JP2012511512A - Mcl−1の特異的調節の方法及び組成物 - Google Patents
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Abstract
【選択図】 図1
Description
本出願は、2008年12月9日に出願された米国仮特許出願第61/120,988号の優先権を主張し、その全てが参照により本明細書に取り込まれている。
本発明は、N.I.H.助成金5PO1 CA92625−06に基づく政府研究支援によってなされた。合衆国政府は本発明においてある特定の権利を有している。
ある特定の実施態様では、置換は同類置換である。
ある特定の実施態様では、置換は非同類置換である。
ある特定の実施態様では、置換は同類と非同類置換の混合である。
置換は、架橋を含んで、天然及び非天然アミノ酸を包含できる。
ある特定の実施態様では、ペプチド配列は、RKALETLRRVGDGVXRNHXTAF、RKXLETXRRVGDGVQRNHETAF、RKALETLRXVGDXVQRNHETAF、RKALXTLRXVGDGVQRNHETAF、RKALETLRRVGDGVQRXHETXF、KALETLRRVGDGVXRNHXTAF、KXLETXRRVGDGVQRNHETAF、KALETLRXVGDXVQRNHETAF、KALXTLRXVGDGVQRNHETAF、及びKALETLRRVGDGVQRXHETXFを包含し、ここでX’は何れかのアミノ酸であって、ある特定の実施態様では、少なくとも1つのXは架橋位置である。
ある特定の実施態様では、ペプチドは、配列LEVESATQLRRFGDKLNFRQKLの少なくとも8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20の連続するアミノ酸と少なくとも70%、80%、又は90%同一の配列を包含できる。
置換は同類置換、非同類置換又はこられの混合であってよい。
ある特定の実施態様では、ポリペプチドは、配列
LEVESATQLRXFGDXLNFRQKL;
LEVXSATXLRRFGDKLNFRQKL;
LEVEXATQXRRFGDKLNFRQKL;
LEVESXTQLXRFGDKLNFRQKL;
LEVESXTQLXRFGDKLNF;
LEVESATQLRRFGDKLXFRQXLを包含し、ここでX’は何れかのアミノ酸であって、ある特定の実施態様では、少なくとも1つのXは架橋位置である。
ある特定の実施態様では、ペプチドは、ヒトBCL−1ファミリーの他の何れのメンバーと結合するよりも、少なくとも2倍、5倍、10倍、又は20倍大きい親和性でMCL−1と結合する。
ある特定の実施態様では、ヒトBCL−1ファミリーは、ヒト型のBIM、BID、BAD、NOXA、PUMA、BAK、BAX、BOK、BCL−2、BCL-XL、BCL−W、及びBFL−1/A1を包含すると理解されている。
ある特定の実施態様では、ヒトBCL−1ファミリーは、ヒト型のBCL−2、BCL-XL、BCL−W、及びBFL−1/A1を包含すると理解されている。
ある特定の実施態様では、ペプチドはXXLXTLRXVGDXVXRXHXTXXの配列を含有し、ここで3アミノ酸分離れた2つのXの1対が架橋によって連結して、残りのX’は何れかのアミノ酸である。
ある特定の実施態様では、ペプチドはXXLXTLRXVGDXVXRXHXTXXの配列を含有し、ここで3アミノ分離れた2つのXの1対が架橋によって連結して、残りのX’は配列KALETLRRVGDGVQRNHETAFからの同類アミノ酸置換を包含することができる。
ある特定の実施態様では、ペプチドはKALETLRXVGDXVQRNHETAFの配列を含有し、ここでX’は架橋によって連結している。
ある特定の実施態様では、ペプチドはKALXTLRXVGDGVQRNHETAFの配列を含有し、ここでX’は架橋によって連結している。
ある特定の実施態様では、ペプチドはKALETLRRVGDGVXRNHXTAFの配列を含有し、ここでX’は架橋によって連結している。
ある特定の実施態様では、ペプチドはKALETLRRVGDGVQRXHETXFの配列を含有し、ここでX’は架橋によって連結している。
一実施態様では、MCL−1阻害剤はBH3ドメインポリペプチド、随意には架橋BH3ドメインポリペプチドを包含する。
別の実施態様では、選択的MCL−1阻害剤は、以下のポリペプチド:NOXA BCL−2ファミリーBH3ドメインの安定化α螺旋(SAHB)ポリペプチド、BOK SAHBペプチド、MCL−1 SAHBペプチド、野生型或いは改変(tailored)BIM SAHB或いはBAK SAHBペプチド、又はMule SAHBペプチド:の1つ又はそれ以上を包含する。
一実施態様では、NOXA SAHBペプチドは、配列番号7、或いは63〜68に記載の配列、又はそれらの誘導体を包含する。
別の実施態様では、BOK SAHBペプチドは、配列番号11に記載の配列、又はそれらの誘導体を包含する。
追加の実施態様では、MCL−1 SAHBペプチドは、配列番号12、或いは17〜60に記載の配列、又はそれらの誘導体を包含する。
更なる実施態様では、BIM SAHBペプチドは、配列番号61或いは62に記載の配列、又はそれらの誘導体を包含する。
別の実施態様では、BAK SAHBペプチドは配列番号69に記載の配列、又はそれらの誘導体を包含する。
追加の実施態様では、Mule SAHBペプチドは配列番号70に記載の配列、又はそれらの誘導体を包含する。
一実施態様では、当該SAHBペプチドの配列は、NOXA、BOK、BIM、BAK、及びMule SAHBポリペプチド配列よりなる群から選ばれる配列(複数も)を包含しているキメラ配列である。
一実施態様では、BCL−2阻害剤は、N−(4−(4−((2−(4−クロロフェニル)−5,5−ジメチル−1−シクロへキサ−1−エン−1−イル)メチル)ピペラジン−1−イル)ベンンゾイル)−4−(((1R)−3−(モルホリン−4−イル)−1−((フェニルスルファニル)メチル)プロピル)アミノ)−3−((トリフルオロメチル)スルホニル)ベンゼンスルホンアミド(「ABT−263」)又はN−(4−(4−((4’−クロロ(1,1’−ビフェニル)−2−イル)メチル)ピペラジン−1−イル)ベンゾイル)−4−(((1R)−3−(ジメチルアミノ)−1−((フェニルスルファニル)メチル)プロピル)アミノ)−3−ニトロベンゼンスルホンアミド(「ABT−737」)である。
一実施態様では、白血病はAML又はALLである。
関連する実施態様では、過剰増殖性障害は、耐性過剰増殖性疾患で、BCL−2阻害剤耐性のものであってよい。
別の実施態様では、過剰増殖性障害は再発性又は難治性の癌である。
一実施態様では、MCL−1活性が阻害される。
別の実施態様では、ポリペプチドは選択的MCL−1阻害剤である。
更なる実施態様では、細胞におけるアポトーシスが増強される。
一実施態様では、難治性の癌は、化学療法剤の投与又はBCL−2阻害剤の投与に耐性である。随意に、難治性の癌は、N−(4−(4−((2−(4−クロロフェニル)−5,5−ジメチル−1−シクロへキサ−1−エン−1−イル)メチル)ピペラジン−1−イル)ベンンゾイル)−4−(((1R)−3−(モルホリン−4−イル)−1−((フェニルスルファニル)メチル)プロピル)アミノ)−3−((トリフルオロメチル)スルホニル)ベンゼンスルホンアミドの投与に耐性、N−(4−(4−((4’−クロロ(1,1’−ビフェニル)−2−イル)メチル)ピペラジン−1−イル)ベンゾイル)−4−(((1R)−3−(ジメチルアミノ)−1−((フェニルスルファニル)メチル)プロピル)アミノ)−3−ニトロベンゼンスルホンアミドの投与に耐性、ゴシポール(gossypole)の投与又はオバトクラクス(obatoclax)の投与に耐性である。
追加の実施態様では、難治性の癌はMCL−1を過剰発現する。
更なる実施態様では、選択的MCL−1阻害剤は、架橋BH3ドメインを保持しているポリペプチドを包含する。
別の実施態様では、選択的MCL−1阻害剤は、NOXA BCL−2 BH3ドメインの安定化α螺旋(SAHB)ポリペプチド、BOK SAHBポリペプチド、MCL−1 SAHBドメインポリペプチド、改変BIM SAHBポリペプチド、改変BAK SAHBポリペプチド、又はMule SAHBポリペプチドである、ポリペプチドを包含する。
一実施態様では、非MCL−1選択的BCL−2ファミリーポリペプチド阻害剤は選択的BCL−2阻害剤である。
別の実施態様では、非MCL−1選択的BCL−2ファミリーポリペプチド阻害剤は、N−(4−(4−((2−(4−クロロフェニル)−5,5−ジメチル−1−シクロへキサ−1−エン−1−イル)メチル)ピペラジン−1−イル)ベンンゾイル)−4−(((1R)−3−(モルホリン−4−イル)−1−((フェニルスルファニル)メチル)プロピル)アミノ)−3−((トリフルオロメチル)スルホニル)ベンゼンスルホンアミド(「ABT−263」);N−(4−(4−((4’−クロロ(1,1’−ビフェニル)−2−イル)メチル)ピペラジン−1−イル)ベンゾイル)−4−(((1R)−3−(ジメチルアミノ)−1−((フェニルスルファニル)メチル)プロピル)アミノ)−3−ニトロベンゼンスルホンアミド(「ABT−737」);ゴシポール;又はオバトクラクスである。
一実施態様では、試験化合物は小分子又はポリペプチドである。随意に、ポリペプチドは架橋BH3ドメインを有する。
一実施態様では、ポリペプチドの配列は、図13に挙げられているSAHB配列に少なくとも80%同一である。
別の実施態様では、本発明は、本発明の方法で同定されたMCL−1調節化合物又は選択的MCL−1結合剤を提供する。
一実施態様では、試験化合物は小分子又はポリペプチドである。
別の実施態様では、MCL−1結合剤はMCL−1阻害剤である。
更なる実施態様では、MCL−1ポリペプチド、又は、随意に、MCL SAHBは標識化されている。
一実施態様では、標識はFITCである。
一実施態様では、選択的MCL−1阻害剤は、NOXA BCL−2ファミリーBH3ドメインの安定化α螺旋(SAHB)ポリペプチド配列、BOK SAHBペプチド配列、MCL−1 SAHBペプチド配列、野生型又は改変BIM SAHB或いはBAK SAHBペプチド配列、又はMule SAHBペプチド配列と少なくとも95%同一のポリペプチド配列を包含している。
別の実施態様では、選択的MCL−1阻害剤は、NOXA BCL−2ファミリーBH3ドメインの安定化α螺旋(SAHB)ポリペプチド、BOK SAHBペプチド、MCL−1 SAHBペプチド、野生型又は改変BIM SAHB或いはBAK SAHBペプチド又はMule SAHBペプチドである、ポリペプチドを包含している。
一実施態様では、MCL−1 SAHBポリペプチドは配列番号16に記載の配列又はそれらの誘導体を包含している。
別の実施態様では、BIM SAHBポリペプチドは配列番号31、32に記載の配列、又はそれらの誘導体を包含している。
更なる実施態様では、BAK SAHBドメインポリペプチドは配列番号40に記載の配列を包含している。
本明細書で用いられる用語「炭化水素架橋」又は「架橋」は、ポリペプチドの天然の二次構造を配座的に与えるのに役立つ少なくとも2つの改変アミノ酸を有するポリペプチドを安定に架橋結合するプロセスを示す。炭化水素架橋は、α螺旋二次構造を有する傾向にある、ポリペプチドをその本来のα螺旋構造を維持できるようにする。この二次構造はポリペプチドのタンパク分解的切断及び熱に対する耐性を増大して、標的結合親和性、疎水性、及び細胞透過性も増大する。従って、本明細書に記載されている炭化水素「架橋された」(架橋結合した)ポリペプチドは、対応する非炭化水素架橋(架橋結合していない)ポリペプチドと比べて生物活性が改善されている。例えば、架橋結合したポリペプチドはBH3 BCL−2相同ドメインのα螺旋ドメインを包含することができて、これは、少なくとも典型的なNOXA、BOK及びMCL−1 BH3ドメインの場合に、MCL−1タンパク質の天然リガンドとの相互作用(例えば、MCL−1二量体及び/又は多量体及び/又はMCL−1/BAKヘテロ二量体の形成を包含する)を競合的に妨害することができて、これにより、細胞中のMCL−1活性を調節できる。MCL−1活性の調節は、例えば、細胞におけるアポトーシスの促進、細胞における細胞周期制御の調節、細胞における自食作用の調節、細胞の炎症応答の調節、細胞の自己免疫応答の調節、及びRNAスプライシングの調節を包含する、多くの効果をもたらすことができる。本明細書に記載されている架橋結合したポリペプチドは、予防的に又は治療的に、例えば、癌のような、過剰増殖性疾患を治療又は予防するために、用いることができる。
一実施態様では、活性部位は、G262及びF270(PDB#2pqk、配列番号1)に対応する2つ又はそれ以上のアミノ酸を包含している。
ある特定の実施態様では、BCL−2相同ドメインは、MCL−1のBH3ドメイン(PDB#1pqk、配列番号1)のL213、G217、及び/又はD218残基に対応するアミノ酸残基のような、1つ又はそれ以上の保存アミノ酸残基を含有している。アンチ(抗)アポトーシスポリペプチドは、MCL−1、BCL−2、BCL−X1、BCL−w、BCL−B、A1/BFL−1、BOO/DIVA、Nr−13、CED−9、及びウィルス性同族体を包含する。
ある特定の実施態様では、BCL−2相同ドメインは、NOXAのBH3ドメイン(PubMed RefSeq:NP_066950.1、配列番号2、5)のL29及びG33残基又はBOKのBH3ドメイン(PubMed RefSeq:NP_115904.1、配列番号3、9)のL70及びG75残基に対応するアミノ酸残基のような、1つ又はそれ以上の保存アミノ酸残基を含有している。プロアポトーシスポリペプチドは、BAX、BAK、BOK/MTD、BID、BAD、BIK/NBK、BLK、HRK、BIM/BOD、BNIP3、NIX、NOXA、PUMA、BMF、EGL−1、及びウィルス性同族体を包含する。標的化分解によってMCL−1レベルを制御して、それによって生理的ストレス中でプロアポトーシスとなる非BCL−2ファミリータンパク質の例は、BH3ドメインを含有しているユビキチンリガーゼMULEである。
ある特定の実施態様では、本発明の化合物は、MCL−1ポリペプチドの活性部位に結合する。
「モジュレータ」はMCL−1ポリペプチドの活性を変える(例えば、増強/促進又は阻害/抑制する)化合物である。
ある特定の実施態様では、「小分子」はペプチド又は核酸分子を包含しない。
例えば、螺旋3のV216、V220、H224、A227及びM231残基、螺旋4のV249、V253及びD255残基、及び螺旋5のG262、R263、T266及びF270残基を包含する、MCL−1ポリペプチドのα螺旋3、4及び5の疎水性及び親水性アミノ酸残基は、 MCL−1BH3ドメイン(PubMed RefSeq: NP_068779.1、配列番号1,16)の残基T212、L213、R214、V216、G217、D218及びV220、NOXA BH3ドメイン(PubMed RefSeq: NP_066950.1、配列番号2,5)の残基A26、L29、G33及びL36、及びBOK BH3ドメイン(PubMed RefSeq: NP_115904.1、配列番号3、9)残基V66、V69、L70、G75及びL79と相互作用すると予測されている。
プロアポトーシス活性を活性化する化合物は、BCL−2ファミリーポリペプチドの活性部位と結合して、その化合物を欠如している対照と比較したときに、BCL−2ファミリーポリペプチドのプロアポトーシス活性の、例えば、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍又はそれ以上の増大をもたらすだろう。
別の実施態様では、アンチアポトーシス活性を活性化する化合物は、BCL−2ファミリーポリペプチドの活性部位と結合して、その化合物を欠如している対照と比較したときに、BCL−2ファミリーポリペプチドのアンチポトーシス(生存)活性の例えば、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍又はそれ以上の増大をもたらすだろう。
別の実施態様では、生化学的な活性(例えば、細胞周期、自食作用)を調節する化合物は、BCL−2ファミリーポリペプチド又は標的タンパク質と結合するその他のBCL−2相同ドメインの活性部位と結合して、その化合物を欠如している対照と比較したときに、標的タンパク質の生化学的活性の、例えば、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍又はそれ以上の増大をもたらすだろう。
アンチアポトーシス又はプロアポトーシス活性の活性化、又は生化学的活性(例えば、自食作用の誘発、細胞周期停止の誘発)の調節を評価するためのアッセイは当該技術分野で公知であって、本明細書に記載されている。
別の実施態様では、アンチアポトーシス活性を阻害する化合物は、BCL−2ファミリーポリペプチドの活性部位と結合して、BCL−2ファミリーポリペプチドのアンチアポトーシス活性を阻止又は減少するだろう。従って、アンチアポトーシス活性、例えば、生存率が、化合物が存在していない対照の細胞集団と比較すると、阻害剤が存在している細胞の集団において、75%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%又はそれ未満に少なくなるだろう。
更に別の実施態様では、生化学的活性(例えば、細胞周期、自食作用)を調節する化合物は、BCL−2ファミリーポリペプチド又は標的タンパク質を結合するその他のBCL−2相同ドメインの活性部位と結合して、標的タンパク質の生化学的活性を阻止又は減少するだろう。従って、生化学的活性(例えば、自食作用、細胞周期停止)が、化合物が存在していない対照の細胞集団と比較すると、阻害剤が存在している細胞の集団において、例えば、75%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、5%又はそれ未満に少なくなるだろう。
一実施態様では、NOXA BH3ポリペプチドは、配列番号2(図5)に記載の配列と30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していて、配列番号2のL29、G33、及び/又はD34に対応する1つ又はそれ以上のアミノ酸残基又はその同類置換を包含している。随意に、NOXA BH3ポリペプチドのNOXA BH3ドメインは、配列番号2に記載のBH3ドメインの配列と30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していてもよい。
ある特定の実施態様では、NOXA BH3ポリペプチドは、配列番号7、及び配列番号63〜68に記載のアミノ酸配列を有している。
ある特定の実施態様では、用語「NOXA BH3ポリペプチド」の範囲は、配列番号2の生物活性断片を包含していて、一方「NOXA BH3ドメイン」の範囲は同様に、配列番号2のBH3ドメインの生物活性断片を包含する。
一実施態様では、BOK BH3ポリペプチドは、配列番号3(図6)に記載の配列と30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していて、配列番号3のL70、G75、及び/又はD76残基に対応する1つ又はそれ以上のアミノ酸残基又はその同類置換を包含する。
随意に、BOK BH3ポリペプチドのBOK BH3ドメインは、配列番号3に記載のBH3ドメインの配列と30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有している。
ある特定の実施態様では、BOK BH3ポリペプチドは、配列番号11に記載のアミノ酸配列を有している。
ある特定の実施態様では、用語「BOK BH3ポリペプチド」の範囲は、配列番号3の生物活性断片を包含していて、一方「BOK BH3ドメイン」の範囲は同様に、配列番号3に記載の配列のBH3のドメインの生物活性断片を包含する。
一実施態様では、MCL−1 BH3ポリペプチドは配列番号1に記載の配列と30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していて、配列番号1(図4)のL213及びG217に対応する1つ又はそれ以上のアミノ酸残基又はその同類置換を包含する。
随意に、MCL−1 BH3ポリペプチドのMCL−1 BH3ドメインは、配列番号1に記載のBH3ドメインの配列と30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有している。
ある特定の実施態様では、MCL−1 BH3ポリペプチドは、配列番号12、17〜60に記載のアミノ酸配列を有している。
ある特定の実施態様では、用語「MCL−1 BH3ポリペプチド」の範囲は、配列番号1の生物活性断片を包含していて、一方「MCL−1 BH3ドメイン」の範囲は同様に、配列番号1に記載の配列のBH3のドメインの生物活性断片を包含する。
一実施態様では、配列番号4に記載のBIM BH3の配列と30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していて、配列番号4(NCBI#NP_619527に基づいて列挙)のL152及びG156に対応する1つ又はそれ以上のアミノ酸残基又はその同類置換を包含するが、MCL−1特異性をもたらすために、1つ又はそれ以上のアミノ酸残基の突然変異、例えば、配列番号3のI155のFへの及び/又はE158のKへの変換、又はそれらの同類置換も包含する。
ある特定の実施態様では、MCL−1特異性改変BIM BH3ポリペプチドは、配列番号62に記載のアミノ酸配列を有している。
別の実施態様では、BH3ポリペプチドは、配列番号9に記載のBAK BH3の配列と30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していて、配列番号6(NCBI#NP_619527に基づいて列挙)のL74及びG78に対応する1つ又はそれ以上のアミノ酸残基又はその同類置換を包含するが、MCL−1特異性をもたらすために、1つ又はそれ以上のアミノ酸残基の突然変異、例えば、配列番号69のI77のFへの及び/又はD84のKへの変換(NCBI#NP_001179に基づいて列挙)、又はそれらの同類置換も包含する。
一実施態様では、非BCL−2ファミリーメンバーBH3ポリペプチドは、配列番号70に記載の配列と30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%又はそれ以上同一のアミノ酸配列を有していて、配列番号70(図13)のL1980及びG1984(NCBI#AAY98258に基づいて列挙)に対応する1つ又はそれ以上のアミノ酸残基又はその同類置換を包含する。
例えば、過剰な細胞生存又は増殖の障害の治療に関しては、治療有効量は、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも100%まで、腫瘍成長の速度を減少し、腫瘍の大きさを減少し、転移の数を減少し、腫瘍進行の時間を増大し、或いは生存時間を増大する、治療薬剤の量を示すことが好ましい。
ある実施態様では、このような用語は、1つ又はそれ以上の治療法の投与によって:(1)癌細胞集団の安定化、減少又は除去、(2)寛解期間の増大、(3)癌の再発率の減少、(4)癌の再発時間の増大、及び(6)患者の生存率の増大:の1つ、2つ、3つ又はそれ以上の結果を示す。
一実施態様では、本発明は、抗癌剤と、本明細書に記載されているようにMCL−1ポリペプチドの活性部位に結合する化合物との有効用量を投与することを含有してなる、MCL−1関連疾患を治療する方法を対象にしている。
ある特定の実施態様では、非−必須アミノ酸の改変によってペプチドの活性を増大することができる。
「必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型配列から変えたときに、MCL−1活性部位に対するポリペプチドの結合活性の無効化又は実質的な消失をもたらすか、或いはそれと反対にポリペプチドの活性を劇的に変える(例えば、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、又は少なくとも90%まで活性を減少する)残基である。
ある特定の例では、「必須」アミノ酸残基は、ポリペプチドの野生型配列から変えたときに、ポリペプチドの結合活性の無効化又は実質的な消失をもたらす残基に限定される。
例えば、MCL−1、NOXA、BOK又はその他のBCL−2ファミリーポリペプチドのBH3ドメインの必須及び非−必須アミノ酸残基は、当該技術分野で公知であって本明細書に記載されている方法によって容易に確認できる。本明細書で用いる用語「必須」アミノ酸残基は必須アミノ酸の同類置換を包含する。一般に、「必須」アミノ酸残基は、BH3ポリペプチドとMCL−1ポリペプチドの活性部位との相互作用面で見出される。
本発明のペプチドでは、架橋が結合タンパク質(例えば、MCL−1)と直接相互作用するアミノ酸と結合していないことが好ましい。本明細書におけるアラニンスキャン及び架橋スキャンによって明らかにされたように、ペプチドは一般に、α螺旋の非相互作用面上での突然変異又は改変に対してより耐性であり、そしてα螺旋の相互作用面上での突然変異に対して耐性がより少ない。相互作用タンパク質と相互作用する螺旋の部分のN末端又はC末端の何れかに近接した相互作用面に作出すると、架橋及び突然変異は耐性となり、ある時は有利である。例えば、螺旋の相互作用面に隣接した架橋の配置がペプチドの標的タンパク質に対する増大した親和性をもたらすということが知られている。本発明のペプチドの相互作用及び非相互作用面上のアミノ酸の同定は十分に当業者の能力の範囲内である。
適切な同類アミノ酸置換は、同じタンパク質を発現する別の動物由来のタンパク質アイソフォームとのアラインメントによって同定することもできる。
好ましい実施態様では、可能な同類アミノ酸変更を確認するために、ヒトの配列を別の哺乳動物の配列と比較する。配列比較のための別の哺乳動物は、これに限定されないが、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウシ、ヤギ、ウサギ、及び非ヒト霊長類を包含する。配列アラインメントを実施する方法は、本明細書で検討するように周知である。
ある特定の実施態様では、選択的MCL−1結合剤は、選択的MCL−1結合剤が非MCL−1BCL−2ファミリーポリペプチドと結合できるよりも、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍又はそれ以上強くMCL−1ポリペプチドと結合できる。随意に、選択的NCL−1阻害剤は、選択的MCL−1結合剤がその他の何れかのBCL−2ファミリーポリペプチドと結合できるよりも、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍又はそれ以上強くMCL−1ポリペプチドと結合できる。
ある特定の実施態様では、「選択的MCL−1結合剤」は、1、2、5、10、20、50、100、150又は200nMにほぼ等しいか又はそれ以下のKDでMCL−1と結合するのに対して、非MCL−1BCL2ファミリーポリペプチド(又は全ての非MCL−1BCL−2ファミリーポリペプチド)はほぼ300、400又は500nM以上のKDで結合する。
ある薬剤の「選択的MCL−1結合剤」としての同定及び評価は、薬剤のMCL−1ポリペプチドのドメインとの物理的相互作用を、非MCL−1アンチアポトーシスマルチドメインタンパク質のそのようなドメインとのその薬剤の相互作用と比較して直接評価する(例えば、薬剤のBCL−2の活性部位と結合する能力と比較した、試験薬剤がMCL−1ポリペプチドの活性部位と結合する能力をモニタリングする)か、又は非MCL−1アンチアポトーシスマルチドメインタンパク質の活性と比較してMCL−1活性を間接的に評価、例えば、薬剤(例えば、試験薬剤)によるMCL−1活性の調節をモニタリングして、の何れかで実施できる。
このような「MCL−1結合剤」のMCL−1ポリペプチドへの結合は、結合薬剤の同一性に応じて、MCL−1ポリペプチド活性を阻害し、MCL−1ポリペプチド活性を活性化し、或いはMCL−1ポリペプチドの活性を調節してよく、又はMCL−1ポリペプチド活性に変化をもたらさなくてよい。
「選択的MCL−1阻害剤」は、薬剤が非MCL−1BCL−2ファミリーポリペプチドの活性を阻害する能力よりも少なくとも1.5倍大きい有効性又は効力でMCL−1活性を阻害できる薬剤である。
ある特定の実施態様では、選択的MCL−1阻害剤は、選択的MCL−1阻害剤が、非MCL−1BCL−2ファミリーポリペプチドの活性を阻害できるよりも、少なくとも2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍又はそれ以上MCL−1活性を阻害できる。随意に、選択的MCL−1阻害剤は、MCL−1阻害剤がその他のBCL−2ファミリーポリペプチドの何れかの活性を阻害できるよりも、少なくとも1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍又はそれ以上MCL−1活性を阻害できる。
ある特定の実施態様では、「選択的MCL−1阻害剤」は、1、2、5、10、20、50、100、150又は200nMとほぼ同一又はそれ以下のKDでMCL−1と結合するのに対して、非MCL−1BCL−2ファミリーポリペプチド(又は全ての非MCL−1BCL−2ファミリーポリペプチド)は約300、400又は500nM以上のKDで結合する。
薬剤の「選択的MCL−1阻害剤」としての同定及び評価は、非MCL−1アンチアポトーシスマルチドメインタンパク質の活性と比較して、MCL−1活性を評価して、例えば、薬剤(例えば、試験薬剤によるMCL−1活性の調節をモニタリングして、又は薬剤の非MCL−1アンチアポトーシスマルチドメインタンパク質のこのようなドメインとの相互作用と比較した薬剤のMCL−ポリペプチドのドメインとの物理的相互作用を評価して(例えば、薬剤がBCL−2の活性部位と結合する能力と比較して試験薬剤がMCL−1の活性部位と結合する能力をモニタリングして)、直接的又は間接的に実施できる。
典型的なBCL−2阻害剤は、BCL−2、BCL−XL、及びBCL−wのそれぞれと結合する、N−(4−(4−((2−(4−クロロフェニル)−5,5−ジメチル−1−シクロヘキサ−1−エン−1−イル)メチル)ピペラジン−1−イル)ベンゾイル)−4−(((1R)−3−(モルホリン−4−イル)−1−((フェニルスルファニル)メチル)プロピル)アミノ)−3−((トリフルオロメチル)スルホニル)ベンゼンスルホンアミド({ABT−263」;Tse et al., Shoemaker et al. 及びLock et al.を参照されたい)及びN−(4−(4−((4’−クロロ(1,1’−ビフェニル)−2−イル)メチル)ピペラジン−1−イル)ベンゾイル)−4−(((1R)−3−(ジメチルアミノ)−1−((フェニルスルファニル)メチル)プロピル)アミノ)−3−ニトロベンゼンスルホンアミド(「ABT−737」)を包含する。典型的な「BCL−2阻害剤」化合物の同一性及び使用は、例えば、米国特許出願公開第2008/0146572号、米国特許出願公開第2008/0160545号及び米国特許出願公開第2008/0193943号に開示されていて、これらは参照によりその全てが本明細書に取り込まれている。
その他のBCL−2阻害剤の構造は当該技術分野で公知であって、例がWalensky, L.D., Cell Death and Differ, 13: 1339, 2006 に要約されている。特定の追加例は、ゴシポール(細胞を通過していくつかのデヒドロゲナーゼ酵素の阻害剤として作用する、ポリフェノールアルデヒド;2,2′−ビス−(ホルミル−1,6,7−トリヒドロキシ−5−イソプロピル−3−メチルナフタレン); 例えば、Tripathki et al. Eur J Biochem. 2004 271(17):3488-502; Conners et al. Mol Biochem Parasitol. 2005 142(2):137-48; 及びChoi et al. J. Med. Chem. 2007, 3841-3850 を参照されたい)及びオバトクラクス(オバトクラクスメシレート又は「GX15−070」とも称される。オバトクラクスは小分子のインドールビピロール薬剤化合物である。例えば、Trudel et al. Blood. 2007 109(12):5430-8; O’Brien et al. Blood. 2008 Oct 17 を参照されたい)。
用語「新生物」、「過形成」、及び「腫瘍」は通常「癌」と言われていて、これは細胞の無制御で異常な生育によって特徴付けられる100を越える疾患に対する一般名である。
本明細書で用いられる「腫瘍」も、正常、良性、又は悪性の組織塊を包含する。
用語「精製された」は、ポリペプチド又は細胞が存在する唯一のポリペプチド又は細胞であることを暗示するのではなく、ポリペプチド又は細胞が、天然にはそれと関連している細胞又は生物物質を基本的に含んでいない(約80から90%、又は約90〜95%、最大99〜100%まで純粋な)こと、そのため天然のポリペプチドとは区別されることを暗示する。
「単離された」は、細胞に関連して用いる場合には、初代細胞又は細胞株の、細胞培養又は臓器培養の何れかの、培養物中の細胞(すなわち、動物内のものではない)を意味する。細胞は、正常動物、トランスジェニック動物、自然に発生した遺伝子変化を有する動物、及び/又は遺伝的及び/又は誘導性疾患又は症状を有する動物から単離できる。
「提供すること」は、例えば、細胞、ポリペプチド、薬物、ポリヌクレオチド、プローブ等を、例えば、購入又は作成することによって、得ることを示す。提供される物質は、あらゆる公知の又は後に開発される生物学的又はその他の技術によって、作成することができる。
病的細胞生存に関わる個々のアンチアポトーシスBCL−2ファミリータンパク質に対する選択的阻害剤の開発は、未だ厄介だが緊急な課題である。精密に目的に合わせた化合物は、特異的なアンチアポトーシス遮断によって促進されるヒトの疾患をそれぞれに研究又は治療するための分子プローブ又は標的治療の両方として役立つだろう。我々は先に、治療効果(Danial et al., Nat Med 14, 144. 2008; Walensky et al., Science 305, 1466. 2004、共に参照により取り込まれている)及びメカニズムの解明(Gavathiotis et al., Nature 455, 1076.2008; Walensky et al., Mol Cell 24, 199. 2006、共に参照により取り込まれている)の両方のために、変性BID、BAD、及びBIM BH3ペプチドを、それらの細胞間標的と噛み合ってこれを調節する、プロテアーゼ耐性で細胞透過性のα螺旋に形質転換するために炭化水素架橋を適用した。広範囲にわたるヒトの癌における主要な耐性因子としてMCL−1が浮かび上がってきた。BCL−2ドメインの安定化α螺旋(SAHBs)のライブラリーをスクリーニングして、MCL−1それ自体のBH3螺旋、更に別のBCL−2ファミリータンパク質由来のその他のSAHBsが強力で排他的なMCL−1阻害剤であることを確認した。X線結晶学及び突然変異誘発検討で、MCL−1結合溝のMCL−1 BH3と噛み合う主要な決定因子を明確にした。MCL−1 SAHBは、MCL−1を直接標的とし、そのプロアポトーシスBAKとの阻害性相互作用を無効にし、そしてMCL−1依存性癌細胞をカスパーゼ依存性アポトーシスに対して感受性にする。従って、リガンド選択性に対する自然の解決法(Nature's solution)を利用することにより、細胞透過性MCL−1特異的薬剤を作出して標的とするMCL−1阻害の構造及び機能特性を明らかにした。
BCL−2ファミリーは、細胞の運命を決定するチェックとバランスの複雑なネットワークを形成するプロ−及びアンチ−アポトーシスタンパク質の両方を包含している(Danial and Korsmeyer, 2004)(図1A)。このファミリーは、その全てがα螺旋セグメントを包含している、最大4つまでの保存「BCL−2相同」(BH)ドメインの存在によって構造上定義される(Adams and Cory, 1998; Reed, 1998)(図1B)。アンチアポトーシスタンパク質は全てのBHドメインにおいて配列保存を表示するのに対して、プロアポトーシスタンパク質は、「マルチBHドメイン」メンバーとBH3α螺旋ドメインと配列類似性のみを表示する「BH3オンリー」メンバーに分けられる。「BH3オンリー」サブグループは多様性があって、異種刺激で生じた死の促進シグナルをミトコンドリアにある核アポトーシス機構へ送達する。アポトーシス刺激及び細胞状況の特質に基づいて、BH3オンリータンパク質の死のシグナルはアンチアポトーシスタンパク質によって無効にされるか或いはミトコンドリア殺執行因子BAX及びBAKへ、直接に又は間接的に送達される。活性化されると、これらのプロアポトーシスマルチBHドメインメンバーはミトコンドリア外膜の浸透性上昇を誘導し、放出されたミトコンドリア因子がカスパーゼを活性化できるようにして、不可逆的に死のプログラムを実行する(Green, 2005)。
癌細胞はプロアポトーシスタンパク質を抑制するためにアンチアポトーシスタンパク質を過剰に発現して、それらの生存を確保するアポトーシス遮断を開始する(図2)。特異的BCL−2ファミリータンパク質相互作用の薬理的な混乱は癌細胞におけるアポトーシスを誘発できる。例えば、BH3オンリータンパク質BADに倣った小分子BH3模倣薬、ABT−737は、BCL−2及びBCL−XLを特異的に標的にして(Oltersdorf et al., 2005)、これらのタンパク質によって引き起こされる選択的な癌においてアポトーシスを誘発する(Kline et al., 2007; Konopleva et al., 2006; van Delft et al., 2006)ように設計された。ABT−737の経口用形態、ABT−263(Lock et al., 2008; Shoemaker et al., 2008; Tse et al., 2008)は現在、第I/IIaフェーズの癌治験で評価されている。ABT化合物は、このアンチアポトーシスがこれらの結合スペクトルの外にあるので、MCL−1を過剰発現する癌細胞に対して効果を示さない(Deng et al., 2007; Konopleva et al., 2006; van Delft et al., 2006)。MCL−1と様々な形態の癌(例えば、AML、乳癌及び多発性骨髄腫)の間の関連性を記載している更なる参照文献は、Darenne et al., Zhang et al., Lin et al., Kim et al., Schulze-Bergkamen et al., Hussain et al. 及びThallinger et al.(完全な参照文献は以下に)を包含する。
BCL−2ドメインの安定化α螺旋(Stabilized Alpha-Helices of BCL-2 domains)、又はSAHBは、インビトロ及びインビボにおけるBCL−2ファミリー相互作用を精査及び調節するために開発された(図3)。例えば、天然のプロアポトーシスBID BH3ペプチド配列に挿入された、全ての炭化水素架橋は首尾よく、(1)α螺旋構造を再構築して安定化した、(2)ペプチドの半減期を増進した、(3)細胞透過性もたらした、(4)標的のアポトーシスタンパク質と特異的に結合した、そして(5)白血病異種移植モデルにおいて細胞アポトーシスを再活性化したことを明らかにした(Walensky et al., 2004)。SAHBはその後、個々のBCL−2ファミリータンパク質相互作用を分析して調節するために用いられた(Danial et al., 2008; Gavathiotis et al., 2008; Walensky et al., 2006)。本明細書に記載されているように、一連の架橋BCL−2ファミリーペプチド螺旋は、生存タンパク質MCL−1を高い親和性及び前例のない選択性で標的とすることが確認された。MCL−1阻害剤SAHBは、MCL−1の標準的なBH3溝を標的として、インビトロ及in situでMCL−1/BAK相互作用を置き換え、そしてMCL−依存性の癌をミトコンドリアアポトーシスに対して感受性にする。
本発明は、少なくとも一部が、MCL−1 SAHB及びNOXA SAHBのような、炭化水素架橋及びそれによって構造強化されたBH3ポリペプチドがMCL−1ポリペプチドの活性部位と結合してMCL−1のアンチアポトーシス(生存)活性の阻害をもたらすという発見に基づいている。本研究は、このような阻害性SAHB薬剤(例えば、BCL−2ファミリーBH3ドメイン(SAHB)ポリペプチドのNOXA安定化α螺旋、BOK SAHBペプチド、MCL−1 SAHBペプチド、野生型又は改変BIM SAHB又はBAK SAHB、Mule SAHBペプチド)と分子相互作用してこのポリペプチドを阻害することに関わっているMCL−1ポリペプチドの領域を同定することを可能にする構造情報も提供し、そのような方法によって、対応する活性部位を含有している別のBCL−2ファミリーポリペプチド(又は別の種類のポリペプチド)にも適用できる、特異的阻害及び/又は結合剤を同定するこのような方法と共に、MCL−1のその他の特異的調節因子を同定する方法を提供する。
R3は、アルキル、アルケニル、アルキニル、[R4−−K−−R4]n、であって、それぞれが0〜6個のR5で置換されている。
R4は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである。
R5は、ハロ、アルキル、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、蛍光部分、又は放射性同位元素である。
Kは、O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、又は
R6は、H、アルキル、又は治療薬剤である。
nは、1〜4の整数である。
xは、2〜10の整数である。
それぞれのyは、独立して0〜100の整数である。
zは、1〜10の整数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)である。 それぞれのXaaは、独立して1つのアミノ酸である。
SAHBポリペプチドは本明細書に記載されているアミノ酸配列を包含していてよい。
ある場合には、それぞれのyが、独立して3〜15の整数である。
ある場合には、それぞれのyが、独立して1〜15の整数である。
ある場合には、R1とR2が、それぞれ独立して、H又はC1〜C6アルキルである。
ある場合には、R1とR2が、それぞれ独立して、C1〜C3アルキルである。
ある場合には、少なくともR1とR2の一方が、メチルである。例えば、R1とR2の両方がメチルである。
ある場合には、R3がアルキル(例えば、C8アルキル)であって、xが3である。
ある場合には、R3がC11アルキルであって、xが6である。
ある場合には、R3がアルケニル(例えば、C8アケニル)であって、xが3である。
ある場合には、xが6であって、R3がC11アルケニルである。
ある場合には、R3が、直鎖のアルキル、アルケニル又はアルキニルである。
ある場合には、R3が、−−CH2−−CH2−−CH2−−CH=CH−−CH2−−CH2−−CH2−−である。
例えば、Xが3のときは、C’及びC”ジ置換立体中心の両方がR配置であるか、或いはこれら両方がS配置になる。xが6のときは、C’ジ置換立体中心がR配置にあって、C”ジ置換立体中心がS配置にある。R3二重結合はE又はZ立体化学配置にある。
それぞれの[Xaa]yは、独立してBH3ドメインの少なくとも5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25個又はそれ以上の連続したアミノ酸を包含することができる。
[Xaa]xは、BH3ドメインの3個又は6個の連続したアミノ酸を含有することができるペプチドである。
[Xaa]y’及び[Xaa]y”はそれぞれ、同一又は異なったBH3ドメイン由来の連続ポリペプチド配列を包含できる。
それぞれのnは独立して、1〜15の整数である。
xは、2、3、又は6である。
それぞれのyは独立して、0〜100の整数である。
zは、1〜10の整数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)である。
それぞれのXaaは、独立して1個のアミノ酸である。
R3は、アルキル、アルケニル、アルキニル、[R4−−K−−R4]n、又は天然アミノ酸の側鎖であって、これらのそれぞれは、0〜6個のR5で置換されている。
R4は、アルキル、アルケニル、又はアルキニルである。
R5は、ハロ、アルキル、OR6、N(R6)2、SR6、SOR6、SO2R6、CO2R6、R6、蛍光部分、又は放射性同位元素である。
Kは、O、S、SO、SO2、CO、CO2、CONR6、又は
R6は、H、アルキル、又は治療薬剤である。
R7は、アルキル、アルケニル、アルキニル、[R4−−K−−R4]n、又は天然アミノ酸の側鎖であって、これらのそれぞれは、0〜6個のR5で置換されている。
nは、1〜4の整数である。
xは、2〜10の整数である。
それぞれのyは独立して、0〜100の整数である。
zは、1〜10の整数(例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10)である。
それぞれのXaaは独立して、1つのアミノ酸である。
当業者に分かるように、MCL−1に特異的に結合して、MCL−1活性の調節をもたらすとして本明細書で同定されたもののような、SAHBのMCL−1と特異的に結合する要素に似せた、小分子の開発に、コンピュータを利用する薬剤設計方法を用いることができる。
この方法の一実施態様では、活性部位の領域に対して同定された化合物の質又は適合性を、形状の相補性によって或いは推定相互作用エネルギーの何れかによって評価することができる(Meng et al., J. Comp. Chem. 13:505-524, 1992)。
一実施態様では、可能性のあるモジュレーターを最初に、本明細書に記載されているか当該技術分野で公知のインビトロアッセイ(例えば、蛍光偏光)を用いて、プロアポトーシス又はアンチアポトーシス活性について同定する。可能性のあるモジュレーターを同定して、それらの構造を確認すると、更に、本明細書に記載されているMCL−1活性部位の構造情報を用いるコンピュータ分析によって最適化を実施できる。
別の実施態様では、可能性のあるモジュレーターを最初に、MCL−1活性部位の構造座標から作成した相互作用テンプレートを用いるスクリーニングで同定して、更に、追加のコンピュータ分析による最適化に付す。
また、本明細書に記載されている方法を用いて、可能性のあるモジュレーターとMCL−1活性部位との共複合体(co-complex)のNMR構造座標を確認して、さらなる最適化を実施できる。
1. Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Mo., 63144, USA から入手できるSYBYL
2. Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Mo., 63144, USA から入手できるUNITY
3. Tripos Inc., 1699 South Hanley Rd., St. Louis, Mo., 63144, USA から入手できる FlexX
4. GRID (Goodford, P. J., "A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules", J. Med. Chem., 28, pp. 849-857 (1985))、GRID はOxford University, Oxford, UK. から入手できる。
5. MCSS (Miranker, A. and M. Karplus, "Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method." Proteins: Structure. Function and Genetics, 11, pp. 29-34 (1991))、MCSS Molecular Simulations, Burlington, Mass. から入手できる。
6. AUTODOCK (Goodsell, D. S. and A. J. Olsen, "Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing", Proteins: Structure. Function, and Genetics, 8, pp. 195-202 (1990))、AUTODOCK は Scripps Research Institute, La Jolla, Calif. から入手できる。
7. DOCK (Kuntz, I. D. et al., "A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions", J. Mol. Biol., 161, pp. 269-288 (1982))、DOCK はUniversity of California, San Francisco, Calif. から入手できる。
1. CAVEAT (Bartlett, P. A. et al, "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules". In "Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems", Special Pub., Royal Chem. Soc., 78, pp. 182-196 (1989))、CAVEATは the University of California, Berkeley, Calif. から入手できる。
2. MACCS-3D (MDL Information Systems, San Leandro, Calif.)のような3Dデータベースシステム。この領域はMartin, Y. C., "3D Database Searching in Drug Design", J. Med. Chem., 35, pp. 2145-2154 (1992))に概説されている。
3. HOOK(Molecular Simulations, Burlington, Mass.から入手できる)。
1. LUDI (Bohm, H.-J., "The Computer Program LUDI: A New Method for the De Novo Design of Enzyme Inhibitors", J. Comp. Aid. Molec. Design, 6, pp. 61-78 (1992))、LUDI はBiosym Technologies, San Diego, Calif. から入手できる。
2. LEGEND (Nishibata, Y. and A. Itai, Tetrahedron, 47, p. 8985 (1991))、LEGEND は Molecular Simulations, Burlington, Mass. から入手できる。
3. LeapFrog (Tripos Associates, St. Louis, Mo.から入手できる)。
コンピュータモデリング、ライブラリースクリーニング、及び/又は断片による創薬に基づいてMCL−1ポリペプチドの活性部位に結合することが見出された化合物の能力の確認は、直接結合試験をすることによってMCL−1ポリペプチド相互作用について更に評価できる。試験化合物のMCL−1ポリペプチドと結合する能力の確認は、例えば、複合体中の標識化されたMCL−1ポリペプチドを検出してMCL−1ポリペプチドの可能性のあるモジュレーターとの結合を確認できるように、MCL−1ポリペプチド又は化合物を放射性同位元素又は酵素標識とカップリングさせて、実施できる。例えば、化合物を124I、35S、14C、又は3Hで直接的又は間接的に標識化して、放射性放出を直接カウントして又はシンチレーションカウンティングによって放射性同位元素を検出する。それとは別に、化合物を、例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、又はルシフェラーゼで、酵素標識化して、適切な基質の生成物への変換を確認することによって酵素標識を検出することができる。更なる例としては、化合物をフルオロセインで標識化して、リガンドとMCL−1ポリペプチドの間の結合相互作用を、蛍光偏光アッセイを用いて定量できる。結合は、本明細書に記載されているように、HSQC NMRによっても測定できる。
一態様では、1つ又は両方のタンパク質をマトリックスに結合させるドメインを加えた融合タンパク質を提供することができる。例えば、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ/MCL−1融合タンパク質又はグルタチオン−S−トランスフェラーゼ/標的融合タンパク質を、グルタチオンセファロースビーズ(Sigma Chemical, St. Louis, Mo.)又はグルタチオン誘導体化マイクロタイタープレート上に吸着でき、次いでこれを試験化合物と、又は試験化合物と非吸着標的タンパク質或いはMCL−1タンパク質の何れかと混合して、混合物を複合体形成を誘導する条件下(例えば、塩及びpHに対する生理学的条件)で培養する。培養後に、ビーズ又はマイクロタイターのウェルを洗浄して非結合成分を除去して、ビーズの場合はマトリックスを固定化して、複合体を、例えば上記のようにして、直接的に或いは間接的に測定する。あるいは、複合体をマトリックスから解離して、MCL−1の結合又は活性のレベルを標準的な技術を用いて測定することができる。
MCL−1特異的SAHB/MCL−1複合体の特異性を、MCL−1の小分子モジュレータを同定する競合的蛍光偏光結合アッセイスクリーニングを実施する目的で、活用することができる。このようなアッセイは、MCL−1又はMCL−1関連ポリペプチドの標的化小分子モジュレーターを同定するために本明細書に記載されているようなSAHB/MCL−1複合体の特異性を利用する方法であるという利点を有している。
本発明の化合物がインビボにおける腫瘍形成を阻害することも明らかにすることができる。本発明の化合物、医薬組成物、及びレジメンをヒトに用いる前に、適切な動物モデル系で試験することができる。このような動物モデル系は、これに限定されないが、遺伝子組み換え動物及びその他の動物疾患モデルを含む、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ブタ、イヌ、ウサギ、霊長類等を包含する。当該技術分野で公知の何れかの動物系を用いることができる。手順の幾つかの態様を変えることができ;当該態様は、これに限定されないが、治療薬剤(例えば、予防及び/又は治療薬)投与の一時的投与計画、このような治療薬剤を別々に投与するか又は混合物としてして投与するか、及び治療薬剤の投与頻度を包含する。
更に、多種の癌に適用可能な一般的な動物モデルが記載されていて、これに限定されないが、p53欠損マウスモデル(Donehower, 1996, Semin. Cancer Biol. 7:269-278)、Minマウス(Shoemaker et al., 1997, Biochem. Biophys. Acta, 1332:F25-F48)及びラット15における腫瘍に対する免疫応答(Frey, 1997, Methods, 12:173-188)を包含する。
本発明の化合物は、治療有効量を投与したとき、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも100%まで腫瘍進展時間を増大するか或いは生存時間を増大する場合に、過剰増殖性疾患の治療に有効であると考えられる。
同様に、本発明の化合物は、治療有効量を投与したとき、少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、又は少なくとも100%まで腫瘍生育速度を減少し、腫瘍量を減少し、転移数を減らす場合に、過剰増殖性疾患の治療に有効であると考えられる。このような結果は、当業者、例えば、癌専門医によって確認できる。
構造的に拘束されているペプチドは、天然のペプチドと比較すると、インビトロにおいて顕著な熱安定性及びタンパク質分解安定性を有している。
MCL−1モジュレーターは、アポトーシス誘導、自食作用誘導、細胞周期停止、炎症応答の阻害、関連病原体、例えば結核菌、の生存機構の無効化等に対するこのようなモジュレーターの影響をアッセイする目的で、以下の実施例5に記載されているようにして、細胞系で評価してもよい。化合物を、以下により詳細に記載されている動物モデルような、関連疾患の動物モデル(例えば、癌異種移植、炎症モデル、感染疾患モデル)で試験することができる。
細胞を、無血清培地中でFITC又はビオチン共役MCL−1選択的SAHB(5〜20μM)で処理した後、2〜4時間で血清を交換して、多時点(例えば、4、8、24時間)培養した後、細胞を採取して溶解緩衝液で抽出する。SAHB結合タンパク質/タンパク質複合体を、記載(Walensky et al. Mol Cell, 2006; Pitter et al, Methods in Enzymology, 2008)のように実施する、抗FITC破壊によって、又はストレプトアビジンアガロース捕獲(実施例5を参照されたい)によって単離する。溶解物をSDS/PAGE、Silver Stain Plus(Biorad)及びタンデム質量分析法で評価する。SAHBに曝された溶解物に現れるが、賦形剤又はSAHB点突然変異体で処理されたものには現れない、バンドをレーザーで切り取って細分化する。細分化しだバンドを水で1度、25mMの重炭酸アンモニウムで2度室温で10分間洗浄する。バンドを25mMの重炭酸アンモニウム中の1%水酸化物と5分間培養して銀染色を除去する。ゲル切片が透明になったら、ゲルを水、1%ギ酸、水:アセトニトリル(50:50)と1%ギ酸、続いてアセトニトリル中で、それぞれ5分間洗浄する。次いで、ゲル切片をタンパク質分解消化、抽出及びタンデム質量分析(MSMS)に付す。Mascot Search エンジンソフトウェアを用いて同定された断片を公知のタンパク質配列にマッチさせる。
MCL−1選択的SHAB(又は同定された小分子、上記を参照されたい)による標的化MCL−1タンパク質相互作用の影響を評価するために、MCL−1を過剰に発現する癌細胞(10×106個)をMCl−1標的化SAHB、賦形剤、又は突然変異SAHBと共に、無血清培地中37℃で24時間培養した後、血清に置き換えて6時間培養する。細胞溶解(例えば、50mMのトリス(pH7.4)、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1%のCHAPS及び完全プロテアーゼ阻害ペレット)した後、細胞残屑を4℃で10分間14,000gでペレットにする。上澄液を前もって平衡化してあるタンパク質A/Gセファロースビーズと共に培養する。次いで、事前に除去した上澄液を4℃で1.5時間回転させて抗MCL−1抗体で処理した後、タンパク質A/Gセファロースビーズに1時間曝す。ビーズをペレットにして溶解緩衝液で4℃、10分間洗浄する。洗浄したビーズをペレットにして、SDS充填緩衝液中で90℃、10分間加熱して、SDS/PAGEで分析する。新規な相互作用物質を検索する(非処理及びSAHB処理免疫沈降物由来の電気泳動したタンパク質を比較する)ために、免疫沈降物をSilver Stain Plus(Biorad)で評価して、SAHBに曝露した免疫沈降物中には現れたり現れなかったりだが、賦形剤又はSAHBの点突然変異体で処理したものには現れないバンドを切り取って、次いで、タンデム質量分析及びMASCOT断片同定ソフトウェアで分析する。
本発明の薬剤は、細胞死のシグナルが下方制御されていて、病的細胞が不適切に減少した細胞死の傾向を有している(本明細書では「減少したアポトーシス状態」であると称する)細胞を処置するのに有用である。本発明は更に、ウィルス感染又は自己抗体発現細胞のような、ある特定のタイプの細胞にアポトーシスを導入することが望ましい、アポトーシス関連疾患を治療するために、治療有効量の薬剤を対象に投与する方法を提供する。一般に、薬剤は投与前に実質的に精製されている。対象は、これに限定されないが、ウシ、ブタ、ウマ、ニワトリ、ネコ、イヌ等を含む動物であってよく、一般に哺乳動物、そして特定の実施態様では、ヒトである。別の特定の実施態様では、非−ヒト哺乳動物が対象である。
一実施態様では、本発明の化合物は、癌の予防、治療、及び/又は管理のために単剤療法として投与される。
例えば、本発明の化合物を、それを必要としている対象に、追加の抗癌治療法の投与の前(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間又は12週間前)に、それと同時に、又はそれに続いて(例えば、5分、15分、30分、45分、1時間、2時間、4時間、6時間、12時間、24時間、48時間、72時間、96時間、1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、8週間又は12週間後)に投与することができる。
多様な実施態様では、抗癌治療法を、1分離して、10分離して、30分離して、1時間未満離して、1時間離して、1時間〜2時間離して、2時間〜3時間離して、3時間〜4時間離して、4時間〜5時間離して、5時間〜6時間離して、6時間〜7時間離して、7時間〜8時間離して、8時間〜9時間離して、9時間〜10時間離して、10時間〜11時間離して、11時間〜12時間離して、24時間まで離して、又は48時間まで離して投与する。一実施態様では、抗癌治療法を同じ外来診察時に投与する。別の実施態様では、本発明の併用抗癌象(照)治療法を1分〜24時間離して投与する。
本発明は、家畜及び/又はヒトへの投与に適している組成物(例えば、医薬組成物)を提供する。本発明の医薬組成物は、組成物を対象に投与することを可能にする何れの形態であってもよく、当該対象は、これに限定されないが、ヒト、哺乳動物、又はウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモットなどの、非ヒト動物を包含する動物であることが好ましく、哺乳動物であることがより好ましく、ヒトが最も好ましい。
ペプチド合成
BCL−2ファミリータンパク質のBH3ドメインに対応する炭化水素架橋ペプチド及びそれらのFITC誘導体を、既述(例えば、Bird et al., Methods Enzymol 446, 369 (2008)及びPCT公開第WO2009/108261号公報を参照されたい。これは参照により本明細書に取り込まれている)のように、合成し、精製して、円偏光二色性によって特徴付けた。全てのペプチドを液体クロマトグラフィー−質量分析によって>95%純度に精製してアミノ酸分析で定量した。
組み換え、非標識MCL−1ΔNΔC、BCL−2ΔC、BCL−XLΔC、BCL−wΔC、及びBFL1/A1ΔCを、既述(Pitter et al., Methods Enzymol 446, 387 (2008)、参照により取り込まれている)のように、発現させて精製した。すなわち、形質転換した大腸菌BL21(DE3)をアンピシリンを含有しているL培地(Luria Broth)中で培養して、0.5mMのイソプロピルβ−D−1−チオガラクトピラノシド(IPTG)でタンパク質の発現を誘発した。細菌性のペレットを緩衝液(250mMのNaCl、20mMのTris、完全プロテアーゼ阻害性の錠剤、pH7.2)に再懸濁して、45,000xgで45分間遠心分離した後、上澄液をグルタチオン−アガロース(Sigma)カラムに付して、PBSで洗浄した。GST標的タンパク質のビーズ上消化を、PBS(3mL)中のトロンビン(75単位)の存在下室温での1晩培養により達成して、切断されたタンパク質を、150mMのNaCl、50mMのTris、pH7.4緩衝液条件を用いる、高速タンパク質液体クロマトグラフィー(FPLC)で精製した。
結合アッセイを既述(Pitter et al., Methods Enzymol 446, 387 (2008))のように実施した。すなわち、FITC−SAHB(50nM)を、結合緩衝液(50mMのTris、100mMのNaCl、pH8.0)中のFPLC−精製組み換えタンパク質の連続希釈液に加えた。競合アッセイのために、アセチル化MCL−1 SAHBの連続希釈液をFITC−BAK SAHB(25nM)と混合した後、結合緩衝液(50mMのTris、100mMのNaClのNaCl、pH8.0)に希釈したMCL−1ΔNΔC(100nM)を加えた。マルチウェルプレートを室温暗所で平衡に達するまで培養して、マイクロプレートリーダー(SpectraMax, Molecular Devices)によって蛍光偏光(mP単位)を測定した。直接結合実験のために、解離定数(KD)を、Prismソフトウェア(Graphpad)を用い用量反応曲線の非線形回帰解析によって算出した。競合実験のために、ワンサイト競合モデルを用い用量反応曲線の非線形回帰解析によってKi値を測定した。
%cytoc=[(cytocsup−cytocbackgr)/(cytoctotal−cytocbackgr)]×100
ここで、バックグランド放出(cytocbackgr)は賦形剤処理(1%DMSO)サンプルの上澄液で検出されたチトクロームcを示し、総放出(cytoctotal)は1%トリトンX100で処理したサンプル中で測定されたチトクロームcを示す。
OPM2細胞(1×107)を、賦形剤又は表示される濃度のMCL−1 SAHBとOpti−MEM培地(Invitrogen)中、37℃で4時間培養した。細胞を冷却したPBSで1度洗浄して、冷却したNP−40溶解緩衝液(50mMのTris、pH7.4、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1mMのDTT、0.5%のNP40、完全プロテアーゼ阻害性ペレット)500μLを用いて氷上で溶解した。細胞残屑を4℃で10分間14,000gでペレット化して、上澄液を採取し、前もって平衡化したタンパク質A/Gセファロースビーズに暴露した。前もって澄明化した上澄液を抗MCL−1抗体(S−19、Santa Cruz Biotechnology)と4℃で1晩培養した後、タンパク質A/Gセファロースビーズを1時間かけて添加した。次いでビーズをペレットにし、NP−40溶解緩衝液で3回4℃で10分間洗浄して、SDS負荷緩衝液中で90℃に10分間加熱することによりビーズからタンパク質サンプルを溶出した。免疫沈降物を電気泳動及びNT抗BAK抗体(CalBio Chem)を用いるうウェスタン分析に付した。
OPM2多発性骨髄腫細胞及びジャーカット白血病T−細胞を継代培養して、10%ウシ胎仔血清、100U/mLのペニシリン、100μg/mLのストレプトマイシン、2mMのL−グルタミン、50mMのHEPES及び50μMのβ−メルカプトエタノールを補完したRPMI 1640培地(Invitrogen)中に保持した。生存能試験のために、OPM2とジャーカット細胞(4×104個)を表示される薬剤でOpti−MEM培地中、37℃で、最終容量100μLに処理した。24時間目にMTTアッセイで細胞生存率を測定した、これは、細胞を20μLのチアゾリルブルーテトラゾリウムブロミド(DPBS中5mg/mL)と37℃で4時間培養し、沈殿物を0.1NのHClイソプロパノール(100μL)で可溶化して570nm及び650nmで吸収を測定した。TRAIL又はFasLとの相乗効果検討のために、プロアポトーシス剤で処理する30分前に細胞に投与された、パンカスパーゼ阻害剤、z−VAD(50μM)の存在下又は非存在下に、細胞をMCL−1 SAHBと死受容体リガンドで同時に処理した。
OPM2及びジャーカット細胞(2×104細胞)を表示される薬剤でOpti−MEM培地中、37℃で、最終容量50μLに処理した。4時間目にApoONEカスパーゼ3/7キットを用い、製造会社(Promega)の使用説明書に従ってカスパーゼ3/7活性化を測定した。TRAIL及びFASLとの相乗効果検討のために、細胞をMCL−1 SAHB及び死受容体リガンドで同時に処理した。
マルチドメインアンチアポトーシス、アンチドメインプロアポトーシス、及びBH3−オンリー(図7)を包含する、BCL−2ファミリーサブグループ全てに渡るBCL−2相同BH3ドメインの第一アミノ酸配列に基づいて、BCL−2ドメインの安定化α螺旋(Stabilized Alpha-Helices of BCL-2 domains;SAHBs)のライブラリーを作り出した。既述(Walensky et al Science 2004, Bird et al Methods in Enzymology 2008)のようにして、オレフィン側鎖を含有している非天然アミノ酸を合成し、次いで標的ペプチド配列のi(i+4)位置に挿入した。固相Fmoc化学を用い、次いでGrubbs第1世代触媒を用いるルテニウム触媒化オレフィン複分解によってSAHBを合成した。ペプチドをアミノ末端でフルオレセインで誘導体化(結合及び画像検討のために)又はアミノ末端をアセチル化し、脱保護し、開裂してLC/MSで精製した。LC/MS及びアミノ酸分析をペプチド組成物及び純度の確認のために使用した。
α螺旋性
炭化水素架橋したペプチドの二次構造改良を評価するために、先に報告されているように(Walensky et al Science, 2004; Bird et al. Methods in Enzymology, 2008)、円偏光二色性(CD)スペクトルを記録してAviv Biomedicalスペクトロメータ(モデル410)上で分析した。一般に、短いペプチドは、配座拘束された構造を維持するためのエントロピー消費がペプチド骨格の水素結合から得られるエントロピーによって克服されないので、溶液中で有意なα螺旋構造を示さない。実際に、改変されていないBH3ペプチドは20%以下のα螺旋傾向を示すことが見出された(MCL−1 BH3について18%、図12)のに対して、化学架橋の導入は一般に、MCL−1 SAHBが55〜100%の範囲の螺旋含有パーセントを示して、MCL−1標的化SAHBのα螺旋性を少なくとも3〜5倍まで増強した。MCL−1標的化SAHBのα螺旋性を、CDによって、それらの非改変同等物と比較した。平均時間0.5秒で0.5nmずつ増加する190〜260nmからの総数5スキャンを一括平均化して、1mmパス長のセルを用いて各スペクトルを得た。CD検討のための標的ペプチド濃度は50mMリン酸カリウム(pH7.5)又はMilli-Q脱イオン水中で25〜50μMであって、正確な濃度は2つのCDサンプル希釈液の定量アミノ酸分析で確認した。CDスペクトルを最初に波長対ミリ度としてプロットした。正確なペプチド濃度を確認したら、平均残基楕円率[θ](度・cm2・dmol−1・残渣−1の単位で)を次の式から誘導した:θ=ミリ度/分子濃度/アミノ酸残基の数。平均残基楕円率へ変換した後、次の式を用いてα螺旋パーセントを算出した:螺旋%=100×[θ]222/max[θ]222、ここでは、max[θ]222=−40,000×[1−(2.5/アミノ酸残基の数)]である。曲線適合CDDNソフトウェアも、α螺旋、平行及び逆平行βシート、β回転及びランダムコイルを包含する二次構造の相対比を算出するために用いた。
以下のパラメータを用いるLC/MS(Agilent 1200)でインビトロでのプロテアーゼ分解を測定した:注入量:20μL、流速:0.6mL、実行時間:15分(10分にわたる水(0.1%ギ酸)から20〜80%アセトニトリル(0.075%ギ酸)までの勾配で構成される)、最初から勾配条件開始までの洗浄:4分、処理後時間:0.5分。DADシグナルをバンド幅8nmで280nmにセットして、MSDを一方のチャンネルを(M+2H)/2、±1質量単位に、他方を(M+3H)/3、±1質量単位にして、スキャンモードにセットした。各MSDシグナルの積分が>108カウントの濃度曲線下面積を生じた。反応サンプルはDMSO(1mMストック)及び2mMのCaCl2を含有する50mMのリン酸緩衝液(pH7.4)からなる195μLの緩衝液中の5μLのペプチドからなっていた。0時間時点のサンプルを注入して、50ng/μLのキモトリプシン(Sigma)を2μL添加し、時間をかけて連続注入することにより無傷のペプチドの量を定量した。濃度100μMのアセチル化トリプトファンカルボキシアミドの内部対照を各MSDデータポイントを正規化するために用いた。時間に対するMSD領域のプロットが指数関数的減衰曲線を生じ、Prismソフトウェア(GraphPad)を用いる非線形回帰分析によって半減期を確定した。
フローサイトメリーによる検討を、MCL−1標的化SAHBの細胞透過性を確認するために最初のハイスループットスクリーニングとして用いた。DMSOで再構築したFITC−SAHBを無血清培地で希釈した。ジャーカット細胞(50,000個)を無血清培地中で濃度1〜10μMのSAHBと1〜4時間37℃で2通りに培養した。表示される時間後に、細胞をペレット化し、PBSで洗浄しトリプシンで5分間処理して表面のタンパク質を分解し(これによって表面に結合しているあらゆるFITC−SAHBを除去する)、そして最後に10%FBS培地でクエンチした。細胞をPBSで洗浄して、FACS緩衝液に再懸濁した。細胞の蛍光を、FACSCaliburフローサイトメータ(Becton Dickinson)を用いて測定して、FlowJoソフトウェア(Tree Star)で分析した。10,000事象について3通りに蛍光強度を測定して、FITC−MCL−1標的化SAHBで処理した細胞の強力な蛍光が明らかにされたが、対応するFITC非改変ペプチドには曝露したものには明らかにされなかった。
MCL−1 SAHB/MCL−1結合界面の構造を確認するために、MCL−1ΔNΔC(6.3mg/mL)を1:1の比のMCL−1 SAHBと培養して、結晶化状態をImnovadyne Technolpgy1によるScreenmarkerを用いて組み立てた96ウェルのシッティングドロッププレート(Crystal Quick, Hampton Research)を用いてスクリーニングした。最初のスクリーニング条件は、HT Index Screen(Hamton Research)、JSCG+SUite(Qiagen)及びPro-Complex Suite(Quiagen)を用いた。最もよくヒットするあたりのスクリーニングを実施して結晶成長のための最適な条件を特定した。形成した結晶を取り出し、結晶化緩衝液中で洗浄して、SDS/PAGE及び質量分析で分析して結晶内にタンパク質及びペプチドの存在を検証した。共複合結晶を抗凍結剤中に浸し、急速冷凍して、液体窒素中で保管した。最初の回折パターンをMIT Department of Biology X-ray sourceで、続いてArgonne National Laboratory synchrotron facilityで測定した。分子置換、それに続くデータ分析及び精製(Phaser、Phenix、及びCootsソフトウェア)によって相を得た。MCL−1 SAHB/MCL−1ΔNΔC構造を、他のBH3ドメイン(例えば、NOXA、BIM)を有するMCL−1の構造と比較及び対照して、選択的なMCL−1 SAHB相互作用の固有の特徴を探し出した。MCL−1特異性に影響する固有のMCL−1 SAHB接触はSAHB選択性を最適化するために利用できそして小分子MCL−1モジュレーター(上記参照)を設計するための基礎を形成する。結合界面の特異性を確認するために、SAHB及び/又はMCL−1タンパク質において点突然変異を生成し、蛍光偏光で測定したように、結合相互作用に対する個々の残基変化の影響を評価した。不活性化SAHB点突然変異は、インビトロの細胞に基づいた検討及びインビボ検討に対する陰性対照として特に有用である(下記を参照されたい)。
選択的MCL−1標的化SAHBのミトコンドリアのアポトーシスを感受性にする能力を検証するために3つのインビトロアッセイを用いた。第1に、競合的FPアッセイにおいて、MCL−1ΔNΔCからFITC−BAK SAHBを解離するそれらの能力についてSAHBを試験した。そこでは、アセチル化した試験SAHBの連続希釈液を、FITC−BAK SAHB(例えば、25nM)の50mMTris(pH7.4)、100nMNaCLの溶液に加えて、次いでそこにMCL−1ΔNΔC(例えば、250nM)を加えた。平衡時点にマイクロプレートリーダー(例えば、Spectrramax)でFP(mP単位)を測定して、Prismソフトウェア(Graphpad)を用いて用量反応性曲線の非線形回帰解析によってKi値を算出した。効果的な用量依存的MCL−1ΔNΔCに対する競合がMCL−1 SAHBのパネルに示さた(図16)。BAK SAHBを首尾よく置き換えた化合物を、天然のMCL−1/BAK複合体を分断する能力についてMCL−1免疫沈降によってモニタリングするミトコンドリアアッセイに進めた。野生型マウス肝臓ミトコンドリア(MLM)を記述(Pitter et al. Methods in Enzymology, 2008)のように単離して、賦形剤、MCL−1 SAHB、又はMCL−1 SAHB突然変異体で処理した後、タンパク質抽出、MCL−1免疫沈降、及びBAKウェスタン分析に用いた。共免疫沈降したBAKの不在によって明らかにされたような、天然のMCL−1/BAK相互作用を分断する化合物をミトコンドリのアチトクロームc放出アッセイに進めた。これは既刊行の方法(Pitter et al. Methods in Enzymology, 2008)に従って実施した。試験SAHBの連続希釈液を、野生型のMLMに単独で、或いはBID BH3のような、BAK活性剤の存在下に曝露した。賦形剤又は1%トリトン X−100単独に曝露されたミトコンドリアは、それぞれ、陰性及び陽性の対照としての機能を果たした。実験する混合物を室温で40分間培養し、次いでプレートを4℃で10分間300rpmで遠心分離してミトコンドリアをペッレト化した。上澄液中に放出されたチトクロームcの相対量を、製造会社プロトコール(Roche(登録商標))によるELISAアッセイにて定量した。全ての実験条件は、(1)野生型ミトコンドリアからの観察されたチトクロームc放出がBAKの活性化に由来していることを保証するためのBak−1−ミトコンドリアについて、及び(2)分子の感受性活性がMCL−1標的に由来することを確認するためのMCL−1−/−ミトコンドリアについても試験した。野生型MLMを用量反応性にBID BH3誘発ミトコンドリアアポトーシスに対して感受性にするが、Bak−/−KLMを感受性にしない、MCL−1 SAHBの能力が、図16Bのヒストグラムに示されているように、明らかにされた。
MCL−1標的化SAHB活性とそのin situでMCL−1を特異的に組み込む能力とを関連付けるために、U937AML細胞をFITC共役SAHBで処理した後、細胞溶解して、(1)報告されたように(Walensky et al. Mol Cell, 2006; Pitter et al. Methods in Enzymology, 2008)実施する、抗FITCプルダウン、又は(2)ストレプトアビジンによるビオチン−SAHBプルダウンによって、SAHBを検索した。後者の手法では、癌細胞を無血清培地中でSAHB(5〜20μM)で処理した後、2〜4時間目に血清交換して、種々の時間(例えば、4、8、24時間)の培養後に細胞を採取して溶解緩衝液で処理した。次いで溶解物をストレプトアビジンアガロースに曝露して4℃で1時間培養した。ビーズを溶解緩衝液で洗浄し、SDS充填緩衝液中、90℃に10分間加熱して、さまざまなアンチアポトーシスタンパク質についてウェスタン分析によって分析した。溶解物を、SDS/PAGE、Silver Stain Plus(Biorad)、及びタンデム質量分析によっても評価した。SAHBに曝露した溶解物中に現れたが、賦形剤又はSAHB点突然変異体で処理されたものに現れないバンドを、レーザーで切り取って、細分化した。細分化したバンドを水で1回、25mMの重炭酸アンモニウムで2回室温で10分間洗浄した。バンドを25mMの重炭酸アンモニウムと5分間培養して銀色染色剤を除去した。ゲル切片を透明にしたら、ゲルを水、1%ギ酸、1%ギ酸水溶液:1%ギ酸アセトニトリル溶液(50:50)、次いでアセトニトリル中でそれぞれ5分間洗浄した。次いでこのゲル切片をプロテアーゼ消化、抽出、及びタンデム質量分析(MSMS)に付した。
上記実験の後、BCL−1の強力で選択的な阻害剤を同定するために、BCL−2ファミリータンパク質のBH3ドメインをモデルとするBCL2ドメイン安定化α螺旋(SAHB)のライブラリーの更なるメンバーを作出した。BH3ドメインの天然α螺旋構造を、非相互作用面の(i、i+4)位置に非天然アミノ酸含有オレフィン鎖を組み込んで補強した後、ルテニウム触媒化オレフィンメタセシスによって架橋BH3ドメインのパネルを作成した(図7)。蛍光偏光アッセイ(FPA)を実施して、BH3結合ポケットを含有して、増強した発現、純度、及び安定性をもたらす、欠失構築物である、組み換えヒトMCL−1ΔNΔC(アミノ酸172〜320)に対する、蛍光標識されたSAHBの結合親和性を測定した。(1)BH3オンリータンパク質、NOXA、PUMA、BID、及びBIM、(2)マルチドメインプロアポトーシスBOK、BAX及びBAK、及び(3)アンチアポトーシスMCL−1それ自体のBH3ドメインに対応するSAHBは、MCL−1に対して高い親和結合(Kd<50nM)を示した(図14B)。MCL−1選択的SAHBを同定するために、最初に、PUMA、BID、BIM、BOK、BAX、及びBAK SAHBを除去した、組み換えBCL−XLΔC結合について、次いでNOXA SAHBを除去した組み換えBFL1/A1ΔCについてスクリーニングした。実際に、MCL−1ΔNΔC、BCL−2ΔC、BCL−XLΔC、BCL−wΔC及びBFL−1/A1ΔCを包含する、アンチアポトーシスタンパク質の拡張パネルを用いるMCL−1 SAHBの結合分析は、MCL−1SAHBがMCL−1単独に対して強力で選択的な結合親和性(KD、43nM)を示すことを裏付けた(図9A)。
MCL−1 BH3螺旋とMCL−1ΔNΔCの間の相互作用に対する結合及び親和性決定因子を明確にするために、アラニンスキャニング、部位特異的突然変異誘発、及び架橋スキャニングを実施した。MCL−1 SAHB内のアミノ酸残基を順にアラニンで置換して、対応する蛍光標識したSAHBをFPAによってMCL−1ΔNΔC結合について試験した。アラニンスキャンをアラニンのグルタミン酸突然変異誘発及びグリシン残基で補完した。N末端及びC末端の突然変異誘発はMCL−1ΔNΔC結合親和性に対して皆無かほとんど影響を有さなかったのに対して、Leu213、Arg214、Val216、Gly217、Asp218及びVal220のアラニン突然変異生成はMCL−1ΔNΔCに対するMCL−1 SAHBの結合親和性を10〜100倍まで減少して、MCL−1ΔNΔC組み込みに対する主要なMCL−1 BH3残基を明らかにした(図10)。BH3ドメイン配列の比較分析は、コア疎水性残基、Leu213、Val216、Val220の組み合わせがMCL−1 BH3に特有であって(図10)、これら疎水性残基ののうちの何れかのアラニン突然変異誘発がMCL−1ΔNΔ結合に著しく弊害をもたらすことを示した。興味深いことに、BCL−2、BCL−XL及びBCL-Wに対して拘束された結合プロファイルを示すBAD BH3、及びアンチアポトーシスタンパク質と広く結合するBIM BH3がMCL−1 BH3におけるVAL220に対応する位置にフェニルアラニンを有している(図14A)。BIM BH3配列の突然変異スキャニングは既に、このフェニルアラニンのアラニン、グルタミン酸、又はリジンによる置換がBCL−XL結合を無効にするが、MCL−1結合に対する影響を最小にすることが実証されている。MCL−1 SAHBにおける単一のV220F点突然変異が、MCL−1ΔNΔC(KD、191nM)及びBCL−XLΔC(KD、89nM)の両方に結合活性を示して、MCL−1ΔNΔCに対する選択性を無効にすることを見出した(図14B)。保存アミノ酸Leu213、Arg214、Gly217、及びAsp218のような選択結合決定因子は多くのBH3ドメイン間で共有されているのに対して、MCL−1 BH3におけるVal220のような、アポトーシスに関するその他の不連続な残基が選択性を決定できる。
MCL−1 SAHBDは、螺旋α2(BH3)及びα3、α4、α5(BH1)及びα8(BH2)の部分からなっている標準的なBH3結合溝でMCL−1ΔNΔCを組み込むα螺旋であることを、三次元構造の分析が明らかにした。MCL−1 SAHBDの疎水性残基Leu213、Val216、Gly217、及びVal220は、これらのアミノ酸のアラニン突然変異生成の負の派生効果と一致して、MCL−1ΔNΔCの表面にある疎水性の溝と直接接触する(図15A)。疎水性の相互作用は、MCL−1 SAHBDのArg214及びAsp218のMCL−1ΔNΔCのAsp256及びArg263、それぞれとの相補的な静電対合によって補強される。MCL−1 SAHBDのこれらの荷電残基は、Arg214に対するMCL−1ΔNΔC Asp256、Val253、Arg263及びHis252、並びにAsp218に対するMCL−1ΔNΔC Arg263及びAsn260からなる水素結合ネットワーク中に存在する。
次に、インビトロ及び細胞において、MCL−1 SAHBDが有効にMCL−1を標的にしてミトコンドリアアポトーシスを感受性にするか否かを確認するために、上記MCL−1 SAHBEを試験するための方法などの方法を用いて、一連の機能検討を行った。最初に、in situ機能に必要な置換活性をシミュレートして、MCL−1ΔNΔCからBAK BH3螺旋を解離するMCL−1 SAHBDの能力を測定するために競合FPAを実施した。直接結合データ(図13)と一致して、MCL−1 SAHBDは、FITC−BAK SAHBとMCL−1ΔNΔCの間の相互作用を遮断するのに最も有効であった(図16A)。FITC−BAK SAHB/MCL−1ΔNΔC複合体を分離するMCL−1 SAHBDの能力が、BAK−誘発チトクロームc放出のSAHB介在感受性に変換されるか否かを確認するために、記載のようにして、ミトコンドリアアッセイを実施した。
重要なことは、MCL−1からプロアポトーシスタンパク質の選択的遊離は、別のアンチアポトーシスが存在してこれらと結合して中和するならば、細胞アポトーシスを活性化できないということである。機能的観点から、選択的MCL−1阻害剤は、それに代わってsiRNAによるMCL−1ノックダウンのプロアポトーシス活性を表現型複写することが期待できる。例えば、MCL−1活性の調節とは対照的に(これはSAHBによっても達成できるがsiRNAによっては達成できない)、MCL−1を削除するときに望ましい。従って、細胞におけるMCL−1の選択的な薬理学的遮断の機能的結果を検討するために、siRNA介在MCL−1ノックダウンによって立証されたように、MCl−1によって特異的に中和される、死の受容体アゴニストに対して癌細胞を感受性にするMCL−1 SAHBDの能力を試験した。ジャーカットT細胞白血病及びOPM2細胞を最初にMCL−1 SAHBDの連続希釈液並びに単剤として外因経路活性剤であるTRAIL及びFasリガンド(FasL)に曝露して、24時間目のMTTアッセイによって基準生存率の測定を行った(図18A、18B)。MCL−1 SAHBDは、40μM用量においてさえ細胞生存率に影響を及ぼさなかった。ジャーカット細胞はTRAIL及びFasLの両方に応答して用量反応性の細胞毒性を示したのに対して、OPM2細胞はTRAILに感受性を示したが、FasLには示さなかった(図19A)。直接的で選択的なMCL−1遮断が細胞をTRAIL及びFasL誘発アポトーシスに対して感受性にするか否かを確認するために、MCL−1 SAHBDの連続希釈液を低用量の死受容体リガンドと組み合わせた。MCL−1 SAHBDは用量反応的にジャーカット細胞をTRAIL及びFasLの両方に対して感受性にして、OPM2細胞を選択的にTRAILに対して感受性にした(図19)。FasL処理に対するOPM2細胞の観察された耐性に一致して、MCL−1 SAHBDはFasLに曝露されたOPM2細胞に影響を及ぼさなかった(図19A)。
切断型MCL−1SAHBG(LRXVGDXV、配列番号31)を作成して、上記のように、蛍光偏光アッセイを用いてMCL−1ΔNΔCへの結合について試験した。9個のアミノ酸を架橋して安定化したペプチドがMCL−1 SAHBと結合することが判った(図22)。このことは、コアコンセンサス配列がMCL−1への結合を促進するのに十分であるということを明らかにしている。
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前の記載から、多様な使用及び条件に適用するために本明細書に記載されている発明に変更及び修正を行うことができるということは明らかである。このような実施態様も以下の特許請求の範囲の範囲内である。
Claims (82)
- ヒトBCL−2ファミリーの別の何れかのメンバーよりMCL−1に対して少なくとも2倍、5倍、10倍、15倍、又は20倍高い親和性でMCL−1に特異的に結合するペプチドであって、ここでペプチドは、BCL−2ファミリーBH3ドメインのMCL−1安定化α螺旋(SAHB)ペプチド、NOXA SAHBポリペプチド、BOK SAHBペプチド、改変BIM SAHBペプチド、BAK SAHBペプチド、及びMULE SAHBペプチドよりなる群から選ばれるポリペプチド配列から誘導される、相対位置、i及びi+3、i及びi+4、又はi及びi+7の間に位置している架橋を含有してなる、非天然のアミノ酸を有する安定化α螺旋を含有してなる、ペプチド。
- ペプチドが、LRXVGDXV(ここで、Xは何れかのアミノ酸である)の配列と少なくとも80%同一の配列を含有してなる、請求項1に記載のペプチド。
- ペプチドが、配列RKALETLRRVGDGVQRNHETAFの少なくとも8連続アミノ酸と少なくとも70%同一の配列を含有してなる、請求項2に記載のペプチド
- ペプチドが、配列RKALETLRRVGDGVQRNHETAFの少なくとも15連続アミノ酸と少なくとも70%同一の配列を含有してなり、そしてここでコア配列に含まれないアミノ酸が配列RALETLRRVGDGVQRNHETAFからの同類アミノ酸置換を含有している、請求項2に記載のペプチド。
- ペプチドが、アミノ酸配列RKALETLRRVGDGVQRNHETAFの一部分と少なくとも80%同一の配列を含有してなる、請求項3又は4に記載のペプチド。
- ペプチドが、アミノ酸配列RKALETLRRVGDGVQRNHETAFの一部分と少なくとも90%同一の配列を含有してなる、請求項3又は4に記載のペプチド。
- ペプチドが、RKALETLRRVGDGVXRNHXTAF、RKXLETXRRVGDGVQRNHETAF、RKALETLRXVGDXVQRNHETAF、
RKALXTLRXVGDGVQRNHETAF、RKALETLRRVGDGVQRXHETXF、KALETLRRVGDGVXRNHXTAF、KXLETXRRVGDGVQRNHETAF、KALETLRXVGDXVQRNHETAF、KALXTLRXVGDGVQRNHETAF、及びKALETLRRVGDGVQRXHETXF(式中のXは何れかのアミノ酸である)よりなる群から選ばれる配列を含有してなる、請求項2に記載のペプチド。 - ペプチドが、配列LRRFGDKLと少なくとも60%同一、70%同一、又は80%同一の配列を含有してなる、請求項1に記載のペプチド。
- ペプチドが、配列LEVESATQLRRFGDKLNFRQKLの少なくとも14連続アミノ酸と少なくとも90%同一である、請求項8に記載のペプチド。
- ペプチドが、配列LEVESATQLRRFGDKLNFRQKLの少なくとも14連続アミノ酸と少なくとも90%同一であり、そしてアミノ酸が、配列LEVESATQLRRFGDKLNFRQKLからの同類アミノ酸置換を含有してなる、請求項8に記載のペプチド。
- ペプチドが、アミノ酸配列LEVESATQLRRFGDKLNFRQKLの一部分と少なくとも80%同一の配列を含有してなる、請求項9又は10に記載のペプチド。
- ペプチドが、アミノ酸配列LEVESATQLRRFGDKLNFRQKLの一部分と少なくとも90%同一の配列を含有してなる、請求項9又は10に記載のペプチド。
- ペプチドが、LEVESATQLRXFGDXLNFRQKL;LEVXSATXLRRFGDKLNFRQKL;LEVEXATQXRRFGDKLNFRQKL;LEVESXTQLXRFGDKLNFRQKL;LEVESXTQLXRFGDKLNF;LEVESATQLRRFGDKLXFRQXL(式中のXは何れかのアミノ酸である)よりなる群から選ばれるポリペプチド配列を含有してなる、請求項8に記載のペプチド。
- ペプチドが、LLXLGDXL;LXRFGDKF;LXRFGDKI;及びLQXMGDXY(式中のXは何れかのアミノ酸である)よりなる群から選ばれるポリペプチド配列を含有してなる、請求項1に記載のペプチド。
- ペプチドが、少なくとも1つのRLAEVSAVLLXLGDXLE;IWIXQELXRFGDKFNAYYAR;IWIXQELXRFGDKFNAYYAR;QVXRQLXRFGDKINRRYD;及びVGQLLQXMGDXYQQYRSLTR(式中のXは何れかのアミノ酸である)と少なくとも70%同一である配列を含有してなる、請求項14に記載のペプチド。
- ペプチドが、少なくとも1つのRLAEVSAVLLXLGDXLE;IWIXQELXRFGDKFNAYYAR;IWIXQELXRFGDKFNAYYAR;QVXRQLXRFGDKINRRYD;及びVGQLLQXMGDXYQQYRSLTR(式中のXは何れかのアミノ酸である)と少なくとも80%同一である配列を含有してなる、請求項14に記載のペプチド。
- ペプチドが、少なくとも1つのRLAEVSAVLLXLGDXLE;IWIXQELXRFGDKFNAYYAR;IWIXQELXRFGDKFNAYYAR;QVXRQLXRFGDKINRRYD;及びVGQLLQXMGDXYQQYRSLTR(式中のXは何れかのアミノ酸である)と少なくとも90%同一である配列を含有してなる、請求項14に記載のペプチド。
- 少なくとも1つのXが架橋である、請求項2、7、及び13〜17の何れか一項に記載のペプチド。
- ペプチドが、8〜40アミノ酸の長さである、前記請求項の何れか一項に記載のペプチド。
- ペプチドが、MCL−1に対して少なくとも50μMの親和性を含有してなる、前記請求項の何れか一項に記載のペプチド。
- 選択的MCL−1阻害剤の有効量及び薬学的に許容される担体を対象に投与して、それによって当該対象における疾患又は障害を治療又は予防することを含有してなる、対象におけるMCL−1関連疾患を治療又は予防する方法。
- 当該選択的MCL−1阻害剤が、BH3ドメインポリペプチドを含有してなる、請求項21に記載の方法。
- 当該BH3ドメインポリペプチドが、架橋されたBH3ドメインポリペプチドを含有してなる、請求項22に記載の方法。
- 当該選択的MCL−1阻害剤が、BCL−2ファミリーBH3ドメインのNOXA安定化α螺旋(SAHB)ポリペプチド、BOK SAHBポリペプチド、MCL−1 SAHBペプチド、改変BIM SAHB又はBAK SAHBペプチド、及びMULE SAHBペプチドよりなる群から選ばれるポリペプチドを含有してなる、請求項21に記載の方法。
- 配列が、配列番号7、63〜68に記載の配列を含有しているNOXA SAHBペプチド、配列番号11に記載の配列を含有しているBOK SAHBペプチド、配列番号12,17〜60に記載の配列を含有しているMCL−1 SAHBペプチド、配列番号61又は62に記載の配列を含有しているBIM SAHBペプチド、配列番号69に記載の配列を含有しているBAK SAHBペプチド、及び配列番号70に記載の配列を含有しているMule SAHBペプチドを含有してなる、請求項24に記載の方法。
- 当該SAHBペプチドの配列が、NOXA、BOK、BIM、BAK、及びMULE SAHBポリペプチド配列よりなる群から選ばれる配列からなるキメラ配列である、請求項4に記載の方法。
- BCL−2阻害剤の有効量を当該対象に投与することを更に含有してなる、請求項1に記載の方法。
- 当該BCL−2阻害剤が、選択的BCL−2阻害剤である、請求項27に記載の方法。
- 当該BCL−2阻害剤が、N−(4−(4−((2−(4−クロロフェニル)−5,5−ジメチル−1−シクロへキサ−1−エン−1−イル)メチル)ピペラジン−1−イル)ベンゾイル−4−(((1R)−3−(モルホリン−4−イル)−1−((フェニルスルファニル)メチル)プロピル)アミノ)−3−((トリフルオロメチル)スルホニル)ベンゼンスルホンアミド;N−(4−(4−((4’−クロロ(1,1’−ビフェニル)−2−イル)メチル)ピペラジン−1−イル)ベンゾイル)−4−(((1R)−3−(ジメチルアミノ)−1−((フェニルスルファニル)メチル)プロピル)アミノ)−3−ニトロベンゼンスルホンアミド;ゴシポール;及びオバトクラクスよりなる群から選ばれる、請求項27に記載の方法。
- 当該疾患又は障害が、過剰増殖性障害、炎症性疾患又は障害、感染性疾患又は障害、細胞周期調節疾患又は障害、自己貧食調節疾患又は障害、及び自己免疫疾患又は障害よりなる群から選ばれる、請求項29に記載の方法。
- 疾患又は障害が、リンパ腫、白血病、癌、多発性骨髄腫、メラノーマ、肉腫、敗血症、関節リウマチ、炎症性大腸炎、結核菌、らい菌、クラミジア、ヒトパピローマウィルス16/18型、関節リウマチ、若年性突発性関節炎、尋常性狼瘡よりなる群から選ばれる、請求項30に記載の方法。
- 疾患又は障害が、AML、ALL、多発性骨髄腫、乳癌、肉腫、及び耐性過剰増殖性疾患よりなる群から選ばれる、請求項31に記載の方法。
- 当該過剰増殖性疾患が、BCL−2阻害剤に耐性であるか、或いは再発性又は難治性の癌である、請求項32に記載の方法。
- 化学療法剤の有効量を当該対象に投与することを更に含有してなる、請求項21に記載の方法。
- 当該化学療法剤が、アルキル化剤、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、植物アルカロイド、抗体、ステロイド、標的治療又はその他の細胞毒性或いは細胞増殖抑制剤よりなる群から選ばれる、請求項34に記載の方法。
- 疾患又は障害が標準的なケア治療に耐性である、請求項31又は32に記載の方法。
- 架橋したBH3ドメインを含有しているポリペプチドを細胞と接触させて、それによって当該細胞中のMCL−1活性を調節することを含有してなる、細胞中のMCL−1活性を調節する方法。
- MCL−1活性が阻害される、請求項37に記載の方法。
- 当該ポリペプチドが選択的MCL−1阻害剤である、請求項37に記載の方法。
- 当該細胞中のアポトーシスが増強される、請求項37に記載の方法。
- 選択的MCL−1阻害剤の有効量と薬学的に許容される担体を対象に投与し、それによって当該対象の難治性癌を治療することを含有してなる、対象の難治性癌を治療する方法。
- 当該難治性癌が、化学療法剤の投与に耐性である、請求項41に記載の方法。
- 当該難治性癌が、BCL−2阻害剤の投与に抵抗する、請求項42に記載の方法。
- 当該難治性癌が、N−(4−(4−((2−(4−クロロフェニル)−5,5−ジメチル−1−シクロへキサ−1−エン−1−イル)メチル)ピペラジン−1−イル)ベンゾイル)−4−(((1R)−3−(モルホリン−4−イル)−1−((フェニルスルファニル)メチル)プロピル)アミノ)−3−((トリフルオロメチル)スルホニル)ベンゼンスルホンアミド;N−(4−(4−((4’−クロロ(1,1’−ビフェニル)−2−イル)メチル)ピペラジン−1−イル)ベンゾイル)−4−(((1R)−3−(ジメチルアミノ)−1−((フェニルスルファニル)メチル)プロピル)アミノ)−3−ニトロベンゼンスルホンアミド;ゴシポール;及びオバトクラクスよりなる群から選ばれる薬剤の投与に耐性である、請求項43に記載の方法。
- 当該難治性癌が、MCL−1を過剰発現する、請求項41に記載の方法。
- 当該選択的MCL−1阻害剤が、架橋されたBH3ドメインを含有しているポリペプチドを含有してなる、請求項41に記載の方法。
- 当該選択的MCL−1阻害剤が、BCL−2BH3ドメインのNOXA安定化α螺旋(SAHB)ポリペプチド、BOK SAHBポリペプチド、MCL−1 SAHBドメインポリペプチド、改変BIM SAHBポリペプチド、改変BAK SAHBポリペプチド、及びMULE SAHBポリペプチドよりなる群から選ばれるポリペプチドを含有してなる、請求項41に記載の方法。
- 選択的MCL−1阻害剤の有効量及び薬学的に許容される担体を対象に投与し、それによって当該対象の当該難治性癌を治療することを含有してなる、対象における癌を治療する方法であって、
ここで、当該癌はN−(4−(4−((2−(4−クロロフェニル)−5,5−ジメチル−1−シクロへキサ−1−エン−1−イル)メチル)ピペラジン−1−イル)ベンゾイル)−4−(((1R)−3−(モルホリン−4−イル)−1−((フェニルスルファニル)メチル)プロピル)アミノ)−3−((トリフルオロメチル)スルホニル)ベンゼンスルホンアミド;N−(4−(4−((4’−クロロ(1,1’−ビフェニル)−2−イル)メチル)ピペラジン−1−イル)ベンゾイル)−4−(((1R)−3−(ジメチルアミノ)−1−((フェニルスルファニル)メチル)プロピル)アミノ)−3−ニトロベンゼンスルホンアミド;ゴシポール;及びオバトクラクスよりなる群から選ばれる薬剤の投与に耐性であり、そして
当該癌がMCL−1を過剰発現する、
方法。 - 選択的MCL−1阻害剤を当該細胞と接触させ、それによって、当該非MCL−1選択的BCL−2ファミリーポリペプチド阻害剤に対する当該細胞のアポトーシス応答を増強することを含有してなる、非MCL−1選択的BCL−2ファミリーポリペプチド阻害剤に対する細胞のアポトーシス応答を増強する方法。
- 当該非MCL−1選択的BCL−2ファミリーポリペプチド阻害剤が、請求項1〜17及び77〜82に記載のペプチドよりなる群から選ばれる選択的BCL−2阻害剤である、請求項48又は49に記載の方法。
- 当該非MCL−1選択的BCL−2ファミリーポリペプチド阻害剤が、N−(4−(4−((2−(4−クロロフェニル)−5,5−ジメチル−1−シクロへキサ−1−エン−1−イル)メチル)ピペラジン−1−イル)ベンゾイル)−4−(((1R)−3−(モルホリン−4−イル)−1−((フェニルスルファニル)メチル)プロピル)アミノ)−3−((トリフルオロメチル)スルホニル)ベンゼンスルホンアミド;N−(4−(4−((4’−クロロ(1,1’−ビフェニル)−2−イル)メチル)ピペラジン−1−イル)ベンゾイル)−4−(((1R)−3−(ジメチルアミノ)−1−((フェニルスルファニル)メチル)プロピル)アミノ)−3−ニトロベンゼンスルホンアミド;ゴシポール;及びオバトクラクスよりなる群から選ばれる、請求項48又は49に記載の方法。
- 当該選択的MCL−1阻害剤が、架橋されたBH3ドメインを含有しているポリペプチドを含有してなる、請求項48又は49に記載の方法。
- 当該選択的MCL−1阻害剤が、BCL−2ファミリーBH3ドメインのNOXA安定化α螺旋(SAHB)ポリペプチド、BOK SAHBペプチド、MCL−1 SAHB(ドメインポリ)ペプチド、野生型又は改変BIM SAHB又はBAK SAHBペプチド、及びMULE SAHBペプチドよりなる群から選ばれるポリペプチドを含有してなる、請求項48又は49に記載の方法。
- 選択的MCL−1阻害剤を細胞と接触させ、それによって当該細胞の自食性細胞死を増強することを含有してなる、細胞における自食性細胞死を増強する方法。
- 当該選択的MCL−1阻害剤が、架橋されたBH3ドメインを含有しているポリペプチドを含有してなる、請求項54に記載の方法。
- 当該選択的MCL−1阻害剤が、BCL−2ファミリーBH3ドメインのNOXA安定化α螺旋(SAHB)ポリペプチド、BOK SAHBペプチド、MCL−1 SAHBペプチド、野生型又は改変BIM SAHB又はBAK SAHBペプチド、及びMULE SAHBペプチドよりなる群から選ばれるポリペプチドを含有してなる、請求項54に記載の方法。
- 細胞を選択的MCL−1阻害剤と接触させ、それによって当該細胞におけるMCL−1の多量体化を阻害することを含有してなる、細胞におけるMCL−1の多量体化を阻害する方法。
- 細胞を選択的MCL−1活性剤と接触させ、それによって当該細胞におけるMCL−1の多量体化を誘発することを含有してなる、細胞におけるMCL−1の多量体化を誘発する方法。
- 細胞を、MCL−1がBAX、BAK、BOK、NOXA、BIM、BID、MCL−1と結合することを阻害するか、又はMCL−1からBAX、BAK、BOK、NOXA、BIM、BID、MCL−1を駆逐するために有効な量の選択的MCL−1阻害剤と接触させ、それによってMCL−1のBAX、BAK、BOK、NOXA、BIM、BID、MCL−1との相互作用を阻害することを含有してなる、細胞におけるMCL−1のBAX、BAK、BOK、NOXA、BIM、BID、MCL−1との相互作用を阻害する方法。
- MCL−1ポリペプチドを試験化合物と、当該試験化合物と当該MCL−1ポリペプチドとの相互作用に適切な条件下に接触させること;及び当該MCL−1ポリペプチドの活性の調節を検出すること(ここで、当該調節が当該MCL−1ポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する)を含有してなる、MCL−1ポリペプチドの活性を調節する化合物を同定する方法。
- 当該試験化合物が小分子及びポリペプチドよりなる群から選ばれる、請求項60に記載の方法。
- 当該ポリペプチドが架橋されたBH3ドメインを含有してなる、請求項61に記載の方法。
- 当該ポリペプチドの配列が図23に列挙されているSAHB配列と少なくとも80%同一である、請求項62に記載の方法。
- 請求項61に記載の方法で同定されるMCL−1調節化合物。
- MCL−1 SAHBと結合しているMCL−1ポリペプチドを試験化合物と、当該試験化合物の当該MCL−1ポリペプチドとの相互作用に適切な条件下に接触させること;及び当該MCL−1 SAHBの当該MCL−1ポリペプチドからの解離を検出すること(ここで、当該MCL−1 SAHBの当該MCL−1ポリペプチドからの解離の検出が選択的MCL−1結合剤として試験化合物を同定する)を含有してなる、選択的MCL−1結合剤を同定する方法。
- 当該試験化合物が小分子及びポリペプチドよりなる群から選ばれる、請求項65に記載の方法。
- 当該ポリペプチドが架橋されたBH3ドメインを含有してなる、請求項66に記載の方法。
- 当該ポリペプチドの配列が図23に列挙されているSAHB配列と少なくとも80%同一である、請求項67に記載の方法。
- 当該MCL−1結合剤がMCL−1阻害剤である、請求項65に記載の方法。
- 当該MCL−1 SAHBが標識化されている、請求項65に記載の方法。
- 当該MCL−1ポリペプチドが標識化されている、請求項65に記載の方法。
- 当該標識がFITCである、請求項70又は71に記載の方法。
- 請求項66に記載の方法で同定される選択的MCL−1結合剤。
- 選択的MCL−1阻害剤を含有してなる、医薬組成物。
- 当該選択的MCL−1阻害剤が、BCL−2BH3ドメインのNOXA安定化α螺旋(SAHB)ポリペプチド、BOK SAHBペプチド、MCL−1 SAHBペプチド、野生型又は改変BIM SAHB又はBAK SAHBペプチド、及びMULE SAHBペプチドよりなる群から選ばれるポリペプチドと少なくとも95%同一であるポリペプチドを含有してなる、請求項74に記載の医薬組成物。
- 当該選択的MCL−1阻害剤が、BCL−2BH3ドメインのNOXA安定化α螺旋(SAHB)ポリペプチド、BOK SAHBペプチド、MCL−1 SAHBペプチド、野生型又は改変BIM SAHB又はBAK SAHBペプチド、及びMULE SAHBペプチドよりなる群から選ばれるポリペプチドを含有してなる、請求項75に記載の医薬組成物。
- 当該NOXA SAHBポリペプチドが、配列番号7、63〜68に記載の配列、及びそれらの誘導体よりなる群から選ばれる配列を含有してなる、請求項76に記載の選択的MCL−1阻害剤。
- 当該BOK SAHBポリペプチドが配列番号11に記載の配列又はその誘導体を含有してなる、請求項76に記載の選択的MCL−1阻害剤。
- 当該MCL−1 SAHBポリペプチドが、配列番号12、17〜60に記載の配列又はそれらの誘導体を含有してなる、請求項76に記載の選択的MCL−1阻害剤。
- 当該BIM SAHBポリペプチドが、配列番号61及び62に記載の配列並びにそれらの誘導体よりなる群から選ばれる配列を含有してなる、請求項76に記載の選択的MCL−1阻害剤。
- 当該BAK SAHBドメインポリペプチドが、配列番号69に記載の配列を含有してなる、請求項77に記載の選択的MCL−1阻害剤。
- 当該MULE SAHBドメインポリペプチドが、配列番号70に記載の配列を含有してなる、請求項77に記載の選択的MCL−1阻害剤。
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