-L-2,3-ジアミノプロピオニル；R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス、カタログ番号ES010）と呼ばれる市販の蛍光原基質ペプチドIXを使って、個々の突然変異体の酵素活性を、25℃ならびに37℃および/または34℃で決定した。このペプチド基質は、2,4-ジニトロフェニル基への共鳴エネルギー移動によって消光される高蛍光性7-メトキシクマリン基を含有する。活性化されたhMMP-1はグリシンとロイシンの間のアミド結合を切断して、放出される蛍光の増加をもたらす。反応を、最初は96ウェルアッセイで行い、14mlチューブフォーマットを使って確認した。
A．96ウェルアッセイ
上清の活性を評価する前に、不活性なチモーゲン型を活性酵素に活性化するために、上清をプロセシング因子で処理した。簡単に述べると、96ウェルプレートにおいて、実施例1で作製した各hMMP-1突然変異体上清4μlを、1mMのプロセシング因子・酢酸p-アミノフェニル水銀（APMA）を含む100μlのTCNB（50nM Tris、10mM CaCl2、150mM NaCl、0.05％Brij35、pH7.5）に加えた。その溶液を反応温度（25℃または37℃）で2時間インキュベートした。この活性化工程によってプロペプチドが切断され、成熟hMMP-1が生成する。
活性化に続いて、620μMのMca-K-P-L-G-L-Dpa-A-R-NH2蛍光基質を含有する1.6μlのTCNBを、最終濃度が10μMになるように、表示した反応温度（25℃または37℃）で1時間各ウェルに加えた。蛍光プレートリーダーにおいて励起波長320nm/蛍光波長405nmで蛍光を測定することにより、蛍光を検出した。相対蛍光単位（RFU）を決定した。野生型hMMP-1およびプラスミド/ベクター形質転換細胞の上清を陽性対照および陰性対照として使用した。各試料、反応温度、ならびに陽性対照および陰性対照について、二重に反応を行った。
2687個のhMMP-1突然変異体の初期スクリーニングの結果を表9に示す。この初期スクリーニングにより、25℃における活性と比較して37℃では低下した活性を持つ199の推定一次ヒット（表10参照）が同定された。
［表9］温度感受性突然変異体の初期スクリーニングの結果
［Down：低下、Neutral：中立、Up：向上］
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同じアッセイを使って199個のhMMP-1推定ヒット突然変異体を再スクリーニングし、104個の一次ヒットを確認した（下記の表11参照）。25℃において活性であり、37℃では少なくとも16％の活性低下を有するhMMP-1突然変異体（例えば25℃または37℃における活性の比（25℃/37℃）が1.2以上であるもの）を、確認済み一次温度感受性ヒットとみなした。
下記の表10に、hMMP-1突然変異、25℃および37℃における平均RFU、ならびに活性の比（25℃/37℃）を掲載する。表には温度感受性も掲載する。DOWNは、突然変異体の活性の比（25℃/37℃）が、野生型の活性の比（25℃/37℃）と比較して低下していること、すなわち野生型の活性の16％を超えて低下していることを示し；NEUTRALは、突然変異体の活性の比（25℃/37℃）が、野生型の活性の比（25℃/37℃）と類似していること、すなわち野生型の活性の16％以内であることを示し；UPは、突然変異体の活性の比（25℃/37℃）が、野生型の活性の比（25℃/37℃）と比較して増加していること、すなわち野生型の活性の16％を超えて増加していることを示す。
下記の表10には、野生型hMMP-1と比較した25℃および37℃における残存活性も掲載する。残存活性は、表示の温度、すなわち25℃または37℃における、hMMP-1突然変異体活性と野生型hMMP-1活性の比である。1未満の比は、所与の突然変異体が表示の温度において野生型よりも低い活性を有することを示し、1より大きい比は、その突然変異体が野生型よりも高い活性を有することを示す。hMMP-1一次ヒット突然変異体のうち、いくつかは、25℃において野生型hMMP-1と同等か、それより高い活性を呈した。一次ヒットとして確認されたhMMP-1は全て37℃において低下した活性を呈したことから、それらが高温では低下した活性を示すことが再確認された。
［表10］温度感受性hMMP-1突然変異体に関する初期スクリーニングの結果
［Down：低下、Neutral：中立、Up：向上］
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［表11］再確認されたヒット
［Down：低下、Neutral：中立、Up：向上］
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B．14mLタンパク質発現
この実施例では、実施例2において温度感受性一次ヒットと同定されたhMMP-1突然変異体を14ml培養チューブで発現させ、高温で活性が低下するという所望の表現型を確認するために、それらの酵素活性を25℃、34℃および37℃で1時間、2時間または終夜測定した。発現を96ウェルプレートではなく14mLチューブで行った点以外は実施例1と同様にして、タンパク質を発現させ、精製した。
4μlの各hMMP-1突然変異体上清を96ウェルマイクロプレートに移した。溶液を25℃、34℃、または37℃の反応温度で2時間インキュベートした点以外は上記実施例2Aで述べたようにして、上清をAPMAで活性化した。上記と同様に、活性化に続いて、10μM Mca-K-P-L-G-L-Dpa-A-R-NH2蛍光基質を含有する100μlのTCNBを、表示の反応温度（25℃、34℃または37℃）で1時間、各チューブに加えた。野生型hMMP-1を陽性対照として使用し、ベクターで形質転換された細胞からの上清を陰性対照として使用した。蛍光プレートリーダーにおいて励起波長320nm/蛍光波長405nmで蛍光を測定することにより、蛍光を検出した。相対蛍光単位（RFU）を決定した。各試料、反応温度、ならびに陽性対照および陰性対照について、二重に反応を行った。
データを、下記の表12A（1時間インキュベーション）、表12B（2時間インキュベーション）および表12C（終夜インキュベーション）に示す。25℃において活性であるが、34℃または37℃では少なくとも33％低下した活性を示す突然変異体（すなわち、25℃と34℃における活性の比または25℃と37℃の活性の比が、試験した時点条件のいずれにおいても1.5以上であるもの）を、温度感受性ヒットと同定した。下記の表12A〜12Cには、高温において低下した酵素活性を有することが確認された64個のhMMP-1突然変異体のhMMP-1突然変異、25℃、34℃および37℃におけるRFU、ならびに活性の比（25℃/34℃と25℃/37℃の両方）を掲載する。一部のhMMP-1突然変異体は、25℃における活性が、高温における活性よりも顕著に高かった。例えば、hMMP-1突然変異体D179N（配列番号160）は、終夜インキュベーション後に、25℃では37℃より87.5％活性が高かった（例えば表12C参照）。さらにまた、発現レベルは、したがって総RFU値は、実験によってばらついたものの、活性の比は同じままだった。例えば、突然変異体D156Tを2回試験したところ（下記表12C参照）、各試験は異なるデータRFU値を与えたものの、値の比は類似しており、一貫して1.5比パラメータ内（within the 1.5 ratio parameter）にあった。
［表12A］温度感受性hMMP-1突然変異体、1時間インキュベーション
Figure 2012519494
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［表12B］温度感受性hMMP-1突然変異体、2時間インキュベーション
Figure 2012519494
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［表12C］温度感受性hMMP-1突然変異体、終夜インキュベーション
Figure 2012519494
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以下の表13に、蛍光ペプチドと共に終夜インキュベートした後のhMMP-1突然変異体の残存活性（hMMP-1突然変異体RFU/野生型hMMP-1 RFUの比）を示す。25℃、34℃、または37℃における突然変異体の活性を、各温度における野生型hMMP-1の活性と比較した。25℃では、5つのhMMP-1突然変異体（E180F、E180Y、D156T、D156K、R150P）が、残存活性＞1によって示されるとおり、野生型hMMP-1よりも活性が高かった。高温では、全てのhMMP-1突然変異体が、同じ温度における野生型hMMP-1と比較すると、活性の総合的低下を呈したことから、hMMP-1突然変異体の表現型は温度感受性突然変異体であると確認された。
［表13］hMMP-1温度感受性突然変異体の残存活性、終夜インキュベーション
Figure 2012519494
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C．hMMP-1トップ突然変異体ヒット
次の14個の位置がトップヒット位置として同定された：95、105、150、156、159、179、180、182、185、187、198、227、234および240。1）活性の比（25℃対37℃および25℃対34℃）と、2）活性（RFUで表したもの）を含む、2つの基準に基づいて、14個の位置における23個のhMMP-1突然変異体をトップヒットとして選択した。下記の表14に掲載する突然変異体は全て、2000より大きい活性と、2より大きい25℃対37℃の比とを有していた。**で特定される11個のヒットは、活性の比と活性レベルがどちらも高くランク付けされたヒットであり、実施例3で述べるコンビナトリアルライブラリーの開発には、これらを使用した。
［表14］トップヒット
Figure 2012519494
実施例3
コンビナトリアルhMMP-1変異体ライブラリーanapec
1．作製
この実施例では、実施例2Cにおいて選択し、表14にダブルアスタリスク（**）を付して示した突然変異体から、コンビナトリアルhMMP-1変異体ライブラリーを作製した。位置182、185および187はhMMP-1触媒活性にとって重要なので、これらの位置における突然変異体は、コンビナトリアルライブラリーの作製では除外した。選択した突然変異体のそれぞれについて、アミノ酸変異体の考えうる組合せを全て含有するように、ライブラリーを作製した。ライブラリー中に理論上含有される全ての突然変異体の組合せを表15に示す。ライブラリーの理論的多様性は、1536個の突然変異体であり、これには、野生型と、11個の単一突然変異体、およびそれら突然変異体の考えうる組合せの全てが含まれる。表示した位置は、配列番号2に示すhMMP-1のアミノ酸残基に対応する位置に関する。各行および列は、表記の突然変異を含有する1つのポリペプチドを示す。例えば、156K 179N 227Eは、配列番号2に示す位置に対応する位置に、3つのアミノ酸の置き換え、すなわち位置156におけるKによるDの置換、位置179におけるNによるDの置換、および位置227におけるEによるVの置換を含有するポリペプチドを指す。ライブラリーは実施例1で述べたように作製し、発現させた。
構築されたライブラリー（CPSライブラリーと命名）は、野生型および9個の個別ヒットを含む全部で1238個の突然変異体を含有する。ライブラリーにおける突然変異の数の分布を決定した。構築されスクリーニングされたライブラリーは、最大多様性の81％を含有していた。
［表15］コンビナトリアルライブラリー突然変異体
Figure 2012519494
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2．スクリーニング
96ウェルフォーマットにおいて大腸菌BL21細胞を1238個のhMMP-1 CPS突然変異体で形質転換し、実施例1で述べたように、IPTGを使って25℃で誘導した。hMMP-1突然変異体のタンパク質分解活性を、実施例2で述べたように蛍光原ペプチドIX（R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス、カタログ番号ES010）を使って、25℃および37℃で測定した。25℃では活性であるが37℃ではわずかな活性しか示さない突然変異体を推定ヒットとして同定した。同定されたヒットを表15Bに示す。ヒットは、37℃において最も低い活性を持つ突然変異体から、37℃で最も高い活性を持つ突然変異体、すなわち野生型へと並べ替えてある。これらの結果は、複合突然変異体を含む突然変異体の多くが、25℃における野生型hMMP-1の活性の10％以下の活性を呈することを示した。低い活性は、発現に伴う問題によるものではなかった。というのも、25℃において活性を持たないか活性が低かった突然変異体の多くは、十分に発現していたからである。いくつかの突然変異体（単一および組合せ）は、25℃において実質的な活性を呈し、最善の温度プロファイル（25℃/37℃）も示した。
［表15B］組合せ突然変異体の温度プロファイル
Figure 2012519494
Figure 2012519494
複合突然変異体の多くに関して25℃での低い活性を示す結果から、複合突然変異体は活性に関する至適温度が25℃未満にシフトするようにタンパク質を変化させていることが示唆される。これを検証するために、蛍光原ペプチドIXに対する複合突然変異体のいくつかのタンパク質分解活性を、20℃、25℃および37℃で調べた。試験した複合突然変異体には、次に挙げるものが含まれた：G159V/A198L；D156T/D179N；G159V/D179N；D179N/V227E；A198L/V227E；D156K/D179N；179/240；およびD156T/D179N/I240S。その結果、複合突然変異体のいくつかは、20℃において25℃よりわずかに高い活性を有し、37℃では活性をほとんど持たないことが示された。試験した突然変異体は全て、対応する温度において、野生型MMP-1より低い活性（わずか33％またはそれ以下の活性）を呈した。突然変異体の一つ、D156T/D179Nを試験したところ、18℃において野生型より高い活性を呈した。
実施例4
温度低下後の酵素活性の可逆性
この実施例では、25℃における酵素活性が、続いて高温にばく露し、さらに25℃に戻した後に、可逆性であるか不可逆性であるかを決定するために、実施例2Bで確認された温度感受性hMMP-1突然変異体を、さらにアッセイした。hMMP-1突然変異体を、実施例2Bで述べたように、14ml培養チューブで発現させた。推定ヒットを、その活性について、次の5つの条件下で試験した：25℃、34℃または37℃、および34℃または37℃の後、25℃の必要温度への再暴露（反応条件については表16を参照されたい）。25℃において活性であり、34℃または37℃に昇温した時に低下した活性を示し（すなわち、25℃/34℃または25℃/37℃における活性の比は1.5以上であり）、再び25℃に下げた時にベースライン活性を呈する突然変異体を、「可逆性ヒット」と記録した。25℃において活性であり、34℃または37℃に昇温した時に低下した活性を示し（すなわち、25℃/34℃または25℃/37℃における活性の比は1.5以上であり）、再び25℃に下げた時に同じ量の低下した活性を呈する突然変異体を、「不可逆性ヒット」と記録した。
A．反応条件
先に記載した蛍光アッセイに以下の変更を加えたものを使って、各hMMP-1突然変異体の酵素活性の可逆性を決定した。要約すると、各hMMP-1突然変異体の上清4μlを、1mM APMAを含むTCNBに希釈し、96ウェルプレートに移した。表16に示すように、各hMMP-1突然変異体について、5つの異なるウェルを調製した。その溶液を初期反応温度（25℃、34℃、または37℃）で2時間インキュベートした。この活性化工程により、プロペプチドが切断されて、成熟hMMP-1が生成する。
活性化に続いて、10μM Mca-K-P-L-G-L-Dpa-A-R-NH2蛍光基質を含む100μlのTCNBを各ウェルに加え、反応条件を、下記表16に要約するとおりにした。簡単に述べると、hMMP-1突然変異体を蛍光原基質の存在下、初期温度で1時間インキュベートすることにより、各hMMP-1突然変異体を、5つの反応条件のそれぞれにばく露した。各突然変異体について、基質と共にさらに1時間（2時間条件）または終夜（終夜条件）インキュベートした後、蛍光測定を行うことにより、25℃、34℃、または37℃におけるベースライン活性を評価した。活性の可逆性/不可逆性を評価するために、34℃、または37℃で最初の1時間インキュベートした試料を25℃に下げて、1時間（2時間条件）または16時間（終夜条件）インキュベートした後、蛍光測定を行った。野生型hMMP-1を陽性対照として使用し、ベクターのみで形質転換した細胞からの上清を陰性対照として使用した。蛍光プレートリーダーにおいて励起波長320nm/蛍光波長405nmで蛍光を測定することにより、蛍光を検出した。相対蛍光単位（RFU）を決定した。各試料、反応温度、ならびに陽性対照および陰性対照について、二重に反応を行った。
［表16］反応条件
Figure 2012519494
B．結果：部分可逆性hMMP-1突然変異体
26個のhMMP-1突然変異体は、部分的に可逆性であると決定された。活性（RFUで表されるもの）は25℃で観察されたベースライン活性には戻らなかったが、温度を25℃に戻すと、34℃または37℃における活性と比較して、活性の総合的増加が観察された。結果を、活性（RFUで表されるもの）および活性の比を掲載する下記の表17〜20に示す。表17および18には、2時間条件下でのhMMP-1部分可逆性突然変異体の、それぞれ34℃または37℃における可逆性の結果を要約する。表19および20には、終夜時間条件下でのhMMP-1部分可逆性突然変異体の、それぞれ34℃または37℃における可逆性の結果を要約する。結果は全ての反応条件、温度および時間で類似している。34℃または37℃で終夜の活性は、34℃または37℃で1時間インキュベートした後、25℃で終夜インキュベートした場合の活性よりも低い。例えば、34℃におけるE180Yの活性は6080RFUであるが、34℃の後、25℃で終夜の活性は8570RFUに増加した（下記表19参照）。
［表17］部分可逆性hMMP-1突然変異体（2時間、34℃）
Figure 2012519494
［表18］部分可逆性hMMP-1突然変異体（2時間、37℃）
Figure 2012519494
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［表19］部分可逆性hMMP-1突然変異体（終夜、34℃）
Figure 2012519494
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［表20］部分可逆性hMMP-1突然変異体（終夜、37℃）
Figure 2012519494
C．結果：非可逆性hMMP-1突然変異体
38個のhMMP-1突然変異体は、非可逆性であると決定された。34℃または37℃におけるこれら突然変異体の活性は、25℃における活性と比較して低下しており、25℃に下げた場合にも、低下したままだった。結果を、活性（RFUで表されるもの）および活性の比を掲載する下記表21〜24に示す。表21および22には、2時間条件下でのhMMP-1不可逆性突然変異体の、それぞれ34℃または37℃における結果を要約する。表23および24には、終夜条件下での不可逆性hMMP-1突然変異体の、それぞれ34℃または37℃における可逆性の結果を要約する。結果は全ての反応条件、温度および時間で類似している。34℃または37℃で終夜の活性は、34℃または37℃で1時間インキュベートした後、25℃で終夜インキュベートした場合の活性と同じか類似している。例えば、34℃におけるD105Rの活性は1407RFUであり、34℃の後、25℃で終夜の活性は1424RFUである（下記表23参照）。
［表21］非可逆性hMMP-1突然変異体（2時間、34℃）
Figure 2012519494
Figure 2012519494
［表22］非可逆性hMMP-1突然変異体（2時間、37℃）
Figure 2012519494
Figure 2012519494
［表23］非可逆性hMMP-1突然変異体（終夜、34℃）
Figure 2012519494
Figure 2012519494
［表24］非可逆性hMMP-1突然変異体（終夜、37℃）
Figure 2012519494
Figure 2012519494
実施例5
不溶性コラーゲンに対するhMMP-1のタンパク質分解活性
この実施例では、hMMP-1のコラゲナーゼ活性を、タンパク質基質コラーゲンに関して、SDS-PAGE分析を使って評価した。野生型hMMP-1は不溶性コラーゲン（α1(I)およびα2(I)鎖）を、4分の3の長さと4分の1の長さの消化産物に切断する。このアッセイでは、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）結合コラーゲンを基質として使用し、反応生成物のSDS-PAGEによって反応をモニタリングした。α1(I)およびα2(I)コラーゲン鎖の切断は、3/4の長さと1/3の長さの消化産物をもたらし、これらはSDSポリアクリルアミドゲルでの分離によって完全長コラーゲンと識別することができる。もう一つの選択肢として、切断を蛍光測定分析によって評価した。同様のアッセイを使って、突然変異体hMMPの活性を、25℃と34℃または37℃における切断活性に関して評価することができる。
A．SDS-PAGE分析
この実施例では、野生型MMP-1を不溶性コラーゲンの切断について試験し、SDS-PAGEで評価した。要約すると、2μgのhMMP-1（R&D Systemsから購入、#901-MP；または実施例1.Bで述べたように精製したBAP006_2およびBAP006_10）を、1mM AMPAを含有するTCNBに希釈し、反応温度（25℃または37℃）で2時間インキュベートした。この活性化工程により、プロペプチドが切断されて、成熟hMMP-1が生成する。次に、TCNB 20μl中の、フルオレセインイソチオシアネート（FITC）にコンジュゲートした不溶性コラーゲン（Anaspec #85111またはSigmaコラーゲン#C4361）6μgを、各活性化hMMP-1アリコートに加え、その混合物を25℃または37℃で24時間または6日間インキュベートした。
不溶性コラーゲンの切断をSDS/PAGEによって観察した。反応混合物を7.5％SDSポリアクリルアミドゲルで分離し、クマシーブルー色素による染色で可視化した。SDS/PAGE結果は、試験した全てのhMMP-1タンパク質について、25℃または37℃で24時間のインキュベーション後に、hMMP-1はα1(I)およびα2(I)コラーゲン鎖を3/4長および1/4長の消化産物へと部分的に切断したことを示している。25℃で6日後には、3/4長および1/4長の消化産物への完全な切断が観察された。37℃で6時間後には、コラーゲンが完全に切断されていた。3/4長および1/4長コラーゲン消化産物は、体温では熱的に不安定である。
B．蛍光測定分析
もう一つの選択肢として、蛍光アッセイを使ってコラゲナーゼ活性を測定した。5μgのhMMP-1（R&D Systemsから購入、#901-MP；または実施例1.Bで述べたように精製されたBAP006_2およびBAP006_10）を、1mM AMPAを含有するTCNBに希釈して最終濃度とし、37℃で2時間インキュベートした。Baici A et al. (1980) Anal. Biochem., 108: 230-232に記載の方法を適合させたプロトコールを使って、FITC標識コラーゲン（Sigma #C4361またはElastin #CF308）に関するhMMP-1の活性を評価した。簡単に述べると、hMMP-1を基質と共に37℃で144時間インキュベートした。陰性対照として、基質をバッファーのみと共にインキュベートした。インキュベーション後に、反応混合物をまず遠心分離して不溶性粒子を除去した。蛍光プレートリーダーにおいて励起波長495nm/蛍光波長520nmで蛍光を測定することにより、上清の蛍光を検出した。相対蛍光単位（RFU）を決定した。各試料について二重に反応を行った。
結果（下記の表25および26参照）は、不溶性コラーゲンを野生型hMMP-1と共に37℃で114時間インキュベートすることにより、バッファーのみの対象と比較して高いRFU値が示すとおり、コラーゲンの切断がもたらされたことを示している。例えば、Sigmaから入手したコラーゲンの切断については、試験したhMMPの全てが、バッファーのみの場合の約400.00というRFU値と比較して、約1000.00〜1200.00のRFUを有していた。CHO-S細胞（BAP006_2）およびBL21細胞（BAP006_10）から精製したコラーゲンの、Sigma不溶性コラーゲンの切断に関する活性は、R&D systemsから購入したhMMP-1と同等だった。Elastinコラーゲンの切断については、R&Dから購入した組換えhMMP-1とBAP006_10の活性は約3000.00RFUであり、一方、BAP006_2の活性は約2000.00RFUだった。バッファーのみは、Elastinコラーゲンの切断に関して、役1500.00RFUというバックグラウンド蛍光を呈した。
［表25］コラーゲン（Sigma不溶性基質）の切断
Figure 2012519494
［表26］コラーゲン（Elastin不溶性基質）の切断
Figure 2012519494
実施例6
ヘモペキシン結合ドメインにおける温度感受性変異体の同定
ヘモペキシンドメイン中、アミノ酸位置259、260、261、262、263、264、301、302、303、304、305、306、441、442、443、444、445および446において、MMP-の単一アミノ酸変異体が生成するように親ヒトMMP-1 DNAに突然変異を導入することにより、実施例1と同様に、hMMP-1突然変異体ライブラリーを作製した。それらの突然変異体を実施例1で述べたように発現させ、実施例2で述べたように蛍光原ペプチド基質に対する酵素活性について試験した。1つの突然変異体C259Q（配列番号3532に示すもの）が、37℃で比較して25℃において増加した活性を持つヒットとして同定された。
次に、C259Qと、L95K；D105N；R150P；D156K；D156T；G159V；D179N；E180T；A198L；V227EまたはI240Sの1つとを含有する、11個の二重突然変異体を作製した。これらの二重突然変異体を実施例1で述べたように発現させ、実施例2で述べたように蛍光原ペプチド基質に対する酵素活性について試験した。25℃において活性であるが、37℃では低下した活性を示す、5つの二重突然変異体が同定された。同定された二重突然変異体は、C259Q/D105N（配列番号3533）；C259Q/R150P（配列番号3534）；C259Q/G159V（配列番号3535）；C259Q/D179N（配列番号3536）；およびC259Q/E180T（配列番号3537）だった。これらの突然変異体は、10倍〜ほとんど25倍という活性の比（25℃/37℃）を呈し、C259Q/D179Nがほとんど25倍という最も大きい活性の比を呈した。
実施例7
活性および温度感受性複合突然変異体の作製
表9において37℃および25℃で高い活性を有すると同定された3つのhMMP-1変異体活性突然変異体（配列番号3538に示すS208K；配列番号3539に示すI213G；および配列番号3540に示すG214E）を使って、表14に示す温度感受性ヒットとの二重突然変異体を作製した。各活性突然変異体を、表14に示す11個の温度感受性ヒット（**）のそれぞれと組み合わせて、二重突然変異体を作製した。実施例1で述べたように14mLチューブにおいて、野生型hMMP-1および31個の二重突然変異体を、大腸菌BL21(DE3)コンピテント細胞に形質転換した。25℃で1mM IPTGを添加して、実施例1で述べたようにタンパク質を発現させた。誘導の6時間後に細胞を集めた。細胞をOSバッファー（200mM Tris-HCl、pH7.5、20％スクロース、1mM EDTA）中で、DNAse、RNAseおよびリゾチームと共にインキュベートすることにより、ペリプラズムタンパク質を調製した。OSバッファー中の細胞にH2Oを加えた後、細胞を遠心分離した。ペリプラズム画分を含有する上清を別のチューブに移した。上清を使って、野生型および二重突然変異体で形質転換されたBL21細胞が産生したhMMP-1のタンパク質分解活性を、実施例2に記載のアッセイを用いて測定した。酵素を活性化するために上清をAPMAと共に37℃および25℃でインキュベートした。hMMP-1の活性を決定するための基質として蛍光原ペプチドIXを使用した。マイクロタイタープレート蛍光リーダーで、320nm（励起）および405nm（蛍光）の波長を使って蛍光を測定した。各試料について二重に反応を行った。25℃における活性を37℃における活性で割ることによって比を決定した。バックグラウンド活性の値を、野生型および二重突然変異体の活性から差し引いた。その結果、活性突然変異体を組み込んでも、25℃における温度感受性突然変異体の活性は増加しないことが示された。しかし、6つの二重突然変異体は、25℃において活性を呈するが、37℃では低下した活性を示すことが確認された。これらの二重突然変異体には、S208K/G159V（配列番号3541）；S208K/D179N（配列番号3542）；S208K/V227E（配列番号3543）；G214E/G159V（配列番号3544）；G214E/D179N（配列番号3545）；およびI213G/D179N（配列番号3546）が含まれる。これらの突然変異体の活性の比（25℃/37℃）は次のとおりだった：S208K/G159V突然変異体ではほとんど14倍；S208K/D179N突然変異体では約14倍；S208K/C227E突然変異体では約13倍；G214E/G159V 突然変異体では約8倍；G214E/D179N突然変異体ではほとんど14倍；そしてI213G/D179N突然変異体では約14倍。予想どおり、野生型hMMP-1は約1倍という活性の比を呈した。
実施例8
コラーゲンに対するhMMP-1変異体のタンパク質分解活性
SDSポリアクリルアミドゲルでの分離と消化産物の分析とにより、野生型およびさまざまな突然変異体hMMP-1の切断活性を、コラーゲンI型およびIV型に関して、25℃または37℃で試験した。これらの実験で使用した野生型hMMP-1には、R&D systems（R&D Systems、カタログ番号901-MP；NSO細胞）から購入した哺乳動物細胞発現産物、または実施例1Bに記載の大腸菌発現産物（BL21細胞）を含めた。hMMP-1変異体を実施例1Aで述べたように大腸菌BL21細胞で発現させ、実施例11で述べるように多少の混入タンパク質を除去するために、Q-Fast Flow Resin（GE Healthcare）を使って大腸菌上清溶解物をさらに精製した。
簡単に述べると、0.025mLの野生型hMMP-1またはhMMP-1 TS変異体大腸菌溶解物を、1mM APMAを含有する0.175mLのTCNBバッファーに希釈した。MMPを活性化するために、その調製物を25℃で2時間インキュベートした。活性化は、ウェスタンブロットにより、MMP-1分子量の下方シフトで確認した。活性化された調製物を各0.1mLのアリコートに小分けしてから、精製可溶性または不溶性コラーゲンの添加に先だって、さらに2時間、25℃または37℃でプレインキュベートした。次に、可溶性ヒトコラーゲンI型（BD Biosciences）20μg、酢酸を除去するための凍結乾燥後の可溶性ヒトコラーゲンIV型（Millipore）10μg、またはpH中和したゲル化不溶性（Gelled-Insoluble）ラットコラーゲンI型（BD Biosciences）30μgを、活性化されプレインキュベートされた野生型または変異体hMMP-1の存在下、25℃で24時間インキュベートした。消化産物をSDS-PAGEで分析した。結果を表27に示す。（+）は消化産物が存在することを示し、一方、（-）はコラーゲンの消化産物が観察されなかったことを示す。これらの結果は、予想どおり、試験した野生型hMMP-1が、25℃でプレインキュベートしても、37℃でプレインキュベートしても、コラーゲンI（可溶性と不溶性の両方）を消化したことを示している。これに対し、hMMP-1変異体では、ゲル化コラーゲンIからも凍結乾燥コラーゲンIからも、コラーゲンIへのばく露に先だって、変異体を25℃でプレインキュベートした場合にのみ、コラーゲンＩの消化産物が観察された。hMMP-1変異体の37℃プレインキュベーション後は、コラーゲンI消化が観察されなかった。コラーゲンIV消化産物が検出されなかったことから、野生型hMMP-1と同様に、変異体hMMP-1もコラーゲンIVを切断しないことが確認された。
［表27］精製コラーゲンのMMP-1消化
Figure 2012519494
実施例9
hMMP-変異体酵素活性の反応速度アッセイ
大腸菌溶解物から発現された（実施例1）、または多少の混入タンパク質を除去するためにQ-Fast Flow Resin（GE Healthcare）によって濃縮された（実施例11）、野生型または変異体hMMP-1の活性を、その基質の切断に関する反応速度アッセイにおいて、反応速度曲線の直線部分から測定した。AnaSpecから購入した野生型MMP-1も試験した（カタログ番号72004）。
簡単に述べると、0.01mLの野生型または変異体hMMP-1を、1mM APMAを含有する0.19mLのTCNBバッファーに希釈した。MMPを活性化するために、その調製物を25℃で2時間インキュベートした。次に、調製物を（2つの100μlアリコートに）分割し、25℃または37℃で2時間、プレインキュベートした。次に、活性化されプレインキュベートされたhMMP-1試料を96ウェルマイクロプレートに加え、そのマイクロプレート中のウェルにMca-K-P-L-G-L-Dpa-A-R-NH2蛍光基質を加えた。
酵素活性の反応速度解析は、SpectraMax（登録商標）蛍光マイクロプレートリーダーにおいて、25℃で行った。読みは、0秒から3600秒（1時間）まで約23秒ごとに1回取得し、Softmax（登録商標）Pro Software（Molecular Devices）を使って解析した。
ウェルに加えられた基質の量について基質消化時間を長時間にわたってモニタリングしたところ、放出が観察される処理可能な基質の最大量は、約17000RFUである。最速の酵素によって処理された最大半量（half maximal）の基質（約8500RFU）は、その8500RFUを500秒後に反応中に放出したので、500秒という時点を、半分の基質が使用される直前にVmaxを決定するためのエンドポイントとして使用した。放出された相対蛍光単位対時間の反応速度表示の最大傾斜をSOFTmax PROソフトウェアで算出し、Vmax単位毎秒値（Vmax units per second value）として報告する。500秒時点におけるVmax単位毎秒値を、試料比較のためのエンドポイントとして使用した。これは、上述のように、このアッセイにおいて、試験したどの試料によっても、利用された基質が50％未満であるような時点である。したがって基質は、アッセイしたどのウェルでも、制限因子にはなっていない。高いVmax値は、処理された基質の存在量の増加に対応する。
表28に、大腸菌溶解物またはQ-Ft濃縮大腸菌溶解物中に生産されたhMMP-1および変異体についての解析の結果を示す。反応速度の結果から、スクリーニングのためにエンドポイント法で測定された25℃における変異体の温度感受性が確認される。
［表28］反応速度アッセイ
Figure 2012519494
実施例10
Hisタグを伴うまたはHisタグを伴わないhMMP-1変異体の発現および比活性の比較
実施例1A.1に記載のpETベースベクターを使って、大腸菌中で、hMMP-1突然変異体をHisタグなしで発現させた。タンパク質を実施例1A.1で述べたように大腸菌BL21細胞中で発現させた。一次ヤギ抗hMMP1 抗体（R&D System）を使用した後、二次HRP-抗ヤギIgG抗体（CalBioChem）で検出することにより、各突然変異体の発現を、コンストラクトで形質転換されたBL21細胞のペリプラズム抽出物のウェスタンブロット分析から評価した。Hisタグを伴うまたはHisタグを伴わない各突然変異体の発現レベルを、それらの発現レベルの値を、Hisタグを伴わない野生型hMMP-1の発現レベルの値で割ることによって、規格化した。Hisタグを伴わない野生型hMMP-1の規格化された発現レベルが1である。試験した他のタンパク質の規格化された発現レベルを表29に示す。
［表29］規格化された発現レベル
Figure 2012519494
規格化された発現レベルを使って、突然変異体の比活性を決定した。蛍光原基質を使って活性を実施例2と同様に評価した。各突然変異体をAPMAを使って表示の温度（25℃または37℃）で2時間活性化した。活性化に続いて、蛍光原基質ペプチドIXを25℃で加え、表示の温度（25℃または37℃）で4時間インキュベートした。蛍光プレートリーダーにおいて励起波長320nm/蛍光波長405nmで蛍光を測定することにより、蛍光を検出した。相対蛍光単位（RFU）を決定した。25℃または37℃における活性を規格化された発現レベルで割ることによって、25℃および37℃における比活性を決定した。データをベクターのみに対して規格化し、バックグラウンドRFUを差し引いた。治療係数（TI；25℃/37℃における規格化された活性の比）を決定した。Hisタグを伴うまたはHisタグを伴わない野生型のTIは約1倍だった。
Hisタグを伴わない突然変異体はほとんど5倍から約30倍までの範囲のTIを呈することを、結果は示している。例えば、変異体D105NのTIは約5倍；R150Pはほとんど5倍；D156Kは約11倍；D156Kは約10倍；G159Vは約16倍；D179Nは約30倍；E180Tは約5倍；A198Lは約10倍；そしてV227Eはほとんど25倍だった。Hisタグの存在は突然変異体活性の一部に対して低下効果を有したことを、結果は示している。例えば、Hisタグを伴う突然変異体は、野生型よりわずかに高い値から約10倍までのTIを呈したことを、結果は示している。Hisタグを伴う大半の突然変異体は、5倍未満のTIを呈した。Hisタグを含有する突然変異体に観察された最も高いTIは、約30倍というHisタグを伴わないD179NのTIと比較して、約10倍のTIを呈するD179N-hisだった。
表示の温度（25℃または37℃）におけるHisタグを伴わない変異体MMPの規格化された活性のパーセンテージを、Hisタグを伴わない野生型hMMP-1の活性と比較した。25℃における活性のパーセンテージについては、25℃で活性化し基質と共にインキュベートした突然変異体の規格化された活性を、25℃で活性化し基質と共にインキュベートした野生型MMP-1の規格化された活性で割った。突然変異体D105N、D156T、およびE180Tは、野生型の活性の約120％を呈し；突然変異体G159V、S208K/G159V、V227Eは、野生型と類似する活性、すなわち野生型の活性の約100％を呈し；突然変異体D156T/D179N、R150PおよびD156Kは、野生型の活性の約80％を呈し；D179Nは野生型の活性の約50％を呈し；突然変異体D179N/I240Sは野生型の活性の約35％を呈したことを、結果は示している。
37℃における活性のパーセンテージについては、25℃で活性化し、37℃で2時間プレインキュベートし、基質と共に37℃でインキュベートした突然変異体の規格化された活性を、25℃で活性化し、25℃で基質と共にインキュベートした野生型MMP-1の規格化された活性で割った。突然変異体D179N、S208K/G159V、D156T/D179N、およびD179N/I240Sは野生型の活性の5％未満を呈し；突然変異体G159Vは野生型の活性の5％を少しだけ上回る活性を呈し；突然変異体V227E、D105N、D156KおよびD156Tは、野生型の活性の約10％〜約12％を呈し；突然変異体R150Pは野生型の活性の約20％を呈し；突然変異体E180Tは野生型の活性のほとんど30％を呈することを、結果は示している。
実施例11
Q-Sepharose Fast Flow ResinによるhMMP-1突然変異体の100mL規模発現と精製
Q-Sepharose Fast Flow（FF）Resin（GE Healthcare）を使ってhMMP-1および変異体をペリプラズム調製物から精製し、濃縮した。簡単に述べると、野生型hMMP-1および突然変異体を、常用の分子生物学的技法を使って、Hisタグを伴って発現するように、またはHisタグを伴わずに発現するように、pET303CHis中にクローニングした。試験した野生型hMMP-1には、クローンBAP006-09（Hisタグなし；配列番号706にヌクレオチドとして示すヌクレオチドの配列を有し、配列番号3547に示すアミノ酸をコードするpelBシグナル配列を含有するもの）と、クローンBAP006-10（配列番号706にヌクレオチドとして示すヌクレオチドの配列を有し、配列番号3547に示すアミノ酸をコードするpelBシグナル配列と、実施例1.Bに記載のC末端Hisタグをコードする配列とを含有するもの）とを含めた。プラスミドをBL21(DE3)大腸菌細胞に形質転換し、形質転換培養物を使って、アンピシリン添加剤を含有するLB培地15mL（50mLコニカル容器中）に接種し、37℃で終夜成長させた。100mLのLB培地を（500mLまたは100mLの三角フラスコで）終夜インキュベートすることにより、抗生物質を含まないLBを37℃に予熱した。接種された培養物のOD600を、翌朝、OD600が0.05〜0.1になるまで測定した。アンピシリン抗生物質を予熱したLBに加えた。抗生物質を含む100mLの予熱LB培養物に15mLの終夜培養物を接種した。60分後および120分後にOD600を測定し、その後は、OD600が約0.6に達するまで、30分ごとに測定した。約0.6のOD600で、1mLを取り出し、遠沈し、分析に使用するためのペリプラズムタンパク質を後述のように調製した。残りの培養物を25℃の培養器に30分間入れた（複合突然変異体の場合は20℃）。培養物を最終濃度1mMのIPTGで誘導し、培養物を25℃（または20℃）で振とうしながら6時間インキュベートした。6時間後に、OD600を測定した。
100mL培養物からペリプラズムタンパク質を調製するために、誘導した培養物を250mLコニカル容器に移し、細胞を室温、1500gで10分間、遠沈した。1mLのRNAase（10mg/mL）に溶解された10mgのDNAaseおよび10mgのリゾチーム（lyzozyme）を含有する酵素混合物を調製した。その混合物をフィルター滅菌し、4℃で保存した。使用直前に50μlの酵素混合物をバッファーI（200mM Tris/HCl pH7.5、20％スクロース、1mM EDTA）に加えた。細胞培養物から上清を除去し、ペレットを、チューブ1本につき2.5mLのバッファーI/酵素混合物に注意深く再懸濁した。その混合物を室温で5分間インキュベートした。チューブ1本につき2.5mLの氷冷水を加え、上下逆さにすることによって混合し、氷上で10分間インキュベートし、細胞片を遠沈するために、室温、5000gで15分間、遠心分離した。hMMP-1タンパク質を含有する上清を、新鮮チューブで、ペリプラズムタンパク質として合わせ、500μlずつ−20℃で貯蔵するか、後述のようにQ Sepharose FFを使ってさらに精製した。
Q Sepharose FFでタンパク質をさらに精製する前に、Q Sepharose FF材料を、元の備蓄物から、ボトルの内容物を全て再懸濁して、50mLコニカル容器に10mlを移し、4000gで3分間遠心分離することによって、調製し、平衡化した。上清を捨て、ペレットを20mLのバッファーQ-bind（100mM Tris/HCl、pH 7.5、10％スクロース、10mM CaCl2、0.5mM EDTA）に再懸濁した。その混合物を4000gで3分間遠心分離し、上清を捨てた。これを2回繰り返し、最後の遠心後に、ペレットを10mLのバッファーQ-bindに再懸濁した。
ペリプラズム調製物をQ-Sepharoseで精製するために、1mLの平衡化したQ-Sepharoseを1.5mLエッペンドルフチューブに入れて、微量遠心機中、全速で2分間遠心分離した。上清を注意深く取り除いた。25μlの2M NaClおよび10μlの1M CaCl2を1mLのペリプラズム調製物に加えた。1mLのペリプラズム調製物を使ってQ-Sepharoseを再懸濁し、その混合物を氷上で10分間、ときおり混合しながらインキュベートした。その混合物を微量遠心機中、全速で3分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移して、「Q-FT1」として保存した。ペレットを1mLのバッファーQ bindに再懸濁し、その混合物を微量遠心機中、全速で3分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、「Q-FT2」として保存した。ペレットを1mLのバッファーQ bindに再懸濁し、その混合物を微量遠心機中、全速で3分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、「Q-FT3」として保存した。ペレットを1mLのバッファーQ Elute（100mM Tris/HCl pH 7.5、10％スクロース、10mM CaCl2、1M NaCl、0.5mM EDTA）に再懸濁し、その混合物を微量遠心機中、全速で3分間遠心分離した。上清を新しいチューブに移し、「Q-ET」として保存した。
溶離した上清をAmicon 30Kスピンフィルター（Millipore）を使って濃縮した。Amicon 30Kフィルターを1mLのQ-bindバッファーですすぎ、SWローター中、3000g、室温で5分間遠心分離した。バッファーを両区画から除去した。800μlのQ-FT1をフィルターに加え、フィルターをSWローター中、3000g、室温で5分間遠心分離した。保持液（約250μl）を集めた。
さまざまな調製物および画分を純度についてSDS-PAGEで分析した。活性は、4μlの溶解物、精製したQ-FT1、または精製し濃縮したQ-FT1を、TCNB中のAPMA 96μlに加えることによって活性化してから、試験した。反応混合物を37℃または25℃で2時間インキュベートしてから、10μM蛍光ペプチド基質を添加し、37℃または25℃で4時間インキュベートした。ある実験では、試験したタンパク質（野生型、D179N、およびD156T/D179N）に関して、溶解物、精製タンパク質または精製濃縮タンパク質のどれを試験しても、それらタンパク質のそれぞれが活性を呈したことを、結果は示している。野生型およびD179Nについては、溶解物、精製タンパク質、または精製濃縮タンパク質のどれを試験しても、それぞれの活性は実質的に同じだった。D156T/D179N二重突然変異体については、溶解調製物の活性が、精製濃縮調製物が呈する活性の約半分だった。Q-Sepharose精製濃縮調製物に関して、25℃におけるD179N突然変異体およびD156T/D179N二重突然変異体の活性は、各条件について約10,000.00のRFU値が観察された野生型と類似していた。野生型の活性は、37℃または25℃において類似していた。対照的に、試験したどの精製条件でも、D179NおよびD156T/D179N突然変異体は、37℃（約1000RFU以下）よりも25℃（約10,000.00RFU）において、より高い活性を呈し、37℃と比較すると25℃では40倍以上の活性を呈した。類似する結果が試験した他の突然変異体（D179N/I240S、G159V、S208K/G159V、V227E、D105N、R150P、D156K、D156T、E180T）についても観察され、試験したタンパク質の多くについて、試験タンパク質をQ-Sepharoseで精製した場合には、試験タンパク質が溶解調製物である場合よりも高い活性が観察された。したがって、10mM CaCl2の存在下でのQ-sepharoseによる精製では、突然変異体の活性および温度感受性表現型が保持されることを、結果は示している。
Q-Sepharose FFによる精製は10mM CaCl2の存在下で行われた。精製プロセスにおいてZnCl2の添加は行われていない。精製を10mM CaCl2の非存在下で行うと、突然変異体の活性は低下した。
実施例12
細菌発現およびNi-NTA精製
野生型hMMP-1または実施例1に記載した変異体をコードするDNAを、C末端6x-Hisタグ（カタログ番号69862-3、Novagen；配列番号3548）を含有するベクターpET-26bの制限部位NdeIおよびXhoI中にクローニングした。標準的な分子生物学的技法を使って各pET26b-hMMP1ベクターをコンピテントBL21(DE3)細胞中に形質転換し、形質転換体をKan-LB寒天プレート上にプレーティングした。2つのコロニーを拾い、カナマイシン（最終濃度50μg/mL）を含む50mLのLB培地中、37℃で振とう（200rpm）しながら、終夜成長させた。各終夜培養物について、20〜22mLの培養物を使って、0.1％グルコース、0.0005％制泡剤および50μg/mLカナマイシンを含有する2Lフラスコ（1コロニーにつき2個のバッフル付きフラスコ）中のLB培地800mLに接種した。その培養物を振とう（200rpm）しながら37℃で成長させ、OD600を測定した。OD600が0.8〜1.3に達したら（約4.5時間）、温度を25℃に下げ、IPTGを最終濃度が0.4mMになるように加えた。生育を振とうしながら25℃で終夜（約12〜15時間）続けた。後述のようにペリプラズム画分を作製するために、JA-5.3ローターを使って、4℃、4000gで20分間の遠心分離によって、細胞を収集した。タンパク質誘導を確認するために、1mLの培養物を遠心分離し、200μlのPBSに再懸濁し、細菌を溶解するために超音波処理した。β-メルカプトエタノール（BME）を含有する6×SDS試料バッファーを溶解した細菌に加え、10分間煮沸し、20μlを4-20％ TG PAGEゲルにローディングした。ゲルをSimply Blue（Invitrogen）で染色して、タンパク質を可視化し、タンパク質誘導の度合いを決定した。
ペリプラズム画分を作製するために、収集した細胞ペレットを、5mL/グラムの溶解バッファー（0.5M NaCl、50mM Tris-HCl pH7.9、10mMイミダゾール、10％グリセロール）に再懸濁した。細胞懸濁液各40mLに、1mM EDTA、0.5mg/mLリゾチーム、および1mg/mL原液からのDNaseI 50μlを加え、その懸濁液を室温で1時間振とうして、細菌を溶解した。4℃、6000×gで、30分間の遠心分離によって、細胞片をペレット化した。上清を集め、精製のために新しいチューブに移した。所望であれば、不溶性タンパク質の抽出/可溶化および再フォールディングのために、ペレットを−80℃で凍結した。
タンパク質を上清から精製するために、5mLのNi-NTA SuperFlowレジン（Qiagen、カタログ番号30430；60％スラリー）を、清澄化したペリプラズム画分に加え、4℃で1時間撹拌した。その混合物を、エコノカラム（Biorad）に通してビーズを保持し、素通り画分（FT）および3mLベッド体積のNi-NTAレジンを集めた。Ni-NTAレジンをカラム内で、3×50mLの0.5 MNaCl、20mM Tris-HCl pH7.9、および10mMイミダゾールで洗浄した。洗浄液をSDS-PAGE分析用に保存し集めた。6×3mlの0.3Mイミダゾール、0.5M NaCl、20mM Tris-HCl（pH7.9）で洗浄し、次に4×3mLの1Mイミダゾール、0.5M NaCl、20mM Tris-HCl（pH7.9）で洗浄することにより、MMP-1を、カラムから、逐次的溶離工程で溶出させた。レジンを各溶離工程で5分間インキュベートしてから、レジンを遠沈した。各洗浄後の上清を集めて保存した。各上清画分のうち約32μlを上述のように4-20％TG PAGEゲルで泳動することにより、精製効率と収率を分析した。また、iBlot（登録商標）（Invitrogen）を使ってタンパク質をPVDFメンブレンに転写し、ヤギ抗hMMP1抗体（R & D Systems、0.5μg/mL）およびHRP-抗ヤギIgG μg/mL）を使って、ウェスタンブロットを行った。
SDS-PAGE分析によって決定された総収率および純度に基づいて、300mMイミダゾール溶出物を合わせて2つのプール（典型的には＃2および＃3と#4〜6）にした。30KDa分子量カットオフ（MWCO）slide-a-lyzerカセットを使って、2LのTCNBバッファーに対して、1回交換して（2×2L）、4℃で終夜、各試料を透析した。集めて透析した材料を4℃で保存するか、長期保存のために−80℃で保存した。タンパク質濃度をブラッドフォード法で決定した。野生型hMMP-1の場合、典型的には、3.2Lの培養物から約9〜10mgのタンパク質が約80％の純度で精製された。
実施例13
亜鉛の効果：濃縮MMP-1変異体の生化学的分析および活性分析
野生型hMMP-1および変異体のペリプラズム調製物を、実施例1で述べた低張溶解法により、遠心分離による細菌片の除去に先だって3回の凍結/融解/プローブ超音波処理工程を加えて調製した。追加の凍結/融解超音波処理工程を行って得た清澄化細菌溶解物を、実施例11で述べたようにQ-Sepharose Fast Flow Resinを使って、さらに精製した。その結果得られたタンパク質を、Mimetic Green 1リガンドアフィニティ精製ビーズカラム（ProMetic（商標）Biosciences；カタログ番号A6XL）を使ってさらに濃縮した。MMP-1タンパク質を、段階的溶出バッファーにおけるNaCl濃度を増加させることにより、1mM亜鉛の存在下または非存在下で、Green Mimeticアフィニティーレジンから溶出させた。タンパク質を4-20％TG PAGEゲルで分割し、Simply Blueを使って、またウェスタンブロットによって可視化した。
1mM亜鉛の存在下で精製した変異体MMP-1の活性を、実施例9で説明した反応速度アッセイを使って評価した。500秒時点におけるVmax単位毎秒値を試料比較のためのエンドポイントとして使用した。結果を表30に示す。亜鉛の存在下で精製した場合、変異体は温度感受性を示さないことを、結果は示している。
Figure 2012519494
活性を回復するために、1mM亜鉛の存在下で精製した変異体から、EDTAによるキレート化で、亜鉛を除去した。P-30ゲル濾過スピンカラム（排除分子量40,000；BioRad）を、0.5mLの50mM Tris pH7.5、150mM NaCl、10mM CaCl2および0.05％ Brij35で4回洗浄することによって平衡化した。0.1mLの各濃縮MMP-1（Znの存在下で精製したもの）を0.002mLの500mM EDTA、pH8.0と混合してから、バッファーで平衡化したスピンカラムにローディングした。カラムを2000×gで10〜15秒間遠心分離し、素通り画分をMMP-1活性についてアッセイした。キレート化によって亜鉛が除去され、NaClは1Mから150mMに低下した。
活性を評価するために、0.01mLの素通り画分を、タンパク質を活性化するための1mM APMAの存在下または非存在下で、0.19mLのTNBCに加え、室温（20℃〜25℃）で2時間インキュベートした。その混合物を2つに分割し、0.1mLの試料を取り出して、新しいチューブにいれ、37℃で2時間インキュベートし、残りの混合物は室温のままにしておいた。次に、1mM APMAの存在下または非存在下で、0.045mLのTNCBを96ウェルブラックプレートのウェルに加えた。各温度の活性化/プレインキュベートしたMMP-1試料0.05mLを、アッセイプレートの対応するウェルに加えた。0.005mLの蛍光原ペプチドIX基質を各ウェルに加えて、アッセイを開始した。30分時点（1200秒）におけるVmax単位毎秒値を試料比較のためのエンドポイントとして使用した。結果を表31に示す。亜鉛をキレート化するためのEDTAおよびスピンカラム処置後は、温度感受性表現型が回復したことを、結果は示している。
Figure 2012519494
実施例14
突然変異体の活性に対する金属の影響
この実施例では、野生型MMP-1およびさまざまな突然変異体の活性を、さまざまな濃度のZnCl2、CaCl2、MgCl2、およびNaCl2の存在下で試験し、活性にとって最適なそれぞれの濃度を決定した。
ZnCl2およびCaCl2の効果は、APMAと共に20℃、25℃または37℃で2時間インキュベートすることによって酵素を活性化した後に、野生型MMP-1およびさまざまな突然変異体（D179N、G159V、D156T/D179N）の活性を試験することによって評価した。具体的には、実施例1で述べたペリプラズム抽出物4μlを、以下の溶液中のAPMA 96μlに加えた：1）TCNB（50mM Tris、10mM CaCl2、150mM NaCl、0.05％ Brij3、pH7.5）；2）1mM ZnCl2を含むTCNB；3）TNB（50mM Tris、150mM NaCl、0.05％ Brij 35、pH7.5）；または1mM ZnCl2を含むTNB。2時間後に、10μM蛍光原ペプチドIX基質を反応混合物に加え、20℃、25℃または37℃で4時間インキュベートした。蛍光プレートリーダーにおいて励起波長320nm/蛍光波長405nmで蛍光を測定することにより、蛍光を検出した。相対蛍光単位（RFU）を決定した。カルシウムは全ての酵素の活性に必要であり、活性化と基質反応がTNBバッファー中で行われる条件下では、活性はほとんど〜全く観察されなかったことを、結果は示している。野生型MMP-1の場合は、ZnCl2の存在が活性をわずかに減少させたことから、ペリプラズム抽出物および/または反応バッファー中に存在する残存亜鉛があったことが示唆される。温度感受性突然変異体の場合、1mM ZnCl2の存在は、突然変異体の温度感受性表現型に影響を及ぼした。1mM ZnCl2の存在下では、20℃/37℃または25℃/37℃における活性の比が劇的に低下し、約1.0の野生型レベルに近づいた。
温度感受性表現型を保持するために必要なZnCl2の至適濃度を評価するために、野生型MMP-1および突然変異体D179Nについて、0.001mM、0.01mM、0.1mMまたは1mM ZnCl2の存在下で、タイトレーション実験を行った。 表示した濃度のZnCl2の存在下または非存在下で、4μlのペリプラズム抽出物をTCNB中のAPMA 96μlに加えることによって、活性を評価した。反応混合物を25℃または37℃で2時間インキュベートした。2時間後に、10μM蛍光原ペプチドIX基質を反応混合物に加え、25℃または で4時間インキュベートした。蛍光プレートリーダーにおいて、励起波長320nm/蛍光波長405nmで蛍光を測定することによって、蛍光を検出し、RFUを決定した。野生型の場合、試験した条件の全てにおいて活性は実質的に同じで、37℃では25℃よりわずかに活性が低かったことを、結果は示している。また、37℃では、0.1または1mM ZnCl2において、それより低濃度の場合と比較して、活性がわずかに低かった。突然変異体D179Nの場合、25℃で検出される活性は、亜鉛の存在下では、亜鉛が存在しない場合よりも高かった（亜鉛の非存在下における約4000RFUと比較して、亜鉛の存在下では約9000RFU）。25℃における突然変異体D179Nのこの活性は、25℃における野生型と同等であり、また、0.001mM、0.01mM、または0.1mM亜鉛の存在下で同じだった。1mM亜鉛の存在下では、突然変異体D179Nの活性が約6000RFUに低下した。最大の温度感受性表現型は0.001mM ZnCl2で観察され（25℃/37℃での活性比は約13倍）、亜鉛濃度が増加すると共に、検出される温度感受性は減少した。0.1mMおよび1mM ZnCl2の存在下で、D179Nは温度感受性表現型を呈さなかった（約1.0の25℃/37℃比）。したがって、至適ZnCl2濃度は0.001mMまたはその前後であることがわかった。
活性と温度感受性表現型を保持するために必要なCaCl2の至適濃度を決定するために、類似する実験を行った。4μlのペリプラズム抽出物を、表示した濃度のCaCl2の存在下または非存在下で、TCNB中のAPMA 96μlに加えることによって、活性を評価した。反応混合物を25℃または37℃で2時間インキュベートした。2時間後に、10μM蛍光原ペプチドIX基質を反応混合物に加え、25℃または で4時間インキュベートした。蛍光プレートリーダーにおいて、励起波長320nm/蛍光波長405nmで蛍光を測定することによって、蛍光を検出し、RFUを決定した。野生型MMP-1の場合、1mMより低いカルシウムレベルでは活性がほとんど観察されなかった。1mM CaCl2では活性が観察されたが、活性は10mM CaCl2において最大であった（9000〜10,000RFU）。D179N MMP-1変異体の場合、活性は10mM CaCl2の存在下でしか観察されなかった。観察された活性は野生型より低かったが、試験した試料は凍結/融解を繰り返したものであり、それが突然変異体溶解物の活性に影響を与えたかもしれない。したがって、至適CaCl2濃度は10mMもしくはその前後または10mM以上であると観察された。
MgCl2（0、0.01mM、0.2mM、0.2mM、1mMおよび10mM）またはNaCl（0、0.0625M、0.125M、0.25Mおよび0.5M）の存在下または非存在下でも、上と同様の実験を行った。その結果、試験した濃度は突然変異体の活性または温度感受性表現型に影響を有さないことが示された。
変更実施形態は当業者には明白になるであろうから、本発明は本願請求項の範囲によってのみ限定されるものとする。

Claims (100)

  1. マトリックスメタロプロテアーゼ1（MMP-1）ポリペプチドまたはその触媒活性フラグメントのアミノ酸残基の配列中に1つまたはそれ以上の改変を含み、
    改変が、MMP-1またはその触媒活性フラグメントに、少なくとも1.2の、非許容温度と比較した許容温度における酵素活性の比を付与し；
    改変MMP-1がその触媒活性フラグメントである場合には、活性フラグメントが該酵素活性の比を呈する、
    改変マトリックスメタロプロテアーゼ1（MMP-1）。
  2. 改変がアミノ酸の置き換え、挿入、欠失およびその組合せの中から選択される、請求項1に記載の改変MMP-1。
  3. 無改変ポリペプチドが配列番号1に示すアミノ酸の配列を含むか、改変を含有するその対立遺伝子変異体もしくは種変異体、チモーゲン、成熟型、または触媒活性フラグメントである、請求項1または請求項2に記載の改変MMP-1。
  4. 無改変MMP-1ポリペプチドが配列番号2に示すアミノ酸の配列を含むか、改変を含有するその対立遺伝子変異体および種変異体、成熟型、またはその触媒フラグメントである、請求項3に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  5. 触媒活性フラグメントが触媒ドメインまたは触媒ドメインの触媒活性部分を含む、請求項3または請求項4に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  6. 非許容温度において、改変を含まないMMP-1が非許容温度において有する活性よりも低い活性を有する、請求項1〜5のいずれか一項に記載の改変MMP-1。
  7. 許容温度が非許容温度より低い、請求項1〜6のいずれか一項に記載の改変MMP-1。
  8. 非許容温度における活性が、無改変MMP-1の活性の90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、3％、1％未満またはそれ以下である、請求項6または請求項7に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  9. 非許容温度と比較して、許容温度では、少なくとも1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、20.0、30、40、50、60、70、80、90、100倍またはそれ以上増加した酵素活性を呈する、請求項1〜8のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  10. 許容温度が20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃もしくは30℃またはその前後である、請求項1〜9のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  11. 許容温度が18℃、19℃または20℃と30℃との間にある、請求項1〜9のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  12. 許容温度が25℃またはその前後である、請求項10に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  13. 非許容温度が34℃、35℃、36℃、37℃、38℃もしくは39℃またはその前後である、請求項1〜12のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  14. 非許容温度が34℃と39℃の間にある、請求項1〜13のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  15. 非許容温度が34℃もしくは37℃またはその前後である、請求項13に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  16. 改変がアミノ酸の置き換えであって、ポリペプチドが1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個の置き換えを含み；
    置き換えのうちの少なくとも1つが酵素活性の比を付与する、
    請求項1〜15のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  17. 改変がアミノ酸の置き換えであって、ポリペプチドが酵素活性の比を付与するために1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上の置き換えを含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  18. 酵素活性の比を付与するためのアミノ酸の置き換えを1つだけ含有する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  19. 酵素活性の比を付与するためのアミノ酸の置き換えを2つだけ含有する、請求項1〜17のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  20. MMP-1の触媒ドメインまたはその触媒活性部分だけを含有し、触媒ドメインが、酵素活性の比を付与するアミノ酸の置き換えを、少なくとも1つは含有する、請求項1〜19のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  21. 請求項20に記載の改変MMP-1ポリペプチドを、MMP-1ではない第2の異なるポリペプチドと共に含む、融合タンパク質。
  22. 改変がアミノ酸の置き換えであり、置き換えが、配列番号2に示すアミノ酸の配列を含むMMP-1ポリペプチドにおける位置84、85、95、98、99、100、103、104、105、106、109、110、111、112、118、123、124、126、147、150、151、152、153、155、156、158、159、170、171、176、178、179、180、181、182、183、185、187、188、189、190、191、192、194、195、197、198、206、207、208、210、211、212、218、223、227、228、229、230、233、234、237、240、251、254、255、256、257および258の任意の1つまたはそれ以上に対応する位置にある、請求項1〜21のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  23. 改変が、T84F、E85F、L95K、L95I、R98D、I99Q、E100V、E100R、E100S、E100T、E100F、E100I、E100N、T103Y、P104A、P104M、D105A、D105F、D105G、D105I、D105L、D105N、D105R、D105S、D105T、D105W、D105E、L106C、L106S、A109H、D110A、V111R、D112S、A118T、S123V、N124D、T126S、G147P、R150P、R150V、R150D、R150I、R150H、D151G、N152A、N152S、S153T、F155L、F155A、D156H、D156L、D156A、D156W、D156V、D156K、D156T、D156R、D156M、P158T、P158G、P158K、P158N、G159V、G159T、G159M、G159I、G159W、G159L、G159C、P170D、P170A、G171P、G171E、G171D、A176F、A176W、F178T、F178L、D179N、D179V、D179C、E180Y、E180R、E180T、E180F、E180G、E180S、E180N、E180D、D181T、D181L、D181K、D181C、D181G、E182T、E182Q、E182M、E182G、E183G、R183S、T185R、T185Y、T185H、T185G、T185V、T185Q、T185A、T185E、T185D、N187R、N187M、N187W、N187F、N187K、N187I、N187A、N187G、N187C、N187H、F188V、R189N、R189T、R189Q、E190G、E190Y、E190D、Y191V、N192H、N192S、N192D、N192C、H194P、R195C、R195W、R195L、R195G、R195Q、R195A、R195D、R195V、A197V、A197C、A198G、A198L、A198M、G206A、G206S、L207R、L207V、L207I、L207G、S208R、S208L、S210V、S210A、T211L、D212G、D212H、Y218S、F223C、F223E、F223G、F223A、F223S、F223K、F223M、V227C、V227D、V227E、V227L、V227S、V227W、V227G、V227H、V227Q、V227R、Q228P、L229A、L229T、L229I、A230V、D233E、I234A、I234T、I234E、I234Q、I237L、I237W、I237N、I240S、I240A、I240C、I251S、I251W、Q254S、T255H、P256C、K257P、K257TおよびA258Pの中から選択される、請求項22に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  24. 改変がアミノ酸の置き換えであって、置き換えが、配列番号2に示すアミノ酸の配列を有するMMP-1ポリペプチドにおける位置95、105、150、151、155、156、159、176、179、180、181、182、185、187、195、198、206、210、212、218、223、227、228、229、230、233、234、および240の任意の1つまたはそれ以上に対応する位置にあり、
    改変が、MMP-1、その対立遺伝子変異体もしくは種変異体、またはその活性フラグメントに、少なくとも1.5の、非許容温度と比較した許容温度における酵素活性の比を付与する、
    請求項1〜23のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  25. 改変が、L95K、D105A、D105F、D105G、D105I、D105L、D105N、D105R、D105S、D105T、D105W、R150P、D151G、F155A、D156K、D156T、D156L、D156A、D156W、D156V、D156H、D156R、G159V、G159T、A176F、D179N、E180Y、E180T、E180F、D181L、D181K、E182T、E182Q、T185R、T185H、T185Q、T185A、T185E、N187R、N187M、N187F、N187K、N187I、R195V、A198L、A198M、G206A、G206S、S210V、Y218S、F223E、V227C、V227E、V227W、Q228P、L229T、L229I、D233E、I234A、I234T、I234E、I240S、およびI240Cの中から選択される、請求項24に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  26. 許容温度における無改変MMP-1の活性を保持している、請求項1〜25のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  27. 少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、140％、150％またはその前後もしくはそれ以上の活性を保持している、請求項26に記載の改変MMPポリペプチド。
  28. 改変がアミノ酸の置き換えであって、置き換えが、配列番号2に示すアミノ酸の配列を有するMMP-1ポリペプチドにおける位置95、105、150、156、159、179、180、182、185、187、195、198、212、223、227、234、および240の任意の1つまたはそれ以上に対応する位置にあり；
    改変MMP-1ポリペプチドが、25℃における、改変を含有しないMMP-1と比較して、25℃において、少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、110％、120％、140％、150％またはその前後もしくはそれ以上の活性を保持している、
    請求項1〜27のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  29. MMP-1ポリペプチド中の改変が、L95K、D105A、D105G、D105I、D105L、D105N、D105S、D105W、D105T、R150P、D156K、D156T、D156V、D156H、D156R、G159V、G159T、D179N、E180Y、E180T、E180F、E182T、T185H、T185Q、T185E、N187M、N187K、N187I、R195V、A198L、F223E、V227E、I234EおよびI240Sの中から選択される、請求項28に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  30. 非許容温度にばく露した後のポリペプチドの活性が、許容温度にばく露した時に、可逆性である、請求項1〜29のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  31. 非許容温度にばく露し、許容温度に戻した時に、ポリペプチドが、非許容温度と比較して120％、125％、130％、140％、150％、160％、170％、180％、200％またはその前後もしくはそれ以上の活性を呈する、請求項30に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  32. 改変が、D105A、D105F、D105G、D105S、D105T、R150P、G159T、E180Y、E180T、E180F、T185H、T185Q、T185A、T185E、N187R、N187M、N187K、R195V、A198L、A198M、S210V、Y218S、F223E、V227W、L229IおよびI240Cの中から選択される、請求項30または請求項31に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  33. 非許容温度にばく露されると、ポリペプチドの活性が不可逆性に不活性になる、請求項1〜32のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  34. 非許容温度にばく露し、許容温度に戻した時に、ポリペプチドが、非許容温度における活性の、50％、60％、70％、80％、90％、100％、105％、110％、115％、もしくは120％またはその前後を呈する、請求項33に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  35. 改変が、L95K、D105I、D105L、D105N、D105R、D105W、D151G、F155A、D156K、D156T、D156L、D156A、D156W、D156V、D156H、D156R、G159V、A176F、D179N、D181L、D181K、E182T、E182Q、T185R、N187F、N187I、G206A、G206S、V227C、V227E、Q228E、L229T、D233E、I234A、I234T、I234EおよびI240Sの中から選択される、請求項33または請求項34に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  36. 配列番号3〜705、779〜3458、3507〜3531および3541〜3546のいずれか一つに示すアミノ酸の配列を有する、請求項1〜35のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  37. 2つの改変を含むか、2つまたはそれ以上の改変を含む、請求項1〜35のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  38. 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個またはそれ以上の改変を含有する、請求項37に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  39. ポリペプチドが2つまたはそれ以上のアミノ酸の置き換えを含み、置き換えが、配列番号2に示すアミノ酸の配列を有するMMP-1ポリペプチドにおける位置95、105、150、156、159、179、180、182、185、187、198、227、234および240の任意の2つまたはそれ以上に対応する位置にある、請求項37または請求項38に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  40. 2つまたはそれ以上の改変が、L95K、D105N、R150P、D156K、D156T、G159V、D179N、E180T、A198L、V227E、およびI240Sの中から選択される、請求項39に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  41. アミノ酸の置き換えD156K/G159V/D179N；R150P/V227E；D156T/V227E；G159V/A198L；D105N/A198L；D179N/V227E；A198L/V227E；E180T/V227E；D179N/A198L；D156K/D179N；D105N/R150P/D156K/G159V/D179N/E180T；D105N/R150P/E180T；G159V/I240S；D156T/D179N/I240S；D156T/G159V；R150P/E180T；D156T/D179N；D179N/I240S；L95K/D156T/D179N；G159V/D179N；L95K/D105N/E180T；R150P/D156T/A198L；L95K/D105N/R150P/D156T/G159V/A198L/V227E/I240S；L95K/R150P；およびD105N/E180Tを有するポリペプチドの中から選択される、請求項40に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  42. アミノ酸の置き換えを含有しないMMP-1ポリペプチドと比較して増加した活性を付与するアミノ酸の置き換えを少なくとも1つはさらに含む、請求項1〜41のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  43. アミノ酸の置き換えが、配列番号2に示すアミノ酸の配列を含むMMP-1ポリペプチドにおける位置81、84、85、86、87、89、104、105、106、107、108、109、124、131、133、134、135、143、146、147、150、152、153、154、157、158、160、161、164、166、167、180、183、189、190、207、208、211、213、214、216、218、220、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、235、236、238、239、244、249、254、256、257および258の任意の1つまたはそれ以上に対応する位置にある、請求項42に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  44. アミノ酸の置き換えが、F81L、F81A、F81G、F81Q、F81R、F81H、T84H、T84L、T84D、T84R、T84G、T84A、E85S、E85V、G86S、N87P、N87R、N87G、N87Q、R89A、R89T、R89G、R89K、P104E、P104D、P104Q、D105V、L106V、P107T、P107S、P107A、R108E、R108A、R108K、R108S、A109S、A109R、A109G、A109M、A109V、N124G、T131D、K132R、V133T、V133L、S134E、S134D、E135M、S143I、R146S、G147R、G147F、R150E、R150G、R150M、T150T、R150A、R150N、R150K、R150L、R150V、R150D、N152G、N152F、N152L、N152I、S153T、S153P、S153F、S153D、S153Y、P154S、P154I、G157F、P158V、P158I、G160Q、N161L、N161R、N161Y、N161E、N161T、N161I、N161V、N161F、N161Q、H164S、F166W、Q167R、Q167A、Q167S、Q167F、Q167P、Q167T、Q167V、Q167M、E180D、R183S、R189N、R189T、R189Q、E190D、L207M、S208K、S208R、S208L、T211N、I213G、G214L、G214E、L216I、Y218W、S220R、S220A、S220Q、S220T、S220G、S220M、S220V、S220N、T222R、T222P、T222S、T222F、T222N、F223Y、F223H, 2224Q、S224K、S224D、G225Q、G225E、G225H、D226S、D226E、D226P、D226I、V227T、Q228A、Q228D、Q228E、Q228G、Q228H、Q228K、Q228L、Q228M、Q228N、Q228R、Q228S、Q228T、Q228W、Q228Y、L229Q、L229P、L229V、A230G、A230W、A230D、A230I、A230S、A230C、A230V、A230T、A230M、A230N、A230H、Q231I、Q231A、Q231F、Q231D、Q231G、Q231V、Q231W、Q231S、Q231H、Q231M、D232H、D232G、D232R、D232P、D232Y、D232S、D232F、D232V、D232K、D232W、D232Q、D232E、D232T、D232L、D235G、D235A、D235L、D235E、D235R、D235Q、D235T、D235N、G236M、G236R、G236S、G236T、G236C、G236K、G236E、G236L、G236N、Q238T、A239S、A239V、A239L、A239I、A239G、A239K、A239H、A239R、S244W、S244Q、Q249W、Q254S、P256S、K257E、K257R、およびA258Pの中から選択される、請求項43に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  45. アミノ酸の置き換えS208K/G159V；S208K/D179N；S208K/V227E；G214E/G159V；G214E/D179N；およびI213G/D179Nを有するポリペプチドから選択される、請求項43に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  46. MMP-1ポリペプチドまたはその触媒活性フラグメントのアミノ酸残基の配列中に1つまたはそれ以上のアミノ酸の置き換えを含み、置き換えが、MMP-1またはその触媒活性フラグメントに、アミノ酸の置き換えを含有しないMMP-1ポリペプチドと比較して増加した活性を付与する、改変MMP-1ポリペプチド。
  47. MMP-1ポリペプチドまたはその触媒活性フラグメントのアミノ酸残基の配列中に少なくとも2つのアミノ酸の置き換えを含み、
    少なくとも1つのアミノ酸の置き換えが、MMP-1またはその触媒活性フラグメントに、少なくとも1.2の、非許容温度と比較した許容温度における酵素活性の比を付与し；かつ
    少なくとも1つのアミノ酸の置き換えが、MMP-1またはその触媒活性フラグメントに、そのアミノ酸の置き換えを含有しないMMP-1ポリペプチドと比較して増加した活性を付与する、
    改変MMP-1ポリペプチド。
  48. チモーゲンである、請求項1〜47のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  49. 成熟酵素である、請求項1〜47のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  50. 触媒活性ドメインだけまたは触媒ドメインの触媒活性部分だけを含有する、請求項1〜47のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  51. プロリンリッチリンカーおよび/またはヘモペキシンドメインの全部または一部を欠く、請求項1〜47のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  52. 1つまたはそれ以上の追加の改変を含む、請求項1〜51のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  53. 1つまたはそれ以上の追加の改変が、増加した安定性、増加した半減期、変化した基質特異性および/または阻害因子に対する増加した耐性を付与する、請求項52に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  54. グリコシル化またはPEG化されている、請求項1〜53のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  55. 融合タンパク質である、請求項1〜54のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  56. Fcドメインに融合されている請求項55に記載の改変MMP-1ポリペプチド。
  57. 請求項1〜53のいずれか一項に記載の改変MMPポリペプチドをコードするヌクレオチドの配列を含む核酸分子。
  58. 請求項57に記載の核酸分子を含むベクター。
  59. 原核生物ベクター、ウイルスベクターまたは真核生物ベクターである、請求項58に記載のベクター。
  60. 哺乳動物ベクターまたは酵母ベクターである、請求項59に記載のベクター。
  61. アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、サイトメガロウイルスおよびピキア（Pichia）ベクターの中から選択される、請求項59に記載のベクター。
  62. 請求項58〜61のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
  63. 原核細胞または哺乳動物細胞である、請求項62に記載の細胞。
  64. 改変MMP-1ポリペプチドを発現する、請求項62または請求項63に記載の細胞。
  65. 請求項1〜56のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチドを含む医薬組成物。
  66. 請求項1〜56のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチド、または請求項65に記載の医薬組成物を、細胞外マトリックス（ECM）に投与することを含む、細胞外マトリックス（ECM）の疾患または症状を処置する方法であって、
    許容温度がECMの正常温度より低く；かつ
    MMP-1が許容温度またはそれ以下の温度で投与される方法。
  67. MMP-1が、許容温度またはそれ以下の温度である組成物に入れて提供される、請求項66に記載の方法。
  68. MMP-1が、投与の直前に、許容温度またはそれ以下の温度である組成物と混合される、請求項66または67に記載の方法。
  69. 投与に先だって、ECMが、身体の生理学的温度より低い温度に冷却される、請求項66〜68のいずれか一項に記載の方法。
  70. 投与後に、ECMが、予め定められた時間、身体の生理学的温度より低い温度に維持される、請求項66〜69のいずれか一項に記載の方法。
  71. 細胞外マトリックス（ECM）に請求項1〜56のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチドまたは請求項65に記載の医薬組成物を投与することを含む、細胞外マトリックス（ECM）の疾患または症状を処置する方法であって、
    許容温度がECMの正常温度より高く；かつ
    MMP-1が許容温度またはそれ以上の温度で投与される方法。
  72. MMP-1が許容温度またはそれ以上の温度である組成物に入れて提供される、請求項71に記載の方法。
  73. MMP-1が、投与の直前に、許容温度またはそれ以上の温度である組成物と混合される、請求項71または72に記載の方法。
  74. 投与に先だって、ECMが、身体の生理学的温度より高い温度に加熱される、請求項71〜73のいずれか一項に記載の方法。
  75. 投与後に、ECMが、予め定められた時間、身体の生理学的温度より高い温度に維持される、請求項71〜74のいずれか一項に記載の方法。
  76. MMP-1がチモーゲンであり、投与前にプロセシングされる、請求項66〜75のいずれか一項に記載の方法。
  77. MMP-1がプロセシング因子によってプロセシングされる、請求項76に記載の方法。
  78. プロセシング因子が、プラスミン、血漿カリクレイン、トリプシン1、トリプシン2、好中球エラスターゼ、カテプシンG、トリプターゼ、キマーゼ、プロテイナーゼ3、プロテイナーゼ3、フューリン、尿プラスミノーゲン活性化因子（uPA）、活性MMP、酢酸4-アミノフェニル水銀（AMPA）、HgCl2、N-エチルマレイミド、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、カオトロピック剤、酸化型グルタチオン、反応性酸素、Au(I)塩、酸性pHおよび熱の中から選択される、請求項77に記載の方法。
  79. 活性MMPが、MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-10、MMP-26およびMT1-MMPの中から選択される、請求項78に記載の方法。
  80. プロセシング因子がAMPAである、請求項77または請求項78に記載の方法。
  81. プロセシング因子が、投与前に、改変MMP-1ポリペプチドから精製除去される、請求項78〜80のいずれか一項に記載の方法。
  82. 改変MMP-1ポリペプチドが、疾患または症状を処置するために治療有効量で投与される、請求項66〜81のいずれか一項に記載の方法。
  83. 投与が、皮下、筋肉内、病巣内、皮内、局所外用、経皮、静脈内、経口および直腸投与の中から選択される、請求項66〜82のいずれか一項に記載の方法。
  84. 投与が表皮下投与である、請求項66〜83のいずれか一項に記載の方法。
  85. 投与が皮下投与である、請求項66〜84のいずれか一項に記載の方法。
  86. 他の生物製剤、小分子化合物、分散剤、麻酔薬および血管収縮薬またはそれらの組合せの中から選択される医薬剤を投与することをさらに含む、請求項66〜85のいずれか一項に記載の方法。
  87. 分散剤がヒアルロナン分解酵素である、請求項86に記載の方法。
  88. ヒアルロナン分解酵素がヒアルロニダーゼである、請求項87に記載の方法。
  89. 麻酔薬がリドカインである、請求項86に記載の方法。
  90. 血管収縮薬がαアドレナリン作動性受容体アゴニストである、請求項86に記載の方法。
  91. αアドレナリン作動性受容体アゴニストが、レボノルデフリン、エピネフリンおよびノルエピネフリンの中から選択される、請求項90に記載の方法。
  92. 他の医薬剤が、MMP-1と同時に、逐次的に、または断続的に投与される、請求項86〜91のいずれか一項に記載の方法。
  93. 他の薬剤がMMP-1の投与に先だって投与される、請求項86〜91のいずれか一項に記載の方法。
  94. ECMの疾患または症状がコラーゲン介在疾患または症状である、請求項66〜93のいずれか一項に記載の方法。
  95. コラーゲン介在疾患または症状が、セルライト、デュピュイトラン病、ペイロニー病、レダーホース線維症、関節のこわばり、既存の瘢痕、強皮症、リンパ浮腫およびコラーゲン性大腸炎の中から選択される、請求項94に記載の方法。
  96. コラーゲン介在疾患または症状が、五十肩である関節のこわばりである、請求項95に記載の方法。
  97. コラーゲン介在疾患または症状が、術後癒着、ケロイド、肥厚性瘢痕および陥凹性瘢痕の中から選択される既存の瘢痕である、請求項95に記載の方法。
  98. ECM介在疾患または症状が突出椎間板ヘルニアである、請求項66〜93のいずれか一項に記載の方法。
  99. 細胞外マトリックス（ECM）の疾患または症状を処置するための医薬を製剤化するための、請求項1〜56のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチドまたは請求項65に記載の医薬組成物の使用。
  100. 請求項1〜56のいずれか一項に記載の改変MMP-1ポリペプチドを含む、細胞外マトリックス（ECM）の疾患または症状を処置するために使用される医薬組成物。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020517615A (ja) * 2017-04-21 2020-06-18 プレシゲン，インコーポレイテッド 硬皮症の処置のための、マトリックス金属タンパク質分解酵素を含む自己由来細胞の送達

Families Citing this family (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004058147A2 (en) 2002-12-16 2004-07-15 Halozyme, Inc. Human chondroitinase glycoprotein (chasegp), process for preparing the same, and pharmaceutical compositions comprising thereof
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
JP4464395B2 (ja) 2003-03-05 2010-05-19 ヘイローザイム インコーポレイテッド 可溶性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、その調製プロセス、使用およびそれを含む薬学的組成物
TWI395593B (zh) 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
DK3037529T3 (da) 2008-12-09 2019-05-20 Halozyme Inc Udvidede opløselige ph20-polypeptider og anvendelse deraf
US20110229451A2 (en) * 2009-03-06 2011-09-22 Halozyme, Inc. Temperature sensitive mutants of matrix metalloproteases and uses thereof
US9878046B2 (en) 2010-07-20 2018-01-30 Halozyme, Inc. Adverse side-effects associated with administration of an anti-hyaluronan agent and methods for ameliorating or preventing the side-effects
WO2012033953A1 (en) 2010-09-08 2012-03-15 Halozyme, Inc. Methods for assessing and identifying or evolving conditionally active therapeutic proteins
WO2012056044A1 (en) 2010-10-30 2012-05-03 Imperial Innovations Ltd Treatment for dupuytren's disease
AU2012255624B2 (en) * 2011-05-18 2016-06-09 David Chin Method of treating excessive collagen formation
GB201119089D0 (en) 2011-11-04 2011-12-21 Isis Innovation Treatment of musculoskeletal fibroproliferative disorders
EP2852403B1 (en) * 2012-04-30 2018-03-07 Elastomics AB Methods for modification of tissues
US20150196625A9 (en) 2013-01-07 2015-07-16 Rudolph D. Paladini Metal Sensitive Mutants of Matrix Metalloproteases and uses thereof
WO2015006469A2 (en) * 2013-07-11 2015-01-15 180 Therapeutics Lp Method of treating fibroproliferative disorders including dupuytren ' s disease with one or more specific human matrix metalloproteinase and a tnf antagonist
FI127924B (en) 2014-02-27 2019-05-31 Oy Medix Biochemica Ab METHOD OF MEASURING MMP-8 ACTIVATION
GB201505305D0 (en) 2015-03-27 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel Peptides and combination of peptides for use in immunotherapy against various tumors
CN109265517B (zh) 2015-03-27 2024-05-10 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于各种肿瘤免疫治疗的肽和肽组合物
GB201505585D0 (en) 2015-03-31 2015-05-13 Immatics Biotechnologies Gmbh Novel peptides and combination of peptides and scaffolds for use in immunotherapy against renal cell carinoma (RCC) and other cancers
AU2022335159B2 (en) * 2021-08-25 2023-10-26 Foothill Saddleback Pty Ltd Tissue modifier and uses therefor
CN114032252B (zh) * 2021-11-01 2022-04-22 武汉爱博泰克生物科技有限公司 一种重组状态人源mmp-7蛋白的表达方法及应用
CN114404667A (zh) * 2021-12-07 2022-04-29 尚诚怡美(成都)生物科技有限公司 一种长效型重组人源胶原蛋白植入物及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5830696A (en) * 1996-12-05 1998-11-03 Diversa Corporation Directed evolution of thermophilic enzymes

Family Cites Families (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3539794A (en) 1967-09-12 1970-11-10 American Cyanamid Co Self-contained chemiluminescent lighting device
US3536809A (en) * 1969-02-17 1970-10-27 Alza Corp Medication method
US3598123A (en) * 1969-04-01 1971-08-10 Alza Corp Bandage for administering drugs
US3630200A (en) * 1969-06-09 1971-12-28 Alza Corp Ocular insert
US3710795A (en) * 1970-09-29 1973-01-16 Alza Corp Drug-delivery device with stretched, rate-controlling membrane
US3847770A (en) 1972-04-10 1974-11-12 Continental Can Co Photopolymerizable compositions prepared from beta hydroxy esters and polyitaconates
US4044126A (en) * 1972-04-20 1977-08-23 Allen & Hanburys Limited Steroidal aerosol compositions and process for the preparation thereof
GB1429184A (en) * 1972-04-20 1976-03-24 Allen & Hanburys Ltd Physically anti-inflammatory steroids for use in aerosols
US3845770A (en) * 1972-06-05 1974-11-05 Alza Corp Osmatic dispensing device for releasing beneficial agent
US3916899A (en) * 1973-04-25 1975-11-04 Alza Corp Osmotic dispensing device with maximum and minimum sizes for the passageway
US4008719A (en) 1976-02-02 1977-02-22 Alza Corporation Osmotic system having laminar arrangement for programming delivery of active agent
SU787035A1 (ru) * 1978-01-11 1980-12-15 Всесоюзный научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники Устройство дл введени лекарственных препаратов
US4202314A (en) * 1978-11-20 1980-05-13 Busygin Valery P Device for injection of medicinal preparations
EP0072057B1 (en) 1981-08-10 1988-02-10 Duphar International Research B.V Automatic injection syringe
US4952496A (en) * 1984-03-30 1990-08-28 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of the gene for bacteriophage T7 RNA polymerase
US4769027A (en) 1984-08-15 1988-09-06 Burroughs Wellcome Co. Delivery system
US4687610A (en) 1986-04-30 1987-08-18 E. I. Du Pont De Neumours And Company Low crystallinity polyester yarn produced at ultra high spinning speeds
SE457417B (sv) * 1987-04-14 1988-12-27 Astra Meditec Ab Automatisk tvaakammarspruta, foerfarande foer blandning och injicering med sprutan samt ampull foer tvaakammarspruta
GB2205643B (en) * 1987-05-08 1991-03-13 Farmos Group Limited Type iii collagen degradation assay
US5033252A (en) * 1987-12-23 1991-07-23 Entravision, Inc. Method of packaging and sterilizing a pharmaceutical product
US5052558A (en) 1987-12-23 1991-10-01 Entravision, Inc. Packaged pharmaceutical product
US5073543A (en) 1988-07-21 1991-12-17 G. D. Searle & Co. Controlled release formulations of trophic factors in ganglioside-lipsome vehicle
IT1229203B (it) * 1989-03-22 1991-07-25 Bioresearch Spa Impiego di acido 5 metiltetraidrofolico, di acido 5 formiltetraidrofolico e dei loro sali farmaceuticamente accettabili per la preparazione di composizioni farmaceutiche in forma a rilascio controllato attive nella terapia dei disturbi mentali organici e composizioni farmaceutiche relative.
US5120548A (en) 1989-11-07 1992-06-09 Merck & Co., Inc. Swelling modulated polymeric drug delivery device
US5733566A (en) * 1990-05-15 1998-03-31 Alkermes Controlled Therapeutics Inc. Ii Controlled release of antiparasitic agents in animals
GB9105893D0 (en) * 1991-03-20 1991-05-08 Orion Yhtymae Oy Bone resorption assay based on a peptide liberated during collagen degradation
US5580578A (en) 1992-01-27 1996-12-03 Euro-Celtique, S.A. Controlled release formulations coated with aqueous dispersions of acrylic polymers
US5171081A (en) 1992-05-29 1992-12-15 Pita Joe W Chemiluminescent reactive vessel
US5323907A (en) * 1992-06-23 1994-06-28 Multi-Comp, Inc. Child resistant package assembly for dispensing pharmaceutical medications
US5353961A (en) 1993-01-15 1994-10-11 Reseal International Limited Partnership Dual chamber dispenser
US5591767A (en) * 1993-01-25 1997-01-07 Pharmetrix Corporation Liquid reservoir transdermal patch for the administration of ketorolac
US5354566A (en) * 1993-06-02 1994-10-11 Kraft General Foods, Inc. Preparation of yeast-leavened dough crusts
US5395326A (en) * 1993-10-20 1995-03-07 Habley Medical Technology Corporation Pharmaceutical storage and mixing syringe having high pressure assisted discharge
US6114159A (en) * 1994-03-17 2000-09-05 Max-Delbruck-Centrum Fur Molekulare Medizin DNA sequences for matrix metalloproteases, their production and use
IT1270594B (it) * 1994-07-07 1997-05-07 Recordati Chem Pharm Composizione farmaceutica a rilascio controllato di moguisteina in sospensione liquida
US5589171A (en) 1994-08-22 1996-12-31 Advance Biofactures Of Curacao Treatment of Dupuytren's disease with collagenase
US5496284A (en) * 1994-09-27 1996-03-05 Waldenburg; Ottfried Dual-chamber syringe & method
DE4445969C1 (de) 1994-12-22 1996-03-14 Schott Glaswerke Spritzenzylinder für eine Zweikammer-Fertigspritze, Zweikammer-Fertigspritze und Verfahren zum Herstellen und Füllen derselben
US5705364A (en) * 1995-06-06 1998-01-06 Genentech, Inc. Mammalian cell culture process
US5747322A (en) * 1996-05-09 1998-05-05 The Regents Of The University Of California Recombinant crab collagenase
US5976556A (en) * 1996-06-13 1999-11-02 Active Organics, Inc. Combination of acid protease enzymes and acidic buffers and uses thereof
US5667793A (en) * 1996-08-02 1997-09-16 Chesebrough-Pond's Usa Co., Division Of Conopco, Inc. Skin care compositions for treating cellulite
US5830741A (en) * 1996-12-06 1998-11-03 Boehringer Mannheim Corporation Composition for tissue dissociation containing collagenase I and II from clostridium histolyticum and a neutral protease
US6086872A (en) * 1997-03-27 2000-07-11 Advance Biofactures Of Curacao, Nv Amelioration of dupuytren's disease
US6294350B1 (en) 1997-06-05 2001-09-25 Dalhousie University Methods for treating fibroproliferative diseases
EP0998572A2 (en) * 1997-07-25 2000-05-10 Du Pont Pharmaceuticals Company Aggrecan degrading metallo proteases
US5971953A (en) * 1998-01-09 1999-10-26 Bachynsky; Nicholas Dual chamber syringe apparatus
US6031005A (en) * 1998-08-03 2000-02-29 Easterling; W. Jerry Composition and method for treating Peyronie's disease and related connective tissue disorders
US6443914B1 (en) * 1998-08-10 2002-09-03 Lysonix, Inc. Apparatus and method for preventing and treating cellulite
US6060474A (en) * 1998-11-05 2000-05-09 New York Society For The Relief Of The Ruptured And Crippled Maintaining The Hospital For Special Surgery Method for preventing scar tissue formation
CA2383486A1 (en) * 1999-02-01 2000-08-03 Darren Lezdey Treatment of bladder and gastrointestinal mastocytosis
US6022539A (en) * 1999-06-03 2000-02-08 Advance Biofactures Of Curacao Amelioration of peyronie's disease
CA2395902A1 (en) 1999-12-28 2001-07-05 Asger Lau Dalmose Dual chamber syringe with a dual function piston
ATE352300T1 (de) 2000-05-12 2007-02-15 Novalar Pharmaceuticals Inc Zusammensetzung bestehend aus phentolaminmesylat und deren verwendung
EP1297112A2 (en) * 2000-05-22 2003-04-02 PHARMACIA & UPJOHN COMPANY Novel matrix metalloproteinases
US6571605B2 (en) 2001-01-19 2003-06-03 Larry Keith Johnson Constant-head soil permeameter for determining the hydraulic conductivity of earthen materials
CA2349506C (en) * 2001-06-14 2009-12-08 Duke University A method for selective expression of therapeutic genes by hyperthermia
US20030026794A1 (en) * 2001-07-31 2003-02-06 Howard Fein Selective enzyme treatment of skin conditions
US6972005B2 (en) 2002-05-10 2005-12-06 Boehm Jr Frank H Dual chamber syringe and dual lumen needle
CN1196758C (zh) * 2002-08-08 2005-04-13 中国科学院理化技术研究所 酶降解骨胶原制备明胶的方法
JP4464395B2 (ja) * 2003-03-05 2010-05-19 ヘイローザイム インコーポレイテッド 可溶性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、その調製プロセス、使用およびそれを含む薬学的組成物
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
US20090123367A1 (en) * 2003-03-05 2009-05-14 Delfmems Soluble Glycosaminoglycanases and Methods of Preparing and Using Soluble Glycosaminoglycanases
US20060104968A1 (en) * 2003-03-05 2006-05-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases
US20070224184A1 (en) * 2006-02-22 2007-09-27 The Research Foundation Of The State University Of New York Method for treating cellulite
US7854929B2 (en) * 2005-01-21 2010-12-21 The Research Foundation Of State University Of New York Method for treating lateral epicondylitis using collagenase
CN101212992A (zh) 2005-06-30 2008-07-02 马林克罗特公司 双腔注射器
US20070128685A1 (en) * 2005-07-01 2007-06-07 Rodolfo Faudoa Methods and compositions for cell culture
US20070004036A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-04 Rodolfo Faudoa Methods and compositions for keratinocyte culture
US20070003541A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-04 Rodolfo Faudoa Methods and compositions for therapeutics
US7811560B2 (en) 2006-01-30 2010-10-12 Auxilium Us Holdings, Llc Compositions and methods for treating collagen-mediated diseases
US20080131500A1 (en) * 2006-12-04 2008-06-05 The Board Of Regents Of The University Of Texas System Methods and compositions for rapid inactivation of proteins
TWI395593B (zh) * 2008-03-06 2013-05-11 Halozyme Inc 可活化的基質降解酵素之活體內暫時性控制
US20110229451A2 (en) * 2009-03-06 2011-09-22 Halozyme, Inc. Temperature sensitive mutants of matrix metalloproteases and uses thereof
CN106008707A (zh) * 2009-03-09 2016-10-12 生物蛋白有限公司 Mirac蛋白
WO2012033953A1 (en) * 2010-09-08 2012-03-15 Halozyme, Inc. Methods for assessing and identifying or evolving conditionally active therapeutic proteins

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5830696A (en) * 1996-12-05 1998-11-03 Diversa Corporation Directed evolution of thermophilic enzymes

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JPN5012008894; ＷＨＩＴＨＡＭ　Ｓ　Ｅ: 'ＣＯＭＰＡＲＩＳＯＮ　ＯＦ　ＨＵＭＡＮ　ＳＴＲＯＭＥＬＹＳＩＮ　ＡＮＤ　ＣＯＬＬＡＧＥＮＡＳＥ　ＢＹ　ＣＬＯＮＩＮＧ　ＡＮＤ　ＳＥＱＵＥＮＣＥ　ＡＮＡＬＹＳＩＳ' ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＪＯＵＲＮＡＬ Ｖ２４０　Ｎ３, 19861215, Ｐ９１３-９１６, ＴＨＥ　ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ　ＳＯＣＩＥＴＹ *
JPN6013037178; Ｂｉｃｋｅｔｔ　ｅｔ　ａｌ: Ａｎａｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｖｏｌ．２１２, ｐ．５８-６４，１９９３ *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2020517615A (ja) * 2017-04-21 2020-06-18 プレシゲン，インコーポレイテッド 硬皮症の処置のための、マトリックス金属タンパク質分解酵素を含む自己由来細胞の送達

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